KR20160095133A - Peg화 단백질의 조성물을 제조하는 방법 - Google Patents

Peg화 단백질의 조성물을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 PEG화의 분야에 있다. 특히, 이는 치료 단백질을 PEG화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 근육 질환 및 장애를 치료하기 위한 이러한 PEG화 치료 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

PEG화 단백질의 조성물을 제조하는 방법 {A PROCESS FOR PREPARING A COMPOSITION OF PEGYLATED PROTEINS}
본 발명은 단백질 PEG화의 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 PEG화 IGF-1 폴리펩티드 및 그의 변이체와 같은, PEG화 치료 단백질에 관한 것이다.
단백질의 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)과의 공유 변형은 신체에서 단백질의 순환성 반감기를 연장하기에 유용한 방법인 것으로 입증된 바 있다 (Hershfield, M.S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596; Meyers, F.J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313; Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug). 이 방법은 PEG화로 알려져 있고, 이는 제약 활성 단백질의 치료 가치를 개선시키기 위한 가장 확립되어 있고 성공적으로 사용되는 기술이다 (Roberts et al., Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476; Caliceti P. et al., 2003).
단백질로의 PEG 쇄의 부착은 그의 분자량 및 유체역학 반경을 증가시키고 이는 유의한 생체내 반감기 연장을 발생시킨다. 단백질을 감싸는 PEG 쇄는 단백질에 대한 차폐 효과를 가지고, 이에 따라 접합체의 단백질분해적 분해 및 면역원성이 낮아진다. PEG화는 또한 생체분포 특성을 바꾸고, 소수성 단백질의 용해도를 유의하게 증가시킨다 (Caliceti,P. and Veronese,F.M. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv.Drug Deliv.Rev., 55, 1261., Roberts et al., Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476;)
메톡시폴리-에틸렌글리콜의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (PEG-NHS)를 사용함으로써 달성되는 커플링 화학은 위치 이소형 및 다중PEG화 형태의 복합 혼합물을 생성하는 상이한 리신 잔기 상의 접합을 일으킬 수 있다. 수년 동안 요법에 이미 사용되어 왔던 여러 접합체 (PEG-인트론(Intron)®, 페가시스(Pegasys)®, 미세라(MIRCERA)®, 소마베르트(Somavert)®)는 랜덤 PEG화 화학의 결과물이다.
랜덤 PEG화의 주요 결점은 최종 생성물의 균질성의 부족이다. 따라서 반응의 재현성에 있어서의 어려움 및 최종 생성물의 분석 특징화에 있어서의 도전과제가 예상된다.
인슐린-유사 성장 인자 (IGF)는 세포가 그의 생리적 환경과 소통하는데 사용하는 복합 시스템의 일부이다. 이 복합 시스템 (종종 인슐린-유사 성장 인자 축으로서 지칭됨)은 2개의 세포-표면 수용체 (IGF-1R 및 IGF-2R), 2개의 리간드 (IGF-1 및 IGF-2), 6개의 고-친화도 IGF-결합 단백질의 패밀리 (IGFBP 1 내지 6), 및 연관 IGFBP 분해 효소 (프로테아제)로 이루어진다. 이 시스템은 정상 생리상태의 조절뿐만 아니라 다수의 병리학적 상태에도 중요하다 (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003).
IGF 축은 세포 증식의 촉진 및 세포 사멸 (아폽토시스)의 억제에서 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. IGF-1은 인간 성장 호르몬 (hGH)에 의한 자극의 결과로서 간에 의해 주로 분비된다. 인체 내의 거의 모든 세포, 특히 근육, 연골, 골, 간, 신장, 신경, 피부 및 폐 내의 세포는 IGF-1에 의해 영향을 받는다. 인슐린-유사 효과뿐만 아니라, IGF-1은 또한 세포 성장을 조절할 수 있다. IGF-1 및 IGF-2는 IGF-결합 단백질로서 공지된 유전자 산물의 패밀리에 의해 조절된다. 이들 단백질은 IGF 수용체에 대한 결합을 방해함으로써 IGF 작용을 억제하는 것뿐만 아니라, 이 수용체로의 전달을 돕고 혈류 내에서의 IGF 반감기를 증가시킴으로써 IGF 작용을 촉진하는 것을 모두 수반하는 복잡한 방식으로 IGF 작용을 조정하는 것을 돕는다. 적어도 6개의 특징화된 결합 단백질 (IGFBP 1 내지 6)이 존재한다.
그의 성숙 형태에서, 소마토메딘으로도 불리는 인간 IGF-1은 배양물에서 광범위한 세포의 성장을 자극하는 것으로 밝혀진 70개 아미노산의 작은 단백질이다. IGF-1 단백질은 처음에 3개의 공지된 스플라이스 변이체 mRNA에 의해 코딩된다. 각각의 mRNA의 오픈 리딩 프레임은 특정한 IGF-1 mRNA에 따라 70개 아미노산 IGF-1 (서열식별번호: 1) 및 C-말단에서의 특정한 E-펩티드를 함유하는 전구체 단백질을 코딩한다. 이들 E-펩티드는 Ea (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; 서열식별번호: 2), Eb (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; 서열식별번호: 3) 및 Ec (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; 서열식별번호: 4) 펩티드로 명명되었고, 35 내지 87개 아미노산의 길이 범위이고, N-말단에 공통 서열 영역 및 C-말단에 가변 서열 영역을 포괄한다. 예를 들어, IGF-1-Ea에 대한 야생형 오픈 리딩 프레임은 리더 서열을 포함하는 135개 아미노산의 폴리펩티드 및 리더 서열을 포함하지 않는 105개 아미노산의 폴리펩티드 (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrh tdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; 서열식별번호: 5)를 코딩한다. 생리학적 발현에서, E-펩티드는 내인성 프로테아제에 의해 전구체가 절단되어 성숙한 70개 아미노산 IGF-1을 생성한다. 인간 혈청 내에서의 IGF-1의 이용가능성 및 반감기는 주로 프로테아제 및 IGF-1 결합 단백질 (IGFBP)에 의해 영향을 받고 조정된다. IGFBP는 IGF-1 활성을 억제하거나 강화시킬 수 있다 (Oh Y, et al., Characterization of the affinities of insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins 1-4 for IGF-I, IGF-II, IGF-I/insulin hybrid, and IGF-I analogs. Endocrinology. 1993 Mar;132(3):1337-44). IGF-1의 반감기를 증가시키는 전략은 선행 기술에 기재된 바 있다. 고려되었던 전략은,
(i) 세린 프로테아제에 의해 인간 혈청 내의 IGF-1의 절단을 방지하거나, 또는 IGF-1의 이용가능성 또는 혈청 반감기에 대한 IGF-1 결합 단백질의 부정적인 영향을 완화시키는 것을 목적으로 하는 특정 돌연변이를 포함하는 IGF-1 변이체의 생산 (WO200040613, WO05033134, WO2006074390, WO2007146689);
(ii) 성숙 IGF-1 단백질이 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역에 융합된 IGF-1 융합 단백질의 생산 (WO2005033134, WO200040613);
(iii) 프로테아제에 의한 IGF-1로부터의 E-펩티드의 절단이 전구체 단백질의 변형에 의해 감소된 IGF-1 전구체 단백질의 사용 (WO2007146689);
(iv) 상기 기재된 전략의 조합 ((i)/(ii) WO05033134, (i)/(ii) WO200040613, (i)/(iii) WO2007146689), 및
(v) PEG화 IGF-1 변이체의 생산 (WO2009121759, WO2008025528 및 WO2006066891)이다.
IGF-1이 불량한 약동학적 특성 (짧은 제거 반감기)을 겪기 때문에, IGF 변이체의 PEG화 버전이 제조되었다. 신경근육 장애의 치료를 위한 IGF-1 변이체의 PEG화 버전의 제조는 WO2008025528, WO2009121759 A2 및 WO2006066891에 기재되었다. 통상적으로, PEG는 단백질의 아미노 기에 부착된다. 그러나, 이 아미노 PEG화 접근법의 주요 한계는 단백질이 전형적으로 상당한 양의 리신 잔기를 함유하고, 따라서 폴리(에틸렌 글리콜) 기가 비-특이적 방식으로 단백질에 부착된다는 것이다. 생물학적 활성에 요구되는 아미노 잔기 (예를 들면, 단백질의 활성 부위 근처의 또는 그 부위에서의 잔기)의 PEG화는 단백질의 낮은 특이적 활성 또는 불활성화를 유발시킬 수 있다.
상기 기재된 결점 중 일부를 피하기 위해, WO2006066891은 IGF-1 변이체 및 1개 또는 2개의 폴리(에틸렌 글리콜) 기(들)로 이루어진 접합체의 사용을 기재하며, 이는 상기 IGF-1 변이체가 야생형 IGF-I 아미노산 서열의 위치 27, 37, 65, 68에서의 3개 이하의 아미노산에서 돌연변이된 것을 특징으로 한다. 그러나, 랜덤 PEG화를 최소화하기 위해 단백질 내로 도입된 각각의 돌연변이는 그와 동시에 면역원성의 위험을 증가시킨다. 따라서, 치료 단백질을 개발할 때 가능한 한 적은 돌연변이가 바람직하다.
WO 2008025528은 재조합 인간 IGF-I 융합 단백질의 제조를 개시하며, 여기서 상기 융합 단백질은 위치 리신 27, 65 및/또는 68에서의 아미노산 치환을 포함한다. WO2008025528에 기재된 방법은 N-말단 PEG화를 갖지 않는 재조합 인간 IGF-I 뮤테인의 제조를 가능하게 한다. WO2006066891 및 WO2008025528에서 사용된 PEG화 시약은 무작위 PEG화 단백질을 유발하는 메톡시폴리에틸렌글리콜의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (PEG-NHS)였다. N-말단 PEG화 및 위치 이성질체의 생성을 피하기 위해, 1개를 제외한 모든 리신 잔기는 극성 아미노산으로 대체되었고, 프로펩티드는 N-말단에 부착되었다. 제1 단계에서, IGF-1 뮤테인은 PEG화되었고, 그 후 프로펩티드는 IGF-1로부터 IgA 프로테아제로 절단되어 단일 리신 잔기에서만 PEG화된 IGF-1 뮤테인을 남겼다.
메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드 (PEG-CHO) 시약을 사용하는 환원성 알킬화는 일반적으로 부위 특이적 PEG화 방법으로서 알려져 있다 (Roberts et al., Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476;). N-말단 PEG화는 암젠(Amgene) 관련 특허 패밀리 (US 7090835 B2, US 6956027 B2, EP 0 822199B1)에 기재되었다. 환원성 알킬화의 반응은 5.0의 pH에서, 산성 조건 하에 수행되었다 (EP 0822199 B1). 일반적으로, PEG-CHO 시약의 핵심 특성은 산성 조건 (대략 pH 5) 하에, 알데히드 기가 다른 친핵체와 비교하여 α-아민의 보다 낮은 pKa 때문에 N-말단 α-아민에 대해 주로 선택적인 것으로 여겨진다 (Kinstler et al., 2002, Molineux, 2004).
N-말단 PEG화의 선택성은 통상적으로 보다 긴 개발 시간 및 보다 높은 비용을 수반하는 조작 방법에서 고도의 복잡성을 유발하는, 고도로 노출되고 고도로 반응성인 리신을 포함하는 단백질에 대해 상당히 감소된다.
WO2007146689에 기재된 바와 같이 IGF-1 성숙 단백질 (소마토메딘) 및 E-펩티드로 이루어진 IGF-1 전구체 변이체에서의 다양한 돌연변이는 개선된 치료 효과를 달성하기 위한 IGF-1 변이체의 테일러링을 가능하게 하였다. 돌연변이는 신체에서 더 천천히 대사되고, 그에 따라 성숙 IGF-1 펩티드보다 긴 반감기를 갖는 안정화된 분자를 발생시킨다. WO2007146689에 기재된 IGF-1 변이체의 신체로부터의 보다 느린 클리어런스는 야생형 IGF-1과 비교하여 개선된 효능을 발생시킨다. 그러나, WO2007146689에 개시된 IGF-1 전구체 변이체는 높은 수의 표면 노출된 리신 잔기를 보유하고, 상기 IGF-1 전구체 변이체의 PEG화는 모노PEG화 위치 이소형 및 상이한 분자량의 PEG화 단백질의 혼합물의 형성을 발생시킨다. 크로마토그래피 정제 방법을 적용하여 균질 생성물을 수득할 수는 있지만, PEG화 혼합물의 분리는 형태의 물리화학적 특징이 너무 유사하기 때문에 기술적 도전과제이다. 이는 낮은 최종 방법 수율을 발생시킨다. 따라서, IGF-1 전구체 단백질의 보다 선택적인 PEG화를 허용하는 개선된 방법을 개발할 필요가 존재한다.
본 개시내용의 제1 대상은 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 PEG화 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하며, 이에 의해 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인, PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 추가 실시양태는 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 단백질 분획의 적어도 65 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은
(a) 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계,
(c) 교환 크로마토그래피 단계 (b)의 용리 분획을 수득하는 단계, 및
(d) 모노-PEG화 치료 단백질을 함유하는 분획을 풀링하는 단계
를 포함하는 것인, 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 추가의 대상은 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노-PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 적어도 61%는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 IGF-1 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 것인, PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서 본 개시내용은 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물은 적어도 65 퍼센트의 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질을 포함하고, 방법은
(a) 수성 매질 중에서 IGF-1 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계,
(c) 교환 크로마토그래피 단계 (b)의 용리 분획을 수득하는 단계, 및
(d) 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질 이소형을 함유하는 분획을 풀링하는 단계
를 포함하는 것인, 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서 본 개시내용은 PEG화 (커플링 반응)를 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 수행하는 것을 특징으로 하는 상기 기재된 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 상기 기재된 PEG화 반응은 약 6.5의 pH에서 수행된다. 본 개시내용의 특정한 실시양태에서 상기 기재된 방법에 사용되는 PEG는 20 내지 100 kDa (킬로 달톤)의 전체 분자량을 갖는 선형 PEG이다. 따라서, 본 개시내용의 한 실시양태에서 상기 기재된 방법에 사용되는 선형 PEG는 약 30 kDa의 전체 분자량을 갖는다. 대안적으로, 상기 기재된 방법에 사용되는 PEG는 분지형일 수 있다. 본 개시내용의 특정한 실시양태에서 상기 기재된 방법에 적용되는 교환 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 단계이다. 마찬가지로, 본 개시내용은
b) 한외여과 (UF)/ 투석여과 (DF) 농축 및 완충제 교환,
c) 최종 여과 및 충전
의 추가의 단계를 추가로 포함하는 상기 기재된 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서 상기 기재된 방법에 따라 PEG화되는 IGF1 전구체 단백질은, 아미노산 E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되어 있으며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질이다.
본 개시내용의 한 실시양태에서 상기 기재된 방법에 따라 PEG화되는 IGF1 전구체 단백질은 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질이다.
따라서, 본 개시내용의 추가 실시양태에서 상기 기재된 방법에 따라 PEG화되는 IGF1 전구체 단백질은 서열식별번호: 55의 아미노산 서열로 이루어진 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질이다.
또 다른 실시양태에서 본 개시내용은 상기 개시된 방법에 따라 생산된 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 따라 생산된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득된 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
게다가, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서 본 개시내용은 상기 개시된 방법에 따라 생산된 모노 PEG화 IGF-1 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 따라 생산된 PEG화 IGF-1 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물에 관한 것이다.
게다가, 한 실시양태에서 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 모노 PEG화 IGF-1 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 PEG화 IGF-1 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득된 모노 PEG화 IGF-1 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 의해 수득된 PEG화 IGF-1 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 상기 개시된 조성물에 포함되는 IGF1 전구체 단백질은, 아미노산 E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되어 있으며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질이다.
게다가, 본 개시내용은 IGF1 전구체 단백질이 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인, 상기 기재된 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 개시내용은 IGF1 전구체 단백질이 서열식별번호: 55의 아미노산 서열로 이루어진 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인, 상기 기재된 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한 제약상 허용되는 형태의 상기 기재된 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용은 게다가 요법에 사용하기 위한 상기 기재된 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 상기 언급된 치료 용도는 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서의 근육 장애의 치료이다. 본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 치료 용도는 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자의 치료, 또는 COPD 환자의 치료, 또는 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA 또는 케네디병) 환자의 치료, 또는 만성 신장 질환 환자의 치료이다. 따라서, 본 개시내용은 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 수반하는 화상, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA, 케네디병) 및 만성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 추가 실시양태에서, 상기 기재된 근육 장애는 근육 위축이다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 치료 용도는 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축의 치료이다. 따라서, 본 개시내용은 근육 위축, 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물을 제공한다
본 개시내용은 게다가 치료 유효량의 상기 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자를 치료하는 방법, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자를 치료하는 방법, 또는 케네디병 환자를 치료하는 방법, 또는 만성 신장 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
게다가, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 근육 장애는 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육 위축인 방법을 제공한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 하기 측면에서 기재된다:
1. PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하며, 이에 의해 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인, PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법.
2. 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며,
여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 단백질 분획의 적어도 65 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은
(a) 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인,
모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법.
3. 실시양태 2에 있어서, 크로마토그래피 단계가 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질을 함유하는 분획을 풀링하는 것을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 단계이며, 이에 의해 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인 방법.
4. 실시양태 1-3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 치료 단백질이 인간 IGF-1 전구체 단백질 또는 그의 변이체인, 조성물을 제조하는 방법.
5. 실시양태 1-4 중 어느 한 실시양태에 있어서, PEG화 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
6. 실시양태 1-5 중 어느 한 실시양태에 있어서, PEG가 20 내지 100 kDa의 전체 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
7. 실시양태 6에 있어서, PEG가 약 30 kDa의 전체 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
8. 실시양태 2 및 4-7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 교환 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)인 방법.
9. 실시양태 2 및 4-8 중 어느 한 실시양태에 있어서,
b) 한외여과 (UF)/ 투석여과 (DF) 농축 및 완충제 교환,
c) 최종 여과
의 추가의 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 실시양태 3-9 중 어느 한 실시양태에 있어서, IGF1 전구체 단백질이, 아미노산 E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되어 있으며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 방법.
11. 실시양태 10에 있어서, IGF1 전구체 단백질이 서열식별번호: 55로 이루어진 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 방법.
12. 실시양태 1 및 5-7 중 어느 한 실시양태의 방법에 따라 생산된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
13. 실시양태 2 및 5-9 중 어느 한 실시양태의 방법에 따라 생산된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
14. 실시양태 1 및 5-7 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 수득가능한 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
15. 실시양태 2 및 5-9 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 수득가능한 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
16. 실시양태 1 및 5-7 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 수득된 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
17. 실시양태 2 및 5-9 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 수득된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
18. 실시양태 10 또는 11의 방법에 따라 생산된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물.
19. 실시양태 10 또는 11의 방법에 의해 수득가능한 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물.
20. 실시양태 10 또는 11의 방법에 의해 수득가능한 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물.
21. 실시양태 10 또는 11의 방법에 의해 수득된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물.
22. 실시양태 10 또는 11의 방법에 의해 수득된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물.
23. 실시양태 18-22 중 어느 한 실시양태에 있어서, IGF1 전구체 단백질이,아미노산 E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되어 있으며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 조성물.
24. 실시양태 23에 있어서, IGF1 전구체 단백질이 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 조성물.
25. 실시양태 12-24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 제약상 허용되는 형태인 조성물.
26. 요법에 사용하기 위한 실시양태 1-11 중 어느 한 실시양태의 방법에 의해 수득된 PEG화 치료 단백질을 포함하는 제약 조성물.
27. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
28. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
29. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
30. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA 또는 케네디병) 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
31. 실시양태 25 또는 26에 있어서, 만성 신장 질환 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
32. 실시양태 27에 있어서, 근육 장애가 근육 위축인 제약 조성물.
33. 실시양태 32에 있어서, 근육 위축이 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
34. 치료 유효량의 실시양태 25 또는 26의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애를 치료하는 방법.
35. 치료 유효량의 실시양태 25 또는 26의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자를 치료하는 방법.
36. 치료 유효량의 실시양태 25 또는 26의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자를 치료하는 방법.
37. 치료 유효량의 실시양태 25 또는 26의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA 또는 케네디병) 환자를 치료하는 방법.
38. 치료 유효량의 실시양태 25 또는 26의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 신장 질환 환자를 치료하는 방법
39. 실시양태 32에 있어서, 근육 장애가 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육 위축인 방법.
도 1: PEG화 IGF-1Ea의 제조 방법을 설명하는 방법 흐름도. 방법은 PEG화 반응, 양이온-교환 정제 단계 (CEX), 완충제 교환 및 농축 단계 (UF/DF) 및 최종 여과 및 충전 단계로 구성된다.
도 2: 모노PEG-IGF1 이소형의 부분적 분리를 위한 정제용 CEX 크로마토그램. 1: N-말단 PEG화 IGF-1Ea 형태; 2, 3 및 4: Lys-PEG화 IGF-1Ea 형태. 넘버링된 화살표는 크로마토그램 상의 풀링된 분획의 위치를 나타낸다. 1, 2, 3 및 4로 지정된 풀은 크로마토그램 상에 화살표로 표시된 시점에 용리된 분획의 풀링을 사용하여 제조되었다.
도 3: 모노PEG-IGF1 이소형의 정제용 CEX 단리로부터 풀링된 물질의 CE-HPLC 분석. N: N-말단 PEG화 IGF-1Ea 형태; 리신 1, 리신 2, 리신 2a 및 리신 3: Lys-PEG화 IGF-1Ea 형태.
도 4: 토요펄(Toyopearl) SP650S 상 분리의 정제용 CEX 크로마토그램.
도 5: SP 세파로스(Sepharose) HP 상 분리의 CEX 크로마토그램.
일반적 정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
약: 용어 "약"은 대체로, 대략, 쯤, 또는 가까이에를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 경계를 기재된 수치 값 초과 및 미만으로 확장함으로써 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치를 5 퍼센트 위 또는 아래 (더 높은 또는 더 낮은) 편차만큼 언급된 값 초과 및 미만으로 변형시키기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, 용어 약 6.5의 pH에서는 6.3 내지 6.8의 pH 범위를 포함할 것이다. 본원에 사용된, 및 반면에 규정되지 않으면, 단어 "또는"은 특정한 목록 중 어느 하나의 구성원을 의미한다. 어구 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에는 6.3 내지 7.9의 pH 범위를 포함할 것이다.
포함하는: 용어 "포함하는"은 "포함하는"을 의미하고, 예를 들면 X를 "포함하는" 조성물은 독점적으로 X로 이루어질 수 있거나, 또는 추가의 것, 예를 들면 X + Y를 포함할 수 있다.
IGF-1 단백질 변이체: 적어도 1개의 아미노산이 IGF-1 야생형 서열과 상이한 단백질이고, 여기서 용어 "야생형 서열"은 적어도 하나의 자연 발생 유기체에서 이용가능한 폴리펩티드 또는 유전자 서열 또는 변경되거나, 돌연변이되거나, 인간에 의해 달리 조작되지 않은 폴리펩티드 또는 유전자 서열 (서열식별번호: 1의 단백질 서열에 의해 특정된다면 인간 IGF-1 야생형 서열)을 지칭한다. IGF-1 변이체는 또한 펩티드 리더 서열을 포함하는 프로-IGF-1 단백질 또는 IGF-1 전구체 단백질이다. 상기 기재된 바와 같은 IGF-1 변이체는 이러한 단백질이 야생형 IGF-1의 기능적 등가물로서 간주될 수 있다는 의미에서 그의 생물학적 활성을 보유한다. IGF-1 야생형 단백질의 기능적 등가물은 IGF-1 수용체 단백질에 대해 특정 친화도를 갖는다.
IGF-1 단백질에 관한 기능적 등가물은 자연 또는 인공 돌연변이를 포함하는 IGF-1 단백질로서 이해되어야 한다. 돌연변이는 IGF-1 단백질의 생물학적 활성을 감소시키지 않는 1개 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 치환일 수 있다. 기능적 등가물은 IGF-1 야생형 단백질, 예를 들면 인간 IGF-1 단백질 서열식별번호: 1에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 초과, 매우 특히 바람직하게는 적어도 98% 동일성 - 그러나 100% 미만의 동일성을 갖는다. 융합 단백질의 경우, 100% 동일성은 이러한 융합 단백질의 IGF-1 부분에 기초해서만 정의될 것이다.
인슐린 유사 성장 인자 (IGF)는 세포가 그의 생리학적 환경과 소통하기 위해 사용하는 복합 시스템의 일부이다. 이 복합 시스템 (종종 인슐린-유사 성장 인자 축으로 지칭됨)은 2개의 세포-표면 수용체 (IGF-1R 및 IGF-2R), 2개의 리간드 (IGF-1 및 IGF-2), 6개의 고-친화도 IGF-결합 단백질의 패밀리 (IGFBP 1 내지 6), 및 연관 IGFBP 분해 효소 (프로테아제)로 이루어진다. 이 시스템은 정상 생리상태의 조절뿐만 아니라 다수의 병리학적 상태에도 중요하다 (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003). IGF 축은 세포 증식의 촉진 및 세포 사멸 (아폽토시스)의 억제에서 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. IGF-1은 인간 성장 호르몬 (hGH)에 의한 자극의 결과로서 간에 의해 주로 분비된다. 인간 신체 내의 거의 모든 세포, 특히 근육, 연골, 골, 간, 신장, 신경, 피부 및 폐 내의 세포는 IGF-1에 의해 영향을 받는다. 인슐린-유사 효과뿐만 아니라, IGF-1은 또한 세포 성장을 조절할 수 있다. IGF-1 및 IGF-2는 IGF-결합 단백질로서 공지된 유전자 생성물의 패밀리에 의해 조절된다. 이들 단백질은 IGF 수용체에 대한 결합을 방해함으로써 IGF 작용을 억제시키는 것뿐만 아니라 이 수용체로의 전달을 돕고 혈류 내에서의 IGF 반감기를 증가시킴으로써 IGF 작용을 촉진하는 것을 모두 수반하는 복잡한 방식으로 IGF 작용을 조절하는 것을 돕는다. 적어도 6개의 특징화된 결합 단백질 (IGFBP1-6)이 존재한다. IGF-1은 광범위한 치료 용도에서 사용된다. 메카세르민 (상표명 인크렐렉스(Increlex)TM)은 성장 부전의 치료를 위해 승인된 IGF-1의 합성 유사체이다. 여러 회사는 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 근위축성 측삭 경화증, 중증 화상 손상 및 근긴장성 근육 이영양증을 비롯한 다양한 추가의 적응증에 대해 임상 시험에서 IGF-1을 평가하였다.
명료성 및 일관성을 위해, 본 출원에 걸쳐서 및 청구범위에서 IGF-1 전구체 또는 성숙 단백질 내의 아미노산의 잔기의 넘버링은 신호 펩티드가 없는 인간 인슐린-유사 성장 인자 1 (소마토메딘 C), 이소형 CRA_c (수탁 번호 EAW97697) (즉, 서열식별번호: 5)의 야생형 전구체 단백질 서열 넘버링에 기초한다.
PEG: 본 개시내용의 문맥에서 사용될 때 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다.
PEG-CHO는 메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드 시약 (예를 들면, NOF 코포레이션(NOF Corporation) (일본)으로부터 구입한 선브라이트(SUNBRIGHT) ME-300AL 또는 닥터 레디스 (EU) 리미티드(Dr Reddy's (EU) Limited)로부터 구입한 30 kDa mPEG 프로피온알데히드)을 지칭한다.
용어 "고차 PEG 형태", "고차 PEG화 형태", "고차 PEG화 변이체" 또는 "디-, 트리- 또는 그 보다 높은 PEG화 형태"는 1개 초과의 PEG 분자 (예를 들면, 2개, 3개, 또는 그 초과의 PEG 분자)가 부착된 단백질 (디-, 트리- 또는 그 보다 높은 PEG화 단백질)을 기재하는데 사용된다. 용어 "모노-PEG화"은 주어진 단백질에 단일 PEG 분자가 단독으로 PEG화 방법 동안 부착된 상황을 기재하는데 사용된다.
"PEG화 반응", "PEG화" 또는 "PEG화 방법"은 또 다른 분자에 대한, 본 발명의 문맥에서는 인간 IGF-1 전구체 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체 쇄의 공유 부착 방법을 지칭한다.
전구체: 다음에서, 용어 "전구체"는 본 발명의 문맥에서 사용될 때, 신호 펩티드가 없지만 각각 Ea, Eb 및 Ec 펩티드를 포함하는 성숙 인간 IGF-1 단백질의 전구체를 지칭한다.
환원성 알킬화: 용어 "환원성 알킬화"는 환원제의 존재 하에 카르보닐 기 및 아미노 기가 아민으로 전환되는 반응을 지칭한다. 이 반응은 다년간 알려져 있었고, 이는 아민을 생성하기 위한 가장 중요한 방법이라고 간주된다.
PEG화의 경우에, PEG-CHO 시약은 온화한 환원 조건 하에 단백질의 아미노 기와 반응한다. 반응은 2 단계, 축합 및 환원으로 진행된다. 제1 단계에서 불안정한 쉬프 염기가 형성되며, 이는 후속적으로 시약과 단백질 사이의 안정한 2급 아민 결합으로 환원된다:
단계 I: 축합
CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CHO + NH2(N-term.)-Prot ↔ CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH=N(Nterm.)-Prot
단계 II: 환원
CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH=N(Nterm.)-Prot → CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2NH-Prot
단백질 변형을 위해, 온화한 환원제, 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드가 통상적으로 단백질에서 본래 디술피드 결합의 동시 환원을 피하는데 선택된다.
치료 단백질: 용어 "치료 단백질(들)"은 인간 또는 수의학적 요법에 사용하기 위한 단백질(들)을 지칭하고, 단기 또는 장기 투여를 위해 의도될 수 있다. 특히, "치료 단백질"은 질환 또는 병리학적 상태를 갖는 포유동물의 치료에 사용되는 단백질이다.
본 발명은 매우 재현가능한 방식의 PEG화 치료 단백질의 제조 및 정제를 기재한다. 생성물은 N-말단 또는 리신 아미노 기에 부착된 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 갖는 모노-PEG화 단백질이다.
본 발명은 개선된 선택성을 갖는 치료 단백질의 PEG화를 위한 절차를 제공한다. PEG화 동안 사용되는 조건은 PEG화 치료 단백질 변이체의 프로파일을 변경하거나 조정하고 또한 고차 PEG화 단백질 변이체의 양을 감소시키는 능력을 제공한다. 반응을 바람직한 접합체로 향하게 하는 파라미터는 PEG화 혼합물의 pH이다. 놀랍게도, PEG화 혼합물 내에 α-시클로덱스트린 (α-CD)을 첨가하는 것은 반응 속도를 상당히 감소시키고, 이에 따라 고차 PEG화 형태의 형성을 상당히 감소시킨다. 게다가 α-CD는 PEG화 반응의 속력을 떨어뜨림으로써 그의 보다 우수한 제어를 가능하게 한다. PEG화 조건은 방법의 고수율 및 높은 재현성을 보장한다.
본 개시내용은 리신 (Lys) 및 N-말단 PEG화 이소형 사이의 부분적 분리를 달성하고 최종 모노-PEG화 생성물에서 PEG화 이소형의 조성에 대한 제어를 가능하게 하는 방식으로 크로마토그래피 단계 (예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX))를 사용하는 정제/단리 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서 본 개시내용은 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 상기 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 것인, PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가 실시양태에서 본 개시내용은 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 단백질 분획의 적어도 65 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은
(a) 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 교환 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계,
(c) 교환 크로마토그래피 단계 (b)의 용리 분획을 수득하는 단계, 및
(d) 모노-PEG화 치료 단백질을 함유하는 분획을 풀링하는 단계
를 포함하는 것인, 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 방법에 따라 생산된 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 따라 생산된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득된 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
게다가, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 의해 수득가능한 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 개시내용의 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 수득된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물에 관한 것이다.
상기에 언급된 치료 단백질은 성장 인자일 수 있다. 성장 인자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 비제한적으로 아드레노-메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형태발생 단백질 (BMP), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 표피 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간세포암-유래 성장 인자 (HDGF), 이동-자극 인자, 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF) 및 다른 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 종양_괴사_인자-알파_(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), Wnt 신호전달 경로 태반 성장 인자 (PlGF), 소 태아 소마토트로핀 (FBS), 인터류킨 2- (IL2), IL3-, IL4-, IL5-, IL6-, IL7-성장 인자를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 매우 재현가능한 방식의 PEG화 인슐린-유사 성장 인자-1 또는 인슐린-유사 성장 인자-1 Ea 변이체 (IGF-1Ea)와 같은 그의 변이체의 제조 및 정제에 관한 것이다. 생성물은 N-말단 또는 리신 아미노 기에 부착된 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 갖는 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질 (예를 들면, IGF-1Ea)이다.
본 발명은 개선된 선택성을 갖는 IGF-1 또는 IGF-1Ea와 같은 그의 변이체의 PEG화를 위한 절차를 제공한다. PEG화 동안 사용되는 조건은 PEG화 IGF-1 또는 IGF-1Ea 전구체 단백질과 같은 그의 변이체의 프로파일을 변경하거나 조정하고 또한 고차 PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질 형태의 양을 감소시키는 능력을 제공한다. 반응을 바람직한 접합체로 향하게 하는 파라미터는 PEG화 혼합물의 pH이다. 놀랍게도, PEG화 혼합물 중에 α-시클로덱스트린 (α-CD)을 첨가하는 것은 반응 속도를 상당히 감소시키고, 이에 따라 고차 PEG화 IGF-1 형태 또는 IGF-1Ea 전구체 단백질과 같은 그의 변이체의 형성을 상당히 감소시킨다. 게다가 α-CD는 PEG화 반응의 속력을 떨어뜨림으로써 그의 보다 우수한 제어를 가능하게 한다. PEG화 조건은 방법의 고수율 및 높은 재현성을 보장한다.
본 발명은 또한 리신 (Lys) 및 N-말단 PEG화 이소형 사이의 부분적 분리를 달성하고 최종 모노-PEG화 생성물에서 PEG화 이소형의 조성에 대한 제어를 가능하게 하는 방식으로 크로마토그래피 단계 (예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX))를 사용하는 정제/단리 방법을 기재한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 PEG화 방법으로부터 직접 수득된 PEG화 인간 IGF-1 단백질 또는 IGF-1Ea 전구체 단백질과 같은 그의 변이체의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 hIGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 hIGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질인 조성물을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 PEG화 방법으로부터 직접 수득된 PEG화 인간 IGF-1 단백질 또는 IGF-1Ea 전구체 단백질과 같은 그의 변이체의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노 PEG화 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질이고, 고차 PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 양은 모든 PEG화 IGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질의 20% 미만, 또는 19% 미만, 또는 18% 미만, 또는 17% 미만인 조성물을 제공한다.
PEG화 방법으로부터 생성된 반응 혼합물 중에 존재하는 모노-PEG화 및 고차 PEG화 IGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 역상 HPLC 방법에 의해 결정될 수 있다 (Park et al., Journal of Chromatography A, 1216, (2009), 7793-7797, Seely el al., BioPharm Int, (2005) 1-7).
PEG화 방법으로부터 생성된 반응 혼합물 중에 존재하는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC (CE-HPLC) 방법에 의해 결정될 수 있다 (Wang et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 17 (2002), 547-570, Monkarsh et al., Anal Biochem, 247, (1997), 434-440).
따라서, 본 발명은 또한 PEG화 방법으로부터 직접 수득된 PEG화 인간 IGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물의 상기 모노 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획은 적어도 66 퍼센트의 N-말단 모노-PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 함유하는 것인 조성물을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 또한 PEG화 방법으로부터 직접 수득된 PEG화 인간 IGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물의 상기 모노 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획은 적어도 66 퍼센트의 N-말단 모노-PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 함유하며, 고차 PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 양은 모든 PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 20% 미만인 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서 상기 기재된 조성물에 포함된 인간 IGF-1 전구체 단백질에 부착된 PEG는 선형 또는 분지형이고, 20 내지 100 kDa, 또는 20 내지 80 kDa, 또는 20 내지 70 kDa, 또는 20 내지 60 kDa, 또는 20 내지 50 kDa의 전체 분자량을 갖는다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 약 30 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEG로 PEG화된 인간 IGF-1 단백질, 예를 들면 IGF-1Ea 전구체 단백질을 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 분자는 Ea, Eb, Ec 펩티드를 포함하는 야생형 인간 IGF-1 전구체 단백질일 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 조성물에 포함된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 분자는 Ea, Eb, Ec 펩티드를 포함하는 인간 IGF-1 전구체 단백질의 돌연변이된 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명은 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질을 포함하는 상기 기재된 조성물이며, 여기서 모노 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67, 또는 적어도 68, 또는 적어도 69 또는 적어도 70 퍼센트 또는 그 초과는 N-말단에서 모노-PEG화되고, G1, P2, E3, R36, R37, G42, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 및/또는 M105로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 1개 이상의 아미노산은 돌연변이되고/거나 결실되며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 조성물을 제공한다.
게다가, 본 발명은 모노-PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 적어도 70 퍼센트, 또는 적어도 80 퍼센트, 또는 적어도 90 퍼센트, 또는 적어도 91 퍼센트, 또는 적어도 92 퍼센트, 또는 적어도 93 퍼센트, 또는 적어도 94 퍼센트, 또는 적어도 95 퍼센트, 또는 적어도 96 퍼센트, 또는 적어도 97 퍼센트, 또는 그 초과의 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질을 포함하고, G1, P2, E3, R36, R37, G42, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 및/또는 M105로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 1개 이상의 아미노산은 돌연변이되고/거나 결실되며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 조성물을 제공한다.
이러한 분자의 예는 하기 폴리펩티드 변이체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
아미노산(들)이 하기와 같은, 인간 IGF-1Ea-펩티드 전구체 단백질을 포함하는 폴리펩티드:
(1) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(2) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(3) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(4) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(5) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(6) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(7) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(8) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(9) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(10) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(11) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(12) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 Q104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(13) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(14) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(15) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(16) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(17) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(18) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(19) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(20) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(21) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(22) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(23) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(24) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(25) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(26) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(27) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(28) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(29) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(30) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(31) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(32) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(33) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(34) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(35) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(36) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(37) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(38) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(39) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(40) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(41) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 Q104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(42) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(43) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(44) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(45) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(46) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(47) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(48) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(49) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(50) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(51) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(52) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72 72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(53) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(54) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(55) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(56) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(57) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(58) G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
또 다른 실시양태에서 본 개시내용은 폴리펩티드 (1)-(58)을 포함하는 상기 기재된 단백질이며, 상기 분자에서 위치 1-3에서 돌연변이되는 대신에 아미노산 E3이 단독으로 결실된 단백질에 관한 것이다.
이러한 분자의 예는 하기 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
아미노산(들)이 하기와 같은, 인간 IGF-1Ea-펩티드 전구체 단백질을 포함하는 폴리펩티드:
(59) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(60) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(61) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(62) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(63) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(64) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(65) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(66) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(67) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
(68) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(69) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(70) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 Q104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(71) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(72) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(73) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(74) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(75) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(76) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(77) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(78) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(79) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(80) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(81) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(82) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(83) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(84) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(85) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(86) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(87) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(88) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(89) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(90) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(91) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(92) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(93) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(94) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(95) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(96) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
(97) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(98) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(99) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 치환되거나 결실되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 Q104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(100) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(101) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(102) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(103) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(104) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(105) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(106) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(107) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(108) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(109) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(110) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(111) E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
(112) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(113) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(114) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(115) E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
(116) E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
또 다른 실시양태에서 본 개시내용은 하기 아미노산으로 이루어진 돌연변이된 E-펩티드를 포함하는, 상기 기재된 바와 같이 PEG화된 인간 IGF-1 전구체 변이체 (예를 들면, 폴리펩티드 변이체 1-116)를 포함하는 상기 기재된 조성물에 관한 것이다:
Figure pct00001
한 실시양태에서, 본 발명은 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 포함하는 상기 기재된 조성물이며, 여기서 인간 IGF-1Ea 전구체 폴리펩티드는 상기 인간 IGF-1Ea 전구체 폴리펩티드 변이체 63에 기재된 돌연변이를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 포함하는 상기 기재된 조성물이며, 여기서 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 것인 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 포함하는 상기 기재된 조성물을 제공하며, 여기서 인간 IGF-1Ea 전구체 폴리펩티드는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 또한 PEG화 방법으로부터 직접 수득된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 상기 기재된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노 PEG화 분획의 적어도 64 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질이며, 인간 IGF-1Ea 전구체 폴리펩티드는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물에 관한 것이다.
PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 상기 기재된 조성물로서, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물은 수성 매질 중에서 상기 IGF-1 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면 선형 PEG와 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
추가 실시양태에서 본 개시내용은 본원에 기재된 PEG화 방법으로부터 직접 생성된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물로서, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물이며, 수성 매질 중에서 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 상기에 기재된 조성물은, 수성 매질 중에서 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키며, 여기서 커플링 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 수득된다.
따라서, 또 다른 특정한 실시양태에서 본 개시내용은 본원에 기재된 PEG화 방법으로부터 직접 생성된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 상기 기재된 조성물로서, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물이며, 수성 매질 중에서 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키며, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법으로부터 수득가능한 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 추가의 실시양태에서 상기 기재된 환원성 알킬화 반응은 약 6.5의 pH에서 수행된다.
특정한 실시양태에서, 상기에 기재된 조성물은 수성 매질 중에서 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키며, 여기서 커플링 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 약 6.5의 pH에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법으로부터 수득가능하다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태는 PEG화 방법으로부터 직접 생성된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노 PEG화 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 IGF-1 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5의 pH에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 것인, PEG화 방법으로부터 직접 생성된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서 본 개시내용은 PEG화 방법으로부터 직접 생성된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물의 모노 PEG화 분획의 적어도 61 퍼센트, 또는 적어도 62 퍼센트, 또는 적어도 63 퍼센트, 또는 적어도 64 퍼센트, 또는 적어도 65, 또는 적어도 66, 또는 적어도 67 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 IGF-1 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 것인, PEG화 방법으로부터 직접 생성된 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
α-시클로덱스트린 (α-CD)은 1 내지 5 % 범위의 최종 농도 (1 내지 5 g / 100 ml)로 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 고체 α-CD는 반응 혼합물에 3 % 이하의 최종 농도로 첨가되었다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 사용되는 PEG는 선형이고, 20 내지 100 kDa, 또는 20 내지 80 kDa, 또는 20 내지 70 kDa, 또는 20 내지 60 kDa, 또는 20 내지 50 kDa의 전체 분자량을 갖는다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 사용되는 PEG는 선형 PEG이고, 약 30 kDa의 전체 분자량을 갖는다. 상기 기재된 바와 같이 사용되는 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다.
상기 기재된 방법은 상기 기재된 PEG화 단계로부터 직접 생성된 단백질의 PEG화 단백질 또는 목적하는 단백질 분획의 추가 정제, 분리, 풍부화를 허용하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 실현가능한 기술을 알고 있다 (Fee et al., Chemical Engineering ScienceChemical Engineering Science, 61 (2006) 924-939), Pabst et al., Journal of Chromatography A, 1147 (2007) 172-182, Lee et al., Pharmaceutical Research, 20 2003 818-85). 특정한 실시양태에서 이들 추가의 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)일 수 있다 (Yun et al., Journal of Biotechnology, 118 (2005) 67-74, Jevsevar et al., Biotechnol. J., 5 (2010) 113-128, Molineux, Current Pharmaceutical Design, 10 (2004) 1235-1244), Baker et al., Bioconjugate Chem. 17 (2006) 179-188). 본 발명은 또한 리신 (Lys) 및 N-말단 PEG화 이소형 사이의 부분적 분리를 달성하고 최종 모노-PEG화 생성물에서 PEG화 이소형의 조성에 대한 제어를 가능하게 하는 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)를 사용하는 정제/단리 방법을 기재한다.
놀랍게도, 상기에 기재된 본 발명의 방법 조건 하에, α-CD의 PEG화 혼합물로의 첨가는 고차 PEG화 형태의 형성을 감소시키고, 또한 PEG화 반응을 느리게 한다. α-CD의 PEG화 혼합물로의 첨가는 고차 PEG화 형태의 양을 감소시키고, 크로마토그래피 정제를 단순화시키고, 그에 따라 단순화된 크로마토그래피 정제로 인한 보다 높은 수율을 보장한다. PEG화 방법에 첨가된 α-CD는 로트 간의 일관성을 향상시키고, 방법의 고수율 및 높은 재현성을 보장한다. 로트 간의 일관성은 또한 리신-PEG화 및 N-말단 PEG화 이소형의 부분적 분리가 달성되는 방식으로 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계에 의해 제어된다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태는 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물은 적어도 70 퍼센트, 또는 적어도 80 퍼센트, 또는 적어도 90 퍼센트, 또는 적어도 91 퍼센트, 또는 적어도 92 퍼센트, 또는 적어도 93 퍼센트, 또는 적어도 94 퍼센트, 또는 적어도 95 퍼센트, 또는 적어도 96 퍼센트, 또는 적어도 97 퍼센트, 또는 그 초과의 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질을 포함하고, 방법은
(a) 수성 매질 중에서 IGF-1 전구체 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 약 6.5의 pH 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 교환 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계,
(c) 교환 크로마토그래피 단계 (b)의 용리 분획을 수득하는 단계, 및
(d) 모노-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질 이소형을 함유하는 분획을 풀링하는 단계
를 포함하는 것인, 모노 PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 상기 기재된 단계 (b)는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)이다.
마찬가지로, 상기 기재된 교환 크로마토그래피 단계 (b), 예를 들면 CEX뿐만 아니라, 하기 농축/정제 단계가 상기 기재된 방법에 추가될 수 있다:
(e) UF/DF 농축 및 완충제 교환
한외여과 및 투석여과 단계는 CEX 크로마토그래피 완충제를 농축시키고 최종 완충제로 교환하기 위한 목적으로 수행된다 (실시예 4; UF/DF 단계, 멸균 여과 및 충전).
(f) 최종 여과 및 충전 (실시예 4)
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 상기 기재된 방법 단계 (a) 내지 (d) 및 (a) 내지 (f)를 수행함으로써 수득된 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질을 90 퍼센트 초과로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 각각 단계 (a) 내지 (d) 및 (a) 내지 (f)를 포함하는 상기에 기재된 방법은 (상기 기재된 바와 같이) 변이체 63 모노 PEG화 인간 IGF-1Ea 전구체 단백질의 조성물을 제조하기 위해 이용된다.
따라서, 본 개시내용의 한 실시양태는 각각 단계 (a) 내지 (d) 및 (a) 내지 (f)를 포함하는 상기 개시된 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 서열식별번호: 55의 단백질 서열로 이루어진 모노 PEG화 인간 IGF-1Ea 전구체 단백질의 조성물을 제조하기 위해 이용된다.
상기 개시된 PEG화 공정/방법에 따라 생산된 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질을 포함하는 상기 기재된 조성물은 추가로 제약상 허용되는 형태로 가공될 수 있다. 통상의 기술자는 선행 기술에 이용가능한 적절한 제제화 기술을 알고 있다.
따라서, 본 개시내용은 서열식별번호: 55의 N-말단 또는 리신 잔기 모노-PEG화 인간 IGF-1Ea 전구체 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 생산하는 방법으로,
(a) 수성 매질 중에서 서열식별번호: 55의 인간 IGF-1Ea 전구체 폴리펩티드를 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계, 및
(b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 교환 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계,
(c) 교환 크로마토그래피 단계 (b)의 용리 분획을 수득하는 단계, 및
(d) 모노-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질 이소형을 함유하는 분획을 풀링하는 단계, 및
(e) 제약 조성물의 제조를 위해 단계 (d)에서 수득된 분획을 사용하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
크로마토그래피 정제
모노-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질은 강한 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피에 의해 잉여량의 시약, 반응 부산물 및 비-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질로부터 정제된다. 정제는 칼럼 상의 모노-PEG화 IGF-1Ea의 체류를 여전히 가능하게 하고, 그와 동시에 리신 및 N-말단 모노-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질 사이의 적어도 부분적 분리를 달성하기에 충분히 높은 pH에서 수행된다. 6.5 내지 7.5의 pH 범위가 분리에 가장 적절한 것으로 결정되었다. 따라서, 본 개시내용은 크로마토그래피 정제 단계 (예를 들면, 상기 단계 (b))가 약 6.5의 pH에서 수행되는 상기 기재된 방법에 관한 것이다.
대안적으로, UF/DF 농축, 완충제 교환, 및 여과와 같은 추가의 단계는 단계 (e)의 제약 조성물의 제조 전에 상기 기재된 방법에 적용될 수 있다.
개시된 방법에 따라 생산된 모노-PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 포함하는 생성된 제약 조성물은 요법에 사용될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한, 특히 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서의 근육 장애 치료에 있어 치료 용도를 위한 제약상 허용되는 형태의 모노-PEG화 인간 IGF-1 전구체 단백질을 포함하는 상기 언급된 특정한 신규 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 특정한 실시양태에서, 치료 용도는 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자의 치료 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자의 치료, 또는 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA 또는 케네디병) 환자의 치료, 또는 만성 신장 질환 환자의 치료이다.
특히 바람직한 실시양태에서 본 개시내용은 상기 기재된 방법에 따라 제조된 서열식별번호: 55로 이루어진 N-말단 및 리신 잔기 모노 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질의 혼합물을 적어도 95 퍼센트, 또는 그 초과로 포함하는 조성물을 사용함으로써 제조된 그러한 제약 조성물의 요법에서의 상기 명시된 제약 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 게다가 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 N-말단 잔기 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 포함 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 조성물을 포함하는 N-말단 잔기 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 포함 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자를 치료하는 방법, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자를 치료하는 방법, 또는 케네디병 환자를 치료하는 방법, 또는 만성 신장 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
아미노산 돌연변이
상기 언급한 바와 같이, 다양한 아미노산이 또 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 그러나 다른 아미노산, 예컨대 비-천연 아미노산 또는 또 다른 군 (즉, 극성, 산성, 염기성 또는 비-극성)으로부터의 천연 아미노산이 사용될 수 있다. 단백질의 아미노산 내로 돌연변이를 도입하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다. 방법은 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 수행한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한 폴리펩티드 기능적 활성 변이체 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA의 증폭 및 필요한 경우 어셈블리 PCR에 의한 단편의 조립 또는 상업적으로 입수가능한 키트, 예컨대 "퀵체인지(QuikChange).TM. 부위-지정 돌연변이유발 키트" (스트라타진(Stratagene))를 사용하는 돌연변이의 도입을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 문헌 [Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다. 추가로, 돌연변이된 서열은 상업적 회사 (예를 들면, 진아트(Geneart), 라이프 테크놀로지(Life Technology))에 의해 제공되는 서비스인 합성 유전자 합성에 의해 얻을 수 있다. 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산을 대체함으로써 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 기능적 활성 변이체 또는 유도체를 생성하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
치료 단백질의 생산
최근 사용되는 최신 기술의 이종 단백질 생산 시스템은 이. 콜라이(E. coli), 효모, 바이러스, 진균, 및 곤충 세포와 같은 원핵 및 진핵 세포 시스템을 포함한다. 번역후 또는 번역주위 변형, 예컨대 글리코실화 (및 산업적 규모 생산이 필요한 경우)를 매우 종종 필요로 하는 재조합 단백질을 생산하기 위해, 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus), 세르코피테쿠스 아에티옵스(Cercopithecus aethiops), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus), 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 및 클로로세부스(Chlorocebus) 종으로부터의 세포를 포함하는 포유동물 세포 시스템이 사용된다. 포유동물 세포 시스템은 치료 단백질 및 항체를 위한 통상적 생산 시스템이 되었다. 상기 세포는 최근 병력에서 광범위하게 특징화되어 있으며, 이들은 매우 높은 생산 수준에 도달할 수 있고, 감염성 또는 바이러스 유사 입자가 없을 수 있고, 생물반응기에서 매우 고밀도로 성장할 수 있고, 이들은 유전자 조작 및 변형될 수 있다. 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포는 적절한 글리코실 트랜스퍼라제의 형질감염에 의해 인간 글리칸 프로파일과 유사하도록 조작할 수 있다. 재조합적으로 생산된 성장 인자는 이미 치료 적용에 광범위하게 사용되거나, 새로운 요법의 개발을 위한 유망한 후보이다.
통상의 기술자는 유전자 변형 포유동물 세포, 예를 들면 CHO 세포, 예컨대 CHO-K1 유도체, CHO-DUXB11 유도체 또는 CHO-DG44 세포를 형질전환시키고, 선택하고, 배양하는 방법을 알고 있다. 선택 프로토콜은 성장 인자, 예를 들면 IGF-1과 같은 목적 치료 단백질을 코딩하는 재조합 DNA가 통합되었을 가능성이 있는 세포의 선택을 용이하는데 통상적으로 사용된다. 형질전환 벡터 상의 공-통합된 유전자에 의해 부여된 항생제 내성 또는 영양 선택 배지에서 성장하는 능력이 통상적으로 사용된다. (문헌 [Weber, W. and Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Amsterdam, pp. 589-604] 참조.) (Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi). 재조합 단백질 생산을 위한 2개의 가장 통상적인 CHO 발현 시스템은 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)-기반 메토트렉세이트 (MTX) 선택 또는 글루타민 신테타제 (GS)-기반 메티오닌 술폭시민 (MSX) 선택을 사용한다 (Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb; 74(2):127-38. Epub 2009 Oct 22. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production).
형질감염된 포유동물 세포, 예를 들면 CHO 세포를 사용하는 폴리펩티드의 대규모 생산은, 예를 들면 웨이브, 유리 또는 스테인레스 스틸 생물반응기에서 행해질 수 있다. 이 목적을 위해 세포는 통상적으로 단일 냉동 바이알, 예를 들어 마스터 세포 은행으로부터의 바이알로부터 출발하여 증식된다. 세포는 해동되고 여러 단계를 통해 증식된다. 상이한 규모의 생물반응기에 적절한 양의 세포가 접종된다. 세포 밀도는 생물반응기에 공급 용액 및 첨가제를 첨가함으로써 증가될 수 있다. 세포는 장시간 동안 높은 생존성으로 유지된다. 1 리터당 수백 밀리그램 내지 1 리터당 수 그램 범위의 반응기 내의 생성물 농도는 대규모로 달성된다. 정제는 친화도, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는, 표준 크로마토그래피 방법론에 의해 수행될 수 있다. 생물반응기의 크기는 최종 규모로 수천 리터의 부피까지 가능할 수 있다 (또한, 예를 들면 문헌 [F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398] 참조).
치료 단백질은 엔프로(Npro) 자가프로테아제 융합 기술 (NAFT)을 사용하여 이. 콜라이에서 매우 효율적으로 생산될 수 있다. 통상의 기술자는 특히 특허 출원/특허 WO200111056, WO200111057, WO2006113957, EP1200604B1 및 US6936455B1에 매우 상세히 개시되어 있는 이 기술을 알고 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 상기 기재된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물 중 하나 또는 그의 조합을 함유하는, 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 조성물, 예를 들면 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물은 적어도 1종의 근육 질량/힘 증가제, 예를 들어 항-ActRIIB 항체, 항-ActRIIA/B 범 항체 IGF-2 또는 변이체 IGF-2, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하나, 그를 활성화시키지 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린(Ghrelin) 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴과 조합될 수 있다. 조합 요법으로 사용될 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 IGF-1 변이체의 용도에 대한 섹션에서 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.
용어 "제약상 허용되는"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제청에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 보다 특히 인간에서의 용도를 위한 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것임을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일, 예를 들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 적합한 제약 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원하는 경우에, 또한 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지연-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 통상의 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재된다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 제약 조성물과 같은 상용 절차에 따라 제제화된다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 가용화제, 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위해 국부 마취제, 예컨대 리도카인을 포함할 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합해야 한다 (예를 들면, 주사 또는 주입에 의함). 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 성장 인자, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 또는 다른 자연적 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 문헌의 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 추가로, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 이루어질 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 작용제들 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에, 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 중 요구되는 다른 작용제를 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 그의 사전 멸균-여과된 용액으로부터 활성제 및 임의의 추가의 목적하는 작용제의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성제의 양은 치료되는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성제의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 100 퍼센트를 기준으로, 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성제의 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트, 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 또는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은, 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 개체에서의 감수성 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 제한에 의해 지시되고 이에 직접 좌우된다.
본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물을 투여하는 것의 맥락에서 폴리펩티드의 치료 유효량은 약 0.001 내지 10 mg/kg 및 보다 통상적으로 0.1 내지 10 mg/kg (숙주 체중)의 범위이다. 예를 들면, 투여량은 약 0.1 mg/kg (체중), 약 0.2 mg/kg (체중), 약 0.3 mg/kg (체중), 약 1 mg/kg (체중), 약 3 mg/kg (체중), 약 5 mg/kg (체중) 또는 약 10 mg/kg (체중)일 수 있다. 통상의 기술자는 적합한 효과적인 용량을 확인하는 방법을 알고 있고, 이것은 투여 경로 (예를 들면, 정맥내 또는 피하)에 따라 달라질 것이다. 예시적인 치료 요법은 1일에 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 또는 1개월에 1회 투여를 수반한다. 이러한 투여는 정맥내로 또는 피하로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법 또는 과정에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물에 대한 투여 요법은 정맥내 투여에 의한 0.1 mg/kg (체중) 또는 0.2 mg/kg (체중) 또는 0.3 mg/kg (체중) 또는 0.5 mg/kg (체중) 또는 1 mg/kg (체중) 또는 3 mg/kg (체중) 또는 10 mg/kg (체중)을 포함한다. 대안적으로, 조성물은 지속 방출 제제일 수 있으며, 이 경우 보다 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 비교적 덜 빈번한 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지, 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법이 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성제의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성제의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
치료 유효 용량의 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물의 투여는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 시간 증가, 또는 질환의 고통에 의한 손상 또는 장애의 억제, 즉, 화상 환자에서 근육 질량 및/또는 기능의 증가 또는 상처 영역의 감소/저하를 초래할 수 있다.
환자는 폴리펩티드 활성 성분의 유효량, 즉 당해 질환 또는 장애의 검출, 치료, 개선 또는 예방에 충분한 양을 받을 것이다. 치료 효과는 또한 신체 증상에서의 감소를 포함할 수 있다. 임의의 특정한 대상체에 대한 치료 단백질의 최적의 유효량 및 농도는 환자의 연령, 크기, 건강 및/또는 성별, 상태의 성질 및 정도, 특정한 치료 단백질의 활성, 신체에 의한 그의 클리어런스 속도, 및 또한 치료 단백질과 조합되어 투여되는 임의의 가능한 추가의 치료제(들)를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이다. 주어진 상황에 대해 전달되는 유효량은 상용 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의의 판단 내에 있다. 투여량은 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 이용하여 1가지 이상의 투여 경로로 투여될 수 있다. 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 치료 단백질에 대한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 포함 조성물은 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서 항체는 피하로 투여된다.
대안적으로, 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로에 의해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯하여 급속 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다 (예컨대, 제어 방출 제제). 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 다수의 제조 방법은 특허를 받았거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 제시된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 제시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 제시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 제시한 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동식 이식가능한 주입 장치를 제시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 제시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 제시한 미국 특허 번호 4,475,196. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 마이크로칩스(MicroCHIPS)TM (메사추세츠주, 베드포드)에서 제조된 것이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물은 생체내 적절한 분배를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다수의 고도로 친수성인 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르는 것을 보장하기 위해 (원하는 경우에); 이는, 예를 들어 리포솜으로 제제화될 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화 약물 전달을 증진시키는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 잔기는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들면, 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드 (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090)를 포함하고; 또한, 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273]을 참조한다.
표적 질환 및 장애
본 발명은 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질의 조성물 또는 요법에 사용하기에 유용한 그의 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물의 제약 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질의 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질을 병리학적 장애를 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병리학적 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
병리학적 장애는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 근육 위축일 수 있다. 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 또는 프레드니솔론으로의 치료의 결과를 비롯하여, 근육 위축의 많은 원인이 존재한다. 근육 위축은 또한 신경 외상으로 인한 탈신경의 결과 또는 퇴행성, 대사성, 또는 염증성 신경병증 (예를 들면, 길랑-바레(Guillian-Barre) 증후군, 말초 신경병증, 또는 환경 독소 또는 약물에 대한 노출)의 결과일 수 있다.
추가로, 근육 위축은 근병증, 예컨대 근긴장증; 네말린 근병증, 다발성/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증을 포함하는 선천성 근병증; 미토콘드리아 근병증; 가족성 주기성 마비; 염증성 근병증; 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환으로 야기되는 것; 피부근염; 다발근염; 봉입체 근염; 골화성 근염; 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨의 결과일 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 케네디병 또는 만성 신장 질환의 치료에 사용될 수 있다.
근병증은 근육 이영양증 증후군, 예컨대 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스, 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마, 선천성 근육 이영양증, 또는 유전성 원위 근병증에 의해 유발될 수 있다. 근골격 질환은 또한 골다공증, 골절, 저신장, 또는 왜소증일 수 있다.
추가로, 근육 위축은 성인 운동 뉴런 질환, 예컨대 근위축성 측삭 경화증; 영아 척수성 근육 위축, 소아 척수성 근육 위축, 다초점 전도 차단을 동반하는 자가면역 운동 신경병증, 졸중 또는 척수 손상에 의한 마비, 외상에 의한 골격 고정화, 장기간 침상 안정, 수의적 무활동, 불수의 무활동, 대사성 스트레스 또는 영양 부족, 암, AIDS, 단식, 갑상선 또는 부신 또는 뇌하수체 장애, 당뇨병, 양성 선천성 저긴장증, 중심핵병, 간 질환 (예, 예컨대 섬유증, 간경변증), 패혈증, 신부전, 울혈성 심부전, 노화, 우주 여행 또는 무중력 환경에서 보낸 시간의 결과일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 성인 및 소아 화상 손상을 포함하는 화상 환자의 치료에 사용될 수 있다.
치료될 수 있는 연령-관련 상태의 예는 근육감소증, 피부 위축, 근육 소모, 뇌 위축, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역 부전증, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 전립선암, 졸중, 기대 수명 감소, 노쇠, 기억 상실, 주름, 신장 기능 장애, 및 연령-관련 청각 상실; 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만을 포함하는 대사 장애를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 근육 위축의 치료에 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 근육 위축 치료를 위한 본 발명의 제약 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 위축 군은 비만-연관 근육감소증, 근육감소증 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료될 수 있는 다른 상태는 급성 및/또는 만성 신질환 또는 신부전, 간 섬유증 또는 간경변증, 암, 예컨대 췌장, 위장 (식도, 위, 및 결장 포함), 폐, 전립선, 림프종, 또는 유방암; 파킨슨병; 뉴런 사멸과 연관된 상태, 예컨대 ALS (근위축성 측삭 경화증), 뇌 위축, 또는 치매 및 빈혈; 만성 감염, 예컨대 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 또는 비정형 미코박테리아에 의해 야기되는 결핵; 만성 진균 감염; 및 의인성 또는 AIDS에 의한 면역 억제 상황에서의 기회 감염을 포함한다.
추가의 상태는 악액질, 류마티스 관절염과 연관된 악액질, 및 암과 연관된 악액질을 포함한다.
또 다른 실시양태에서 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같이, 치료 유효량의 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 근육 질량을 증가시키기 위한 개시된 폴리펩티드 또는 조성물로의 치료의 필요성은 특히 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 근육 위축의 결과로서 상기 언급된 상태 중 1가지로부터 발생할 수 있으며, 여기서 근육 장애는 비만-연관 근육감소증, 근육감소증 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육 위축이다.
추가적으로, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같이, 치료 유효량의 본 발명의 공정 또는 방법에 따라 생산된 PEG화 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 화상 손상, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 근육감소증과 같은 연령 관련 상태, 케네디병, 또는 만성 신장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 근육 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 근육 질량을 증가시키는 것을 필요로 하는 환자에서 근육 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 근육 질량 증가의 필요성은 특히 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 근육 위축의 결과로서 상기 언급된 상태 중 1가지로부터 발생할 수 있다. 근육 질량 증가의 필요성은 또한 화상 손상, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 근육감소증과 같은 연령 관련 상태, 케네디병, 또는 만성 신장 질환으로부터 발생할 수 있다.
환자 투여
본 발명의 제약 조성물은 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 시린지를 통할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 전달 장치 (예를 들면, 시린지)를 제공한다.
다양한 전달 시스템, 예를 들면 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포 내로의 캡슐화, 수용체-매개 세포내이입 (예를 들면, 문헌 [Wu and Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987] 참조), 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 아데노바이러스, 폭스바이러스 (예를 들어, 조류폭스바이러스, 특히 가금폭스바이러스) 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구축 등은 공지되어 있으며, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 데 사용될 수 있다. 도입 방법은 경장 또는 비경구일 수 있으며, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 폐, 비강내, 안내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 라이닝 (예를 들면, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국부일 수 있다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물을 중추 신경계 내로 뇌실내 및 척수강내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 뇌실내 주사는, 예를 들어 저장소, 예컨대 옴마야 (Ommaya) 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물을 치료가 필요한 영역에 국부로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는, 예를 들어 제한 없이 수술 동안 국부 주입, 국소 적용에 의해, 예를 들어 주사에 의해, 카테터에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 이식물은 막, 예컨대 시알라스틱 막, 섬유, 또는 상업적 피부 대용물을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (문헌 [Langer, Science 249:1527-1533, 1990] 참조). 또 다른 실시양태에서, 활성제는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다.
환자 그룹
제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자는 집중 치료 또는 장기간 입원 (1주 초과)을 필요로 하는 급성 또는 중대 질병으로부터 회복 중인 환자; 근육감소증을 가진 노쇠한 노인 환자; 심각한 외상, 예컨대 자동차 사고, 중증 화상, 전투 부상, 및 다른 외상성 손상으로부터 회복 중인 청년 성인; 상기 나열된 바와 같은, 악액질을 유발하는 것으로 공지된 만성 질환을 가진 환자; 및 상기 나열된 바와 같은, 근육 질환을 가진 환자를 포함한다. 근육 감소는 중증이거나 장기 지속되는 대부분의 질병의 공통적인 합병증이기 때문에, 근육 소모의 반전은 근육 감소의 근본적인 원인과 무관하게 근육 감소를 경험하는 환자의 회복 및 기능 회복을 촉진할 것으로 예상된다.
조합 요법
이 치료는 근육 소모 과정의 1차 원인을 목표로 하는 임의의 치료와 조합될 수 있다. 이러한 조합은 코르티코스테로이드, 면역 억제제, 항-시토카인 작용제, 항암 약물; 성장 인자, 예컨대 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, 또는 기타; 당뇨병의 치료에 사용되는 약물 (인슐린 및 경구 혈당강하제 포함), 항-결핵 약물, 및 항생제를 포함할 수 있다. 조합은 소분자 및 생체분자 작용제 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단독 활성제로서 또는 예를 들면 다른 약물, 예를 들면 ActRIIB 항체, ActRIIA 항체, 가용성 ActRIIB 디코이 모방체, ActRIIA/B 범 특이적 항체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 이를 활성화시키지 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴에 대한 아주반트로서 또는 이와의 조합으로 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약물은 WO2010125003에 개시된 바와 같은 ActRIIB 항체와 조합되어 사용될 수 있다.
서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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실시예
IGF-1Ea 전구체 단백질은 높은 수의 표면 노출된 리신 잔기를 보유한다. PEG화 파라미터의 최적화만으로는 충분한 수율을 보장하지 못하고, 특히 최종 생성물 조성의 재현성이 충분히 높지 않다. PEG화 반응의 수율은, PEG화 반응을 pH 6.5에서 수행함으로써 증가하였다. 이 pH에서 IGF-1Ea와 PEG-CHO 시약의 환원성 알킬화 커플링의 선택성은 보다 높고, 부산물의 형성은 감소한다. 선행기술에서는 일반적으로 환원성 알킬화가 보다 낮은 pH에서 보다 선택적인 것으로 여겨지기 때문에, 보다 높은 pH에서 수행된 PEG화 반응이 보다 선택적이라는 것은 매우 놀라운 것이었다.
파트 A: 일반적 방법론
방법 설명
모노-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질의 제조 방법은 단계 (i) PEG화 반응 (hIGF-1Ea 전구체 펩티드를 PEG 시약과 커플링시킴), (ii) 크로마토그래피 정제 (목적 생성물을 비-반응 PEG 시약, 비-PEG화 IGF-1Ea 전구체 단백질 및 반응 부산물로부터 정제함), 및 (iii) 한외여과/투석여과 단계 (완충제를 교환하고, 관심 PEG화 단백질을 농축시킴)를 포함한다. 방법 흐름도를 도 1에 나타내었다.
엔-프로 기술을 사용한 hIGF-1Ea 단백질의 제조.
하기 변형을 함유하는 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 발현 벡터를 구축하였다: E3의 결실; R37의 A로의 돌연변이; 및 R71의 결실 및 S72의 결실 (서열식별번호: 55).
hIGF-1-Ea 변이체 서열식별번호: 55 (ΔE3; R37A; ΔR71, ΔS72)
Figure pct00009
서열식별번호: 55의 상기 기재된 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 엔프로 자가프로테아제 융합 기술 (NAFT)을 사용하여 생산하였다. 통상의 기술자는 특히 특허 출원/특허 WO200111056, WO200111057, WO2006113957, EP1200604B1 및 US6936455B1에 개시된 바 있는 이러한 기술을 알고 있다.
PEG화 반응
PEG화 반응 동안 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 NaCNBH3에 의해 달성된 환원성 조건 하에 30 kDa PEG 알데히드 시약 (PEG-CHO)과 커플링시켰다. PEG-CHO 시약이 우세하게 N-말단 아미노 기와 반응한다는 것은 문헌로부터 공지되어 있었다. 서열식별번호: 55 분자의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 상의 높은 수의 표면 노출된 리신 잔기는 PEG-CHO에 의한 N-말단 PEG화의 선택성을 감소시켰다. PEG화 반응을 상이한 pH 값에서 수행함으로써 반응이 pH 4.0에 비해 pH 6.5에서 N-말단에 대해 보다 선택적이었음이 밝혀졌다. 일반적으로 PEG-CHO를 사용하는 PEG화 반응은 보다 낮은 pH에서 보다 선택적인 것으로 여겨지기 때문에, 이는 놀라운 결과였다 (Kinstler et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 477-485, Molineux, Current Pharmacetical Design, 10 (2004) 1235-1244).
α-CD의 PEG화 혼합물로의 첨가는 고차 PEG화 변이체 (즉 디-, 트리- 또는 그 보다 높은 PEG화)의 형성이 억제되는 조건을 제공한다.
크로마토그래피 정제
서열식별번호: 55의 모노-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 강한 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피에 의해 잉여량의 시약, 반응 부산물 및 서열식별번호: 55의 비-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드로부터 정제하였다. 정제를 칼럼 상의 서열식별번호: 55의 모노-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드의 체류를 여전히 가능하게 하고 그와 동시에 서열식별번호: 55의 리신 및 N-말단 모노-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 사이의 적어도 부분적 분리를 달성하기에 충분히 높은 pH에서 수행하였다. pH 6.5를 분리에 가장 적절한 것으로 결정하였는데, 이보다 높은 pH에서 서열식별번호: 55의 모노-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드는 칼럼에 결합하지 않고 이보다 낮은 pH (예를 들면, 5.0)에서는 서열식별번호: 55의 리신 및 N-말단 PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 사이의 체류에 어떠한 차이도 없기 때문이다.
농축 및 완충제 교환
UF/DF 단계는 완충제를 최종 제제 완충제로 교환하고 IGF-1Ea를 최종 농도로 농축시키기 위해 수행하였다.
파트 B: 작업 실시예
실시예 1
본 실시예는 PEG-CHO에 의한 PEG화 반응의 선택성에 대한 PEG화 반응 pH의 영향을 입증한다. 놀랍게도, 보다 높은 pH에서 반응은 보다 낮은 pH에 비해 N-말단 접합에 대해 보다 더 선택적이었다.
서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드의 PEG화
PEG화 반응을 pH 4.0 및 6.5의 2개의 상이한 완충제 중에서 수행하였다. 보다 낮은 pH의 경우, 20 mM 아세트산나트륨, 50 mM 염화나트륨 pH 4.0을 선택한 반면에, 보다 높은 pH의 경우, 50 mM 인산나트륨, 140 mM 염화나트륨 pH 6.5를 사용하였다. 두 경우에, 고체 PEG 시약 (30 kDa 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드), 고체 α-CD 및 고체 NaCNBH3을 서열식별번호: 55의 IGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 용액에 첨가하였다. PEG화 반응을 스티어링 없이, 실온에서 단백질 농도 4.8 mg/ml, 3 몰 과량의 PEG 시약, 3 % 농도의 α-CD, 40 mM 농도의 NaCNBH3에서 수행하였다. 분석을 위한 샘플을 PEG화 3.5 및 7시간 후에 추출하였다. 샘플을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 양이온 교환 크로마토그래피 (CE-HPLC)로 분석하였다.
PEG화 혼합물의 특징화
RP-HPLC를 모노- 및 고차 PEG화 형태의 양의 결정에 사용하였고, CE-HPLC는 모노PEG화 분획 중 N-말단 PEG화 형태의 %의 결정에 사용하였다. 각각 샘플의 조성과 관련하여, 결과는 PEG화 반응이 pH 4.0에서보다 pH 6.5에서 N-말단 접합에 대해 보다 더 선택적임을 입증한다. pH 6.5에서 N-말단 PEG화 형태의 양은 pH 4.0과 비교하여 약 10 % 보다 높다. 또한 고차 PEG화 형태의 양은 보다 높은 pH에서 유의하게 보다 낮았다. PEG화 7시간 후에, 고차 PEG화 형태의 양은 pH 6.5에서 16 %이고, pH 4.0에서 29 %인 반면에, 모노-PEG화 형태의 백분율은 7시간 후에 PEG화 반응의 pH와 관계없이 동일하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1: 상이한 pH 값에서의 반응 혼합물 조성의 비교
Figure pct00010
* RP-HPLC에 의해 결정됨; ** CE-HPLC에 의해 결정됨
실시예 2
본 실시예는 고차 PEG화 형태의 양에 대한 α-CD의 영향을 입증한다. 고차 PEG화 형태의 양은 α-CD의 존재 하에 감소하였다.
서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드의 PEG화
2개의 PEG화 반응을 수행하였다. 둘 다의 경우에서 고체 PEG 시약 (30 kDa 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드; NOF) 및 고체 NaCNBH3을 IGF-1Ea 용액에 첨가하였다. 1개의 반응에서 고체 α-CD를 3 % 최종 농도까지 첨가하였다. PEG화 반응은 스티어링 없이, 실온에서 4.4 mg/ml의 단백질 농도, 4 몰 과량의 PEG 시약 및 40 mM 농도의 NaCNBH3에서 수행하였다. 분석을 위한 샘플을 PEG화 2시간 및 3.5시간 후에 추출하였다. 샘플을 RP-HPLC 및 CE-HPLC로 분석하였다.
PEG화 혼합물의 특징화
PEG화 혼합물을 RP-HPLC로 2 및 3.5시간 후에 분석하였다. RP-HPLC를 모노- 및 고차 PEG화 형태의 양의 결정에 사용하였다.
결과는 고차 PEG화 형태의 양이 3% α-CD의 존재 하에 보다 낮음을 입증한다. PEG화 혼합물 중에서 3.5시간 후에 3% α-CD의 존재 하에 약 24% 더 적은 고차 PEG화 형태를 수득한 반면에, 모노-PEG화 형태의 백분율은 동일하게 유지되었다. 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2: α-CD의 존재 하의 및 α-CD 첨가 부재 하의 반응 혼합물 조성의 비교
Figure pct00011
실시예 3
서열식별번호: 55의 모노-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 이소형의 부분적 분리.
고체 PEG 시약 (30 kDa 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드; NOF), 5 M NaCNBH3/1 M NaOH의 중화된 용액 및 12% α-CD 용액을 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 (75 mg) 용액에 첨가하였다. PEG화 반응을 실온에서, pH 6.5, 단백질 농도 6 mg/ml, 2.25 몰 과량의 PEG 시약, 50 mM 농도의 NaCNBH3 및 3% 농도의 α-CD에서 수행하였다. 20시간 후에 PEG화 혼합물을 물로 희석하여, 샘플 전도성을 낮추고, 멸균 여과하였다. 서열식별번호: 55의 모노-PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 이소형의 정제 및 단리를 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 반응 혼합물을 완충제 (10 mM Na-포스페이트, pH 6.5) 중에 평형화시킨 49.6 ml (XK 16/40, 지이 헬스케어(GE Healthcare)) 토요펄 SP-650S (도소 바이오사이언스(Tosoh bioscience)) 칼럼 상에 로딩시켰다. 칼럼을 3 칼럼 부피의 평형 완충제로 세척하였다. 펩티드 형태를 30 칼럼 부피로 용리 완충제 (20 mM Na-포스페이트, 500 mM naCl, pH 5.0)의 0 내지 100% 선형 구배를 사용하여 용리하였다. 전체 실행에 대한 유량은 2.5 ml/분으로 유지하였다. 정제용 크로마토그램을 도 2에 나타내었다.
용리 동안 2.5 ml 분획을 수집하였다. 분획을 분석용 CE-HPLC에 따라 풀링하였다. 상이한 조성의 모노-PEG화 이소형을 함유하는 4개의 풀을 제조하고 1, 2, 3 및 4로 지정하였다. 풀을 저장 완충제, 20 mM 아세테이트, pH 5.0로 농축시키고 투석여과하였다. 농축 및 투석여과를 3 kDa 컷 오프를 갖는 15 ml 아미콘(Amicon) 원심분리 장치 상에서 수행하였다.
각각 풀 중의 이소형 조성 (분석용 CE-HPLC로 결정됨) 및 모노-PEG화 물질의 함량 (RP-HPLC로 결정됨)을 표 3에 나타내었다.
표 3: RP-HPLC 및 CE-HPLC에 의해 결정된 샘플 조성의 비교
Figure pct00012
1로 지정된 풀은 단지 서열식별번호: 55의 N-말단 PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 함유하였다. 모노-PEG화 물질의 양은 97%를 넘었다.
2, 3 및 4로 지정된 풀은 일부 디-PEG화 물질의 존재로 인해 보다 낮은 RP-HPLC 순도를 보유하였다. 풀 2, 3 및 4 중에 남아있는 모노-PEG화 물질은 리신-PEG화된 것이었다. 리신-PEG화 이소형의 단지 부분적 분리가 CEX 크로마토그래피 상에서 달성되었기 때문에 풀은 상이한 리신-PEG화 이소형의 혼합물이었다. 분석용 CE-HPLC 상에서 4개의 피크가 분해될 수 있었다. 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 중의 노출된 리신 잔기의 수를 고려하면 이들 4개의 분석용 CE-HPLC 피크는 여전히 상이한 리신-PEG화 이소형의 혼합물이었다.
2, 3 및 4로 지정된 CEX 풀의 CE-HPLC 분석을 도 3에 나타내었다.
실시예 4
본 실시예는 서열식별번호: 55의 PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드의 제조 방법을 설명한다. 전체 방법은 서열식별번호: 55의 PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드의 제조를 매우 재현가능한 방식으로 가능하게 한다. 방법 강건성을 증가시키기 위해 설계된 단계는 PEG화 반응 및 CEX 정제였다. α-CD가 고차 PEG화 형태의 형성을 감소시키고 반응을 느리게 하여 PEG화 반응 종결을 위한 윈도우 (CEX 칼럼 상 적용)가 대규모 방법에 대해 보다 넓고 보다 적절하게 되도록 하므로 α-CD를 PEG화 반응 내로 도입시켰다. 반응의 특이성을 PEG화 반응을 pH 6.5에서 수행함으로써 개선시켰다. 추가적으로, 최종 생성물의 조성을 CEX에 의한 정제에 의해 제어하였다. CEX를 리신 및 N-말단 PEG화 분자 사이의 적어도 부분적 분리를 달성하도록 설계하였다. 최종 생성물의 일관성을 CEX 분획의 적절한 풀링에 의해 보장하였다. 일관된 조성의 이소형을 보장하기 위한 풀링 기준에 대한 IPC 제어를 분석용 CE-HPLC에 의해 수행하였다.
PEG-시약 및 환원제의 제조
3.35 g의 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 해동시키고, 실온으로 온도조절시키고 부드럽게 혼합시킴으로써 균질화하였다. PEG 시약 (30 kDa 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드; NOF)을 20 mM Na-포스페이트, 30 mM NaCl, pH 6.5 중에 200 mg/ml 원액으로서 제조하였다. α-CD의 12 % 용액을, α-CD를 140 mM NaH2PO4 중에 용해시킴으로써 제조하였다. 1 M NaOH 중 5 M NaCNBH3을 12 % α-CD 용액에 첨가하여, NaCNBH3의 191 mM 원액을 수득하였다.
PEG화 반응
용해시킨 PEG-CHO 시약을 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 용액에 첨가하였다. PEG화 반응을 α-CD 및 NaCNBH3 용액의 첨가에 의해 시작하였다. PEG화 반응을 20.5시간 동안 22℃, pH 6.4, 단백질 농도 6 mg/ml, 2.25 몰 과량의 PEG 시약, 50 mM 농도의 NaCNBH3 및 3% 농도의 α-CD에서 수행하였다.
크로마토그래피 정제
CEX 칼럼에 결합하는 것을 달성하기 위해, PEG화 혼합물을 물로 2배 희석하였다. 희석된 반응 혼합물을 완충제 (20 mM Na-포스페이트, pH 6.5) 중에 평형화시킨 XK 50/30 칼럼 (지이 헬스케어, Ø 5cm) 토요펄 SP-650S (도소 바이오사이언스) 칼럼 상에 로딩시켰다. 칼럼을 3 칼럼 부피의 평형 완충제로 세척하였다. 펩티드 형태를 5 칼럼 부피로 용리 완충제 (20 mM Na-포스페이트, 500 mM naCl, pH 5.0)의 0 내지 40% 선형 구배를 사용하여 용리하였다. 전체 실행에 대한 유량은 75 cm/시간으로 유지하였다. 용리 피크를 분석용 CE-HPLC 및 RP-HPLC에 따라 분획화시키고 풀링하였다. 전형적 CEX 크로마토그램을 도 4에 나타내었다.
풀링
분획의 풀링을 RP-HPLC 및 CE-HPLC 분석에 따라 수행하였다. 풀 조성물을 표 4에 나타내었다.
UF/DF 단계, 멸균 여과 및 충전
한외여과 및 투석여과 단계를 수행하여, 서열식별번호: 55의 PEG화 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 농축시키고 완충제를 교환하였다. 완충제를 7 mM Na-숙시네이트, pH 5.0으로 교환하였다. 한외여과 및 투석여과를 위해 3개의 펠리콘 바이오맥스(Pellicon Biomax) 5 (밀리포어) 막을 사용하였다. 투석여과를 8 턴오버 부피로, 6 내지 7 mg/ml의 단백질 농도에서 수행하였다. UF/DF 단계 후의 농축된 샘플을 0.2 μm 세공 크기를 갖는 폴리에테르술폰 막 필터를 사용하여 멸균 여과하고, 최종 저장 용기 (날진(Nalgene) 25 ml PETG 병)에 충전시켰다.
표 4: RP-HPLC 및 CE-HPLC에 의해 결정된 샘플 조성
Figure pct00013
실시예 5
본 실시예는 SP-세파로스 HP 칼럼 상의 서열식별번호: 55 PEG화 혼합물의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드의 정제를 설명한다.
PEG화 반응
0.3 g의 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 해동시키고, 실온으로 온도조절시키고 부드럽게 혼합시킴으로써 균질화하였다. 고체 PEG 시약 (폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드; NOF) 및 고체 α-CD를 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 용액에 첨가하였다. PEG화 반응을 NaCNBH3 원액의 첨가에 의해 시작하였다. PEG화 반응을 3시간 동안 22℃, pH 6.5, 단백질 농도 4.75 mg/ml, 3 몰 과량의 PEG 시약, 40 mM 농도의 NaCNBH3 및 3% 농도의 α-CD에서 수행하였다.
분리
상이한 CEX 수지 (토요펄 SP 650S 및 SP 세파로스 HP) 상의 분리의 헤드 투 헤드 비교를 위해 보다 많은 양의 PEG화 혼합물을, 수회의 분리 실행을 가능하게 하도록 제조하였다. PEG화 반응을 TSK 겔 SP-5PW 칼럼 (NaCNBH3의 제거 및 PEG의 제거)에 적용함으로써 종결시켰고, 이를 본래 PEG화 완충제 10 mM Na-포스페이트, pH 6.5 (5.000 kDa 컷오프를 갖는 아미콘 울트라 원심분리 장치 사용함)로 되돌렸다.
22.8 mg의 서열식별번호: 55의 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드를 완충제 (10 mM Na-포스페이트, pH 6.5) 중에 평형화시킨 트리콘(Tricorn) 10/100 (지이 헬스케어, Ø 1cm) SP 세파로스 HP (지이 헬스케어) 칼럼 상에 로딩시켰다. 칼럼을 3 칼럼 부피의 평형 완충제로 세척하였다. 펩티드 형태를 15 칼럼 부피로 용리 완충제 (40 mM Na-포스페이트, 200 mM naCl, pH 8.5)의 0 내지 85% 선형 구배를 사용하여 용리하였다. 전체 실행에 대한 유량을 0.9 ml/분으로 유지하였다. 용리 피크를 분석용 CE-HPLC 및 RP-HPLC에 따라 분획화시키고 풀링하였다. CEX 크로마토그램을 도 5에 나타내었다.
상기에 기재된 hIGF-1-Ea 전구체 폴리펩티드 변이체뿐만 아니라, 하기 추가의 단백질 변이체 (이에 제한되지는 않음)를, 상기 기재된 본 발명의 방법에 따라 PEG화시킬 수 있다:
실시예 6
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00014
실시예 7
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00015
실시예 8
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00016
실시예 9
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00017
실시예 10
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00018
실시예 11
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00019
실시예 12
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00020
실시예 13
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00021
실시예 14
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00022
실시예 15
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00023
실시예 16
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00024
실시예 17
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00025
실시예 18
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00026
실시예 19
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00027
실시예 20
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00028
실시예 21
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00029
실시예 22
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00030
실시예 23
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00031
실시예 24
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00032
실시예 25
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00033
실시예 26
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00034
실시예 27
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00035
실시예 28
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00036
실시예 29
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00037
실시예 30
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00038
실시예 31
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00039
실시예 32
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00040
실시예 33
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00041
실시예 34
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00042
실시예 35
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00043
실시예 36
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00044
실시예 37
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00045
실시예 38
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00046
실시예 39
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00047
실시예 40
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00048
실시예 41
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00049
실시예 42
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00050
실시예 43
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00051
실시예 44
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
Figure pct00052
실시예 45
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00053
실시예 46
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72 72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00054
실시예 47
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00055
실시예 48
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00056
실시예 49
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00057
실시예 50
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00058
실시예 51
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00059
실시예 52
G1, P2, E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00060
실시예 53
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00061
실시예 54
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00062
실시예 55
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00063
실시예 56
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00064
실시예 57
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00065
실시예 58
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00066
실시예 59
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00067
실시예 60
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00068
실시예 61
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00069
실시예 62
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00070
실시예 63
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00071
실시예 64
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00072
실시예 65
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00073
실시예 66
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00074
실시예 67
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00075
실시예 68
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00076
실시예 69
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00077
실시예 70
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00078
실시예 71
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00079
실시예 72
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00080
실시예 73
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00081
실시예 74
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00082
실시예 75
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00083
실시예 76
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00084
실시예 77
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00085
실시예 78
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00086
실시예 79
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00087
실시예 80
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00088
실시예 81
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실됨.
Figure pct00089
실시예 82
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00090
실시예 83
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00091
실시예 84
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00092
실시예 85
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00093
실시예 86
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00094
실시예 87
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 글루탐산 (E)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00095
실시예 88
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00096
실시예 89
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00097
실시예 90
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌 (A)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민으로 돌연변이됨.
Figure pct00098
실시예 91
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00099
실시예 92
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72 72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00100
실시예 93
E3이 결실되고, 아미노산 R37이 프롤린 (P)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00101
실시예 94
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00102
실시예 95
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00103
실시예 96
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74 및 R77이 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00104
실시예 97
E3이 결실되고, 아미노산 R36 및 R37이 둘 다 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00105
실시예 98
E3이 결실되고, 아미노산 R36이 글루타민 (Q)에 의해 치환되고, R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 K68, S69, A70, R71 및 S72가 결실되고, 아미노산 R74, R77 및 R104가 글루타민 (Q)으로 돌연변이됨.
Figure pct00106
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG LEK Pharmaceuticals D.D. <120> A process for preparing a composition of pegylated proteins <130> PAT056013 <140> US 61/915090 <141> 2013-12-12 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 1 5 10 15 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 20 25 30 Tyr Arg Met 35 <210> 3 <211> 77 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 1 5 10 15 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 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99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 protein <400> 84 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Gln Met <210> 85 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 protein <400> 85 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Arg Glu Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln 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Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Arg Pro Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Arg Met <210> 92 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 92 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Arg Pro Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Arg Met <210> 93 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 93 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Arg Pro Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Gln Met <210> 94 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 94 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Gln Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Arg Met <210> 95 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 95 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Gln Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Arg Met <210> 96 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 96 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Ala Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Arg Met <210> 97 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 97 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Gln Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Gln Met <210> 98 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated human IGF-1 Protein <400> 98 Gly Pro Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Ala Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys 50 55 60 Pro Ala Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn 85 90 95 Tyr Gln Met <210> 99 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mutated Human IGF1 E-peptide <400> 99 Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val 1 5 10 15 His Leu Lys Asn Ala Ser Gly 20 <210> 100 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mutated Human IGF1 E-peptide <400> 100 Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln 1 5 10 15 Pro Pro Ala Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser 20 25 30 <210> 101 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mutated Human IGF1 E-peptide <400> 101 Val Gln Ala Gln Gln His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val 1 5 10 15 His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Gln 20 25 30 Met

Claims (38)

  1. PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하며, 이에 의해 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인, PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법.
  2. 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법이며,
    여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 단백질 분획의 적어도 65 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질이고, 방법은
    (a) 수성 매질 중에서 치료 단백질을 환원성 알킬화의 조건 하에 수용성 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계로서, 여기서 커플링 반응을 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단계,
    (b) 단계 (a)에서 수득된 조성물로 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계
    를 포함하며, 이에 의해 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인,
    모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료 단백질이 인간 IGF-1 전구체 단백질 또는 그의 변이체인, 조성물을 제조하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화 반응을 α-시클로덱스트린 (α-CD)의 존재 하에 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 20 내지 100 kDa의 전체 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, PEG가 약 30 kDa의 전체 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 교환 크로마토그래피 단계가 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질을 함유하는 분획을 풀링하는 것을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)이며, 이에 의해 모노 PEG화 치료 단백질의 조성물을 제공하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    b) 한외여과 (UF)/ 투석여과 (DF) 농축 및 완충제 교환,
    c) 최종 여과
    의 추가의 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IGF1 전구체 단백질이, 아미노산 E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되어 있으며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 방법.
  10. 제9항에 있어서, IGF1 전구체 단백질이 서열식별번호: 55로 이루어진 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 방법.
  11. 제1항, 제3항 내지 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
  12. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
  13. 제1항, 제3항 내지 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
  14. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의해 수득가능한 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
  15. 제1항, 제3항 내지 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 의해 수득된 PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
  16. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 모노-PEG화 치료 단백질의 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 치료 단백질 분획의 적어도 65%는 N-말단 모노-PEG화 치료 단백질인 조성물.
  17. 제9항 또는 제10항의 방법에 따라 생산된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물.
  18. 제9항 또는 제10항의 방법에 의해 수득가능한 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물.
  19. 제9항 또는 제10항의 방법에 의해 수득가능한 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물.
  20. 제9항 또는 제10항의 방법에 의해 수득된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 모노 PEG화 IGF-1 단백질 분획의 적어도 61 퍼센트는 N-말단 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질인 조성물.
  21. 제9항 또는 제10항의 방법에 의해 수득된 조성물이며, 여기서 상기 조성물에서 상기 조성물에 포함된 PEG화 IGF-1 전구체 단백질 분획의 적어도 70%는 N-말단 및 리신 잔기 모노-PEG화 IGF-1 전구체 단백질의 혼합물인 조성물.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, IGF1 전구체 단백질이, 아미노산 E3이 결실되고, 아미노산 R37이 알라닌에 의해 치환되고, 아미노산 R71 및 S72가 결실되어 있으며, 아미노산의 넘버링은 서열식별번호: 5에 상응하는 것인 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, IGF1 전구체 단백질이 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IGF-1Ea 펩티드 전구체 단백질인 조성물.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 제약상 허용되는 형태인 조성물.
  25. 요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 PEG화 치료 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  29. 제24항 또는 제25항에 있어서, 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA 또는 케네디병) 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  30. 제24항 또는 제25항에 있어서, 만성 신장 질환 환자의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  31. 제26항에 있어서, 근육 장애가 근육 위축인 제약 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 근육 위축이 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  33. 치료 유효량의 제24항 또는 제25항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 근육 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 근육 장애를 치료하는 방법.
  34. 치료 유효량의 제24항 또는 제25항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제지방 체질량의 감소 및/또는 근육 소모를 앓고 있는 화상 환자를 치료하는 방법.
  35. 치료 유효량의 제24항 또는 제25항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자를 치료하는 방법.
  36. 치료 유효량의 제24항 또는 제25항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 척수 및 연수 근육 위축 (SBMA 또는 케네디병) 환자를 치료하는 방법.
  37. 치료 유효량의 제24항 또는 제25항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 신장 질환 환자를 치료하는 방법.
  38. 제31항에 있어서, 근육 장애가 비만-연관 근육감소증, 근육감소증, 및 당뇨병-연관 근육 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육 위축인 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20151612A1 (es) 2012-12-18 2015-11-19 Novartis Ag Polipeptidos estabilizados del factor de crecimiento tipo insulina
WO2020096958A1 (en) * 2018-11-05 2020-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Method for purifying pegylated protein

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US20030053982A1 (en) 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE60016560T2 (de) 1999-01-06 2005-12-15 Genentech, Inc., South San Francisco Mutierte variante des insulin-ähnlichen wachstumsfaktor-i (igf-i)
EP1200603B1 (en) 1999-08-09 2014-12-24 Sandoz AG Production of proteins by autoproteolytic cleavage
HU230231B1 (hu) 1999-08-09 2015-10-28 Sandoz Ag Fehérjék termelése
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
US7355018B2 (en) 2003-09-30 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified IGF1 polypeptides with increased stability and potency
EP1674113A1 (en) 2004-12-22 2006-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol)
AU2006203882B2 (en) 2005-01-07 2011-05-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IGF-1 fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
JP2008538897A (ja) 2005-04-26 2008-11-13 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生
CA2653781A1 (en) 2006-06-09 2007-12-13 Novartis Ag Stabilized insulin-like growth factor polypeptides
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
BRPI0910338A2 (pt) 2008-04-03 2020-08-18 F. Hoffmann-La Roche Ag uso de variantes peguiladas de igf-i para o tratamento de distúbios neuromusculares
MY153078A (en) 2009-04-27 2014-12-31 Novartis Ag Compositions and methods for increasing muscle growth

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