TW201526908A - 製備聚乙二醇化蛋白質組合物之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係於蛋白質聚乙二醇化之領域。特別地，其係關於一種使治療性蛋白質聚乙二醇化之方法。本發明亦關於此聚乙二醇化治療性多肽之用途，其用於治療肌肉疾病及病症。

Description

製備聚乙二醇化蛋白質組合物之方法
本發明係關於蛋白質聚乙二醇化之領域。特定言之，其係關於聚乙二醇化治療性蛋白質，如聚乙二醇化IGF-1多肽及其變體。
已證實用聚(乙二醇)(PEG)共價修飾蛋白質為延長蛋白質在體內之循環半衰期之可用方法(Hershfield,M.S.等人，N.Engl.J.Med.316(1987)589-596；Meyers,F.J.等人，Clin.Pharmacol.Ther.49(1991)307-313；Delgado,C等人，Crit.Rev.Ther.Drug)。此過程稱為聚乙二醇化，且其為最確定且成功使用的改善醫藥學上活性蛋白質之治療價值的技術(Roberts等人，Chemistry for peptide and protein PEGylation.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476；Caliceti P.等人，2003)。
PEG鏈與蛋白質之連接增加其分子量及流體動力學半徑，導致顯著活體內半衰期延長。包裹在蛋白質周圍之PEG鏈對蛋白質具有遮蔽作用且因此降低結合物之蛋白水解降解及免疫原性。聚乙二醇化亦改變生物分佈特性且顯著提高疏水蛋白質之溶解度(Caliceti,P.及Veronese,F.M.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv.Drug Deliv.Rev.,55,1261.，Roberts等人，Chemistry for peptide and protein PEGylation. 2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476)。
藉由使用甲氧基聚乙二醇之N-羥基丁二醯亞胺酯(PEG-NHS)達成之偶合化學反應可產生與不同離胺酸殘基之結合，其產生位置同功異型物與多聚乙二醇化形式之複合混合物。已用於治療數年之若干結合物(PEG-Intron®、Pegasys®、MIRCERA®、Somavert®)為隨機聚乙二醇化化學反應之結果。
隨機聚乙二醇化之主要缺點為最終產物不具有均質性。因此，預期再現反應之困難及關於最終產物之分析型表徵之挑戰。
類胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)為使用細胞與其生理環境通訊之複合系統之部分。此複合系統(常稱為類胰島素生長因子軸)係由兩個細胞表面受體(IGF-1R及IGF-2R)、兩個配位體(IGF-1及IGF-2)、一個具有六種高親和力IGF結合蛋白(IGFBP 1-6)之家族及相關IGFBP降解酶(蛋白酶)組成。此系統不僅對於調節正常生理為重要的，對於調節多種病理狀態亦為重要的(Glass,Nat Cell Biol 5：87-90,2003)。
已展示IGF軸在促進細胞增生及抑制細胞死亡(細胞凋亡)中起作用。IGF-1主要由於人類生長激素(hGH)之刺激而由肝分泌。人體內幾乎每一細胞均受IGF-1影響，尤其肌肉、軟骨、骨骼、肝、腎、神經、皮膚及肺中之細胞。除類胰島素作用以外，IGF-1亦可調節細胞生長。IGF-1及IGF-2係由稱為IGF結合蛋白之基因產物家族調節。此等蛋白質有助於以複雜方式調節IGF活動，其涉及藉由阻止結合至IGF受體而抑制IGF活動以及經由幫助傳遞至受體且提高血流中之IGF半衰期而促進IGF活動。存在至少六種特性化之結合蛋白質(IGFBP1-6)。
亦稱為促生長因子之人類IGF-1在其成熟形式中為70個胺基酸之小蛋白質，其已在培養中展示刺激廣泛範圍之細胞的生長。首先藉由 三種已知剪接變體mRNA編碼IGF-1蛋白質。視特定IGF-1 mRNA而定，各mRNA之開放閱讀框架編碼在C端含70個胺基酸IGF-1(SEQ ID NO：1)及特定E-肽之前驅蛋白質。此等E-肽已稱為Ea(rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm；SEQ ID NO：2)、Eb(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk；SEQ ID NO：3)及Ec(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk；SEQ ID NO：4)肽且長度在35至87個胺基酸範圍內，且在N端涵蓋常見序列區，且在C端涵蓋可變序列區。舉例而言，IGF-1-Ea之野生型開放閱讀框架編碼包括前導序列的135個胺基酸之多肽及不含前導序列的105個胺基酸之多肽(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm；SEQ ID NO：5)。在生理表現中，E-肽藉由內源性蛋白酶自前驅物裂解以產生成熟之70個胺基酸IGF-1。IGF-1在人類血清中之可用性及半衰期主要由蛋白酶及IGF-1結合蛋白質(IGFBP's)影響及調節。IGFBP's可抑制或強化IGF-1活動(OhY等人，Characterization of the affinities of insulin-like growth factor(IGF)-binding proteins 1-4 for IGF-I,IGF-II,IGF-I/insulin hybrid,and IGF-I analogs.Endocrinology.1993年3月；132(3)：1337-44)。先前技術中已描述延長IGF-1半衰期之策略。已考慮之策略為(i)產生包含特異性突變之IGF-1變體，該等特異性突變旨在藉由絲胺酸蛋白酶預防人類血清中IGF-1之裂解，或減輕IGF-1結合蛋白質對IGF-1可用性或血清半衰期之負面影響(WO200040613、WO05033134、WO2006074390、WO2007146689)；(ii)產生IGF-1融合蛋白，其中成熟IGF-1蛋白質融合至人類免疫球蛋白Fc區(WO2005033134、WO200040613)；(iii)使用IGF-1前驅蛋白質，其中藉由修飾前驅蛋白質而降低E- 肽藉由蛋白酶自IGF-1之裂解(WO2007146689)；(iv)上述策略之組合((i)/(ii)WO05033134、(i)/(ii)WO200040613、(i)/(iii)WO2007146689)，以及(v)產生聚乙二醇化IGF-1變體(WO2009121759、WO2008025528及WO2006066891)。
由於IGF-1具有不良藥物代謝動力學特性(較短消除半衰期)之缺點，因此製備IGF變體之聚乙二醇化形式。製備IGF-1變體之聚乙二醇化形式以用於治療神經肌肉病症係描述於WO2008025528、WO2009121759 A2及WO2006066891中。通常，PEG連接至蛋白質之胺基。然而，此胺基聚乙二醇化方法之主要限制為蛋白質通常含有大量離胺酸殘基且因此聚(乙二醇)基團以非特異性方式連接至蛋白質。需要生物活性之胺基殘基(例如，靠近或位於蛋白質活性部位之殘基)之聚乙二醇化可導致蛋白質之低比活性或不活化。
為避免上述缺點中之一些，WO2006066891描述使用由IGF-1變體與一或兩個聚(乙二醇)基團組成之結合物，其特徵為該IGF-1變體已在野生型IGF-I胺基酸序列之位置27、37、65、68之至多三個胺基酸處突變。然而，將各突變引入蛋白質中以最小化無規聚乙二醇化，同時提高免疫原性之風險。因此，在研發治療性蛋白質時，儘可能少之突變為較佳的。
WO 2008025528揭示製備重組人類IGF-I融合蛋白質，其中該等融合蛋白質在離胺酸27、65及/或68之位置包含胺基酸取代。WO2008025528中所述之方法允許製備不經歷N端聚乙二醇化之重組人類IGF-I突變蛋白質。用於WO2006066891及WO2008025528之聚乙二醇化試劑為甲氧基聚乙二醇之N-羥基丁二醯亞胺酯(PEG-NHS)，其產生無規聚乙二醇化蛋白質。為避免N端聚乙二醇化及位置異構體之形成，除一個離胺酸殘基以外之所有離胺酸殘基係由極性胺基酸替換 且原肽係連接至N端。在第一步中，使IGF-1突變蛋白質聚乙二醇化且之後用IgA蛋白酶自IGF-1裂解原肽，使IGF-1突變蛋白質僅在單個離胺酸殘基處經聚乙二醇化。
使用甲氧基聚乙二醇丙醛(PEG-CHO)試劑之還原烷化公認為位點特異性聚乙二醇化方法(Roberts等人，Chemistry for peptide and protein PEGylation.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476)。N端聚乙二醇化係描述於Amgene相關專利家族(US 7090835 B2、US 6956027 B2、EP 0 822199B1)中。還原烷化反應係在酸性條件下、在5.0之pH下進行(EP 0822199 B1)。一般而言，咸信PEG-CHO試劑之關鍵特性為，在酸性條件(約pH 5)下，由於α-胺之pKa相比於其他親核試劑較低，醛基對N端α-胺主要為選擇性的(Kinstler等人，2002,Molineux,2004)。
N端聚乙二醇化選擇性通常顯著降低，因為含高暴露性及高反應性離胺酸之蛋白質在改造過程中產生伴有較長發展時間及較高成本之較高程度之複雜性。
由如WO2007146689中所述之IGF-1成熟蛋白質(促生長因子)及E-肽組成的IGF-1前驅變體中之各種突變允許調適IGF-1變體以獲得改善之治療作用。突變產生由身體較緩慢代謝之穩定分子且因此具有與成熟IGF-1肽相比較長之半衰期。WO2007146689中所述之IGF-1變體自身體之較慢清除率產生相比於野生型IGF-1改善之功效。然而，WO2007146689中所揭示之IGF-1前驅變體具有大量表面暴露之離胺酸殘基且該等IGF-1前驅變體之聚乙二醇化導致形成單聚乙二醇化位置同功異型物與不同分子量之聚乙二醇化蛋白質之混合物。儘管可應用層析純化法以獲得均質產物，但由於各形式之物理化學特徵過於類似，分離聚乙二醇化混合物在技術上具有挑戰性。此導致最終製程產量較低。因此，需要研發使IGF-1前驅蛋白質之聚乙二醇化較有選擇 性之改良方法。
本發明之第一標的物係關於一種用於製備聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含在含水介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵為聚乙二醇化反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，以得到聚乙二醇化治療性蛋白質之組合物。
本發明之另一實施例係關於一種用於製備單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含以下步驟：(a)在含水介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，(b)用步驟(a)中所獲得之組合物進行陽離子交換層析步驟，(c)獲得交換層析步驟(b)之溶離部分，及(d)彙集彼等含有單聚乙二醇化治療性蛋白質之溶離份。
本發明之另一標的物係關於一種用於製備聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該方法包含在含水介質中使IGF-1前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行。
在一個特定實施例中，本發明係關於一種用於製備單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物之方法，其中該組合物包含至少65% N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該方法包含以下步驟： (a)在含水介質中使IGF-1前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，(b)用步驟(a)中所獲得之組合物進行陽離子交換層析步驟，(c)獲得交換層析步驟(b)之溶離部分，及(d)彙集彼等含有單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質同功異型物之溶離份。
在某一實施例中，本發明係關於上述方法，其特徵為聚乙二醇化(偶合反應)在α-環糊精(α-cyclodextrine，α-CD)存在下進行。
在本發明之一個特定實施例中，上述聚乙二醇化反應係在約6.5之pH下進行。在本發明之一個特定實施例中，用於上述方法之PEG為總分子量為20至100kDa(千道爾頓(kilo dalton))之直鏈PEG。因此，在本發明之一個實施例中，用於上述方法之直鏈PEG之總分子量為約30kDa。或者，用於上述方法之PEG可為分支鏈的。在本發明之一個特定實施例中，應用於上述方法之交換層析步驟為陽離子交換層析(CEX)步驟。同樣，本發明係關於上述方法，其進一步包含以下其他步驟：b)超濾(UF)/透濾(DF)濃縮與緩衝液交換，c)最終過濾及填充。
在本發明之一個特定實施例中，根據上述方法經聚乙二醇化之IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其中胺基酸E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且其中胺基酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
在本發明之一個實施例中，根據上述方法經聚乙二醇化之IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55。
因此，在本發明之另一實施例中，根據上述方法經聚乙二醇化 之IGF1前驅蛋白質為由胺基酸序列SEQ ID NO：55組成之人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質。
在另一實施例中，本發明係關於根據上文所揭示之方法產生之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
此外，本發明係關於根據上述方法產生之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
此外，本發明之一個實施例係關於藉由上述方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
另外，在一個實施例中，本發明係關於可藉由上述方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
在一個特定實施例中，本發明係關於可藉由上述方法獲得之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
此外，本發明之一個實施例係關於藉由上述方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
在另一實施例中，本發明係關於根據上文所揭示之方法產生之 單聚乙二醇化IGF-1組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
此外，本發明係關於根據上述方法產生之聚乙二醇化IGF-1組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
另外，在一個實施例中，本發明係關於可藉由上述方法獲得之單聚乙二醇化IGF-1組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
在一個特定實施例中，本發明係關於可藉由上述方法獲得之聚乙二醇化IGF-1組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
此外，本發明之一個實施例係關於藉由上述方法獲得之單聚乙二醇化IGF-1組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
在另一實施例中，本發明係關於藉由上述方法獲得之聚乙二醇化IGF-1組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
在本發明之一個特定實施例中，包含在上述方法所揭示之組合物中之IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其中胺基酸E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且其中胺基 酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
另外，本發明係關於上述組合物，其中IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55。
因此，本發明係關於上述組合物，其中IGF1前驅蛋白質為由胺基酸序列SEQ ID NO：55組成之人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質。
在另一實施例中，本發明係關於上述組合物，其呈醫藥學上可接受之形式以用作藥物。
本發明進一步提供上述醫藥組合物以用於治療。
在本發明之另一實施例中，上述治療用途為治療有需要之患者體內之肌肉病症。在本發明之一個特定實施例中，治療用途為治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者或治療COPD患者，或治療脊髓延髓肌肉萎縮(Spinal and Bulbar Muscular Atrophy，SBMA或甘迺迪病(Kennedy disease))患者，或治療慢性腎病患者。因此，本發明提供如上所述之醫藥組合物以用於治療選自由以下組成之群的疾病或病狀：伴有瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA，甘迺迪病)及慢性腎病。
在本發明之另一實施例中，上述肌肉病症為肌肉萎縮。在本發明之一些態樣中，治療用途為治療與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。因此，本發明提供如上所述之醫藥組合物以用於治療選自由以下組成之群的疾病或病狀：肌肉萎縮、與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
本發明進一步提供一種治療有需要之患者體內之肌肉病症的方法，該方法包含投與治療有效量之上述組合物。
因此，在一個特定實施例中，本發明係關於治療罹患瘦體質量 損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者的方法，或治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者之方法，或治療甘迺迪病患者之方法，或治療慢性腎病患者之方法，該方法包含投與治療有效量之上述組合物。
另外，本發明提供一種治療有需要之患者體內之肌肉病症之方法，其中該肌肉病症為選自由以下組成之群的肌肉萎縮：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症，該方法包含投與治療有效量之上述組合物。
本發明之某些實施例描述於以下態樣中：
1.用於製備聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含在含水介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵為該反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，以得到聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。
2.用於製備單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含以下步驟：(a)在含水介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，(b)用步驟(a)中所獲得之組合物進行層析步驟，以得到單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。
3.如實施例2之方法，其中該層析步驟為陽離子交換層析步驟，其包含彙集含N端單聚乙二醇化治療性蛋白質之彼等溶離份，以得到單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。
4.如實施例1至3中任一者之製備組合物之方法，其中該治療性蛋白質為人類IGF-1前驅蛋白質或其變體。
5.如前述實施例中任一者之方法，其特徵為聚乙二醇化反應在α-環糊精(α-CD)存在下進行。
6.如前述實施例中任一者之方法，其特徵為PEG之總分子量為20kDa至100kDa。
7.如實施例6之方法，其特徵為PEG之總分子量為約30kDa。
8.如實施例2及4至7之方法，其中該交換層析步驟為陽離子交換層析(CEX)。
9.如實施例2及4至8之方法，其進一步包含以下其他步驟：b)超濾(UF)/透濾(DF)濃縮與緩衝液交換，c)最終過濾。
10.如實施例3至9中任一者之方法，其中IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其中胺基酸E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且其中胺基酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
11.如實施例10之方法，其中該IGF1前驅蛋白質為由SEQ ID NO：55組成之人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質。
12.如實施例1、5、6及7之方法產生之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
13.如實施例2及5至9之方法產生之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
14.可藉由實施例1、5、6及7之方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
15.可藉由實施例2及5至9之方法獲得之單聚乙二醇化治療性蛋 白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
16.藉由實施例1、5、6及7之方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
17.藉由實施例2及5至9之方法獲得之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
18.如實施例10及11之方法產生之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
19.可藉由實施例10及11之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
20.可藉由實施例10及11之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
21.藉由請求項10及11之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
22.藉由實施例10及11之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
23.如實施例18至22中任一者之組合物，其中IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其中胺基酸E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且其中胺基酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
24.如實施例23之組合物，其中該IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55。
25.如實施例12至24中任一者之組合物，其呈醫藥學上可接受之形式以用作藥物。
26.一種醫藥組合物，其包含藉由實施例1至11之方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質以用於治療。
27.如實施例25或26之醫藥組合物，其用於治療有需要之患者體內之肌肉病症。
28.如實施例25或26之醫藥組合物，其用於治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者。
29.如實施例25或26之醫藥組合物，其用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者。
30.如實施例25或26之醫藥組合物，其用於治療脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA或甘迺迪病)患者。
31.如實施例25或26之醫藥組合物，其用於治療慢性腎病患者。
32.如實施例27之醫藥組合物，其中該肌肉病症為肌肉萎縮。
33.如實施例32之醫藥組合物，其中該肌肉萎縮係選自由以下組成之群：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
34.治療有需要之患者體內之肌肉病症的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之如實施例25或26之組合物。
35.治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之如實施例25或26之組合物。
36.治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之如實施例25或26之組合物。
37.治療脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA或甘迺迪病)患者之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之如實施例25或26之組合物。
38.治療慢性腎病患者之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之如實施例25或26之組合物。
39.如實施例32之方法，其中該肌肉病症為選自由以下組成之群的肌肉萎縮：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
圖1：描述用於製備聚乙二醇化IGF-1Ea之方法的方法流程圖。該方法由聚乙二醇化反應、陽離子交換純化步驟(CEX)、緩衝液交換及濃縮步驟(UF/DF)以及最終過濾及填充步驟組成。
圖2：單PEG-IGF1同功異型物之部分分離之製備型CEX層析圖。1：N端聚乙二醇化IGF-1Ea形式；2、3及4：離胺酸聚乙二醇化IGF-1Ea形式。編號之箭頭指示層析圖上所彙集溶離份之位置。表示為1、2、3及4之集合體係由彙集在層析圖上用箭頭標記之時間點上溶離之部分而製備。
圖3：來自單PEG-IGF1同功異型物之製備型CEX分離的彙集物質之CE-HPLC分析。N：N端聚乙二醇化IGF-1Ea形式；離胺酸1、離胺酸2、離胺酸2a及離胺酸3：離胺酸聚乙二醇化IGF-1Ea形式。
圖4：用Toyopearl SP650S分離之製備型CEX層析圖。
圖5：用SP Sepharose HP分離之CEX層析圖。
一般定義
為使本發明可較容易理解，首先定義某些術語。在整個實施方式中列出其他定義。
約：術語「約」在本文中用於指大約、大致、在......左右或 在......區域中。當結合數值範圍使用術語「約」時，其藉由使所列出數值之界限向上及向下擴展來修改彼範圍。一般而言，術語「約」在本文中用於藉由向上或向下(較高或較低)之5%變化來調節數值以高於及低於所述值。舉例而言，約6.5 pH之術語應包括6.3至6.8之pH範圍。如本文所用，且若未另外規定，則字語「或」意謂特定清單之任一成員。片語約6.5至7.5之pH範圍內應包括6.3至7.9之pH範圍。
包含：術語「包含」意謂「包括」，例如「包含」X之組合物可僅由X組成或可包括另外之某物(例如X+Y)。
IGF-1蛋白質變體：為至少一種胺基酸不同於IGF-1野生型序列之蛋白質，其中術語「野生型序列」係指在至少一種天然存在之有機體中可獲得之多肽或基因序列或者未經改變、突變或以其他方式由人類操控之多肽或基因序列(若由蛋白質序列SEQ ID NO：1規定，則為人類IGF-1野生型序列)。IGF-1變體亦為包含肽前導序列之IGF-1前驅蛋白質或促IGF-1蛋白質。如上所述之IGF-1變體在此類蛋白質可視為野生型IGF-1之功能等效物之意義上保持其生物活性。IGF-1野生型蛋白質之功能等效物對IGF-1受體蛋白質具有特異性親和力。
關於IGF-1蛋白質之功能等效物必須理解為包含天然或人造突變之IGF-1蛋白質。突變可為插入、缺失或替代一或多種不削弱IGF-1蛋白質生物活性之核酸。功能等效物與IGF-1野生型蛋白質(例如人類IGF-1蛋白質SEQ ID NO：1)之一致性為至少80%，較佳85%，更佳90%，最佳95%以上，極尤佳至少98%一致性-但小於100%。在融合蛋白之情況下，100%一致性應僅基於此類融合蛋白質之IGF-1部分來界定。
類胰島素生長因子(IGF)為使用細胞與其生理環境通訊之複合系統之部分。此複合系統(常稱為類胰島素生長因子軸)係由兩個細胞表面受體(IGF-1R及IGF-2R)、兩個配位體(IGF-1及IGF-2)、一個具有六 種高親和力IGF結合蛋白(IGFBP 1-6)之家族及相關IGFBP降解酶(蛋白酶)組成。此系統不僅對於調節正常生理為重要的，對於調節多種病理狀態亦為重要的(Glass,Nat Cell Biol 5：87-90,2003)。已展示IGF軸在促進細胞增生及抑制細胞死亡(細胞凋亡)中起作用。IGF-1主要由於人類生長激素(hGH)之刺激而由肝分泌。人體內幾乎每一細胞均受IGF-1影響，尤其肌肉、軟骨、骨骼、肝、腎、神經、皮膚及肺中之細胞。除類胰島素作用以外，IGF-1亦可調節細胞生長。IGF-1及IGF-2係由稱為IGF結合蛋白之基因產物家族調節。此等蛋白質有助於以複雜方式調節IGF活動，其涉及藉由阻止結合至IGF受體而抑制IGF活動以及經由幫助傳遞至受體且提高血流中之IGF半衰期而促進IGF活動。存在至少六種特性化之結合蛋白質(IGFBP1-6)。IGF-1用於廣泛範圍之治療應用。美卡舍明(Mecasermin)(商品名IncrelexTM)為經批准用於治療生長障礙之合成IGF-1類似物。若干公司已在臨床試驗中就各種其他適應症評估IGF-1，包括1型糖尿病、2型糖尿病、肌肉萎縮性側索硬化、嚴重燒傷及肌肉緊張性肌肉萎縮症。
為清楚及一致起見，在本申請全文及申請專利範圍中，IGF-1前驅或成熟蛋白質中胺基酸殘基之編號係基於不含信號肽(亦即SEQ ID NO：5)的人類類胰島素生長因子1(促生長因子C)、同功異型物CRA_c(寄存編號EAW97697)之野生型前驅蛋白質序列編號。
PEG：用於本發明之情形中時係指聚乙二醇。
PEG-CHO：係指甲氧基聚乙二醇丙醛試劑(例如SUNBRIGHT ME-300AL，購自NOF Corporation,Japan或30kDa mPEG丙醛，購自Dr Reddy's(EU)Limited)。
術語「較高PEG形式」、「較高聚乙二醇化形式」、「較高聚乙二醇化變體」或「二-、三-或較高聚乙二醇化形式」係用於描述蛋白質有一個以上PEG分子(例如兩個、三個或三個以上PEG分子)連接的二- 、三-或較高聚乙二醇化蛋白質。術語「單聚乙二醇化」係用於描述在聚乙二醇化方法期間僅單個PEG分子已連接至指定蛋白質之情形。
「聚乙二醇化反應」、「聚乙二醇化」或「聚乙二醇化方法」係指使聚乙二醇(PEG)聚合物鏈連接至另一分子(在本發明之情形中，連接至人類IGF-1前驅分子)之共價連接方法。
前驅體：在下文中，當用於本發明之情形中時，術語「前驅體」應指不含信號肽但分別包括Ea、Eb及Ec肽的成熟人類IGF-1蛋白質之前驅體。
還原烷化：術語「還原烷化」係指在還原劑存在下使羰基及胺基轉化成胺之反應。此反應多年來已為已知的且其被視為製造胺之最重要方式。
在聚乙二醇化之情況下，PEG-CHO試劑在溫和還原條件下與蛋白質之胺基反應。反應在縮合與還原兩步中進行。在第一步中，形成不穩定席夫鹼(Schiff's base)，接著使其還原為試劑與蛋白質之間的穩定二級胺鍵：
步驟I：縮合
CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CHO+NH2(N端)-蛋白質CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH=N(N端)-蛋白質
步驟II：還原
CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH=N(N端)-蛋白質→CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2NH-蛋白質
對於蛋白質修飾，通常選擇溫和還原劑(諸如氰基硼氫化鈉)以避免同時還原蛋白質中之天然二硫鍵。
治療性蛋白質：術語「治療性蛋白質」係指用於人類或獸醫學治療之蛋白質且其可預期用於急性或慢性投藥。特定言之，「治療性蛋白質」為用於治療具有疾病或病理病狀之哺乳動物的蛋白質。
實施方式
本發明描述以高度可再現方式製備及純化聚乙二醇化治療性蛋白質。產物為經聚乙二醇(PEG)連接至N端或離胺酸胺基之單聚乙二醇化蛋白質。
本發明提供以改良之選擇性使治療性蛋白質聚乙二醇化之程序。在聚乙二醇化期間使用之條件提供更改或調節聚乙二醇化治療性蛋白質變體之概況以及減少較高聚乙二醇化蛋白質變體之量的能力。將反應導向所要結合物之參數為聚乙二醇化混合物之pH。意外地，在聚乙二醇化混合物中添加α-環糊精(α-CD)顯著降低反應速率且因此顯著減少較高聚乙二醇化形式之形成。另外，α-CD能夠藉由減緩聚乙二醇化反應而較佳地控制聚乙二醇化反應。該等聚乙二醇化條件確保方法之高產量及高再現性。
本發明係關於以在離胺酸(Lys)與N端聚乙二醇化同功異型物之間達成部分分離的方式採用層析步驟(例如，陽離子交換層析(CEX))且能夠在最終單聚乙二醇化產物中控制聚乙二醇化同功異型物組成的純化/分離方法。
在一個實施例中，本發明係關於一種用於製備聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含在含水介質中使該治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行。
本發明之另一實施例係關於一種用於製備單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含以下步驟： (a)在含水介質中使治療性蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，(b)用步驟(a)中所獲得之組合物進行交換層析步驟，(c)獲得交換層析步驟(b)之溶離部分，及(d)彙集彼等含有單聚乙二醇化治療性蛋白質之溶離份。
本發明亦係關於根據上述方法產生之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
此外，本發明係關於根據上述方法產生之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
此外，本發明之一個實施例係關於藉由上述方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
另外，在一個實施例中，本發明係關於可藉由上述方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
在一個特定實施例中，本發明係關於可藉由上述方法獲得之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
此外，本發明之一個實施例係關於藉由上述方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性 蛋白質。
上述治療性蛋白質可為生長因子。生長因子為此項技術中已知的且包括(但不限於)腎上腺髓素(AM)；血管生成素(Ang)；自分泌動力因子；骨形態發生蛋白(BMP)；腦衍生神經營養因子(BDNF)；表皮生長因子(EGF)；紅血球生成素(EPO)；纖維母細胞生長因子(FGF)；膠細胞株衍生神經營養因子(GDNF)；顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)；生長分化因子-9(GDF9)；肝細胞生長因子(HGF)；肝癌衍生生長因子(HDGF)；遷移刺激因子；肌肉生長抑制素(GDF-8)；神經生長因子(NGF)及其他神經營養因子；血小板衍生生長因子(PDGF)；血小板生成素(TPO)；轉變生長因子α(TGF-α)；轉變生長因子β(TGF-β)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；血管內皮生長因子(VEGF)；Wnt信號傳導路徑胎盤生長因子(PlGF)；胎牛生長素(FBS)；介白素2-(IL2)、IL3-、IL4-、IL5-、IL6-、IL7-生長因子。
因此，本發明亦係關於以高度可再現方式製備及純化聚乙二醇化類胰島素生長因子-1或其變體，如類胰島素生長因子-1 Ea變體(IGF-1Ea)。產物為有聚乙二醇(PEG)連接至N端或離胺酸胺基之單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質(例如IGF-1Ea)。
本發明提供以改良之選擇性使IGF-1或其變體(如IGF-1Ea)聚乙二醇化之程序。在聚乙二醇化期間使用之條件提供更改或調節聚乙二醇化IGF-1或其變體(如IGF-1Ea前驅蛋白質)之概況以及減少較高聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質形式之量的能力。將反應導向所要結合物之參數為聚乙二醇化混合物之pH。意外地，在聚乙二醇化混合物中添加α-環糊精(α-CD)顯著降低反應速率且因此顯著減少較高聚乙二醇化IGF-1形式或其變體(如IGF-1Ea前驅蛋白質)之形成。另外，α-CD能夠藉由減緩聚乙二醇化反應而較佳地控制聚乙二醇化反應。該等聚乙二 醇化條件確保方法之高產量及高再現性。
本發明亦描述以在離胺酸(Lys)與N端聚乙二醇化同功異型物之間達成部分分離的方式採用層析步驟(例如，陽離子交換層析(CEX))且能夠在最終單聚乙二醇化產物中控制聚乙二醇化同功異型物組成的純化/分離方法。
因此，在一個態樣中，本發明提供直接由聚乙二醇化方法獲得之聚乙二醇化人類IGF-1蛋白質或其變體(如IGF-1Ea前驅蛋白質)組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%，或至少62%，或至少63%，或至少64%，或至少65%，或至少66%，或至少67%單聚乙二醇化hIGF-1前驅蛋白質部分為N端單聚乙二醇化hIGF-1蛋白質，例如IGF-1Ea前驅蛋白質。
此外，本發明提供直接由聚乙二醇化方法獲得之聚乙二醇化人類IGF-1蛋白質或其變體(如IGF-1Ea前驅蛋白質)組合物，其中在該組合物中，該組合物之至少61%，或至少62%，或至少63%，或至少64%，或至少65%，或至少66%，或至少67%單聚乙二醇化部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，且其中較高聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之量少於所有聚乙二醇化IGF-1蛋白質(例如IGF-1Ea前驅蛋白質)之20%，或小於19%，或小於18%，或小於17%。
存在於由聚乙二醇化方法產生之反應混合物中的單聚乙二醇化及較高聚乙二醇化IGF-1蛋白質(例如IGF-1Ea前驅蛋白質)之量可藉由熟習此項技術者所熟知之逆相HPLC法(Park等人，Journal of Chromatography A,1216,(2009),7793-7797，Seely等人，BioPharm Int,(2005)1-7)測定。
存在於由聚乙二醇化方法產生之反應混合物中的N端單聚乙二醇化IGF-1蛋白質(例如IGF-1Ea前驅蛋白質)之量可藉由熟習此項技術者所熟知之陽離子交換層析HPLC(CE-HPLC)法(Wang等人，Advanced Drug Delivery Reviews,17(2002),547-570，Monkarsh等人，Anal Biochem,247,(1997),434-440)測定。
因此，本發明亦提供直接由聚乙二醇化方法獲得之聚乙二醇化人類IGF-1蛋白質(例如IGF-1Ea前驅蛋白質)組合物，其中該組合物之該單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分含有至少66% N端單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質。
此外，本發明亦提供直接由聚乙二醇化方法獲得之聚乙二醇化人類IGF-1蛋白質(例如IGF-1Ea前驅蛋白質)組合物，其中該組合物之該單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分含有至少66% N端單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質且其中較高聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之量少於所有聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之20%。
在本發明之一個特定實施例中，包含在上述組合物中的連接至人類IGF-1前驅蛋白質之PEG為直鏈或分支鏈且總分子量為20kDa至100kDa，或20kDa至80kDa，或20kDa至70kDa，或20kDa至60kDa，或20kDa至50kDa。因此，在本發明之一個實施例中，組合物包含以分子量約30kDa之直鏈PEG聚乙二醇化的人類IGF-1蛋白質(例如IGF-1Ea前驅蛋白質)。
包含在本發明組合物中之聚乙二醇化人類IGF-1前驅分子可為包含Ea、Eb、Ec肽之野生型人類IGF-1前驅蛋白質。此外，包含在本發明組合物中之聚乙二醇化人類IGF-1前驅分子可為包含Ea、Eb、Ec肽之人類IGF-1前驅蛋白質之突變形式。因此，本發明提供包含聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質之上述組合物，其中至少61%，或至少62%，或至少63%，或至少64%，或至少65%，或至少66%，或至少67%，或至少68%，或至少69%，或至少70%或70%以上單聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質部分在N端單聚乙二醇化，且其中一或多個位於選自由以下組成之群之位置的胺基酸突變及/或缺失：G1、 P2、E3、R36、R37、G42、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104及/或M105，其中該等胺基酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
另外，本發明提供單聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物，其中該組合物包含至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少91%，或至少92%，或至少93%，或至少94%，或至少95%，或至少96%，或至少97%或97%以上單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，且其中一或多個位於選自由以下組成之群之位置的胺基酸突變及/或缺失：G1、P2、E3、R36、R37、G42、K68、S69、A70、R71、S72、R74、R77、G96、S97、A98、G99、N100、K101、N102、Y103、Q104及/或M105，其中該等胺基酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
此類分子之實例包括(但不限於)以下多肽變體：包含人類IGF-1Ea-肽前驅蛋白質之多肽，其中胺基酸
(1)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失。
(2)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(3)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失。
(4)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(5)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
(6)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(7)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37經取代或缺失且胺基酸 R71及S72缺失。
(8)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(9)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
(10)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(11)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(12)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及Q104突變為麩醯胺酸(Q)。
(13)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(14)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(15)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(16)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(17)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(18)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(19)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(20)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸 R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(21)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(22)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(23)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(24)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(25)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(26)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(27)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(28)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(29)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(30)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(31)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(32)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(33)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(34)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(35)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(36)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(37)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(38)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(39)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(40)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(41)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及Q104突變為麩醯胺酸(Q)。
(42)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(43)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸 K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(44)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(45)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(46)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(47)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(48)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(49)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(50)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(51)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(52)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(53)G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(54)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(55)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(56)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(57)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(58)G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
在另一實施例中，本發明係關於包含多肽(1)至(58)之上述蛋白質，其中在該等分子中，位置1至3之突變改為僅胺基酸E3缺失。
此類分子之實例包括(但不限於)以下多肽：包含人類IGF-1Ea-肽前驅蛋白質之多肽，其中胺基酸
(59)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失。
(60)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(61)E3缺失，胺基酸R37經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失。
(62)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(63)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
(64)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(65)E3缺失，胺基酸R36及R37經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失。
(66)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
(67)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
(68)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(69)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(70)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及Q104突變為麩醯胺酸(Q)。
(71)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(72)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(73)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(74)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(75)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(76)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(77)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(78)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(79)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(80)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(81)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(82)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(83)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(84)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(85)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(86)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(87)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(88)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(89)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(90)E3缺失，胺基酸R37經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(91)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(92)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(93)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(94)E3缺失，胺基酸R36及R37經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(95)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(96)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
(97)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(98)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(99)E3缺失，胺基酸R36經取代或缺失且胺基酸K68、S69、 A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及Q104突變為麩醯胺酸(Q)。
(100)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(101)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(102)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(103)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(104)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(105)E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(106)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(107)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(108)E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(109)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(110)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、 A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(111)E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸。
(112)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變為麩醯胺酸(Q)。
(113)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(114)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變為麩醯胺酸(Q)。
(115)E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
(116)E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變為麩醯胺酸(Q)。
在另一實施例中，本發明係關於包含如上所述經聚乙二醇化之人類IGF-1前驅變體(例如，多肽變體1至116)之上述組合物，其包含由以下胺基酸組成之突變E-肽：a)VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG(SEQ ID.NO.：99)，或b)VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS(SEQ ID. NO.：100)c)VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYQM(SEQ ID.NO.：101)。
在一個實施例中，本發明提供包含單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質之上述組合物，其中該人類IGF-1Ea前驅多肽包含描述於以上人類IGF-1Ea前驅多肽變體63中之突變。
在一個實施例中，本發明提供包含單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質之上述組合物，其中該聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致於SEQ ID NO：55。
在一個實施例中，本發明提供包含單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質之上述組合物，其中該人類IGF-1Ea前驅多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：55。
因此，本發明之一個實施例亦係關於直接由聚乙二醇化方法獲得之上述聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物，其中在該組合物中，該組合物之至少64%單聚乙二醇化部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，且其中人類IGF-1Ea前驅多肽由胺基酸序列SEQ ID NO：55組成。
上述聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物可藉由包含在含水介質中使該等IGF-1前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇(例如直鏈PEG)在還原烷化條件下反應之步驟的方法產生，其中在該組合物中，該組合物之至少61%、或至少62%、或至少63%、或至少64%、或至少65%、或至少66%、或至少67%單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該方法之特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行。
在另一實施例中，本發明係關於直接由本文所述之聚乙二醇化方法產生之聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物，其中在該組合物中，該組合物之至少61%、或至少62%、或至少63%、或至少64%、或至少65%、或至少66%、或至少67%單聚乙二醇化IGF-1前驅 蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該組合物藉由包含在含水介質中使人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟的方法而獲得，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行。
在一個特定實施例中，上述組合物藉由在含水介質中使人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之方法獲得，其特徵為該偶合反應在α-環糊精(α-CD)存在下於約6.5至7.5之pH範圍內進行。
因此，在另一特定實施例中，本發明係關於直接由本文所述之聚乙二醇化方法產生的上述聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物，其中在該組合物中，該組合物之至少61%、或至少62%、或至少63%、或至少64%、或至少65%、或至少66%、或至少67%單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為可由在含水介質中使人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應獲得之N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行。在本發明之另一實施例中，上述還原烷化反應在約6.5之pH進行。
在一個特定實施例中，上述組合物可由在含水介質中使人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應獲得，其特徵為該偶合反應於約6.5之pH下在α-環糊精(α-CD)存在下進行。
本發明之另一實施例係關於製備直接由聚乙二醇化方法產生之聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物的方法，其中在該組合物中，該組合物之至少61%、或至少62%、或至少63%、或至少64%、或至少65%、或至少66%、或至少67%單聚乙二醇化部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該方法包含在含水介質中使IGF-1前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵為該偶合 反應在約6.5之pH下進行。
在一個特定實施例中，本發明係關於製備直接由聚乙二醇化方法產生之聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物的方法，其中在該組合物中，該組合物之至少61%、或至少62%、或至少63%、或至少64%、或至少65%、或至少66%、或至少67%單聚乙二醇化部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該方法包含在含水介質中使IGF-1前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵為該偶合反應在約6.5至7.5之pH下在α-環糊精(α-CD)存在下進行。
α-環糊精(α-CD)可在1%至5%(1g/100ml至5g/100ml)之最終濃度範圍內使用。在一個特定實施例中，添加至反應混合物中之固體α-CD多至3%最終濃度。
在本發明之一個特定實施例中，用於上述方法之PEG為直鏈的且總分子量為20kDa至100kDa，或20kDa至80kDa，或20kDa至70kDa，或20kDa至60kDa，或20kDa至50kDa。因此，在本發明之一個實施例中，用於上述方法之PEG為直鏈PEG且總分子量為約30kDa。如上述使用之PEG可為直鏈或分支鏈的。
上述方法可包含允許進一步純化、分離、增濃直接由上述聚乙二醇化步驟產生之聚乙二醇化蛋白質或彼等蛋白質之所要蛋白質部分的其他步驟。熟習此項技術者瞭解可行技術(Fee等人，Chemical Engineering ScienceChemical Engineering Science,61(2006)924-939)，Pabst等人，Journal of Chromatography A,1147(2007)172-182，Lee等人，Pharmaceutical Research,20 2003 818-85)。在一個特定實施例中，此等其他步驟可為陽離子交換層析(CEX)(Yun等人，Journal of Biotechnology,118(2005)67-74，Jevsevar等人，Biotechnol.J.,5(2010)113-128,Molineux,Current Pharmaceutical Design,10(2004)1235-1244)，Baker等人，Bioconjugate Chem.17(2006)179-188)。本 發明亦描述以在離胺酸(Lys)與N端聚乙二醇化同功異型物之間達成部分分離之方式採用陽離子交換層析(CEX)且能夠在最終單聚乙二醇化產物中控制聚乙二醇化同功異型物組成的純化/分離方法。
意外地，在上述發明方法條件下，將α-CD添加至聚乙二醇化混合物中減少較高聚乙二醇化形式之形成以及減緩聚乙二醇化反應。將α-CD添加至聚乙二醇化混合物中減少較高聚乙二醇化形式之量，簡化層析純化，且由於簡化之層析純化而從而保證較高產量。將α-CD添加至聚乙二醇化方法中提高批次一致性且確保方法之高產量及高再現性。批次一致性亦由陽離子交換層析純化步驟控制，該步驟以達成離胺酸聚乙二醇化與N端聚乙二醇化同功異型物之部分分離的方式進行。
本發明之另一實施例係關於製備單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質組合物之方法，其中該組合物包含至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%或97%以上單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質，該方法包含以下步驟：
(a)在含水介質中使IGF-1前驅蛋白質與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵為該偶合反應為在約6.5之pH下在α-環糊精(α-CD)存在下進行，
(b)用步驟(a)中所獲得之組合物進行交換層析步驟，
(c)獲得交換層析步驟(b)之溶離部分，及
(d)彙集彼等含有單聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質同功異型物之溶離份。
在本發明之一個特定實施例中，上述步驟(b)為陽離子交換層析(CEX)。
同樣，除上述交換層析步驟(b)(例如CEX)以外，可將以下濃縮/ 純化步驟添加至上文所揭示之方法中：
(e)UF/DF濃縮與緩衝液交換
進行之超濾及透濾步驟旨在將CEX層析緩衝液濃縮且交換成最終緩衝液(實例4；UF/DF步驟、無菌過濾及填充)。
(f)最終過濾及填充(實例4)
因此，本發明之另一實施例係關於分別藉由進行上述方法步驟(a)至(d)與步驟(a)至(f)獲得的包含90%以上單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之組合物。
在本發明之一個特定實施例中，分別包含步驟(a)至(d)與步驟(a)至(f)的上文所揭示之方法係用於製備變體63單聚乙二醇化人類IGF-1Ea前驅蛋白質組合物(如上所述)。
因此，本發明之一個實施例涉及分別包含步驟(a)至(d)與步驟(a)至(f)的上文所揭示之方法，其中該方法係用於製備由蛋白質序列SEQ ID NO：55組成之單聚乙二醇化人類IGF-1Ea前驅蛋白質組合物。
根據上文所揭示之聚乙二醇化方法/製程產生的包含N端及離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之上述組合物可進一步加工成醫藥學上可接受之形式。熟習此項技術者瞭解先前技術中可用之相關調配物技術。
因此，本發明係關於產生醫藥組合物，其包含SEQ ID NO：55之N端或離胺酸殘基單聚乙二醇化人類IGF-1Ea前驅多肽，該方法包含以下步驟：(a)在含水介質中使SEQ ID NO：55之人類IGF-1Ea前驅多肽與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵為該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內在α-環糊精(α-CD)存在下進行，及(b)用步驟(a)中所獲得之組合物進行交換層析步驟，(c)獲得交換層析步驟(b)之溶離部分，及 (d)彙集彼等含有單聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質同功異型物之溶離份，以及(e)使用步驟(d)中所獲得之溶離份來製備醫藥組合物。
層析純化
藉由層析法在強力陽離子交換樹脂上自過量試劑、反應副產物及非聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質純化單聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質。純化係在仍能夠將單聚乙二醇化IGF-1Ea滯留於管柱上且同時足夠高以達成離胺酸與N端單聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質之間的至少部分分離之pH下進行。經測定，6.5與7.5之間的pH範圍最適於分離。因此，本發明係關於上述方法，其中層析純化步驟(例如上文步驟(b))係在約6.5之pH下進行。
或者，可在製備步驟(e)之醫藥組合物之前在上述方法中應用如UF/DF濃縮、緩衝液交換及過濾之其他步驟。
根據本發明方法產生的包含單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質之所得醫藥組合物可用於治療。
因此，在一個實施例中，本發明係關於上文提及之特定及新穎組合物，其包含呈醫藥學上可接受形式的單聚乙二醇化人類IGF-1前驅蛋白質以用於治療用途，尤其用於治療有需要之患者體內之肌肉病症的治療用途。在本發明之一個特定實施例中，治療用途為治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者或治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者，或治療脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA或甘迺迪病)患者，或治療慢性腎病患者。
在尤佳之實施例中，本發明係關於彼等醫藥組合物在治療中之上文規定之醫藥用途，該等醫藥組合物已藉由使用根據上述方法製備的包含至少95%或95%以上N端與離胺酸殘基單聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質(由SEQ ID NO：55組成)之混合物的組合物來製備。
本發明進一步提供治療有需要之患者體內之肌肉病症的方法，該方法包含投與治療有效量之根據本文所揭示之方法產生的包含N端殘基聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質之組合物。
因此，在一個特定實施例中，本發明係關於治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者之方法，或治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者之方法，或治療甘迺迪病患者之方法，或治療慢性腎病患者之方法，其包含投與治療有效量之根據本文所揭示之方法產生的包含N端殘基聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質之組合物。
胺基酸突變
參考上文，多種胺基酸可突變為另一種胺基酸。然而，可使用其他胺基酸，諸如來自另一基團(亦即，極性、酸性、鹼性或非極性)之非天然胺基酸或天然胺基酸。在蛋白質之胺基酸中引入突變之方法為熟習此項技術者所熟知的。參見例如Ausubel(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；T.Maniatis,E.F.Fritsch及J.Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。方法包含(但不限於)藉由用突變誘發引物進行之聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼多肽功能活性變體或其片段且在需要時藉由組裝PCR而組裝片段之DNA，或使用市售套組(諸如「QuikChange.TM.定點突變誘發套組」；Stratagene)來引入突變。參見例如Ausubel(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；T.Maniatis,E.F.Fritsch及J.Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。另外，突變序列可藉由合成基因合成，即由商業公司(例如，Geneart,Life Technology)提供之服務獲得。藉由置換不影響多肽功能的胺基酸產生多肽功能活性變體或多肽衍生物可由熟習此項 技術者來完成。
產生治療性蛋白質
目前使用之先進技術之異源蛋白質產生系統包括原核及真核細胞系統，如大腸桿菌、酵母、病毒、真菌及昆蟲細胞。為產生需要轉譯後或圍轉譯修飾(諸如糖基化)(且需要工業規模產生)之重組蛋白質，經常使用包括來自灰倉鼠(Cricetulus griseus)、草原猴(Cercopithecus aethiops)、智人、金倉鼠(Mesocricetus auratus)、小家鼠(Mus musculus)及綠猴屬(Chlorocebus species)之細胞的哺乳動物細胞系統。哺乳動物細胞系統已變為治療性蛋白質及抗體之常規產生系統。在最近歷史中該等細胞已充分特性化，其可達至極高產生濃度，可不含感染性或病毒樣粒子，可在生物反應器中生長至極高密度且其可經基因操控及轉化。舉例而言，中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞可藉由轉染適當糖基轉移酶而經改造以類似於人類聚糖概況。以重組方式產生之生長因子已廣泛用於治療應用或為發展新穎療法之有前景之候選物。
熟習此項技術者知曉如何轉化、選擇及培養經遺傳修飾之哺乳動物細胞，例如CHO細胞，如CHO-K1衍生物、CHO-DUXB11衍生物或CHO-DG44細胞。選擇方案常規地用於促進選擇很可能已整合編碼所要治療性蛋白質(如生長因子，例如IGF-1)之重組DNA的細胞。常規地使用抗生素耐藥性或在由轉化載體上共同整合之基因賦予的營養學選擇性培養基中生長之能力。(參見Weber,W.及Fussenegger,M.(2003)Inducible gene expression in mammalian cells,Gene transfer and expression in mammalian cells,(Makrides,S.C.，編)，Elsevier：Amsterdam，第589-604頁。)(Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector：Niwa Hitoshi,Yamamura Ken-ichi,Miyazaki Jun-ichi)。產生重組蛋白質之兩種最常見CHO表現 系統利用基於二氫葉酸還原酶(DHFR)之甲胺喋呤(MTX)選擇或基於麩醯胺酸合成酶(GS)之甲硫胺酸磺基肟(MSX)選擇(Rita Costa A,Elisa Rodrigues M,Henriques M,Azeredo J,Oliveira R.Eur J Pharm Biopharm.2010年2月；74(2)：127-38.電子版2009年10月22日.Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production)。
用經轉染哺乳動物細胞(例如CHO細胞)大規模產生多肽可例如在wave、玻璃或不鏽鋼生物反應器中進行。出於該目的，細胞經擴增，通常自單個冷凍小瓶，例如來自主細胞庫(Master Cell Bank)之小瓶起始。經由若干步驟解凍且擴增細胞。不同規模之生物反應器接種有適當量之細胞。可藉由向生物反應器中添加進料溶液及添加劑來提高細胞密度。細胞持續較長時間保持在高存活力下。以大規模獲得在每公升數百毫克達至每公升數公克範圍內的反應器中之產物濃度。可藉由標準層析方法完成純化，其可包括親和、離子交換、疏水相互作用或尺寸排阻層析步驟。生物反應器之尺寸可達至數千公升體積之最終規模(亦參見例如F.Wurm,Nature Biotechnology第22卷，11,2004,1393-1398)。
可在大腸桿菌中使用Npro自蛋白酶融合技術(Npro Autoprotease Fusion Technology，NAFT)極有效地產生治療性蛋白質。熟習此項技術者瞭解尤其已在專利申請案/專利WO200111056、WO200111057、WO2006113957、EP1200604B1及US6936455B1中極詳細揭示之此技術。
醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供組合物，例如醫藥組合物，其含有根據本發明之方法或製程產生，與醫藥學上可接受之載劑一起調配的上述聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物中之一者或組合。本發明之醫藥組合物亦可以組合療法，亦即與其他藥劑組合投與。舉 例而言，根據本發明之方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物可與至少一種以下肌肉質量/力量增加劑組合：例如抗ActRIIB抗體、抗ActRIIA/B泛抗體IGF-2或變體IGF-2、抗肌肉生長抑制素抗體、肌肉生長抑制素原肽、結合ActRIIB但不使其活化之肌肉生長抑制素誘餌蛋白質、β 2促效劑、胃內激素促效劑、SARM、GH促效劑/模擬劑或卵泡抑素。下文在關於本發明之IGF-1變體用途之章節中更詳細地描述可用於組合療法之治療劑之實例。
術語「醫藥學上可接受」意謂由聯邦政府或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他用於動物，且更特定言之用於人類之公認藥典中。術語「載劑」係指與治療一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物油、植物油或合成來源之彼等者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。適合醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。若需要，組合物亦可含有微量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝液。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、持續釋放調配物及其類似物之形式。可將組合物與傳統黏合劑及載劑(諸如甘油三酯)一起調配為栓劑。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合藥物載劑之實例描述於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。
在一個較佳實施例中，根據常規程序將組合物調配成適合於向人類靜脈內投與之醫藥組合物。若需要，組合物亦可包括增溶劑及諸如利多卡因(lidocaine)之局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。當組合物係藉由輸液投與時，其可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸液 瓶分配。當組合物係藉由注射投與時，可提供注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿，以使成分可於投與前混合。
醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似者。載劑應適用於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、經脊椎或經表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投與途徑而定，可在材料中塗佈活性化合物(亦即，抗體、生長因子、免疫結合物或雙特異性分子)以保護化合物不受可使化合物不活化之酸及其他天然條件之作用。
本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基甲氧苯(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
可用於本發明之醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用塗佈物質(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由前述滅菌程序及藉由包括多種抗菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物存在。將等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物包括於組合物中亦可為所要的。此外，可藉由包括延緩吸收之試劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成可注射藥物形式之延長吸收。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。此類介質及試劑用於醫藥學活性物質之用途在此項技術中為已知的。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其在本發明之醫藥組合物中之用途。亦可將補充活性化合物併入組合物中。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)之溶劑或分散介質及其適合混合物。可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中可包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可藉由在組合物中包括延緩吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由以所需量將活性化合物併入含有上文所列舉試劑中之一者或組合的適當溶劑中，視需要隨後進行滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉試劑之其他所需試劑的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性劑加來自其先前無菌過濾溶液之任何其他所要試劑的粉末。
可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性劑之量將視所治療之個體及特定投藥模式而變化。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性劑之量一般將為產生治療作用之組合物之量。一般而言，以100%計，此量將在約0.01%至約99%活性劑，約0.1%至約70%，或約1%至約30%活性劑與醫藥學上可接受之載劑組合之範圍內。
調節劑量方案以得到最佳所要反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團；可隨時間投與若干分次劑量；或可按治療情況之緊急需要所指示按比例減少或增加劑量。出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，將非經腸組合物調配成單位劑型為尤其有利的。如本文中所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上離散之單位；各單位含有經計算以產生所要治療作用之預定量的與所需醫藥載劑締合之活性化合物。本發明之單位劑型之規格由活性化合物之獨特特徵及待達成之特定治療作用，及在混配此類活性化合物用於治療個體之敏感性的技術中固有之限制來規定且直接視其而定。
在投與根據本發明之方法或製程產生的聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物之情形中，治療有效量之多肽在約0.001mg/kg至10mg/kg，且較通常0.1mg/kg至10mg/kg主體體重範圍內。舉例而言，劑量可為約0.1mg/kg體重，可為約0.2mg/kg體重，可為約0.3mg/kg體重，可為約1mg/kg體重，可為約3mg/kg體重，可為約5mg/kg體重或約10mg/kg體重。熟習此項技術者知曉如何確定適合之有效劑量，其將視投藥途徑(例如靜脈內或皮下)而變化。一個例示性治療方案需要每天一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次或每月一次進行投藥。此類投藥可靜脈內或皮下地進行。藉由靜脈內投藥，根據本發明之方法或製程產生的聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物之劑量方案包括0.1mg/kg體重或0.2mg/kg體重或0.3mg/kg體重或0.5mg/kg體重或1mg/kg體重或3mg/kg體重或10mg/kg體重。或者，組合物可為持續釋放調配物，在此情況下需要較不頻繁之投藥。劑量及頻率視抗體在患者體內之半衰期而變化。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，在長時期內以相對不頻繁之時間間隔投與相對低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短之時間 間隔投與相對高之劑量直至疾病進程得以延緩或終止，或直至患者展示疾病症狀得以部分或完全改善。其後，可向患者施以預防性方案。
本發明醫藥組合物中活性劑之實際劑量濃度可變化，以獲得可有效達成針對特定患者、組合物及投藥模式之所要治療反應而對患者無毒的活性劑之量。所選劑量濃度應視多種藥物代謝動力學因素而定，該等因素包括所採用之本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性；投藥途徑；投藥時間；所採用之特定化合物之排泄率；治療持續時間；與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫療技術中所熟知之類似因素。
投與治療有效劑量之根據本發明之方法或製程產生的聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物可導致疾病症狀之嚴重程度降低，無疾病症狀週期之頻率及持續時間增加，或防止因疾病病痛所致之損傷或失能(亦即，提高燒傷患者之肌肉質量及/或功能或降低/減小創傷面積)。
患者將接受有效量(亦即，足以偵測、治療、改善或預防所述疾病或病症之量)之多肽活性成分。治療作用亦可包括生理症狀之減少。用於任何特定個體之治療性蛋白質之最佳有效量及濃度應視各種因素而定，包括患者之年齡、身材、健康及/或性別；病狀之性質及程度；特定治療性蛋白質之活性；身體對其之清除率；以及與治療性蛋白質組合投與之任何可能之其他治療。對於指定情形傳遞之有效量可由常規實驗確定且在臨床師之判斷內。劑量可依據單劑量時程或多劑量時程。
本發明之組合物可藉由一或多種投藥途徑使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。本發明之治療性蛋白質之投藥途 徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下、經脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文中所用，片語「非經腸投與」意謂經腸及局部投與以外(通常藉由注射)之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及腦幹內注射及輸注。在一個實施例中，靜脈內投與包含組合物之抗體。在另一實施例中，皮下投與抗體。
或者，根據本發明之方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物可以非經腸途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如以鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部方式。
活性化合物可與保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微膠囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此調配物之許多方法為獲得專利的或一般為熟習此項技術者已知的。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治療性組合物可用此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一個實施例中，本發明之治療性組合物可用無針皮下注射裝置，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所示之裝置投與。可用於本發明之熟知植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其顯示以控制速率分配藥物之可植入微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其顯示經皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，其顯示以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其顯示用於連續藥物傳遞之可變流速之可植入 輸注設備；美國專利第4,439,196號，其顯示具有多腔隔室之滲透藥物傳遞系統；及美國專利第4,475,196號，其顯示滲透藥物傳遞系統。許多其他此類植入物、傳遞系統及模組為熟習此項技術者已知，且包括由MicroCHIPSTM(Bedford,MA)製造者。
在某些實施例中，可調配根據本發明之方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物以確保活體內之適當分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除許多高度親水性化合物。為確保本發明之治療性化合物通過BBB(若需要)，該等化合物可調配於例如脂質體中。對於製備脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號；第5,374,548號；及第5,399,331號。脂質體可包含一或多個部分，選擇性輸送至特定細胞或器官中，由此增強靶向藥物傳遞(參見例如V.V.Ranade,1989 J.Cline Pharmacol.29：685)。例示性靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如美國專利第5,416,016號)；甘露糖苷(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；界面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen,1994 FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler,1994 Immunomethods 4：273。
靶向疾病及病症
本發明提供根據本發明之方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物或其適用醫藥組合物，用於治療。本發明進一步提供根據本發明方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物之醫藥組合物，其用於治療病理性病症。本發明進一步提供根據本發明方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅 蛋白質組合物在製造用於治療病理性病症之藥物中的用途。本發明進一步提供治療罹患病理性病症之患者的方法，其包含向該患者投與治療有效量之根據本發明方法或製程產生的聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質。
病理性病症可能為肌肉骨骼疾病或病症，諸如肌肉萎縮。肌肉萎縮存在許多誘因，包括由用糖皮質激素進行治療引起，糖皮質激素為諸如皮質醇、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、潑尼松(prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)或潑尼龍(prednisolone)。肌肉萎縮亦可由因神經外傷所致之去神經或由退化性、代謝性或發炎性神經病(例如，格林-巴利症候群(Guillian-Barré syndrome)、末梢神經病或暴露於環境毒素或藥物)引起。
此外，肌肉萎縮可由肌病，諸如肌強直；先天性肌病，包括桿狀體肌病、多軸空/微軸空肌病及肌管(中央核)肌病；粒線體肌病；家族性週期性麻痹；發炎性肌病；代謝性肌病，諸如由肝糖或脂質儲存疾病所致；皮肌炎；多發性肌炎；包涵體肌炎；骨化性肌炎；橫紋肌溶解症及肌球蛋白尿所致。
在本發明之另一實施例中，本發明之醫藥組合物可用於治療甘迺迪病或慢性腎病。
肌病可由肌肉萎縮症症候群引起，諸如杜興氏(Duchenne)、貝克氏(Becker)、肌緊張性、面肩肱型、艾-德氏(Emery-Dreifuss)、眼咽型、肩肱型、肢帶型、福山氏(Fukuyama)、先天性肌肉萎縮症或遺傳性遠端肌病。肌肉骨骼疾病亦可為骨質疏鬆症、骨折、身材矮小或侏儒症。
此外，肌肉萎縮症可由成人運動神經元疾病，諸如肌肉萎縮性側索硬化；嬰兒脊髓性肌肉萎縮、幼年型脊髓性肌肉萎縮、伴隨多灶性導體阻斷之自體免疫性運動神經病、因中風或脊髓損傷所致之麻 痹、因外傷所致之骨骼固定、長期臥床、自主不活動、非自主不活動、代謝應力或營養不足、癌症、AIDS、禁食、甲狀腺或腎上腺或垂體腺病症、糖尿病、良性先天性低張症、中央核疾病、肝病(實例諸如纖維化、肝硬化)、敗血症、腎衰竭、充血性心臟衰竭、老化、在零重力環境中之空間移動或時間消耗引起。
在一個特定實施例中，本發明之醫藥組合物可用於治療燒傷患者，包括成人及小兒燒傷患者，其罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮。
可治療之年齡相關病狀之實例包括肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫功能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏症(Huntington's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、白內障、年齡相關之黃斑變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、虛弱、失憶症、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽覺損失；代謝障礙，包括II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。
在一個特定實施例中，本發明之醫藥組合物可用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者。
在本發明之另一實施例中，本發明之醫藥組合物可用於治療肌肉萎縮症。在一個特定實施例中，本發明係關於本發明之醫藥組合物用於治療肌肉萎縮症之用途，其中萎縮症之群係選自由以下組成之群：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
可治療之其他病狀包括急性及/或慢性腎病或衰竭，肝纖維化或肝硬化，癌症，諸如胰腺癌、胃腸(包括食道、胃及結腸)癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤或乳癌；帕金森氏病(Parkinson's Disease)；與神經元死亡相關之病狀，諸如肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、腦萎縮或癡呆 及貧血；慢性感染，諸如肺結核，無論其由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)或非典型分枝桿菌引起；慢性真菌感染；及免疫抑制設定中之機會性感染，無論醫原性的或因AIDS所致。
其他病狀包括惡病體質、與類風濕性關節炎相關之惡病體質及與癌症相關之惡病體質。
在另一實施例中，本發明係關於治療肌肉病症方法，如上所述，該方法包含投與治療有效量之根據本發明方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物。用本發明之多肽或組合物治療以提高肌肉質量之需要可由上述病狀中之一者引起，尤其由肌肉骨骼疾病或病症(諸如肌肉萎縮症)引起，其中該肌肉病症為選自由以下組成之群的肌肉萎縮：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
此外，本發明係關於治療燒傷、慢性阻塞性肺病(COPD)、年齡相關之病狀(如肌肉減少症)、甘迺迪病或慢性腎病之方法，如上所述，其包含向患者投與治療有效量之根據本發明方法或製程產生之聚乙二醇化人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質組合物。
在另一實施例中，本發明係關於用於增加肌肉質量之方法。在一個特定實施例中，本發明係關於用於增加有需要之患者體內之肌肉質量的方法。提高肌肉質量之需要可由上述病狀中之一者引起，尤其由肌肉骨骼疾病或病症(諸如肌肉萎縮症)引起。提高肌肉質量之需要亦可由燒傷、慢性阻塞性肺病(COPD)、年齡相關之病狀(如肌肉減少症)、甘迺迪病或慢性腎病引起。
患者之投藥
可向患者投與本發明之醫藥組合物。投藥通常應藉助於注射器。因此，本發明提供包括本發明醫藥組合物之傳遞裝置(例如注射器)。
各種傳遞系統為已知的且可用於投與本發明之多肽，例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現蛋白質之重組細胞中，受體介導內飲作用(參見例如Wu及Wu,J Biol Chem 262：4429-4432,1987)，將核酸建構為反轉錄病毒、腺相關之病毒、腺病毒、痘病毒(例如鳥類痘病毒，尤其禽痘病毒)或其他載體之一部分等。引入方法可為腸內或非經腸的且包括(但不限於)皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、經肺、鼻內、眼內、硬膜外及經口途徑。可藉由任何便利途徑投與多肽，例如藉由輸注或快速注射，藉由經由上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收且可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身或局部的。此外，藉由任何適合途徑(包括心室內及鞘內注射)將本發明之醫藥組合物引入中樞神經系統中可為合乎需要的；可藉由例如連接至儲集器(諸如Ommaya儲集器)之心室內導管以促進心室內注射。在一特定實施例中，向需要治療之區域局部投與本發明之醫藥組合物可為合乎需要的；此可例如(且不限於)藉由在手術期間局部輸液、局部應用來實現，例如藉由注射、藉助於導管或藉助於植入物，該植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括諸如矽橡膠膜之膜、纖維或商業皮膚替代物。
在另一實施例中，醫藥組合物可在囊泡，尤其脂質體內傳遞(參見Langer,Science 249：1527-1533,1990)。在另一實施例中，活性劑可以受控釋放系統傳遞。在一個實施例中，可使用泵。
患者群
可受益於所提出之治療之患者包括自急性或危重病恢復而需要充分護理或長期住院(1週以上)之患者；患有肌肉減少症之虛弱老年患者；自嚴重外傷，諸如機動車輛事故、嚴重燒傷、對抗損傷及其他外傷性損傷恢復之青少年；患有已知引起如上文所列之惡病體質的慢性疾病之患者；及患有如上文所列之肌肉疾病之患者。由於肌肉損失 為大多數嚴重或長期疾病之常見併發症，因此吾人預期，與此損失之根本原因無關，肌肉萎縮之恢復將加速經受肌肉損失之患者之恢復及功能復原。
組合療法
此治療可與針對肌肉萎縮病程之主要原因之任何治療組合。此類組合可包括皮質類固醇、免疫抑制劑、抗細胞激素劑、抗癌藥物；生長因子，諸如紅血球生成素、G-CSF、GM-CSF或其他者；用於治療糖尿病之藥物(包括胰島素及口服降血糖藥)、抗肺結核藥物及抗生素。組合可包括小分子及生物分子劑。
本發明之醫藥組合物可以單獨活性劑形式或例如作為佐劑與其他藥物結合或組合投與，該等藥物為例如ActRIIB抗體、ActRIIA抗體、可溶性ActRIIB誘餌模擬劑、ActRIIA/B泛特異性抗體、抗肌肉生長抑制素抗體、肌肉生長抑制素原肽、結合ActRIIB但不使其活化之肌肉生長抑制素誘餌蛋白質、β 2促效劑、胃內激素促效劑、SARM、GH促效劑/模擬劑或卵泡抑素。舉例而言，本發明之藥物可與如WO2010125003中所揭示之ActRIIB抗體組合使用。
序列
實例
IGF-1Ea前驅蛋白質具有大量表面暴露之離胺酸殘基。僅優化聚乙二醇化參數不確保足夠產量且尤其最終產物組合物之再現性不夠高。聚乙二醇化反應物之產量藉由在pH 6.5下進行聚乙二醇化反應而提高。在此pH下，PEG-CHO試劑與IGF-1Ea之還原烷化偶合之選擇性較高且副產品之形成減少。極出人意料地，在較高pH下進行之聚乙二醇化反應較有選擇性，因為在先前技術中咸信還原烷化在較低pH下較有選擇性。
部分A：一般方法 方法描述
用於製備單聚乙二醇化IGF-1Ea前驅蛋白質之方法包含步驟(i)聚乙二醇化反應，其中hIGF-1Ea前驅肽與PEG試劑偶合，(ii)層析純化，其中所要產物自未反應之PEG試劑、未聚乙二醇化之IGF-1Ea前驅蛋白質及反應副產物純化，及(iii)超濾/透濾步驟，其中交換緩衝液且濃縮所關注之聚乙二醇化蛋白質。方法流程圖呈現於圖1中。
使用N-Pro技術製備hIGF-1Ea蛋白質.
構建含以下修飾之編碼hIGF-1-Ea前驅多肽的DNA表現載體：使E3缺失；使R37突變為A；且使R71缺失且使S72缺失(SEQ ID NO：55)。
hIGF-1-Ea變體SEQ ID NO：55(△E3；R37A；△R71，△S72)
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：55)
使用Npro自蛋白酶融合技術(NAFT)產生上述SEQ ID NO：55之hIGF-1-Ea前驅多肽。熟習此項技術者瞭解此技術，其尤其已在專利申請案/專利WO200111056、WO200111057、WO2006113957、EP1200604B1及US6936455B1中揭示。
聚乙二醇化反應
在聚乙二醇化反應期間，SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽與30kDa PEG醛試劑(PEG-CHO)在藉由NaCNBH3達成之還原條件下偶合。由文獻已知PEG-CHO試劑主要與N端胺基反應。SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽分子上之大量表面暴露之離胺酸殘基藉由PEG-CHO降低N端聚乙二醇化之選擇性。藉由在不同pH值下進行聚乙二醇化反應，發現該反應在pH 6.5下比在pH 4.0下對N端較有選擇性。此為出人意料之結果，因為咸信使用PEG-CHO之聚乙二醇化反應在較低pH下較有選擇性(Kinstler等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54(2002)477-485,Molineux,Current Pharmacetical Design,10(2004)1235-1244)。
向聚乙二醇化混合物中添加α-CD提供抑制較高聚乙二醇化變體(即，二-、三-或較高聚乙二醇化變體)形成之條件。
層析純化
藉由層析法在強力陽離子交換樹脂上自過量試劑、反應副產物及未聚乙二醇化之SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽純化單聚乙二醇化之SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽。純化在仍能夠將單聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽滯留在管柱上且同時足夠高以達成離胺酸與N端單聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽之間的至少部分分離之pH下進行。經測定，pH 6.5最適於分離，因為在較高pH下，單聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽不結合至管柱，且在較低pH(例如5.0)下，離胺酸與N端聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽之間不存在滯留差異。
濃縮與緩衝液交換
進行UF/DF步驟以將緩衝液交換成最終調配物緩衝液且將IGF-1Ea濃縮為最終濃度。
部分B：操作實例： 實例1
此實例展示聚乙二醇化反應pH藉由PEG-CHO對聚乙二醇化反應之選擇性的影響。意外地，相比於較低pH，在較高pH下，反應對N端結合較有選擇性。
SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽之聚乙二醇化
在pH 4.0與6.5之兩種不同緩衝液中進行聚乙二醇化反應。對於較低pH，選擇pH 4.0之20mM乙酸鈉、50mM氯化鈉，而對於較高pH，使用pH 6.5之50mM磷酸鈉、140mM氯化鈉。在兩種情況下，均向SEQ ID：55之IGF-1-Ea前驅多肽溶液中添加固體PEG試劑(30kDa聚乙二醇丙醛)、固體α-CD及固體NaCNBH3。無需導引，以4.8mg/ml之蛋白質濃度、以3莫耳過量PEG試劑、以3%之α-CD濃度及以40mM之NaCNBH3濃度在室溫下進行聚乙二醇化反應。聚乙二醇化3.5h及7h之後抽取樣品用於分析。用逆相層析法(RP-HPLC)及陽離子交換層析(CE-HPLC)分析樣品。
聚乙二醇化混合物之表徵
RP-HPLC係用於測定單聚乙二醇化及較高聚乙二醇化形式之量，而CE-HPLC係用於測定單聚乙二醇化部分中N端聚乙二醇化形式之百分比。關於各樣品之組成，結果展現聚乙二醇化反應在pH 6.5下比在pH 4.0下對N端結合較有選擇性。在pH 6.5下，N端聚乙二醇化形式之量相較於pH 4.0高約10%。此外，較高聚乙二醇化形式之量在較高pH下顯著較低。聚乙二醇化7小時之後，較高聚乙二醇化形式之量在pH 6.5下為16%且在pH 4.0下為29%，而在7小時之後，單聚乙二醇化形式之百分比相同，無關於聚乙二醇化反應之pH。結果呈現於表1中。
實例2
此實例展示α-CD對較高聚乙二醇化形式之量的影響。較高聚乙二醇化形式之量在α-CD存在下降低。
SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽之聚乙二醇化
進行兩個聚乙二醇化反應。在兩種情況下，均向IGF-1Ea溶液中添加固體PEG試劑(30kDa聚乙二醇丙醛；NOF)及固體NaCNBH3。在一個反應中，添加固體α-CD達至3%最終濃度。無需導引，以4.4mg/ml之蛋白質濃度、以4莫耳過量PEG試劑及以40mM之NaCNBH3濃度在室溫下進行聚乙二醇化反應。聚乙二醇化2h及3.5h之後抽取樣品用於分析。用RP-HPLC及CE-HPLC分析樣品。
聚乙二醇化混合物之表徵
2h及3.5h之後用RP-HPLC分析聚乙二醇化混合物。RP-HPLC係用於測定單聚乙二醇化及較高聚乙二醇化形式之量。
結果展現較高聚乙二醇化形式之量在3% α-CD存在下較低。3.5小時之後，在聚乙二醇化混合物中存在3% α-CD之情況下獲得少約24%之較高聚乙二醇化形式，而單聚乙二醇化形式之百分比保持相同。結果呈現於表2中。
實例3 單聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽同功異型物之部分分離.
向SEQ ID NO：55之hIGF-1-Ea前驅多肽溶液(75mg)中添加固體PEG試劑(30kDa聚乙二醇丙醛；NOF)、5M NaCNBH3/1M NaOH之中和溶液及12% α-CD溶液。在pH 6.5、室溫下以6mg/ml之蛋白質濃度、2.25莫耳過量PEG試劑、50mM之NaCNBH3濃度及3%之α-CD濃度進行聚乙二醇化反應。20h之後，用水稀釋聚乙二醇化混合物以降低樣品傳導率且進行無菌過濾。使用陽離子交換層析進行單聚乙二醇化SEQ ID NO：55之hIGF-1-Ea前驅多肽同功異型物之純化及分離。將反應混合物負載至49.6ml(XK 16/40,GE Healthcare)Toyopearl SP-650S(Tosoh bioscience)管柱上，平衡於緩衝液(10mM磷酸鈉，pH 6.5)中。用3倍管柱體積之平衡緩衝液洗滌管柱。在30倍管柱體積下使用0%至100%之線性梯度之溶離緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，pH 5.0)溶離肽形式。整個操作之流動速率維持在2.5ml/min下。製備型層析圖展示於圖2中。
在溶離期間收集2.5ml溶離份。根據分析型CE-HPLC彙集溶離份。製備四個含有不同組成之單聚乙二醇化同功異型物之集合體且表示為1、2、3及4。將集合體濃縮且透濾至儲存緩衝液，即pH 5.0之20mM乙酸酯。在截止值為3kDa之15ml Amicon離心單元上進行濃縮及 透濾。
各集合體中之同功異型物組成(用分析型CE-HPLC測定)及單聚乙二醇化物質之含量(用RP-HPLC測定)呈現於表3中。
表示為1之集合體僅含有N端聚乙二醇化之SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽。單聚乙二醇化物質之量為97%以上。
表示為2、3及4之集合體具有較低RP-HPLC純度，其由存在一些二聚乙二醇化物質所致。集合體2、3及4中之剩餘單聚乙二醇化物質經離胺酸聚乙二醇化。由於用CEX層析僅達成離胺酸聚乙二醇化同功異型物之部分分離，因此集合體為不同離胺酸聚乙二醇化同功異型物之混合物。用分析型CE-HPLC可解析四個峰。考慮到SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽中之暴露之離胺酸殘基之數量，此四個分析型CE-HPLC峰仍為不同離胺酸聚乙二醇化同功異型物之混合物。
表示為2、3及4之CEX集合體之CE-HPLC分析展示於圖3中。
實例4
此實例描述用於製備聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽之方法。整個方法能夠以高度可再現方式製備聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽。經設計以提高方法穩定性之步驟為聚乙二醇化反應及CEX純化。將α-CD引入聚乙二醇化反應中，因為其減少較高聚乙二醇化形式之形成且減緩反應，以使得用於聚乙二醇化反應 終止之窗口(應用於CEX柱上)較寬且較適於大規模方法。藉由在pH 6.5下進行聚乙二醇化反應提高反應之特異性。此外，藉由CEX純化控制最終產物之組成。以達成離胺酸與N端聚乙二醇化分子之間的部分分離之方式設計CEX。藉由適當彙集CEX溶離份確保最終產物之一致性。藉由分析型CE-HPLC進行用於彙集標準以確保同功異型物之一致組成的IPC控制。
製備PEG試劑及還原劑
解凍3.35g SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽，恆溫調節至室溫且藉由平緩混合均質化。將PEG試劑(30kDa聚乙二醇丙醛；NOF)製備為200mg/mL於pH 6.5之20mM磷酸鈉、30mM NaCl中之儲備溶液。藉由將α-CD溶解於140mM NaH2PO4中製備α-CD之12%溶液。向12% α-CD溶液中添加含5M NaCNBH3之1M NaOH以獲得191mM NaCNBH3儲備溶液。
聚乙二醇化反應
向SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽溶液中添加溶解之PEG-CHO試劑。藉由添加α-CD及NaCNBH3溶液開始聚乙二醇化反應。在22℃、pH 6.4、6mg/ml之蛋白質濃度、2.25莫耳過量PEG試劑、50mM之NaCNBH3濃度及3%之α-CD濃度下進行聚乙二醇化反應20.5小時。
層析純化
為實現結合至CEX管柱，用水將聚乙二醇化混合物稀釋2倍。將經稀釋之反應混合物負載至XK 50/30管柱(GE Healthcare， 5cm)Toyopearl SP-650S(Tosoh bioscienee)管柱上，平衡於緩衝液(20mM磷酸鈉，pH 6.5)中。用3倍管柱體積之平衡緩衝液洗滌管柱。在5倍管柱體積下使用0%至40%之線性梯度之溶離緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，pH 5.0)溶離肽形式。整個操作之流動速率維持在75cm/h下。根據分析型CE-HPLC及RP-HPLC分離且彙集溶離峰。典型CEX層 析圖展示於圖4中。
彙集
根據RP-HPLC及CE-HPLC分析進行溶離份彙集。集合體組成展示於表4中。
UF/DF步驟、無菌過濾及填充
進行超濾及透濾步驟以濃縮聚乙二醇化SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽且交換緩衝液。將緩衝液交換成pH 5.0之7mM丁二酸鈉。對於超濾及透濾，使用三個Pellicon Biomax 5(Millipore)膜。在八倍體積之情況下，以6mg/ml與7mg/ml之間的蛋白質濃度進行透濾。使用孔徑為0.2μm之聚醚碸膜過濾器無菌過濾在UF/DF步驟之後的濃縮樣品且將其填充於最終儲存容器(Nalgene 25ml PETG瓶)中。
實例5
此實例展示SEQ ID NO：55之hIGF-1-Ea前驅多肽聚乙二醇化混合物在SP-Sepharose HP管柱上之純化。
聚乙二醇化反應
解凍0.3g SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽，恆溫調節至室溫且藉由平緩混合均質化。向SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽溶液中添加固體PEG試劑(聚乙二醇丙醛；NOF)及固體α-CD。藉由添加NaCNBH3儲備溶液開始聚乙二醇化反應。在22℃、pH 6.5、4.75mg/ml之蛋白質濃度、3莫耳過量PEG試劑、40mM之NaCNBH3濃度及3%之α-CD濃 度下進行聚乙二醇化反應3小時。
分離
為頭對頭比較使用不同CEX樹脂(Toyopearl SP 650S及SP Sepharose HP)之分離，製備能夠實現若干分離操作之較大量聚乙二醇化混合物。藉由施加至TSK凝膠SP-5PW管柱(移除NaCNBH3且移除PEG)終止聚乙二醇化反應且使其返回至pH 6.5之初始聚乙二醇化緩衝液10mM磷酸鈉(使用截止值為5.000kDa之Amicon超離心單元)。
將22.8mg SEQ ID：55之hIGF-1-Ea前驅多肽負載至Tricorn 10/100(GE Healthcare, 1cm)SP Sepharose HP(GE Healthcare)管柱上，平衡於緩衝液(10mM磷酸鈉，pH 6.5)中。用3倍管柱體積之平衡緩衝液洗滌管柱。在15倍管柱體積下使用0%至85%之線性梯度之溶離緩衝液(40mM磷酸鈉，200mM氯化鈉，pH 8.5)溶離肽形式。整個操作之流動速率維持在0.9ml/min下。根據分析型CE-HPLC及RP-HPLC分離且彙集溶離峰。CEX層析圖展示於圖5中。
除上述hIGF-1-Ea前驅多肽變體以外，可根據上述本發明方法使以下其他蛋白質變體(但不限於其)聚乙二醇化：
實例6
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
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實例7
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：7)。
實例8
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：8)。
實例9
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：9)。
實例10
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：10)。
實例11
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：11)。
實例12
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：12)。
實例13
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：13)。
實例14
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：14)。
實例15
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：15)。
實例16
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：16)。
實例17
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：17)。
實例18
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及 S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：18)。
實例19
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsaguknyrm(SEQ ID NO：19)。
實例20
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：20)。
實例21
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：21)。
實例22
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：22)。
實例23
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：23)。
實例24
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：24)。
實例25
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：25)。
實例26
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：26)。
實例27
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：27)。
實例28
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例29
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：29)。
實例30
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：30)。
實例31
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：30)。
實例32
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：32)。
實例33
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：33)。
實例34
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaqvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：34)。
實例35
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：35)。
實例36
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：36)。
實例37
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：37)。
實例38
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸 K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：38)。
實例39
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例40
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：40)。
實例41
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：41)。
實例42
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：42)。
實例43
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：43)。
實例44
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例45
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：45)。
實例46
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：46)。
實例47
G1、P2、E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺 酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：47)。
實例48
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例49
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：49)。
實例50
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：50)。
實例51
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp avqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：51)。
實例52
G1、P2、E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：52)。
實例53
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：53)。
實例54
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：54)。
實例55
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：55(變體63))。
實例56
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：56)。
實例57
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：57)。
實例58
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：58)。
實例59
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：59)。
實例60
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：60)。
實例61
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：61)。
實例62
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失， 且胺基酸R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：62)。
實例63
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：63)。
實例64
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：64)。
實例65
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：65)。
實例66
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：66)。
實例67
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：67)。
實例68
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：68)。
實例69
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：69)。
實例70
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：70)。
實例71
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：71)。
實例72
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycapl kpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：72)。
實例73
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：73)。
實例74
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例75
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例76
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：76)。
實例77
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：77)。
實例78
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：78)。
實例79
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：79)。
實例80
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaqvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：80)。
實例81
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：81)。
實例82
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQ ID NO：82)。
實例83
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例84
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例85
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例86
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例87
E3缺失，胺基酸R37經麩胺酸(E)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例88
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例89
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例90
E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸(A)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸。
gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyqm(SEQ ID NO：90)。
實例91
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例92
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例93
E3缺失，胺基酸R37經脯胺酸(P)取代且胺基酸K68、S69、A70、 R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例94
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例95
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例96
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74及R77突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例97
E3缺失，胺基酸R36及R37均經麩醯胺酸(Q)取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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實例98
E3缺失，胺基酸R36經麩醯胺酸(Q)取代，R37經丙胺酸取代且胺基酸K68、S69、A70、R71及S72缺失，且胺基酸R74、R77及R104突變成麩醯胺酸(Q)。
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<110> 瑞士商諾華公司
<120> 製備聚乙二醇化蛋白質組合物之方法
<130> PAT056013
<140> US 61/915090
<141> 2013-11-20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 33
<210> 34
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 34
<210> 35
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 35
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<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 36
<210> 37
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 37
<210> 38
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 38
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<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 39
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<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 41
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 42
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<212> PRT
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<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 45
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<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 48
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<212> PRT
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<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 49
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<211> 97
<212> PRT
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<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<212> PRT
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<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 51
<210> 52
<211> 97
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<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 52
<210> 53
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 53
<210> 54
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 55
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 56
<210> 57
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 57
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 61
<210> 62
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<210> 63
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 63
<210> 64
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 64
<210> 65
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質：實例41
<400> 65
<210> 66
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 66
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
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<210> 68
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 68
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 69
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 70
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<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 71
<210> 72
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 72
<210> 73
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 73
<210> 74
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 74
<210> 75
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 75
<210> 76
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 76
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<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 77
<210> 78
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 78
<210> 79
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 79
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<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 80
<210> 81
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 81
<210> 82
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 82
<210> 83
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質：hIGF1-Ea-D1-3、R36Q、G42E、D68-72、R74Q、 R77Q、R104Q-fc域
<400> 83
<210> 84
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 84
<210> 85
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 85
<210> 86
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 86
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<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 87
<210> 88
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 88
<210> 89
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 89
<210> 90
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 90
<210> 91
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 91
<210> 92
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 92
<210> 93
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 93
<210> 94
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 94
<210> 95
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 95
<210> 96
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 96
<210> 97
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 97
<210> 98
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF-1蛋白質
<400> 98
<210> 99
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF1 E-肽
<400> 99
<210> 100
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF1 E-肽
<400> 100
<210> 101
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變之人類IGF1 E-肽
<400> 101

Claims (38)

  1. 一種製備聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含使治療性蛋白質在含水介質中與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應之步驟，其特徵在於該反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，以得到該聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。
  2. 一種製備單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物之方法，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質，該方法包含以下步驟：(a)使該等治療性蛋白質在含水介質中與水溶性聚乙二醇在還原烷化條件下反應，其特徵在於該偶合反應於約6.5至7.5之pH範圍內進行，(b)步驟(a)中所獲得之組合物進行層析步驟，以得到該單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。
  3. 如請求項1至2中任一項之製備組合物之方法，其中該治療性蛋白質為人類IGF-1前驅蛋白質或其變體。
  4. 如請求項1至2中任一項之方法，其中該聚乙二醇化反應在α-環糊精(α-CD)存在下進行。
  5. 如請求項1至2中任一項之方法，其中該PEG之總分子量為20kDa至100kDa。
  6. 如請求項5之方法，其中該PEG之總分子量為約30kDa。
  7. 如請求項2之方法，其中該交換層析步驟為陽離子交換層析(CEX)，其包含彙集含該N端單聚乙二醇化治療性蛋白質之溶離份，以得到該單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物。
  8. 如請求項7之方法，其進一步包含以下其他步驟：b)超濾(UF)/透濾(DF)濃縮與緩衝液交換，c)最終過濾。
  9. 如請求項3之方法，其中該IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其中胺基酸E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且其中該等胺基酸之編號對應於SEQ ID NO：5。
  10. 如請求項9之方法，其中該IGF1前驅蛋白質為由SEQ ID NO：55組成之人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質。
  11. 一種如請求項1、3至6、9及10中任一項之方法產生之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
  12. 一種如請求項2至10中任一項之方法產生之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
  13. 一種可由如請求項1、3至6、9及10中任一項之方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
  14. 一種可由如請求項2至10中任一項之方法獲得之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
  15. 一種由如請求項1、3至6、9及10中任一項之方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二 醇化治療性蛋白質。
  16. 一種由如請求項2至10中任一項之方法獲得之單聚乙二醇化治療性蛋白質組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少65%單聚乙二醇化治療性蛋白質部分為N端單聚乙二醇化治療性蛋白質。
  17. 一種如請求項9及10中任一項之方法產生之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端及離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
  18. 一種可由如請求項9及10中任一項之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
  19. 一種可由如請求項9及10中任一項之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端及離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
  20. 一種由如請求項9及10中任一項之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少61%單聚乙二醇化IGF-1蛋白質部分為N端單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質。
  21. 一種由如請求項9及10中任一項之方法獲得之組合物，其中在該組合物中，包含在該組合物中之至少70%聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質部分為N端及離胺酸殘基單聚乙二醇化IGF-1前驅蛋白質之混合物。
  22. 如請求項17至21中任一項之組合物，其中該IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其中胺基酸E3缺失，胺基酸R37經丙胺酸取代且胺基酸R71及S72缺失，且其中該等胺基酸之編號 對應於SEQ ID NO：5。
  23. 如請求項22之組合物，其中該IGF1前驅蛋白質為人類IGF-1Ea肽前驅蛋白質，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55。
  24. 如請求項11至21中任一項之組合物，其呈醫藥學上可接受之形式，用作藥物。
  25. 一種醫藥組合物，其包含由如請求項1至10中任一項之方法獲得之聚乙二醇化治療性蛋白質，用於治療。
  26. 如請求項24或25之組合物，其用於治療有需要患者之肌肉病症。
  27. 如請求項24或25之組合物，其用於治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者。
  28. 如請求項24或25之組合物，其用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者。
  29. 如請求項24或25之組合物，其用於治療脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA或甘迺迪病(Kennedy disease))患者。
  30. 如請求項24或25之組合物，其用於治療慢性腎病患者。
  31. 如請求項26之組合物，其中該肌肉病症為肌肉萎縮。
  32. 如請求項31之組合物，其中該肌肉萎縮係選自由以下組成之群：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
  33. 一種如請求項24或25之組合物之用途，其用於製造治療有需要患者之肌肉病症的藥物。
  34. 一種如請求項24或25之組合物之用途，其用於製造治療罹患瘦體質量損失及/或肌肉萎縮之燒傷患者之藥物。
  35. 一種如請求項24或25之組合物之用途，其用於製造治療慢性阻塞性肺病(COPD)患者之藥物。
  36. 一種如請求項24或25之組合物之用途，其用於製造治療脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA或甘迺迪病)患者之藥物。
  37. 一種如請求項24或25之組合物之用途，其用於製造治療慢性腎病患者之藥物。
  38. 如請求項33之用途，其中該肌肉病症為選自由以下組成之群的肌肉萎縮：與肥胖症相關之肌肉減少症、肌肉減少症及與糖尿病相關之肌肉萎縮症。
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