KR20130009761A - 메티오닌-감마-라이아제 효소를 이용하여 유전자조작된 효소 및 이의 약리학적 제제 - Google Patents

메티오닌-감마-라이아제 효소를 이용하여 유전자조작된 효소 및 이의 약리학적 제제 Download PDF

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Abstract

메티오닌-γ-라이아제 효소 활성을 갖는 신규한 단백질의 유전자조작과 연관된 방법 및 조성물이 기술된다. 예를 들어, 특정 양상에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고 메티오닌을 분해할 수 있는 변형된 시스타티오닌-γ-라이아제 (CGL)이 개시될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 양상은 개시된 단백질 또는 핵산을 사용한 메티오닌 소모로 암을 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

메티오닌-감마-라이아제 효소를 이용하여 유전자조작된 효소 및 이의 약리학적 제제{ENGINEERED ENZYMES WITH METHIONINE-GAMMA-LYASE ENZYMES AND PHARMACOLOGICAL PREPARATIONS THEREOF}
본원은 2010년 2월 4일에 출원된 미국특허원 제61/301,368호를 우선권 주장하며, 이의 전체 교시는 전문이 본원에 권리 포기 없이 참조로 구체적으로 인용된다.
본 발명은 미국 국립 보건원의 지원으로 NIH CA 139059하에 정부 보조로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 L-메티오닌을 소모하는 효소로 암을 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특정적으로는, 본 발명은 사람 치료요법에 적합한 메티오닌 분해 활성 및 상당히 증가된 안정성을 갖는 신규한 사람 메티오닌-γ-라이아제 효소의 유전자조작에 관한 것이다.
필수 아미노산인 메티오닌에 대한 요구는 암 조직에서 특히 높다. 메티오닌의 소모는 비암 조직에 유해한 영향을 미치지 않으면서 다양한 종류의 종양을 사멸시키는데 효과적인 것으로 제시되어 왔다. 메티오닌 소모는 아미노산을 가수분해하는 효소의 작용을 통해 유효해질 수 있다. 사람 메티오닌 소모 효소는 존재하지 않는 한편, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 기원의 세균 효소인 메티오닌-γ-라이아제는 병원에서 치료학적으로 효과적인 것으로 제시되어 왔고 임상 시험으로도 평가되었다. 그러나, 세균 단백질로서 메티오닌-γ-라이아제는 고도로 면역원성이고 특이적인 항체의 형성을 유도하여 부작용 및 활성 감소를 초래한다. 메티오닌-γ-라이아제는 또한 시험관내 및 생체내에서 불과 약 2시간의 아주 짧은 반감기를 갖기 때문에 전신 소모를 달성하기 위해서는 아주 빈번하고 비실용적일 정도로 높은 투약을 필요로 한다.
전신 메티오닌 소모는 많은 연구의 대상이고 무엇보다도 전이성 유방암, 전립선암, 신경아세포종 및 췌장 암종과 같은 암을 치료하는 잠재성을 갖는다. 비록 이와 같은 치료학적 접근법에 대해 많은 관심이 존재하지만 세균 유도 메티오닌-γ-라이아제는 이의 화학 치료요법제로서의 각광이 상당히 약화될 만큼 심각한 결함을 갖는다.
따라서, L-메티오닌 소모 치료요법의 치료학적 성공을 위해서 이들의 결함을 해소하는 방법 및 조성물을 개발할 필요성이 남아있다.
본 발명의 특정 양상은 메티오닌-γ-라이아제(MGL) 활성을 갖는 사람 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 이는 암 치료요법에 적합할 수 있으며 낮은 면역원성과 향상된 혈중 안정성을 갖는 신규한 효소를 제공함으로써 본 분야의 중대한 결함을 극복한다. 따라서, 제1 실시형태로서, 변형된 폴리펩타이드, 특히 MGL과 연관된 영장류 효소로부터 유도된 메티오닌 분해 활성을 갖는 신규한 효소 변이체를 제공한다. 예를 들어, 신규한 효소 변이체는 서열번호 10 내지 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특히, 변이체는 사람 시스타티오닌-γ-라이아제(CGL)와 같은 사람 효소로부터 유도될 수 있다. 특정 양상에서, 메티오닌을 분해할 수 있는 변형된 사람 시스타티오닌 감마-라이아제를 포함하는 폴리펩타이드가 존재할 수 있다. 일부 실시형태로서, 폴리펩타이드는 생리학적 조건 하에서 메티오닌을 분해할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 M-1s-1 또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위의 메티오닌에 대한 촉매 효능(k cat /K M)을 가질 수 있다. 추가의 양상에서, 폴리펩타이드는 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 M-1s-1 또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위의 k cat /K M까지 L-호모시스틴에 대한 촉매 활성을 나타낼 수 있다.
상기 논의된 변형 폴리펩타이드는 비변형 폴리펩타이드(예를 들면, 천연 폴리펩타이드) 또는 본원에 기술된 임의의 폴리펩타이드 서열과 비교하여 특정 비율[%]의 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 비변형 폴리펩타이드는 천연 영장류 시스타티오나제(즉, 시스타티오닌 감마 라이아제)의 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400개 이상 또는 이하(또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)의 잔기를 포함할 수 있다. 동일성 비율은 변형된 폴리펩타이드와 비변형된 폴리펩타이드 사이 또는 비교되는 임의의 두 서열 사이에 약, 최대 또는 최소 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)일 수 있다. 또한, 상기 논의된 동일성 비율[%]은 폴리펩타이드의 비변형된 영역과 비교하여 폴리펩타이드의 변형된 특정 영역에 관한 것일 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터의 비변형 또는 돌연변이 시스타티오나제의 비변형 또는 돌연변이 기질 인식 부위의 아미노산 서열에 대한 시스타티오나제의 변형 또는 돌연변이 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성을 기준으로 특징지어질 수 있는 시스타티오나제의 변형 또는 돌연변이 기질 인식 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비변형 시스타티오나제와 90% 이상의 동일성을 갖는 것으로서 특징지어지는 변형 또는 돌연변이 사람 폴리펩타이드는 변형 또는 돌연변이 사람 폴리펩타이드의 아미노산 중 90%가 비변형 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하다는 것을 의미한다.
이와 같은 비변형 폴리펩타이드는 천연 시스타티오나제, 특히 사람 동형 또는 기타 영장류 동형일 수 있다. 예를 들어, 천연 사람 시스타티오나제는 서열번호 1의 서열을 가질 수 있다. 다른 천연 영장류 시스타티오나제의 비제한적 예는 Pongo abelii 시스타티오나제(진뱅크 ID: NP_001124635.1; 서열번호 18), Macaca fascicularis 시스타티오나제(진뱅크 ID: AAW71993.1; 서열번호 19), 및 Pan Troglodytes 시스타티오나제(진뱅크 ID: XP_513486.2; 서열번호 20)를 포함한다. 천연 폴리펩타이드의 예는 서열번호 1 또는 18 내지 20과 약, 최대 또는 최소 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위) 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 천연 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 18 내지 20의 서열 중 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 415개 이상 또는 이하(또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)의 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태로서, 천연 시스타티온 감마-라이아제는 화학적 변형, 치환, 삽입, 결실 및/또는 절단과 같은 하나 이상의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형은 천연 효소의 기질 인식 부위에 존재할 수 있다. 특정 실시형태로서, 천연 시스타티오닌은 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 치환 수는 1, 2, 3 또는 4개 이상일 수 있다. 추가의 실시형태로서, 천연 시스타티오닌 감마-라이아제는 기질 인식 부위 또는 기질 특이성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 위치에서 변형될 수 있다. 특히, 변형될 수 있는 아미노산은 음으로 하전된 잔기(예, Asp, Asn) 또는 양으로 하전된 잔기(예, Arg, Lys)와 같은 하전된 잔기이다. 예를 들어, 변형된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 E59, E119 및/또는 R339에 상응하는 아미노산 위치 또는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제의 59, 119 및/또는 339의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 영장류는 사람, Pong abelii, Macaca fascicularis, Pan Troglodyte일 수 있다.
특정 실시형태로서, 변형은 하나 이상의 하전된 잔기(Arg 또는 R, Lys 또는 K, His 또는 H와 같은 양으로 하전된 잔기 및 Asp 또는 D 및 Glu 또는 E와 같은 음으로 하전된 잔기를 포함)가 중성 잔기(예, Ala, Asn, Gln, Gly, Ile, Leu 또는 Val)로의 치환일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 위치 59, 119 및/또는 339에서의 치환은 아스파트산(N), 발린(V) 또는 류신(L)이다. 특정 실시형태로서, 변형은 E59N, E59V, R119L 및 E339V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환이다. 추가의 실시형태로서, 치환은 R119L 및 E339V 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 추가의 실시형태로서, 치환은 E59N 또는 E59V의 추가적인 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시형태로서, 천연 시스타티오닌-γ-라이아제는 사람 시스타티오닌-γ-라이아제일 수 있다. 특정 실시형태로서, 치환은 사람 시스타티오닌 감마-라이아제의 E59N, R119L 및 E339V의 조합(예, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 변형 폴리펩타이드, 이의 단편 또는 상동체) 또는 사람 시스타티오닌 감마-라이아제의 E59V, R119L 및 E339V의 조합(예, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 변형 폴리펩타이드, 이의 단편 또는 상동체)이다. 추가의 실시형태로서, 변형 폴리펩타이드는 Pongo abelii CGL-NLV 돌연변이체(서열번호 12), Pongo abelii CGL-VLV 돌연변이체(서열번호 13), Macaca fascicularis CGL-NLV 돌연변이체(서열번호 14), Macaca fascicularis CGL-VLV 돌연변이체(서열번호 15), Pan Troglodytes CGL-NLV 돌연변이체(서열번호 16) 및 Pan Troglodytes CGL-VLV 돌연변이체(서열번호 17)일 수 있다.
일부 양상에서, 본 발명은 또한 이종 아미노산 서열에 연결된 변형 시스타티오닌 감마-라이아제를 포함한 폴리펩타이드를 고려한다. 예를 들어, 변형 시스타티오닌 감마-라이아제는 융합 단백질로서 이종 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 특정 실시형태로서, 변형 시스타티오닌 감마-라이아제는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 XTEN 폴리펩타이드에 연결될 수 있다.
혈청 안정성을 증가시키기 위해, 변형된 시트타티오닌 감마-라이아제는 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결될 수 있다. 특정 실시형태로서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 변형 폴리펩타이드는 라이신 또는 시스테인과 같은 특정 아미노산 잔기를 통해 PEG에 연결될 수 있다. 치료학적 투여를 위해, 변형 시스타티오닌 감마-라이아제를 포함한 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체에 분산될 수 있다.
일부 양상에서, 이와 같은 변형 시스타티오닌 감마-라이아제를 암호화하는 핵산이 고려된다. 일부 실시형태로서, 핵산은 세균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 특정 실시형태로서, 세균은 이. 콜라이이다. 다른 양상에서, 본 발명은 이러한 핵산을 함유하는 발현 벡터와 같은 벡터를 추가로 고려한다. 특정 실시형태로서, 변형 시스타티온 감마-라이아제를 암호화하는 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되고, 이로써 한정되는 것은 아니지만 이종 프로모터를 포함한 프로모터를 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 이러한 벡터를 포함한 숙주 세포를 추가로 고려한다. 숙주 세포는 이. 콜라이와 같은 세균일 수 있다. 천연 시스타티오닌 감마-라이아제 기원의 메티오닌 분해 활성을 갖는 목적하는 CGL 돌연변이체를 구별하기 위해 ilvA 및 metA의 결실을 갖는 숙주 세포(예, 이. 콜라이 ilvA-metA-)를 제조하고 사용하여 목적하는 돌연변이체를 동정할 수 있다.
추가의 실시형태로서, (a) 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체의 군집을 유전자 ilvA 및 metA의 결실을 갖는 이. 콜라이 균주의 세포에서 발현시키는 단계; 및 (b) L-메티오닌 분해 활성을 갖는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 동정하는 단계(여기에서, 상기 동정된 변이체를 발현하는 세포는, 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제를 발현하는 세포와 비교하여 L-메티오닌이 보충된 최소 배지에서 보다 높은 성장 속도를 갖는 것을 제외하고는 동일한 조건들 하에 있다)를 포함하는, L-메티오닌 분해 활성을 갖는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 동정하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 변형 시스타티오닌 감마 라이아제를 발현시키기 위해 숙주 세포 내로 도입된다. 단백질은 임의의 적합한 방식으로 발현될 수 있다. 한 실시형태로서, 단백질은 이것이 당화되도록 숙주 세포에서 발현된다. 다른 실시형태로서, 단백질은 이것이 비당화되도록 숙주 세포에서 발현된다.
또한, 본 발명의 특정 양상은 변형 시스타티오닌 감마-라이아제 펩타이드, 핵산 또는 본 발명의 제형의 투여에 의한 치료 방법, 및 특히 종양 세포 또는 암 보유 피검체의 치료 방법을 고려한다. 피검체는 마우스와 같은 임의의 동물일 수 있다. 예를 들어, 피검체는 포유동물, 특히 영장류, 더욱 구체적으로는 사람 환자일 수 있다. 일부 실시형태로서, 상기 방법은 암을 보유한 환자를 선별하는 것을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 피검체 또는 환자는 메티오닌-제한된 급식 또는 정규 급식으로 유지될 수 있다.
일부 실시형태로서, 암은 메티오닌 소모에 민감한 모든 암이다. 하나의 실시형태로서, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태로서, 투여는 암 세포의 적어도 일부가 사멸되도록 하는 조건 하에서 발생한다. 다른 실시형태로서, 제형은 생리학적 조건에서 메티오닌 분해 활성을 갖는 변형 시스타티오닌 감마-라이아제를 포함하며, 추가로 부착된 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 포함한다. 일부 실시형태로서, 제형은 상기된 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체 및 약제학적으로 허용되는 부형제 중 어느 하나를 포함하는 제형이다. 이러한 약제학적으로 허용되는 부형제는 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 상기 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체 모두는 사람의 치료를 위해 유용한 것으로 고려된다.
추가의 실시형태로서, 메티오닌 분해 활성을 갖는 비세균성(포유동물, 예로는 영장류 또는 마우스) 변형 시스타티오닌 감마-라이아제 또는 이의 암호화 핵산을 포함한 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 치료 방법이 제공될 수 있다.
종양 세포는 메티오닌에 대한 영양 배지에 의존하기 때문에, 투여 또는 치료는 반드시 세포 자체에 관한 것이 아니라 세포의 영양원에 관한 것일 수 있다. 따라서, 생체내 적용에서 종양 세포를 치료하는 것은 종양 세포의 군집을 위한 영양 배지를 유전자조작된 메티오닌아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 실시형태에서, 상기 배지는 메티오닌 소모가 필요한 혈액, 림프액, 척수액 및 유사 체액일 수 있다.
본 발명의 특정 양상에 따르면, 변형 시스타티오닌 감마-라이아제를 함유한 제형은 정맥내, 피부내, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 활액내, 기관내, 비내, 초자체내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심막내, 제대내, 안내, 경구, 국소, 흡인, 주입, 지속 주입, 국소적 관류, 카테터 경유, 세척, 액체 조성물 중(예, 리포좀) 또는 당업자에게 알려진 바와 같은 기타 방법 또는 상기 경로의 조합에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물과 관련하여 논의된 실시형태는 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관한 실시형태는 또한 본 발명의 다른 방법 및 조성물에도 적용될 수 있다.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "암호화" 또는 "암호화하는"은 본 분야의 전문가에 의해 본 발명이 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 사용된다. 그러나, 이들 용어는 "포함하는"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 단수형은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 명세서의 청구범위에서 용어 "포함하는"과 연계되어 사용되는 경우, 단수형 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 사용된 용어 "또는"은 비록 명세서가 단지 양자택일 및 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지할지라도 특별하게 양자택일만을 가리키거나 양자택일이 상호 배타적임을 나타내는 것으로 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "약"은 해당 수치가 이를 결정하기 위해 사용되는 장치 및 방법에 대한 고유 변수 또는 연구 피검체 사이에 존재하는 변수를 포함함을 나타내도록 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 이하 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내는 한편, 이러한 상세한 설명으로부터 본 발명의 정신 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 본 분야의 전문가에게 자명한 것이기 때문에, 단지 예시적인 것으로 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 양상을 추가로 증명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본원에 기술된 특정 실시형태의 상세한 설명과 더불어 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1: CGL 및 MGL은 L-시스타티오닌 또는 L-메티오닌(L-Met)을 각각 암모니아, α-케토부티레이트 및 시스테인 또는 메탄-티올로의 유사한 PLP 의존적 분해를 촉매한다.
도 2: 시간 경과에 따른, 37℃에서 배양된 풀링된(pooled) 사람 혈청 중에서의 활성(%)의 플롯. 2±0.1시간의 겉보기 T0 .5를 갖는 슈도모나스 퓨티다 기원의 MGL(○), 16±0.8시간의 겉보기 T0 .5를 갖는 사람 CGL(▲), 95±3시간의 겉보기 T0 .5를 갖는 변이체 hCGL-NLV(◆) 및 260±18시간의 겉보기 T0 .5를 갖는 변이체 hCGL-VLV(●).
도 3: 약 68℃의 겉보기 TM 값을 갖는 사람 CGL(▲) 및 변이체 hCGL-NLV(◆), 및 약 71℃의 겉보기 TM 값을 갖는 변이체 hCGL-VLV(●).
도 4: 페길화는 hCGL 변이체의 겉보기 분자량을 상당히 증가시킨다. 분자량 표시(1 레인), 정제된 hCGL 변이체(2 레인) 및 PEG NHS-에스테르 분자량 5000의 다양한 양(10, 20, 40 및 80 배 몰 과량)으로 변형된 정제된 hCGL 변이체(각각 3 내지 6 레인)의 SDS-PAGE.
도 5: 페길화는 hCGL 변이체의 겉보기 분자량을 상당히 증가시킨다. 페길화 hCGL 변이체의 경우 약 1,340 kDa의 겉보기 MW(A) 및 비페길화 hCGL 변이체의 경우 약 220 kDa의 겉보기 MW(B)를 나타내는 SEC(크기 배제 크로마토그래피) 크로마토그래피.
도 6: 신경아세포종 세포주 Lan-1에 대한 L-Met 소모 효소의 영향. 0.6μM의 겉보기 IC50을 갖는 재조합 pMGL(○) 및 0.3 μM의 겉보기 IC50을 갖는 재조합 hCGL-NLV(◆).
도 7: PEG-hCGL-NLV의 약력학 분석. t=0에 비해 혈청 샘플 중의 효소 활성의 비율(%)을 플로팅한다. 시간에 따른 28±4시간에서 겉보기 활성 T1/2(◆).
도 8: 200 U PEG-hCGL-NLV의 투여 전에 무흉선 마우스(N=5)에 Met(-)Hcyss(-)Chl(-)가 급식되었다. 혈청 메티오닌 농도는 평균±SD로서 표시되었다. 8시간째에 혈중 메티오닌 수준이 최악의 3.9±0.7 μmol/L로 감소하였다.
도 9: 다양한 신경아세포종 세포주의 증식의 시험관내 억제에 대한 pMGL과 페길화 hCGL-NLV의 비교.
도 10: LAN-1 이종이식편을 갖는 무흉선 마우스. (□) 정상 급식된 대조군 (N=10); (●) 마우스에 Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식 (N=10); (○) 마우스에 100 U PEG-hCGL-NLV와 함께 Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식 (N=10)(▲ 처리일). 종양 성장율은 각 그룹에 대해 평균±SEM(표준 평균 오차)로 표시되었다. * Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 마우스 급식과 조합한 PEG-hCGL-NLV의 치료가 다른 두 그룹에서 비교된 경우, p<0.01.
도 11: 유전자 ilvA 및 metA의 이중 결실을 보여주는 이. 콜라이 L-메티오닌 및 L-이소류신 합성 경로의 도식. 이 경로는 L-Met 및 L-Ile에 대한 이. 콜라이의 영양요구성을 제시한다. 이. 콜라이가 L-Met이 보충된 배지에서 성장하고 활성 메티오닌-γ-라이아제를 암호화하는 유전자를 갖는 경우, 얻어지는 α-케토부티레이트 생성은 L-Ile 영양요구성을 보상할 것이다.
도 12: 0.5 mM의 L-메티오닌이 보충되고, 메티오닌-γ-라이아제에 대한 유전자를 암호화하는 플라스미드(좌측) 또는 시스타티오닌-γ-라이아제를 암호화하는 유전자를 갖는 플라스미드(우측)를 함유하는 M9 최소 한천 배지에 평판 배양된 이. 콜라이 BL21(DE3)(ΔilvAΔmetA).
일반적으로 본원 명세서는 특정 실시형태에 따라 메티오닌 분해 활성을 갖도록 유전자조작된 신규한 사람 효소를 제조하는 조성물 및 방법 및 이와 연관된 치료학적 응용에 관한 것이다.
이론 또는 기전에 상관없이 본원 내용은 아래의 연구를 근거로 한다. 96웰 평판에서 생성물 α-케토 부티레이트의 형성을 모니터링함으로써 메티오닌-γ-라이아제를 검출하기 위해 고속 대량 분석법을 일차적으로 개발하였고, 또한 메탄 티올의 형성 후 효소 역학을 신속히 측정하기 위해 이차 분석법을 개발하였다. 효소에 의한 α-케토부티레이트의 형성과 이어서 이. 콜라이 ilvA 돌연변이 세포의 성장 복원을 기준으로 L-메티온 분해 활성에 대한 유전자 선별을 고안하였다. 또한, 포화 돌연변이유발 및 랜덤 돌연변이유발에 이어서 메티오닌 분해에 대한 고속 대량 스크리닝을 실시하여 높은 메티오닌-γ-라이아제 활성을 갖는 시스타티오닌-γ-라이아제를 분리하였다.
본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 아미노산을 포함하는 화합물을 가리키며 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 비천연 방식으로 작동적으로 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "반감기"(1/2 수명)는 예를 들어 포유동물에 주사 후 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩타이드 농도가 반으로 감소하는데 걸리는 시간을 가리킨다.
용어 "작동가능한 조합으로", "작동가능한 순서로" 및 "작동적으로 연결된"은 기술된 구성원들이 의도한 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 연결, 예를 들어 핵산 분자가 해당 유전자의 전사 및/또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 유도할 수 있는 방식으로 핵산 서열이 연결된 상태 또는 융합 단백질이 생성되도록 하는 방식으로 아미노산 서열이 연결된 상태를 가리킨다.
용어 "링커"는 두개의 상이한 분자를 작동적으로 연결하는 분자 브릿지로서 작용하는 화합물 또는 모이어티(moiety)로서 링커의 한쪽 부분은 제1 분자에 작동적으로 연결되고 링커의 다른쪽 부분은 제2 분자에 작동적으로 연결되는 것을 가리킨다.
용어 "페길화"는 고도의 생체적합성 및 변형 용이성으로 인해 약물 담체로서 널리 사용되고 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 접합을 가리킨다. PEG는 화학적 방법을 통해 PEG 쇄의 말단에서 하이드록시 그룹을 통해 활성 제제에 커플링(예, 공유결합으로 연결)될 수 있지만, PEG 자체는 분자당 최대 2개의 활성 제제로 한정된다. 다른 접근법으로서, PEG와 아미노산의 공중합체가 PEG의 생체적합성을 유지하면서 분자당 많은 부착 지점의 추가 이점을 가지고 다양한 용도에 맞춰 합성적으로 설계될 수 있는 신규한 생체물질로서 개발되었다.
용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 이의 전구체의 생성을 위해 필요한 조절 및 암호 서열을 포함하는 DNA 서열을 가리킨다. 폴리펩타이드는 전장 암호 서열에 의해 또는 목적하는 효소 활성이 유지되도록 암호 서열 중 임의의 일부분에 의해 암호화될 수 있다.
용어 "천연"은 자연 발생 공급원으로부터 분리되었을 때 유전자의 전형적인 형태, 유전자 생성물 또는 이러한 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 가리킨다. 천연 형태는 자연 군집에서 가장 빈번히 관찰되는 것이고, 따라서 임의로 정상형 또는 야생형이라고 지칭한다. 대조적으로, 용어 "변형된", "변이체" 또는 "돌연변이체"는 천연 유전자 또는 유전자 생성물과 비교했을 때 서열 및 기능적 특성에서 변형을 나타내는(즉, 변형된 특징) 유전자 또는 유전자 생성물을 가리킨다.
용어 "벡터"는 핵산 서열을 세포내로 도입하여 이를 복제할 수 있도록 그 핵산 서열을 삽입할 수 있는 담체 핵산 분자를 가리키기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이 서열은 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래적이거나 세포 내의 서열에 대해 상동성이지만 숙주 세포 내의 위치에서 그 서열이 보통 발견되지 않음을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인조 염색체(예, YAC)를 포함한다. 본 분야의 전문가는 표준 재조합 기술을 이용하여 벡터를 용이하게 작제할 수 있다(참조예: Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994 - 이들 두 문헌의 내용은 본원에 참조로 인용된다).
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 모든 유형의 유전자 작제물을 가리킨다. 일부 경우에서, RNA 분자는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 또 다른 경우에서, 이들 서열은 예를 들어 안티센스 분자 또는 리보자임의 생성에서 해독되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이것은 특정 숙주 세포내에서 작동적으로 연결된 암호 서열의 전사 및 가능한 해독을 위해 필요한 핵산 서열을 가리킨다. 전사 및 해독을 통제하는 조절 서열 이외에 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 제공하고 앞서 기술된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료학적으로 유효한"은 치료되는 병태의 하나 이상의 증상을 적어도 완화시키는 것과 같은 치료학적 효과를 달성하기 위해 방법 및/또는 이들 세포와 병용되는 방법 또는 물질의 분석에 사용되는 세포 및/또는 치료학적 조성물(예, 치료학적 폴리뉴클레오타이드 및/또는 치료학적 폴리펩타이드)의 양을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "KM"은 효소에 대한 미카엘리스-멘텐 상수를 가리키며 해당 효소가 효소 촉매 반응에서 최대 속도의 절반을 제공하는 특정 기질의 농도로서 정의된다. 본원에 사용된 용어 "k cat "는 효소가 최대 효율로 작동하는, 각 효소의 부위가 단위시간 당 생성물로 전환되는 기질 분자의 회전 횟수 또는 기질 분자의 수를 가리킨다. 본원에 사용된 용어 "k cat /K M "은 효소가 기질을 생성물로 전환시키는 효율의 정도를 측정하는 특이성 상수이다.
용어 "시스타티오닌-γ-라이아제"(CGL 또는 시스타티오나제)는 시스타티오닌을 시스테인으로 가수분해하는 것을 촉매하는 모든 효소를 가리킨다. 예를 들어, 이 효소는 영장류 형태의 시스타티오닌-γ-라이아제 또는 특히 사람 형태의 시스타티오닌-γ-라이아제를 포함한다.
I. 메티오닌-γ- 라이아제 및 시스타티오닌 -γ- 라이아제
라이아제는 다양한 화학 결합의 분해를 촉매하여 흔히 새로운 이중결합 또는 새로운 고리 구조를 형성하는 효소이다. 예를 들어, 다음의 반응을 촉매하는 효소는 라이아제이다: ATP → cAMP + PPi. 라이아제는 한쪽 방향의 반응에서 하나의 기질만을 요구하지만 역반응에서는 두개의 기질을 요구한다는 점에서 다른 효소와 상이하다.
다수의 피로옥살-5'-포스페이트(PLP)-의존 효소가 시스테인, 호모시스테인 및 메티오닌의 대사에 연루되어 있으며, 이들 효소는 Cys/Met 대사 PLP-의존 효소로 지칭되는 진화상 관련 계열을 형성한다. 이들 효소는 약 400개의 아미노산으로 구성된 단백질이며 PLP 그룹은 폴리펩타이드의 중앙 위치에 위치한 라이신 잔기에 연결된다. 이 계열의 일원은 시스타티오닌-γ-라이아제(CGL), 시스타티오닌-γ-신타제(CGS), 시스타티오닌-β-라이아제(CBL), 메티오닌-γ-라이아제(MGL), O-아세틸호모세린(OAH)/O-아세틸-세린(OAS) 설프하이드릴라제(OSHS)를 포함한다. 이들 모두에서 나타나는 공통점은 외부 기질 알디민을 유도하는 미카엘리스 복합체의 형성이다. 반응의 추가 과정은 특정 효소의 기질 특이성에 의해 결정된다.
예를 들어, 본 발명자들은 PLP-의존 라이아제 계열 일원(예, 사람 시스타티오닌-γ-라이아제)내로 특정 돌연변이를 도입하여 기질 특이성을 변경시켰다. 이러한 방식으로 본 발명자들은 기질로서의 L-Met을 분해하는 새로운 능력을 갖는 신규한 변이체를 생성하였다. 다른 실시형태로서, 새로운 메티오닌 분해 활성을 생성하기 위한 다른 PLP-의존 효소의 변형이 또한 고려될 수 있다.
PLP-의존 효소로서, 메티오닌 감마-라이아제(EC 4.4.1.11)은 다음의 화학반응을 촉매하는 효소이다: L-메티오닌 + H2O
Figure pct00001
메탄디올 + NH3 + 2-옥소부타노에이트. 따라서, 이 효소의 두 기질은 L-메티오닌과 H2O인 반면, 이의 3개 생성물은 메탄디올, NH3 및 2-옥소부타노에이트이다. 이 효소는 라이아제 계열, 특히 탄소-황 라이아제의 부류에 속한다. 이 효소 부류의 체계명은 L-메티오닌 메탄티올-라이아제(탈아민화 2-옥소부타노에이트의 형성)이다. 다른 일반 명칭은 L-메티오닌아제, 메티오닌 라이아제, 메티오닌아제, 메티오닌 데티오메틸라제, L-메티오닌 감마-라이아제 및 L-메티오닌 메탄티올-라이아제(탈아민화)를 포함한다. 이 효소는 셀레노아미노산 대사에 참여한다. 이는 하나의 보조인자 피리독살-5'-포스페이트를 사용한다.
메티오닌아제는 보통 389 내지 441개 아미노산으로 구성되며 동종 사량체를 형성한다. 메티오닌아제 효소는 일반적으로 약 45 kDa 분자량의 4개의 동일한 서브유닛으로 구성된다(Sridhar et al., 2000; Nakamura et al., 1984). 효소의 구조는 결정화에 의해 밝혀졌다(Kudou et al., 2007). 사량체의 각 단편은 3개의 영역으로 구성된다: 2개의 나선과 3개의 베타-가닥을 포함하는 연장된 N-말단 도메인(잔기 1 내지 63), 8개의 알파-나선 사이에 거의 평행으로 샌드위치된 7개 가닥의 베타-시트로 구성된 거대한 PLP 결합 도메인(잔기 64 내지 262) 및 C-말단 도메인 (잔기 263 내지 398). 보조인자 PLP는 촉매 기능을 위해 필요하다. 촉매를 위해 중요한 아미노산이 구조를 바탕으로 동정되었다. 다른 c-계열 효소에서 강하게 보존되고 있는 이웃한 서브유닛의 Tyr59 및 Arg61은 PLP의 포스페이트 그룹과 접촉한다. 이들 잔기는 활성 부위 내의 주된 앵커로서 중요하다. 한 단량체의 Lys240, Asp241 및 Arg61 및 인접한 단량체의 Tyr114 및 Cys116은 효소에 특이성을 부여하는 메티오닌아제 활성 부위에서 수소-결합 네트워크를 형성한다.
시스타티오닌 감마-라이아제(CGL 또는 시스타티오닌아제)는 시스타티오닌을 시스테인 및 α-케토부티레이트로 분해시키는 효소이다. 피리독살 포스페이트는 이 효소의 보결 그룹이다. 비록 포유류가 메티오닌아제(MGL)를 갖고 있지 않지만, 이들은 세균 MGL 효소와 서열, 구조 및 화학적 상동성을 갖는 시스타티오나제를 함유한다. 실시예에 제시된 바와 같이, 단백질의 유전자조작을 이용하여 L-메티오닌의 분해에 대한 활성이 없는 시스타티오닌아제를 L-메티오닌을 이러한 아미노산을 고속으로 분해할 수 있는 효소로 전환시켰다.
II . 메티오닌아제의 유전자조작
사람은 메티오닌-γ-라이아제(MGL 또는 메티오닌아제)를 생성하지 않기 때문에 사람 치료요법을 위해 생리학적 조건 하에서 메티오닌을 분해하기 위한 고도의 활성과 특이성뿐만 아니라 혈청과 같은 생리적 체액에서의 고도의 안정성을 갖고, 이들이 정상적으로 면역 내성을 유도하는 천연 단백질이기 때문에 비면역원성인 메티오닌아제를 유전자조작할 필요가 있다.
pMGL을 이용한 동물 연구에서 밝혀진 바람직하지 못한 면역원성 효과로 인하여, 사람 효소에서 L-메티오닌 분해 활성을 유전자조작하는 것이 바람직하다. 사람 단백질에 대한 면역 내성은 이러한 효소가 비면역성이거나 최소로 면역성이되어 체내에서 허용되도록 하는 것이다.
유전자조작된 메티오닌아제로서 MGL 활성을 갖는 신규한 효소의 특정 양상은 이러한 요구를 해소해 준다. 비록 포유동물은 MGL을 갖고 있지 않지만 세균 MGL 효소에 대한 서열, 구조 및 화학적 상동성을 갖는 시스타티오닌-감마-라이아제(CGL)를 보유한다. CGL은 포유류의 황전환 경로에서 마지막 단계를 촉매하는 사량체이다(Rao et al., 1990). CGL은 L-시스타티오닌의 L-시스테인, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매한다(도 1). 사람 CGL(hCGL) cDNA는 이미 클로닝되어 발현되었으나 그 수율은 비교적 낮다(약 5 mg/L 배양물)(Lu et al., 1992; Steegborn et al., 1999).
예를 들어, 시스타티오닌-γ-라이아제가 천연 형태로 메티오닌아제 활성을 나타내지 않는 한편, 고효율로 메티오닌이 가수분해되도록 돌연변이유발을 통해 변형된 영장류(특히, 사람) 시스타티오닌-γ-라이아제(CGL 또는 시스타티오닌아제)와 관련된 방법 및 조성물이 제공되었다.
일부 실시형태는 변형된 단백질 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특정 실시형태는 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드와 비교할 수 있는 적어도 하나의 기능적 활성, 바람직하게는 메티오닌아제 효소 활성을 나타내는 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 추가의 양상에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 추가로 혈청 안정성이 증가되도록 변형될 수 있다. 따라서, 본원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩타이드"의 기능 또는 활성을 가리킬 때 본 분야의 전문가는 이것이 예를 들어 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드에 비하여 추가의 이점(예, 메티오닌아제 효소 활성)을 보유하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 소정 실시형태로서, 비변형 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연 시스타티오닌-γ-라이아제, 구체적으로는 시스타티오닌-γ-라이아제이다. 특히, "변형된 단백질"에 관한 실시형태는 "변형된 폴리펩타이드"에 대하여 실시될 수 있고 반대의 경우로도 실시될 수 있음이 고려된다.
활성의 측정은 특히 단백질의 활성에 관하여 본 분야의 전문가에게 잘 알려진 분석법을 사용하여 달성할 수 있고, 비교 목적을 위해 예를 들어 변형 또는 비변형 단백질 또는 폴리펩타이드의 천연물 및/또는 재조합물의 이용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌아제 활성은 알파-케토부티레이트, 메탄티올 및/또는 암모니아와 같이 메티오닌의 전환으로부터 생성되는 임의의 기질의 생성을 검출하는 어떠한 분석법에 의해서도 측정할 수 있다.
특정 실시형태로서, 변형된 폴리펩타이드(예, 변형된 시스타티오닌-γ-라이아제)는 메티오닌 분해 활성의 증가를 기준으로 동정될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 폴리펩타이드의 기질 인식 부위가 동정될 수 있다. 이러한 동정은 구조 분석 또는 상동성 분석을 기초로 할 수 있다. 이러한 기질 인식 부위의 변형을 포함한 돌연변이체의 군집이 형성될 수 있다. 추가의 실시형태로서, 메티오닌 분해 활성이 증가된 돌연변이체는 돌연변이체 군집 중에서 선택될 수 있다. 목적하는 돌연변이체의 선별은 메티오닌 분해로부터 부산물 또는 생성물의 검출과 같은 방법을 포함할 수 있다.
특정 실시형태로서, L-이소류신 및 L-메티오닌의 영양요구성이 형성되도록 유전자 ilvA 및 metA의 염색체 결실을 포함한 유전자조작된 이. 콜라이 균주를 사용하는 방법이 제공될 수 있다. L-메티오닌이 보충된 배지가 메티오닌 감마 라이아제 또는 메티오닌 분해 활성을 갖는 유전자조작된 시스타티오닌 감마-라이아제를 암호화하는(그러나 천연 시스타티오닌 감마 라이아제를 암호화하지 않는) 플라스미드의 존재 하에 제공되는 경우, 이는 α-케토부티레이트의 생성을 통해 L-이소류신 영양요구성을 해결해 줄 수 있다. 이 방법은 α-케토부티레이트도 생성할 수 있는 다른 경로로부터의 영향을 최소화함으로써 메티오닌 분해 활성을 갖는 돌연변이체의 동정을 촉진할 수 있다.
변형된 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 보유할 수 있고, 따라서, 결실을 가진 단백질, 치환을 가진 단백질 및 결실과 치환 둘 다를 가진 단백질이 변형된 단백질이다. 일부 실시형태로서, 이들 변형된 단백질은 예를 들면, 융합 단백질 또는 링커를 가진 단백질과 같이 아미노산의 삽입 또는 부가를 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 천연 단백질의 1개 이상의 잔기가 결여되어 있지만, 천연 단백질의 특이성 및/또는 활성을 가질 수 있다. 또한, "변형된 결실 단백질"은 면역원성 또는 항원성이 감소된 것일 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 특정 유기체(예, 변형된 단백질이 투여될 수 있는 유기체 종류)에서 항원성을 나타내도록 결정되는 단백질의 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 가진 것이다.
치환 또는 대체 변이체는 전형적으로 단백질내의 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 교환되는 것을 포함하며 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 이펙터 기능 및/또는 생체이용성을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적이거나 그렇지 않을 수 있고, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형태 및 전하를 갖는 것으로 대체된다. 보존 치환은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 알라닌이 세린으로, 아르기닌이 라이신으로, 아스파라긴이 글루타민 또는 히스티딘으로, 아스파테이트가 글루타메이트로, 시스테인이 세린으로, 글루타민이 아스파라긴으로, 글루타메이트가 아스파테이트로, 글리신이 프롤린으로, 히스티딘이 아스파라긴 또는 글루타민으로, 이소류신이 류신 또는 발린으로, 류신이 발린 또는 이소류신으로, 라이신이 아르기닌으로, 메티오닌이 류신 또는 이소류신으로, 페닐알라닌이 티로신, 류신 또는 메티오닌으로, 세린이 트레오닌으로, 트레오닌이 세린으로, 트립토판이 티로신으로, 티로신이 트립토판 또는 페닐알라닌으로, 및 발린이 이소류신 또는 류신으로 변환되는 것을 포함한다.
결실 또는 치환 이외에, 변형된 단백질은 잔기의 삽입을 가질 수 있으며, 전형적으로 폴리펩타이드에 하나 이상의 잔기의 부가를 포함한다. 이것은 표적 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 삽입 또는 단지 한 개의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 말단 부가(융합 단백질이라고 한다)가 하기에 기술된다.
용어 "생물학적 기능성 균등체"는 본 분야에 잘 이해되고 있으며 본원에서 추가로 상세하게 설명된다. 따라서, 약 70% 내지 약 80% 또는 약 81% 내지 약 90% 또는 약 91% 내지 약 99%의 대조군 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 균등한 아미노산을 갖는 서열은 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한 포함된다. 변형된 단백질은 특정 양상에서 이의 상응하는 천연 단백질과 생물학적 기능상 균등할 수 있다.
또한, 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 잔기(예, 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열)을 포함할 수 있으며, 서열이 상기된 기준(단백질 발현과 연관된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함)을 충족하는 한 본원에 기술된 서열 중 하나와 필수적으로 동일한 것일 수 있다. 특히 말단 서열의 부가는 예를 들어 암호 영역의 5' 또는 3' 부분에 인접하는 다양한 비암호 서열을 포함하거나 다양한 내부 서열, 즉 유전자내에 존재하는 것으로 알려진 인트론을 포함할 수 있다.
III . 치료를 위한 효소적 L-메티오닌 소모
특정 양상에서, 폴리펩타이드는 간세포 암종, 흑색종 및 신장 세포 암종과 같이 메티오닌 소모에 민감한 암을 포함한 질환을 L-메티오닌을 소모하는 새로운 효소로 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 구체적으로 메티오닌 분해 활성을 갖는 변형된 시스타티오닌-γ-라이아제를 사용하는 치료 방법을 기술한다. 아래에 설명된 바와 같이, 현재 이용가능한 메티오닌-γ-라이아제는 전형적으로 세균-유도 단백질이기 때문에 사람 치료요법에서 이들을 이용하는데 몇 가지 문제가 있다. 본 발명의 특정 실시형태는 치료학적 효능이 향상된 메티오닌-γ-라이아제 활성을 갖는 신규한 효소를 제공한다.
메티오닌 (L-Met) 소모는 잠재적 암치료용으로 오랫동안 연구되어 왔다. L-Met은 필수 아미노산인 한편, 다수의 악성 사람 세포주 및 종양은 메티오닌을 상대적으로 더 많이 요구하는 것으로 밝혀졌다(Halpern et al., 1974; Kreis and Goodenow, 1978; Breillout et al., 1990; Kreis et al., 1980; Kreis, 1979). 메티오닌-의존성 종양 세포주는 정상적으로 호모시스테인을 L-Met로 재생하는 효소인 메티오닌 신타제를 전혀 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현한다(Halpern et al., 1974; Ashe et al., 1974). 대부분의 정상 세포는 호모시스테인 및 호모시스틴과 같은 전구체에서 성장할 수 있는 반면, 다수의 악성 세포는 이들의 세포외 환경으로부터 L-Met를 직접 획득해야 한다. 또한, 급속히 성장하는 신생물 어떠한 것도 성장에 필요한 필수 빌딩 블록의 결핍에 의해 유해하게 영향을 받을 수 있다. 메티오닌은 이의 소모가 감소된 단백질 합성을 유도할 뿐만 아니라 유전자 조절에 특히 중요한 S-아데노실메티오닌(SAM) 의존성 메틸화 경로를 비정상적으로 조절하기 때문에 특히 중요하다.
정상 세포와 암 세포 사이의 메티오닌 요구 차이는 치료학적 기회를 제공한다. 효소적 메티오닌 소모는 많은 동물 모델에서뿐만 아니라 임상 단계 I에서 연구되어 왔다(Tan et al., 1997a; Tan et al., 1996a; Lishko et al., 1993; Tan et al., 1996b; Yoshioka et al., 1998; Yang et al., 2004a; Yang et al., 2004b; Tan et al., 1997b).
사람은 메티오닌 가수분해 효소가 없기 때문에, 다양한 출처의 세균성 L-메티오닌-감마-라이아제(MGL)가 암 치료요법에 대해 평가되어 왔다. 메티오닌-감마-라이아제는 메티오닌의 메탄티올, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매한다. 여러 출처의 세균성 효소가 정제되어 암세포주에 대한 메티오닌 소모제로서 시험되었다. 슈도모나스 퓨티다(pMGL)의 출처가 다른 출처에 비하여 높은 촉매 활성, 낮은 K M 및 상대적으로 높은 k cat 값 때문에 치료학적 용도로 선택되었다(Esaki and Soda, 1987; Ito et al., 1976). 또한, pMGL에 대한 유전자는 이. 콜라이 내로 클로닝되었고, 이 단백질은 높은 단백질 수율로 발현되었다(Tan et al., 1997a; Hori et al., 1996).
동물 모델뿐만 아니라 사람에 대한 생체내 연구가 이루어졌다. Tan 등은 누드 마우스에 이종 이식된 사람 종양으로 연구를 수행하였고, 폐, 결장, 신장, 뇌, 전립선 및 흑색종 암 모두가 pMGL에 민감하다는 것을 발견하였다(Tan et al., 1997a). 추가로, 유효 용량에서 독성이 검출되지 않았다(동물에서 체중이 감소하지 않는 것으로 측정되었기 때문이다). 이들 실험에서 채혈 시료로부터 측청한 결과 반감기는 불과 2시간인 것으로 측정되었다. 추가로, MGL 활성을 유지하기 위해 PLP 주입이 필요하다. 아주 짧은 반감기에도 불구하고, Tan 등은 염수 대조군에 비하여 종양 성장의 억제를 보고하였다.
Yang 등은 영장류 모델에서 MGL의 약동학, 메티오닌 소모 측면에서의 약력학, 항원성 및 독성을 연구하였다 (Yang et al., 2004b). 용량-범위 연구가 정맥내 투여로 1000 내지 4000 단위/kg으로 실시되었다. 최고 용량은 주사 후 30분까지 혈장 잔존 메티오닌을 미검출 수준(0.5 μM 미만)으로 감소시킬 수 있었고, 8시간 동안 잔존 메티오닌 수준은 검출되지 않았다. 약동학 분석에서는 pMGL이 2.5 시간의 반감기로 제거되는 것으로 나타났다. 2주 동안 하루 8시간마다 그 용량을 투여한 결과 혈장 메티오닌이 2 μM 미만으로 정상-상태 소모되었다. 감소된 음식물 섭취 및 약간의 체중 손실로 인해 미미한 독성이 관찰되었다. 불행하게도, 28일째의 재도전시 과민성 쇼크가 발생하였고 동물 한 마리가 사망하였으며, 이는 pMGL이 고도로 면역원성임을 가리키며 사람 치료요법에 상당히 불리한 점이다. 하이드로코르티손으로의 후속적인 예비치료는 과민성 반응을 방지하지만, 빈번한 구토가 관찰되었다. 추가의 재도전이 66일째, 86일째 및 116일째에 수행되었다. 1차 도전 후 항-rMGL 항체가 검출되었고 치료 기간 동안 농도가 증가되었다.
MGL의 치료학적 시행에 대한 상기 관찰된 장애에 반응하여, Yang 등은 효소의 페길화 및 이의 반감기와 면역원성에 대한 영향을 연구하였다. 효소는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석신이미딜 글루타레이트(MEGC-PEG-5000)에 커플링되었다. 용량 범위 연구가 재차 수행되었고 4,000 단위/kg (90 mg/kg)은 12시간 동안 혈장 메티오닌을 <5 μmol/L로 감소시키는데 충분하였다. 약동학 분석은 비페길화 효소에 비하여 페길화 효소의 혈청 청소 반감기가 36배 증가한 것으로 나타났다. 또한, 페길화는 음식물 섭취 감소 및 약간의 체중 손실의 미미한 독성만이 관찰됨에 따라 어느 정도 면역원성을 약독화하였다. 그러나, 활성 반감기는 L-Met 수준이 불과 12시간 동안 검출 수준 아래로 유지됨에 따라 (대조적으로 비페길화 효소의 경우 8시간) 향상되지 않았다. 이들 결과는 L-Met 소모 효소가 항신생제로서 능력이 있다고는 하지만 면역원성 및 약동학의 중대한 결함으로 도전을 받고 있다.
본 발명의 특정 양상은 종양과 같은 질병을 치료하기 위해 메티오닌 분해 활성을 갖는 변형된 시스타티오닌-γ-라이아제를 제공한다. 특히 변형된 폴리펩타이드는 사람 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있으며, 이에 따라 사람 환자에게 알러지 반응을 예방하고, 반복 투여가 가능하며, 치료 효능을 높일 수 있다.
본 발명의 치료 방법이 유용하게 적용되는 종양은 고형 종양 또는 혈액 종양에서 발견되는 것과 같은 악성 세포 유형 어떠한 것도 포함할 수 있다. 고형 종양의 예로는 이로써 한정되는 것은 아니지만 췌장, 결장, 막창자, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 콩팥, 후두, 육종, 폐, 비장, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 기관의 종양이 포함될 수 있다. 혈액 종양의 예로는 골수, T 또는 B 세포 악성, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등이 포함된다.
본원에서 유전자조작에 의해 시스타티오나제로부터 유도된 사람 메티오닌아제가 종양 세포, 종양 조직 또는 암을 보유한 포유동물의 순환계로부터 메티오닌을 소모하기 위한 다양한 양상 또는 메티오닌 제거가 바람직한 것으로 고려되는 다양한 관점에서 항종양제로서 사용될 수 있다.
메티오닌 소모는 생체내에서, 포유동물의 순환계에서, 조직 배양물 또는 다른 생물학적 배지에서의 메티오닌 소모가 바람직한 경우에 시험관내 또는 생물학적 유액에서, 세포 또는 조직이 환자 포유동물의 체외에서 처리된 후 체내로 재주입되는 생체외 방법으로 수행될 수 있다. 순환계, 배양 배지, 생물학적 유액 또는 세포로부터 메티오닌의 소모는 처리 대상물에 접근하는 메티오닌의 양을 감소시키기 위해 실시되며, 이에 따라 소모될 그 처리 대상물과 메티오닌-제거 양의 유전자조작된 사람 메티오닌아제와 접촉되는 처리 대상물중의 주변 메티오닌을 분해하는 메티오닌-소모 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다.
종양 세포는 메티오닌을 위한 영양 배지에 의존하기 때문에, 메티오닌 소모는 세포를 위한 영양 공급원에 관한 것이지 반드시 세포 자체에 관한 것이 아니다. 따라서, 생체내 방법에서 종양 세포의 치료는 종양 세포 군집을 위한 영양 배지를 유전자조작된 메티오닌아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 실시형태에서, 배지는 혈액, 림프액, 척수액 및 기타 메티오닌 소모가 필요한 체액일 수 있다.
메티오닌-소모 효능은 방법에 따라 다양할 수 있고 전형적으로 처리 대상물중에 존재하는 메티오닌의 양, 목적하는 소모율 및 메티오닌아제에 대한 처리 대상물의 노출 내성에 의해 좌우된다. 처리 대상물중의 메티오닌 수준 및 이에 따른 처리 대상물로부터의 메티오닌 소모율은 본 분야에 잘 알려져 있는 다양한 화학적 및 생물학적 방법에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다. 메티오닌-소모 양의 예가 본원에 기술되어 있고 처리 대상물 밀리미터 (ml) 당 0.001 내지 100 단위 (U)의 유전자조작된 메티오닌아제, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 U, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5 U의 유전자조작된 메티오닌아제일 수 있다.
메티오닌-소모 조건은 메티오닌아제 효소의 생물학적 활성에 적합한 완충액 및 온도 조건이며, 효소에 적합한 적정 온도, 염 및 pH 조건, 예를 들어 생리학적 조건이 포함된다. 대표적인 예는 약 4-40℃, 약 0.05 내지 0.2 M NaCl과 균등한 이온강도 및 약 5 내지 9의 pH가 포함되며, 한편으로 생리학적 조건이 포함된다.
특정 실시형태로서, 본 발명은 항종양제로서 유전자조작된 메티오닌아제를 사용하는 방법을 제공하며 이에 따라 종양 세포 군집을 치료학적 유효량의 유전자조작된 메티오닌아제와 종양 세포 성장을 억제하기에 충분한 기간동안 접촉시키는 것을 포함한다.
하나의 실시형태로서, 생체내 접촉은 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 본 발명의 유전자조작된 메티오닌아제를 함유한 치료학적 유효량의 생리학적으로 허용되는 조성물을 환자에게 투여하여 환자의 체내에 존재하는 종양 세포의 순환 메티오닌 공급원을 제거함으로써 달성된다. 또한, 유전자조작된 메티오닌아제의 접촉은 유전자조작된 메티오닌아제를 종양 세포가 함유된 조직내로 투여함으로써 달성될 수 있다.
치료학적 유효량의 유전자조작된 메티오닌아제는 목적하는 효과를 달성하기 위해, 즉 종양 조직내에서 또는 환자의 순환계에서 메티오닌을 소모하기 위해 순환되는 예정량이며, 이에 따라 종양 세포가 분열하지 못하도록 한다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자조작된 메티오닌아제의 투여를 위한 용량 범위는 종양 세포 분열 및 세포 주기의 증상이 감소되는 효과를 나타내기에 충분할 만큼 많은 양이다. 용량은 과점조증후군, 폐부종, 울혈성 심부전 등과 같은 부작용이 발생할 만큼 많아서는 않된다. 일반적으로, 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 중증도에 따라 다양할 수 있고 본 분야의 전문가에 의해 결정될 수 있다. 용량은 합병이 유발에 따라 의사 재량으로 조정될 수 있다.
예를 들어, 치료학적 유효량의 유전자조작된 메티오닌아제는 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우 ml 당 약 0.001 내지 약 100 단위 (U)의 유전자조작된 메티오닌아제, 바람직하게는 약 0.1 U 이상, 더 바람직하게는 1 U 이상의 혈관내 (혈장) 또는 국소 농도를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 전형적인 용량은 체중을 기준으로 투여될 수 있고 약 5-1000 U/킬로그램 (kg)/일의 범위, 바람직하게는 약 5-100 U/kg/일, 더 바람직하게는 약 10-50 U/kg/일, 더 더욱 바람직하게는 약 20-40 U/kg/일의 범위이다.
유전자조작된 메티오닌아제는 주사에 의해 또는 경과시간에 따른 점진적 주입에 의해 비경구 투여될 수 있다. 유전자조작된 메티오닌아제는 정맥내, 복강내, 경구, 근육내, 피하, 복강내, 경피, 피부도포로 투여되거나, 연동 수단에 의해 전달되거나, 종양 세포를 함유한 조직내로 직접 주사되거나, 전위 바이오센서 또는 메티오닌을 함유할 수 있는 카테터에 연결된 펌프에 의해 투여될 수 있다.
유전자조작된 메티오닌아제를 함유한 치료 조성물은 통상적으로 예를 들어 단위용량의 주사에 의한 것과 같이 정맥내 투여된다. 치료 조성물과 관련하여 사용될 경우의 용어 "단위용량"은 피검체에게 단위용량으로서 적합한 물리적으로 구분되는 단위를 가리키며, 각 단위는 필요한 희석제 (즉, 담체 또는 비히클)와 혼합되어 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해 순환되는 예정량의 활성물질을 함유한다.
조성물은 용량형에 적합한 방식 및 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여량은 치료 피검체, 활성 성분을 이용하는 피검체 체계의 능력 및 목적하는 치료 효과의 정도에 의해 좌우된다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 의해 결정되며 개인에 따라 다르다. 그러나, 전신 투여에 적합한 용량 범위는 본원에 기술되어 있으며, 투여 경로에 의해 좌우된다. 최초 투여 및 추가접종 투여에 적합한 용법이 또한 고려되며 최초 투여 후 1시간 이상의 간격으로 연속 주사 또는 기타 방식에 의한 반복 투여가 전형적이다. 수회 투여의 예가 본원에 기술되어 있고, 특히 메티오닌을 연속적으로 고도의 혈중 수준 및 조직 수준으로 유지하는 것이 바람직하다. 다른 방법으로서, 생체내 요법에 특정된 범위로 혈중 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
IV . 접합체
본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어 이종 펩타이드 단편 또는 중합체 (예, 폴리에틸렌 글리콜)과의 접합체를 형성함으로써 개량을 위해 유전자조작된 메티오닌아제의 추가 변형을 포함한다. 추가의 양상에서, 유전자조작된 메티오닌아제는 효소의 수화반경을 증가시키고 이에 따라 혈중 지속성을 증가시키기 위해 PEG에 연결시킬 수 있다. 특정 양상으로서, 기술된 폴리펩타이드는 임의의 표적화제, 예를 들어 종양 세포상의 외부 수용체 또는 결합 부위에 특이적으로 및 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드에 결합될 수 있다 (미국특허공고 2009/0304666).
A. 융합 단백질
본 발명의 특정 실시형태는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 이종 도메인의 N- 또는 C-말단에 연결된 변형 시스타티오나제를 가질 수 있다. 예를 들어, 융합은 또한 다른 종의 리더 서열을 이용하여 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현이 가능하게 할 수 있다. 다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 6개 히스티딘 잔기와 같은 단백질 친화성 태그 또는 항체 에피토프 (바람직하게는 분해가능한 것)와 같은 면역학적 활성 도메인의 부가를 포함한다. 이로써 한정되는 것은 아니지만 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토즈 결합 단백질 (MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함한다.
특정 실시형태로서, 변형된 시스타티오닌 감마-라이아제는 생체내 반감기를 증가시키는 펩타이드, 예를 들어 XTEN 폴리펩타이드에 연결될 수 있다 (Schellenberger et al., 2009).
융합 단백질을 제조하는 방법은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 이와 같은 단백질은 예를 들어 완전한 융합 단백질의 신합성법에 의해 또는 이종 도메인을 암호화하는 DNA 서열의 연결 후 완전한 융합 단백질의 발현에 의해 제조될 수 있다.
모 단백질의 작용성을 복원하는 융합 단백질의 제조는 탠덤으로 연결된 폴리펩타이드사이에 스플라이싱되는 펩타이드 링커를 암호화하는 가교 DNA 단편과 유전자를 연결시킴으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 가능케 하기에 충분한 길이여야 한다.
B. 링커
특정 실시형태로서, 유전자조작된 메티오닌아제는 이작용성 가교 시약을 사용하여 화학적으로 결합시키거나 펩타이드 링커와 단백질 수준에서 융합될 수 있다.
이작용성 가교 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조물의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 동정 및 구조 연구를 포함한 여러 목적에 광범위하게 사용되어 왔다. 적합한 펩타이드 링커가 또한 유전자조작된 메티오닌아제를 결합시키는데 사용될 수 있으며, 예로는 Gly-Ser 링커를 들 수 있다.
두개의 동일한 작용기를 갖는 동종이작용성 시약이 동일하고 상이한 거대분자들 또는 거대분자의 서브유닛 사이에 가교 및 폴리펩타이드 리간드의 이의 특정 결합 부위에 의해 결합을 유도하는데 상당히 효율적인 것으로 입증되었다. 이종이작용성 시약은 2개의 상이한 작용기를 함유한다. 2개의 상이한 작용기의 차등적인 반응성을 이용함으로써 가교는 선택적으로 및 순차적으로 조절될 수 있다. 이작용성 가교 시약은 이들의 작용기, 예를 들어 아미노, 설프하이드릴, 구아니디노, 인돌, 카르복실 특정기의 특이성에 따라 분류될 수 있다. 이들 가운데 유리 아미노기에 대한 시약은 구입편리성, 합성용이성 및 적용될 수 있는 순한 반응 조건때문에 특히 애용되고 있다.
대부분의 이종이작용성 가교 시약은 일차 아민-반응기 및 티올-반응기를 함유한다. 다른 예로서, 이종이작용성 가교 시약 및 이를 이용하는 방법은 공개되어 있다 (미국특허 제5,889,155호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다). 가교 시약은 친핵성 하이드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 결합시켜 주어 한 예로서 알데하이드가 유리 티올에 결합되도록 해준다. 가교 시약은 다양한 작용기를 가교시키기 위해 변형될 수 있다.
추가로, 본 분야의 전문가에게 알려진 어떠한 다른 가교/결합 시약 및/또는 기전도 사람 유전자조작된 메티오닌아제를 결합시키는데 사용될 수 있으며, 예로는 항체-항원 상호작용, 아비딘 바이오틴 연결, 아미드 연결, 에스테르 연결, 티오에스테르 연결, 에테르 연결, 티오에테르 연결, 포스포에스테르 연결, 포스포르아미드 연결, 무수물 연결, 디설파이드 연결, 이온성 및 소수성 상호작용, 이특이성 항체 및 항체 단편 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
적절한 혈중 안정성을 갖는 가교제를 사용하는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료/예방 물질을 결합시키는데 성공적으로 사용될 수 있는 많은 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 알려져 있다. 입체적 장애를 갖는 디설파이드 결합을 함유하는 링커가 더 큰 생체내 안정성을 제공하는 것으로 증명될 수 있다. 따라서, 이들 링커는 결합제의 한 부류이다.
장애를 갖는 가교제외에 비장애 링커가 또한 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하지 않는 다른 유용한 가교제로는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란이 포함된다 (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교제의 이용은 본 분야에서 잘 이해되고 있다. 다른 실시형태는 유연성 링커의 사용을 포함한다.
일단 화학적으로 결합된 펩타이드는 일반적으로 그 접합체를 비결합 물질 및 기타 오염물로부터 분리하기 위해 정제한다. 임상적으로 사용하기에 충분한 순도의 접합체를 제공하는데 있어서 다수의 정제 기술이 이용가능하다.
일반적으로 가장 많이 사용되는 것은 겔 여과, 겔 침투 또는 고성능액체 크로마토그래피와 같이 크기별 분리를 기초로 하는 정제 방법이다. 다른 크로마토그래피 기술 (예, 블루-세파로즈 분리)이 또한 사용될 수 있다. 나트륨 N-라우로일-사르코신 (SLS)와 같은 약 세정제를 사용하는 것과 같이 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하는 통상의 방법이 유용할 수 있다.
C. 페길화
본 발명의 특정 양상으로서, 유전자조작된 메티오닌아제의 페길화와 관련된 방법 및 조성물이 기술된다. 예를 들어, 유전자조작된 메티오닌아제는 본원에 기술된 방법에 따라 페길화될 수 있다.
페길화는 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체 쇄가 다른 분자 (보통 약물 또는 치료 단백질)에 공유 결합시키는 방법이다. 페길화는 PEG의 반응성 유도체를 표적 거대분자와 배양함으로서 달성하는 것이 통상적이다. 약물 또는 치료 단백질에 PEG의 공유 결합은 숙주의 면역계로부터 물질을 "위장"하고 (면역원성 및 항원성의 감소), 물질의 유체역학적 크기 (용액중의 크기)를 증가시켜 신장 청소를 감소시킴으로써 물질의 순환 시간을 연장시킬 수 있다. 또한, 페길화는 소수성 약물 및 단백질에 수용성을 제공할 수 있다.
페길화의 첫번째 단계는 PEG 중합체의 한쪽 또는 양쪽 말단에 적합하게 작용성화하는 것이다. 동일한 반응성 잔기로 각 말단이 활성화되는 PEG를 동종이작용성이라고 알려져 있는 한편, 만일 존재하는 작용기가 상이한 경우 이때의 PEG 유도체는 이종이작용성 또는 이종작용성이라고 한다. 목적하는 분자에 PEG를 결합시ㅋ키기 위해 PEG 중합체의 화학적 활성 또는 활성화된 유도체가 제조된다.
PEG 유도체의 적합한 작용기의 선택은 PEG에 결합되는 분자상의 이용가능한 반응기의 유형에 기초한다. 단백질의 경우, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파트산, 글루탐산 세린, 트레오닌, 티로신을 포함한다. 또한, N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복실산이 사용될 수 있다.
1세대 PEG 유도체를 형성하기 위해 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 중합체를 하이드록실 기와 반응하는 기, 전형적으로 무수물, 산염화물, 클로로포르메이트 및 카보네이트와 반응시킨다. 2세대 페길화 화학의 경우는 보다 더 효율적인 작용기, 예를 들어 알데하이드, 에스테르, 아미드 등이 결합에 이용되었다.
페길화의 응용이 점점 더 발전되고 정교해짐에 따라 결합을 위한 이종이작용성 PEG의 필요성이 증가하고 있다. 이들 이종이작용성 PEG는 친수성, 유동성 및 생체친화성 스페이서가 요구되는 두 대상물을 결합시키는데 아주 유용하다. 이종이작용성 PEG를 위해 바람직한 말단 기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카르복실산 및 NHS 에스테르이다.
가장 흔한 변형제 또는 링커는 메톡시 PEG (mPEG) 분자를 기준으로 한다. 이들의 활성은 알코올 말단에 단백질-변형 기를 부가하는 것에 의해 좌우된다. 일부 사례에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 디올)이 전구체 분자로서 사용된다. 이어서 디올은 (PEG 비스-비닐설폰의 사용예에서 보는 바와 같이) 헤테로- 또는 단독-이량체 PEG-연결된 분자를 제조하기 위해 양쪽 말단에서 변형된다.
단백질은 일반적으로 비양자화 티올 (시스테이닐 잔기) 또는 아미노기와 같은 친핵성 부위에서 페길화된다. 시스테이닐-특정 변형 시약의 예로는 PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올 및 PEG 비닐설폰이 포함된다. 4종 모두는 순한 조건하에서 강한 시스테이닐-특이적이고 약 알카리성 pH에서 중성이지만 각각은 약간의 단점이 있다. 말레이미드와 형성된 아미드는 알카리성 조건하에서 약간 불안정함에 따라 이러한 링커와의 제형 옵션에 약간 제약이 있을 수 있다. 요오도 PEG와 형성된 아미드 결합은 더 안정하지만 유리 요오드가 어떤 조건하에서 티로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 디설파이드 결합을 형성하지만 이러한 결합은 또한 알카리성 조건하에서 불안정하다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 요오도 PEG에 비하여 상대적으로 느리지만, 형성된 티오에테르 결합은 아주 안정하다. 또한, 그와 같이 좀더 느린 반응 속도에 의해 PEG-비닐설폰 반응은 통제하기가 더 용이할 수 있다.
천연 시스테이닐 잔기에서의 부위-특정 페길화는 이들 잔기가 보통 디설파이드 결합의 형태이거나 생물학적 활성을 위해 필요하기 때문에 별로 실시되지 않는다. 한편, 위치지정돌연변이를 이용하여 티올-특정 링커를 위해 시스테이닐 페길화 부위를 도입할 수 있다. 시스테인 돌연변이는 시스테인이 페길화 시약에 접하여 페길화 후 계속해서 생물학적으로 활성을 나타내도록 설계되어야 한다.
아민-특정 변형제는 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데하이드, PEG 이소티오시아네이트 및 기타 몇 가지를 포함한다. 모두는 순한 조건하에서 반응하며 아미노 기에 대해 아주 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마도 더 반응성인 물질중 하나이다. 그러나, 이의 높은 반응성은 대량 규모에서 페길화 반응의 조절을 어렵게 할 수 있다. PEG 알데하이드는 아미노 기와 이민을 형성한 다음 나트륨 시아노보로하이드라이드에 의해 이차 아민으로 환원된다. 수소화붕소나트륨과 달리 시아노보로하이드라이드는 디설파이드 결합을 환원시키지 않는다. 그러나, 이 화학물질은 상당한 독성을 나타내며 특히 휘발성이 되는 저 pH에서 주의깊게 다뤄야 한다.
대부분의 단백질에는 다수의 라이신 잔기가 존재하기 때문에 부위-특정 페길화는 어려움이 있을 수 있다. 다행히 이들 시약은 비양자화 아미노 기와 반응하기 때문에 저 pH에서 반응을 수행함으로써 저-pK 아미노 기에 페길화하는 것이 가능할 수 있다. 일반적으로, 알파-아미노 기의 pK는 라이신 잔기의 엡실론-아미노 기보다 1-2 pH 낮다. pH 7 또는 그 이하에서 분자를 페길화함으로써 N-말단에 대한 높은 선택성이 빈번히 이루어질 수 있다. 그러나, 이것은 단백질의 N-말단 부분이 생물학적 활성을 위해 필요하지 않은 경우만 가능하다. 여전히 페길화에 의한 약동학적 이익은 종종 시험관내 생물활성의 상당한 손실보다 크며, 결과적으로 페길화 화학과 무관하게 훨씬 더 큰 생체내 생물활성을 갖는 물질을 얻는다.
페길화 방법을 개발할때 고려해야 할 몇 가지 변수가 있다. 다행히 4가지 또는 5가지 이하의 핵심 변수가 있는 것이 보통이다. 페길화 조건의 최적화를 위한 "실험 디자인" 방법이 아주 유용할 수 있다. 티올-특정 페길화 반응의 경우 고려되는 변수는 단백질 농도, PEG 대 단백질 비율 (몰 기준), 온도, pH, 반응 시간 및 일부 경우 산소 배제를 포함한다. (산소는 단백질에 의한 분자간 디설파이드 형성에 기여하여 페길화 생성물의 수율을 떨어뜨린다). 아민-특정 변형의 경우도 동일한 요소 (산소 제외)가 고려되어야 하며, 단 pH는 특히 N-말단 아미노기를 표적으로 할때 훨씬 더 중요할 수 있다).
아민- 및 티올-특정 변형 모두의 경우 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 온도, 단백질 농도 및 pH를 제약할 수 있다. 또한, 페길화 반응의 개시 이전에 PEG 링커의 반응성을 알고 있어야 한다. 예를 들어, 페길화제가 단지 70% 활성을 나타내는 경우 PEG의 사용량은 단지 활성적인 PEG 분자만이 단백질 대 PEG 반응 화학양론에서 계수되도록 확정되어야 한다.
V. 단백질 및 펩타이드
특정 실시형태로서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드 (예, 유전자조작된 메티오닌아제)를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 상기된 바와 같이 융합 단백질에 포함되거나 물질에 결합될 수 있다.
본원에 사용된 단백질 또는 펩타이드는 일반적으로 이로써 한정되는 것은 아니지만 약 200개 이상의 아미노산부터 유전자로부터 해독된 전장 서열의 단백질; 약 100개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개 아미노산의 펩타이드를 가리킨다. 편의상 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본원에서 상호교환하여 사용된다.
본원에 사용된 "아미노산 잔기"는 본 분야에 공지된 모든 천연 아미노산, 모든 아미노산 유도체 또는 모든 아미노산 모사체를 가리킨다. 특정 실시형태로서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기는 연속적이며 어떠한 비아미노산도 아미노산 잔기의 서열내에 삽입되지 않는다. 다른 실시형태로서, 서열은 하나 이상의 비아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시형태로서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기의 서열에 하나 이상의 비아미노산 잔기가 삽입될 수 있다.
따라서, 용어 "단백질 또는 펩타이드"는 천연 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산중 적어도 하나 또는 이로써 한정되는 것은 아니지만 아래 표 1에 수록된 것을 포함하여 적어도 하나의 변형 또는 희귀 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
단백질 또는 펩타이드는 표준 분자생물학 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연 출처로부터 단백질 또는 펩타이드의 분리 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 합성을 포함하여 본 분야의 전문가에게 알려진 모든 기술에 의해 제조될 수 있다. 여러 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 이미 공개되어 있고 당업자에게 공개된 전산화 데이터베이스에서 찾아 볼 수 있다. 이와 같은 하나의 데이터베이스는 National Center for Biotechnology Information's Genbank 및 GenPept 데이터베이스이다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 이용가능하다). 공지 유전자의 암호 영역은 본원에 기술된 기술을 이용하거나 당업자에게 알려져 있는 기술을 이용하여 증폭 및/또는 발현시킬 수 있다. 다른 방법으로서, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 다양한 시판 제제가 본 분야의 전문가에게 알려져 있다.
VI . 핵산 및 벡터
본 발명의 특정 양상으로서, 유전자조작된 메티오닌아제 또는 변형된 시스타티오나제를 암호화하는 핵산 서열은 공개된 것일 수 있다. 사용된 발현 시스템에 따라 핵산 서열은 통상적인 방법을 기초로 선택할 수 있다. 예를 들어, 유전자조작된 메티오닌아제는 사람 시스타티오나제로부터 유도된 것이고 발현을 방해할 수 있어 이. 콜라이에서 거의 사용되지 않는 다수의 코돈을 함유하며, 이에 따라 개개의 유전자 또는 이의 변이체는 이. 콜라이 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 또한, 다양한 벡터들이 유전자조작된 메티오닌아제와 같은 목적 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 대표적인 벡터는 이로써 한정되는 것은 아니지만 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포손 또는 리포좀-기본 벡터를 포함한다.
VII. 숙주 세포
숙주 세포는 유전자조작된 메티오닌아제 및 이의 접합체의 발현 및 분비가 가능하도록 형질전환될 수 있으면 어떠한 것도 가능할 수 있다. 숙주 세포는 세균, 포유류 세포, 효모 또는 곰팡이일 수 있다. 다양한 세균에는 이스케리키아 및 바실러스가 포함된다. 사카로마이세스 속, 키유베로마이세스 속, 한세눌라 속 또는 피키아 속에 속하는 효모들이 적합한 숙주 세포로 이용될 수 있다. 곰팡이의 여러 종들이 발현 숙주로서 사용될 수 있으며 다음의 속이 포함된다: 아스퍼질러스, 트리코더마, 뉴로스포라, 페니실륨, 세팔로스포륨, 아킬라, 포도스포라, 엔도티아, 뮤코르, 코클리오볼루스 및 파리큘라리아.
이용가능한 숙주 유기체의 예로는 세균 (예, 에스케리키아 콜라이 MC1061, 바실러스 서브틸리스 BRB1의 변형체 (Sibakov et al., 1984), 스타필로코커스 아우레우스 SAI123 (Lordanescu, 1975) 또는 스트렙토코커스 리비단스 (Hopwood et al., 1985)); 효소 (예, 사카로마이세스 세레비지애 AH 22 (Mellor et al., 1983) 및 쉬조카라로마이세스 프롬베)); 곰팡이 (예, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스포질러스 아와모리 (Ward, 1989), 트로코더마 리세이 (Penttila et al., 1987; Harkki et al., 1989)).
포유류 숙주 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; ATCC CCL61), 랫트 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC CCL82), 헬라 S3 세포 (ATCC CCL2.2), 랫트 간암 세포 (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-형질전환 원숭이 신장 세포 (COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐 배아 세포 (NIH-3T3; ATCC CRL 1658)을 포함한다. 상기한 것들은 예시적인 것으로 이로써 한정되는 것은 아니며 많은 가능한 숙주 유기체들이 본 분야에 알려져 있다. 원칙적으로 분비할 수 있는 모든 숙주는 원핵이든 진핵이든 사용될 수 있다.
유전자조작된 메티오닌아제 및/또는 이의 융합 단백질을 발현하는 포유류 숙주 세포는 모 세포주를 배양하는데 전형적으로 사용되는 조건하에서 배양된다. 일반적으로, 세포는 전형적으로 5-10% 혈청 (예, 태아 소 혈청)이 보충된 생리학적 염 및 영양소 함유 표준 배지, 예를 들어 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM에서 배양된다. 또한, 배양 조건은 표준 조건이며, 예를 들어 배양은 목적하는 수준의 단백질이 달성될때까지 정치 배양 또는 회전병 배양으로 37℃에서 진행된다.
VIII . 단백질 정제
단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 기술은 한 단계에서 세포, 조직 또는 기관의 균질화 및 조 분획화에 의한 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획을 수득하는 것을 포함한다. 추가로, 달리 특정하지 않는 한 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 목적하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 부분적으로 또는 완전하게 정제 (또는 균질성의 정제)할 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특정적으로 맞춘 분석 방법은 이온교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 등전점전기영동이다. 특히 효율적인 펩타이드 정제 방법은 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)이다.
정제된 단백질 또는 펩타이드는 다른 성분으로부터 분리가능하여 천연적으로 획득되는 상태에 비하여 어느 정도로든 해당 단백질 또는 펩타이드가 정제되는 조성물을 가리킨다. 따라서, 분리된 또는 정제된 단백질 또는 펩타이드는 이 물질이 천연적으로 존재할 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질 또는 펩타이드를 가리킨다.
일반적으로, "정제된"은 분획화되어 다양한 다른 성분들이 제거된 단백질 또는 펩타이드 조성물을 가리키며, 이 조성물은 실질적으로 단백질 또는 펩타이드의 발현된 생물학적 활성을 유지한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우 이 의미는 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예를 들어 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상의 단백질을 구성하는 조성물을 가리킨다.
단백질 정제에 사용하기에 적합한 여러 기술들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 예를 들어 황산암모늄, PEG, 항체 등으로의 침전, 열변성 후 원심분리, 크로마토그래피 단계 (예, 이온교환, 겔여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피), 등전점 전기영동, 겔 전기영동 및 이들의 조합 및 기타 기술을 포함한다. 본 분야에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 여러 정제 단계를 실시하는 순서는 바꾸거나 특정 단계를 배제하고서도 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조를 위한 적합한 방법을 제공한다.
단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량하는 다양한 방법들은 본 발명과 관련하여 당업자에게 알려져 있다. 이들 방법은 예를 들어 활성 분획의 고유 활성을 결정하거나 SDS/PAGE 분석에 의해 분획내 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 고유 활성을 계산하고, 이 값은 최초 추출물의 고유 활성과 비교하며, 이에 따라 분획의 순도 정도를 계산하여 "-배 순도값"으로 평가하는 것이다. 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 물론 정제를 수행하기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는 지의 여부에 의해 좌우된다.
단백질 또는 펩타이드를 가장 정제된 상태로 항상 제공할 수 있는 일반적인 요건은 없다. 사실, 덜 실질적으로 정제된 생성물이 특정 실시형태에서 이용될 수 있음이 고려된다. 부분적인 정제는 소수의 정제 단계를 배합적으로 사용하거나 동일한 일반적인 정제 과정의 다른 형태를 이용함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 이용하여 실시된 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일 기술에 비하여 일반적으로 보다 큰 배수의 정제를 제공하는 것으로 알려져 있다. 보다 낮은 정도의 상대적 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 전체 회수에서 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 이점을 가질 수 있다.
특정 실시형태로서, 단백질 또는 펩타이드는 분리되거나 정제된, 예를 들어 유전자조작된 메티오닌아제, 유전자조작된 메티오닌아제 함유 융합 단백질 또는 페길화 후의 유전자조작된 메티오닌아제일 수 있다. 예를 들어, His 태그 또는 친화성 에피토프가 유전자조작된 메티오닌아제에 포함되어 정제를 용이하게 해 줄 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 분리 대상 물질과 이 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자사이의 특정 친화성에 의존하는 크로마토그래피 방법이다. 이것은 수용체-리간드 유형의 상호작용이다. 컬럼 재료는 불용성 매트릭스에 결합 파트너중 하나를 공유 결합시킴으로써 합성한다. 그런 후, 컬럼 재료는 용액으로부터 그 물질을 특정적으로 흡착할 수 있다. 용출은 결합이 일어나지 않는 조건으로 (예, pH, 이온강도, 온도 등의 변경) 변화를 줌으로써 진행한다. 매트릭스는 자체적으로 어떠한 유의적인 정도로도 분자에 흡착하지 않고 광범위한 화학적, 물리적 및 열 안정성을 갖는 물질이어야 한다. 리간드는 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 결합되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 조밀한 결합을 제공해야 한다. 또한, 시료 또는 리간드를 파괴하지 않고서 물질을 용출할 수 있어야 한다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 용액중의 분자들이 크기별로 또는 보다 전문적 관점에서 유체역학 용량을 기준으로 분리하는 크로마토그래피 방법이다. 이 방법은 보통 큰 분자 또는 거대분자 복합체 (예, 단백질 및 공업용 중합체)에 적용된다. 전형적으로, 수용액을 이용하여 시료를 컬럼을 통해 이송시키는 경우 이 기술은 겔 여과 크로마토그래피로 알려져 있으며, 이에 대비하여 이동상으로서 유기 용매가 사용되는 경우 겔 침투 크로마토그래피라고 한다.
SEC의 근간은 상이한 크기의 입자들이 정지상을 통해 다른 속도로 용출 (여과)한다는 것이다. 이것은 크기별로 입자 용액을 분리해 준다. 모든 입자들이 동시에 또는 거의 동시에 로딩되는 전제하에 같은 크기의 입자들은 함께 용출되어야 한다. 각각의 크기별 배제 컬럼은 분리될 수 있는 분자량의 범위를 갖는다. 배제 한계는 그 범위의 최상위에 해당하는 분자량으로 정의되며 분자가 너무 커서 정지상에 포획되지 않는 경우이다. 침투 한계는 분리 범위의 최하위에 해당하는 분자량으로 정의되며 충분히 작은 크기의 분자들이 정지상의 세공내로 완전히 침투할 수 있고 이 분자량 이하의 모든 분자들은 단일 밴드로서 용출할 수 있을 만큼 작은 경우이다.
고성능 액체 크로마토그래피 (또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리, 동정 및 정량하기 위해 생화학 및 분석화학에서 흔히 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 패키징 재료 (정지상)를 고정한 컬럼, 컬럼을 통해 이동상을 움직이는 펌프 및 분자의 보존 시간을 보여주는 검출기를 이용한다. 보존 시간은 정지상, 분석 대상 분자 및 사용 용매사이의 상호작용에 따라 다양하다.
IX . 약제학적 조성물
신규한 메티오닌아제는 종양 세포 성장을 억제하기 위해 및 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암을 가진 암환자의 암세포를 사멸시키기 위해 전신 또는 국소 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 정맥내, 척수내 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 항증식성 약물과의 혼합물로 투여될 수 있다. 하나의 실시형태로서, 이들은 수술 또는 다른 절차이전에 환자에게 암부담을 덜기 위해 투여될 수 있다. 다른 방법으로서, 이들은 남아있는 어떠한 잔여 암도 (예, 수술로 제거하지 못한 암) 생존하지 않고 있음을 보장하기 위해 수술 후에 투여할 수 있다.
본 발명은 치료제의 특성으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이와 같은 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형에 제공될 수 있다. 이들 치료제는 가축과 같은 포유류에 수의용으로 투여되거나 다른 치료제와 유시한 방식으로 사람에게 임상용으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능을 위해 요구되는 용량은 사용 유형 및 투여 방식뿐만 아니라 개개인의 특화된 요건에 따라 다양할 수 있다.
이러한 조성물은 전형적으로 액체 용액 또는 현탁액의 주사제로 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제는 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤 등 및 이들의 배합물이다. 또한, 필요한 경우 조성물은 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 조정제를 함유할 수 있다.
임상 적용이 고려되는 경우 단백질, 항체 및 약물을 포함한 약제학적 조성물을 의도한 용도에 알맞은 형태로 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체중에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 시스티온아제 변이체 또는 추가의 물질을 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 또는 약물학적으로 허용되는"은 적절한 예로서 사람과 같은 동물에게 투여될때 부작용, 알레르기 반응 또는 기타 좋지 못한 반응을 발생하지 않는 분자 자체 및 조성물을 가리킨다. 본원에 기술된 방법에 의해 분리된 하나 이상의 시스타티오나제 변이체 또는 추가의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990에 예시된 바와 같이 본 발명의 양상에서 당업자에게 잘 알려져 있으며, 위 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 또한, 동물 (예, 사람) 투여시 제제는 FDA Office of Biological Standards의 규정에 따라 무균성, 발열성, 전체적 안전성 및 순도 표준을 충족하여야 한다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 알려져 있는 바와 같은 (참조예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990 - 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다) 임의의 및 모든 용매, 분산매질, 피복제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제 (예, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수지연제, 염, 방부제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 유사물질 및 이들의 배합물을 포함한다. 어떠한 통상적인 담체도 활성 성분과 배합할 수 없는 경우를 제외하고 약제학적 조성물에 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 특정 실시형태는 투여되는 제형이 고형, 액형 또는 에어로졸형인지의 여부 및 주사제로서의 투여 경로에 따른 멸균 필요성에 의해 다른 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내, 피부내, 경피, 척수내, 동맥내, 복강내, 비내, 질내, 직장내, 국소, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 흡인 (예, 에어로졸 흡인), 주사, 주입, 지속 주입, 표적세포의 직접적인 국소적 관류욕, 카테터 경유, 세척, 액체 조성물 중(예, 리포좀) 또는 당업자에게 알려진 바와 같은 기타 방법 또는 상기 경로의 조합에 의해 투여될 수 있다 (참조예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990 - 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다).
변형된 폴리펩타이드는 유리 염기, 중성 또는 염 형태로서 조성물내로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노기와 형성된 염 또는 무기산 (예, 염산 또는 인산) 또는 유기산 (예, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산)와 형성되는 염을 포함한다. 유리 카르복실 기와 형성된 염은 또한 무기 염기 (예, 수산화 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 3가철) 또는 유기 염기 (예, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인)로부터 유도될 수 있다. 제형시 용액은 용량형에 적합한 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여된다. 제제는 주사용액 또는 폐로 전달하기 위한 에어로졸과 같은 비경구 투여용 제형 또는 약물 방출 캡슐 등과 같은 소화관 투여용 제형과 같은 다양한 용량형으로 간단히 투여된다.
본 발명의 특정 양상에 따라 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 불활성 희석제 없이 약제학적으로 허용되는 담체중에 제공된다. 담체는 동화성이어야 하며 액체, 반고체 (즉, 페이스트) 또는 고체 담체를 포함한다. 어떠한 통상적인 매질, 물질, 희석제 또는 담체도 환자에 또는 그에 함유되는 조성물의 치료 효능에 유해하지 않는 한, 방법을 실시하는데 사용되는 투여 조성물에 그들을 사용하는 것은 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 생리식염수, 액체, 리포좀, 수지, 결합제, 충진제 등 또는 이들의 배합물을 포함한다. 또한, 조성물은 하나 이상 이상의 성분의 산화를 지연시키는 여러 가지 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물의 작용은 여러 가지 항균제 및 항진균제와 같은 보존제로 예방될 수 있으며 이로써 한정되는 것은 아니지만 파라벤 (예, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 또는 이들의 배합물이 포함된다.
본 발명의 특정 양상에 따라 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡착 등에 의해 담체와 배합된다. 이러한 방법들은 본 분야의 전문가에게 통상적인 것들이다.
본 발명의 특정 실시형태로서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 배합 또는 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 어떠한 용이한 방식으로도 실시될 수 있다. 또한, 안정화제는 치료학적 활성의 유실 (즉, 위에서의 변성)로부터 조성물을 보호하기 위해 혼합 과정에 첨가될 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예는 완충제, 아미노산 (예, 글리신 및 라이신), 탄수화물 (예, 덱스트로즈, 만노즈, 갈락토즈, 프락토즈, 락토즈, 수크로즈, 말토즈, 솔비톨, 만니톨) 등을 포함한다.
추가의 실시형태로서, 본 발명은 시스타티오나제 변이체, 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "지질"은 수중에서 특징적으로 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 광범위한 물질중 어떠한 것도 포함하는 것으로 정의된다. 이와 같은 광범위한 부류의 화합물은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본원에서 사용됨에 따라 지질은 특정 구조로 한정되지 않는다. 이의 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 천연적이거나 합성된 것 (사람에 의해 설계 또는 생성된 것)일 수 있다. 그러나, 지질은 보통 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 본 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑코지질, 당지질, 설파타이드, 에테르 및 에스테르-연결된 지방산을 가진 지질 및 중합성 지질 및 이들의 배합물을 포함한다. 물론, 지질로서 당업자에 의해 이해되는 것으로 본원에 특정적으로 기술된 것이외의 화합물도 조성물 및 방법에 내포된다.
당업자는 지질 비히클에 조성물을 분산시키기 위해 사용할 수 있는 기술 범위를 잘 알고 있다. 예를 들어, 유전자조작된 메티오닌아제 또는 이의 융합 단백질은 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 지질 함유 용액중에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질에 공유결합되거나, 지질중에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀 또는 리포좀에 함유되거나 복합체를 형성하거나, 지질 또는 지질 구조와 결합될 수 있다. 분산은 리포좀을 형성할 수 있거나 그렇지 않을 수도 있다.
동물 환자에 투여된 조성물의 실제 용량은 체중, 중증도, 치료 받아야 하는 질병의 종류, 이전 또는 병형되는 치료 상담, 환자의 특발성 질환 및 투여 경로와 같은 신체적 및 생리적 요인에 의해 결정될 수 있다. 용량형 및 투여 경로에 따라 바람직한 용량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 피검체의 반응에 따라 다양할 수 있다. 투여 담당 의사는 어떠한 경우라도 개별적인 피검체를 위해 조성물 중의 활성 성분의 농도 및 적절한 용량을 결정할 수 있다.
특정 실시형태로서, 약제학적 조성물은 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시형태로서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75% 또는 약 25% 내지 약 60%, 예를 들어 이들 범위내에서 추론가능한 임의의 양을 포함할 수 있다. 당연히 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 성분의 양은 적합한 용량이 화합물의 임의의 해당 단위 용량에서 획득되는 정도이다. 용해성, 생체이용성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 물질의 유통기한뿐만 아니라 기타 약물학적 고려사항과 같은 요소가 약제 제조 분야의 전문가에 의해 고려되며, 이에 따라 다양한 용량형 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
기타 비한정적인 예로서, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상 및 이들 범위내에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 수록된 수치로부터 추론가능한 범위의 비한정적인 예로서, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중의 범위, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중의 범위 등이 상기된 수치를 기준으로 투여될 수 있다.
X. 키트
본 발명의 특정 양상은 치료용 키트와 같은 키트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 약제학적 조성물 및 임의로 사용 지침서를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 이러한 조성물의 투여를 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 키트는 암 종양내로 조성물의 직접적인 정맥내 주사를 달성하기 위한 카테터와 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 다른 실시형태로서, 본 발명의 키트는 임의로 전달 장치와 함께 사용하기 위해 약제로서 제형 또는 동결건조된 유전자조작된 메티오닌아제의 1회용 앰풀을 포함할 수 있다.
키트는 라벨이 붙은 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재질로 제조될 수 있다. 용기는 상기된 바와 같이 치료 용도 또는 비치료 용도에 효과적인 항체를 포함하는 조성물을 보유할 수 있다. 용기상의 라벨은 조성물이 특정 치료 또는 비치료 용도를 위해 사용된다는 것을 가리킬 수 있으며, 또한 상기된 바와 같은 생체내 또는 시험관내 용도의 지침을 나타낼 수 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 상기된 용기 및 판매자 및 사용자 관점에서 원하는 재료 (완충제, 희석제, 필터, 침, 주사기 및 사용지침서를 담은 처방정보를 포함)를 포함한 하나 이상의 다른 용기를 포함한다.
XI . 실시예
아래 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 증명하기 위해 포함된다. 본 분야의 전문가는 아래 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 실시에 잘 기능하는 것으로 본 발명자들에 의해 개발된 기술을 대표하고 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 인정할 것이다. 다른 한편으로, 본 분야의 전문가는 본원 명세서의 내용을 기초로 하여 기재되어 있는 특정 실시형태에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 발명의 특성 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인정할 것이다.
실시예 1
천연 사람 시스타티오나제-γ-라이아제 및 변형된 사람 시스타티오나제-γ-라이아제의 유전자 합성 및 발현
가이드로서 시스타티오닌-감마-라이아제(CGL) 및 메티오닌-γ-라이아제(MGL) 효소의 서열 및 구조 정렬을 이용하여, CGL, 특히 사람 CGL(hCGL)을 메티오닌의 효율적인 분해를 위한 효소로 전환시켰다.
사람 시스타티오나제 유전자는 이. 콜라이에서 거의 이용되지 않고 발현을 방해할 수 있는 다수의 코돈을 함유한다. 따라서, 이. 콜라이에서 단백질 발현을 최적화하기 위해 DNA-Works 소프트웨어를 사용하여 설계된 코돈 최적화 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 hGCL 유전자를 합성하였다(Hoover et al., 2002). NcoI 5' 제한 부위, 인-프레임 N-말단 His6 태그 및 3' EcoRI 부위를 ORF 내로 도입하였다. pET28a 벡터(Novagen) 내로 클로닝한 후 적절한 시스타티오나제 발현 벡터를 함유한 이. 콜라이(BL21) 형질전환체를 37℃ 하에서 250 rpm으로 진탕 플라스크에 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 테리픽 브로스 (TB) 배지에서 0.5 내지 0.6의 OD600에 도달할때까지 성장시켰다. 이 시점에서 배양물을 25℃의 진탕기로 전환시키고 IPTG로 유도하여 추가로 12시간 동안 단백질을 발현시켰다. 이어서, 세포 펠렛을 원심분리하여 수거하고 IMAC(고정된 금속 친화성 크로마토그래피) 완충액(10 mM NaPO4/10 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)에 재현탁시켰다. 프렌치 프레셔 셀(French Pressure Cell)로 용해한 후 용해물을 4℃에서 20분간 20,000 x g로 원심분리하고 생성된 상청액을 니켈 IMAC 컬럼에 적용하고, 10-20 컬럼 용적의 IMAC 완충액으로 세척한 다음, IMAC 용출 완충액(50 mM NaPO4/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)로 용출시켰다. 이어서, 효소를 함유한 분획을 10 mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP)와 함께 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후, 10,000 MWCO 원심분리 여과 장치(Amicon)를 사용하여, 단백질을 100 mM PBS, 10% 글리세롤, pH 7.3 용액으로 수회에 걸쳐 완충액 교환처리하였다. 이어서, 시스타티오나제 효소의 분액을 액체 질소에서 급속 냉동시키고 -80℃에 저장하였다. 이러한 방식으로 정제된 시스타티오나제는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 평가한 결과 95% 이상의 균질성을 나타냈다. 수율은 6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 20 mM 인산염 완충액, pH 6.5의 최종 완충액 농도에서 계산된 흡광계수 ε280=29,870 M-1 cm-1을 기준으로 약 400 mg/L 배양물로 계산되었다 (Gill and von Hippel, 1989).
실시예 2
메티오닌-γ- 라이아제 활성의 96-웰 평판 스크린 및 클론의 등급지정
MGL과 CGL 둘 다는 각각의 기질로부터 2-케토부탄산을 생성한다. 소단위 라이브러리를 선별하고 가장 큰 METase(메티오닌-γ-라이아제) 활성을 갖는 클론에 등급을 지정하기 위해 α-케토 산 3-메틸벤조티아졸린-2-온 하이드라존(MBTH)의 검출을 위한 비색 분석(Takakura et al., 2004)을 96-웰 평판 포맷으로 조정하였다.
이전 단락에 기술된 분석에서 활성을 나타내는 돌연변이 효소를 암호화하는 단일 콜로니를 75 ㎕의 TB 배지/웰 및 50 ㎍/ml 카나마이신이 함유된 96-웰 평판의 마이크로웰로 주입하였다. 0.8-1의 OD600에 도달할때까지 37℃하에 평판 진탕기에서 세포를 성장시켰다. 25℃로 냉각시킨 후, 50 ㎍/ml 카나마이신과 0.5 mM IPTG가 함유된 75 ㎕의 배지/웰을 추가로 첨가하였다. 25℃에서 진탕하면서 2시간 동안 발현이 이루어지도록한 후 100 ㎕의 배양물/웰을 96웰 분석 평판으로 옮겼다. 이어서, 분석 평판을 원심분리하여 세포 펠렛을 획득하고, 배지를 제거한 다음, 50 ㎕/웰의 B-PER 단백질 추출 시약(Pierce)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 원심분리하여 제거한 후 용해물을 37℃에서 5 mM L-Met와 10 내지 12시간 동안 배양하였다. 이어서, 1 M 나트륨 아세테이트 pH 5중의 0.03% MBTH 용액 3부를 첨가하여 반응을 유도체화하였다. 평판을 40분간 50℃로 가열하고 냉각시킨 후 미세역가 평판 판독기로 320 nm에서 판독하였다.
실시예 3
메티오닌-γ- 라이아제 활성의 유전자 선별
α-케토부티레이트는 이소류신 생합성 경로의 첫번째 효소로서 이. 콜라이에서 트레오닌 데아미나제 (ilvA에 의해 암호화됨)의 작용에 의해 생성된다. 거의 40년전 Grimminger와 Feldner는 이소류신 영양요구주인 트레오닌 데아미나제 돌연변이체를 동정하였고(Grimminger and Feldner 1974) 보다 최근에 트레오닌 데아미나제 점돌연변이체가 배지로부터 이소류신이 제거된 경우 정상 성장능의 5% 미만을 갖는 것으로 밝혀진 일반적인 발현 균주 BLR(DE3)에서 발견되었다(Goyer et al., 2007). α-케토부티레이트를 생성하는 메티오닌아제의 발현은 ilvA 돌연변이체의 성장을 회복시켜 주고 이에 따라 최소배지에서 콜로니가 형성되도록 하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, BLR(DE3)내의 트레오닌 데아미나제 유전자는 점돌연변이체이고 특히 아주 큰 라이브러리에서 복귀할 가능성이 높다. 트레오닌 데아미나제는 이소류신 생합성 오페론 ilvGMEDA에서 먼쪽에 위치한 유전자이며 오페론의 일부로서 발현되거나 내부 프로모터와 독립적으로 발현된다(Lopes and Lawther 1989).
다른 Ile 유전자의 발현에 미치는 원치 않는 효과를 피하기 위해, 이. 콜라이 균주 BL21의 1545 bp ilvA 유전자 내에서 내부 단편을 문헌에 공지된(Datsenko and Wanner 2000) 바와 같이 FLP 리컴비나제 플라스미드 pCP20을 사용함으로써 P1 형질도입 및 카나마이신 내성 마커의 복원을 통해 예일 이. 콜라이 제네틱 스톡 센터 (New Haven, CT)로부터 입수된 이. 콜라이 균주 JW3745-2(Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, ΔilvA723::kan, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514)를 사용하여 결실시켰다. 또한, L-시스타티오닌 및 L-호모시스테인이 이. 콜라이 메티오닌 생합성 경로에서 중간체인 것이 확인되었다 (도 11). L-시스타티오닌 및 L-호모시스테인은 시스타티오닌-γ-라이아제의 기질이며 이 효소에 의해 α-케토부티레이트가 생성되고 이소류신 생합성 경로를 보완해준다. 따라서, 유전자 metA (호모세린-O-석시닐트랜스퍼라제를 암호화)를 문헌에 공지된 (Datsenko and Wanner 2000) 바와 같이 FLP 리컴비나제 플라스미드 pCP20을 사용함으로써 P1 형질도입 및 카나마이신 내성 마커의 복원을 통해 예일 이. 콜라이 제네틱 스톡 센터 (New Haven, CT)로부터 입수된 이. 콜라이 균주 JW3973-1(Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, ΔmetA780::kan, hsdR514)을 사용하여 녹아웃시켰다. 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)(F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 유전자 1 ind1 sam7 nin5])를 수용체 균주로 사용하였고 결과적으로 L-이소류신과 L-메티오닌 모두에 대해 영양요구성인 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) (ΔilvA, ΔmetA)가 생성되었다.
따라서, 메티오닌-γ-라이아제(유전자조작된 시스타티오닌-γ-라이아제)에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드를 보유한 이. 콜라이 BL21(DE3) (ΔilvA, ΔmetA)는 L-메티오닌이 보충된 M9-최소배지 평판에서 성장할 수 있지만 야생형 시스타티오닌-γ-라이아제 및 빈 플라스미드를 가진 동일한 균주는 성장할 수 없었다 (도 12). 따라서, 메티오닌-γ-라이아제 활성을 가진 재조합적으로 발현된 유전자조작된 시스타티오닌-γ-라이아제 변이체의 아주 큰 라이브러리는 불활성 클론의 배경 또는 시스타티오닌아제 활성을 갖는 클론에 대해 신속하게 선별할 수 있었다.
실시예 4
hCGL 의 잔기 E59 , R119 및 E339 에 미치는 돌연변이유발의 영향
구조 분석 결과, 잔기 E59, R119 및 E339가 기질 L-시스타티오닌에 대한 hCGL의 인식에 연루되어 있는 것으로 나타났다. 돌연변이유발 프라이머 순방향 5'-ggccagcatagcggttttNNStatagccgtagcggc (서열번호 2), 역방향 5'- GCCGCTACGGCTATASNNAAAACCGCTATGCTGGCC (서열번호 3), (R119) 순방향 5'-gtatggtgggaccaatNNStatttccgtcaggtggcg (서열번호 4), 역방향 5'- CGCCACCTGACGGAAATASNNATTGGTCCCACCATAC (서열번호 5), (E339) 순방향 5'- ctgaaactgtttaccctggcaNNSagcttgggcggctttg (서열번호 6) 및 역방향 5'- CAAAGCCGCCCAAGCTSNNTGCCAGGGTAAACAGTTTCAG (서열번호 7)를 사용하고, hCGL 유전자를 주형 DNA로서 및 특정 말단 프라이머 순방향 5'- gatataccATGGGAGGCCATCACCACCATCATCATGGCGGGCAGGAAAAGGATGCG (서열번호 8) 및 역방향 5'-CTCGAATTCTCAACTGTGGCTTCCCGATGGGGGATGGGCCGCTTTCAGCGCCTGATCC (서열번호 9)를 사용하여 상기 부위에서 NNS 코돈 포화 라이브러리를 작제하고 선별하였다. PCR 생성물을 NcoI 및 EcoRI으로 분해시키고, T4 DNA 리가제로 pET28a내로 연결시켰다. 생성된 접합체로 이. 콜라이(BL21)를 직접 형질전환시키고 실시예 2에 기술된 바와 같이 후속 선별을 위해 LB-카나마이신 평판에 도말하였다. 라이브러리의 이론상 다양성보다 2배 많은 콜로니가 선별되었다. 활성을 나타내는 클론을 분리하고 hCGL 유전자의 서열을 결정하여 돌연변이를 동정하였다.
효소 변이체는 SDS-PAGE에 의해 95% 이상의 균질성으로 정제하였다. PLP와의 배양은 아마도 발현을 위해 사용된 이. 콜라이가 생성된 모든 hCGL을 위해 충분한 PLP를 생성하지 않기 때문에 고유 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 일단 효소가 PLP와 함께 적용되면 저장시 보조인자의 손실 없이 안정적이었다.
실시예 5
사람 시스타티오닌 -γ- 라이아제 변이체의 성상확인
최고 촉매 활성을 나타내는 것으로 선별 동정된 두 hCGL 변이체는 다음의 돌연변이를 갖는 것으로 밝혀졌다: E59N 또는 V, R119L 및 E339V뿐만 아니라 N-말단 His6 태그 부가. 이들 변이체는 각각 hCGL-NLV (서열번호 10) 및 hCGL-VLV (서열번호 11)이라고 명명하였다. 이들 변이체 둘 다는 실시예 2에 기술된 바와 유사한 1 ml 규모 MBTH 검정을 사용하여 pH 7.3 및 37℃하에 100 mM PBS 완충액중의 L-Met를 분해하는 능력에 대해 역학적으로 성상확인하였다. L-Met의 hCGL 변이체 촉매작용으로부터 메탄 티올의 방출을 검출하기 위해 엘만 시약 (DTNB)를 사용하였고 이는 간편한 연속 분석을 제공한다. hCGL-NLV 및 hCGL-VLV 둘 다는 L-Met에 대해 약 1 x 104 s-1 M-1의 k cat /K M 을 나타냈다. 모효소인 천연 hCGL은 이들 분석의 검출 한계내에서 L-Met를 분해할 수 없었다.
메티온아제를 37℃ 및 10μM의 최종 농도하에 채집된 사람 혈청중에서 배양하여 효소의 혈청 안정성을 시험하였다. 다른 시점에서 분액을 수거하고 활성을 시험하였다. 데이터를 플로팅한 후 P. 퓨티다의 MGL은 2±0.1 시간의 겉보기 T0 .5를 나타낸 것으로 밝혀졌다. 사람 CGL은 16±0.8 시간의 겉보기 T0.5를 나타냈다. 놀랍게도, hCGL-NLV 및 CGL-VLV는 상당히 더 안정적으로 나타났으며, hCGL-NLV는 95±3 시간의 겉보기 T0 .5를, hCGL-VLV는 260±18시간의 겉보기 T0 .5를 나타냈다 (도 2).
또한, 원편광 이색성 분광법 (CD)으로 메티오닌아제 효소의 열안정성을 평가하였다. 사람 CGL 및 변이체 hCGL-NLV는 약 68℃의 겉보기 TM 값을 나타냈고, hCGL-VLV는 약 71℃의 겉보기 TM 값으로 약간 더 안정하였다 (도 3). hCGL, hCGL-NLV 및 hCGL-VLV의 비슷한 TM 값은 증가된 혈청 안정성이 hCGL-NLV 및 hCGL-VLV의 활성 부위에 우선적으로 체류되는 PLP 보조인자에 기인한다는 것을 제시한다.
실시예 6
신경아세포종에 대한 사람 메티오닌-γ- 라이아제의 세포독성
신경아세포종 세포주 Lan-1를 이용하여 hCGL 및 pMGL의 시험관내 세포독성을 평가하였다. LAn-1 세포를 약 7000 세포/웰로 접종하고 다양한 농도의 pMGL 또는 hCGL-NLV와 배양하였다. 3 내지 5일 노출 후 WST-8을 사용하여 증식을 측정하고 데이터를 플롯팅하여 겉보기 IC50 값을 계산하였다(Hu and Cheung 2009). 생성된 데이터 (도 6)의 분석 결과 pMGL 처리된 세포의 경우 겉보기 IC50 값은 0.34 U/ml (약 0.6 μM)로 나타났고 hCGL-NLV 처리된 세포의 경우는 겉보기 IC50 값이 0.15 U/ml (약 0.3 μM)로 나타났다.
실시예 7
신경아세포종 세포의 패널에 대한 페길화 사람 메티오닌-γ- 라이아제의 세포독성
NB 세포주 (BE(1)N, BE(2)N, BE(2)S, BE(2)C, SK-N-LD, NMB-7, SH-EP-1, IMR32, CHP-212, SKN-MM, LAN-1, LAI-66N, LAI-55N, LAI-5S)의 시험관내 증식을 PEG-hMGL 또는 PEG-hCGL-NLV의 다양한 농도로 96-웰 평판 (BD Biosciences, Bedford, MA)에서 분석하였다.
3000-6000 세포/웰의 밀도로 접종 후 24시간 경과하여 PEG-hCGL-NLV 및 pMGL을 첨가하였다. 3일 배양 후 PEG-hMGL 및 pMGL을 제거하고 새로운 배지를 첨가한 후 세포를 추가로 36시간 동안 배양하였다. WST8 (Dojindo Molecular Technologies, MA)를 배양 웰에 1:10의 용적비로 첨가하였다. 4 내지 6 시간의 반응 후 흡광도 (OD)를 450 nm에서 판독하였다. 세포 증식은 다음과 같이 계산하였다: 세포 성장률(%) = (실험웰의 OD450 - 배지만의 웰의 OD450)/(대조웰의 OD450 - 배지만의 웰의 OD450) x 100%. IC50 (최대 억제 약물 농도의 절반)은 SigmaPlot 8.0 (Systat Software, Inc., San Jose, CA)을 사용하여 계산하였다. PEG-hCGL-NLV는 0.174-0.042 U의 IC50 값을 갖는 슈도모나스 MGL과 유사하게 0.175 내지 0.039 U의 IC50 값으로 시험된 모든 세포에 대해 세포독성을 나타냈다 (도 9).
실시예 8
사람 시스타티오닌 -γ- 라이아제 변이체의 약리학적 제제
hCGL-NLV를 하나의 예외를 두고 실시예 1에 기술된 바와 같이 정제하였다: IMAC 컬럼에 결합시킨 후 단백질을 시료중에 0.1% 트리톤 114를 함유한 IMAC 완충액으로 다량으로 (90-100 컬럼 용량) 세척하였다. 이어서 10-20 컬럼 용량의 IMAC 완충액으로 세척한 다음, IMAC 용출 완충액 (50 mM NaPO4/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)으로 용출시켰다. 트리톤 114로 세척하여 내독소 (지질다당류) 오염을 감소시켰다. 정제된 단백질을 10,000 MWCO 여과 장치 (Amicon)를 사용하여 pH 8.3의 100 mM NaPO4 완충액으로의 교환에 적용하였다. 이어서, PLP를 100 mM의 농도로 첨가하고 단백질을 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음 메톡시 PEG 석신이미딜 카르복시메틸 에스테르 5000 MW (JenKem Technology)를 hCGL-NLV에 80:1의 몰비로 첨가하고 연속 교반하에 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 생성된 혼합물을 100,000 MWCO 여과 장치 (Amicon)를 사용하여 완충액 교환 (10% 글리세롤 함유 PBS)에 적용하고 0.2 마이크론 주사기 필터 (VWR)로 멸균시켰다. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 키트 (Cape Cod Incorporated)를 사용하여 모든 페길화 효소를 지질다당류 (LPS) 함량에 대해 분석하였다.
SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피의 분석(도 4-5)은 80배 몰 과량의 PEG MW5000이 MGL 활성을 갖는 hCGL 변이체의 수화반경을 비페길화된 사량체의 경우 약 220 kDa로부터 페길화 hCGL 변이체의 경우 약 1,340 kDa로 상당히 증가시킴을 보여준다. 페길화 사람 메티온아제는 비페길화 효소와 비교하여 거의 동일한 역학 활성 및 시험관내 혈청 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
실시예 9
마우스에서 PEG MW5000 hCGL - NLV 의 약력학 분석
마우스 (balb/c)(n=5)에 50 U의 PEG-hCGL-NLV로 꼬리 정맥 주사 후 페길화 hCGL 변이체의 생체내 반감기를 결정되었다. 혈액 시료를 다른 시점에서 수거하고 상기와 같이 hCGL-NLV 활성을 결정하였다. t=1 시간에서 채혈된 혈액의 활성이 100%로 설정되었다. 데이터의 지수 적합으로 T1 /2이 28±4시간으로 나타났으며 이 값은 PEG-pMGL에 비하여 14배 증가한 것이다.
실시예 10
마우스 혈장 중의 메티오닌 소모
치료 이전에 메티오닌(-) 호모시스틴(-) 콜린(-) (Met(-)Hcyss(-)Chl(-)) 급식된 마우스 (n=5)에 꼬리 정맥 주사를 통해 200 U의 PEG-hCGL-NLV를 투여하였다. 혈장 시료를 기본적으로 문헌에 기술된 바와 같이 (Sun, et al. 2005) HPLC에 의해 L-Met 수준에 대해 분석하였다. 혈중 메티오닌 수준은 치료전 124±37 μM로부터 8시간째에 3.9±0.7 μM로 감소하였고 24시간 내내 낮은 상태를 유지하였다 (도 8).
실시예 11
LAN -1 종양 이종이식편에 미치는 PEG - hCGL - NLV 의 영향
PEG-hCGL-NLV 투여 일정은 체중 감소를 최소화하고 PEG-hCGL-NLV의 약력학을 최대화하도록 설정하였다. (메티오닌 소모 후 유일한 생체내 용량 제한 독성은 체중 감소이다). LAN-1이 이식된 무흉선 마우스를 4주간 주 3회 정맥내로 100 단위의 PEG-hCGL-NLV를 치료했을 때 15-20%의 가역적 체중 감소가 관찰되었다. 치료 마지막 4주째에 3차 PEG-hCGL-NLV 주사 후 24시간 경과하여, 혈중 메티오닌 농도는 치료전 (n=10) 124±37 μM과 대조적으로 Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식된 PEG-hCGL-NLV-치료된 마우스에서 5.8±2.1 μM이었다. Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식된 마우스는 10-15% 가역적 체중 감소를 나타냈고 혈중 메티오닌 농도는 Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식중에 13.2±4.5 μM이었다. 100 단위의 PEG-hCGL-NLV 치료가 Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식과 조합되었을 때 무치료군 또는 Met(-)Hcyss(-)Chl(-) 급식만 치료된 군과 비교하여 LAN-1 이종이식에 대한 유의적인 항종양 효과 (p<0.01)가 관찰되었다 (도 10).
실시예 12
영장류 메티오닌-γ- 라이아제의 유전자조작
침팬치(Pan troglodytes), 오랑우탄(Pongo abelii) 및 마카크(Macaca fascicularis)와 같은 영장류 종의 CGL 서열은 각각 사람 CGL의 아미노산 조성과 약 99%, 96% 및 95% 동일하다. 메티오닌-γ-라이아제 활성을 제공하는 돌연변이를 갖는 영장류 CGL 효소를 실시예 4에 기술된 바와 같이 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 작제하였다. 생성된 유전자를 L-메티온아제 활성을 갖는 pET28a 비사람 영장류 hGCL내로 클로닝시킨 다음, 상기된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. N 또는 V59, L119 및 V339에 상응하는 아미노산 위치에 유전자조작된 영장류 CGL은 L-Met을 적어도 1 x 102s-1M-1의 k cat /K M 값으로 분해시켰다.
MGL 활성을 갖는 유전자조작된 영장류 CGL의 아미노산 서열의 예는 아래 기술된다:
Pongo abelii CGL-NLV (진뱅크 ID NP_001124635.1 (즉, 서열번호 18)을 갖는 천연 서열에 N-말단 His6 태그의 V59N, R119L 및 E339V 치환 및 부가를 갖는 서열번호 12), Pongo abelii CGL-VLV (진뱅크 ID NP_001124635.1을 갖는 천연 서열에 N-말단 His6 태그의 R119L 및 E339V 치환 및 부가를 갖는 서열번호 13);
Macaca fascicularis CGL-NLV (진뱅크 ID AAW71993.1 (즉, 서열번호 19)을 갖는 천연 서열에 N-말단 His6 태그의 E59N, R119L 및 E339V 치환 및 부가를 갖는 서열번호 14), Macaca fascicularis CGL-VLV (진뱅크 ID AAW71993.1을 갖는 천연 서열에 N-말단 His6 태그의 E59V, R119L 및 E339V 치환 및 부가를 갖는 서열번호 15);
Pan Troglodytes CGL-NLV(진뱅크 ID XD_513486.2 (즉, 서열번호 20)을 갖는 천연 서열에 N-말단 His6 태그의 E59N, R119L 및 E339V 치환 및 부가를 갖는 서열번호 16), Pan Troglodytes CGL-VLV(진뱅크 ID XD_513486.2를 갖는 천연 서열에 N-말단 His6 태그의 E59V, R119L 및 E339V 치환 및 부가를 갖는 서열번호 17).
본원에 기술되고 청구된 모든 방법은 본원 명세서의 내용을 기초로 하여 과중한 실험 부담없이 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태로서 기술되어 있는 한편, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 방법 및 단계 또는 이의 순서에 변형이 이루어질 수 있음을 본 분야 전문가에게는 자명한 것이다. 보다 특정적으로는, 본원에 기술된 물질들은 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 한 화학적으로 및 생리학적으로 모두에서 관련이 있는 특정 물질로 대체될 수 있음은 자명한 것이다. 본 분야의 전문가에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범위에 기술된 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것이다.
참조 문헌
하기 참조 문헌은 본원에 나타낸 것에 예시적인 절차 또는 다른 상세 보충을 제공하는 정도로 본원에 참조로서 구체적으로 인용된다.
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SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> ENGINEERED ENZYMES WITH METHIONINE-GAMMA-LYASE ENZYMES AND PHARMACOLOGICAL PREPARATIONS THEREOF <130> UTFB.P0741WO <150> 61/301,368 <151> 2010-02-04 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 405 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile 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Cys Glu 225 230 235 240 Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala Val Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Ser 405 410 415 <210> 13 <211> 415 <212> PRT <213> Pongo abelii <400> 13 Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Gln Glu Lys Glu Ala 1 5 10 15 Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln His Phe Ala Thr Gln Ala 20 25 30 Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp Thr Ser Arg Ala Val Val 35 40 45 Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys Gln Gly Ala Pro Gly Gln 50 55 60 His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asn Cys 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Tyr Cys Leu Ala 85 90 95 Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp Val Tyr Ala Gly Thr Asn 115 120 125 Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe 130 135 140 Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Thr Gln Lys Met 165 170 175 Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val His Lys His Gly Asp Ile 180 185 190 Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro 195 200 205 Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys Ser Ala Thr Lys Tyr Met 210 215 220 Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu 225 230 235 240 Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala Val Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Ser 405 410 415 <210> 14 <211> 415 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 14 Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Gln Glu Lys Asp Ala 1 5 10 15 Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln His Phe Ala Thr Gln Ala 20 25 30 Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp Thr Ser Arg Ala Val Val 35 40 45 Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys Gln Ala Ala Pro Gly Gln 50 55 60 His Ser Gly Phe Asn Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asn Cys 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Tyr Cys Leu Ala 85 90 95 Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp Val Tyr Gly Gly Thr Asn 115 120 125 Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe 130 135 140 Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Val Leu Lys Met 165 170 175 Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val His Lys Arg Gly Asp Ile 180 185 190 Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro 195 200 205 Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys Ser Ala Thr Lys Tyr Met 210 215 220 Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu 225 230 235 240 Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala Ile Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Asn 405 410 415 <210> 15 <211> 415 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 15 Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Gln Glu Lys Asp Ala 1 5 10 15 Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln His Phe Ala Thr Gln Ala 20 25 30 Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp Thr Ser Arg Ala Val Val 35 40 45 Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys Gln Ala Ala Pro Gly Gln 50 55 60 His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asn Cys 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Tyr Cys Leu Ala 85 90 95 Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp Val Tyr Gly Gly Thr Asn 115 120 125 Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe 130 135 140 Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Val Leu Lys Met 165 170 175 Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val His Lys Arg Gly Asp Ile 180 185 190 Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro 195 200 205 Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys Ser Ala Thr Lys Tyr Met 210 215 220 Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu 225 230 235 240 Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala Ile Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Pro Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Asn 405 410 415 <210> 16 <211> 415 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 16 Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Gln Glu Lys Asp Ala 1 5 10 15 Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln His Phe Ala Thr Gln Ala 20 25 30 Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp Thr Ser Arg Ala Leu Val 35 40 45 Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys Gln Gly Ala Pro Gly Gln 50 55 60 His Ser Gly Phe Asn Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asn Cys 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Tyr Cys Leu Ala 85 90 95 Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp Val Tyr Gly Gly Thr Asn 115 120 125 Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe 130 135 140 Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Thr Gln Lys Val 165 170 175 Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val His Lys His Gly Asp Ile 180 185 190 Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro 195 200 205 Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr Ser Ala Thr Lys Tyr Met 210 215 220 Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu 225 230 235 240 Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala Ile Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Ser 405 410 415 <210> 17 <211> 415 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 17 Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Gln Glu Lys Asp Ala 1 5 10 15 Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln His Phe Ala Thr Gln Ala 20 25 30 Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp Thr Ser Arg Ala Leu Val 35 40 45 Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys Gln Gly Ala Pro Gly Gln 50 55 60 His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asn Cys 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Tyr Cys Leu Ala 85 90 95 Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp Val Tyr Gly Gly Thr Asn 115 120 125 Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe 130 135 140 Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Thr Gln Lys Val 165 170 175 Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val His Lys His Gly Asp Ile 180 185 190 Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro 195 200 205 Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr Ser Ala Thr Lys Tyr Met 210 215 220 Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu 225 230 235 240 Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala Ile Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Ser 405 410 415

Claims (32)

  1. 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서,
    상기 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체가 L-메티오닌의 분해를 위한 촉매 특이성 상수(k cat /K M)가 약 10M-1s-1 내지 약 1x106M-1s-1인, 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 천연 시스타티오닌 감마 라이아제의 기질 인식 부위의 하나 이상의 하전된 잔기에 존재하는, 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 천연 시스타티오닌 감마 라이아제의 아미노산 위치 59, 119 및/또는 339번에 존재하는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 서열번호 1의 아미노산 위치 59, 119 및/또는 339번에 존재하는, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 위치 59, 119 및/또는 339번에서의 치환이 아스파트산(N), 발린(V) 또는 류신(L)인, 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 위치 59, 119 및/또는 339번에서의 치환이 R119L 및 E339V 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 위치 59, 119 및/또는 339번에서의 치환이 E59V 또는 E59N의 추가의 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체가 약 104M-1s-1 이상의 L-메티오닌의 분해를 위한 k cat /K M를 갖는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체가 약 50M-1s-1보다 낮은 L-호모시스틴의 분해를 위한 k cat /K M를 갖는, 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제가 서열번호 1의 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제가 서열번호 1의 서열과 98% 이상의 서열 동일성을 갖는, 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제가 서열번호 18 내지 20 중 어느 하나의 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제가 사람 시스타티오닌 감마-라이아제(서열번호 1)인, 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 펩타이드 단편을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 펩타이드 단편이 XTEN 펩타이드인, 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 커플링되는(coupled), 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 하나 이상의 Lys 또는 Cys 잔기를 통해 PEG에 커플링되는, 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 상기 핵산이 세균에서의 발현에 대해 최적화된 코돈인, 핵산.
  20. 제19항의 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  21. 제19항의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균인, 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포가 유전자 ilvA 및 metA의 결실을 갖는 이. 콜라이 균주인, 숙주 세포.
  24. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제1항의 폴리펩타이드 또는 제18항의 핵산을 포함하는, 약제학적 제형.
  25. 피검체의 종양 세포를 치료하기 위해 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제18항 또는 제19항의 핵산, 제20항의 발현 벡터, 제24항의 약제학적 제형을 포함하는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 피검체가 메티오닌 제한된 급식으로 유지되는, 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 피검체가 정상 급식으로 유지되는, 조성물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 사람 환자인, 조성물.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포가 유방암, 전립선암, 신경아세포종 또는 췌장 암종의 세포인, 조성물.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 종양 세포의 영양 배지 중에 존재하는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 영양 배지가 혈액, 림프액 또는 척수액인, 조성물.
  32. L-메티오닌 분해 활성을 갖는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 동정하는 방법으로서,
    (a) 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체의 군집을 유전자 ilvA 및 metA의 결실을 갖는 이. 콜라이 균주의 세포에서 발현시키는 단계; 및
    (b) L-메티오닌 분해 활성을 갖는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 동정하는 단계(여기에서, 상기 동정된 변이체를 발현하는 세포는, 천연 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제를 발현하는 세포와 비교하여 L-메티오닌이 보충된 최소 배지에서 보다 높은 성장 속도를 갖는 것을 제외하고는 동일한 조건들 하에 있다)를 포함하는, L-메티오닌 분해 활성을 갖는 영장류 시스타티오닌 감마-라이아제 변이체를 동정하는 방법.
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KR20220062745A (ko) 2020-11-09 2022-05-17 경북대학교 산학협력단 바실러스 세레우스에서 유래한 시스타티오닌 감마 라이아제 및 이의 변이체

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