KR101106931B1 - 인슐린-유사 성장 인자-ｉ 및 폴리(에틸렌 글라이콜)의 접합체의 제조 방법 - Google Patents

인슐린-유사 성장 인자-ｉ 및 폴리(에틸렌 글라이콜)의 접합체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로펩티드의 C-말단에 N-말단으로 연결된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포를 배양하고, 상기 프로펩티드가 아미노산 -Y-Pro에 의해 C-말단으로 종결되고, 이때 Y가 Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택되고, 상기 융합 단백질을 회수하고 PEG화하고, 상기 PEG화된 융합 단백질을 IgA 프로테아제로 절단시키고, 상기 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 제조 방법에 관한 것으로, 이때 상기 변이체는 독립적으로 다른 극성 아미노산에 의해 치환된 라이신 27, 65 및/또는 68로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산을 포함한다. PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 알츠하이머병과 같은 신경변성 장애의 치료에 유용하다.

Description

인슐린-유사 성장 인자-Ｉ 및 폴리(에틸렌 글라이콜)의 접합체의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF CONJUGATES OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-I AND POLY(ETHYLENE GLYCOL)}
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I)와 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)의 접합체(conjugate)의 제조 방법, 이 접합체를 함유하는 약학 조성물, 및 이 접합체의 사용 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 65세가 넘는 사람들의 치매의 전체 경우의 약 50 내지 60%의 원인이 되는, 점증하고 있는 신경변성의 한 형태이다. 현재 세계적으로 어림잡아 1,500백만 명의 사람들이 걸려있고, 인구에서 노령자의 상대적 증가로 인하여 이의 이환율이 다음 20 내지 30년에 걸쳐 증가할 것으로 보인다. AD는 임상적 증상의 발병과 사망 사이에 약 8.5년의 평균 지속기간을 갖는 진행성 장애이다. 고도의 정신적 기능과 연관된 뇌 영역에서 피라미드 신경세포의 사망 및 신경 시냅스의 손실은 인지 기능의 총체적 및 진행성 손상을 특징으로 하는 전형적인 증상을 야기한다(문헌[Francis, P. T., et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66 (1999) 137-147]). AD는 세계에서 노인성 및 초로성 치매 둘 다에서 가장 일반적인 형태이고, 기억, 지적 능력의 점진적 손실 및 언어 장애를 나타내는 가혹하게 진행하는 치매로서 임상적으로 인식된다(문헌[Merritt, A Textbook of Neurology, 6th edition, Lea & Febiger, Philadelphia, pp. 484-489, 1979]). 신경병리학적으로, AD의 주된 특징은 두 가지 특징적 병변: 아밀로이드 노인성 플라크(plaque) 및 신경섬유 매듭(tangle)(NFT)의 존재이다. 플라크는 신경세포 밖에 침착되는 반면, 매듭은 사후 뇌의 신경세포 내에서 관찰된다. 아밀로이드 플라크 코어의 주 성분중의 하나는 병리학적으로 침착된 소형 아밀로이드-β-펩티드(Aβ)이고, 이는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 세크레타제(secretase)에 의해 절단(cleaved)된다(문헌[Selkoe, D. J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766]; [Hardy, J., and Selkoe, D. J., Science 297 (2002) 353-356]; 및 [Bush, A. I., and Tanzi, R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 7317- 7319]). Aβ, 39 내지 43 잔기의 자가-응집 펩티드(MW: 약 4kDa)는 보다 큰 APP(110 내지 120kDa)의 일부로서 합성된다. APP는 큰 N-말단 세포외 영역, 단일 막횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 갖는 유형 I의 완전 막 글리코단백질이다. Aβ 영역은 APP의 세포외 및 막횡단 영역의 부분에 걸친다. AD에서 신경 세포 사망에 APP가 참여하는 데 대한 가장 일반적인 가설은 아밀로이드 가설이다. 이 가설은 플라크 아밀로이드 침착 또는 부분적으로 응집된 가용성 Aβ가 세포독성 캐스케이드를 기동시키고, 이에 따라 AD 병리학에 유사한 신경변성을 유발한다고 가정한다(문헌[Selkoe, D. J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766]; 및 [Hardy, J., and Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356]).
인간 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I)는 구조적으로 인슐린에 관련된 순환 호르몬이다. IGF-I는 전통적으로 말초 조직에서 성장 호르몬 작용의 주요 매개체로 간주되었다. IGF-I는 70개의 아미노산으로 구성되고, 또한 소마토메딘(somatomedin) C로도 불리고, 스위스프로트(SwissProt) 제 P01343 호에 의해 정의된다. 용도, 활성 및 제조에 대해서는, 예를 들어 문헌[le Bouc, Y., et al, FEBS Lett. 196 (1986) 108-112]; [de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184]; [Sandberg Nordqvist, A. C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277]; [Steenbergh, P. H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514]; [Tanner, J. M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696]; [Uthne, K., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554]; 유럽 특허 제 0 123 228 호; 제 0 128 733 호; 및 미국 특허 제 5,861,373 호; 제 5,714,460 호; 유럽 특허 제 0 597 033 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 02/32449 호; 및 제 WO 93/02695 호에 언급되어 있다.
IGF-I 기능 조절은 상당히 복잡하다. 순환시 단지 0.2%의 IGF-I만이 유리 형태로 존재하는 반면, 대부분은 IGF-결합 단백질(IGFBP)에 결합되고, 이 단백질은 IGF에 매우 높은 친화도를 갖고 IGF-I 기능을 조절한다. 이 인자는 프로테아제에 의한 IGFBP의 단백질 분해 같은 IGF-I 방출 기전에 의해 국부적으로 유리될 수 있다.
IGF-I은 성장중 및 성숙 뇌에서 주변분비(paracrine) 역할을 담당한다(문 헌[Werther, G. A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778]). 시험관내 연구에서 IGF-I는 도파민 신경세포(문헌[Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570]) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)(문헌[McMorris, F. A., and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209]; [McMorris, F. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826]; 및 [Mozell, R. L., and McMorris, F. A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390])를 포함하는 CNS(문헌[Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570]; 및 [Svrzic, D., and Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60])에서의 몇가지 유형의 신경세포에 대하여 효력있는 비선택적 영양 작용제(trophic agent)인 것으로 나타난다. 미국 특허 제 5,093,317 호에서는 콜린성 신경 세포의 생존이 IGF-I의 투여로 증진되는 것으로 언급된다. IGF-I가 말초 신경 재생을 자극하고(문헌[Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398]), 오르니틴 데카복실레이스 활성을 증진시키는 것으로 또한 공지되어 있다(미국 특허 제 5,093,317 호). 미국 특허 제 5,861,373 호 및 국제 특허 출원 공개 제 WO 93/02695 호에서는 환자의 중추신경계에서 IGF-I 및/또는 이의 유사체의 활성 농도를 증가시킴으로써, 아교세포(glia) 및/또는 비-콜린성 신경 세포에 현저하게 영향을 미치는 중추신경계에 대한 손상 또는 이의 질환을 치료하는 방법을 언급하고 있다. 국제 특허 출원 공개 제 WO 02/32449 호는 치료 효과량의 IGF-I 또는 이의 생물학적 활성 변이체를 포함하는 약학 조성물을 포유동물의 비강에 투여함으로써 포유동물의 중추신경계에서 허혈성 손상을 감소시키거나 예방하는 방법에 관련된다. IGF-I 또는 이의 변이 체는 허혈성 사건와 연관된 허혈성 손상을 감소시키거나 예방하기에 효과적인 양으로 포유동물의 비강을 통해 흡수되어 중추신경계로 수송된다. 유럽 특허 제 EP 0 874 641 호에서는 AIDS-관련 치매, AD, 파킨슨병, 픽병(Pick's Disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 간성 뇌병증(hepatic encephalopathy), 피질-기저 신경절 퇴행증(cortical-basal ganglionic syndrome), 진행성 치매, 경직성 마비(spastic parapavresis)를 동반하는 가족성 치매, 진행성 핵상 마비(supranuclear palsy), 다발 경화증, 쉴더(Schilder)의 뇌 경화증 또는 급성 괴사 출혈성 뇌척수염에 기인하는, 중추신경계의 신경세포 손상을 치료하거나 예방하는 약제의 제조를 위한 IGF-I 또는 IGF-II의 용도를 청구하고 있고, 여기서 약제는 혈액-뇌 장벽 또는 혈액-척수 장벽의 외부에서 상기 IGF의 효과량의 비경구 투여를 위한 형태이다.
유리 IGF-I의 뇌 및 혈청 수준의 감소는 AD의 산발성 및 가족성 형태의 발병과 관련된다. 더 나아가, IGF-I는 Aβ-유도된 신경독성에 대하여 신경세포를 보호한다(문헌[Niikura, T., et al., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910]; [Dore, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777]; 및 [Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364]). 최근, 래트와 마우스에서 말초로 투여된 IGF-I가 뇌 Aβ 수준을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다(문헌[Carro, E., et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397]). 더욱이, 이 연구에서는 유전자 도입(transgenic) AD 마우스 모델에서 지속된 IGF-I 치료가 뇌 아밀로이드 플라크 하중을 상당히 감소시킴을 보여주었다. 이들 자료는 IGF-I가 뇌로부터 Aβ를 청 소(clearance)함으로써 뇌 Aβ 수준 및 플라크-연관 뇌 치매를 감소시킬 수 있음을 강력하게 지지한다.
폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)을 이용한 단백질의 공유 결합 변형은 체내에서 단백질의 순환 반감기를 연장하는 데 유용한 방법으로 입증되었다(문헌[Hershfield, M. S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596]; [Meyers, F. J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313]; [Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9 (1992) 249-304]; [Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10 (1993) 91-114]; 유럽 특허 공개 제 EP A 0 400 472 호; 문헌[Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]; [Satake-Ishikawa, R., et al., Cell Struct. Funct. 17 (1992) 157-160]; [Katre, N. V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 1487-1491]; [Tsutsumi, Y., et al., Jpn. J. Cancer Res. 85 (1994) 9-12]; [Inoue, H., et al., J. Lab. Clin. Med. 124 (1994) 529-536]; 및 [Chamow, S.M., et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 133-140]).
PEG화(PEGylation)의 다른 장점은 용해도의 증가 및 단백질 면역원성의 감소이다(문헌[Katre, N.V., J. Immunol. 144 (1990) 209-213]). 단백질의 PEG화의 일반적인 방법은 N-하이드록시석신이미드(NHS) 같은 아미노-반응성 반응 물질로 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)의 사용이다. 이러한 반응 물질을 이용하여 폴리(에틸렌 글라이콜)은 N-말단 α-아미노 기 및 라이신 잔기의 ε-아미노 기와 같은 유리 1차 아미노 기에서 단백질에 부착된다. 그러나, 이 접근법의 주요 한계는 단백질이 전형적으로 상당한 양의 라이신 잔기를 함유하여 폴리(에틸렌 글라이콜) 기가 모든 유리 ε-아미노 기에서 비특이적 방식으로 단백질에 부착됨으로써, 무작위 PEG화된 단백질의 이종 생성물 혼합물이 생성된다는 점이다. 그러므로, 많은 NHS-PEG화된 단백질은 낮은 특이 활성 때문에 상업적 용도에 부적합하다. 생물학적 활성에 요구되는 하나 이상의 라이신 잔기 또는 N-말단 아미노 잔기의 공유 결합 변형 때문에, 또는 단백질의 활성 부위의 또는 그 부근의 폴리(에틸렌 글라이콜) 잔기의 공유 결합 부착 때문에 비활성화가 야기된다. 예를 들어, NHS-PEG화 반응 물질을 이용한 인간 성장 호르몬의 변형은 단백질의 생물학적 활성을 10배 넘게 감소시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969-21977]). 인간 성장 호르몬은 N-말단 아미노산 외에 또한 9개의 라이신을 포함한다. 이들 라이신중 소정의 것은 수용체 결합에 결정적인 것으로 알려진 단백질 영역에 위치한다(문헌[Cunningham, B. C., et al., Science 254 (1991) 821-825]). 게다가, 아미노-반응성 폴리(에틸렌 글라이콜) 반응 물질을 이용한 에리트로포이에틴의 변형은 또한 생물학적 활성의 거의 완전한 손실을 야기한다(문헌[Wojchowski, D. M., et al., Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232]). 아미노-반응성 PEG화 반응 물질을 이용한 인터페론-α2의 공유 결합 변형은 생활성의 40 내지 75% 손실을 유발한다(미국 특허 제 5,382,657 호). G-CSF의 유사한 변형은 60% 초과의 활성 손실을 유발하고(문헌[Tanaka, H., et al., Cancer Res. 51 (1991) 3710- 3714]), 인터류킨-2의 경우 90% 초과의 생활성의 손실을 유발한다(문헌[Goodson, R. J., and Katre, N. V., BioTechnology 8 (1990) 343-346]).
국제 특허 출원 공개 제 WO 94/12219 호 및 제 WO 95/32003 호에서는 PEG 및 IGF 또는 시스테인 돌연변이된 IGF를 포함하는 폴리(에틸렌 글라이콜) 접합체를 청구하고 있으며, 이 때 PEG는 뮤테인의 N-말단 영역에서 유리 시스테인에서 상기 뮤테인에 부착된다. 국제 특허 출원 공개 제 WO 2004/60300 호에서는 N-말단 PEG화된 IGF-I를 기술하고 있다.
IgA 프로테아제의 인지 부위는 Yaa-Pro.!.Xaa-Pro로서 기술된다. Yaa는 Pro(또는 드물게는 Ala, Gly 또는 Thr과 조합된 Pro: Pro-Ala, Pro-Gly 또는 Pro-Thr)를 나타낸다. Xaa는 Thr, Ser 또는 Ala를 나타낸다(문헌[Pohlner, J., et al., Bio/Technology 10 (1992) 799-804]; [Pohlner, J., et al., Nature 325 (1987) 458-462]; 및 미국 특허 제 5,427,927 호). 천연 절단 부위는 문헌[Wood, S.G. and Burton J., Infect. Immun. 59 (1991) 1818-1822]에 의해 확인되었다. 임균(Neisseria gonorrhoea)(유형 2)로부터의 면역글로불린 A1 프로테아제에 대한 합성 펩티드 기질은 자가단백질분해 부위 Lys-Pro-Ala-Pro.!.Ser-Pro, Val-Ala-Pro-Pro.!.Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ala-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro.!.Thr-Pro 및 IgA1 절단 부위 Pro-Pro-Thr-Pro.!.Ser-Pro 및 Ser-Thr-Pro-Pro.!.Thr-Pro이다.
국제 특허 출원 공개 제 WO 2006/066891 호는 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I) 변이체 및 1 또는 2개의 폴리(에틸렌 글라이콜) 기로 이루어진 접합체를 개시하고 있으며, 이때 IGF-I 변이체는 아미노산 중 1 또는 2개가 라이신이고, 아미노산 27이 라이신이 아닌 극성 아미노산이 되도록 하는, 야생형 IGF-I 아미노산 서열의 3개 이하의 아미노산 위치 27, 37, 65, 68에서 아미노산 변이를 갖고, 상기 라이신의 1차 아미노 기를 통해 접합되고, 상기 폴리(에틸렌 글라이콜) 기는 20 내지 100kDa의 총 분자량을 가짐을 특징으로 한다. 이러한 접합체는 알츠하이머병과 같은 신경변성 장애의 치료에 유용하다. 국제 특허 출원 공개 제 WO 2006/074390 호는 IGF-I 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은
a) 프로펩티드의 C-말단에 N-말단으로 연결된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포를 배양하고;
b) 이에 따라 상기 프로펩티드의 C-말단이 아미노산 -Y-Pro로 종결되고, 이때 Y가 Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택되고;
c) 상기 융합 단백질을 회수하고 PEG화하고;
d) 상기 PEG화된 융합 단백질을 IgA 프로테아제로 절단시키고;
e) 상기 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체의 제조 방법을 포함하며, 이때 상기 변이체는 다른 극성 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 라이신 27, 65 및/또는 68로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 RRK이고 상기 변이체가 라이신 잔기 68에서 단일PEG화되거나, 또는 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 RKR이고 상기 변이체가 라이신 잔기 65에서 단일PEG화되는 것을 특징으로 한다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 RKK이고 상기 변이체가 라이신 잔기 65 및 68에서 단일- 또는 이중PEG화되는 것을 특징으로 한다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 RRK, RKR 또는 RKK의 혼합물이고 상기 변이체가 라이신 잔기 65 및 68에서 단일- 또는 이중PEG화되는 것으로 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 프로펩티드의 C-말단에 N-말단으로 연결된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 이때 상기 프로펩티드는 아미노산 -Y-Pro에 의해 C-말단으로 종결되고, 여기서 Y가 Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택되는 것으로 특징으로 한다. -Y-Pro 서열로 인해, 프로펩티드는 상기 IGF-I 또는 IGF-I 변이체로부터 IgA 프로테아제 처리에 의해 분리될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 융합 단백질은 하기 화학식 1로 표시된다:
Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-I 또는 IGF-I 변이체]
상기 식에서,
IGF-I는 인간 IGF-I를 나타내고, IGF-I 변이체는 IGF-I를 나타내되, 라이신 27, 65 및/또는 68로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산은 독립적으로 다른 극성 아미노산에 의해 치환되고;
Met는 메티오닌을 나타내고;
X1은 결합, 세린 또는 아스파라긴이고;
His는 히스티딘이고;
n은 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6의 수이고;
X2는 연결자 펩티드로서, 펩티드 서열 식별 번호: 6 내지 10으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
Pro는 프롤린이고;
Y는 Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 융합 단백질은 융합 단백질 서열 식별 번호: 2 내지 5 및 서열 식별 번호: 22 내지 25로 이루어진 군 중에서 선택된다.
바람직하게는, 프로펩티드는 하기 화학식 2로 표시된다:
Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-
상기 식에서,
Met는 메티오닌을 나타내고;
X1은 결합, 세린 또는 아스파라긴이고;
His는 히스티딘이고;
n은 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6의 수이고;
X2는 연결자 펩티드로서, 펩티드 서열 식별 번호: 6 내지 10으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
Pro는 프롤린이고;
Y는 Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택된다.
프로펩티드는 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 N-말단(글리신)에 C-말단으로 연결된다. 바람직하게는, 프로펩티드는 라이신 잔기를 포함하지 않는다. 프로펩티드는 바람직하게는 30개 이하의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직하게는, X1은 결합이다. 바람직하게는, n은 0 또는 6이다. 바람직하게는, X2는 펩티드 서열 식별 번호: 7이다. 바람직하게는, Y는 Pro-Arg-Pro이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 N-말단 메티오닌을 포함하지 않음을 특징으로 하는 라이신-PEG화된 IGF-I이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체이며, 이때 라이신 27, 65 및/또는 68로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산은 독립적으로 다른 극성 아미노산에 의해 치환되고, 상기 변이체가 N-말단 메티오닌을 포함하지 않음을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 극성 아미노산은 독립적으로 아르기닌, 글루타민 또는 아스파라긴, 특히 아르기닌이다.
바람직한 IGF-I 변이체 및 융합 단백질에서의 변이체는 RKK, RKR, RRK이다. IGF-I 변이체는 다음과 같이 기재된다: K65는 아미노산 65가 라이신임을 의미하고, R27은 아미노산 27이 아르기닌임을 의미한다, 등. 아미노산 R27, K65, K68을 갖는 IGF-I 변이체는 RKK로 기재되고, 상기 RKK 변이체의 잔여 아미노산은 서열 식별 번호: 1의 IGF-I 야생형에서의 것과 동일하다. 따라서, RKK는 IGF-I 야생형의 변이체이며, 이는 K를 R로 교환함에 의해 위치 27에서 돌연변이화된다. RKR은 IGF-I 야생형의 변이체이며, 이는 K를 R로 교환함에 의해 위치 27 및 68에서 돌연변이화된다. RRK는 IGF-I 야생형의 변이체이며, 이는 K를 R로 교환함에 의해 위치 27 및 65에서 돌연변이화된다. 아미노산이 변하지 않는 IGF-I 야생형을 KKK로 기재한다.
라이신-PEG화된 IGF-I는 바람직하게는 라이신 잔기 27, 65 및 68에서 무작위 PEG화되고, 바람직하게는 단일- 또는 이중PEG화된다(IGF-I 분자 당 1 또는 2개의 PEG). 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체는 바람직하게는 라이신 잔기 65 및 68에서 단일- 또는 이중PEG화되고, 바람직하게는 K65 또는 K68에서 단일PEG화된다. 폴리(에틸렌 글라이콜) 기는 라이신의 1차 아미노 기를 통해 IGF-I 또는 IGF-I 변이체에 접합된다.
본 발명의 방법은 폴리(에틸렌 글라이콜)이 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기를 통해 IGF-I 중간체에 화학적으로 결합하도록 하는 조건 하에서 본 발명에 따른 IGF-I 융합 단백질과 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)과의 반응에 의한, 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 제조(이때, 폴리(에틸렌 글라이콜) 기는 바람직하게는 IGF-I 또는 IGF-I 변이체 당 20kDa 이상, 보다 바람직하게는 약 20 내지 100kDa, 특히 바람직하게는 20 내지 80kDa의 총 분자량을 갖는다)를 포함한다. 바람직하게는, 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 단일PEG화된다. 변이체는 바람직하게는 각각 아미노산 위치 27, 65 및 68과 관련한 RKK, RKR, RRK로 이루어진 군 중에서 선택된다. PEG는 바람직하게는 30 내지 45kDa, 특히 30kDa 또는 40kDA의 총 분자량을 갖는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 함유하는 약학 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 함유하는 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 AD의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 아미노-반응성 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 약학적 효과량을 AD의 치료가 필요한 환자에게, 바람직하게는 주당 1 또는 2회 적용하여 투여함을 특징으로 하는 AD의 치료 방법을 포함한다.
도 1: 단일PEG화된 융합 단백질의 펩티드 분석. PEG화 전 및 후에 접힌 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인(Lane) 1, 표준 단백질 혼합물(소 폐 아프로티닌, 6.0kDa; 달걀 백색 리소자임, 14.4kDa; 대두 트립신 억제제, 21.5kDa; 소 적혈구 탄산 탈수효소, 31.0kDa; 돼지 근육 락테이트 탈수소효소, 36.5kDa; 소 간 글루탐산 탈수소효소, 55.4kDa; 소 혈청 알부민, 66.3kDa; 토끼 근육 인산화효소 b, 97.4kDa; 이. 콜라이(E. coli) β-갈락토시다제, 97.4kDa; 토끼 근육 미오신, 200kDa); 레인 2, PEG화 전 pro-IGF-I; 레인 3, PEG화 후 pro-IGF-I.
도 2: 단일PEG화된 IGF-I 변이체의 펩티드 분석. IgA 절단 전 및 후에 PEG화된 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인 1, 표준 단백질 혼합물(도 1에서와 같음); 레인 2, IgA 프로테아제 절단 전 반응 혼합물; 레인 3, IgA 프로테아제 절단 후 반응 혼합물.
도 3: SDS PAGE. PEG화 전 및 후에 접힌 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인 1, 표준 단백질 혼합물(도 1에서와 같음); 레인 2, IEC 전 반응 혼합물; 레인 3, IEC를 통한 흐름; 레인 4 내지 19, IEC로부터의 단일 용리된 분절.
도 4: B6.152H 마우스에서의 PEG-RRK 생체 내 뇌 Aβ(Abeta) 강하. 9 내지 10개월된 이중 유전자 도입 B6.152H 마우스를 14일 동안 비히클(NaCl) 또는 PEG-RRK(5㎍/kg 피하, 2회-주)로 처리하였다. 가용성 뇌 추출물을 제조하고, APP, Aβ 및 액틴 수준을 기재한 바와 같이 평가하였다. APP/액틴, Aβ/액틴 및 Aβ/APP의 비를 계산하였고, 대조군(%)으로서 표현하였다. A, APP/액틴; B, Aβ/액틴; C, Aβ/APP. 위쪽의 그래프는 단일 동물 데이터 점을 나타내며, 아래쪽의 그래프는 통 계적 차이(*, p<0.05; **, p<0.01 대 비처리된 대조군, n=10)를 포함한 막대 표시를 보여준다(평균±SEM).
놀랍게도, IgA 프로테아제, 바람직하게는 임균으로부터의 IgA 프로테아제가 아미노산 서열 Y-Pro.!.Gly-Pro를 절단시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. Y는 Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택된다. 바람직하게는, Pro-Pro.!.Gly-Pro(서열 식별 번호: 15) 또는 Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro(서열 식별 번호: 11)(.!.: 절단 위치)가 절단 부위로서 유용하다. 본 발명에 따른 방법에서 IgA 프로테아제 절단 부위는 아미노산 공통 서열 Y-Pro.!.Gly-Pro를 가지며, 이때 Gly-Pro는 IGF-I의 처음 2개의 아미노산이다. Y는 바람직하게는 아미노산 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro 또는 Pro-Arg-Pro에 의해 종결된 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 Y 아미노산 서열, 특히 Pro-Arg-Pro는 추가로 Ala 또는 Pro-Ala 기에 의해 연장될 수 있다(예컨대, Ala-Pro-Arg-Pro(서열 식별 번호: 12) 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro(서열 식별 번호: 13)). 절단 아미노산 서열 Pro-Ala-Pro.!.Gly-Pro(서열 식별 번호: 14), Pro-Pro-!.Gly-Pro(서열 식별 번호: 15), Pro-Arg-Pro-Pro.!. Gly-Pro(서열 식별 번호: 16), Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro(서열 식별 번호: 17) 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro(서열 식별 번호: 18)가 특히 바람직하다.
본 발명에 따라 용어 "IgA 프로테아제"는 특이적으로 IgA를 절단시키며 예컨대 문헌[Kornfeld, S.J. and Plaut, A.G. in Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534]에 기재된 프로테아제를 포함한다(예컨대, 임균(유형 2)으로부터의 IgA1 프로테아제). 또한, 독일 특허 공개 제 A 36 22 221 호, 문헌[Koomey, J.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881-7885], [Bricker, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681-2685], [Pohlner, J., et al., Nature 325 (1987) 458-462], 및 [Halter, R., et al., EMBO J. 3 (1984) 1595-1601]에 기재된 것과 같은 재조합 IgA 프로테아제가 바로 적합한 것이다. 바람직하게는, IgA 프로테아제는 임균, 바람직하게는 유형 2로부터의 IgA 프로테아제이다. 바람직하게는, 임균(유형 2)으로부터의 IgA1 프로테아제는 서열 식별 번호: 26의 서열을 갖는다.
융합 단백질을 암호화하는 유전자는 바람직하게는 융합 단백질이 필요요건에 따라 생성될 수 있도록 적합한 (바람직하게는 유도성) 발현 신호의 조절하에 위치한다. 적합한 원핵 또는 진핵(식물 및 동물) 세포가 단백질 융합의 제조를 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있지만, 세포-부재 시스템도 가능하다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태는 숙주 세포를 재조합 DNA 또는 재조합 벡터로 형질전환시키고(이때, DNA 또는 벡터는 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자 카피(copy)를 함유하고, 형질전환된 세포는 적합한 배지에서 배양된다), 융합 단백질을 암호화하는 유전자가 형질전환된 세포에서 발현되기 시작하고, 융합 단백질이 PEG화되고, 이어서 IgA 프로테아제로 절단되고, PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체가 단리됨을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 발현은, 예컨대 라이신-부재 β-갈락토시다제 유전자의 분절과의 융합에 의해 DNA 수준에서 개선될 수 있다(즉, Y는 라이신-부재 β-갈락토시다제 단백질의 일부를 함유한다). 융합 단백질의 발현을 증가시키는 다른 대안은 숙련자에게 공지되어 있다. 발현 생성물의 정제 및 분리는 다른 폴리펩티드, 특히 고도로 하전되거나(예컨대, 폴리(Lys, Arg)) 또는 높은 친화도를 갖는 특정 물질에 결합될 수 있는(예컨대, 스트렙타비딘) 폴리펩티드 또는 단백질과의 융합에 의해 촉진될 수 있다(예컨대, 유럽 특허 공개 제 A 0 089 626 호, 제 A 0 306 610 호를 참고). 특히 바람직한 연결자 펩티드는 펩티드 서열 식별 번호: 6 내지 10이며, 바람직하게는 SHHHHHH(서열 식별 번호: 19), NHHHHHH(서열 식별 번호: 20) 또는 HHHHHH(서열 식별 번호: 21)이 N-말단으로 우선한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하고 IgA 프로테아제 절단 부위가 프로펩티드와 IGF-I 또는 IGF-I 변이체 간의 이음 영역에 혼입된 (재조합) 핵산을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 DNA는 분자 생물학 분야의 숙련자에게 공지된 방식으로 수득할 수 있다. 이를 위해, IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터는 일반적으로 이 유전자의 5' 말단 영역에서 제한 엔도뉴클레아제로 절단되고, 목적하는 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드로 재연결된다.
게다가, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 DNA의 하나 이상의 카피를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 원핵 유기체에서 단백질 발현을 위한 기재로서 적합한 벡터는 숙련자에게 공지되어 있다. 이 벡터는 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 DNA의 높은 발현을 허용하는 것이다. 벡터 상의 재조합 DNA는 바람직하게는 유도성 발현 신호의 조절하에 있다(예컨대, 람다, tac, lac, trp 프로모터).
본 발명에 따른 벡터는 숙주 유기체(예컨대, 박테리오파지 람다)의 유전체에서 통합될뿐만 아니라 염색체외적으로(예컨대, 플라스미드) 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드이다. 특정 숙주 유기체에서 유전자 발현을 위해 각각의 경우에 적합한 벡터는 분자 생물학 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 이는 진핵 벡터일 수 있지만, 바람직하게는 원핵 벡터이다. 원핵 생물에서 본 발명에 따른 DNA의 발현에 적합한 벡터의 예는, 예를 들면 시판되는 pUC 및 pUR 벡터이다.
또한, 본 발명은 세포, 바람직하게는 원핵 세포, 특히 바람직하게는 이. 콜라이 세포를 제공하며, 이는 본 발명에 따른 재조합 DNA 및/또는 본 발명에 따른 재조합 벡터에 의해 형질전환된다.
융합 단백질이 원핵 생물에서 발현되는 경우, 드물게는 비활성인 가용성 응집물(굴절 반사소체, 포함체)이 형성된다. 따라서, 융합 단백질은 그의 활성 형태로 형질전환되어야 한다. 당해 분야의 숙련자에게 친숙한 방법(참고: 예컨대 유럽 특허 공개 제 A 0 219 874 호, 제 A 0 114 506 호, 국제 특허 출원 공개 제 WO 84/03711 호)을 사용하여, 복원이 뒤따르는 변성제를 첨가하여 먼저 가용화를 수행하고, 필요한 경우 추가의 정제 단계를 수행한다. IgA 프로테아제에 의한 융합 단백질의 처리는 융합 단백질의 PEG화 후에 발생한다.
IgA 프로테아제에 의해 절단될 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 처리에 필요한 조건은 중요하지 않다. 그러나, 이 방법에서 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체 대 IgA 프로테아제의 중량 비율이 1:1 내지 500:1, 바람직하게는 100:1인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 반응은 6.5 내지 8.5의 pH를 갖는 완충된 수용액에서 발생한다. 완충 농도는 바람직하게는 50 내지 500mmol/l이고, 필요한 경우 0 내지 100mmol/l의 염화나트륨을 첨가한다. 바람직하게는, 절단은 60분 이상 내지 5일까지, 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 실온에서 수행된다.
가용화, 복원, PEG화 및 IgA 프로테아제에 의한 절단 후에, 이러한 방식으로 수득된 PEG화된 절단 생성물은 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 크기에 의한 분별에 의해 정제된다. 이러한 방식으로 생성된 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 -1 위치에서 메티오닌이 없고, 바람직하게는 비-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체와 같은 다른 단백질이 없고, 바람직하게는 N-말단 PEG화된 프로펩티드가 5%(w/w) 이하만큼 없다.
본원에서 사용되는 용어 "PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체" 또는 "아미노-반응성 PEG화"는 IGF-I 또는 IGF-I 변이체가 아미노-반응성 커플링에 의해 폴리(에틸렌 글라이콜) 기에 공유 결합하는 것을 의미한다. PEG 기는 라이신 측쇄의 1차 ε-아미노 기인 IGF-I 또는 IGF-I 변이체 분자 부위에 부착된다. 또한, PEG화가 프로펩티드의 N-말단 α-아미노 기 상에서 추가로 일어나는 것도 가능하다. 사용되는 합성 방법 및 융합 단백질로 인해, PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 혼합물로 구성될 수 있고, 이때 PEG화의 부위는 상이한 분자에서 상이할 수 있거나, 또는 분자당 폴리(에틸렌 글라이콜) 측쇄의 양 및/또는 분자 중 PEG화의 부위와 관련하여 실질적으로 균질할 수 있다. 바람직하게는, IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 단일- 및/또는 이중PEG화된다.
본원에서 사용되는 아미노-반응성 PEG화는 반응성(활성화된) 폴리(에틸렌 글라이콜)을 사용하여, 바람직하게는 메톡시폴리(에틸렌 글라이콜)의 바람직하게는 N-하이드록시석신이미딜 에스터를 사용하여 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기에 폴리(에틸렌 글라이콜) 쇄를 무작위로 부착하는 방법을 가리킨다. 이 커플링 반응은 폴리(에틸렌 글라이콜)을 라이신 잔기의 반응성 1차 ε-아미노 기 및 선택적으로 융합 단백질의 N-말단 아미노산의 α-아미노 기에 부착한다. PEG의 단백질로의 이러한 아미노 기 접합은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 이러한 방법의 고찰이 문헌[Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에서 제공된다. 베로니스(Veronese)에 따라서, 단백질의 1차 아미노 기로의 PEG의 접합은 이 1차 아미노 기의 알킬화를 수행하는 활성화된 PEG를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 반응을 위해, 활성화된 알킬화 PEG, 예를 들어 PEG 알데하이드, PEG-트레실 클로라이드 또는 PEG 에폭사이드를 사용할 수 있다. 추가로 유용한 반응 물질로는, 말단 하이드록시 기가 클로로포르메이트 또는 카보닐이미다졸로 활성화된 카복실화된 PEG 또는 PEG의 하이드록시석신이미딜 에스터 같은 아실화 PEG가 있다. 추가로 유용한 PEG 반응 물질로는 아미노산 팔(arm)을 갖는 PEG가 있다. 이러한 반응 물질은 소위 분지화된 PEG를 함유할 수 있고, 이에 따라 2개 이상의 동일하거나 상이한 PEG 분자가 펩티드성 스페이서(바람직하게는, 라이신)에 의해 함께 연결되고, 예를 들어 라이신 스페이서의 활성화된 카복실레이트로서 IGF-I 또는 IGF-I 변이체에 결합된다.
본원에서 사용되는 용어 "PEG 또는 폴리(에틸렌 글라이콜)"은 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 에틸렌 글라이콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 수용성 중합체를 의미한다(문헌[Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271]; 및 [Francis, G. E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18]). 용어 "PEG"는 에틸렌 글라이콜 단위의 수가 460 이상, 바람직하게는 460 내지 2300, 특히 바람직하게는 460 내지 1840(230 PEG 단위는 약 10kDa의 분자량을 가리킨다)인 임의의 폴리에틸렌 글라이콜 분자를 널리 포괄하는 것으로 사용된다. PEG 단위의 상한은 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 용해도에 의해서만 제한된다. 보통, 2300 단위를 함유하는 PEG보다 더 큰 PEG는 사용되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 PEG는 한쪽 끝은 하이드록시 또는 메톡시(메톡시 PEG, mPEG)로 종결되고, 다른쪽 끝은 에터 산소 결합을 통해 연결자 잔기에 공유 결합으로 부착된다. PEG 중합체는 선형이거나 분지형이다. 바람직하게는, PEG 중합체는 분지형이다. 분지형 PEG는, 예를 들어 문헌[Veronese, F. M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207]에 기술되어 있다. 유용한 PEG 반응 물질은, 예를 들어 넥타 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics (www.nektar.com))로부터 입수할 수 있다. 분지형 PEG는, 예를 들면 폴리에틸렌 옥사이드를 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소비톨을 포함한 다양한 폴리올에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 4개의 팔을 갖는 분지형 PEG는 펜타에리트리톨 및 에틸렌 옥사이드로부터 제조될 수 있다. 일반적으로 분지형 PEG는 2 내지 8개의 팔을 갖고, 예컨대 유럽 특허 공개 제 A 0 473 084 호 및 미국 특허 제 5,932,462 호에 기재되어 있다. 라이신의 1차 아미노 기를 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄를 갖는 PEG(약어로 PEG2)가 특히 바람직하다(문헌[Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]).
PEG에 대한 임의의 분자량은 필요에 따라, 예를 들어 약 20 내지 100kDa(n은 460 내지 2300이다)의 분자량을 이용할 수 있다. PEG에서 반복 단위의 수 "n"은 달톤(Dalton)으로 나타낸 분자량에 대하여 어림계산을 한 것이다. 예를 들어, 두 PEG 분자가 연결자에 부착된다면, 각각의 PEG 분자가 10kDa(각각의 n은 약 230이다)의 동일한 분자량을 갖는 경우, 연결자 상의 PEG의 총 분자량은 약 20kDa이다. 또한, 연결자에 부착된 PEG의 분자량은 연결자 상의 두 분자에서 상이할 수 있고, 예를 들어 한 PEG 분자는 5kDa이고, 또 한 PEG 분자는 15kDa일 수 있다. 분자량은 항상 평균 분자량을 의미한다.
하기 실시예에는, 아미노-반응성 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 제조를 위한 몇몇의 바람직한 반응 물질이 기술되어 있다. 본 발명에 따른 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 생성하는 한, 예를 들어 문헌[Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에 기재된 방법에 기초하여 제조 방법의 절차에 변형을 가할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 개선된 특성을 갖는 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 PEG화된 형태의 제조 방법을 제공한다. 이러한 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 이에 무작위로 부착된 선형 또는 분지형 PEG를 함유하고, 이에 따라 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체에서 모든 PEG 기의 총 분자량은 바람직하게는 약 20 내지 80kDa이다. PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체가 뇌에서 Aβ 펩티드 수준을 강하시키는 활성을 보이는 한, 이 범위의 분자량으로부터 작은 편차가 생길 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게 자명하다. 또한, 80kDa보다 큰 분자량을 갖는 PEG는 더 높은 생활성을 유발한다. 그러나, 이러한 활성은 분자량이 증가함에 따라 감소된 IGF-I 수용체 활성화 및 혈류-뇌 장벽 수송으로 인하여 감소될 것으로 예상된다. 그러므로, PEG 분자량의 20 내지 100kDa 범위가 AD를 앓고 있는 환자의 효율적인 치료에 유용한 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체에 대한 최적의 범위로서 이해된다.
RKK, RKR 및 RRK로 이루어진 군 중에서 선택되는 단일PEG화된 IGF-I 변이체가 바람직하게 제조되고, 이때 분지형 PEG 기는 30 내지 45kDa, 바람직하게는 40 내지 45kDa(약 920 PEG 단위)의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG의 44kDa의 평균 분자량 및 IGF-I의 7.6kDa의 분자량을 기준으로, 이러한 단일PEG-IGF-I의 계산된 평균 분자량은 약 51.6kDa이다. 분자량 40kDa의 N-하이드록시석신이미딜 활성화된 분지형 PEG 에스터(mPEG2-NHS)를 사용하는 것이 특히 바람직하다(문헌[Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]; [Veronese, F. M., et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12 (1997) 197-207]; 및 미국 특허 제 5,932,462 호). 또한, PEG가 30 또는 40kDa의 평균 분자량을 갖는, 단일PEG화된 IGF-I가 바람직하게는 제조된다.
본원에서 사용되는 용어 "분자량"은 PEG의 평균 분자량을 의미한다.
하기 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 PEG화된 형태는 바람직한 생성물이고 본 발명에 따른 방법에 의해 이용가능하다:
- K68 단일PEG화된 IGF-I 변이체, 바람직하게는 RRK 또는 RKK 변이체, 보다 바람직하게는 RRK 변이체(이때, PEG 기는 20 내지 80kDa(460 내지 1840 PEG 단위)의 분자량을 갖는다);
- K65 단일PEG화된 IGF-I 변이체, 바람직하게는 RKR 또는 RKK 변이체, 보다 바람직하게는 RKR 변이체(이때, PEG 기는 20 내지 80kDa(460 내지 1840 PEG 단위)의 분자량을 갖는다);
- 이중PEG화된 IGF-I 변이체, 바람직하게는 RKK 변이체(이때, PEG 기는 각각 약 10 내지 50kDa(230 내지 1150 PEG 단위)의 분자량을 갖는다), 및 이의 혼합물;
- 40kDa의 분자량을 갖는 PEG2 기를 포함하는, K68 단일PEG화된 IGF-I 변이체, 바람직하게는 RRK 또는 RKK 변이체, 보다 바람직하게는 RRK 변이체;
- 40kDa의 분자량을 갖는 PEG2 기를 포함하는, K65 단일PEG화된 IGF-I 변이체, 바람직하게는 RKR 또는 RKK 변이체, 보다 바람직하게는 RKR 변이체;
- 단일PEG화된 IGF-I(이때, PEG 기는 20 내지 80kDa(460 내지 1840 PEG 단위)의 분자량을 갖는다);
- 이중PEG화된 IGF-I(이때, PEG 기는 각각 약 10 내지 50kDa(230 내지 1150 PEG 단위)의 분자량을 갖는다);
- 40kDa의 분자량을 갖는 PEG2 기를 포함하는, 단일PEG화된 IGF-I.
PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 실질적으로 균질하다. 제제는 소량의 비반응된(즉, PEG 기의 부족) 단백질을 함유할 수 있다. 펩티드 매핑에 의해 확인되는 바에 따르면, 변이체의 순도는 90%(w/w) 이상이다. 단일- 및/또는 이중PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 분리를 포함하여 상기 제제의 추가의 정제는 보통의 정제 방법, 바람직하게는 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 특히 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단일PEG화된"은 IGF-I 또는 IGF-I 변이체가 IGF-I 또는 IGF-I 변이체 분자 당 단지 하나의 라이신에서 PEG화되는 것을 의미한다.
"활성화된 PEG 또는 활성화된 PEG 반응 물질"은 현재의 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글라이콜)의 알콕시뷰티르산 석신이미딜 에스터("저급 알콕시-PEG-SBA"), 폴리(에틸렌 글라이콜)의 알콕시프로피온산 석신이미딜 에스터("저급 알콕시-PEG-SPA") 또는 N-하이드록시석신이미드 활성화된 PEG 같은 친전자적으로 활성화된 PEG가 사용된다. 활성화된 에스터를 아민과 반응시켜 아미드를 형성하는 임의의 통상의 방법이 사용될 수 있다. 활성화된 PEG의 IGF-I와의 반응에서, 예시되는 석신이미딜 에스터는 아미드 형성을 유발하는 이탈기이다. 단백질과의 접합체를 제조하기 위한 석신이미딜 에스터의 사용은 미국 특허 제 5,672,662 호에 개시되어 있다.
사용되는 반응 조건은 상이하게 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 상대적 양에 영향을 미친다. 반응 조건(예를 들어, 반응 물질의 비, pH, 온도, 단백질 농도, 반응 시간 등)을 미세조작함으로써, 상이한 PEG화된 종의 상대적 양을 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 이 반응은 선택적으로 30%(v/v) 이하의 에탄올을 함유하는, pH 8 내지 10의 완충된 수용액에서 수행된다. 단백질:PEG 몰비는 1:1 내지 1:6, 바람직하게는 1:2 내지 1:5이다. 반응 온도 및 반응 시간은 숙련자의 지식에 따라 변화될 수 있으며, 이때 높은 온도 및 더 긴 반응 시간은 PEG화를 증가시킨다. 따라서, 단일PEG화된 단백질이 제조되는 경우, 4℃ 내지 22℃에서 30분 이하 또는 60분 이하로 시행하는 것이 바람직하다. pH 약 9.0 내지 9.5에서 약 1:3 내지 1:4의 단백질:PEG 비 및 4℃의 반응 온도에서, 바람직하게는 5OmM 붕산 나트륨 및 25% 에탄올로 이루어진 반응 완충액에서 PEG화 반응 물질이 IGF-I 또는 IGF-I 변이체와 조합되는 경우, 단일-, 이중- 및 흔적량의 삼중-PEG화된 종의 혼합물이 단백질 중 Lys 잔기의 존재에 따라 생성된다.
본 발명에 따른 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는, IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기를 이작용성 반응 물질과 공유 결합으로 반응시켜 아미드 연결을 갖는 중간체를 형성하고, 아미드 연결을 갖는 중간체를 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜) 유도체와 공유 결합으로 반응시켜 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 전술한 방법에서, 이작용성 반응 물질은 바람직하게는 N-석신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 또는 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트이고, 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜) 유도체는 바람직하게는 요오도-아세틸-메톡시-PEG, 메톡시-PEG-비닐설폰 및 메톡시-PEG-말레이미드로 이루어진 군 중에서 선택된다.
활성화된 PEG 유도체는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Morpurgo, M., et al., J. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 363-368]에 PEG-비닐설폰에 대하여 기술되어 있다. 선형 쇄 및 분지쇄 PEG 종이 화학식 I의 화합물의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 반응 물질의 예로는 요오도-아세틸-메톡시-PEG 및 메톡시-PEG-비닐설폰이 있다. 이러한 요오도-활성화된 물질의 사용은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) pp. 147-148]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "극성 아미노산"은 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산을 가리킨다. 또한, 라이신도 극성 아미노산이지만, 라이신은 본 발명에 따라 치환되므로 배제된다. 바람직하게는, 극성 아미노산으로서 아르기닌이 사용된다.
약학 제형
본 발명에 따라 제조된 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 낮은 적용 간격으로 신체를 통한 IGF-I 수용체에의 지속적 접근을 가능케 하는 개선된 순환 안정성을 제공한다.
본 발명의 화합물은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 약학 조성물의 제조 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물의 제조를 위해, 본 발명에 따른 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 바람직하게는 약학 조성물의 목적하는 성분을 함유하는 수용액에 대한 투석 또는 여과작용에 의해 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 조합된다. 이러한 허용가능한 담체는, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Oslo et al. (e.g. pp. 1435-1712)]에 기재되어 있다. 전형적인 조성물은 효과량, 예를 들어 약 0.1 내지 100mg/ml의 본 발명에 따른 물질과 함께 적당량의 담체를 함유한다. 조성물은 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체는 바람직하게는 복강내, 피하, 정맥내 또는 비강내 적용을 통해 투여된다.
본 발명에 따른 약학 제형은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 일반적으로, PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 용액을 약학 조성물에 사용될 예정인 완충액에 대하여 투석 또는 여과작용하고, 농축 또는 희석에 의해 목적하는 최종 단백질 농도를 조정한다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부한 청구의 범위에 기재된다. 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 기재된 절차에 변형을 가할 수 있는 것으로 이해된다. 아미노산의 명칭은 1개의 문자 코드(예컨대, R) 또는 3개의 문자 코드(예컨대, Arg)를 사용하여 약기된다.
서열 목록:
서열 식별 번호: 1 - 인간 IGF-I의 아미노산 서열(스위스프로트 P01343으로부터의 아미노산 49 내지 118).
서열 식별 번호: 2 - 융합 단백질 px3036_IAG_R K27R K65R K68의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 3 - 융합 단백질 px3036_IAEE_F1 K27R K65R K68의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 4 - 융합 단백질 px3036_IAFX_F1 K27R K65R K68의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 5 - 융합 단백질 px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 6 내지 10 - 연결자.
서열 식별 번호: 11 내지 18 - 절단 서열.
서열 식별 번호: 19 내지 21 - 기타.
서열 식별 번호: 22 - 융합 단백질 px3036_IAG_R K27R K65 K68R의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 23 - 융합 단백질 px3036_IAEE_F1 K27R K65 K68R의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 24 - 융합 단백질 px3036_IAFX_F1 K27R K65 K68R의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 25 - 융합 단백질 px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R의 아미노산 서열.
서열 식별 번호: 26 - 임균(유형 2)으로부터의 IgA1 프로테아제의 아미노산 서열.
실시예 1
(화학식 I)의 프로펩티드를 갖는 하기 돌연변이(IGF-I 변이체 RRK를 포함)를 제조하였다:
돌연변이 X1 X2 n Y
Px3036_ IAG K27R K65R K68 없음 KAKRFKKH 6 PRPP
Px3036_IAG_R K27R K65R K68 없음 RARRFRRH 6 PRPP
Px3036_IAEE_F1 K27R K65R K68 S NTEHNREH 6 PRPP
Px3036_IAFX_F1 K27R K65R K68 N IEGRH 6 PRPP
Px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68 N TEFENIEH 6 PRPP
K68-단일PEG화된 IGF-I 변이체(RRK 변이체)의 제조
사용되는 발현 벡터 및 이. 콜라이 균주는 유럽 특허 제 0 972 838 호에 기재되어 있다. 선택적 아가 판에서 성장한 융합 단백질 px3036_IAG_R K27R K65R K68, px3036_IAEE_F1 K27R K65R K68, px3036_IAFX_F1 K27R K65R K68 또는 px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68을 발현하는 이. 콜라이 클론으로부터 하나의 접종 루프를 (100ml) 선택적 배지로 옮기고 37℃에서 13시간 동안 2 내지 4의 광학 밀도(578nm)로 배양하였다. 이 배양물을 다음 6시간 동안 얼음에서 저장한 후 37℃에서 수행되는 주요 배양물의 자동화된 접종을 실시하였다. IGF-I 돌연변이의 발현은 1.0mM IPTG의 첨가와 함께 50의 광학 밀도(578nm)에서 시작되었다. 전체 발효를 16시간까지 지속시켰다. 생성물의 단백질 밴드의 용적 강도를 SDS-PAGE 겔 상의 IGF 표준 밴드와 비교함으로써 밀도측정법으로 단백질 양을 결정하였다. 배 양액을 원심분리에 의해 수확하였다.
정제된 포함체(IB) 물질을 수득하기 위해, 표준 발효로부터 수확된 생물량을 다음의 절차에 따라 처리하였다: 생물량을 트리스MgSO4 완충제 pH7로 재현탁하고, 0.3g/100g 생물 건조 중량으로 보충하였다. 리소자임 및 5U/1 g 생물 건조 중량 벤조나제(Benzonase)를 20분 동안 배양하고 균질화시켰다. 30U/1 g 생물 건조 중량 벤조나제를 첨가하고 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 0.5L 브리지(Brij)-완충제/리터를 첨가하고 30분 동안 실온에서 배양하였다. 원심분리 후, 펠릿을 300ml 트리스-EDTA-완충제/100g 생물 습윤 중량(정제된 IB 습윤 중량)에서 재현탁하고, 30분 동안 실온에서 배양하고 원심분리하였다. 1g IBs/리터를 6.8M 구아니딘-HCl, 0.1M 트리스HCl, 0.1M DTT, pH 8.5에서 밤새 실온에서 가용화시켰다. 혼탁한 용액을 6.8M 구아니딘-HCl, 0.1M 트리스HCl, pH 8.0에 대하여 4℃에서 투석하였다. 투석 후, 불용성 성분을 원심분리에 의해 제거하였다. 실온에서 pro-IGF-I 용액의 0.8M 아르기닌, 0.1M 트리스HCl, 0.1M 구아니딘-HCl, 1mM GSH, 1mM GSSG, pH 8.5로의 50배 희석에 의해 중첩화(folding)를 수행하였다. 2시간 후, 용액을 2M 염화나트륨으로 보충시키고, 여과하고 10ml/분의 유속으로 HIC 컬럼(뷰틸 세파로즈 4 빠른 흐름; GE 애머샴 바이오사이언시즈(GE Amersham Biosciences))으로 적용하였고, 이는 2M NaCl, 0.8M 아르기닌, 0.1M 트리스HCl, 0.1M 구아니딘-HCl, pH 8.5를 함유하는 완충제에 의해 실온에서 평형화되었다. 기준선에 도달할 때까지 평형 완충제로 컬럼을 세척한 후 평형 완충제로 출발하여 0.1M 트리스HCl, 5% 에틸렌 글라이 콜, pH 8.5를 함유하는 완충제로 끝나는 선형 구배의 10 컬럼 용적으로 용리시켰다. 용리된 분획을 역 상 고 성능 크로마토그래피(rpHPLC)에 의해 분석하였다. 정확하게 형성된 SS-브릿지를 갖는 단백질이 함유된 분획을 풀링(pooling)하였다. 풀을 50mM 붕산 나트륨, pH 9.0에 대해 4℃에서 투석하였다. mPEG MW 20,000의 NHS 활성화된 40kDa 분지형 PEG(N-하이드록시석신이미드)(NHS) 에스터(미국 알라바마주 헌트스빌 소재의 네크타르 쉐어워터 폴리머스(Nektar Shearwater Polymers), mPEG2NHS, 미국 특허 제 5,932,462 호)를 빙냉 2mM HCL에서 가용화시키고, 투석된 단백질 용액(PEG-반응 물질/단백질의 몰비 2:1)에 즉시 첨가하였다. 얼음 위에서 1시간 및 2시간 배양 후, 동일한 양의 산성 mPEG2-NHS 용액을 단백질/PEG 반응 혼합물에 첨가하였다. 동일한 양의 산성 mPEG2-NHS 용액의 제 3 첨가 후(PEG 반응 물질의 총 6배의 몰 과량), 추가의 시간 동안 얼음 위에서 반응을 배양하였다. 고체 염화암모늄을 첨가하여 반응을 중지시키고 또다른 45분 동안 배양한 후 pH 8.0으로 조정하였다(도 1 참고). 단백질/PEG 반응 혼합물을 임균(유형 2)으로부터의 IgA1 프로테아제(w/w 비율 1:50)로 보충시키고 실온에서 밤새 배양하였다(도 2 참고). 반응 혼합물을 50mM 아세트산 pH 4.5로 1:2 희석한 후 양이온 IEC 컬럼(매크로캡(MacroCap) SP 지지체: 스웨덴 웁살라 소재의 GE 애머샴 바이오사이언시즈)에 적용하였고, 이는 50mM 아세트산에 의해 평형화되었다. 기준선에 도달할 때까지 컬럼을 세척한 후 50mM 아세트산으로 출발하여 1M 염화나트륨으로 보충된 50mM 아세트산으로 끝나는 선형 구배의 20 컬럼 용적으로 용리시켰다. 용리된 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 어림잡아 약 60kDa의 상대적 분자 크기를 갖는 단일 결합을 함유하는 분획을 K68-단일PEG화된 IGF-I로서 풀링하였다(도 3 참고). K68-단일PEG화된 IGF-I의 정체는 정적 광 산란 검출에 의한 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 트립신 소화의 MS 분석, Asp-N 소화의 MS 분석 및 분석용 양이온 IEC에 의해 확인하였다. K68-단일PEG화된 IGF-I 외에 어떠한 다른 PEG화 동종변이체도 발견될 수 없었다.
실시예 2
(화학식 I)의 프로펩티드를 갖는 하기 돌연변이(IGF-I 변이체 RKR을 포함)를 제조하였다:
돌연변이 X1 X2 n Y
Px3036_ IAG K27R K65 K68R 없음 KAKRFKKH 6 PRPP
Px3036_IAG_R K27R K65 K68R 없음 RARRFRRH 6 PRPP
Px3036_IAEE_F1 K27R K65 K68R S NTEHNREH 6 PRPP
Px3036_IAFX_F1 K27R K65 K68R N IEGRH 6 PRPP
Px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R N TEFENIEH 6 PRPP
K65-단일PEG화된 IGF-I 변이체(RKR 변이체)의 제조
사용되는 발현 벡터 및 이. 콜라이 균주는 유럽 특허 제 0 972 838 호에 기재되어 있다. 선택적 아가 판에서 성장한 융합 단백질 px3036_IAG_R K27R K65 K68R, px3036_IAEE_F1 K27R K65 K68R, px3036_IAFX_F1 K27R K65 K68R 또는 px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R을 발현하는 이. 콜라이 클론으로부터 하나의 접종 루프를 (100ml) 선택적 배지로 옮기고 37℃에서 13시간 동안 2 내지 4의 광학 밀도(578nm)로 배양하였다. 이 배양물을 다음 6시간 동안 얼음에서 저장한 후 37℃에서 수행되는 주요 배양물의 자동화된 접종을 실시하였다. IGF-I 돌연변이의 발현은 1.0mM IPTG의 첨가와 함께 50의 광학 밀도(578nm)에서 시작되었다. 전체 발 효를 16시간까지 지속시켰다. 생성물의 단백질 밴드의 용적 강도를 SDS-PAGE 겔 상의 IGF 표준 밴드와 비교함으로써 밀도측정법으로 단백질 양을 결정하였다. 배양액을 원심분리에 의해 수확하였다.
정제된 포함체(IB) 물질을 수득하기 위해, 표준 발효로부터 수확된 생물량을 다음의 절차에 따라 처리하였다: 생물량을 트리스MgSO4 완충제 pH7로 재현탁하고, 0.3g/100g 생물 건조 중량으로 보충하였다. 리소자임 및 5U/1 g 생물 건조 중량 벤조나제를 20분 동안 배양하고 균질화시켰다. 30U/1 g 생물 건조 중량 벤조나제를 첨가하고 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 0.5L 브리지-완충제/리터를 첨가하고 30분 동안 실온에서 배양하였다. 원심분리 후, 펠릿을 300ml 트리스-EDTA-완충제/100g 생물 습윤 중량(정제된 IB 습윤 중량)에서 재현탁하고, 30분 동안 실온에서 배양하고 원심분리하였다. 1g IBs/리터를 6.8M 구아니딘-HCl, 0.1M 트리스HCl, 0.1M DTT, pH 8.5에서 밤새 실온에서 가용화시켰다. 혼탁한 용액을 6.8M 구아니딘-HCl, 0.1M 트리스HCl, pH 8.0에 대하여 4℃에서 투석하였다. 투석 후, 불용성 성분을 원심분리에 의해 제거하였다. 실온에서 pro-IGF-I 용액의 0.8M 아르기닌, 0.1M 트리스HCl, 0.1M 구아니딘-HCl, 1mM GSH, 1mM GSSG, pH 8.5로의 50배 희석에 의해 중첩화를 수행하였다. 2 내지 48시간 후, 바람직하게는 2 내지 24시간 후, 용액을 2M 염화나트륨으로 보충시키고, 여과하고 10ml/분의 유속으로 HIC 컬럼(뷰틸 세파로즈 4 빠른 흐름; GE 애머샴 바이오사이언시즈)으로 적용하였고, 이는 2M NaCl, 0.8M 아르기닌, 0.1M 트리스HCl, 0.1M 구아니딘-HCl, pH 8.5를 함유하는 완 충제에 의해 실온에서 평형화되었다. 기준선에 도달할 때까지 평형 완충제로 컬럼을 세척한 후 평형 완충제로 출발하여 0.1M 트리스HCl, 5% 에틸렌 글라이콜, pH 8.5를 함유하는 완충제로 끝나는 선형 구배의 10 컬럼 용적으로 용리시켰다. 용리된 분획을 역 상 고 성능 크로마토그래피(rpHPLC)에 의해 분석하였다. 정확하게 형성된 SS-브릿지를 갖는 단백질이 함유된 분획을 풀링하였다. 풀을 50mM 붕산 나트륨, pH 9.0에 대해 4℃에서 투석하였다. mPEG MW 20,000의 NHS 활성화된 40kDa 분지형 PEG(N-하이드록시석신이미드)(NHS) 에스터(미국 알라바마주 헌트스빌 소재의 네크타르 쉐어워터 폴리머스, mPEG2NHS, 미국 특허 제 5,932,462 호)를 빙냉 2mM HCL에서 가용화시키고, 투석된 단백질 용액(PEG-반응 물질/단백질의 몰비 2:1)에 즉시 첨가하였다. 얼음 위에서 1시간 및 2시간 배양 후, 동일한 양의 산성 mPEG2-NHS 용액을 단백질/PEG 반응 혼합물에 첨가하였다. 동일한 양의 산성 mPEG2-NHS 용액의 제 3 첨가 후(PEG 반응 물질의 총 6배의 몰 과량), 추가의 시간 동안 얼음 위에서 반응을 배양하였다. 고체 염화암모늄을 첨가하여 반응을 중지시키고 또다른 45분 동안 배양한 후 pH 8.0으로 조정하였다(도 1 참고). 단백질/PEG 반응 혼합물을 임균(유형 2)으로부터의 IgA1 프로테아제(w/w 비율 1:50)로 보충시키고 실온에서 밤새 배양하였다(도 2 참고). 반응 혼합물을 50mM 아세트산 pH 4.5로 1:2 희석한 후 양이온 IEC 컬럼(매크로캡 SP 지지체: 스웨덴 웁살라 소재의 GE 애머샴 바이오사이언시즈)에 적용하였고, 이는 50mM 아세트산에 의해 평형화되었다. 기준선에 도달할 때까지 컬럼을 세척한 후 50mM 아세트산으로 출발하여 1M 염화나트륨으로 보충된 50mM 아세트산으로 끝나는 선형 구배의 20 컬럼 용적으로 용 리시켰다. 용리된 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 어림잡아 60kDa의 상대적 분자 크기를 갖는 단일 결합을 함유하는 분획을 K65-단일PEG화된 IGF-I로서 풀링하였다. K65-단일PEG화된 IGF-I의 정체는 정적 광 산란 검출에 의한 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 트립신 소화의 MS 분석, Asp-N 소화의 MS 분석 및 분석용 양이온 IEC에 의해 확인하였다.
실시예 3
생체 내 K68 단일PEG화된 IGF-I 변이체 RRK에 의한 뇌 가용성 Aβ의 감소
K68 단일 PEG화된 IGF-I 변이체 RRK(40kD, PEG2)(PEG-RRK)의 강하된 가용성 Aβ 수준에 대한 효능의 평가를 위해, 무거운 아밀로이드 플라크 하중을 갖는 9 내지 10개월된 B6.152H 마우스(인간 APP 및 PS2 돌연변이를 발현하는 이중 유전자 도입 마우스)를 5㎍/kg PEG-RRK의 2회-주 피하 주입에 의해 반복적으로 처리하였다. 피질 APP, Aβ 및 액틴 수준을 14일 후에 검출하였다. APP/액틴 비율은 PEG-RRK에 의해 상당히 변화되지 않았으며(도 4A), 이는 PEG-RRK가 14일에 걸쳐 트랜스유전자(transgene) 발현에 영향을 미치지 않음을 시사한다. 반면, Aβ/액틴(도 4B) 및 Aβ/APP(도 4C) 비율은 PEG-RRK에 의해 상당히 강하되었다. 이는 트랜스유전자에 의한 그의 생성과 관계없이, PEG-RRK의 Aβ 청소에 대한 긍정적인 효과를 가리킨다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for the production of conjugates of insulin-like growth factor-I and poly(ethylene glycol) <130> 23907 WO <140> PCT/EP2007/007540 <141> 2007-08-29 <150> EP06018170.8 <151> 2006-08-31 <160> 26 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> amino acid sequence of human IGF-I (amino acids 49-118 from SwissProt P01343) <400> 1 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <210> 2 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of fusion protein px3036_IAG_R K27R K65R K68 <400> 2 Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val 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Glu Asn Lys Gly Lys Phe Phe Val Gly Ala Thr Asp Leu Ser Val 20 25 30 Lys Asn Lys Arg Gly Gln Asn Ile Gly Asn Ala Leu Ser Asn Val Pro 35 40 45 Met Ile Asp Phe Ser Val Ala Asp Val Asn Lys Arg Ile Ala Thr Val 50 55 60 Val Asp Pro Gln Tyr Ala Val Ser Val Lys His Ala Lys Ala Glu Val 65 70 75 80 His Thr Phe Tyr Tyr Gly Gln Tyr Asn Gly His Asn Asp Val Ala Asp 85 90 95 Lys Glu Asn Glu Tyr Arg Val Val Glu Gln Asn Asn Tyr Glu Pro His 100 105 110 Lys Ala Trp Gly Ala Ser Asn Leu Gly Arg Leu Glu Asp Tyr Asn Met 115 120 125 Ala Arg Phe Asn Lys Phe Val Thr Glu Val Ala Pro Ile Ala Pro Thr 130 135 140 Asp Ala Gly Gly Gly Leu Asp Thr Tyr Lys Asp Lys Asn Arg Phe Ser 145 150 155 160 Ser Phe Val Arg Ile Gly Ala Gly Arg Gln Leu Val Tyr Glu Lys Gly 165 170 175 Val Tyr His Gln Glu Gly Asn Glu Lys Gly Tyr Asp Leu Arg Asp Leu 180 185 190 Ser Gln Ala Tyr Arg Tyr Ala Ile Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Asp Ile 195 200 205 Asn Ile Asp Gln Thr Met Asn Thr Glu Gly Leu Ile Gly Phe Gly Asn 210 215 220 His Asn Lys Gln Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Lys Gln Ala Leu Ser Gln 225 230 235 240 Asp Ala Leu Thr Asn Tyr Gly Val Leu Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu 245 250 255 Phe Ala Phe Asp Lys Gln Lys Asn Gln Trp Val Phe Leu Gly Thr Tyr 260 265 270 Asp Tyr Trp Ala Gly Tyr Gly Lys Lys Ser Trp Gln Glu Trp Asn Ile 275 280 285 Tyr Lys Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Lys Gln His Asp Asn Ala Gly 290 295 300 Thr Val Lys Gly Asn Gly Glu His His Trp Lys Thr Thr Gly Thr Asn 305 310 315 320 Ser His Ile Gly Ser Thr Ala Val Arg Leu Ala Asn Asn Glu Gly Asp 325 330 335 Ala Asn Asn Gly Gln Asn Val Thr Phe Glu Asp Asn Gly Thr Leu Val 340 345 350 Leu Asn Gln Asn Ile Asn Gln Gly Ala Gly Gly Leu Phe Phe Lys Gly 355 360 365 Asp Tyr Thr Val Lys Gly Ala Asn Asn Asp Ile Thr Trp Leu Gly Ala 370 375 380 Gly Ile Asp Val Ala Asp Gly Lys Lys Val Val Trp Gln Val Lys Asn 385 390 395 400 Pro Asn Gly Asp Arg Leu Ala Lys Ile Gly Lys Gly Thr Leu Glu Ile 405 410 415 Asn Gly Thr Gly Val Asn Gln Gly Gln Leu Lys Val Gly Asp Gly Thr 420 425 430 Val Ile Leu Asn Gln Lys Ala Asp Ala Asp Lys Lys Val Gln Ala Phe 435 440 445 Ser Gln Val Gly Ile Val Ser Gly Arg Gly Thr Leu Val Leu Asn Ser 450 455 460 Ser Asn Gln Ile Asn Pro Asp Asn Leu Tyr Phe Gly Phe Arg Gly Gly 465 470 475 480 Arg Leu Asp Ala Asn Gly Asn Asp Leu Thr Phe Glu His Ile Arg Asn 485 490 495 Val Asp Glu Gly Ala Arg Ile Val Asn His Asn Thr Asp His Ala Ser 500 505 510 Thr Ile Thr Leu Thr Gly Lys Ser Leu Ile Thr Asn Pro Asn Ser Leu 515 520 525 Ser Val His Ser Ile Gln Asn Asp Tyr Asp Glu Asp Asp Tyr Ser Tyr 530 535 540 Tyr Tyr Arg Pro Arg Arg Pro Ile Pro Gln Gly Lys Asp Leu Tyr Tyr 545 550 555 560 Lys Asn Tyr Arg Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser Gly Gly Arg Leu Asn Ala 565 570 575 Pro Met Pro Glu Asn Gly Val Ala Glu Asn Asn Asp Trp Ile Phe Met 580 585 590 Gly Tyr Thr Gln Glu Glu Ala Arg Lys Asn Ala Met Asn His Lys Asn 595 600 605 Asn Arg Arg Ile Gly Asp Phe Gly Gly Phe Phe Asp Glu Glu Asn Gly 610 615 620 Lys Gly His Asn Gly Ala Leu Asn Leu Asn Phe Asn Gly Lys Ser Ala 625 630 635 640 Gln Asn Arg Phe Leu Leu Thr Gly Gly Ala Asn Leu Asn Gly Lys Ile 645 650 655 Ser Val Thr Gln Gly Asn Val Leu Leu Ser Gly Arg Pro Thr Pro His 660 665 670 Ala Arg Asp Phe Val Asn Lys Ser Ser Ala Arg Lys Asp Ala His Phe 675 680 685 Ser Lys Asn Asn Glu Val Val Phe Glu Asp Asp Trp Ile Asn Arg Thr 690 695 700 Phe Lys Ala Ala Glu Ile Ala Val Asn Gln Ser Ala Ser Phe Ser Ser 705 710 715 720 Gly Arg Asn Val Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ile Thr Ala Thr Asp Asn 725 730 735 Ala Lys Val Asn Leu Gly Tyr Lys Asn Gly Asp Glu Val Cys Val Arg 740 745 750 Ser Asp Tyr Thr Gly Tyr Val Thr Cys Asn Thr Gly Asn Leu Ser Asp 755 760 765 Lys Ala Leu Asn Ser Phe Asp Ala Thr Arg Ile Asn Gly Asn Val Asn 770 775 780 Leu Asn Gln Asn Ala Ala Leu Val Leu Gly Lys Ala Ala Leu Trp Gly 785 790 795 800 Lys Ile Gln Gly Gln Gly Asn Ser Arg Val Ser Leu Asn Gln His Ser 805 810 815 Lys Trp His Leu Thr Gly Asp Ser Gln Val His Asn Leu Ser Leu Ala 820 825 830 Asp Ser His Ile His Leu Asn Asn Ala Ser Asp Ala Gln Ser Ala Asn 835 840 845 Lys Tyr His Thr Ile Lys Ile Asn His Leu Ser Gly Asn Gly His Phe 850 855 860 His Tyr Leu Thr Asp Leu Ala Lys Asn Leu Gly Asp Lys Val Leu Val 865 870 875 880 Lys Glu Ser Ala Ser Gly His Tyr Gln Leu His Val Gln Asn Lys Thr 885 890 895 Gly Glu Pro Asn Gln Glu Gly Leu Asp Leu Phe Asp Ala Ser Ser Val 900 905 910 Gln Asp Arg Ser Arg Leu Phe Val Ser Leu Ala Asn His Tyr Val Asp 915 920 925 Leu Gly Ala Leu Arg Tyr Thr Ile Lys Thr Glu Asn Gly Ile Thr Arg 930 935 940 Leu Tyr Asn Pro Tyr Ala Gly Asn Arg Arg Pro Val Lys Pro Ala Pro 945 950 955 960

Claims (19)

  1. a) 프로펩티드의 C-말단에 N-말단으로 연결되고 Gly-Pro가 처음 2 개의 아미노산인 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포를 배양하고;
    b) 상기 프로펩티드의 C-말단이 아미노산 -Y-Pro로 종결되고, 이때 Y가 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    c) 상기 융합 단백질을 회수하고 PEG화하고;
    d) 상기 PEG화된 융합 단백질을 임균(Neisseria gonorrhoea)으로부터 유래한 IgA 프로테아제로 절단시키고;
    e) 상기 PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 회수하는 것
    을 특징으로 하는, 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 제조 방법으로서, 상기 변이체가 다른 극성 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 라이신 27, 65 및 68(서열 식별 번호: 1을 기준으로 함)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산을 포함하는, 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    프로펩티드가 하기 화학식 2로 표시됨을 특징으로 하는 제조 방법:
    화학식 2
    Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-
    상기 식에서,
    Met는 메티오닌을 나타내고;
    X1은 결합, 세린 또는 아스파라긴이고;
    His는 히스티딘이고;
    n은 0 내지 10의 수이고;
    X2는 연결자 펩티드로서, 펩티드 서열 식별 번호: 6 내지 10으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    Pro는 프롤린이고;
    Y는 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택된다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    프로펩티드가 라이신 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    극성 아미노산이 독립적으로 아르기닌, 글루타민 또는 아스파라긴인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 라이신 잔기 65 및 68에서 단일- 또는 이중PEG화되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 아미노산 R27, R65, K68을 갖고(RRK) 상기 변이체가 라이신 잔기 68에서 단일PEG화되거나, 또는 라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 아미노산 R27, K65, R68을 갖고(RKR) 상기 변이체가 라이신 잔기 65에서 단일PEG화되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 아미노산 R27, K65, K68을 갖고(RKK) 상기 변이체가 라이신 잔기 65 및 68에서 단일- 또는 이중PEG화되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    라이신-PEG화된 IGF-I 변이체가 아미노산 R27, R65, K68을 갖는 변이체(RRK), 아미노산 R27, K65, R68을 갖는 변이체(RKR) 또는 아미노산 R27, K65, K68을 갖는 변이체(RKK)의 혼합물이고 상기 변이체가 라이신 잔기 65 및 68에서 단일- 또는 이중PEG화되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    라이신-PEG화된 IGF-I가 무작위로 단일- 또는 이중PEG화되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    PEG가 20 내지 100kDa의 총 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    폴리(에틸렌 글라이콜) 기가 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜) 기인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 라이신-PEG화된 IGF-I 또는 IGF-I 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 변이체가 다른 극성 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 라이신 27, 65 및 68(서열 식별 번호:1을 기준으로 함)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산을 포함하며, 프로펩티드의 C-말단에 N-말단으로 연결되고, Gly-Pro가 IGF-I의 처음 2 개의 아미노산이며, 상기 프로펩티드의 C-말단이 아미노산 -Y-Pro로 종결되고, 이때 Y가 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서,
    프로펩티드가 30개 이하의 아미노산 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    하기 화학식 1로 표시됨을 특징으로 하는 융합 단백질:
    화학식 1
    Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-I 또는 IGF-I 변이체]
    상기 식에서,
    IGF-I는 인간 IGF-I를 나타내고, IGF-I 변이체는 IGF-I를 나타내되, 라이신 27, 65 및 68(서열 식별 번호:1을 기준으로 함)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 아미노산은 다른 극성 아미노산에 의해 독립적으로 치환되고;
    Met는 메티오닌을 나타내고;
    X1은 결합, 세린 또는 아스파라긴이고;
    His는 히스티딘이고;
    n은 0 내지 10의 수이고;
    X2는 연결자 펩티드로서, 펩티드 서열 식별 번호: 6 내지 10으로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    Pro는 프롤린이고;
    Y는 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro 및 Pro-Arg-Pro로 이루어진 군 중에서 선택된다.
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