TW200819120A

TW200819120A - Tetrahydro-isoalpha acid based protein kinase modulation cancer treatment

Info

Publication number: TW200819120A
Application number: TW096122224A
Authority: TW
Inventors: Matthew L Tripp; John G Babish; Jeffrey S Bland; Amy Hall; Veera Konda; Linda M Pacioretty; Anu Desai
Original assignee: Metaproteomics Llc
Priority date: 2006-06-20
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2008-05-01
Also published as: WO2007149485A1; TW200817023A; TW200819121A; EP2043622A2; AU2007261400A1; CA2655047A1; EP2043621A2; WO2007149482A3; EP2046353A2; KR20090023721A; TW200816982A; TW200817027A; EP2043621A4; JP2009541329A; TW200817026A; CN101573128A; TW200817022A; WO2007149504A3; WO2007149481A2; WO2007149503A2

Description

200819120 九、發明說明： [001]本專利申請案主張於2006年6月20曰申請之U.S· 臨時申請案序號60/815,064優先權。【發明所屬之技術領域】 5 [002]本發明係一般關於方法及組成物，其可用於治療或防止易感於蛋白激酶調節之癌症。更細分之，本發明係關於方法及組成物，其利用一般分離自蛇麻子類或相思樹屬 ® 植物之化合物或衍生物，或其組合物。【先前技術】 ίο [003]訊號傳遞提供一項包羅萬象之調整機制，對於維持正常的恆定，或若被擾亂時作為與許多疾病病理學以及病況相關之病因或影響機制來說是重要的。訊號傳遞於細胞層次，指訊號或發訊體自細胞外移動至細胞内部。訊號於到達其目標受體時，可起始多項細胞事件必需之配备位體-受體交互作用，其中某些細胞事件可進一步作用，成為後續之訊號。該等交互作用非僅提供一系列串級反應，尚提供錯表丁、複雜之互動網路，或足以提供體内微調控制級恆定程序之訊號事件網。然而，該網路可能發生失序，因而造成細胞活性改變與反應細胞内基因表現程式之變化。 20 爿如見® 1 ’其簡略顯示調㈣島素敏感度㈣受性互作用激酶網路。 \ [004]訊號傳遞受體一般分類為三類。第一類受細胞質膜並具固有酵素活性之受體。具固有酵素活性4 200819120 表欧又體包括酿胺酸激酶(如pDGF、胰島素、EGF及受體)—、路胺酸填酸脂轉(如T細胞及巨嗟細胞之CD45 [叢集^定因子-45]蛋白質）、鳥普酸環化酶(如利尿納激素胜肽艾體）及絲胺酸/經丁胺酸激酶（如活化素及TGF_i3受 5 體）。具固有路胺酸激酶活性之受體足以自體磷酸化並魏化其它基質。 [GG5]第—類受體為在細胞内與結合蛋白及水解蛋白 (稱A G·蛋白）偶合者。此類與&蛋白交互作用之受體具有2個跨膜穿越部位(d〇mains)之結構。該等受體稱為蛇根 1〇驗受體，如腎上腺素性受體、氣味受體及特定荷爾蒙受體 (如升糖素、血官收縮素、血管加壓素及緩激肽)屬於本類。 [〇6]弟—類受體可敘述為細胞内發現之受體，且其於配位體結合時，形成配位體_受體複合體，移行至細胞核，直接影響基因轉錄作用。 ^ [〇〇7]編碼為受體酪胺酸激酶(RTK)之蛋白質包含四個主要部位，其為：a)跨膜部位、b)細胞外配位體結合部位、 c)細胞内調節部位，及幻細胞内酪胺酸激酶部位。rtk之胺基酸序列高度存於cAMP-依賴蛋白激酶（位於Ατρ及基質結合區内）之序列。RTK蛋白，可依其細胞外部位之結才^ 性特徵，分類為富含半胱胺酸部位、似免疫球蛋白部位、鈣粘附素(caherin)部位、富含白胺酸部位、環餅(Kringle) 部位 '酸性部位、ΠΙ型纖維粘連蛋白重覆部位、似盤狀結構I部位，及似EGF部位。RTK已依各種該等細胞外部位 6 200819120 之存在，細分為至少14種不同類別。 [008] 多種具固有路胺酸激酶活性之受體，於雜化時，與訊號串級反應之其它蛋白質發生交互作用。該等立它蛋白質所包含胺基酸序列部位，與初次_於如原致癌 5 基因者同源。該等部位之術語為SH2部位。 [009] 含有RTK蛋白質’或受體相關路胺酸激酶之迎部位發生交互個，導致含有SH2之蛋白f發生㈣_酸 • 化作用。所生之鱗酸化作用，造成該活動之(正向或負向）變化。數種具固有酵素活性而含有SH2之蛋白質包括：磷 10 脂酶C-Y (ΡΙΧ·γ)、原致癌基因das相關之GTPase活化蛋白質（rasGAP)、磷脂醯肌醇-3_激酶(pi_3K)、蛋白質酪胺酸石粦酸月曰酶-1C (PTP1C)，以及蛋白質酪胺酸激酶(ρτκ)之 Src族成員。 [0010] 大體上，非受體蛋白質酪胺酸激酶(PTK)偶合至本 15 身缺乏酵素活性之細胞受體。例如胰島素受體(IR)，經由 •蛋白質父互作用而生受體訊號。該受體具固有酪胺酸激酶活性，惟其自體磷酸化後，未直接與含有SH2部位之酵素活性蛋白（如PI-3K或PLC-γ)交互作用。反之，主要之 IR作用物，係術語為IRS-1之蛋白。 20 [0011] TGF-β超家族之受體代表原型受體絲胺酸/蘇胺酸激酶(RSTK)。TGF-β超家族之多功能蛋白包括活化素、抑制素(inhibins)及骨成形蛋白（BMP)。該等蛋白質可誘發及/ 或防止細胞增殖或分化，並調整各類細胞之移行作用及附 7 200819120 著作用TGF-β纟中-種主要效應係調整細胞週期之進展。此外，c-Myc為一種關於細胞對TGF_13反應之核蛋白，其直接影響含Myc-結合元素基因之表現。pKA、pKc 及MAP激酶代表三種無受體絲胺酸/蘇胺酸激酶之主要分類。 [0012] 目前，許多實驗室正研究激酶活性與額狀離間之，聯。該等關聯可促發疾病本身或密切地相關於疾病相關徵候j表現及其進行。風難關節炎屬自體免疫疾病，可對目前激酶與疾病間關係之研究提供一項範例。、 [0013] 自體m病根源於m統功能障礙，製造自體抗體攻擊其自身器官、組織及細胞一―經蛋石来酸化作用媒介之程序。、&曰胃拜 [00M]臨床上已㈣鑑別出超過8G例之自體免疫疾病，士在美國總共危害約二千四百萬人。自體免疫疾‘可影樂身體任何組織或器官。_特異性，該病依自體免疫& 擊之部位可引起廣泛之症狀及n官損害。雖衫自體=疫疾病存在治療方法，但該等方法中並無最可靠之治療法。減緩其嚴重程度之治療常伴隨有害之副作用。〜 [0015]風濕性關節炎(RA)為最盛行且研究最深入之自體免疫疾病，其危害全世界約1%人口，且如同其它自體免疫疾病，由於未知之原因，其數量正增加中。特性為慢性滑液發炎，形成進行性關節骨及軟骨破壞。細胞介素'、化學增活素及前列腺素係發炎之關鍵媒介物，其可於發、病 200819120 病患之關節及血液發現豐富含量。例如，PGE2大量出現於 RA病患之關節滑液。經環氧化酶-2 (COX-2)及可誘導一氧化氮合成酶（iNOS)於發炎部位之誘導媒介，PGE2量為之增加。[如見 van der Kraan PM and van den Berg WB· 5 Anabolic and destructive mediators in osteoarthritis. Cuff

Opin Clin Nutr Metab Care，3:205-21 1，2000; Choy EHS and Panayi GS. Cytokine pathways and joint inflammation in _ rheumatoid arthritis· N Eng J Med· 344:907-916, 2001; and

Wong BR, et al. Targeting Syk as a treatment for allergic and ίο autoimmune disorders· Expert Opin Investig Drugs 13:743-762, 2004·] [0016] 目前對人類RA病因及發病機制之了解仍極少，但似乎可視作分為三階段進行。於起始階段，樹狀細胞對自身反應性T細胞表現自身抗原。T細胞以細胞介素活化自 15 身反應性B細胞，其製造自體抗體，隨後形成關節内之免鲁疫複合體。於效應階段，免疫複合體結合巨噬細胞及肥胖細胞上之Fcf受體，造成細胞介素與化學增活素之釋放、發炎及疼痛。於最終階段，細胞介素及化學增活素活化並補充滑液纖維母細胞、蝕骨細胞及多形核嗜中性球，其釋 20 放蛋白酶、酸類及ROS如02-，造成軟骨及骨不 <逆之破壞。 [0017] 於膠原_誘導劑a動物模型中，起始該疾痛需要T 及B細胞之參與。b細胞活化作用，經由抗原受體觸發脾臟赂胺酸激酶（Syk)及磷酸肌醇3_激酶(P13K)發送訊號 9 200819120 [Ward SG，Finan P. Isoform-specific phosphoinositide 3-kinase inhibitors as therapeutic agents. Cuff Opin Pharmacol· Aug;3(4):426-34,（2003)]。B 細胞上之抗原受體參與後，Syk於三酪胺酸上磷酸化。Syk係72-kDa之蛋 5 白質-酪胺酸激酶，其於偶合具免疫辨識作用受體以增幅下游發訊通道之程序扮演中心角色。該功能係其催化活性及其參與包含SH2部位之效應蛋白質交互作用能力之特 _ 質。Tyr-317、-342及-346之磷酸化作用創造多數含SH2 部位蛋白之停泊位置。[Hutchcroft，J. E.，Harrison，M. L. & i〇 Geahlen, R. L. (1992). Association of the 72-kDa protein-tyrosine kinase Ptk72 with the B-cell antigen receptor. 3. Biol. Chem. 267: 8613jX8619? (1992) and Yamada，T·，Taniguchi，T·, Yang，C·，Yasue，S·，Saito, H. & Yamamura, H. Association with B-cell antigen cell antigen 15 receptor with protein-tyrosine kinase-P72(Syk) and φ activation by engagement of membrane IgM. Eur. J. Biochem. 213: 455.tX459，(1993)] 〇 [0018] Syk已展現其需要性於對各種訊號反應之pi3K活化作用，包括結合B細胞抗原受體（BCR)及巨噬細胞或嗜 20 中性球 FC 受體[見 Crowley，Μ· T·, et at，· J. Exp· Med· 186: 1027·4Χ1039，（1997); Raeder，Ε· M” etal·，J· Immunol· 163，6785jX6793，（1999); and Jiang，K·，etal·，Blood 101， 236jX244，（2003)]。於B細胞中，BCR刺激之PI3K活化可經由轉接蛋白如BCAP、CD19或Gabl之磷酸化作用達 200819120

10 15 成’其創造PI3K之p85调郎次早位之結合位置。由諸多 IgG受體傳遞之訊號需要Syk及P13K及其補充於受體聚集之部位之活動。於嗜中性球及單核球，P13K與FcgRIIA 上磷酸化免疫受體酪胺酸活化主題序列之直接關聯，提出為一補充於受體之P13K機制。且近來報告已顯示syk與 P13K間有直接分子父互作用[Moon KD，et at·，Molecular Basis for a Direct Interaction between the Syk Protein-tyrosine Kinase and Phosphoinositide 3-Kinase. J. Biol，Chem· 280, No· 2, Issue of January 14, ρρ· 1543-1551， (2005)] 〇 ’ [0019]已有大里研究顯示，c〇x_2活性抑制劑造成製造減少ϋ於病患慢性關節炎狀態諸如RA之疼痛緩解 :::然而’既COX-i及c〇x_2二者均有關於組織之重 Η你ί能，諸如胃腸道及心血管系統，抑制cox酵素 =物質之有害效應造成_。因此必須等 =患疼痛之途徑。既然嶋2及_合珉之誘導物經由Syk、Ρίπ

賴通道發訊’該等通道之抑制二：自R: 病患之特定關節發炎及^計u自體免疫㈣及RA

[002〇]蛇麻子類衍生彡 RAW 264.7鼠巨噬細胞0異阿伐酸(RIAA)發現於們於此研$ RIAA是否A 2防止發炎模型之監測。我是否抑制COX-2及iN〇'直接C〇X酵素抑制劑，及/或其未直接抑制c〇W S之誘導作用。我們發現RIAA並 μ ’性，惟其阻止NF_kB驅動酵素誘 20 200819120 發，讓我們進一步研究RIAA是否為激酶抑制劑。我們發現RIAA抑制Syk及P13K二者，促使我們於罹患各種自體免疫疾病病患之領先研究中測試RIAA之功效。 [0021] 目前研究關聯於疾病徵候之其它激酶包括 5 Aurora、FGFB、MSK、RSE 及 SYK 〇 [0022] Aurora -細胞分裂之重要調整子，絲胺酸/羥丁胺酸激酶之AUrora群包括Aurora A、B及c。Aur〇ra a及B激 _已經鑑別為於有絲分裂扮演直接，惟不明確之角色。該荨二異構物之過度表現已建立關聯於互異範圍之人類腫瘤 10 類型，包括白血病、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤及子宮頸癌。 [0023] 纖維母細胞生長因子受體(FGFR)為受體酪胺酸激酶。受體突變，可經由受體二聚合、激酶活化及親和性增加，導致FOF固有性活化作用。於軟骨發育不全、血管生 15 成及先天性疾病中均可發現FGFR。 [0024] MSK(有絲分裂誘致劑及壓力活化蛋白激酶）1及 MSK2，為活體内ERK (細胞外訊號調整激酶）1/2或p38 MAPK (有絲分裂誘致劑活化蛋白激酶）通道下游活化之激酶，CREB (cAMP反應元素結合蛋白）及組織蛋白H3之磷 2〇酸化作用需要該等激酶。 [0025] Rse最高度表現於腦中。Rse亦稱Brt、BYK、Dtk、 Etk3、Sky、Tif或海洋_相關受體酪胺酸激酶，係一受體酪胺酸激酶，其首要作用為保護神經元免於細胞凋亡。新近 12 200819120 鑑別Rse、Axi及Mer屬於細胞附著分子-相關受體胳胺酸激酶。GAS6為酪胺酸激酶受體Rse、Axi及馗打之配位體。 GAS6可作為生理抗發炎劑，由休眠之此製造，當原發炎刺激開啟EC之原附著機能時耗竭。

[0026] 以一種異構物存在之肝醣合成酶激酶J 已經鑑別為有__代謝控制組之酵素，並可作為細胞增殖與細胞死亡之調整劑。與許多絲胺酸邊丁胺酸 ^ 不同，GSK-3原本即具有活性，對胰島素或生長因子反^ 轉變為受抑制。GSK_3於_㈣合成，激發胰島素矛;序中之作用使其成為治癒糖尿病及代謝症候群具吸引力之目標物。 ^ [0027] GSK-3失調已發現為抗騰島素現象發展中之病灶位置。GSK3之抑制促發抗胰島素現象，不僅由於分配使用率增加，且糖質新生基因受到抑制，諸如肝細胞之構酸烯醇丙_酸鹽縣激酶及葡萄糖·6·磷酸脂酶。此外’於實驗室中及活體内，選擇性GSK3抑制劑激發肌肉内運輸及利用葡萄糖之潛在騰島素_依賴活化作用。 GSK3亦直接魏化胰島素受體受質]之絲殘基，其導致騰島素傳訊之不完全。GSK3於騰島路徑扮演4要角色’且於胰島素缺乏之情形下，其磷酸化並抑制肝醣合成酶[Parker，P. J·，Caudwell，F. B，am}

Cohen，P. (1983) Eur. J. Biochem. 130:227-234]。支持 GSK 3 於調整骨題之葡萄糖運輸活性具有貞面仙之證據增加。例如’以選擇性GSK_3抑制子緊急治療抗騰島素^ 200819120 嚅齒動物，增進全身之胰島素敏感度與肌肉葡萄糖運輸之胰島素作用。以專一性GSK-3抑制子慢性治療前-糖尿病肥胖之Zucker大鼠之抗胰島素現象，可增進其口服葡萄糖耐受性及全身胰島素敏感度，且係有關於異常血脂症之改良法及具有增進骨骼肌之IRS-1_依賴胰島素發訊之作用。該等結果，為肌肉之GSK-3選擇性導向，可作為肥胖症-相關抗胰島素現象之有效治療方法提供證據。 [0028] Syk為無受體酪胺酸激酶，相關於自爲 IgE受體發訊之ZAP务Syk結合該等受體内之汀二主題’並經由RaS、Pl 3遗酶及PLCg發訊通道起動發訊功能。Sy^於：胞内發訊扮演關鍵性角色而為二吸性異常之重要標的。 ⑻正及吁 [0029] 因此，調節單—或多數所選擇激酶表現或活性之 15 實現各種蛋白激酶與激酶通道間之關係及乂互仙賴性，增強了發展足以作為蛋_ 子、調整子或抑制劑，於多數激酶或多數激酶路經且= ==物質之迫切需要。專-地以單種激;;= 尿:單一代理途徑不適於治療極度複雜如糖 f病或代謝症候群等疾病、狀態及異常。另外，調r夕1 ::之活性可產生經由單一激酶調節無法獲得之:同:療 =2 節及用途可能需要於慢性狀態連續使用il 間歇性❹，例如發炎，無論其狀態本身或作為 20 200819120 及狀您之整體構成要素。此外，作為激酶調節子之組成物可影響哺乳動物身體内各式各樣之異常。本發明敘述衍生自蛇麻子類或相思樹屬之化合物及萃取物，其可用於調整 /放酶活〖生，從而k供治療多種疾病相關症狀之方法，以及 5 增進生活品質。【發明内容】本發明總綱 [0031] 本發明係關於一般方法及組成物，其可用於治療或防止易感於蛋白激酶調節之癌症。更細分之，本發明係關於方法及組成物，其利用一般分離自蛇麻子類，或相思樹屬植物之化合物或衍生物，或其組合物。 [0032] 本發明之第一種具體實例，敘述治療對需要之哺乳類蛋白激酶調節反應癌症之方法。該方法包含投與哺乳類動物有效治療量之四氫_異阿伐酸。 [0033] 本發明之第二種具體實例，敘述治療對需要之哺乳類蛋白激酶調節反應癌症之組成物。其中該組成物包括有效治療量之四氫-異阿伐酸，其中有效治療量調節癌症相關之蛋白激酶。本發明詳細救述 20 [0080]本發明係關於一般方法及組成物，其可用於治療或防止易感於蛋白激酶調節之癌症。更細分之，本發明關於方法及組成物，其利用一般分離自蛇麻子類，或相思樹屬植物之化合物或衍生物，或其組合物。 15 200819120 5

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[〇_此處參照之專利、公開之^㈣及科學性文獻，建立具備^者之知識，並因此整體納人本文以供參考，程度：：母一項具體而個別指定納入參考資料。任何此處引用參考貢料與此說明間之任何衝突與所需解答以後者為優先。、以此類^，任何衝突已知技術辭蚊義與具體記載於本說明之辭彙定義間之任何衝突與所需解答讀者為優先0 [0082] —般本發明之技術工作者，可了解此處所用技術性及科學性術語所具意義，除非另行定義。此處所引用各種參考方法及材料屬具備技術者已知。標準參考作業所提出 DNA重組技術之一般原則，包括：Sambro〇k et aL， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Kaufman et al” Eds·，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press，Boca Raton (1995); McPherson，Ed” Directed Mutagenesis: A Practical Approach， IRL Press, Oxford (1991)。標準參考作業所提出藥理學之一般原則，包括：Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，11th Ed·，McGraw Hill Companies Inc” New York (2006) 〇 [0083] 於所附申請專利範圍說明中，除非内容清楚另行規定，單數態包括複數指示對象。除非清楚另行規定，本說明所使用單數態「a」「an」及「the」亦具體包含該術語之複數態。此外，除非具體另行指出，此處所用之「或」 16 20 200819120 字以「含」、「及/或」之語意，而非「除外」、「語意。此處使用「約」字以表示約、於某了“地之或附近。當「約」字結合數字化粗略地，字，修飾所載數值以上及以下兄來’此處所用「約」 [0084]此處所列舉變數之數值範圍， =Γί圍内任何值之情形下操作。因此，= ίί:ί、Γ ’變數可等於數值範圍内任何整數值，包括靶圍之鈿點。卩此類推，變數值匕括等於數值範圍内任何實數值括=為連_，變數可某處敘述變數值為〇與2 點。舉例說明’ 為〇、1或2,變數變數實質上為貝上為不連續時可 (^或其它任何實數值。4“^^^、^ [藝]叮詳㈣財發 15 合該等專一性代表敘述本發明時，Am貧料。當結之該等專一性代,。 w 了解非限夂於本發明利範圍所定義，本二傾向於涵蓋如附錄申請專當物。為提供對t::=之替代物、修飾物及相項專-性細節。本節下實作。於其它實例中，為不了;=所有該等專-性細為人熟知之操作枝絲詳細敘述。必要地_本發明，利用任何為具備技術者所知之適當方决。然而’所敘述者為較優之物質及方法，ς 17 20 200819120 非另行記述，以下敘述及範例參考資料所用材料、試劑及其類似物可自商業來源取得。 [0087]本發明第一種具體實例敘述目前所需方法，其治療對哺乳類蛋白激酶調節反應之癌症，其中方法包含投與哺 5 乳類動物有效治療量之四氫-異阿伐酸。於此具體實例之某方面，四氩·異阿伐酸係選自下組：四氫-異蛇麻草酮、四氫-異類蛇麻草酮及四氫_附蛇麻葫酮。

• [0088]於此具體實例之其它方面，所調節蛋白激酶係選自下組：Abl(T3151)、Aurora-A、Bmx、BTK、CaMKI、CaMKI ίο δ、CDK2/細胞週期素A、CDK3I細胞週期素E、CDK9/細胞週期素 Ti、CKl(y)、CKlyi、（：Κ1γ2、（：Κ1γ3、CKI6、 cSRC、DAPIU、DAPK2、DRAK卜 EphA2、EphA8、Fer、 FGFR2、FGFR3、Fgr、Flt4、JNK3、P13K、Pim-1、Pim-2、 PKA、PKA(b)、ΡΚΒβ、ΡΚΒα、ΡΚΒγ、PRAK、PrKX、R0n、 15 Rsld、Rsk2、SGK2、Syk、Tie2、TrkA、及 TrkB。 • [0089]另於其它方面，對激酶調節反應之癌症係選自下組：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、直腸、肺、淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、曱狀腺癌及子宮癌。 [0090]此具體實例之方法中使用組成物可進一步包括選 2〇自下組之一或多成員：抗氧化劑、維生素、礦物質、蛋白質、脂肪及碳水化合物，或選自下組之醫藥可接受職形劑：塗覆物、等張及吸收延遲劑、結合劑、附著劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、香味劑、增甜劑、吸收劑、清潔劑及乳 18 200819120 化劑。 [0091] 此處所用「疾滅相明批心 ^ 活化作用與其作為所1寸士入二广」:不直接促發疾病或其蛋白激酶或1_ 病症狀惡化之路徑相關之個別 [0092] 「蛋白激酶調節有益於個體一扭減輕、預防及/或逆轉，加強二線物理治療之效力。 ΓΓ二蛋ί激酶調節之癌症」-語，意指其實例成有：於，杈與可a)直接調節癌症細胞激酶，其中调即於個體健康之效應(如標的癌症細胞之細胞 15 、，）調即弟二種激酶，其中該調節 :一種激酶調節，其製造有益於個體健康之 >、〜、，S C钛的之所調節激酶使癌症細胞更易於接受二線物理治療法（如化學療法或放射線治療）。 [:94]本說明過渡性辭彙或申請專利範圍内容音義所二包括」及「包含」應解釋為具有開放式 :、思、’“付语應给釋為與以下辭彙同義··「至少且有」方法之内容中使用時，「包括」」語表丁“ /少〇所列舉步驟，惟亦可包括額外步驟。於 =物或成份之内容中使用時，「包括」一語表示該化合物 =成份至少包括所轉特徵或化合物，㈣可包括額外之特徵或化合物。 ' [0095]此處所用「衍生物」—語或「衍生」之事件，意指化予物貝其它物質之結構性相關，且理論上可由其獲得， 20 200819120 如可由其它物質製造之物質。衍生物可包括由化學反應獲得之化合物。 [0096] 此處所用「蛇麻子萃取物」一語，意指自以下方式形成之固體物質：（1)將蛇麻子類植物製品曝露於溶劑， 5 (2)自蛇麻子類植物製品將溶劑分離，與(3)移除溶劑。「失效蛇麻子類」意指蛇麻子類經過萃取程序後所餘蛇麻子類植物製品。蛇麻子類化學討論細節見Verzele，M. and De , Keukeleire，D.，Developments in Food Science 27： Chemistry and Analysis of Hop and Beer Acids, Elsevier Science Pub. i〇 Co·，1991，New York，USA，於此納入全體參考資料。此處所參照之RIAA，「Rho」意指還原異阿伐酸類，其中減少係退原4-甲基-3-戊稀醯基侧鍵之幾基。 [0097] 此處所用「溶劑」一語意指水性或有機性液體，含有自蛇麻子植物製品萃取固體物質之必需特徵。溶劑範例 15 包括，惟非限疋於·水、蒸氣、過熱水、甲醇、乙醇、己 _ 烧、氣仿、液體C〇2、液體n；2或該等材料之任何混合物。 [0098] 此處所用「C〇2萃取物」一語意指，自蛇麻子類植物製品曝露於液體形成或以超臨界C〇2製備隨後移除 C02之固體物質。 20 [0099] 「醫藥可接受」一語使用於相容成份中之其它組成，且對其接受者不具毒性之語意下。 [00100]此處所用「化合物」可以其化學結構、化學名稱或一般名稱鑑別。當化學結構與化學或一般名稱衝突， 20 200819120 10 15 20 化學結構純魏合物之決紐㈣。此祕述化合物可包含-或^個不對稱中心及/或雙鍵，而因此可存在立體里構物，諸如雙鍵異構物（如幾何異構物）、鏡像異構物或非鏡像兴構㉟自此觀之，此處描述化學結構包含所示範或鑑別之化合物所有可能鏡像異構物與立體異構物，包括純粹立體異獅態（純幾何異構物、純鏡似構物或純非鏡像異構物)及鏡像異構物及立體異構物之混合物。鏡像異構物及立體異構物之混合物，可使用具備技術工作者熟知分離技術或不對稱合錢術，分析為其構成之鏡像異構物或 ^體異構物。化合物亦可存在數種互變異構形態，包括稀醇形,％、鬚场及其混合物。由此觀之，此處描述化學結構包含所不fe或鍍別化合物所有可能互變異構形態。所敘述化合物亦包含同位素標籤化合物其中一或多原子所具原子量相異於平常於自然界中發現者之原子量。可納入本务明化合物之同位素範例包括，但非限定於：2H、3h、13c、 C、15N、18〇、17〇等等。化合物可以非溶劑化物形態以及溶劑化物形態存在，包括水合形態及N_氧化物。一般說來，化合物可為水合物、溶劑化物或N-氧化物。特定化合物可以複數結晶或非晶形態存在。同類物、類比物、水解製品、代謝物及化合物之前驅物或前驅藥，亦應考慮屬於本發明。一般說來，除非另行指出，此處考慮所有之物理形態於此用途均屬相等物且屬於本發明。 [00101]本發明之化合物可以鹽類存在。特別考慮化合物之醫藥可接受鹽類。本發明之Γ醫藥可接受鹽」混合本發 21 200819120 明化合物及酸或鹼以形成化合物之鹽（諸如鎂鹽，此處標誌為Mg」或Mag」），且於治療狀態下屬個體可财受者。一般說來，本發明化合物之醫藥可接受鹽治癒指數(最低毒性劑量與最低有效治癒劑量之比例）將為1或更大。具備技 5 術工作者將認知，最低治癒有效劑量將因對象及適效而產生差異，並從而相應調適。 [00102]此處所用「蛇麻子」意指蛇麻屬植物之毯果，其馨包含苦芳族油其係使用於釀造業，以預防細菌作用，添加特殊苦味於啤酒。所使用蛇麻子類更優係衍生自啤酒花。 10 此處所用「相思樹屬」一語，意指豆科樹及相思樹屬灌木之任何成員。衍生自相思樹屬之植物性化合物，較優係衍生自相思樹屬兒茶或阿拉伯金合歡。 [00104] 本發明之化合物係隨意地以醫藥可接受載體與任何熟知之醫藥可接受媒劑配製，其包括稀釋劑及賦形劑（見 15 Remington^ Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.? Gennaro, 籲 Mack Publishing C。·，Easton，PA 1990 and Remington: The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams &

Wilkins, 1995)。當所使用產生本發明成份醫藥可接受載體 /媒劑型恶依投與哺乳類成份模式而異時，一般醫藥可接受 20 載體屬生理惰性及無毒性。本發明組成物之調配物可包含多於一種型態之本發明化合物，，以及任何其它有用於治療所治療症狀/狀態之藥理活性成分。 [00105] 此處所用「調節」或「調節」等語表示以化合物、 22 200819120 原料等，向上或向下調整酵素之表現或活性。 [00106]此處所用「蛋白激酶」一語，代表轉移酶系酵素，其足以自予體分子轉移鱗酸基至蛋白質之胺基酸片段。蛋白激姆族/糸命名时論細節見Kostich，M·，et al.，Human 5 Members of the Eukaryotic Protein Kinase Family, Genome

Biology 3(9):research0043.1_0043.12, 2002 於此納入全體參考資料。 • [00107]激酶之代表性、非限定性範例包括Abi、 Abl(T3151)、ALK、ALK4、AMPK、Arg、Arg、ARK5、 ίο ASK1、Aurora-A、Axi、Blk、Bmx、BRK、BrSKl、BrSK2. BTK、CaMKI、CaMKII、CaMKIV、CDK1/細胞週期素 B、 CDK2/細胞週期素A、CDK2/細胞週期素E、CDK3/細胞週期素 E、CDK5/p25、CDK5/p35、CDK6/細胞週期素 D3、 CDK7/細胞週期素HIMAThCDKW細胞週期素ThCHKl、 15 CHK2、CKl(y)、CK卜 CK2、CK2CI2、cKit(D816V)、cKit、 • c-RAP、CSK、cSRC、DAPK1、DAPK2、DDR2、DMPK、 DRAIH、DYRK2、EGFR、EGFR(L858R)、EGFR(L861Q)、 EphA卜 EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA7、EphA8、 EphBl、EphB2、EphB3、EphB4、ErbB4、Fer、Fes、FGFR1、 2〇 FGFR2、FGFR3、FGFR4、Fgr、Fiti、Flt3(D835Y)、Flt3、

Flt4、Fms、Fyn、GSK3P、GSK3a、Hck、ΗΙΡίΠ、HIPK2、 HIPK3、IGF-1R、IKKB、IKKCI、IR、IRAKI、IRAK4、 IRR、ITK、JAK2、JAK3、JNKlal、JNK2a2、JNK3、 KDR、Lck、LIMK1、LKB 卜 LOK、Lyn、Lyn、MAPK1、 23 200819120 MAPK2、MAPK2、MAPKAP-K2、MAPKAP-K3、MARKl、 ΜΕΐα、MELK、Met、MINK、MKK4、MKK6、ΜΚΚ7β、 MLCK、MLK1、Mnk2、MRCKP、MRCKoc、MSIU、MSK2、 MSSKh MST卜 MST2、MST3、MuSK、NEK2、NEK3、 5 NEK6、NEK7、NLK、p70S6K、PAK2、PAK3、PAK4、 PAK6、PAR-lBa、PDGFRp、PDGFRa、PDK卜 Ρ13Κβ、 Ρ13Κδ、Ρ13Κγ、Pim-i、Pim-2、PKA(b)、PKA、ΡΚΒβ、 _ PKBa、ΡΚΒγ、PKCp、PKCpI、PKCpII、PKCa、PKCy、 PKC5、PKCs、ΡΚΟζ、PKCrj、PKC0、PKCi、PKD2、PKG1 β、 ίο PKGla、Plk3、PRAK、PRK2、PrKX、PTK5、Pyk2、Ret、 RIPK2、ROCK-I、ROCK-n、ROCK-n、Ron、Ros、Rse、 Rsld、Rsld、Rsk2、Rsk3、SAPK2a、SAPK2a(T106M)、 SAPK2b、SAPK3、SAPK4、SGK、SGK2、SGK3、SIK、 Snk、SRPia、SRPK2、STK33、Syk、TAK 卜 TBia、Tie2、 15 TrkA、TrkB、TSSK1、TSSK2、WNK2、WNK3、Yes、ZAP-70、 φ ZIPK。於某些具體實例中，激酶可為ALK、Aurora-A、

Axi、CDK9/細胞週期素 T1、DΑΡΚ1、DAPK2、Per、FGFR4、 GSK3p、GSK3a、Hck、JNK2a2、MSK2、p70S6K、PAK3、 Ρ13Κδ、Ρ13Κγ、PKA、ΡΚΒβ、PKBa、Rse、Rsk2、Syk、 20 TrkA及TSSK1。另於其它具體實例中激酶係選自下組： ABL、AKT、AURORA、CDK、DBF2/20、EGFR、 EPH/ELK/ECK、ERK/MAPKFGFR、GSK3、IKKB、INSR、 JAK DOM 1/2、MARK/PRKAA、MEKISTE7、MEKKISTE1 1、MLK、mTOR、PAK/STE20、PDGFR、P13K、PKC、 24 200819120 POLO、SRC、TEC/ATK 及 ΖΑΡ/SYK。 [00108] 本發明之方法及組成物傾向用於任何可體驗本發明方法益處之哺乳類動物。該等哺乳類之中，最首要者當為人類，雖本發明不傾向於如此局限而可應用於獸醫用途。因此為符合本發明，「哺乳類」或「需要之哺乳類」包括人類以及非人類之哺乳類動物，尤其包括馴養動物，其包括而非限定於··貓、狗及馬。 [00109] 此處所用「自體免疫異常」意指宿主之系統受到宿主本身之免疫系統攻擊所引起之疾病、患病狀態或狀態。自體免疫疾病之代表性、非限定性範例包括斑禿、僵直性脊椎炎、關卽炎、抗填脂質症症候群、自體免疫愛狄生症疾病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫内耳疾病（亦稱梅尼爾氏症）、自體免疫淋巴增生性症候群(ALps)、自體免疫血小板缺乏性紫斑症、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、白塞病、克隆氏症疾病、第一型糖尿病、腎小球性月k、葛瑞夫兹氏病、格林-巴利綜合徵、發炎性腸疾病、紅斑性狼瘡腎炎、多發性硬化症、重症肌無力、天胞瘡、惡性負血、結卽性多動脈炎、多發性肌炎、原發性膽汁性肝硬化、銀屑病、風濕熱、風濕性關節炎、皮痹、修格蘭氏症候群、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、白斑及韋格納肉芽腫。自體免疫異常相關激酶之代表性、非限定性棘例包括 AMPK、BTK、ERK、FGFR、FMS、GSK、IGFR、 IKK、JAK、PDGFR、P13K、PKC、PLK、ROCK 及 VEGFR。 25 200819120 [00110]此處所用「過敏性異常」意指對物質、狀況或物理性狀態之過度或病理性反應（如噴嚏、呼吸緊迫、搔癢或皮膚疹）’不包括平均個別之可比較性效應。此處所用「炎性異常」表示對細胞傷害之(通常局部）反應，其表現 5 為微血管擴張、白血球浸潤、發紅、熱、痛、腫，常伴隨功能喪失’其提供起始移除有害物質與受損組織之機制。過敏性或炎性異常之範例包括而非限定於：氣喘、鼻炎、瞻潰瘍性大腸炎、克隆氏症、胰臟炎、胃炎、良性瘤、痣肉、 la傳性癔肉症候群、結腸癌、直腸癌、乳癌、前列腺癌、 10 胃癌、消化器官潰瘍性疾病、心絞痛、動脈粥狀硬化、心肌梗塞、心絞痛或心肌梗塞之後發病、老年痴呆及腦血管疾病。過敏性異常相關激酶之代表性、非限定性範例包括 AKT、AMPK、BTK、CHK、EGFR、FYN、IGF-1R、IKKB、 ITK、JAK、KIT、LCK、LYN、MAPK、MEK、mTOR、 15 、P13K、PKC、PPAR、ROCK、SRC、SYK 及 ZAP。 ⑩ [oom]此處所用「代謝症候群」及「糖尿病相關異常」意指胰島素相關異常，如該等疾病或狀態，其中對胰島素反應促發疾病或表示疾病或狀態之進行或抑止。胰島素相關異常之代表性範例包括而非限定於：糖尿病、糖尿病併 20 發症、胰島素敏感、多囊性卵巢疾病、高血糖症、異常血脂症、抗胰島素現象、代謝症候群、肥胖症、體重增加、發炎性疾病、消化器官疾病、心絞痛、心肌梗塞、心絞痛或心肌梗基之後發病、老年痴呆及腦血管性癡呆。見

Harrison’s Principles of Internal Medicine，16h Ed·，McGraw 26 200819120

Hill Companies Inc·，New York (2005)。發炎狀態之範例，一般包括而非限定於：消化器官疾病（諸如潰瘍性大腸炎、克隆氏症、胰臟炎、胃炎、消化器官良性腫瘤、消化性痣肉、遺傳性痣肉症候群、結腸癌、直腸癌、胃癌及消化器官潰瘍）、心絞痛、心肌梗塞、心絞痛或心肌梗塞之後發病、老年痴呆、腦血管性癡呆、免疫疾病及癌症。代謝症候群相關激酶之非限定範例可包括AKT、AMPK、CDK、CSK、 ERK、GSK、IGFR、JNK、MAPK、MEK、P13K 及 PKC。 [00112] 「抗胰島素現象」意指身體之胰島素-依賴程序造成對胰島素敏感度之降低，導致該等程序活性降低，或胰島素之製造增加，或二者均有。抗胰島素現象典型發生於第2型糖尿病，惟亦可發生於無糖尿病之情形。 [00113] 此處所用「糖尿病併發症」包括而非限定於：視網膜病變、肌肉梗塞、原發性骨肥大及骨質喪失、腳潰瘍、神經病變、動脈硬化、呼吸自主神經病變與胸腔及肺實質結構性失調、左心室肥大、心血管之發病率、腎功能進行性喪失及貧血。 [00114] 此處所用癌症」意指各種良性或惡性腫瘤，其特徵為未分化細胞之增殖，其若為惡性，將侵犯周圍組織且會轉移至身體其它部位。代表性，本發明所指癌症之非限定範例包括腦癌、乳癌、直腸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌及前列腺癌。本發明所指癌症相關蛋白激酶之非限定範例包括 ABL、AKT、AMPK、Aurora、BRK、CDK、CHK、 EQFR、ERB、FGFR、IGFR、KIT、MAPK、mTOR、PDGFR、 27 200819120 P13K、PKC 及 SRC。 [00115] 「眼異常」意指由進行性異常、疾病、傷害、年齡或毒素引起之眼結構性或功能性障礙。本發明所指眼異常之非限定範例包括視網膜病變、黃斑部病變或糖尿病性 5 視網膜病變。眼異常相關激酶包括而非限定於：AMPK、

Aurora、EPH、ERB、ERK、FMS、IGFR、MEK、PDGFR、 P13K、PKC、SRC 及 VEGFR 〇馨 [00116]此處所用「神經性異常」意指由進行性異常、疾病、傷害或毒素造成之任何中樞神經系統之結構性或功能 10 性障礙。神經性異常之代表性，非限定範例包括阿茲海默氏症、帕金森氏症、多發性硬化症、肌萎縮性偏侧硬化症 (ALS或路•蓋里格氏病）、亨丁頓舞蹈症、神經認知功能障礙、老年痴呆、及情感性疾患。神經性異常相關蛋白激酶可包括而非限定於：AMPK、CDK、FYN、JNK、MAPK、 15 PKC、ROCK、RTK、SRC 及 VEGFR 〇 _ [00117]此處所用「心血管疾病」或「(^/;〇」意指損害功能或摧毀心臟組織或血管之病理或狀態。心血管疾病相關激酶包括而非限定於：AKT、AMPK、ORK、GSK、IGF-1R、 IKKB、JAK、JUN、MAPK、PKC、RHO、ROCK 及 TOR 〇 20 [00118]此處所用「骨質疏鬆」意指一疾病，其中骨骼轉變為極度多孔，因此使骨骼更容易骨折且減緩復原速度。骨質疏鬆相關蛋白激酶包括而非限定於：AKT、AMPK、 CAMK、IRAK-M、MAPK、mTOR、PPAR、RHO、ROS、 SRC、SYR 及 VEGFR。 28 200819120 [00119] 本發明之_具體實例敘述、冶療需要之哺於蛋白激_節之癌症之組成物，該組成物包括 ^感里之四氫異阿伐酸；其中有效治療量調節癌症相關之療 5

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激酶。於此具體實例之某些方面，四氫·異阿伐酸係選白組：四氫-異蛇麻草酮、四氫·異類蛇麻草酮及四附下草酮。附蛇麻 [00120] 於具體實例之其它方面，組成物進一步包^ 可接受賦賴，其選自下組：塗覆物、等張及魏商藥結合劑、附著劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、香^、甜劑、吸收劑、清潔劑及乳化劑。 M、増 [=21]另於其它方面，組成物進—步包括—或多成員，八遥自下組·抗氧化劑、維生素、礦物質、蛋白 : 及碳水化合物。、如肪 [00122] 此處所用「治療」意指已經本發明化合物之個體上之症狀’相I於未依本發H療之>^體，已為減輕、預防，及/或逆轉。開業醫師將察知，此處敘述該化合^、成份及方法使用時將由具備技術之開業醫師（内科醫師或歟醫師）-併進行連續臨床評估關定後續治療法。因此後續 ^療中’ f㈣醫師將根據鮮^法學評估其於治療肺部發 k中之任何改善。该等評估將有助於提供評估是否增加、減少或維持-種特定治療之投藥劑量、模式等之資訊。 [00123] 應、了解本發明化合物投藥對象狀態。事實上，於任何症狀發展前，本發 1 防性投藥。「治療的」、「祕上」等語及其變㈣以其t 29 200819120 =癒性、緩和性以及預防性使用。因此，此處所用「治療或減緩症狀」意指相較於未接受本發明化合物投藥個體之症狀’減輕、預防及/或逆轉接受該等投藥個體之症狀。 [=0124]使用「有效治療量」以代表治療劑量有效以達所 5 m練結果。此外’具備技術者將察知，本發明化合物之有效治療量，可以適切微調及/或投與多於一種本發明化合物，或混合投與本發明化合物與其它化合物，而為降籲低或提高。例如見 Meiner，c丄.，"Clinical Trials: Design，

Conduct, and Analysis,^ Monographs in Epidemiology and io Biostatistics, VoL 8 Oxford University Press, USA (1986) ° 因此本發明所提供方法，可特別為特定之哺乳類之特定迫切舄要，里身汀製投藥/治療。如以下範例所示，有效治癒量可（如）憑經驗輕易測定，以相對少量開始而逐步增量，同步評估有益之效應。 15 [00125]具備技術工作者將察知本發明之化合物之投藥量鲁於任何特定時間因病患之特定醫療狀態，包括其它臨床因子如哺乳類年齡、體重及狀態及所選擇投藥路徑而有個體差異。 [00126]此處所用「症狀」代表有關於特定疾病，一病患身 20 體功能之任何感應或變化，例如伴隨「X」之任何事物可視為「X」存在之適切反應。應認知及了解，症狀將因疾病或狀態不同而生差異。自體免疫異常相關症狀之非限定範例包括疲倦、眩暈、不適、器官大小增加或組織(例如葛 30 200819120 瑞夫&氏病之曱狀腺增大），或者器官或組織破壞造成器官或組織功能減弱（例如糖尿病摧毀胰臟之小島細胞）。 [00127] 過敏相關疾病或狀態之代表性徵候包括恍惚、重度過敏、氣喘、眼燻痛、便秘、咳嗽、黑眼圈、皮膚炎、 5 抑鬱、下痢、吞嚥困難、分心或注意力集中困難、眩暈、澈疹、窘迫、疲倦、潮紅、頭痛、心悸、蓴麻疹、嗅覺損 _ 傷、容易興奮性/行為性問題s、癢鼻或皮膚或喉、關節痛肌肉疼痛、鼻塞、鼻痣肉、乾嘔、鼻後滴流（鼻後滴流）、脈搏過速、流鼻水（流鼻水）、耳鳴或耳内塞物感、呼吸短 10 促、皮膚疹子、睡眠障礙、喷嚏、腫脹(血管水腫）、喉嗄耸、鼻發紅、疲累、暈眩、嘔吐、流淚或眼睛癢或乾眼或紅眼，及哮喘。 [00128] 此處所用「發炎作用」或「發炎狀態」意指細胞傷害之局部反應如微血管擴張、白血球浸潤、紅、熱、痛、 ^ It及常伴隨魏钱，作為歸有害物纽受損組織之起始機制。若限定於關節，發炎及發炎狀態之代表性症狀包括，有熱感之關節發紅、腫脹、關節疼痛及僵硬，及關節功能喪失。全身發炎性反應，製造「類流感」症狀，^如發熱、發冷、疲倦/活力喪失、頭痛、食慾喪失及肌肉僵硬。 0 [00129]糖尿病及代謝症候群常未經診斷，因其許多症狀觀之無害，例如f尿病症狀包括而非限定於：頻尿、頻渴、極度叙餓、不尋常體重喪失、疲倦增加、容易興奮性及視線扭糊。 31 200819120 [00130]神經性異常徵候可多變化且可包括而非限定於：麻木、刺痛、感覺過敏（敏感度增加）、麻痒、局部虛弱、發音困難（說話困難）、失語症（說話能力喪失）、吞嚥困難 (吞嚥困難）、複視（雙重視野）、認知障礙（注意力集中能 5 力喪失、例如）、記憶喪失、暫時性黑矇（暫時性單眼視力喪失）行走困難、協調性喪失、震顫、癲癇、混淆、嗜睡、癡呆、妄想及昏迷。瞻 [00131]以下範例傾向於進一步示範本發明之特定較優代表而不為限定意義。具備技術工作者將認知，或足以為特 ίο 定，使用不多於常規性實驗程序，此處敘述之多種相當物特定物質程序。【實施方式】實施例實施例1 _ 經修飾蛇麻子類組成成份對蛋白激酶所造成效應 [00132]如上載，激酶代表足以自予體分子（通常為ATP) 轉移磷酸基至蛋白質（通常為羥丁胺酸、絲胺酸或酪胺酸) 之胺基酸片段之轉移酶系酵素。激酶係使用於酵素調整之訊號轉導，如其可抑制或活化酵素活性，諸如於膽固醇生 20 物合成、胺基酸轉化或肝醣周轉中。當大部份激酶係對單一種類胺基酸片段具有專一性，某些激酶表現出雙重活性，因其可磷酸化二種不同種類之胺基酸。激酶於訊號轉導及轉譯之功能表示於圖1。 32 200819120 [00133] 方法-於一組超過200種激酶之激酶輪廓τΜ鑑定（Upstate Cell Signaling Solutions，Upstate USA，：tnc·， Charlottesville，VA.，USA)，測試本發明 l〇 RIAA/ml 對人類激酶活性之抑制效應。該專一性激酶鑑定程序總結於 5

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htl^//www>upstatexomlimg/pdf/kp_protocols fulLprlf (last visited on June 12, 2006)。 [00134] 結果-超過205種人類激酶於無細胞系統經過鑑定。我們發現，所測試蛇麻子類化合物驚人地抑制2〇5種激酶中之25種，10%或更多。205種之八（8)種受抑制 >20%; 205種中之5種受抑制>30%; 2種受抑制約5〇%。 [00135] 蛇麻子類，於P13激酶通道專一抑制pI3Ky、 PI3K、PI3K、Akt I、Alct2、GSK3 a、GSK3P、p7〇S6^。值得注意者為mTOR無法取得供測試。 [00136] 所測試蛇麻子類化合物幻从對激酶之抑m 表1

KinaseProfilerTM /ml 對激激酶控制組％激酶 Abl 93 —〜組％ MAPKAP-K2 ^- Abl 102 MAPKAP-K3 Abl(T3151) 121 ----— MARK1 ^- ALK 84 ~~~-~~—oi MEKl - Jm 33 200819120 ALK4 109 MELK V 98 AMPK 103 Met 109 Arg 96 MINK 109 ArG 95 MKK4 94 ARK5 103 MKK6 114 ASK1 116 ΜΚΚ7β 113 Aurora-A 77 MLCK 114 Axl 89 MLK1 109 Blk 115 Mnk2 116 Bmx 108 MRCKp 114 BRK 112 MRCKa 119 BrSKl 108 MSK1 97 BrSK2 100 MSK2 89 BTK 97 MSSK1 92 CaMKI 96 MST1 105 CaMKII 119 MST2 103 CaMKIV 115 MST3 104 CDK1/細胞週期素B 109 MuSK 100 CDK2/細胞週期素A 94 NEK2 99 CDK2/細胞週期素E 122 NEK3 109 CDK3/細胞週期素E 104 NEK6 98 CDK5/p25 100 NEK7 98 CDK5/p35 103 NLK 109 CDK6/細胞週期素D3 110 p70S6K 87 34 200819120 CDK7/細胞週期素 H/MAT1 108 PAK2 92 CDK9/細胞週期素T1 84 PAK3 54 CHK1 102 PAK4 99 CHK2 98 PAK6 109 CKl(y) 109 PAR-lBa 109 CK15 104 PDGFRP 109 CK2 122 PDGFRa 101 CK2a2 126 PDK1 118 CKit(D816V) 135 Ρ13Κβ 95 Ckit 103 P13K5 88 c-RAF ioi Ρ13Κγ 80 CSK 108 Pim-1 133 Csrc 103 Pim-2 112 DAPK1 78 PKA(b) 99 DAPK2 67 PKA 66 DDR2 108 ΡΚΒβ 87 DMPK 121 PKBa 49 DRAK1 111 ΡΚΒγ 100 DYRK2 112 ΡΚ€μ 100 EGFR 120 PKCpI 112 EGFR(L858R) 113 ΡΚΟβΙΙ 99 EGFR(L861Q) 122 PKCa 109 EphAl 105 PKCy 109 35 200819120

EphA2 115 PKC5 101 EphA3 93 PKCs 99 EphA4 108 ΡΚΟζ 107 EphA5 120 ΡΚΟη 119 EphA7 127 PKce 117 EphA8 112 PKCi 96 EphBl 134 PKD2 115 EphB2 110 ΡΚΟΙβ 99 EphB3 101 PKGla 110 EphB4 113 Plk3 98 ErbB4 123 PRAK 100 Fer 80 PRK2 102 Fes 121 PrKX 94 FGFR1 96 PTK5 104 FGFR2 103 Pyk2 112 FGFR3 109 Ret 96 FGFR4 83 RIPK2 98 Fgr 102 ROCK-I 105 Fiti 102 ROCK-11 90 Flt3(D835Y) 103 ROCK-11 105 Flt3 108 Ron 102 Flt4 110 Ros 94 Fms 105 Rse 84 Fyn 100 Rskl 93 36 200819120 GSK3p 82 Rskl 95 GSK3a 89 Rsk2 89 Hck 83 Rsk3 95 HIPK1 98 SAPK2a 111 HIPK2 113 SAPK2a(T106M) 108 HIPK3 119 SAPK2b 100 IGF-1R 97 SAPK3 98 ΙΚΚβ 117 SAPK4 98 IKKa 117 SGK 94 IR 95 SGK2 96 IRAKI 109 SGK3 107 IRAK4 110 SIK 90 IRR 102 Snk 98 ITK 117 SRPK1 117 JAK2 112 SRPK2 110 JAK3 111 STK33 94 JNKlal 104 Syk 82 JNK2a2 84 TAK1 109 JNK3 98 TBK1 121 - KDR 101 Tie2 95 Lck 94 TrkA 85 - LIMK1 102 TrkB 91 LKB1 106 TSSK1 51 LOK 127 TSSK2 97 37 200819120

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二1:7!值仔〉主意之處為’於叩尺通道之數種激酶優先受抑制，例如對Akt丨具51%抑制作用。有趣之處為，子一種Akt異構物。Aktl缺乏小鼠可存活，惟生長遲緩 [Ch〇 el al.5 Science 292:1728-1731 (2001)] 〇眼、、田胞將車乂小[Verdu et al，Nat 細胞 Bi〇i 丨:5〇〇_5〇5 (1999)] ’過度表5見導致大小比正常增力口。Akt2缺乏小鼠可存活，惟葡萄糖控制組受損[Ch0 et al.，了 Bk)1 chem 276:38345-38352 (2001)]。因此，測定結果發現細具有決定大小作用，而Akt2係關於胰島素發訊。 [00138] 已知P13K通道之作用係於mRNA穩定度及 mRNA轉譯選擇作用，造成各種致癌基因蛋白及發炎通道蛋白之差異性蛋白表現。特定5，mRNA結構標誌之 5’-TOP已顯示為mRNA轉譯選擇作用調整之關鍵結構。 [00139] 重新探討CPLA文獻及DNA序列指出，人類 CPLA2之5’mRNA包含一致（82%相似度於類似已知調整致癌基因）序列指出，其亦具5’TOP結構。亦已知暗示發炎之sPLAs ’亦具有此相同5’·ΤΟΡ。並且，其指出 CPLA2及其它可能PLAs係受Ρ13Κ通道向上調整，以增加cPLA2mRNA轉譯選擇作用形成CPLA2蛋白質增加。 38 15 200819120 反之P13K抑制子減少cpla2量並減緩經由c〇x2通道之PGE2形成作用。 [00140] 整合激酶之數據及我們本身之結果，其中我們已發現蛇麻子類化合物抑制CPLA2蛋白質表現（西方墨點 5 法，數據未顯示）而非mRNA，暗示蛇麻子類化合物抗_ 發炎作用模式可經由減少CPLA2蛋白質濃度而減少基質了為COX2取得，以及或許詳細言之，以抑制p 13κ通道 ® 形成對TOP mRNA轉譯活化作用之抑制。 [00141] 活性之確切通道仍不明。某些報告與模型一致， ίο 其模型之活化作用經由核糖蛋白S6 (RPS6)六種異構物中一或多種之磷酸化作用產生。報告RPS6分解容許5，T0P mRNA之高效率轉譯入蛋白質。然而，Stolovichetal. Mol 細胞Biol Dec，8101-8113 (2002) ’爭論該模型及計劃，其 Aktl磷酸化未知轉譯因子X，其容許TOPmRNA轉譯。 g 實施例2 检麻子類威相思榭屬組成成散對所選擇蛋白激酶之反應劑景μ [00142] 根據實施例1之程序，於超過六十種所選擇之蛋白激酶以約1 〇、50及100 pg/ml之mgRho測試其劑量反應，呈現於以下表2A & 2B。受最大抑制之五種激酶，圖 20 形化顯示於圖2。 [00143] 以約 10、50 及 1〇〇 pg/mi THIAA 製品，於 86 種所選擇激酶，測試激酶抑制作用之劑量反應（以控制組百分比列報），顯示於下表3。以此類推，以約1、5、及25pg/mi 39 200819120 相思樹屬製品於超過230種所選擇蛋白激酶根據實施例1 程序測試，顯示於下表4。亦以約1、1〇、25及5〇 ug/ml 之異阿伐酸類（IAA)、六氫異阿伐酸(ITHIAA)、貝他酸及黃腐醇等製品，於86種所選擇激酶測試，其劑量反應結果 5 分別呈現於表5-8。

表2A mgRho對所選擇蛋白激酶之劑量屋應效應（以控制組激酶 10 抖铉/1111 50 抖砮/1111 100 Hg/ml 激酶 10 μδ/ιηΐ 50 ^/ml 100 ^/ml Abl 103 82 65 MSSK1 120 31 26 ALK 79 93 109 P70S6K 105 86 69 AMPK 107 105 110 PAK2 99 84 89 Mg 94 76 64 PAK5 99 94 78 Aurora-A 96 59 33 PASK 105 111 102 Axl 101 87 85 PDK1 98 90 78 CaMKI 95 85 77 Ρ13Κβ (est) 74 49 39 - CDK2/細胞週期素A 106 81 59 Ρ13Κδ (est) 64 22 13 CDK9/細胞週期素τι 100 88 101 Ρ13Κγ (est) 85 69 55 c-RAF 105 109 103 PKA 103 95 92 DAPK1 82 56 51 PKCs 96 93 91 DAPK2 64 51 45 PKCi 100 94 96 200819120

EphA3 103 64 55 PrKX 100 105 90 Fer 87 74 83 ROCK-11 102 101 99 FGFR1 98 99 93 Ros 105 86 90 FGFR4 111 68 35 Rse 71 39 22 GSK3P 65 17 26 Rsk2 108 79 56 GSK3a 65 64 13 Rsk3 108 102 86 Hck 86 72 59 SAPK2a 96 105 109 ΙΚΚβ 104 91 92 SAPK2a(T106M) 100 107 107 IKKa 104 101 96 SAPK2b 101 102 106 IR 87 85 78 SAPK3 110 109 110 JNKlal 105 115 106 SAPK4 97 107 109 JNK2a2 119 136 124 SGK 111 105 94 - JNK3 98 98 86 SIK 130 125 117 Lck 105 83 81 STK33 99 96 103 MAPK1 77 53 44 Syk 79 46 28 MAPK2 101 104 106 Tie2 113 74 56 MAPKAP-K2 111 99 49 TrkA 127 115 93 MAPKAP-K3 109 106 73 TrkB 106 105 81 MEK1 106 104 91 TSSK1 105 100 95 MKK4 110 110 98 Yes 100 105 100 MSK2 92 54 43 ZIPK 92 62 83 41 200819120

表2B --—^ 激酶 5μ^/ϋΐ1 25pg/ml 50pg/ml AMPK(r) 102 98 99 91 CaMKI(h) 100 106 106 87 CaMKIip(h) 101 87 114 97 CaMKIIy(h) 85 97 97 90 CaMKI6 (h) 117 110 105 90 CaMKII5(h) 100 97 102 96 CaMKIV(h) 109 101 73 95 FGFRl(h) 103 108 106 103 FGFRI(V561M)(h) 104 108 110 102 FGFR2(h) 96 90 94 55 FGFR3(h) 100 113 91 40 FGFR4(h) 115 110 100 71 GSK3a(h) 51 77 63 38 GSK3p(h) 95 86 71 51 Hck(h) 89 96 87 95 IGF-IR(h) 76 65 65 102 IKKa(h) 126 125 145 144 IKKP(h) 130 118 105 89 IRAKI (h) 101 104 107 99 JAK3(h) 89 93 89 76 42 200819120 JNKlal(h) 103 78 72 70 JNK2a2(h) 95 97 97 92 JNK3(h) 88 92 91 98 KDR(h) 108 103 102 109 Lck(h) 99 102 90 92 LKBI(h) 135 135 140 140 MAPKI(h) 98 90 90 80 MAPK2(h) 112 110 111 107 MAPKAP-K2(h) 103 100 92 68 MAPKAP-K3(h) 108 99 94 87 MSKI(h) 134 110 111 101 MSK2(h) 117 97 102 86 MSSKI(h) 103 103 81 69 p70S6K(h) 100 103 100 89 PKCpiI(h) 98 100 77 58 PKCy(h) 106 99 105 92 PKC5(h) 103 102 91 85 PKCs(h) 107 104 93 85 PKCii(li) 108 106 99 89 PKCi(h) 84 94 94 101 PKCp(h) 88 97 95 89 PKC0(h) 110 105 102 100 PKCC(h) 96 100 100 103 Syk(h) 101 109 90 84 43 200819120

TrkA(h) 97 98 51 41 TrkB(h) 91 87 91 97 表3 THIAA對所選擇蛋白激酶之劑量反應效應（以控制組％)

激酶 5终羟/1111 25pg/ml 50pg/ml Abl(T3 151) 104 95 68 10 ALK4 127 112 108 AMPK 135 136 139 62 Aurora-A 102 86 50 5 Bmx 110 105 57 30 BTK 104 86 58 48 CaMKI 163 132 65 16 CaMKIip 106 102 90 71 CaMKIIy 99 101 87 81 CaMKII5 99 103 80 76 CaMKIV 99 117 120 126 CaMKI8 91 95 61 43 CDK1/細胞週期素B 82 101 77 66 CDK2/細胞週期素A 118 113 87 50 CDK2/細胞週期素E 87 79 73 57 CDK3/細胞週期素E 113 111 105 32 CDK5/p25 102 100 85 54 CDK5/p35 109 106 89 80 44 200819120

CDK6/細胞週期素D3 114 113 112 70 CDK9/細胞週期素T1 106 93 66 36 CHK1 116 118 149 148 CHK2 111 116 98 68 CKl(y) 101 101 55 CKlyl 101 100 42 43 CKly2 94 85 33 48 CKly3 99 91 23 18 CK1 109 97 65 42 cKit(D816H) 113 113 69 75 CSK 110 113 92 137 cSRC 105 103 91 17 DAPK1 62 34 21 14 DAPK2 60 54 41 17 DRAK1 113 116 75 18 EphA2 110 112 85 31 EphA8 110 110 83 43 EphBl 153 177 196 53 ErbB4 124 125 75 56 Fer 85 41 24 12 Fes 112 134 116 57 FGFR1 109 110 110 111 FGFR1(V561M) 97 106 91 92 FGFR2 126 115 58 7 45 200819120

FGFR3 112 94 39 16 FGFR4 122 93 83 58 Fgr 121 120 110 47 Flt4 126 119 85 31 ΙΚΚα 139 140 140 102 JNKlal 71 118 118 107 JNK2a2 94 97 98 101 JNK3 121 78 58 44 KDR 106 107 104 126 Lck 97 105 125 88 LKB1 145 144 140 140 MAPK2 99 109 112 102 Pim-1 103 100 44 44 Pim-2 103 109 83 22 PKA(b) 104 77 32 0 · PKA 104 101 90 25 ΡΚΒβ 117 102 27 33 PKBa 103 101 49 50 ΡΚΒγ 107 109 99 33 ΡΚΟμ 90 90 93 87 ΡΚΟβΙΙ 99 107 103 64 PKCa 110 111 112 102 PKCy 86 95 77 62 PKC8 97 93 84 87 46 200819120

PKCe 76 88 88 90 ΡΚΟζ 93 100 107 103 ΡΚΟη 82 99 103 90 PKce 93 95 86 90 PKCi 77 90 93 134 PRAK 99 81 21 33 PrKX 92 76 32 38 Ron 120 110 97 42 Ros 105 105 94 93 Rskl 101 87 48 31 Rsk2 100 85 40 14 SGK 98 103 79 77 SGK2 117 110 45 18 Syk 99 93 55 17 TBK1 101 100 82 56 Tie2 109 115 100 32 TrkA 107 65 30 15 TrkB 97 96 72 21 TSSK2 112 111 87 66 ZIPK 106 101 74 59 47 200819120 表4 相思樹屬對所選擇蛋白激酶之劑量反應效應（以控制組％) 激酶 Ιμξ/ηιΙ 5μ^ιη1 25μ^ιη1 激酶 lpg/ml 5pg/ml 25μ^ηι1 Abi 53 27 2 LOK 103 72 27 Abl(T3151) 57 26 11 Lyn 4 1 2 ALK 102 52 10 MAPK1 115 38 15 1 ALK4 84 96 98 MAPK2 108 90 48 AMPK 108 101 77 MAPK2 99 78 45 Arg 86 53 23 MAPKAP-K2 67 12 1 Arg 106 55 18 MAPKAP-K3 82 28 1 ARK5 36 13 6 MARK1 52 20 4 ASK1 100 70 23 MEK1 117 94 41 Aurora-A 8 -1 3 MELK 61 27 “2 Axl 64 17 4 Mer 95 74 5 丨 Blk 31 -2 -3 Met 168 21 7 Bmx 101 51 0 MINK 79 57 18 BRK 47 19 7 MKK4 103 135 13 BrSKl 58 6 2 MKK6 113 105 50 BrSK2 82 16 4 ΜΚΚ7β 91 44 9 BTK 15 -1 -3 MLCK 83 38 52 CaMKI 97 90 49 MLK1 92 75 42 CaMKII 83 50 6 Mnk2 103 71 29 CaMKIIp 87 45 10 MRCKp 95 52 18 48 200819120

CaMKIIy 90 51 12 MRCKa 96 76 32 CaMKII6 25 13 6 MSK1 105 97 33 CaMKIV 89 44 44 MSK2 56 22 12 CaMKI5 69 19 10 MSSK1 12 4 -4 CDK1/細胞週期素B 62 48 9 MST1 58 36 17 CDK2/細胞週期素A 69 15 5 MST2 106 104 -38 CDK2/細胞週期素E 51 14 8 MST3 50 10 2 |CDK3/細胞週期素E 41 13 4 MuSK 97 83 63 CDK5/p25 82 41 7 NEK 11 89 58 19 CDK5/p35 77 46 13 NEK2 99 100 -37 CDK6/細胞週期素D3 100 54 5 NEK3 79 41 18 CDK7/細胞週期素 H/MAT1 124 90 42 NEK6 78 43 4 CDK9/細胞週期素Ή 79 21 4 NEK7 110 94 -27 CHK1 87 52 17 NLK 103 90 44 | CHK2 52 16 5 p70S6K 43 17 10 CKl(y) 77 32 3 PAK2 103 79 16 CKlyl 51 7 -4 PAK3 43 5 -3 CKly2 31 5 1 PAK4 99 91 58 CKly3 49 16 0 PAK5 69 6 2 CK16 60 15 6 PAK6 77 22 1 CK2 157 162 128 PAR-lBa 70 20 8 CK2a2 95 83 51 PASK 136 114 26 cKit(D816H) 27 7 2 PDGFRP 59 19 9 - 49 200819120 cKit(D816V) 111 91 41 PDGFRa(D842V) 60 11 5 51 cKit 94 68 24 PDGFRa 100 106 cKit(V560G) 49 5 0 PDGFRa(V561D) 59 11 7 cKit(V654A) 30 8 3 PDK1 97 57 16 CIK3 33 16 6 PhKy2 67 62 16 c-RAF 105 100 87 Pim-1 44 9 -2 CSK 74 19 1 Pim-2 82 17 10 I cSRC 99 12 0 PKA(b) 104 52 7 DAPK1 90 72 12 PKA 99 85 16 DAPK2 75 31 4 ΡΚΒβ 61 9 -I DCAMKL2 107 106 77 PKBa 98 67 8 DDR2 84 91 45 ΡΚΒγ 86 50 5 DMPK 105 106 116 ΡΚΟμ 90 81 44 - DRAK1 92 40 11 PKCpi 108 112 100 DYRK2 83 55 25 PKCpil 71 47 30 | eEF-2K 103 97 59 PKCa 75 34 32 EGFR 76 26 6 PKCy 72 47 27 - EGFR(L858R) 99 40 1 PKC6 105 94 63 EGFR(L861Q) 90 49 1 PKCe 108 90 59 EGFR(T790M) 93 29 7 PKCC 34 10 2 EGFR(T790M，L858R) 74 30 4 PKCi 107 99 84 EphAl 106 43 9 PKCO 88 31 21 EphA2 94 82 6 PKCt 66 69 63 EphA3 94 83 50 PKD2 106 108 81 - 50 200819120

EphA4 55 12 6 PKG1B 31 16 5 EphA5 100 28 10 PKGlt 41 18 7 EphA7 103 80 6 Plk3 114 106 115 EphA8 113 84 19 PRAK 18 18 35 EphBI 116 63 8 PRK2 92 35 8 - EphB2 30 5 2 PrKX 49 14 16 EphB3 109 35 1 PTK5 99 95 88 - k EphB4 30 11 3 Pyk2 90 45 9 ErbB4 61 8 0 Ret 23 -1 -2 FAK 106 78 2 R]PK2 103 95 64 Fer 106 134 28 ROCK-I 95 90 54 Fes 143 74 43 ROCK-11 100 66 39 FGFR1 125 26 3 ROCK-II 91 59 39 FGFR1(V561M) 92 50 2 Ron 32 2 4 FGFR2 73 •1 -5 Ros 95 40 35 _ FGFR3 21 3 1 Rse 35 14 -0 FGFR4 30 7 5 Rskl 45 9 4 Fgr 78 18 7 Rskl 75 8 5 Fiti 41 12 1 Rsk2 60 4 3 Flt3(D835Y) 65 15 1 Rsk3 78 31 7 Flt3 76 16 3 Rsk4 71 25 12 Flt4 12 3 2 SAPK2a 99 106 106 Fms 94 73 19 SAPK2a(T106M) 110 106 80 Fyn 23 5 1 SAPK2b 99 100 77 51 200819120 GRK5 96 91 81 SAPK3 108 79 40 GRK6 117 117 94 SAPK4 103 86 57 GSK3I3 13 5 4 SGK 89 34 2 GSK3a 5 2 1 SGK2 102 36 5 Hck 87 29 -2 SGK3 103 96 34 HIPK1 110 112 62 SIK 115 28 5 HIPK2 92 71 24 Snk 93 96 61 | HIPK3 106 92 56 SRPK1 56 14 6 IGF-1R 148 122 41 SRPK2 37 15 4 IKKB 30 6 3 STK33 100 94 64 IKKa 120 86 11 Syk 2 2 3 IR 121 123 129 TAK1 105 101 86 IRAKI 98 85 49 TA02 97 64 25 IRAK4 117 95 47 TBK1 37 5 [2 IRR 91 70 28 Tie2 97 67 7 | Itk 121 114 48 TrkA 20 4 2 JAK2 83 69 23 TrkB 22 0 0 JAK3 24 7 1 TSSK1 89 10 5 JNK11 118 110 75 TSSK2 97 29 2 JNK2a2 99 106 102 VRK2 98 88 67 JNK3 52 23 3 WNK2 96 75 21 KDR 90 60 18 WNK3 110 98 38 Lck 92 93 25 Yes 63 33 3 LIMK1 108 104 53 ZAP-70 57 19 10 52 200819120 LKB1 126 122 98 ΖΙΡΚ 104 81 28 表5 IAA對所選擇蛋白激酶之劑量反應效應（以控制組％)

激酶 bg/ml 5^/ml 25pg/ml 50pg/ml Abl(T3151) 104 119 84 56 ALK4 92 110 113 AMPK 122 121 86 49 Aurora-A 103 106 61 20 Bmx 90 125 108 43 BTK 96 102 62 48 CaMKI 126 139 146 54 CDK1/細胞週期素B 96 102 86 69 CDK2/細胞週期素A 102 111 98 59 CDK2/細胞週期素E 81 89 72 55 CDK3/細胞週期素E 99 121 107 62 CDK5/p25 88 108 95 69 CDK5/p35 92 117 100 73 CDK6/細胞週期素D3 111 119 108 64 CDK9/細胞週期素ΤΙ 87 109 77 51 CHK1 105 117 140 159 CHK2 102 106 75 46 CKl(y) 94 105 103 CKlyl 98 102 69 21 53 200819120

CKly2 89 88 39 42 CKly3 91 87 26 17 CK16 95 111 90 56 CKit(D816H) 98 117 100 59 CSK 95 111 72 86 Csrc 99 111 100 53 DAPKl 73 52 36 21 DAPK2 59 54 50 47 DRAK1 102 123 129 75 EphA2 104 118 108 88 EphA8 113 120 117 98 EphBl 112 151 220 208 ErbB4 93 107 110 20 Fer 95 76 49 38 Fes 101 110 120 59 FGFR2 85 122 97 5 Fgr 99 120 119 70 Flt4 85 37 74 33 Fyn 90 88 92 90 GSK3P 86 77 47 14 GSK3a 85 83 56 17 Hck 88 81 76 4 HIPK2 101 107 107 84 HIPK3 97 101 127 84 54 200819120

IGF-1R 132 229 278 301 ΙΚΚβ 103 116 93 56 IR 110 107 121 131 IRAKI 115 143 156 122 JAK3 88 98 83 74 Lyn 82 114 41 73 MAPK1 81 87 55 55 MAPKAP-K2 100 98 82 36 MAPKAP-K3 108 113 106 80 MINK 102 122 118 127 MSK1 99 103 66 61 MSK2 95 90 44 45 MSSK1 90 78 52 52 p70S6K 94 98 84 58 PAK3 91 66 21 11 PAK5 101 108 106 59 PAK6 98 109 106 102 PhKy2 103 109 102 66 Pim-1 104 106 77 46 Pim-2 101 108 88 60 PKA(b) 104 115 86 12 PKA 110 102 99 106 ΡΚΒβ 104 110 57 76 ΡΚΒα 98 103 91 72 55 200819120

ΡΚΒγ 103 108 104 76 ΡΚΟβΙΙ 103 103 102 59 PKCa 106 104 89 46 PRAK 99 91 38 18 PrKX 94 92 91 58 Ron 117 113 113 40 Ros 101 108 84 75 Rskl 96 101 72 48 Rsk2 95 101 76 36 SGK 102 110 100 96 SGK2 99 128 105 60 Syk 85 92 53 7 TBK1 100 105 82 86 Tie2 101 124 113 40 TrkA 112 139 24 20 TrkB 97 111 90 59 TSSK2 99 112 109 75 ZIPK 102 102 95 73 表6 I-IHIAA對所選擇蛋白激酶之劑量反應效應（以控制組％) 激酶 lp^g/ml 5^g/ml 25pg/ml 50^g/ml Abl(T315I) 113 109 84 38 ALK4 123 121 108 56 200819120

AMPK 133 130 137 87 Aurora-A 111 107 64 27 Bmx 103 102 106 44 BTK 110 105 67 61 CaMKI 148 151 140 56 CDK1/細胞週期素B 118 115 98 85 CDK2/細胞週期素A 109 112 82 60 CDK2/細胞週期素E 83 84 70 88 CDK3/細胞週期素E 115 119 108 85 CDK5/p25 101 94 69 51 CDK5/p35 110 103 73 68 CDK6/細胞週期素D3 119 124 117 83 CDK9/細胞週期素ΤΙ 106 96 66 40 CHK1 127 124 140 144 CHK2 119 117 110 82 CKl(y) 102 102 100 CKlyl 105 103 68 30 CKly2 99 99 45 49 CKly3 104 98 28 22 CK15 110 115 89 56 cKit(D816H) 116 109 91 68 CSK 100 108 109 112 cSRC 105 114 103 37 DAPK1 94 67 37 27 57 200819120

DAPK2 72 58 46 47 DRAK1 110 119 103 69 EphA2 106 127 115 68 EphA8 133 109 89 74 EphBl 154 162 200 164 ErbB4 141 122 85 14 Fer 90 62 13 20 Fes 137 126 111 81 FGFR2 116 120 71 7 Fgr 122 127 118 91 Flt4 135 116 88 58 Fyn 104 119 82 81 GSK3P 138 84 51 10 GSK3a 89 82 58 18 Hck 93 99 73 77 HIPK2 103 105 100 98 HIPK3 117 121 118 29 IGF-1R 138 173 207 159 ΙΚΚβ 123 116 98 79 JR 129 95 105 81 IRAKI 142 140 152 120 JAK3 104 103 61 90 Lyn 115 113 56 80 MAPK1 100 88 55 67 58 200819120

MAPKAP-K2 104 99 71 29 MAPKAP-K3 111 109 99 77 MINK 107 102 114 123 MSK1 105 101 58 69 MSK2 101 86 39 48 MSSK1 98 78 41 60 p70S6K 108 99 78 56 PAK3 113 24 14 10 PAK5 109 105 89 36 PAK6 106 106 88 71 PhKy2 105 109 85 54 Pim-1 107 110 81 50 Pim-2 111 106 98 58 PKA(b) 105 119 67 12 PKA 98 107 102 91 ΡΚΒβ 121 142 50 42 ΡΚΒα 105 108 81 57 ΡΚΒγ 115 116 107 42 ΡΚΟβΙΙ 113 115 109 95 PKCa 110 90 105 103 PRAK 109 89 41 33 PrKX 86 88 77 59 Ron 114 106 129 74 Ros 113 107 109 98 59 200819120

Rskl 101 102 53 60 Rsk2 105 103 58 25 SGK 108 114 112 64 SGK2 120 121 96 63 Syk 100 95 68 17 TBK1 115 103 99 114 Tie2 109 120 95 43 TrkA 87 73 41 24 TrkB 100 107 97 13 TSSK2 115 112 109 71 ZIPK 109 109 96 8

表7 貝他酸對所選擇蛋白激酶之劑量反應效應（以控制組％) 激酶 lpg/ml 5pg/ml 25pg/ml 50pg/ml Abl(T3151) 101 101 70 29 ALK4 108 114 90 AMPK 136 131 135 77 Aurora-A 110 85 43 2 Bmx 111 100 93 54 BTK 96 90 14 37 CaMKI 142 142 131 57 CDK1/細胞週期素B 116 120 95 65 CDK2/細胞週期素A 106 104 94 64 60 200819120

CDK2/細胞週期素E 93 86 81 65 CDK3/細胞週期素E 119 115 96 53 CDK5/p25 97 97 95 96 CDK5/p35 109 106 90 50 CDK6/細胞週期素D3 107 117 101 76 CDK9/細胞週期素T1 101 104 88 35 CHK1 111 125 144 164 CHK2 103 100 94 69 CKl(y) 102 104 83 CKlyl 100 95 82 33 CKly2 97 83 55 44 CKly3 99 75 40 21 CK15 103 98 81 54 cKit(D816H) 103 112 100 18 CSK 107 111 108 145 cSRC 104 99 90 19 DAPK1 109 106 88 59 DAPK2 97 76 57 45 DRAK1 124 134 107 51 EphA2 116 122 115 80 EphA8 107 105 86 36 EphBl 130 164 204 207 ErbB4 111 118 116 28 Fer 78 69 30 18 61 200819120

Fes 120 106 114 79 FGFR2 130 118 99 7 Fgr 119 119 127 62 Flt4 104 96 65 22 Fyn 99 94 86 78 GSK3B 83 67 27 4 GSK3ct 70 71 31 1 Hck 102 88 61 22 HIPK2 101 104 99 94 HIPK3 109 119 118 83 IGF-1R 101 163 262 260 IKKI3 110 113 85 59 JR 106 106 108 95 IRAKI 143 155 165 158 JAK3 100 98 64 38 Lyn 114 120 68 59 MAPK1 88 75 51 37 MAPKAP-K2 111 104 65 22 MAPKAP-K3 108 106 102 69 MINK 102 103 123 140 MSK1 106 97 54 36 MSK2 96 86 28 25 MSSK1 95 82 61 67 p70S6K 89 95 69 44 62 200819120

PAK3 103 40 16 11 PAK5 103 99 81 44 PAK6 103 98 82 83 PhKy2 108 103 79 40 Pim-1 104 97 57 21 Pim-2 103 101 68 73 PKA(b) 120 104 51 3 PKA 103 105 102 28 ΡΚΒβ 114 108 56 52 ΡΚΒα 98 95 80 58 ΡΚΒγ 105 104 101 52 ΡΚΟβΙΙ 107 105 100 49 PKCcc 108 104 98 54 PRAK 105 81 24 11 PrKX 93 86 68 29 Ron 108 119 98 44 Ros 107 103 80 98 Rskl 103 99 69 17 Rsk2 98 96 56 8 SGK 109 111 98 100 SGK2 123 113 84 0 Syk 92 81 62 16 TBK1 110 103 80 78 Tie2 110 100 106 79 63 200819120

TrkA 97 66 53 18 TrkB 105 100 86 11 TSSK2 112 109 103 62 ΖΙΡΚ 105 110 85 37 表8 黃腐醇對所選擇蛋白激酶之劑量反應效應（以控制組％)

激酶 lμg/m\ 5^g/ml 25μ§/ϋΐϊ 50^g/ml Abl(T3151) 126 115 16 4 ALK4 116 100 71 49 AMPK 122 113 90 81 Aurora-A 83 27 3 8 Bmx 108 97 22 0 BTK 109 57 2 20 CaMKI 142 83 3 4 CDK1/細胞週期素B 118 103 46 18 CDK2/細胞週期素A 107 96 57 6 CDK2/細胞週期素E 82 86 18 9 CDK3/細胞週期素E 101 100 37 8 CDK5/p25 97 97 24 87 CDK5/p35 103 102 41 44 CDK6/細胞週期素D3 110 79 23 7 CDK9/細胞週期素ΤΙ 110 107 45 31 CHK1 121 126 142 149 64 200819120

CHK2 25 5 3 2 CKl(y) 91 63 37 9 CKlyl 101 79 50 26 CKly2 92 48 30 12 CKly3 98 51 22 15 CK16 75 32 16 12 cKit(D816H) 94 45 14 CSK 113 113 93 100 cSRC 92 50 27 21 DAPK1 113 85 49 20 DAPK2 105 88 45 26 DRAK1 133 40 19 _5 EphA2 124 113 121 52 EphA8 103 92 29 19 EphBl 92 122 175 161 ErbB4 132 85 52 27 Fer 55 20 10 1 Fes 131 106 102 26 FGFR2 116 89 36 4 Fgr 101 36 10 0 Flt4 74 10 11 4 Fyn 104 66 42 18 GSK3P 120 99 25 3 GSK3a 102 81 11 -4 65 200819120

Hck 85 35 17 0 HIPK2 110 98 75 37 HIPK3 106 102 90 59 IGF-1R 107 113 129 139 IKKB 145 118 61 44 JR 120 108 97 103 IRAKI 129 104 81 36 JAK3 104 84 17 5 Lyn 97 40 4 2 MAPK1 91 64 19 17 MAPKAP-K2 99 95 6 8 MAPKAP-K3 100 99 17 7 MINK 42 10 5 7 MSK1 114 92 31 9 MSK2 126 61 8 19 MSSK1 47 11 7 5 p70S6K 94 48 19 7 PAK3 21 18 8 4 PAK5 106 99 42 5 PAK6 105 94 14 2 PhKy2 106 60 11 5 Pim-1 88 35 4 3 Pim-2 104 48 14 6 PKA(b) 137 113 33 2 66 200819120

PKA 105 109 98 21 ΡΚΒβ 146 102 1 8 ΡΚΒα 102 81 18 5 ΡΚΒγ 104 104 12 4 ΡΚΟβΙΙ 108 108 71 79 PKCa 100 100 75 83 PRAK 101 53 2 2 PrKX 92 75 2 3 Ron 135 127 60 69 Ros 101 99 85 94 Rskl 34 49 4 0 Rsk2 96 43 3 4 SGK 111 84 0 3 SGK2 130 110 2 -4 Syk 95 60 32 17 TBK1 104 71 45 42 Tie2 94 96 100 35 TrkA 36 19 8 3 TrkB 95 89 58 3 TSSK2 102 95 61 48 ZIPK 115 74 20 70 [00144]結果-各種化合物對激酶活性調節效應之測試，顯示大範圍之調節效應依專一性激酶及以下列舉代表實施 67 200819120 例測試之化合物（表2 - 8)而定。 [00145] 強烈暗示自體免疫疾病諸如風濕性關節炎及紅斑性狼瘡之激酶H3K5、MgRho分別表現反應抑制36%、78〇/〇及87%之激酶活性，於1〇、5〇、及1〇〇 μ§/ιηι。抑制Syk分別於劑量10、50、及1〇〇|ig/ml產生21%、54%及 72%抑制作用。此外，GSK或肝醣合成酶激酶（含gsk阿伐及貝他一者）曝露於mgRho下，顯示抑制作用（阿伐： 35、36、87°/〇抑制；貝他：35、83、74 %抑制；分別於 10、50、1〇〇 pg/ml)。可見表 2。 [00146] THIAA對許多激酶顯示激酶活性之劑量依賴抑制作用：FGFR2 分別為 7%、·16%、77%及 91% 於！，5,25 及 50 pg/ml。於 FGFR3(0%、6%、61%及 84%)及 TrkA(24%、 45%、93%及94%)可分別於1、5、25及50 Hg/ml見類似結果。可見表3。 [00147] 所測試相思樹屬萃取物(A· nilotica)顯露對所檢驗激酶活性最強力之抑制作用（表4)，對該等激酶如syk (98%)、Lyn (96%)、GSK3CI (95%)、Aurora_A (92%)、Flt4 (88%)、MSSK1 (88%)、GSK3I3 (87%)、BTK (85%)、PRAK (82%)及TrkA (80%)展現80%或更大之活性抑制作用，全部均曝露於1 gg/ml。實施例3 蛇卿早類组成成份對P13K活性尤效應 [00148]依實施例1程序及方法，檢驗蛇麻子類組成成份 68 200819120 中黃腐醇、貝他酸之鎂鹽、異阿伐酸（Mg-IAA)、四氫-異阿伐酸類（Mg-THIAA)及六氫-異阿伐酸（Mg-HHIAA)，對人類ΡΙ3Κ-β、PI3K-y及ΡΙ3Κ-δ之抑制效應。另外檢驗阿拉伯金合歡心木萃取物。所有化合物均於50 pg/ml測試。結果於圖3圖形化呈現。 [00149]值得注意之處為，所有測試之蛇麻子類化合物對 P13K活性表現出>5〇%抑制作用，其中Mg-THIAA製造最大通盤抑制作用（所有測試之P13K異構物均有>80% 之抑制作用）。進一步注意黃腐醇及Mg-貝他酸對ΡΙ3Κ-γ 相較於對Ρ13Κ·β或ΡΙ3Κ-δ表現更大抑制性。Mg-IAA對 Ρ13Κ-β相較於ΡΙ3Κ-γ或Ρΐ3Κ-δ，表現多出約3倍之抑制性。阿拉伯金合歡心木萃取物顯露出刺激Ρ13κ_β或 ΡΙ3Κ_δ活性。於Syk及GSK等激酶獲得可比較之結果(數據未顯示)。 15 實施例4 • 及般庄物對經刺激及未經刺激鼠類肓嗞

If胞PGE2合成之抑制作用 [00150]本實施例目標係評估於鼠類RAW 264 7巨噬細胞杈型内蛇麻子類衍生物抑制PGE2合成COX-2優先於pge2 20 合成COX-1之範圍。RAW 264.7細胞系係建立周全模型，其用於評估測試劑之抗發炎活性。RAW264 7細胞以細菌酉曰多醣刺激誘發PGE2表現，製造c〇x_2。pGE2合成抑制作用係用於測定測試物之抗發炎活性。設備、化學品及試劑，PGE2鑑定及計算程序敘述於以下。 200819120 [00151] 設備-於本實施例所使用設備包括〇HAS模型 #E01140分析性平衡、Forma模型#F1214生物安全艙 (Marietta，Ohio)、0.1 至 1〇〇μ1 之各種滴管（VWR，Rochester， NY)、細胞手動計數器（VWR Catalog #23609- 102, 5 Rochester，NY)、Forma 模型 #F3210 C02 培養器（Marietta，

Ohio)、血球計（Hausser 模型 #1492, Horsham，PA)、Leica 模型 #ΒΜμ1 倒裝顯微鏡（Wetzlar，Germany)、PURELAB _ Plus Water Polishing 系統（U.S·過濾，Lowell, MA)、4〇C 冷藏櫃（Forma 模型 #F3775, Marietta, Ohio)、渦流混合 ίο 器（VWR Catalog #33994-306, Rochester，NY)及 37°C 水浴（Shel Lab 模型 #1 203, Cornelius, OR)。 [00152] 化學品及試劑-細菌酯多醣（LPS; B E. coli 055:B5)係來自Sigma (St. Louis，MO)。加熱不活化胎牛血清（FBS-HI Cat· #35- OllCV)及 Dulbecco，s 調整作用 of is Eagle’s Medium (DMEM Cat #10-O13CV)係購買自 _ Mediatech (Herndon，VA)。蛇麻子類碎片（1)阿伐蛇麻子 (1%阿伐酸類；AA)、（2)香蛇麻子OE(10%貝他酸類及 2%異聚合阿伐酸類、（3)異蛇麻子（異聚合阿伐酸類； IAA)、（4)貝他酸溶液（貝他酸類BA)、（5)六蛇麻子金（六氫 2〇異聚合阿伐酸類；HI-IIAA)、（6)還原蛇麻子（還原異聚合- 阿伐酸類；RIAA)、（7)四蛇麻子（四氫-異-阿伐酸類THIAA) 及（8)失效蛇麻子類係得自貝他科技蛇麻子類製品 (Washington, D.C·，U.S.A·)。失效蛇麻子類以相等體積純酒精萃取二次。於40°C加熱移除乙醇直至僅留下稠褐色殘餘 70 200819120 物。將殘餘物溶解於DMS0以於RAW264 7細胞測試。 [53].待測物質-使用敘述於表12之蛇麻子類衍生物。使用COX1選擇性抑制子阿斯匹靈及⑶χ_2選擇性抑制子塞來考昔作騎性控制組。阿斯匹靈得自sigma⑼. L〇Uis，MO)，而使用商業配方(CdebrexTM，Seade & c〇 , Chicago, IL)之塞來考昔。 [00154] 培養細胞並以待測物質處理自

Culture Collection (Catalog #TIB_71，Manassas，从)取得之 &八\¥264.7細胞，培養於調整〇1111^(^〇之£眧1^8培養基 (DMEM，Mediated!，Herndon，VA)並維持於對數生長。添加 50 ml之加熱不活化PBS及5 ml 〇f青黴素/鍵黴素，至 500 ml之DMEM瓶，並儲存於4。〇，以製備DMEM生長培養基。使用前將生長培養基水浴加熱至37。〇。 [00155] 為COX-2相關之PGE2合成，於第一日將1〇〇叫培養基自所製備細胞盤之每一孔移除並以1〇〇 μ1平衡2χ 最終濃度之待測化合物取代。隨後將細胞定溫培養9〇分 1里。將20 μΐ之LP添加於每一孔接受刺激之細胞以達到最終濃度IpgLPS/ml，並將細胞定溫培養4小時。將細胞以5μΜ花生四稀酸進一步定溫培養丨5分鐘。將％叫上澄液培養基自每一孔移至清潔微量離心管，以進行pG^ 釋入培養基之測定。 2 [00156] 為COX-1相關之PGE2合成，將1〇〇 μ1培養基自第一日製備之細胞盤每一孔移除，並以1〇〇 μ1平衡2χ 200819120 最終濃度之待測化合物取代。隨後將細胞定溫培養分鐘。隨後，不進行LPS激發作用，而將細胞以= 生四烯酸定溫培養15分鐘。將25 μΐ上澄液培養基自每一孔轉移之清潔微量離心管，以進行PGE2釋入培養基之測 5 定。 < 土 /、 [00157]觀察細胞外觀並以肉眼評估生存能力。任何化合物於最高測試濃度未觀察到明顯毒性。將25μ1上澄液典養瞻基自每一孔轉移至清潔微量離心管，以進行PGE2釋二培養基之測定。隨後如先前敘述測定PGE2並報告。 10 [⑽158] PGE2鑑定-使用商業性、非放射線活性程序計量 PGE2 (Caymen Chemical, Ann Arbor，MI)，並使用製造商所建議程序未經調整。簡要而言，將25 μΐ培養基，伴隨 PGE2標準樣本之一連_稀釋，以適當量之乙醯膽驗酯酶_ 標籤示蹤劑及PGE2抗血清混合，並於室溫定溫培養 15 h。於孔清空並以沖洗用緩衝液潤濕後，添加乙酸膽驗酯 • 酶之包含基質200 μΐ之Eliman’s試劑。於室溫將反應維持於緩慢搖晃器1小時並以Bio-Tek儀器（模型#Ε1χ800, Winooski，VT) ELISA 光譜儀測定 415 nm 吸光度。PGE2 濃度以皮克perml表示。本鑑定之製造商說明包括鑑定内 20 變異係數<10%，與PGD2及PGF2之交叉反應度少於 1% ，且線性於10 - 1000 pg mil之範圍。如以下敘述計算 COX-2 and COX- 1之PGE2合成培養基抑制濃度（IC50) 〇 [00159]計算程序-使用 CalcuSyn (BIOSOFT，Ferguson， 72 200819120 MO)計算PGE2合成培養基抑制濃度（IC5G)。使用每種待測物質四種濃度中之最小值或陽性控制組於運算。統計套組使用 T.C Chou and P· Talalay [Chou，T.C· and P· Talalay· Quantitative analysis of dose-effect relationships; the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regu I 22: 27-55,（1984)]於此處納入參考資料。實驗於三個不同日期重覆三次。將三個相關實驗每一劑量之抑制百分比取平均值並計算報告使用之培養基抑制濃度。 10 15

[00160]將培養基抑制濃度排入四種任意項目：（丨)該等物貝隶面抗發炎反應IC5〇值於〇·3 pg/ml内之〇·1; (2)該等物貝南抗發炎反應IC5〇值於〇·7 pg/ml内之ΐ·〇; (3)該等物質中間程度抗發炎反應ΙΟ：%值於2與7 pg/ml之間；及 (4)該等物質低抗發炎反應1(：5〇值大於12]Lig/m卜最高測試濃度。 [00161]結果-阿斯匹靈及塞來考昔陽性控制組，於模型系、、先刀別展現其環氧化轉選擇性（表9)。阿斯匹靈約1〇〇〇_ 倍廷擇性於COX-1 •，塞來考昔114倍選擇性於c〇x_2。所有蛇麻子類物質展現cox_2選擇性，其中Rh0異阿伐酸 ^異阿伐酸展現最高C0X_2選擇性，分別為363及138 =該等高0)Χ·2選擇性結合低培養基抑制濃度，報告㈢於其它來源之天然製品得到。對所餘蛇麻子類衍生、，僅香蛇麻子油展示最低限度c〇x_2選擇性為3倍。為於實驗室中以數據外插法計算臨床效度，二般作灵。定 73 20 200819120 COX-2選擇性5倍或更大表示臨床顯著之胃黏膜保護潛力。於此準則下，貝他酸類、c〇2蛇麻子萃取物、失效蛇麻子類C02/乙醇、四氫異阿伐酸及六氫異阿伐酸類顯示潛在臨床相關COX-2選擇性。 5 表9 蛇麻子砗片及衍生物於RAW 264.7細胞對COX-2 1 COX_l之抑制作用 • ___ 待測物質 ICsoCOX-2 ["g/mlj IC5〇COX-1 COX-l/COX-2 Rho異阿伐酸 0.08 29 363 異阿伐酸 0.13 18 138 貝他酸 0.54 29 54 co2蛇麻子萃取物 0.22 63 29 阿伐酸 0.26 6.2 24 失效蛇麻子類C02/Ethanol 0.88 21 24 四氫異阿伐酸 0·20 4.0 20 六氫異阿伐酸 0.29 3.0 10 香蛇麻子油 1.6 4·1 3.0 陽性控制組阿斯匹靈 L16 0.0009 0.0008 塞來考昔 0.005 0.57 114 74 200819120 實施例5 或異聚合阿刺激Raw2647細胞直接對PGF2也迦並屋之缺乏

10 i [0162] 本研究目標係評估蛇麻子類衍生物還原異阿伐酸及異聚合阿伐酸類，於RAW 264·7細胞發炎模型内，直接抑制COX-2所媒介PGE2生物合成之能力。本實施例使用敘述於實施例4之RAW 264·7細胞系。設備、化學品及試劑，PGE2鑑定及計算程序敘述於實施例4。 [00163] 待測物質—使用敘述於表12之蛇麻子類衍生物避原異阿伐酸及異聚合阿伐酸類<0X4選擇性陽性控制、、且—阿斯匹靈’得自 Sigma (St. Louis，ΜΟ)。 [00164] 培養細胞並以待測物質處理-RAW 264.7細胞 (TIB-71)付自 American Type Culture Collection (Manassas， VA)，並次培養如敘述於實施例4。隨後隔夜培養於 37 C，以5% C02，將生長培養基吸出並以不含FBS或青黴素/鏈黴素之200μΠ3ΜΕΜ取代。將RAW 264.7細胞以LPS刺激並定溫培養隔夜，以誘發COX-2表現。LPS-激發作用後十八小時，添加待测物質，60分鐘後添加鈣離子電泳A23187。將待測物質溶解於DMSO成為250倍原料溶液。添加四μΐ本250·倍原料待測物質製品至1 ml ί)ΜΕΜ，並將200 μΐ溶液後績添加入待測物質每一劑量之八孔。上澄液培養基採樣以於30分鐘後測定PGE2。如敘述於實施例4以二項獨立實驗四種濃度之最小值計算培 75 20 200819120 養基抑制濃度。 [00165] PGE2測定-使用商業性、非放射線活性計量pGE2 (Caymen Chemical，Ann Arbor，MI)於 PGE2 測定並如敘述於實施例4使用製造商所建議程序未調整。 [00166] 細胞生存能力-細胞生存能力以細胞顯微鏡檢查評估於培養基採樣以進行PGE2鑑定之前或之後。可見無明顯細胞死亡於任何測試濃度。

10 [00167] 計算四種濃度0·10、1·0、10及l〇〇pg/mi使用以取得劑量-反應曲線並計算培養基抑制濃度(IC 5 〇)以9 5 % 信賴區間使用 CalcuSyn (BIOSOFT，Ferguson，MO)。 [00168] 結果-於RAW264.7細胞PGE2iLPS-激發作用相對於未刺激細胞範圍自1·4倍至2·1倍。算出阿斯匹靈陽性控制組IC50值8.7 pg/ml (95% CI = 3.9 - 19)，與出版值直接COX-2範圍自1·4 to 50 pg/ml抑制作用一致 [Warner, T.D. et al. Nonsteroidal drug selectivities for cyclo-oxygenase- 1 rather than cyclo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis. Proc. Natl. Acad Sci· USA 96:7563-7568, (1999)]，而本實驗室於A549細胞系之歷史數據為3.2 μΗ/πιΙ (95% CI = 0·55 - 19)。 [00169] 當LPS於RAW 264.7細胞誘發COX-2後，添加 RIAA或IAA均製造僅適度之劑量-相關之PGE2抑制作用。待測物質濃度1000倍增加，可見於RIAA及IAA僅 76 20 200819120 分別增加抑制作用14及10百分比伯、止# π炫/主Μ 千滑之劑量-反應峰

值造成IC50值（表10)mg/ml範圍於RIAA(36m I

心㈧㈣呵/岭可見三·對數單位反應之劑量最小變= 暗不所見蛇麻子類衍生物於本細胞基礎敎之P 效應為對細胞之次級效應，轉直接⑽_ 性，抑制作用。畔古f生之 Γα171]Λ4Α及4B分別描緣劑量-反應數據，幻AA及為白色長條，而本實施例之劑量_ '物見並切祕 COX-2酵素抑制子之結論。接 Γ二於實驗室中測試評估抑制P吼生 = 蛇麻子材料為其中最具活性之抗-4 15 i及1ΑΑ以其關於CC^誘發抑制 (3)RIAA及UA呈^路直接C〇X_2酵素抑制作用；現之抑4Γ=〇Χ_2選擇性’其顯露為，2表同於差SI: 酵素抑制作用。本選擇性，不、”性酵素抑制選擇性之塞來考昔。表10 寺測物曾之 ΕιΙΔΛ、IA A培養基抑制潭

Riaa ICsoI/zg/ml] 36,000 區間[卩g/ml] 17,000.7Q000 77 20 200819120 IAA >1，000,000 --------- 陽性控制組 iCso【pg/ml】 95 Λ信賴區間丨阿斯匹靈 8.7 pg/ml 3·9 _ 19 — RAW264.7細胞以LPS刺激，並定溫培養隔夜以誘發c〇X-2表現。LPS-激發作用18小時後，添加待測物質，6〇分鐘後添加 A23187。於30分鐘後採取上澄液培養基以進行PGE2測定。於二次獨立實驗四種濃度之八次複製值取最小值以計算培養基抑 p 制濃度。 < 實施例6 蛇麻子類化合物及衍生物於A549肺部上虔細跑不具直接環氧化酶酵素抑制作用 [00172] 化學品-本實施例所使用蛇麻子類及蛇麻子類衍 ίο 生物先前敘述於實施例4。所有其它化學品之供應商敘述於實施例4。 [00173] 設備、PGE2鑑定及計算程序如敘述於實施例4 •者。 [00174] 細胞-A549 (人類肺部上皮）細胞得自American 15 Type Culture Collection (Manassas，VA)並根據供應商說明進行次培養。37°C下將細胞以5% C〇2常態性培養於包含 10%FBS、5〇單位青黴素lml、5〇pg鏈黴素im卜5mM 丙酮酸鈉及5 mM L-麵醯胺之RPMI 1640。實驗當日，收成指數性生長細胞並以無血清RPMI 1640沖洗。 [00175] 於96-孔組織培養盤之每一孔含0.2 ml生長培 78 20 200819120 5 10 15

養基，放置8 χ 104對數生長期A549細胞。為待測化合物PGE2抑制作用之測定，使用Warner，et al. [Nonsteroid drug selectivities for cyclooxygenase-1 rather than cyclooxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: a full in vitro analysis, Proc Natl Acad Sci U S A 965 7563-7568,（1999)]之方法，亦稱 WHMA-COX-2 程序未經調整。簡要而言，於放置A549細胞24小時後，添加白細胞介素-lp(10ng/ml)以誘發COX-2表現。24小時後，將細胞以無血清RPMI 1640沖洗。隨後將待測物質溶解於 DMSO ’並添加無血清RPMI至培養孔以達到最終濃度 25、5.0、0.5及〇.〇5 pg/m卜每一濃度進行二次。添加相等於測試孔組内體積之DMSO至控制組孔組。60分鐘後，添加A23187 (50μΜ)至培養孔以釋放花生四烯酸。3〇分鐘後自培養孔採取25 μΐ培養基以測定PGE2。 [00176]細胞生存能力以肉眼可評估，且於任一項化合物最高測試濃度中均未觀察到明顯毒性。測定上澄液培養基中之PGE2並以先前敘述於實施例4之方法報告。計算pGE2 合成之培養基抑制濃度(ICw)如先前敘述於實施例4。 [00177]結果_於測試劑量，實驗程序未能找到任一項蛇麻子類萃取物或衍生物之有效培養基濃度。既然程序需要於添加待測化合物之前C0X-2表現之激發作用，咸^待測物質未能抑制PGR合成其作用機制係抑制類異位酶之表現且無直接活性。某些直接抑制用二 WHMA_C〇x_2程序觀察，本程序㈣不適於評估蛇麻 79 20 200819120 子類化合物或蛇麻子類化合物之衍生物之抗發炎特質。實施例7 蛇窳子類哲生物於A549 -肺部上皮細胞抑制PGE? 4物金成之塵蟎過敏原活化作用 5 [00178]化學品-本實施例使用先前敘述於實施例1之蛇麻子類及蛇麻子類衍生物（1)阿伐蛇麻子（1%阿伐酸； AA)、（2)香蛇麻子〇E(10%貝他酸及2%異聚合阿伐酸、 (3)異蛇麻子（異聚合阿伐酸；IAA)、（4)貝他酸溶液（貝他酸 BA)、（5)六蛇麻子金（六氫異聚合阿伐酸類；MHIAA)、⑹ ίο 還原蛇麻子（還原異聚合-阿伐酸類；RIAA)及（7)四蛇麻子 (四氫-異-阿伐酸THIAA)。所有其它化學品之供應商如敘述於實施例4。最終濃度1〇 gg/mi之待測物質於添加塵蟎過敏原60分鐘前添加。 [00179]没備、PGE2鑑定及計算程序敛述於實施例4。齡 [00180]塵蟎過敏原分離-粉塵蟎為美洲屋塵蟎。以u 比例飼養 Purina Laboratory Chow (Ralston Purina，Co，St

Louis, MO)之粉塵端與Fleischmann粒狀乾酵母菌 (Standard Brands，lnc· New York，NY)於室溫及 75〇/〇渴度。活蟎自培養基移行出時將其自培養容器吸出，冷凍殺 20 蟲，乾燥並儲存於〇%濕度。將蟎塵過敏成份以水於周圍溫度萃取。添加五百mg之蟎粉至5ml之水（L.10w/v)於 15 ml圓錐離心f (VWR，R〇chester,NY)’搖晃一分鐘並於周圍溫度靜置以待隔夜。隔日，使用〇2_可撤棄式過 80 200819120 濾注射器（Nalgene，Rochester，NY)將水過濾。濾出液術語為塵蟎過敏原，且使用於測試於A549肺部上皮細胞誘發PGE2生物合成。 [00181] 細胞培養及處理—將人類呼吸道上皮細胞系 (American Type Culture Collection，Bethesda，MD)以先斤敘述於實施例6之方法培養及處理。將塵蟎過敏原添加至培養基以達到最終濃度1000 ng/ml。小時後，將拉> 採樣以進行PGE2測定。〇、基 [00182] 結果-表11描繪蛇麻子類衍生物於受塵蠕過卞 10 § 刺激之A549肺部細胞之PG&生物合成抑制作用原所有測試之蛇麻子類衍生物均足以顯著抑制塵蟎=圍。刺激效應。 k破原之表11 瘦應子麗衍肺-.1.上皮 PGE 用六蛇麻子（HHIAA)

待測物質阿伐蛇麻子（AA) 香蛇麻子OE 異蛇麻子（IAA) 貝他酸（BA) 200819120 麻子（RIAA) 81 76 [00183] 本實施例顯示蛇麻子類衍生物於a549肺部細胞足以抑制塵蟎過敏原之PGE2刺激效應。實施例8 還龙伐酸缺乏直接COX-2抑制作用 [00184] 本實施例目標係測定還原異阿伐酸鎂是否可作為 CGX-2酵素活性之直接抑制子。 [00185] 材料-待測化合物放置於二甲基亞磺醯（DMSq) 内並儲存於_2〇 ◦。LPS 係講買自 Sigma-Aldrich (St· Louis， MO)。MgRIAA 由 Metagenics (San Clemente, CA)供應，而使用塞來考昔商業性配方（CelebrexTM，Searle & Co.， Chicago, IL) 〇 [00186] 細胞培養-鼠類巨噬細胞RAW 264.7細胞系係購買自ATCC (Manassas，VA)並依其說明嗣養。細胞次培養於96孔盤，密度為每一孔8x1 〇4細胞，並靜置約2曰到達90%滿盤。添加LPS (1 pg/ml)或純PBS至細胞培養基並定溫培養12小時。將培養基自培養孔移除並將LPS (1 pg/ml)與待測化合物溶解於DMSO，且將無jk清RPMI添加至培養孔以達MgRIAA最終濃度20、5.0、1.0及0.1 pg/ml，而塞來考昔則為loo、1〇、1及〇丨ng/ml。每一濃度進行8次。1小時後以待測化合物培養，將細胞培養基 82 200819120 移除並以新鮮培養基與待測化合物及LPs (1 pg/mi)取代並定溫培養1小時。將培養基自培養孔移除並分析合成之 PGE2。

[00187] PGE2鑑定-使用商業性、非放射線活性程序計 5 量 PGE2 (Cayman Chemical，Ann Arbor, MI)。將樣本以 EIA 緩衝液稀釋10倍，並使用製造商所建議程序未經調整。 PGE2浪度以母ml皮克表示。本鐘定製造商之說明包括 • 鑑定内變異係數<10%、與POD2及PGF2交叉反應度少於 1 %且線性範圍10 - 1 〇〇〇 Pg ml] α 10 [00188] cox_2專一性抑制子塞來考昔依劑量抑制cox-2 所媒；l之PGE2合成（100、lo、l及olng/ml)，MgRIAA 未察見顯著性PGE2抑制作用。數據暗示MgRIAA並非直接COX-2酵素抑制子，如塞來考昔（圖5) 實施例9 Μ成IAA之iNOS及蛋白皙矣現抑制作用 [00189] RAW 264.7細胞之細胞萃取物以MgRIAA處理，並以LPS刺激並以西方墨點法鑑定iN〇s及c〇x_2蛋白質。 [00190] 材料-待測化合物放置於二甲基亞續醯（DMSO) 20 内並儲存於_20 C。MgRIAA 由 Metagenics (San Clemente， CA)供應。塵滿係講自 Sigma-Aldrich (St, Louis，MO)。 P13K抑制子渥曼青黴素及LY294002係購自EMB Biosciences (San Diego, CA)。抗 COX-2 及 iNOS 抗體購自 83 200819120

Cayman Chemical (Ann Arbor，MI)。抗 GAPDH 抗體講自

Novus Biological (Littleton，CO)。與山葵過氧化酶結合之次級抗體係購自 Amersham Biosciences (Piscataway 。 [00191] 細胞培養-鼠類巨噬細胞RAW 264.7細胞系係購 5 貝自ATCC (Manassas，VA)並根據其說明飼養。細胞生長並次培養於24孔盤，密度每孔3 xlO5細胞並靜置以達9〇% 滿盤，約2日。將待測化合物添加至細胞於無血清培養 •基中，最終濃度0.4% DMSO。以待測化合物培養1小時，將LPS (1 lg/ml)或純磷酸緩衝生理液添加至培養孔並持續 ίο 培養指定次數。 [00192] 西方墨點法—將細胞萃取物製備於緩衝液e (50mMFIEPES，pH7.0;150mMNaCl;l% 氚核 χ_10〇; 1 mM飢酸鈉；抑肽酶5 pg/ml ;胃酶抑素八108/1111;亮抑蛋白酶肽5 gg/ml;苯基曱烷磺醯基氟化物1 mM)。 15 簡要而言，將細胞以冰冷PBS沖洗二次並添加緩衝液釀 E。將細胞刮入乾淨試管隨後於4。〇14，_ Γρπι離心1〇分鐘’採取上澄液為全部細胞萃取物。將細胞萃取物（5〇 pg)經由前置 4%-20% 三-HCI Criterion 凝膠（Bio-Rad， Hercules，CA)電泳直至前部移行作用染劑自凝膠底部到達 20 5 mm處。使用Bio-Rad (Hercules，CA)之半乾系統將蛋白質轉移至墙化纖維素膜。於室溫將膜沖洗並以5%乾燥奶粉阻擋1小時。於室溫以初級抗體，隨後以次級抗體培養各一小時。使用Super訊號West Femto最大Sensitivity 基質from Pierce Bio技術（R0Ckford，IL)演算化學發 84 200819120 光’其培養相等體積之發光胺/促進劑溶液化物溶液固定5分鐘。使用；人名；至，置、氧 mv、το · ν CCD Kodak® (Rochester, NY) IS 1000 imaging 系統進杆 mm ^ A/_ 運仃西方墨點法。使用Kodak⑧ 軟體演算光密度測定法。 5

10 [00193]使用西方墨點法偵測埤只〜Ό卡估COX-2及iNOS蛋白質又見百刀比於LPS之，放發作用2〇小時後觀察⑶η表現。相較於DMSO溶劑控制組，峋⑽八可見c〇x_2蛋白質表現減少55%(圖6)。專—性Nf_kB抑制子塵端，抑制蛋白質表現22.5% ’而p13_激酶抑制子減少c〇x_2表現約47% (圖6)。此外，於lps激發作用20 hr後可見 MgRIAA使iNOS蛋白質表現減少73% (圖7)。實施例10 NF-κΒ核易位乃γ>να結合 [00194] RAW 264·7細胞之核萃取物以MgRIAA處理並以LPS刺激4小時，鏗定NF-κΒ與DNA之結合。 [00195] 材料-將待測化合物製備於二甲基亞續酿 (DMSO)並儲存於-20 C。MgRIAA 由 Metagenics (San Clemente，CA)供應。，NF-κΒ活化作用專一性抑制子之塵蟎購買自 Sigma-Aldrich (St· Louis，MO)。P13K 抑制子 LY294002 購自 EMD Biosciences (San Diego, CA) 〇 [00196] 細胞培養-鼠類巨噬細胞RAW 264.7細胞系購自ATCC(Manassas，VA)並依其說明飼養。將細胞次培養於6孔盤，密度每孔1.5 X 106細胞靜置以達90%滿盤， 85 20 200819120 約2日。將待測化合物MgRIAA (55及14 pg/ml)、塵虫茜 (80 jiM)及LY294002 (25μΜ)添加至無血清培養基中之細胞於最終濃度0,4% DMSO。以下1小時以待測化合物培養’將LPS (1 pg/ml)或純PBS添加至細胞培養基並額外持續培養四小時。 [00197] NF-kB-DNA 結合-將核萃取物以 Dignam，et al [Nuci Acids Res 11:1475-1489,（1983)]基本敘述製備。簡

要而言，將細胞以冰冷PBS沖洗二次，隨後添加緩衝液A (10 mM HEPES、pH 7.0、1 ·5 mM MgCl2、10 mM KC1、〇·!〇/〇 ΝΡ·40、抑肽酶5 gg/ml ;胃酶抑素A 1 pg/ml、亮抑蛋白酶肽5pg/ml;苯基甲烷磺醯基氟化物imM)並靜置於冰上15分鐘。隨後將細胞刮入乾淨試管並進行三循環之冷康/解珠。隨後於4°(3以10,000 \8離心5 11^11收集上澄液層之細胞質碎片。將餘留小粒再懸浮於緩衝液C (20 mM HEPES、pH7.0、1.5mMKC卜 420 mMKC卜 25% 甘油、〇.2Mm>TA、抑肽酶5pg/m卜胃酶抑素Alpg/m卜亮抑蛋白酶肽5pg/m卜苯基曱烧石黃醯基氟化物imM)並靜置於冰上15分鐘。隨後於4°C以105000 X g離心5 min收集上澄液層之核萃取物碎片。核使用Active Motif (Carlsbad，CA)之TransAM NF-κΒ套組依製造商之說明評估萃取物之NF-κΒ DNA結合。如圖8所見，TransAM套組於96-孔規格調查性序列，彳貞測NF-κΒ結合之p50次單位。測定蛋白質濃度(Bio-Rad鑑定）並鏗定10μ§核蛋白萃取物二次。 86 200819120 [00198] 核萃取物（10 pg蛋白質）分析演算二次，且結果圖形化呈現於圖9。以LPS (1 pg/ml)刺激，結果造成^^^^ DNA結合二倍增加。以LY294002 (a P13激酶抑制子) 處理造成NF-κΒ結合適度減少，符合依先前文獻報告所 5 預期者。塵瞒亦如預期造成NF-kB結合顯著減少。以

MgRIAA可見NF-κΒ、结合之大量減少。所見效應係以劑量-反應方式。NF-κΒ結合減少可造成標的基因包括 _ COX-2、iNOS及11^〇1之轉錄活化作用之減少。 [00199] 結果暗示所見MgDHIAA所造成nf_kB結合減 10 少，導致COX-2蛋白質表現減緩，最終導致ρ〇Ε2製造減少。 . 貫施例11 3T3-L_1脂肪母細胞内，受相思樹屬古之水性萃取物之二 1基亞磺Si-可溶性碎片誘發脂皙生成之增加 g [00200]模型-使用3T3-L1鼠類纖維母細胞模型以研究化合物對脂肪母細胞分化與脂肪生成之潛在效應。該等細胞系容許獨立研究調控前脂肪母細胞複製之刺激及機制，於已分化為脂肪母細胞之調控研究之外[Fasshauer, M·，Klein, J” Neumann, S·，Eszlinger，M·，and Paschke，R· 2〇 Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes. Biochem Biophys Res Commun5 290: 1084-1089; (2002); Li5 Y. and Lazar, M. A. Differential gene regulation by PPARgamma agonist and constitutively active 87 200819120 PPARgamma2. Mol Endocrinol，16: 1040,1048,（2002)]，以及研究測試劑之胰島素-致敏及三甘油酯-降低能力[Raz，I.， Eldor，R·，Cemea，S·，and Shafrir，Ε· Diabetes: insulin resistance and derangements in lipid metabolism. Cure 5 through intervention in fat transport and storage. Diabetes

Metab Res Rev，21: 3-14,（2005)]。 [00201] 前脂肪母細胞3T3-L1細胞具有纖維母細胞外藝觀。其於培養中複製直至形成融合之單層細胞，於其細胞間接觸後促發G0/G1生長阻礙。3T3-L1細胞依前-及後-ίο 融合前脂肪母細胞之增殖，終端分化為脂肪母細胞。後續以3-異丁基-1 -甲基三仙膠、曱基脫氫皮質固醇及高劑量膜島素(MDI)激發一日’促使該等細胞經歷後-融合有絲分裂菌落擴張，完成細胞週期並開始表現脂肪母細胞-專一基因。於分化誘發後約五日，多於90%之細胞顯示脂肪母細 15 胞表現型之飽含脂肪特徵。評估3T3-L1細胞之三甘油酯瞻合成提供測試物胰.島素-致敏能力之正讀模型。 [00202] 結果發現矛盾，——促進脂肪細胞脂質攝取物質應增進胰島素敏感度.已經提出數種假說以求解釋此一矛盾。其中一項持續獲得研究支持之前提為「脂肪酸竊取] 2〇概念，或the of脂肪酸類自細胞質併入脂肪母細胞引起脂肪酸類於肌肉之相對性耗竭與葡萄糖攝取之同時增加 [Martin，G·，K· Schoonjans，et al. PPARgamma activators improve glucose homeostasis by stimulating fatty acid uptake in the adipocytes. Atherosclerosis 137 Suppi: S75-80, 200819120

10 15

(1998)]。噻唑二酮，諸如曲格列酮及鹽酸吡格列酮，已顯示其選擇性刺激脂肪細胞產脂活動，造成胰島素對脂肪分解或脂肪酸釋入細胞質較大之抑制作用[Yamauchi，T.，J. Kamon, et at. The mechanisms by which both heterozygous peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) deficiency and PPARgamma agonist improve insulin resistance. J Biol Chem 276(44): 41245-54, (2001); Oakes，N· D·，P· G· Thalen，et at· Thiazolidinediones increase plasma-adipose tissue FFA exchange capacity and enhance insulin-mediated control of systemic FFA availability· Diabetes 50(5): 1158-65,（2001)]。該作用將留下較少游離脂肪酸類供其它組織取得[Yang，W· S·，W· J· Lee, et at. Weight reduction increases plasma levels of an adipose-derived anti-inflammatory protein, adiponectin. J Clin Endocrinol Metab 86(8): 3815-9,（2001)]。因此，嗟嗅二酮處理後續將造成胰島素於肌肉及肝臟之游離脂肪酸類去敏感化效應為之降低。該等實驗室結果已經臨床確診 [Boden, 0. Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM. Diabetes 46(1):3-10，（1997); Stumvoll, M. and H. U. Haring Glitazones: clinical effects and molecular mechanisms. Ann Med 34(3): 217-24, (2002)] 〇 [00203]待測物質-曲格列酮係得自Cayman化學品 (Ann Arbor, MI，而曱基異丁基黃嗓呤、曱基脫氫皮質固 89 20 200819120 醇、吲哚美辛、油紅0號及胰島素係得自Sigma (St. Louis， MO)。待測物質係暗褐色粉末由5(h50(v/v)水/·酒精萃取相思樹屬（AcE)樣本#4909之樹脂膠製造且係得自 Bayir 化學品（No· 68，South Cioss Road，Basavanagudi， 5 India)。萃取物標準化為包含不少於20%類人猿兒茶素。本實施例所使用批號A Cat/2304經UV分析測定包含 20.8%類人猿兒茶素。青黴素、鏈黴素、Dulbecco’s經修 | 飾 Eagle’s 培養基（DMEM)係來自 Mediatech (Hemdon， VA)而10%FBS-HI (胎牛血清-加熱不活化）來自Mediatech 〇 and HyCIone (Logan，UT)。所有其它標準試劑，除非另行說明’均係購買自Sigma。 [00204] 細胞培養及處理-鼠類纖維母細胞細胞系 3T3-L1 係購買自 American Type Culture Collection (Manassas，VA)，並根據供應商說明進行次培養。於實驗 5 前’將細胞培養於包含10% FBS-HI添加50單位青黴素 > /ml及50 gg鏈黴素/ml之DMEM，並於實驗設定之前維

持對數生長期。於37。(：將細胞生長於5% C02濕化培養裔。前-融合培養基組成成份包括（1)含4.5 g葡萄糖/L 之 10% FBS/DMEM、（2) 50 U/ml 青黴素；及(3) 50 pg/ml -0 鏈彳政素。添加50 ml加熱不活化FBS及5 ml之青黴素/ 鏈黴素於500 ml DMEM以製作生長培養基。將該培養基儲存於4°C。使用前將培養基以水浴加熱至37°C。 [00205] 將3T3-T1細胞播種於24孔盤，起始密度6χ1〇4 細胞/cm2。將細胞靜置二日以使其生長達滿盤。滿盤後， 90 200819120 添加分化培養基迫使細胞分化為脂肪母細胞；該等培養基包括（1) 10% FBS/DMEM (高葡萄糖）；（2) 〇·5 mM甲基異丁基黃嘌呤；（3) 0·5 μΜ甲基脫氫皮質固醇；及(4)10pg/ml 胰島素(MDI培養基）。3曰後，將該培養基轉為後-分化培 5 養基，其包括1〇% FBS/DMEM，含1〇 pg/ml胰島素。 [00206]將AcE部份溶解於二甲基亞續醯(DMSO)並添加至培養基以達濃度50 gg/ml於分化第〇日，並經過成熟期 _ (第6或7日（D6/7))。當添加新鮮培養基時，亦添加新鮮待測物質。選擇DMSO係因其極性，且因其可與水性細 10 胞培養基溶混。作為陽性控制組，分別添加弓卜朵美辛及曲格列酮，以達到最終濃度5·0及4.4 pg/ml。將已分化D6/D7 3T3-L1細胞以0·36%油紅0號或〇.〇〇i%b〇DIPY染色。分化及以待測物質處理細胞之完整程序，圖式輪廓描繪於圖10。 15 [00207]油紅0號染色-D6/D7-分化3T3_L1細胞之三甘 ί 油酯含量係以油紅0號根據Kasturi及Joshi [Kasturi，R. and

Joshi，V· C· Hormonal regulation of stearoyl coenzyme A desaturase activity and lipogenesis during adipose conversion of 3T3-L1 cells. J Biol Chem, 257: 12224-12230, 20 1982]之方法估計。將單層細胞以PBS (磷酸緩衝生理液，

Mediatech)沖洗，並以10%甲搭固定1〇分鐘。將固定之細胞以含三份0.6%油紅0號/異丙醇原料溶液及二份水之油紅0號作業溶液染色1小時，並以水沖掉多餘染色一次。將形成之染色油小滴以異丙醇自細胞萃取並以分光光 91 200819120 度分析於 540 nm (MEL312e BID-KINETICS READER, Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)計量。待測物質及陽性控制組吲哚美辛與曲格列酮540 nm吸光度之結果，與溶劑控制組呈現強烈對比。 5 [00208] BODIPY 染色-使用 4,4-二氟-1，3,5,7,8-五_甲基 -4-硼_3a，4a-重氮-s-引達省（BODIPY 493/503; Molecular Probes，Eugene, OR)於計量細胞之中性及非極性脂質。簡 ⑩ 而言之，將培養基移除，並將細胞以未滅菌PBS沖洗一次。溶解1 mg BODIPY於1 ml DMSO製作1〇〇〇又 ίο BODIPY/DMSO 原料溶液(1，〇〇〇 BODIPY/ml)。添加 1〇 μΐ原料溶液於990 μΐ PBS以製作有效BODIPY溶液，有效溶液最終BODIPY濃度為〇·〇1 μδ/μ1〇96-孔微量滴定盤，每孔添加有效溶液1〇〇01(1吨6〇〇1?丫）。15 1^11後置於軌道搖晃器（DS_5〇0，VWR科學性製品，south 15 plainfield，NJ)於周圍溫度，將細胞以100 μ1 PBS沖洗， • 隨後添加10〇 W PBS，以閱讀螢光光譜，測定併入細胞之 BODIPY。使用packard光譜螢光量測螢光光譜儀（模型 #BF10000, Meridan，CT)設定於 485 nm 激發及 53〇 nm 發射於計量BODIPY螢光。待測物質、吲哚美辛及曲格列 20 酮之結果報告發現與溶劑控制組螢光具相對性。 [00209]分析所有中性及非極性脂質之BODIPY計量，與 D7之3T3-L1細胞三甘油酯含量之油紅〇號測定量間關係之開-平方分析指出二方法間之顯著相關性ρ<〇〇〇ι且 Odds比例為4.64。 92 200819120 [00210] 統計計异與判讀-鏗定AcE及啼哚美辛之最小值三次並重覆。將溶劑及曲格列酮控制組複製八次並重覆。非極性脂質吸收呈現對溶劑控制組完全分化細胞之非極性脂質堆積之相對性。陽性反應係定義為評估油紅〇號或 BODIPY染色’發現脂質堆積增加大於溶劑控制組相應 95% 信賴區間以上（〇ne-tail，Excel; Microsoft, Redmond， WA)。進一步，AcE可特徵描述為增加脂肪生成率優於或等於曲格列酮陽性控制組，相對於溶劑反應；本評估使用 Excel之學生t-測試功能。 [00211] 結果-陽性控制組吲哚美辛及曲格列酮於3T3-L1 細胞所誘發脂質生成之範圍相似（圖11}。出乎預期地，

AcE所製造產脂性反應大於陽性控制組吲哚美辛及曲格列酮中任何一個。 [00212] 既然於3T3-L1細胞，水性相思樹屬樣本#49〇9萃取物之二甲基亞磺醯_可溶性組成成份展現產脂潛力，表示其可潛在增加具胰島素不敏感症候或症狀之人類或其它動物胰島素敏感度。實施例12 甲基亞磺醯-可溶辟η誘發抗胰母細胞之脂聯素分泌增加 [00213] 模型·於該等實驗使用敘述於實施例^之 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。

Cayman Chemical [00214] 待測物質，曲格列嗣係講自 93 200819120 (Ann Arbor，MI)，而甲基異丁基黃嘌呤、甲基脫氫皮質固醇及胰島素係得自Sigma (St· Louis，MO)。待測物質為暗褐色粉末，其製造自相思樹屬樣本#4909膠樹脂之50:50 (v/v) 7】c/酒精萃取物，且係得自Bayir化學品（No· 68, 5 South Cross Road，Basavanagudi，India)。將萃取物標準化為包含不少於20%類人猿兒茶素。本實施例所使用批號A Catl2304經UV分析測定包含20.8%類人猿兒茶素。青 _ 黴素、鏈黴素、Dulbecco’s經修飾 Eagle’s培養基 (DMEM)係來自 Mediatech (Herndon，VA)，而 10% FBS-HI ίο (胎牛血清-加熱不活化）來自 Mediatech and HyCIone (Logan, UT)。所有其它標準試劑除非另行指定，係購自 Sigma 〇 [00215]細胞培養與處理-以如敘述於實施例1〇之方法計算培養鼠類纖維母細胞細胞系3T3-L1所製造6日分化脂 15 肪母細胞。將3T3-LI細胞播種，96孔盤起始密度lxlO4細 • 胞/cm2。細胞靜置2日以生長達滿盤。滿盤後，添加分化培養基迫使細胞分化為脂肪母細胞；該等培養基包括（1) 10%FBS/DMEM (高葡萄糖）；（2)〇.5mM曱基異丁基黃嘌呤；（3)0·5 μΜ甲基脫氫皮質固醇；及(4)1〇μ§/πι1胰島素 20 (MDI培養基）。第3曰至第5曰時，將該培養基轉為後- 分化培養基，其包括10% FBS/DMEM，含10 pg/ml胰島素。 [00216]使用欽述於 Fasshaiier et al· [Fasshauer，et al. Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 94 200819120 3T3-L1 adipocytes· BBRC 29〇:1084- 1089,（2002)]之修正程序’评估演异相思樹屬對於抗胰島素成熟3T3_U細胞之政應。簡要而έ，於第6日將細胞維持於包含〇·5%牛血清白蛋白（BSA)之無血清培養基三小時，隨後並以工叫 5 胰島素iml加溶劑或胰島素加待測物質處理。將曲格列酮溶解於二甲基亞磺醯並添加以達濃度5、2 5、125及〇 625 pg/m卜於5〇、25、12·5及6.25 pg/ml測試相思樹屬萃取，物。24小時後，將上澄液培養基採樣以進行脂聯素測定。將分化及以待測物質處理細胞之完整程序圖表式輪廓描 10 、纟會於圖12。 [00217]脂聯素鑑定_使用未調整M〇use脂聯素 Q腦tikine® 免疫鑑定套組（R&D syst_，Minneap〇Hs， MN)計量分泌入培養基之脂聯素。製造商所提供資訊指出鼠細胞培養基之脂聯素添加回收率平均為1〇3%，而最小 15 可偵測脂聯素濃度範圍自0.001至0.007 ng/ml。 ’ [00218]計算統計與判讀_所有鑑定均重覆進行一次。為統计分析’计异相思樹屬相對於溶劑控制組，對脂聯素分泌之效應。使用不含多數對照更正之學生測試測定劑量間差異；選擇型態I誤差之名義上之五百分比可能性。 20 [00219]待測物質潛力之估計，使用Hofstee[Hofstee，B ·Η.

Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics. Nature 184.1296- 1298,（1959)]之修正方法以測定明顯米氏常數與最大速率。以獨立變數V/[S]取代{相對性脂聯素分 95 200819120 [濃度]}並以應變數{v}取代成y=mx+b之關係。自y_戴 ^生月日如素分泌}，形最大脂聯素分泌，同時自峰值之^相=於溶劑控制組之最大值之半，所需侧物質濃度。、轉為達脂聯素分泌 [00220]結果-陽性控制組胰島素3T3-U έ 0々，&、7，之所有測試濃度，於抗之最大激菸# 、、田〇 :纟·44倍於溶劑控制組2.5 gg/ml 之取大田放發作用，增進脂聯素分泌（圖13)。濃产= pg相心樹屬/】八則如斜又及辑加脂η八劑控制組均L76與u倍觀家最二κ、。齡濃度之相思樹屬均不及#格列酮所修正Hofstee pi〇ts法得出之最大之脂聯素分泌 15 曰，可比杈性脂聯素分泌相對性增加與達最大激毛作半所需濃度之差異很大。自y_截面所得曲格列酮彳“树屬兒茶隶大脂聯素分泌估計值分別為2.29及1.88 合劑控制組。然而，於抗胰島素3T3-L1細胞達最大素为泌半數值所需濃度，曲格列酮為〇叩如卜相了树f為5·38吨/〇11。以最低類人猿兒茶素含量20%計算，了換#後者相思樹屬為約l.Opg/ml。 [0222]相思樹屬及/或類人猿兒茶素以其於抗胰島素 3J3_L1細胞增進脂聯素分泌之能力為主，可預期對細胞質卩素/辰度文抑制之臨床病理具有正向效應。 96 20 200819120 實施例13 相思樹屬水性萃取物之二甲基亞磺醯-可溶碎片誘發經 TNFa-處理3T3-L1脂肪母細胞之脂聯素分泌增加 [00223] 模型-該等實驗使用敘述於實施例11之3T3-L1 5 鼠類纖維母細胞模型。 [00224] 待測物質-吲哚美辛、曱基異丁基黃嘌呤、甲基，脫氫皮質固醇及胰島素係得自Sigma (St. Louis，MO)。待測物質為暗褐色粉末，其製造自相思樹屬樣本#4909膠樹脂之50:50 (v/v)水/酒精萃取物，且係得自Bayir化學品 ίο (No· 68, South Cross Road，Basavanagudi，India)。將萃取物標準化為包含不少於20%類人猿兒茶素。本實施例所使用批號A Catl2304經UV分析測定包含20.8%類人猿兒茶素。青黴素、鏈黴素、Dulbecco’s經修飾Eagle，s培養基（DMEM)係來自 Mediatech (Herndon，VA)，而 10% I FBS-HI (胎牛金清-加熱不活化）來自Mediatech and

Hyclone (Logan，UT)。所有其它標準試劑除非另行指定，係購自Sigma。 [00225] 細胞培養與處理—以如敘述於實施例1〇之方法計算培養鼠類纖維母細胞細胞系3T3-L1所製造6日分化脂 20 肪母1胞。將3T3_LI細胞播種，96孔盤起始密度二〇4二胞/cm。細胞靜置二日以生長達滿盤。滿盤後，添加分化培養基迫使細胞分化為脂肪母細胞；該等培養基包括 10%FBS/DMEM (高葡萄糖）；（2)〇 5mM甲基異丁美普, 97 200819120 呤；（3) 0·5 μΜ曱基脫氫皮質固醇；及(4)10|Ig/ml胰島素 (MDI培養基）。第3曰至第5曰時，將該培養基轉為後_ 分化培養基，其包括10% FBS/DMEM。第5日時將培養基轉為測试培養基’其包含10、2或〇·5 ng TNFa/ml於10% FBS/DMEM含或不含S卜朵美辛或相思樹屬萃取物。將弓卜朵美辛溶解於二甲基亞罐醯並添加至達到濃度5、2 5、1 25 及0.625 gg/ml。將相思樹屬萃取物測試於5〇、25、12.5

10 15

及6.25 pg/ml。於第6日’將上澄液培養基採樣以進行脂聯素測定。分化及以待測物質處理細胞之完整程序，圖式輪廓描繪於圖14。 [00226] 脂聯素鑑定·分泌入培養基之脂聯素之計量係使用Mouse脂聯素Quantilcine®免疫鑑定套組未經調整 (R&D systems，Minneapolis，MN)。製造商所提供資訊指出 mJ田胞培養基之脂聯素添加回收率平均為1〇3❹、，而最小可偵測脂聯素濃度範圍自〇〇〇1至〇〇〇7 ng/ml。 [00227] 计异統計與判讀_所有鑑定均重覆進行一次。為統计分析，♦朵美辛或相思樹屬兒茶對脂聯素分泌效應均相對於溶劑控制組計算。使用不含多數對照更正之學生^ 測試測定劑量間差異；選擇型態I誤差之名義上之五百分比可能性。 [=]膝TNFt 細㈣彳脂聯素分 / 及29%，相對於溶劑控制組於成熟3T3-L1細胞於 10及2 ng/ml濃度未具明顯效應於脂聯素分泌於ο」 98 20 200819120 =1 (圖15)。於10及2 ng TNFa/mi，令朵美辛增進 =素:加°ln相思樹屬兒茶與啊美辛間脂聯素激毛作用差*於四種遞增劑量分別為14、2Q、32及偶。

10 15

==辛及相思樹屬劑量間相同，該等結果暗示於起生理性濃度™Fa之存在下，3T3-L1細胞中"㈣美辛恢復脂聯素分泌潛力大於相思樹屬中活性物質。μ ' m]以2ngTNFaA相思樹屬處理3t3_li細胞造成脂如素/刀泌增加相對於純TNFa具有顯純㈣〇5)於 25及50 Pg/ml。然而，不似以10 ng TNFa/ml處理 Ϊ ’相思樹屬與啊、美辛間差異較小且未明顯相關於劑里於所有四種測試濃度平均Μ%。觀察口引〇朵美辛、相思樹屬並未恢復溶劑控制組之脂聯素分泌程度。 [〇〇23〇]於〇.5 ng ™Fa/m卜吲哚美辛造成脂聯素分泌劑量依賴顯著減少（1><0.05)於2.5及5 〇 _濃度。有趣地，不似吲哚美辛，於5〇 pg/ml相對於TNFa及溶劑處理 3T3-L1脂肪母細胞，相思樹屬兒茶增加脂聯素分泌。因此，TNFa達到生理層次之濃度，相對於TNFa及溶劑控制組，相思樹屬兒茶增進脂聯素分泌，並驚人地超越吲哚美辛。 [00231]相思樹屬及/或類人猿兒茶素以其增進經TNF.處 99 20 200819120 理3T3-L1細胞脂聯素分泌之能力為主，可預期對TNFa 層次提升及細胞質脂聯素濃度受抑制之臨床病理具有正向效應。實施例14 5 备種商業性相思樹屬樣本於3T3-L1脂肪母增加脂皙峰成

[00232]板型-該等貫驗使用敛述於實施例11之3T3-LI B 鼠類纖維母細胞模型。所有使用化學品及程序均敘述於實施例11，除一例外：僅演算油紅0號鑑定以評估相思樹 ίο 屬兒茶誘發之細胞三甘油酯含量。相思樹屬兒茶樣本 #5669 係得自天然 Remedies (364，2nd Floor, 16th Main， 4th T 阻擋 Bangalore，Karnataka 560041 India);且樣本 #4909、#5667 及#5668 係得自 Bayir 化學品（No. 10, Doddanna Industrial Estate，Penya II Stage, Bangalore， 15 560091 Karnataka, India)。阿拉伯金合歡樣本 #5639、#5640 藝及#5659 係購買自 KDN-Vita International，Inc· (121 Stryker Lane，單位 4& 6Hillsborough，NJ 08844)。樣本 #5640 係敛述為皮、樣本#5667為膠樹脂’而樣本#5669為心木粉末。所有其它樣本除非另行指出’係指專屬相思樹屬 2〇兒茶皮曱醇萃取物。 [002331結果-所有檢驗之相思樹屬樣本均造成正向產脂反應（圖16)。最南產脂反應為樣本#5669之心木粉末 (1.27) > #5659 甲醇萃取物（1.31)、#5640 DMSO 萃取物 100 200819120 (1.29)抓(1#4909 甲醇萃取物（131)。 [00234] 本實施例進一步展現存在於相思樹屬兒茶之許多化合物足以正向調控脂肪母細胞生理支持增加之胰島素作用。山’、實施例15 备種—商-業性相思樹_屬兔毛|加TNFa-3T3-Ll曼細胞鱼崖-1旨聯素分泌 [00235] 模型-該等實驗使用敘述於實施例n之鼠類纖維母細胞模型。如記錄於實施例n及13演算標準化學品使用及細胞之處理。然而，以TNFa處理3T3_L1脂肪母細胞不同於實施例12，細胞僅曝露於2或1〇 ng TNFa/ml。於第6日，將上澄液培養基採樣以進行脂聯素測定，細節如實施例12。相思樹屬樣本#4909, #5639, #5659, #5667, #5668, #5640及#5669之配方敘述於實施例13。 [00236] 結果_ 2 ng/ml TNFa相較於溶劑控制組降低 3T3_L1脂肪母細胞之脂聯素分泌27%，TNFa溶劑控制組由1·25 吲哚美辛/ml最大化提升u%脂聯素分泌 (表12)。僅相思樹屬配方#5559未能於四種測試劑量中任一項增加脂聯素分泌。所有其它相思樹屬配方，造成相對最大增加脂聯素分泌1〇至15%。然而，各種相思樹屬配方誘發最大脂聯素分泌濃度可見差異。最強力之配方係#5640 ’最大之脂聯素激發作用達成於12·5 pg/m卜隨後 #4909 及#56沾於 25 Vg/ml 最後#5639, #5667 及#5669 於 101 200819120 50 μ§/ιη1 ° 表12 樹屬配方於2 存在下諉發3T3-L1脂肪母細胞大脂聯素分泌待测物質濃度【pg/ml] 脂聯素指標f 2 ng TNFa/ml± 95% Cl - 1.00 ±0.05 溶劑控制組 - 1.27* 吲哚美辛 1.25 1.11* 相思樹屬兒茶#4909皮（曱醇萃取物） 25.0 1，15* 阿拉伯金合歡#5639心木（DMSO萃取物） 50.0 1.14* 拉伯金合歡#5659皮（甲醇萃取物） 25 1.02 相思樹屬兒茶#5667皮（曱醇萃取物） 50.0 1.10* 土！樹屬兒茶 #5668 (Gum resin) 25.0 1·15* 伯金合歡#5640皮(DMSO萃取物） 12.5 1.14* 樹屬兒茶#5669心木粉末(DMSO萃取物） 50.0 1.14* t脂聯素指標=[脂聯素]測試/[脂聯素]TNFa控制組 *顯著多於TNFot溶劑反應(p<〇.〇5)。 [00237] 10 ng/ml TNFa減低3T3_L1脂肪母細胞之脂聯素分泌低於溶劑控制組54%，而脂聯素分泌由5 〇μ§巧丨嘴美辛/ml最大提升67%高於TNFa溶劑控制組(表13)。曲格列酮最大增加脂聯素分泌51%於最低測試劑量 Hg/ml。相思樹屬配方#5 5 5 9 25 pg/ml造成最低顯著性增加 (Ρ<0·05)之12%。所有其它相思樹屬配方均造成脂聯^分 102 200819120 泌最大增加於50 pg/ml範圍自17至41%。最強力配方為#4909及#5669，分別增加脂聯素分泌超出 TNFA溶劑控制組41及40%。表13 毛種相邊|塞方於10 ng TNFa/ml存在下諉發3T3-L1 龜殷母細胞相對性最大脂聯素分泌待測物質濃度丨pg/mlj 月旨聯素指標t 10 ng TNFa/ml土 95% CI - 1.00 土 0.10 溶劑控制組 - L54* 吲哚美辛 5.0 1.67* 曲格列酮 0.625 1.51* 一相思樹j兒茶#4909皮(甲醇萃取物） 50 1.41 * j可拉伯^合歡#5639心木(DMSO萃取物） 50 1.26* 阿拉伯全合歡#5659皮(甲醇萃取物） 25 1.12* j目思掏j兒茶#5667皮(曱醇萃取物） 50 1.26* 兒茶#5668 (膠樹脂） 50 130* 合歡#5640皮(DMSO萃取物） 50 1.17* 茶#5669心木粉末(DMSO萃取物） 50 1.40* t脂聯素指標=[脂聯素]測試/[脂聯素]TNFa控制組 *顯著多於TNFa溶劑反應(p<〇.〇5)。 [00238]不同樣本或相思樹屬配方於代謝症候群之第二模型所誘發相似反應，進一步展現相思樹屬多數化合物之存在足以正向調整脂肪母細胞生理支持性增加之膜島素作 103 200819120 用。實施例16 "劑萃取必合物於增加脂聯素分泌 5

10 [0023^9]核型、亥等貫驗使用敘述於實施例η之3T3_li 鼠類纖維母細胞模型。如記錄於實施Wu及i3使用標準化學品。3^3_ L1脂肪母細胞如敘述於實施例13以ι〇 ng™=n於第6日鑑定上澄液培養基之脂聯素，細卽如貫施例13。 [_]待=質-大片相思樹屬兒茶樣本#5 (每片5-10克間）接受以5/S”金屬鑽以標孔。收集木刨片入研缽，並於液體n2 〇鑽緻粉末。隨後將該粉末濾經250微米濟H 之細敏自由流動粉末。 ^场得約心

表14 3T3-L1 茶^」萃取溶劑一__---- 百分比 16 胃液 11 二甲基亞磺醢 40 27 氣仿 0.2 曱醇/水pHd#·5 20 0.13 13 水 10 6.7 乙酸乙酯_____ 4 __2.7 104 200819120 月/夜抑包括2.90gNaCI、7.0ml濃縮、水性HC1、3.2g胃液素（800-2500 活1生單位^mg)以水稀釋為1〇〇〇地。最終pH為丨2。為該萃取，將胃液于液保持於4〇°C 一小時隨後於真空中移除胃液。所剩殘餘物隨後浴解於MeOH，濾經〇·45微米打即過滤注射器並於真空中濃縮。 [00241]將該粉末分配入六個玻璃琥珀藥水瓶（l5〇mg/藥水瓶）並於4(TC以列於表14之溶劑萃取約1〇 hr。該萃取後，將心木7溶劑懸浮液接受離心（5800 X g，10 mm·)。將之上澄液碎片濾經0.45微米PTFE過濾注射器進入分離之號轴玻璃藥水瓶。所該等樣本於真空中濃縮。如見 ;表，自相思樹屬兒茶心木萃取最多物質，而氯仿萃取最少。所有萃取物樣本測試於50、25、12.5及6.25 pg/ml 〇 [〇〇242]所獲得鹽酸吡格列酮，為自Actos⑧(Takeda Pharmaceuticals，Lincoinshire，IL)商業取得之 45 mg 鹽酸吡格列酮藥片。將藥片研磨為細緻粉末並測試於5力、 2·5、1.25及〇·625μ§鹽酸吡格列酮/m卜將吲哚美辛亦包括為額外之陽性控制組。 [00243]、、、α果_ g性控制組鹽酸吼格列酮及巧卜朵美辛，於 TNFa之存在下，均增加脂肪母細胞之脂聯素分泌，分別為115及94% (圖17)。鹽酸吡格列酮及吲哚美辛之最佳濃度刀別+為1.25 and 2·5 pg/m卜所有相思樹屬兒茶樣本 =669萃取物，相對於經ΤΝρα處理者均增加脂聯素分泌。萃取，之中，DMSO萃取物為脂聯素分泌最強力誘導劑，所見取大活性於6.25Mg萃取物/m卜該結果可因DMS〇i 105 200819120 能力萃取大·之不同極性物質。圖17之檢驗指出水萃取物（極性化合物）及氣仿萃取物（非極性化合物）於 TNFCJ3T3-L1脂肪母細胞模型増加脂聯素分泌，其能力相似。觀諸該料取物，不似包含相似化合物。本實施例， 5

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示範溶劑萃取於原發炎性刺激物之存在下，足以增加脂肪母細胞脂聯素分泌之相思樹屬兒茶心木化合物，鑑別極性之能力。實施例17 i^MA_mitA^£^^TNFa/3T3_L1 脂肪聯素分泌 [00244]模型-5亥等貫驗使用敘述於實施例η之mL1 鼠類纖維母細胞模型。如記錄於實施W η及i3使用標準化子π口。3Τ3- L1脂肪母細胞如敘述於實施例13以1〇 ng^NFa/ml處理。於第6日鑑定上澄液培養基之脂聯素，細卽如實施例13。 ·相思樹屬兒茶樣本#5669根據以下 ^田萃取·、添加驗性異丙基酒精溶液（l%(v/v)1.5NNa〇H m兴丙醇，)約50 mg於乾相思樹屬兒茶心木粉末#5669於 50’mi之試管。隨後將樣本簡單混合，音波振動3〇分鐘旅 ^ 一小時使所制體物f成小粒。隨制上澄液滤經之微米濾、、、、氏。所使用驗性異丙醇阳值為8 〇，而所收二夜，pH值為7·0。將清澈之過濾液體部份於真空中乾、卞』路為白色固體。該樣本之術語為乾燥驗性萃取物。 106 20 200819120 [00246]所剩餘小 10% HC1於里丙^ 性異丙基酒精溶液（1% (V/V) 小粒物質充份散布於溶液。將該樣本混合直至度縮小剩餘固體。淡離心3〇分鐘’以再紅褐色沉㈣二^且發2高樣本PH值至”時，得出紅褐色固體^ 沉㈣收集並乾燥，

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以移除任何·澄祕體再度濾經G.45微米濾紙乾_成㈣、ΓΓ 絲義深黃色。將該剩餘液體二種^夕D \樣本，而其術語為乾燥酸性萃取物。該 ϋ之回收¥列於表15。將所有待測物質敎於％、 .5及6.25 μ§/ϊη1，而將鹽酸吡格列酮陽性控制組測式於表15 —木粉末回收之待測物質待測物質屬兒茶樣本#5669) 乾無驗性萃取物 0.9 〔1.8) 乾燥沉澱物 --------- V >/ 12 (2.4) 萃取物 1.5 (3.0) [00247]結果··相對於溶劑控制組，丁NFa降低脂聯素分泌 46%。鹽酸吡格列_對脂聯素分泌最大之恢復為TNFa處理之〗·47倍，見於丨·25 Pg/ml (表16)。待測物質中，僅乾燥沉澱物未能增加脂聯素分泌顯著高於僅1^1?(1控制組。 107 200819120 酸性卒取物及心木叙末(起動铋♦ .^ ^ ^ v 勒材枓）係相似於其於TNFa之存在下增加脂聯素分泌之能六』’而驗性萃取物增加脂聯辛分泌僅於最高㈣5〇ng/ml。 u 表16 5 待測物質

濃度[pg/ml】脂聯素指標卞 DMSO控制組 1.86

TNFa±95%CI 1.00±0.11tt

相思樹屬兒茶樣本#5669心木粉太乾燥驗性萃取物乾燥沉澱物乾燥酸性萃取物鹽酸吼格列酮 6.25 L14 50 L19 6.25 6.25 1.25 1.09 L16 1.47 t脂聯素指標=[脂聯素]測試/[脂聯素]TNFoi控制組 t卞值>1·11為顯著性不同（ρ<〇·〇5)於TNFa控制組實施例18 水性萃取物之二甲基亞磺醯-可溶砗>{於經 TNFa_7·處建一3T3-L1脂肪母細胞減少白細胞介素_6分泌 [00248]白細胞介素_6 (IL-6)為多功能細胞分裂素，於宿主防禦、急性期反應、免疫性反應、神經細胞功能、造血作用及代謝症候群扮演重要角色。其表現為各種正常及變形 108 10 200819120 之淋巴及非淋巴細胞諸如脂肪母細胞。IL_6製造受多種訊號向上-調整，諸如有絲分裂誘致或抗原激發作用、酯多醣、鈣離子電泳、細胞介素及病毒[Hibi，M.，Nakajima，K.， Hirano T. IL-6 cytokine family and signal transduction · a model of the cytokine system. J Mol Med. 74(1):1-12, (Jan 1996)]。其血清層次之提升，可見於某些病理狀態，包括細菌及病毒感染、創傷、自體免疫疾病、惡性腫瘤及代謝症候群[Amer· P· Insulin resistance in type 2 diabetes —role of the adipokine· Cuff Mol Med.;5(3):333-9,（May 2005)]。 [00249] 模型-該等實驗使用敘述於實施例，n之3T3-L1 鼠類纖維母細胞模型。如記錄於實施例11及13使用標準化學品。3T3- L1脂肪母細胞如敘述於實施例13以1〇 ng TNFa/ml處理。於第6曰鑑定上澄液培養基之脂聯素，細節如實施例13。 [00250] 待測物質-吲哚美辛、曱基異丁基黃嘌呤、曱基脫氫皮質固醇及胰島素係得自Sigma (St· Louis，MO)。待測物質為暗褐色粉末，其製造自相思樹屬樣本#4909膠樹脂之50:50 (v/v)水/酒精萃取物，且係得自丑3>^1*化學品 (No· 68, South Cross Road，Basavanagudi，India)。將萃取物標準化為包含不少於20%類人猿兒茶素。本實施例所使用批號A Catl2304經UV分析測定包含20.8%類人猿兒茶素。青黴素、鏈黴素、Dulbecco’s經修飾Eagle’s培養基（DMEM)係來自 Mediatech (Herndon，VA)，而 10% FBS-HI (胎牛血清-力口熱不活化）來自Mediated! and 109 200819120

Hyclone (Logan，UT)。所有其它標準試劑除非另行指定，係購自Sigma。 5

10

[00251] 白細胞介素-6鑑定-分泌入培養基之IL-6之計量，使用Quantikine⑧Mouse IL_6免疫鏗定套組未經調整 (R&D systems，Minneapolis，MN)。製造商所提供資訊指出鼠細胞培養基之IL-6添加回收率平均為99%，1:2稀釋，而最小可偵測IL-6濃度範圍自1.3至1.8 pg/mi。所有上澄液培養基樣本均未經稀釋鑑定。 [00252] 計算統計與判讀-所有鑑定均重覆進行一次。為統計分析，計算相思樹屬相對於溶劑控制組，對脂聯素或 IL-6分泌之效應。使用不含多數對照更正之定劑量間差異；選擇型態」誤差之名義上之五百分 =0253]結果·先前實施例所見，TNFa急遽地降低脂聯素刀泌而吲^木美辛及相思樹屬兒茶萃取物於TNFa之存在分泌。雖刪⑽性控制組及相思樹屬兒 (表:7= 見於不，™Fa二甲基亞磺醯控制組者分泌潛在目^萃取祕™Fa之存在下展現對1L-6 發炎效應。Θ里相關抑制作用，然而吲哚美辛未展現抗- ^月^^^丨賴辛及相糊兒茶萃取物，抗-發炎 “素與原發紐IL_6之比例，形成完美之劑量_相關 110 20 200819120 相對性抗發炎活性增加。表17 於TNFa/3T3_|J_模型，受相思樹屬5^茶樣木糾909誘發，減少之IL-6及增如之疆避素分泌待測物質 Jt 度[pg/ml] 脂聯素指標t IL-6指標卞卞脂聯素/IL_6 DMSO控制組 • 2.87* 0.46* 6.24* TNFa 控制組土95%CI - 1·00 士 0.079 1.00 土 0.08 1·00±0·08 吲哚美辛 5.00 2.69* L10* 2.45* 2.50 2.08* 1.04 2.00* 1.25 1.71* 1.01 1.69* 0.625 1.54* 1.37* 1.12* 相思樹屬兒茶樣本#4909 50.0 L51* 0.27* 555* 25.0 1.19* 0.71* 1·68* 12.5 U3* 0.78* 1.45* 6.25 1.15* 0.93 1.23* 將相心树屬兒荼待測物質或弓卜朵美辛與l〇ng TNFa/ml添加於仍犯丄1脂肪母 =胞。P同日’將上澄液培養基採樣及IL-6測定。所有值係以TNFa控制組為基 t月曰％素h標=[脂聯素]職/[脂聯素] TNFa控制組 10忖IL-6指標=[il-6測試-IL_6控制組}/[IL-6TNF-IL-6控制組] *顯著相異於TNFa控制組p<〇.05)。 111 200819120 [00255]相思樹屬兒茶樣本#4909展現雙重抗-發炎性作用於TNFot/3T3-Ll脂肪母細胞模型。相思樹屬兒茶萃取物組成成份增加脂聯素分泌並減少IL-6分泌。相思樹屬兒茶相對於theTNFa控制組，具通盤強烈抗_發炎效應。該 5 等結果支持相思樹屬兒茶調整脂肪母細胞生理減少抗胰島素現象、體重增加、肥胖症、心血管疾病及癌症之用途。實施例19 ’ 丞隹相思樹屬萃取物之二曱基亞碏醯-可滚碎片對抗胰島素脂肪母細胞H旨聯素、IL-6及抗胰島音激章分泌之效應 10 [⑽256]模型-該等實驗使用敘述於實施例η之3T3-L1 鼠類纖維母細胞模型。如記錄於實施例11及12使用標準化學品及統計方法。IL-6之鑑定如敘述於實施例18。 [00257]抗胰島素激素鑑定·分泌入培養基抗胰島素激素之計量使用Quantikine⑧Mouse抗胰島素激素免疫鑑定套祕組未經調整(R&D systems，Minneapolis，MN)。製造商所提供資訊指出鼠細胞培養基之抗騰島素激素添加回收率平均為99%，1:2稀釋，而最小可偵測抗胰島素激素濃度範圍自L3至1.8gg/ml。所有上澄液培養基樣本於鑑定前以製造商供應之稀釋培養基稀釋為1:2〇。 20 [00258]計算統計與判讀-所有鑑定均重覆進行一次。為統计分析’計异相思樹屬相對於溶劑控制組，對脂聯素或 IL-6分泌之效應。使用不含多數對照更正之學生測試測疋齊彳畺間差異，選擇型悲I誤差之名義上之五百分比可能 112 200819120 性。 [00259] 結果-曲格列嗣及相思樹屬樣本#49〇9於高濃度胰島素之存在下以劑量_相關方式增加脂聯素分泌（表 18)。相思樹屬兒茶僅於6·25 μ§/ιη1濃度經由減少IL_6展 5 示抗-發炎效應，曲格列酮係於5.00及1.25 pg/ml濃度原發炎性，於其它二種濃度未見效應。曲格列酮以劑量-依賴方式，造成抗胰島素激素分泌增加；然而，相思樹屬兒茶 • 減少抗胰島素激素亦以劑量_依賴方式表現。 [00260] 見於貫施例18，相思樹屬兒茶樣本#4909於高 1〇胰島素血症/3T3_L1脂肪母細胞模型再度展現雙重抗-發炎性作用。相思樹屬兒茶萃取物之組成成份增加脂聯素分泌，同時減少IL-6分泌。因此，相思樹屬兒茶相對於高胰島素控制組之通盤效應係抗-發炎性。相思樹屬兒茶，: 南胰島素濃度存在下對抗胰島素激素分泌效應係對比於 15 曲格列酮者：曲格列酮增加抗胰島素激素表現，相思樹屬肇兒茶進一步減少抗胰島素激素表現。該等數據暗示複人相思樹屬兒茶萃取物並非經由PPARy受體作用。令亥等纟士果提供進一步支持相思樹屬兒茶調整脂肪母細胞生理減少抗胰島素現象、體重增加、肥胖症、心血管疾病及癌症^ 20 用途。表18 相思^屬兒茶萃取物盆拉AA素 IL-6及选廬Afc敫素分％之效應、 113 200819120

--- --0.93 抗胰島素激素费標忖卞 166 nM 3T3-L1 有值係以僅胰島綠及脂聯素、IL_6及抗胰島素激素測定。所丨脂聯素指標,聯素]測試/[脂聯素]·控制組 1*tIL-6 扣軚=[il-6 測試-IL-6 控制組}/[il-6TNF-IL-6 控制組] ttt抗胰島素激素指標[抗月夷島素激素測試]/[抗胰島素激素騰_組] *指j票值代表以平均± 95%信麵間自變動分析之殘餘平均平方計算於或少於胰島素控制組± 95°/〇CI為顯著不同，ρ<0·05。實施例20 赶生直趁廬物化學物質造成脂肪母細胞脂皙 [00261]模型-該等實驗使用敘述於實施例η之3T3_u 114 200819120 鼠類纖維母細胞模型。如記錄於實施例11使用標準化學品及統計方法。 [00262]待測物質-使用於本測試之蛇麻子類植物化學物質係敘述於表19,且取自Betatech蛇麻子類製品 5 (Washington，D.C·，U.S.A.)。表19 蛇麻子類待測物t之紇遂蛇麻子類待測物質敘述阿伐酸溶液體積82%阿伐酸/2.7%貝他酸/2.95%異阿伐酸。阿伐酸包括蛇麻草酮、附蛇麻草酮及類蛇麻草酮。 Rho異阿伐酸（RIAA) Rho-異蛇麻草酮、rho-異附蛇麻草酮及 rho異類蛇麻草酮。異阿伐酸（IAA) 體積25.3%異阿伐酸。包括順與逆異蛇麻草酮、順與逆異附蛇麻草酮及順與逆異類蛇麻草酮。四氫異阿伐酸（THIAA) 複合體蛇麻子類-8.9% THIAA以體積。包括順與逆四氫-異蛇麻草酮、順與逆四氫-異附蛇麻葫酮及順與逆四氫-異類蛇麻草酮。六氫異阿伐酸（FIHIAA) 體積 3.9% THIAA; 4.4% HHIAA。HHIAA 異構物包括六氫-異蛇麻草酮、六氫-異附 115 200819120 蛇麻草酮及六氫-異類蛇麻草酮。貝他酸溶液體積10%貝他酸；<2%阿伐酸。貝他酸包括蛇麻蘆酮、附蛇麻蘆酮、附蛇麻蘆酮及前蛇麻蘆酮。黃腐醇（XN) >80%黃腐醇以重量計。包括黃腐醇、黃腐醇A、黃腐醇B、黃腐醇C、黃腐醇 D、黃腐醇E、黃腐醇G、黃腐醇Η、去曱基黃腐醇、黃原酸自乳鯨脂醇、4’-0-甲基黃腐醇，3’ -香葉酯類黃酮柚皮素、 3’，5 6二異戊烯基類黃酮柚皮素、5’-異戊烯基黃腐醇、黃素卡文、ab-二氫黃腐醇及異去氳環黃腐醇水合物。失效蛇麻子類黃腐醇、黃腐醇A、黃腐醇B，黃腐醇 C、黃腐醇D、黃腐醇E、黃腐醇G、黃腐醇Η、逆-氫氧黃腐醇、1,2-二氫氧黃腐醇C、去甲基黃腐醇Β、去甲基黃腐醇 J、黃腐醇I、去甲基黃腐醇、異黃腐醇、 ab-二氫黃腐醇、二異戊烯基黃腐醇、5’-氫氧黃腐醇、5’ -異戊烯基黃腐醇，6,8-二異戊烯基柚皮素、8-異戊烯基柚皮素、6-異戊稀基柚皮素、異黃腐醇、蘀草靈酮、附#草靈酮、4- 氫氧苯曱醛及谷甾醇比喃葡萄糖苷。六氫附蛇麻蘆酮六氫附蛇麻蘆酮於KOH體積1% 116 200819120 [00263]細胞培養與處理〜將蛇麻子類化合物溶解於二甲基亞磺醯（DMSO)並添加以達到濃度1〇、5、4或2 盹/ml於分化第〇曰，並維持經過成熟期（第6或7曰）。將失效蛇麻子類測試於50 μ§/πι1。一經添加新鮮培養基， 5 亦將新鮮待測物質添加。選擇DMSO以其極性及其可溶混於水性細胞培養基。作為陽性控制組，將吲哚美辛及曲格列酮为別添加以達隶終浪度5·〇及4.4 pg/ml。將分化D6/D7 _ 3T3-L1細胞以0.36%油紅〇號或o.oop/oBodjpy染色。 [00264] 結果-陽性控制組,嘴美辛及曲格列酮於3T3-L1 1〇細胞誘發脂質生成程度相似（圖18)。出乎預期地，四種蛇麻子類於3T3-L1脂肪母細胞製造產脂反應大於陽性控制組吲哚美辛及曲格列酮。該四種包括異阿伐酸、Rh〇_異阿伐酸、四氫異阿伐酸及六氫異阿伐酸類。本發現驚人地呼應出版報告，個別性異蛇麻草酮與PPARy結合，約強力 15 PPARy促效劑鹽酸吡格列酮之1/3至1/4 [Yajima，H·，翁 Ikeshima，E·，Shiraki，M·，Kanaya，T·，Fujiwara，D·，Odai，H·，

Tsuboyama-Kasaoka，N·，Ezaki，O.，Oikawa，S·，and Kondo, K. Isohumulones, bitter acids derived from hops, activate both peroxisome proliferator-activated receptor alpha and 20 gamma and reduce insulin resistance. J Biol Chem, 279: 33456-33462, (2004)] 〇 [00265] 將黃腐醇、阿伐酸及貝他酸之產脂性反應可比朵美辛及曲格列酮，而失效蛇麻子類及六氫附蛇麻蘆酮未能誘發大於溶劑控制組之產脂反應。 117 200819120 [00266]本研究之正向蛇麻子類植物化學物質種類，以其於3T3-L1細胞之產脂性潛力為主，包括異聚合阿伐酸: 阿伐酸及貝他酸以及黃腐醇，可預期增加胰島素敏感度炎減少具對胰島素不敏感之症候或症狀之人類或其它動物 5 體内之血清三甘油酯。實施例21 蛇麻子類植物化學物質於抗胰島素3T3-L1脂肪

10 15

增加脂聯素 [00267]模型-該等實驗使用敘述於實施例η及12之 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。標準化學品、蛇麻子類化合物RIAA、ΙΑΑ、THIAA、ΗΗΙΑΑ、黃腐醇、六氫附蛇麻蘆酮、失效蛇麻子類分別敘述於實施例12及20。 [00268]細胞培養與處理—將細胞培養如敘述於實施例 12並以蛇麻子類植物化學物質處理如先前敘述。脂聯素鏗定及統計判讀如敘述於實施例12。待測物質之潛力估計，係使用Hofstee測定明顯米氏常數及最大速率之修正方法。以獨立變數v/[s]取代{相對性脂聯素分泌/[濃度並以應變數{v}取代{相對性脂聯素分泌}，形成之關係。自y_—估計減於溶触制組之最大脂八泌’同時自峰值之負值計算為達脂聯素分泌最大值之^ 所需待測物質濃度。 f ’ [00269]、纟。果-陽性控制組曲格列酮於抗胰島素π 細胞最大增進脂聯素分泌超過溶劑控制組2•料倍於2 5 118 20 200819120 10

gg/ml (圖19)。所有所測試蛇麻子類植物化學物質相對於溶劑控制組，展現增進脂聯素分泌，其中異阿伐酸製造顯著多於曲格列酮之脂聯素分泌（2.97倍相對於控制組）。四種測試劑量中，最大之脂聯素分泌見於5 pg/ml、最高劑量，於異阿伐酸、Rho異阿伐酸、六氫異阿伐酸及四氫異阿伐酸。貫腐醇、失效蛇麻子類及六氫附蛇麻蘆顯1之最大可見脂聯素分泌增加分別見於1.25、25及12.5pg/ml。可見最大之相對性脂聯素表現，黃腐醇、！^^異阿伐酸及失效蛇麻子類可比於曲格列酮，而六氫異阿伐酸、六氫附蛇麻蘆酮及四氬異阿伐酸少於曲格列酮，惟大於控制組。 ’ 表20 自一iiofsteeplots之及峰值最大脂聯素分泌及待測物 i.分別達取大么屋聯素分泌之丰必零濃度估計隻待測物質異阿伐酸黃腐醇最大脂聯素分泌⑴待測物質於最大分泌之半制組倍數]__[μ§/πιΙ1]_ 3.17 2.47 0.49 0.037

Rh〇-異阿伐酸曲格列酮[2] 2.38 2.29 0.10 0.085 失效蛇麻子類六氫異阿伐酸[2] 六氫附蛇麻蘆酮[2] 2.21 0.092 1.83 四氫異阿伐酸 2.8 1.89 3.2 1.60 0.11 15 200819120 [00270] 如見於表20，自經修飾Hofstee plots最大脂聯素分泌估計值（圖20)支持上述觀察。最大脂聯素分泌y-截面估計值粗略區別為三組··（1)異阿伐酸、（2)黃腐醇、Rho 異阿伐酸、曲格列酮及失效蛇麻子類及(3)六氫異阿伐酸、 5 六氫附蛇麻蘆酮及四氳異阿伐酸。激發作用所需於抗胰島素3T3-L1細胞達最大脂聯素分泌半數值之待測物質濃度，約0.1 gg/ml，曲格列酮、Rh〇異阿伐酸、四氫異阿 _ 伐酸及六氫異阿伐酸彼此相似。異阿伐酸最大脂聯素分泌半數值濃度於0.49 pg/ml近5倍大。黃腐醇展示最大脂聯 ίο 素分泌半數值之最低劑量，估計於〇·〇37 pg/ml。可見失效蛇麻子類及六氳附蛇麻蘆酮估計最大脂聯素分泌半數值最高濃度，分別為2.8及3.2 pg/ml。 [00271] 正向蛇麻子類植物化學物質種類見於本研究，以其增進於抗胰島素3T3-L1細胞脂聯素分泌能力為主，異 15 阿伐酸、異阿伐酸、四氫異阿伐酸、六氫異阿伐酸、 φ 黃腐醇、失效蛇麻子類及六氫附蛇麻蘆酮，可預期對所有細胞質脂聯素濃度受抑制之臨床病理均具有正向效應。實施例22 蛇麻子皇員_植應也曼後經由於抗胰島音脂肪母細胞 20 制白細胞介素-6合泌，展示抗發炎活性 [00272] 模型-該等實驗使用敘述於實施例u之 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。脂聯素及几巧之鑑定分別如貫施例12及18敘述。標準化學品、蛇麻子類化合物 120 200819120 RIAA、ΙΑΑ、THIAA、HHIAA、黃腐醇、六氫附蛇麻蘆_、失效蛇麻子類分別敘述於實施例12及20。 [00273]計算統計與判讀-所有鏗定均重覆進行一次。為統計分析，計算蛇麻子類衍生物相對於溶劑控制組，對於 5 聯素或IL-6分泌之效應。使用不含多數對照更正之變動分析測定劑量間差異；選擇型態I誤差之名義上之五百分= 可能性。 • [00274]結果-曲格列酮及所有测試之蛇麻子類衍生物於高濃度胰島素之存在下增加脂聯素分泌（表21)。曲格列 ίο 酮於本模型並未減少IL-6分泌。事實上，曲格列_及

HHCI展示^一種辰度’其中IL-6分泌增加，而THIAA及失效蛇麻子類增加IL-6於最高濃度，而於其它濃度不具效應。其它蛇麻子類衍生物對IL-6分泌之效應為一般二相性。於最高測試濃度，RIAA、HHIAA及XN增加iL-6分 15 泌；僅IAA不然。可見RIAA、IAA、THIAA及XN之U ® 分泌顯著減少。表21 虫匕麻子類化合物龙^彳几騰島素3T3 -L1脂肪母纟應對脂聯素細胞介素-6分泌之效鹿待測物質濃度【pg/ml】脂聯素指標t IL-6指標卞卞 Ρ"""""^—— 脂聯素/IL-6 胰島素控制組±95% CI - 1.00±0.30* 1·00 土 0.23 1.00 土 0·30 L—--- 121 200819120

曲格列酮 5.00 1.47# 1.31# 1.12 2.50 2.44# 1.06 2.30# 1.25 1.87# 1.46# 1.28 0.625 2.07# 1.00 2.07# Rho異阿伐酸(RJAA) 5.0 2.42# 1.28# 1.89# 2.5 2.27# 0.83 2.73# L25 2.07# 0.67# 3.09# 0.625 2.09# 0.49# 4.27# 異阿伐酸(IAA) 5.0 2.97# 0.78 3.81# 2.5 2.49# 0.63# 3.95# 1.25 2.44# 0.60# 4.07# 0.625 1.73# 0.46# 3.76# 四氫異阿伐酸(THIAA) 5.0 1.64# L58# 1.04 2.5 1.42# 0.89 L60# 1.25 1.55# 0.94 1.65# 0.625 1.35# 0.80 1.69# 六氫異阿伐酸(HHIAA) 5.0 1.94# L49# 1.30# 2.5 1.53# 0.74# 2.07# 1.25 1.64# 0.67# 2.45# 0.625 1.69# 0.73# 2.32# 122 200819120

黃腐醇(XN) 5.0 2.41# 1.23# 1.96# 2.5 2.11# 0.96 2.20# 1.25 2.50# 0.92 2.72 0.625 229# 0.64# 3.58# 六氫附蛇麻蘆酮(HHCI) 50.0 1.65# 2.77# 0.60# 25.0 1.62# 1.19 1.36# 12.5 1.71# 0.94 1.82# 6.25 1.05 1.00 1.05 失效蛇麻子類 50.0 1.92# 1.58# L22# 25,0 2.17# 0.86 2.52# 12.5 1.84# 1.03 1.79# 6.25 1.46# 1.03 1.42# 將相思樹屬兒茶待測物質或吲哚美辛與166 nM胰島素添加於D5 3T3-L1 脂肪母細胞。隔日，將上澄液培養基採樣及脂聯素、正-6及抗胰島素激素測定。所有值係以僅胰島素控制組為基準。 5 t脂聯素指標=[脂聯素[脂聯素}控· ttIL-6 指標=[lL-6 測試-IL-6 控制組}/[il-6TNF-IL-6 控制組] *指標值代細平均±95% _關自_分析之殘餘平均平謂算。脂聯素或脂聯飢_6，值<0.7 or> 13為顯著相異於騰值<0.77 5戈^3躺著相異於胰島素控制組。、、、而IL-6， #顯著相異於胰島素控制組p<0 05。 123 200819120 [00275] RIAA、IAA HHIA及XN之全面抗-發炎性有效性之單位一一脂聯素/1L-6比例為強烈陽性（>2·〇〇)。 ΤΗΙΑΑ，HHCI及失效蛇麻子類展現陽性，惟較低之脂聯素 /IL-6比例。曲格列酮之脂聯素/IL_6比例混合2.5及〇 625 5 Pg/ml之知烈知性反應及5.0或1·25 pg/ml之無效應。 [00276] 數據暗示，於脂肪母細胞，高胰島素血症之原發炎效應可為蛇麻子類衍生物rIAa、IAA、HHIA、THIAA、瞻 XN、HHCI及失效蛇麻子類減弱。一般說來，高胰島素血症狀態中蛇麻子類衍生物之抗發炎效應，TNFa簡單化之 10 南胰島素血症較曲格列酮一致。貫施例23 里盒土龜光於經TNFa-處理之3T3-L1脂肪母細胞增加脂聯素分泌 [00277] 模型-該等實驗使用敘述於實施例η之 g 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。標準化學品、蛇麻子類化合物RIAA、IAA、ΤΗΙΑΛ、IffllAA、黃腐醇、六氫附蛇麻蘆酮、失效蛇麻子類分別敘述於實施例13及2〇。蛇麻子類衍生物測試於濃度〇·625、1.25、2.5及5·0μ§/πι1。脂聯素鑑定如敘述於實施例12。 20 [⑻278]結果-以10 ng TNFa/ml隔夜處理之第5曰（D5) 3T3_L1脂肪母細胞脂聯素分泌顯著受抑制（圖21)。相對於TNFa/溶劑控制組，所有蛇麻子類衍生物IAA、RIAA、 HHIAA及THIAA均增加脂聯素分泌。可於最高測試濃度 124 200819120 5.0 μ_1見RIAA及HHIAA之線性劑量-反應曲線形成最大之抑制作用。ΙΑΑ誘發之脂聯素最大分泌於125gg/m卜而THIAA於曲線性反應展現脂聯素最大分泌於5〇 pg/ml 〇 5 [GG279]於超生雌™Fa濃度之存在下，域子類街生物；LAA、RIAA、HHIAA及ΤΗΙΑΑ增加脂肪母細胞脂聯素分泌能力，支持該等化合物可用於預防或治療牽鲁脂肪母細胞功能之發炎狀態。、 •實施例24 10 丞1JT3-L1脂肪母包跑丄相思方輿蛇窳子g 同交互作用 [00280] 模型-該等實驗使用敘述於實施例u及13之 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。 [00281] 測试化學品及處理_使用如記錄於實施例“及 • 13之標準化學品。3T3-L1脂肪母細胞於如實施例u分化前，如敘述於實施例12以TNFa處理以計算產脂指標或評估脂聯素指標。如敘述於實施例14，使用相思樹屬兒茶樣本#5669與如先前敘述之蛇麻子類衍生物沿^-異阿伐酸及異阿伐酸。於50、1〇、5 〇及^网編測試相思 20 树屬兒余，以及5:1與1〇:1混合之相思樹屬：RIAA和相思樹屬：IAA。獨立測試RIAA及IAA於5·〇、2·5、1·25及 0.625 pg/ml 〇 [00282] 计异耘序_混合相思樹屬/蛇麻子類之預期產脂反 125 200819120 應及脂聯素分泌估計值以及綜效之測定程序如先前教述。 5

10

[00283] 結果-所有之混合測試展現產脂綜效於—或多種測試濃度（表22)。相思樹屬：riaA混合全面性較相甲行屬：IAA混合具活性，相思樹屬：幻八八[5:1]展現綜效於二二劑量，相思樹屬：RIAA[10:1]於10及5.0pg/mi具協同效力而於任何測試濃度不具拮抗性。相思樹屬：IAA [1〇:1]混人亦協同於二中間劑量而不表現拮抗性。同時相思樹屬〗八八 [5:1]協同於50μ§/πι1濃度，具拮抗性於5·〇μ§/ιη1劑量。 [00284] 以此類推，所有之混合均於一或多測試濃度展現增加脂聯素分泌綜效(表23)。相思樹屬：ΙΑΑ[1〇:1]展示綜效於所有劑量，同時Acaca:RIAA [5··1]及相思樹屬:RIAA [1〇:1] 協同於二種劑置而具拮抗性於一種濃度。相思樹屬·ιαα [5··ι] 混合協同於1·0 pg/ml而具拮抗性於較高之μ§/πι1。表22 相思樹屬·兒茶及蛇麻子類衍生物於抗膝島龛3Τ3-1模型 Δ 斤誘發產脂反應之觀察值及預期信產脂指標卞待測物質濃度丨Kg/mlJ 觀察值預期值結果相思樹屬/RIAAPI]1 50 1.05 0.98 具綜效 10 0.96 0.89 具綜效 5.0 0.93 0.90 具綜效 1.0 0.92 0.89 具綜效 — 126 200819120 相思樹屬/IAA[5:lf 50 1.06 0.98 具綜效 10 0.93 0,95 無效應 5.0 0.90 0.98 结抗 1.0 0.96 0.98 無效應相思樹屬/RIAA[10:1]3 50 0.99 1.03 無效應 10 1.00 0.90 具綜效 5.0 1.00 0.90 具綜效 1.0 0.94 0.89 無效應相思樹屬/IAA[10:1]4 50 1.37 1.29 具綜效 10 1.16 L15 無效應 5.0 1.08 1.09 ：無效應 1.0 L00 0.99 無效應

t產脂指標二[OD]測試/[OD]dmso控制組。 1) 上95%信賴極限為1·〇3而最小顯著差異二〇〇3。 2) 上95%信賴極限為1.03而最小顯著差^ =〇〇3。 3) 上95%信賴極限為1·〇7而最小顯著差異=〇〇7。 4) 上95/)彳s賴極限為1·〇2而最小顯著差異=〇〇2。表23 虹愚樹屬兒余及蛇麻子物於TNFft ㈣料相思樹屬/RIAApi]1 —— r—-- ——-—-_ 指; 票个一 ——— 觀察值預期值結果 1 1.27 ------ 1.08 具綜效待測物質 127 200819120 10 0.99 1.25 相括抗 5.0 L02 0.92 具綜效 1.0 1.19 1.07 具綜效相思樹屬/IAAP1]1 50 1.13 1.16 無效應 10 0.92 1.13 相抬抗 5.0 1.04 1.09 無效應 1.0 1.25 1.13 具綜效相思樹屬/RIAA[10:1]2 50 1.29 1.11 具綜效 10 1.07 0.95 具綜效 5.0 0.94 1.06 相抬抗 L0 L03 0.94 具綜效相思樹屬/IAA[10:1]2 50 1.28 0.82 具綜效 10 1.12 1.07 具綜效 5.0 L11 0.99 具綜效 1.0 1.30 1.05 具綜效卞脂聯素指標[脂聯素]測試/[脂聯素]TNFct控制組 | 1)上95%信賴極限為1.07而最小顯著差異=0.07。 2)上95%信賴極限為1.03而最小顯著差異=0.03 [00285]相思樹屬兒茶與蛇麻子類衍生物Rho異阿伐酸 5 或異阿伐酸混合，對增加脂肪母細胞脂質吸收，及增加脂肪母細胞脂聯素分泌，展現協同混合及僅具些微拮抗性混合。實施例25 蛇麻子類衍生物於酯多醣/3T3-L1脂肪母細胞模型之抗發炎活性 128 200819120 [00286] 模型-該等實驗使用敘述於實施例11及13之 3T3-L1鼠類脂肪母細胞模型。 [00287] 測試化學品及處理-標準化學品如記錄於實施例 11及13。然而，於D5使用100 ng/ml細菌酯多醣（1^>8, 5 Sigma，St· Louis, MO)代替丁NFa。蛇麻子類衍生物 Rh〇- 異阿伐酸及異阿伐酸之使用如敘述於實施例20。非類固醇抗發炎藥劑(NSAID)阿斯匹靈、水揚酸及布洛芬得自 ❿ sigma。使用塞來考昔商業性膠囊配方（CelebrexTM，G.D.

Searle & Co· Chicago, IL)，並將細胞以活性原料含量決定 ίο 投藥劑量。蛇麻子類衍生物、布洛芬及塞來考昔投藥劑量為5·00、2.50、1.25及0.625 pg/ml。弓丨哚美辛、曲格列酮及鹽酸吼格列酮測試於1〇、5 〇、h〇及〇·5〇叫/以。阿斯匹靈7辰度為100、50·0、25.0及12.5 pg/md，而水揚酸濃度為200、100、50·0及25·0 pg/mi。及脂聯素進行鑑定， 15 並以先$敘述於貫施例之方法分析IL-6 (實施例18)及 ⑩ 脂聯素（實施例B)之數據。、 [00288] 結果-於D5脂肪母細胞Lps提供12倍於IL_6 之激發作用。所有測試物質均在不同程度上降低Lps•刺激脂肪母細胞之IL_6分泌。所見最大IL_6抑制作用及最大 20 抑制作用濃度呈現於表24。因於治療時相對變動大，待測物質中最大IL_6抑制作用範圍未產生差異。㈣，其最大抑制作用劑量的確具有可觀差抑㈣㈣力排打為布洛分〉RIAA=IAA>塞來考昔〉鹽酸η比格列晒…㈣美辛〉曲格列酮>阿斯匹攀k 水酸。於之定性之基礎，吲哚 129 200819120 美辛、曲格列_ L比格刺、布洛芬及塞來考，試濃度抑制edIL_6分泌，而RIAA，IAA及^ = 於取低濃度未顯著抑制IL_6(麟未顯*)。風 =0289] D5 3T3_U脂肪母細胞之肥冶療相對於、控制組減少脂聯素分泌（表25)。不似其中所有待 10 15

σ物抑制IL.6分泌至某種程纟，阿斯匹靈、水揚酸及二^考曰未此誘發sLPS_處理之3T3_L1脂肪母細胞脂聯素为泌於任何測試劑量。分別見濃度0.625 卜曲格列酮、RIA A、IA Α及布洛芬之脂聯素激發作用最大，為i 5、、20及22/〇。鹽酸吡格列酮其次，脂聯素激發作用η% 於I.25 Pg/m卜吲哚美辛脂聯素分泌激發作用9%於2.50 Kg/m卜為最小活性待測物質。 [00290]於LPS/3T3_u模型中，蛇麻子類衍生物獻a 及IAA以及布洛芬，於活體内可獲得之濃度，減少IL-6分 j並牦加知聯素分泌。噻唑二酮：曲格列酮及鹽酸吡格列酮之IL-6分泌抑制力較少，所需劑量高於蛇麻子類衍生物隹月曰％素激發作用相似於蛇麻子類衍生物。可見崎哚吴=、阿斯匹靈、布洛芬及塞來考昔等Nsaid，對巨噬細月^模型與對脂肪母細胞模型之抗發炎性活性，無一致關係0 表24

分泌之最大牲κ乍用 130 20 200819120 待測物質濃度[pg/ml】 JL-6指標个 %抑制作用 DMSO控制組 - 0.09* 91* LPS控制組土95%CI - —----- 1·00±〇·3〇 0 ---—_ 吲哚美辛 5,00 .~—·—--0.47* 53*- 曲格列酮 10.0 —*—— 0.31* 69* 鹽酸°比格列酮 5.00 — 0.37* 63* Rho-異阿伐酸 1.25 0.63* 37* 異阿伐酸 1.25 0.61* 39* 阿斯匹靈 25.0 ———__ 0.61* -------— 39* 水揚酸 50.0 ~— 0.52* ------ 48* 布洛芬 0.625 ----- 0.46* 54* 塞來考昔 2.50 '~~~—j 0.39* ------ 61* 添加待測物質伴隨100 ng LPS/ml於D5 3T3-L1脂肪母細胞。隔日，將上澄液培養基採樣以測定IL-6。所有數值均以以下記述lps控制組為基準。所呈現濃度代表提供最大IL-6分泌抑制作用之劍量，而該值少於0.70可視為顯著(ρ，<〇·〇5)少於LPS控制組。 t IL-6 指標=[IL-6 測試-IL-6 控制組]/[IL-6lps - IL-6 控制組] *顯著相異於LPS控制組p<〇.〇5)。表25 迄赢子類衍生物及所選擇NSAID於LPS/3T3-L1脂肪母 |_田』包之最大脂聯素分泌激發作用待測物質濃度【pg/ml】脂聯素指標f %刺激 DMSO控制組 - 1.24 131 200819120

t脂聯素指標=[脂聯素]測試/[脂聯素]LPS控制組 *數值大於1·07為顯著相異於LPS控制組p<〇.〇5)。 NS=未顯著相異於LPS控制組。實施例26 έ 相思槪屬兒莶或蛇麻子類衍生物混合蔓^ TNFa/3T3-l 及13之 [0〇291]模型·該等實驗使用敘述於實施例^ 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。 [00292]測試化學品及處理-使用如記錄於實a 13之標準化學品。將3T3-L1脂肪母細胞如^知；例11及 Π以TNFa刺激以評估脂聯素指標。相田抖，於實施: 相心、树屬兒茶樣本

#5669如敘述於實施例14，蛇麻子類街生物Rh〇_異阿找酸及黃腐醇如敘述於實施例20及薑黃素如MetagejiicS 132 200819120 (Gig Harbor，WA)提供使用於該等實驗。相思樹屬兒茶及 5:1混合之相思樹屬：薑黃素及相思樹屬：黃腐醇測試於 50、10、5.0及1.0pg/m卜RIAA及1:1混合薑黃素及χΝ 測試於 10、5、1·0 及 0·50 pg/ml。 5 [00293]计异程序-估計該等混合之預期脂聯素指標並測定綜效如先前敘述。 [00294] 結果-TNFa相較於純溶劑控制組，降低脂聯素分 • 泌約百分之50。陽性控制組鹽酸ϋ比格列酮增加脂聯素分泌百分之80 (表26)。混合相思樹屬與薑黃素或χΝ證明於 ίο 較高濃度具拮抗性而於較低濃度具協同性。相似地，riaa 及薑黃素具拮抗性於三種較高劑量，惟高度協同於最低劑量l.Opg/m卜二種蛇麻子類衍生物RIAA及ΧΝ未展現綜效於TNFa-刺激3T3-L1細胞之脂聯素分泌。 [00295] 經TNFa-處理之3T3-L1脂肪母細胞中，相思樹屬 15 及RIAA均協同增加脂聯素分泌，而僅相思樹屬展現與χΝ B 之綜效。表26 相思樹屬兒荼及蛇窳子類衍生物混合薑黃素或黃腐 TNFa/3T3-l模却之綜效待測物質濃度丨pg/ml】觀察預期判讀 DM50控制組 - 2.07 - TNFa±95% CI - 1.0 土 0.049 - ------— -—---- 133 20 200819120 鹽酸咕格列酮 1.0 1.8 - 喝相思樹屬/薑黃素[5:1]1 50 0.56 0.94 拮抗性 10 1.01 1.07 枯抗性 5.0 1.19 1.02 綜效 L0 1.22 1.16 綜效相思樹屬/XN [5:1]1 50 0.54 0.85 拮抗性 10 0.95 1.06 拮抗性 5.0 0.97 1.01 抬抗性 1.0 1.26 1.15 综效 RIAA/薑黃素[1:1]1 50 0.46 0.79 括抗性 10 1.03 1.11 拮抗性- 5,0 1.12 1.28 枯抗性 1.0 1.30 L08 綜效 RIAA/XNC1:!]1 50 031 0.63 拮抗性 10 0.81 1.06 拮抗性 5.0 1.09 1.25 拮抗性 1.0 1.09 1.06 No效應了脂聯素指標二[月旨聯素]測W[脂聯素]TNFa控制組 1) 95%信賴極限為0.961至1.049而最小顯著差異=0.049。 134 200819120 實施例27

复塗ΧίΑΙ厄亞麻油酸混合蛇麻子類衍生物Rho-異阿I 3T3-L1脂肪母細胞模艰之脂皙生成綠旅 [00296] 模型-該等實驗使用敘述於實施例η及13之 5 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。 [00297] 測試化學品及處理-使用標準化學品如記錄於實 I 施例11者。3T3-L1脂肪母細胞於分化前如實施例11處理以運算產脂指標。CIA粉末得自脂質Nutrition (Channahon，IL)並敘述為c9tll及tlOCI2異構物之1:1混 ίο 合物。CIA及CIA:RIAA之5:1混合測試於50、10、5·〇及 1 ·0 pg/ml。RIAA 測試於 1 〇、1 .〇 and 0.1 pg/ml 以如先前敘述計算預期產脂指標。， [00298] 琴果-RIAA混合CIA協同增加三甘油醋含量。可見綜效於所有劑量（表27)。 § [00299] CIA與RIAA間綜效見於大範圍之劑量，而潛在可使用於增加CIA之胰島素致敏潛力。表27 共軛亞廠油酸混合蛇麻子類衍生物Rho-異阿伐酸於抗胰島棄3T3-L1脂嚴母細胞模剷之腊皙生成綜效產脂指; f票卞測試 Materiai 濃度[μδ/ml】觀察值預期值判讀 CIAiRIAAtS:!]1 50 L26 L15 綜效 135 200819120 10 5.0 1.0 JL06 綜效綜效综效 t 產脂指標=[OD]W[OD]dmsc^· 1)上95% “賴極限為1·05而最小顯著差異二0仍實施例28

10

15 蛇麻子盤後物化學物質抑丨ρ ^ TNFa^Jl [00300]模型-該等實驗使用敘述於實施例u之 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。 [00301]細胞培養與處理—將分化3T3_U脂肪母細胞飼養於後-分化培養基另40日。標準化學品、培養基及蛇麻子類化合物RIAA及黃腐醇敘述於實施例13及2〇。蛇麻子類衍生物及陽性控制組鹽酸0比格列酮測試於濃度2·5 及5.0 pg/ml。於1小時之前添加待測物質，並以TNFa處理後3及24小時製備核萃取物。 [00302] ELISA - 3T3-L1脂肪母細胞分化飼養於生長培養基40日。核NF-KBp65之測定使用未調整之Active Motif (Carlsbad, CA)之 Tran5AMTM NP-kB 套組。套組所提供 Jurkat核萃取物係衍生自細胞培養於37Ό補充with 50 ng/ml TPA(phorbol，12-myristate，13 acetate)培養基，並立即以0·5μΜ鈣離子電泳A23187二小時取得。 [00303] 蛋白質鑑定-核蛋白使用活性主題螢光蛋白質 136 20 200819120 計量套組計算。 [〇〇3〇4]統計分析-使用單尾學生w定比較。型態α 差可能性設定於名義上之五百分比。 [〇〇3〇5]結果-ΤΡΑ-處理jUrkat核萃取物展示預期之 5 NF_KBp65增加指出套組試劑之恰當表現（圖22)。D40 3T3-L1脂肪母細胞分別以1〇 % TNFa/ml處理聊22八) 或24小時（圖22B)，增加之核NF_KBp65有21及2·2 么如預期，PPARy促效劑鹽酸吼格列酮，於τ·α處理後並未抑制核NF-KBp65於三或24小時之量。於TNFa ίο 處理—小日錢，於 5·θ 及 2·5 Hg RIAA/ml，NF-KBp65 之核易位分別受抑制9·4及25%。於24小時，僅5〇RIAA/mi 之處理’對NF-KBp65核易位展現顯著（p<〇〇5)之抑制作用。於TNFa處理後三小時，黃腐醇於5 〇及2·5盹/㈤分別抑制NF-kBP65核易位ΐ5·6及6.9% ，於24小時後 15 為 Β.4 及 8.0〇/〇。 [00306] 儘管較小，RIAA及黃腐醇均一致表現NF_KBp65 核易位抑制作用於TNFa處理之成熟抗胰島素脂肪母細月匕本、纟°果不同於欽述於PPARy促效劑者，其於3T3-L1 脂肪母細胞未顯示抑制NF-kBP65核易位。 20 實施例29 萃一取物及二甲雙胍協同性抗胰島素 SX3-L1脂肪母細胞之三甘油醋 [00307] 模型-該等實驗使用敘述於實施例η之 137 200819120 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型敘述於實施例11者。。所有化學品及程序均使用如

10 15 [00308]測式化學品及處理-二曱雙胍細得自⑼· L〇U1S，M〇)。於分化第0日及成熟期（Day6/7)中每二曰，將待測，質添加於二甲基亞賴。將陽性控制組曲格列嗣添加達最終濃度4·4μ§/πι卜二甲雙胍、相思樹屬兒茶樣本 #5669及一甲雙胍/相思樹屬混合(w/w)於別叫待測物質lml測試。將分化之3T3_U細胞以〇 2%油紅〇號染色。將所形成染色油小滴溶解於異丙醇並以53〇 nm分光光度分析计量。結果代表對溶劑控制組，完全分化細胞之相對性三甘油酯含量。 [00309]計算程序-二甲雙胍/相思樹屬兒茶萃取物之預期產脂效應之估計，係使用關係：1/LI = x/Ux +Y/LIy，其中LI-產脂指標，X及γ為每一組成成份於測試混合物之相對性碎片，而χ +；[。若估計LI之平均值落入相應觀察碎片估計值之95°/◦信賴區間外，推估其綜效。該等牽涉其每項組成成份之混合效應比較之综效定義，敘述於 Berenbaum [Berenbaum, M. C. What is synergy? Pharmacol Rev 41(2)，93-141，（1989)] 〇 [00310]結果-相思樹屬兒茶萃取物具高度產脂效應，增加 3T3-L1細胞三甘油酯含量32百分點（圖23)，產生產脂才曰松1.32。產脂指標〇·79之純二曱雙脈不具產脂效應。所見二曱雙胍/相思樹屬兒茶萃取物混合展現產脂指標 138 20 200819120 1·35。預期產脂指標為％之二曱雙胍/相思樹屬兒茶萃取物展現綜效，其所見之產脂指標落入預期值95%上信賴極限外二百分點。 [00311] 1: 1混合之二曱雙胍及相思樹屬兒茶萃取物，以展現於3T3-L1細胞之產脂潛力為主，預期將於臨床使用時產生協同作用。該等混合將有用於增加二甲雙胍治療之正面效益範圍’諸如減少細胞質三甘油酯或延伸二甲雙胍效度期。實施例30 10 免驗室中蛇廚^£息衍生物及噻唑二酮於抗胰島素3TVL1 毋細胞模切之脂皙生成綜效 [00312] 模型-該等實驗使用敘述於實施例11及13之 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。 [00313] 測試化學品及處理-標準化學品之使用方式如記 • 錄於實施例11者。3T3-L1脂肪母細胞於分化前如於實施例11處理以計算產脂指標。曲格列酮係得自Cayman化學品（Chicago，IL)。使用商業性藥片配方（ACTOSE®， Takeda Pharmaceuticals，Lincolnshire, IL)之鹽酸吼格列酮。將藥片搗碎並將全部粉末使用於鑑定。所有結果以活 20 性原料含量計算。所使用蛇麻子類衍生物Rho-異阿伐酸及異阿伐酸如敘述於實施例20。於4·〇μ§/πιΐ測試曲格列酮混合RIAA及ΙΑΑ，而更強力之鹽酸吡格列酮與RIAA 及ΙΑΑ之1:1混合，於2·5 pg/ml測試。所有材料亦獨立 139 200819120 測試於4·0及2·5 pg/ml以計算預期產脂指標，如敘述於實施例34者。 [00314] 結果-以曲格列酮或匹格列酮分別於4·〇及2.5 pg/ml測試時，Rho-異阿伐酸及異阿伐酸與嘆唑二酮於抗膜島素3T3-L1脂肪母細胞模型，協同增加三甘油醋合成 (表 28)。 [00315] 蛇麻子類衍生物Rho-異阿伐酸及異阿伐酸可協同增加噻唑二酮之胰島素致敏效應，形成劑量-減少之潛在臨床效益，或增加反應良好之病患。表28 實驗室中蛇麻子類衍生物及噻吔二酮於抗胰島素廬肪母細胞模刑之綜效產脂指標t 待測物質濃度 l>g/ml] 觀察值預期值判讀曲格列酮/RIAACkl]1 4.0 1.23 L06 綜效曲格列酮/IAAfm]1 4.0 1.14 1.02 綜效鹽酸吡格列酮/RIAA[ 1:1 ]2 _ 2.5 1.19 1.00 綜效鹽酸吡格列酮/IAA[m]2 2.5 1.16 0.95 綜效 t產脂指標=[〇D]賴/[〇D]dmso控制組。 15 1)上95%信賴極限為1·02而最小顯著差異二〇·〇2。 2)上95%信賴極限為1.05而最小顯著差異二〇.〇5。 140 200819120 實施例31 麗一％_至 ί Rho_六阿也胍於廬肪母細腧辑里之、综效 [00316]杈型-該等實驗使用敘述於實施例η之 5 3T3-L1鼠類纖維母細胞模型。如分別記述於實施例u及 13使用標準化學品並以1GngTNFa/ml處理脂肪母細胞。 • ”待測物質及細胞處理-二曱雙胍係得自Sigma (St· Louis，MO)而Rho-異阿伐酸係如敘述於實施例2〇。二甲雙胍於50、10、5.0或1·〇盹―不含或含1吨 10 RIAA/m卜與10叩TNFa/ml添加於D5 3T3-L1月旨肪母細胞。第6日鑑定培養上澄液培養基之IL_6，細節如實施例 11。如先前敘述估計二甲雙胍:RIAA混合物對IL_6抑制作用之預期效應。 [00318] 結果-TNFa於D5脂肪母細胞提供六倍增加之 _ IL_6分泌。曲格列酮於1 gg/ml相對於控制組抑制il-6分泌34百分點，而IpgRiAA相對於控制組抑制il-6分泌 24百分點（表29)。二曱雙胍混合1 pg RiAAIml於5〇 pg/ml濃度展現綜效且於lpg/ml濃度展現強综效。於5〇 pg二甲雙胍/m卜1 pg RIAA於混合物提供額外1〇百分 20 點之抑制力；而於1 pg二曱雙胍，1 gg RIAA增加IL-6 抑制作用3 5百分點。二曱雙脈:RIAA混合，於二種中間劑量分別見拮抗性與無效應。 [00319] 二曱雙胍及Rho-異阿伐酸混合協同作用於高及低 141 200819120 濃度，於經TNFct-處理3T3-L1脂肪母細胞，減缓IL-6分泌0 表29 Μ麻子類Rho-異阿伐酸及二甲静胍於TNFa/3T3-Ll脂肪母細胞IL-6分泌之協同抑制作用

測試物質濃度[pg/ml] IL_6指標卞 %抑制作用判讀 DMSO控制組 - 0.16 TNFa 控制組士95%CI - 1.00 ±0.07* 0 曲格列酮 1.0 0.66 34 RIAA 1.0 0.76 24 二甲雙胍 50 0.78 22 二甲雙胍/lpgRIAA 50 0.68 32 綜效二甲雙胍 —--—— 10 0.78 22 一甲雙胍/1 Kg RIAA 10 0.86 14 拮抗性二甲雙胍 -——~~.— 5.0 0.96 4 虜 5.0 0.91 9 無效應二甲雙胍 "~~~---—---- 1.0 0.91 9 - 1.0 0.56 44 綜效 10 2戶:载濃度與10 ng TNFa/ml添加至D5 3T3_L1脂肪母細胞。隔日 ^ 。、基採樣測定IL-ό。所有值以TNFa控制組為基準。 4曰 [IL-6 測試-IL-6 控做]/[IL-6lps-IL-6 控制組] 數值少於0·93係顯著(p<〇.〇5)少於TNFa控制組。 142 200819120 實施例32 柃紐室中待測化金教胞增殖之效應 [00320]本實驗展現於實驗室中數種制本發明化合物對癌症細胞增瘦之直接抑制效應。 5 [⑽321]方法制本發明化合物對癌症細胞增殖之抑制效應之檢驗係於RL 95-2子宮内膜癌細胞模型（AKT激 φ 酶之過度表現子）以及於HT_29 (固有表現COX-2)及 SW480 (固有表現活化AKT激酶）結腸癌細胞模型。簡要而吕’標的細胞被置入96孔組織培養盤並靜置以生長直 10 至次融合。隨後將細胞如敘述於實施例4以各種量之待測化合物處理 72 小時並以 CyQuant (Invitrogen，Carlsbad, CA)商業性螢光鑑定測定相對性細胞增殖。 [00322]結果-將 RL 95-2 細胞以 i〇pg/mi MgDHIAA (mgRho)、ΙΑΑ、THIAA、TH-RHIAA(THIAA 及 HHIAA • 之1:1混合物）、Xn(黃腐醇）、LY(LY 249002、P13K抑制

子）、EtOH(乙醇）、阿伐（阿伐酸混合物）及貝他（貝他酸混合物）處理72小時。對細胞增殖之相對性抑制作用呈現於圖 24，顯示黃腐醇相對於DMSO溶劑控制組大於5〇%之抑制作用。圖25及26顯示各種濃度之RIAA或THIAA 2〇分別對HT-29及SW480癌症細胞之劑量反應結果。RIAA 及THIAA之培養基抑制濃度對HT-29細胞系為31及1〇 μΜ，而對SW480細胞系為38及3·2卩M。 143 200819120

年代發展為糖尿病模型及Ay/a基因型品系。所見表現型係多基因突變絲，其未具有完全描述特徵，惟至少已鑑 10

實施例33 及蛇麻子皇糖尿病模型之低血 [00323]模型—使用平均4〇土 5g、雄性、九週大 KK-A/Ta小鼠評估待測物質減緩斷食血清葡萄糖或胰島素/辰度之/曰力。本品系鼠係κκ品系間雜交而得，於4〇別出四種數量性狀基因座。其中之一連結至痩素受體之意義錯誤突變。儘管該突變中，受體保持功能，雖未完全高效率。KK品系發展之糖尿病，有胰島素不敏感及葡萄糖不耐，惟無明顯高血糖症。引入A突變誘發肥胖症及高血糖症。A大變係位於野鼠色基因座5，Ra〗y基因之刪除，於Raly啟動子下之野鼠色控制組。同型合子動物於植入程序前死亡。 [00324] 待測物質—使用阿拉伯金合歡樣本#5659如敘述於貫施例14且蛇麻子類衍生物^^〜異阿伐酸、異阿伐酉文及育腐醇如敘述於實施例20。阿拉伯金合歡、EJAA及 IAA 投以 100 mg/kg/day ; XN 之劑量為 20 mg/kg。此外，配製阿拉伯金合歡與RIAA、IAA及XN之5:1及10:1混合，劑量為 1 00 mg/kg/day。 [00325] 測試程序·測試物質伴隨〇.2%吐溫_8〇乳化劑以月官灌食法每日投與每組五隻動物。於開始投藥前及於 144 20 200819120 第三且最終投藥後九十分鐘自眶後竇收集血清。一一變旋酶/葡萄糖氧化酶方法，測定非禁食血清葡萄楂〆而椒島素之測定係以鼠專一性卿二：: 吸附鑑定）。逆…免左 [00326]數據分析—為評估測試物質是否相對於控減少血清葡萄糖或騰島素，首先將投劑後葡萄糖及騰島素

10 15

值相對於投㈣濃度以每I治療前百分比歸—化。葡^糖及騰島素變數二者均計算關鍵值（單尾，低95%信賴區 f於控制組小氣）治療前百分比。各待測物質百分^: 丽值與控制組關鍵值比較。該等待測物質百分比治療前

值，其少於控制組關鍵值者可認為與控·有顯不^ (ρ<0·05)。 J

[00327] 結果-於三天治療間，控制組小鼠非禁食、血清葡萄糖升咼2.6%，而血清胰島素減少6·7%。羅格列_、阿拉伯金合歡、χΝ:相思樹屬[1:5]、χΝ:相思樹屬 [ι:ι〇]、相思樹屬：RIAA [5:1]、黃腐醇、相思樹屬：ιαα [5:1]、異聚合阿伐酸及Rho-異阿伐酸之非禁食血清葡萄糖，相對於控制組均減少，而對也清胰島素不具效應。相思樹屬：RIAA [10:1]及相思樹屬：IAA [10:1]對血清葡萄糖或胰島素均不具效應（表30)。 [00328] 阿拉伯金合歡樣本#.5659、黃腐醇、異聚合阿伐酸、Rho-異阿伐酸及其各種混合物對KK_Ay鼠第2型糖尿病模型之快速低血糖效應，支持其於治療人類高血糖疾病之潛在臨床效果。 145 20 200819120 表30 阿拉伯金合歡及蛇麻子類衍生物對KK-Ay糖尿病小鼠非禁食血清葡萄糖及胰島素之效應待測物質劑量t [mg/kg- a ] 葡萄糖 [%治療前】胰島素 [%治療前】控制組（關鍵值） - 102.6 (98.7) 93.3 (85.4) 羅格列酮 1.0 803# 88.7 阿拉伯金合歡樣本#5659 100 89. 1# 95.3 XN:相思樹屬[1:5] 100 9L5# 106.5 XN:相思樹屬[1:10] 100 91.7# 104.4 相思樹屬：RIAA[5:1] 100 92.6# 104.8 黃腐醇 20 93.8# 106.4 相思樹屬:IAA[5:1] 100 98.0# 93.2 異聚合阿伐酸 100 98.1# 99· 1 Rho-異阿伐酸 100 983# 100 相思樹屬:RIAA[10:1] 100 101.6 109.3 相思樹屬:IAA[10:1] 100 104.3 106.4 卞連續三日於各組之五動物每日投劑一次。 #顯著少於控制組（p<〇.〇5)。實施例34 阿拉伯金合歡及蛇麻子類衍生物於糖尿病db/db 鼠模型之活體内綜效。 [00329]模型-使用雄性、C57BLKS/Jm+/m+Lep严（db/db) 146 10 200819120 小鼠’以評估待測物質降低禁食血清葡萄糖或胰島素濃度之潛力。該品系小鼠，以其可作用瘦素受體不存在而對瘦素具抗性。細胞質胰島素之提升開始於10至14日而血糖則於4至8週。於測試期間（9週)動物顯著增胖50 士 5 5 g並顯示胰小島肥大之證據。 [00330]待測物質-連續三日陽性控制組二甲雙胍及羅格列酮投藥劑量分別為300 mg/kg-日及1 ·0 mg/kg-日。阿 • 拉伯金合歡樣本#5659、蛇麻子類衍生物及其混合物投藥劑量如先前敘述。 10 [00331]測試程序-測試物質伴隨0.2%吐溫-80乳化劑以胃管灌食法每曰投與。於開始投藥前及於第三且最終投樂後九十分鐘自眶後竇收集血清。以酵素法--變旋酶/葡萄糖氧化酶方法，測定非禁食血清葡萄糖，而血清胰島素之測定係以鼠專一性ELISA(酵素連結免疫吸附鑑定）。 [⑻332]結果-陽性控制組二甲雙胍及羅格列酮，顯示相對於控制組降低血清葡萄糖及胰島素濃度（表31)。僅 RIA A及xn以單一待測物質展現可接受之結果。RI a a F牛低血清胰島素，而XN使血清葡萄糖降低而對胰島素不具效應。相思樹屬：RIAA [5:1]為測試物中降低血清胰島素 2〇濃度最有效者，提供血清胰島素濃度21 %之降低，且雙胍類之二曱雙胍降低胰島素濃度17 %，噻唑二酮類之羅格列酉同則降低15 %。相思樹屬：RIAA [5:1]混合之反應大於任個別組成成份之反應，從而展示綜效潛力。純阿拉伯金 147 200819120 低血清葡萄糖或胰島素，_ΑΑ降低血清胰

St 二？雙胍。剩餘待測物f中，相思樹屬嫩 • a ’、有效於降低血清胰島素濃度。 [=33]於db/db鼠第2型糖尿病模型，RhG_異阿伐酸快 j低血清胰島素，黃腐醇降低血清_萄糖，支持療人顯騰島素不敏感及高血糖等疾病之潛在臨床效果^ 1異阿錢及相思樹屬兒茶之5:1混合，於db/db ^ ::病杈型顯露協同效應。Rh〇•異阿伐酸、黃腐醇及：;、相.RIAA [5:1]配方展現陽性反應於二組獨〜 =模型及三組實驗室模型，支持其可用於需要降葡萄糖或增進胰島素敏感度等臨床狀況之潛力。—^ 表31 15 子類衍生^口金^清I]萄糖及之效| 待測物質劑量t 【mg/kgn 葡萄糖 f%治療前】騰島素 84 Ία 控制組（關鍵值） -一 —-~~~一 ---~~-J 103.6 (98.4) 相思樹屬:RIAA[5:i；] -----— 100 99.6 二曱雙胍 --------------- ---, 300 67.6# Rho-異阿伐酸 -------- 〜----- 100 102.3 相思樹屬:ΙΑΑ[1〇:ι] --—一 ――—-— 100 104.3 羅格列酮 --—-— —------ 1.0 83.0# 100 10L5 148 200819120

阿拉伯金合歡樣本#5659 100 100.4 91.9 相思樹屬:RIAA[10:1] 100 101.6 93.5 異聚合阿伐酸 100 100.8 95.8 黃腐醇S 20 97.8# 10L6 XN:相思樹屬[1:5] 100 104.1 105.6 相思樹屬:IAA[5:1] + 100 102.7 109.1 丨連績二日於各組之五動物每日投劑一次。 #顯著少於控制組（p<〇.〇5)。實施例35 5

歡及蛇窳子類衍生物於糠尿病db/db I模型之活體内比例最谪jh [〇〇334]模型·'使用雄性、C57BLKS/J m+/m+ Lepr办 (db^db)小鼠以評估待測物質減緩禁食血清葡萄糖或胰島素辰度之'曰力。該品系小鼠，以其可作用痩素受體不存在而對瘦素具抗性。細胞質胰島素之提升開始於1〇至14日而企糖貝:於4至8週。於測試期間(9週)動物顯著增胖50 士 5 g並顯示胰小島肥大之證據。 [00335]待測物質_陽性控制組二甲雙胍及羅格列鋼投樂劑量為’分別地於300 mg/kg_日及以叫知日每五斷。蛇麻子類衍生物RUA及阿拉伯金合歡樣本 b h99’ 1:5, 1:2, h1，2:1 及 5:1 投藥劑量為於 100 mg/kg。吐溫-8 0乳化劑以 [00336]測試程序·測試物質伴隨〇2% 149 15 200819120 胃管灌食法每曰投與。於開始投藥前及於第三且最終投藥後九十分鐘自眶後賣收集血清。以酵素法變旋酶/葡萄糖氧化酶方法，測定非禁食血清葡萄糖，而血清胰島素之測定係以鼠專一性ELISA。 [00337] 結果-陽性控制組二甲雙胍及羅格列酮，顯示相對於控制組降低血清葡萄糖及胰島素濃度(ρ<〇·〇5、結果未顯示)。RIAA及相思樹屬個別於100 mg/kg五曰降低血清葡萄糖’分別為相對於控制組7·4及7.6百分點(p<〇.〇5)。 RIAA及相思樹屬之混合於1:99、1:5或1:1出現拮抗性’而2:1及5:1之RIAA:相思樹屬相對於控制組分別降低血清葡萄糖11及22百分點。該反應大於純rjAA或相思樹屬任一項，而暗示二種組成成分間之協同效應。相似效應見於血清胰島素濃度之降低（圖27)。 [00338] 本模型額外測試5:1混合之Rh〇_異阿伐酸及相思樹屬與二甲雙胍及羅格列酮比較，後二種藥物目前用於糖尿病治療。結果（圖28)指出Rho-異阿伐酸及相思樹屬5:1 混合所得結果相彷於降低血清葡萄糖（組A)及血清胰島素 (組B)之醫藥用物質。 [00339] 1〇1〇_異阿伐酸及相思樹屬之2:1及5:1混合顯露綜效於db/db鼠類糖尿病模型，支持其可用於需要降低灰清葡萄糖或增進胰島素敏感度等臨床狀況之潛力。 150 200819120 貫施例3 6 待測蛇麻子類也金物於膠星誘發恩溋進|||^鼠模型名立息 [00340] 本實施例展現二種蛇麻子類化合物，Mg Rh〇及 THIAA於風濕性關節炎模型減輕發炎及關節炎徵候之效 5 度’該等發炎及症狀已知部分為蛋白激酶所媒介。 [00341] 模型-將雌性DBAJJ小鼠（10/組）留置於標準明藝暗狀態下，並容許隨意進食。於第0日將小鼠皮内^射包含100 gg型II膠原及於鯊烯中100 結核病分枝桿菌= 混合物。起動注射重覆於第21日。於第22 - 27日檢驗小 1〇鼠關節炎之症候，不反應小鼠自研究移除。於第28日至 42日之14日，母日以月管灌食待測化合物治療小鼠。使用於本實施例之待測化合物為RIAA (MgRh〇) 1〇 mg/kg(低）、50 mg/kg (中）或 250 mg/kg (高）；THIAA 10 mg/kg(低）、50 mg/kg (中）或 250 mg/kg (高）；塞來考昔 2〇 g mg/kg ;而去氫皮質醇為1〇 mg/kg。 [00342] 如以下敘述使用關節炎指標評估（評分〇 _4)各掌關節徵候。於本關節炎指標下，〇 =無可見症候；1 =單指水腫及/或紅斑；2=二關節水腫及/或紅斑；3=多於二關節水腫及/或紅斑；及4二嚴重關節炎，全掌及指關節僵硬及 20 畸形。 [00343] 於實驗終了時進行組織學檢驗，將小鼠安樂死並截一肢’保存於緩衝福馬林。分析關節炎指標之改善，自各治療組隨機選擇二隻動物進行H&E染色組織學分析。 151 200819120 觀察軟組織、關節及骨變化並以1〜4分評估，其中4表示嚴重損害。 [00344]細胞分裂素分析-於實驗終了，收集小鼠应清以進行細胞分裂素分析。十隻小鼠之少量(0.2-0.3 ml/鼠）樣 5 本隨機分配為二組各五隻動物。如此可進行重覆分析；每次分析最少二次。TNF-α及IL-6之分析係根據製造商說明使用鼠專一性試劑（R&D systems，Minneapolis, MN)。僅二 ⑩ 十六組中之五組造成可偵測TNF-α濃度；其中包含載體治療之控制組動物。 1〇 [00345]結果_ RIAA對關節炎指標之效應圖形化呈現於圖29。可見顯著減少（ρ<0·05，雙尾-測試）：去氫皮質醇於 10mg/kg (第 3〇 - 42 曰）、塞來考昔於 2〇mg/kg (第 32-42 曰）、RIAA 於 250 mg/kg (第 34_42 曰），而 RIAA 於 50 mg/kg (第 38-40 日），示範 RIAA 於 50 或 250 mg/kg 之 15 抗關節炎效度。圖3〇顯示THIAA對關節炎指標之效 ⑩ 應。此處可見痛著減少者有：塞來考昔（第32-42曰）、 THIAA 於 250 mg/kg (第 34-42 日）及 THIAA 於 5〇 mg/kg (第34-40日），表示ΤΗΙΑΑ為有效之抗關節炎劑。 [00346]組織學檢驗關節組織損害結果表示於圖31，於 20 ΤΗΙΑΑ治療個體表現無或最少關節破壞證據。組織學評分於250 mg/kg及50 mg/ kg分別降低4〇%及28%，乃劑量反應之明確跡象。該等比較偏好塞來考昔治療组，其中 •關節破壞評分為輕微。注意事實上塞來考昔（2〇mg/kg)組 152 200819120 織予砰分增加33%。個別性動物間具明顯差異，如載體治 =動^之一表現中等程度關節破壞證據，而其它動物明顯熟抽告。、麵炎出現於所有治療組，其巾去氳皮質醇治療組有一動物例外。 ^0347]細胞分裂素分析IL_6結果總結於圖32。除塞來考曰例外’馬劑量Rho之所有治療均降低血清IL_6濃度，雖僅去氣皮質醇到達統計顯著性。

10 實施例3 7 盘屬（1:5)於人類代謝症候群教龐 [00348] 本實驗檢驗以RIAA:相思樹屬（1:5)配方治療一些自願代謝症候群病患之臨床相關徵候。 [0349] 方法及试驗设计—本试驗為隨機、安慰劑-控制、、且之雙目武驗’進行於單一研究地點（the functional

Medicine Research Center，Gig Harbor，WA)。研究所需對象滿足條件（年齡18至70歲）包含以下：（i) BMI 25與42·5 kg/m 間（ii) TG/HDL-C 比例 $3·5 ; (iii)禁食胰島素—1〇 mcIU/mL。另，對象需滿足以下5項條件中之3項（i)腰圍 >35”（女性）或>4〇，，(男性）；出）丁0 15〇11^/(11^;(出）110乙 < 50 mg/dL (女性）或<4〇1^/此（男性）；（卜）血壓130/85 或診斷為高血壓需用藥；及(v)禁食葡萄糖l〇〇mg/dL。 [00350] 滿足包含條件對象隨機分為4組：（i)服用RIAA/ 相思樹屬混合（每藥片包含1 〇〇 mg RIAA及500 mg阿拉伯金合歡心木萃取物）1藥片t.i.d.;(ii)服用RIAA/相思樹 153 20 200819120 屬混合2藥片t.i.d ; (iii)安慰劑、1藥片、t.i.d ;及(iv)安慰劑、2藥片t.i.d。試驗全部時間為12週。於第1日、8 週及12週抽取對象血液以評估於增加各項代謝症候群參數之效應。 5

10 [00351]結果-對象之起始個數及生化特徵（安慰劑組及每曰服用RIAA/相思樹屬3藥片之對象）編入之試驗表示於表32°RIAA/相思樹屬與安慰劑組間之起始禁食血中葡萄糖與食後2 h (2 h pp)葡萄糖值相似（分別為〇 vs 96 5 瓜挪與128.4vs.1〇9.2mg/dL)。另，二者葡萄糖值係於實驗室參考範_ (4G. mg/dL禁食血中葡萄糖及7〇_15〇 mg/dl^hpp葡萄糖）。結果正如預期，因2h 島素反應改變先於葡萄糖與禁食胰島素上升，後二代謝症候群及嚴重糖尿病。 = 表32 人α 15

盘基礎生彳安慰劑RIAA7相思樹屬

N 35 35 藥片

Gender 男女 11(31%) --- 24 (69%) 年齡（歲）體重(lbs) BMI (kg/m2) 平均 46.0 220.6 35.0 12(34%) 23 (66%) SD 13.2 35.2 4.0 47.9 —------- 35.4 SP 13.4 31.6 4.0 154 200819120 收縮壓(mm) 13L0 15.1 129.7 13.9 舒張塵(mm) 83·7 8.5 82.6 7.8 腰圍(对） 42.9 4.9 42.9 4.5 臀圍(叶） 47.1 4.0 47.6 3.2 禁食胰島素(mcIU/mL) 13.2 5.2 17.5 12.1 2 hpp 胰島素（mcIU/mL) 80.2 52.1 993* 59.2* 禁食葡萄糖（mg/dL) 96.5 9.0 99.0 10.3 2 h pp 葡萄糖（mg/dL) 109.2 30.5 128.4 36.9 禁食 TG(mg/dL) 231.2 132.2 255.5 122.5 *一位對象排除在分析外，因其2 hpp胰島素值不正常；BMI，基礎代謝指標；BP，血壓；TG，三甘油酯；HDL，高-密度脂蛋白 [00352] 禁食血液胰島素之測定值相似且亦均位於參考值範圍内，相思樹屬組起始於17.5mcIU/mLRIAAI及安慰劑 5 組 13·2 mcIU/mL(參考值範圍 3-30 mcIU/mL)。2 h pp 胰島素濃度於參考值範圍内逐漸提升（99.3 vs. 80.2 mcIU/mL)，且其表現變異性大於禁食胰島素或葡萄糖測定◊雖起始值相似，RIAA/相思樹屬組於程序8週後表現出更大量降低之禁食騰島素及2 hpp胰島素，以及2 hpp ίο 血中葡萄糖（圖33及34)。 [00353] 體内恆定模型評估（H〇MA)為發表之抗胰島素現象評分方法。所有對象之H〇MA分數變化表示於圖35。因見變異於代謝症候群對象之胰島素及葡萄糖值，對象中一僅禁食胰島素> 15 mcIU/mL之子群亦進行評估。該子 15 群HOMA評分表示於表33，其可見RIAA/相思樹屬組相較於安慰劑組顯著減少。 155 200819120 表33 RIAAI相思樹屬投樂（3藥片/日）對起始学食胰島素i5 mcIU/mL對象HOMA ft分之#龐 IIOMA評合治療 N 起始 8週後安慰劑 9 4.39 4.67 RIAA/相思樹屬 13 5.84 4.04

[00354]於8週後各組間差異顯著（p <〇〇5)。以所發表 HOMA评分法计异禁食胰島素及葡萄糖[(胰島素 (mcIU/mL) * 葡萄糖（mg/dL))/405]。 10

[00355]三甘油酯（TG)之提升亦為代謝症候群之重要跡象。表34及圖36指出RIAAI相思樹屬投藥8週後，造成TG相較於安慰劑投藥顯著減少（ρ <〇·〇5)。RIAA/相思樹屬組之TG/HDL-C比例亦顯示大大降低（自6.40至5.28)，而安慰劑組（自5.81至5.92)並未降低。表34 15 RIAA/相思樹屬投藥（3藥Η / Β、對TG濃唐及 Tg/IfflL·膽固醇比之斿赢禁食 TG(mg/dL) TG/HDL 投與起始值 8週後變化起始值 8週後變化安慰劑 231.2 229.8 -L4 5.81 5.92 +0.11 RIAA/相思樹屬(每日3片） 258.6 209.6 -49.0 6.40 5·28 -1.12 156 200819120 =候群對象投與1〇0 mg rh°-異-阿伐酸及週相#^1 伯金合被心木萃取物混合藥片每日3片持續8 ^較於女慰劑更為降低減少2 h PP胰島素濃度。進一二’可見相較於㈣安慰觸象更為降舖食胰島素、禁良及2 h pp葡萄糖、禁食三甘油醋及恥μα評分於服用 RIAA/相思樹屬對象（每日3藥片該等結果指出r认^

10 15

相思樹屬投藥可能有用於維持代謝症候群對象之姨島素體内怪定。實施例38 垄11·验待測化合物對瘺症細胞增殖之效鹿 [00357] 本實驗示範於實驗室中一些待測本發明化合物對癌症細胞增殖之直接抑制效應。 [00358] 方法—將大腸直腸癌細胞糸jjT-29、Caco-2及 SW480以3xl03細胞/培養孔播種入96孔盤並定溫培養隔夜以讓細胞附著於盤上。待測物質每一濃度複製八次。七十二小時後，使用CyQUANT⑧細胞增殖鑑定套組鑑定全部生存細胞。計算生存細胞相對於DMSO溶劑控制組減少之百分點。圖示觀察值表示八項值土 95%信賴區間。 [00359] 結果-圖37-41圖形化呈現RIAA (圖37)、IAA (圖 38)、THIAA(圖 39)、ΗΗΙΑΑ(圖 40)及黃腐醇（XN;Fig 41)之抑制效應。 157 20 200819120 實施例39 登宜^±^4^及待測化舍&對轰症IE跑增殖之效應 [00360]本實驗比較實驗室中RIAA或THIAa混合塞來考昔對癌症細胞增殖之抑制效應觀察值與預期值。 5 [〇〇361]方法—將大腸直腸癌細胞系以3xl〇3細胞/培養孔拓種入96孔盤並定溫培養隔仪以讓細胞附著於盤上。 • 待測物質每一濃度複製八次。72小時後，使用CyQu^NT⑧ 細胞增殖鑑定套組鑑定全部生存細胞。計算於·〇溶劑控制組減少之百分點。估 10 RIAA或THIAA混合之預期ED細胞毒性效應，其二用以下關係式：l/[T]c = X/[T]X + Y/[T]y，其中丁 =毒性，代表生長抑制分數或被殺死之細胞’ X及γ為相對性分數代表測試混合物之每項組成成份，且χ + γ=卜圖示^察值表示八項觀察值土 95%信賴區間。推估綜效當估計百二比 g 減少落入相應觀察分數95%信賴區間之下。 [00362] 圖42及43圖形化呈現RIAA(圖42)或thiaa (圖43)對癌症細胞增殖抑制效應觀察值與預期值間之比較。該等結果指出，多數實例中，該等測試化合物混合塞來考昔，抑制癌症細胞增殖程度大於數學預測值。 20 貫施例40

口服投藥後复測血清THT A A

[00363] 實驗目的係測定口服投藥後TmAA是否經代謝 158 200819120 而可偵測。 [00364] 方法·投藥前採血後，食用五份含有94〇 mg ΤΉΙΑΑ (PR 四 Standalone Sofigel· OG# 2210 KP-247 Lot C42331111)之自由酸軟膠（188mgTHIAA/軟膠），隨後並立即食用一杯水果優格。除無咖啡因咖啡外，THIAA攝取後四小時不攝取額外食物。以45分鐘間隔抽取樣本入不含凝企活化劑之Corvac血清分離器試管。將樣本靜置於室溫45分鐘至凝血，並以1800 X g於40 °C離心1〇分鐘分離血清。添加包含（X5%HOAc之〇 9mlMeCN於〇 3 ml 灰清並維持-20°C45-90分鐘。於4°C將混合物離心於 15000 Xg 1〇分鐘。離心後明顯分離為二層；〇·6㈤上層採樣以進行HPLC分析。使用添加樣本測定回收率，其大於 95%。 ’ [00365] 結果-結果圖形化呈現於圖44_46。圖料圖形化顯示於攝取940 mg THIAA後血清中ΤΙΠΑΑ偵測值。圖 45頒示於攝取225分鐘後，相較於實驗室中ΤΗΙΑΑ濃度測試之血清ΤΗΙΑΑ濃度偵測值。圖46描繪之ΤΗΙΑΑ代謝。 [^0366]本發明現已敘述完畢，明顯對具備一般技術者而吕，可不違背附錄申請專職®之精神或視角而進行多種變化及調整。【圖式簡單說明】 [0034]圖丨圖形化描繪&激酶網路調整胰島素敏感度及 159 200819120 耐受性部位。 [0035] 圖2圖形化描繪五種所選擇激酶受 (mgRho)之抑制作用。 [0036] 圖3圖形化描纟會五種蛇麻子類組成成份及一種阿 5 拉伯金合歡萃取物對P13K異構物之抑制作用。 [0037] 圖4描綠於C0X_2表現之LPS激發作用前（白棒) 或隔夜LPS-激發作用後於添加待測物質之前（灰棒）添加 RIAA [組A]及IAA [组B]之劑量-相關PGE2生物合成抑制作用。 ^ ίο [⑽38]圖5提供圖形代表分析於RAW 264·7細胞塞來考昔[組Α]及MgRIAA [組Β]對LPS誘發c〇x_2媒介 PGE2製造直接酵素抑制作用。PGE2以μ§/ιη1測定及表現。錯誤棒代表標準差（η 8)。 [0039] 圖6提供西方墨點法偵測cox-2蛋白質表現。以 • LPS刺激RAW 264.7細胞指定次數，其後全部細胞萃取物以COX-2及GAPDH表現[組a]之西方墨點法顯現。進行COX-2及GAPDH帶之光密度測定。圖[組B]代表 COX-2對GAPDH之比例。 [0040] 圖7提供西方墨點法偵測iN〇s蛋白質表現。以 2〇 LPS刺激RAW 264.7細胞指定次數，其後全部細胞萃取物以iNOS及GAPDH表現[組A]之西方墨點法顯現。進行 INOS及GAPDH帶之光密度測定。圖[組B]代表iN〇s 對GAPDH之比例。 160 200819120 [0041]圖8提供96-孔格式TransAM NF-κΒ套組之代表性圖式。盤中原有之寡核苷酸包含NF-kB 一致結合位。初級抗體偵測NF-κΒ之p50次單位。 [0042]圖9提供TransAMNF-KB套組測定之NF-κΒ代表 5

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性結合活性。相對於LPS控制組（1〇〇%)計算DnA結合百分比。錯誤棒代表標準差（n2)。RAW264 7細胞如敘述於實施例處以待測化合物及LPS處理4 hr。 [0043]圖10為圖式，評估相思樹屬樣本#49〇9萃取物對發展中及成熟脂肪母細胞產脂效應之代表性測試程序。使用3T3-L1鼠類纖維母細胞模型以研究待測化合物對脂肪母細胞脂肪生成之潛在效應。 [〇〇44]圖11為圖形，其代表描繪以相思樹屬樣本#4909 萃取物或陽性控制組吲哚美辛及曲格列酮處理之3T3_ Li 脂肪母細胞，相對於溶劑控制組之非極性脂質含量。錯誤棒代表95%信賴極限（單尾）。 [0045]圖12為代表㈣試程序圖式，其評估效應相思樹屬樣本#4909水性萃取物對於抗胰島|阳七脂肪母細胞脂聯素分泌之二甲基亞磺醯_可溶分數。 [〇〇46]圖13為代表性長條圖，其描繪24 hr内受三-欠曲格列酮投劑及四次相思樹屬樣本麵9水性萃取物之二甲容部分投劑誘發之抗胰島素3仙細胞最大月曰砂刀泌。數值呈現為相對於溶劑控制组之百分比；錯誤棒代表95%信賴區間。、、之百刀比 161 20 200819120 [0047]圖14為代表性測試程序圖式，其評估相思樹屬樣本#4909水性萃取物之二甲基亞磺醯可溶部分’對以待测物質加10、2或0.5ngTNFa/ml處理之3T3-L1脂肪母細胞之脂聯素分泌效應。 [0048]圖15描繪代表性長條圖，表示以TNFa 10ng/ml (A)、2 ng/ml (B)或 0·5 ng/ml (C)處理之成熟 3T3-L1 細胞且由吲哚美辛或一相思樹樣品#4909萃取物所引起

10 15

20 之脂聯素分泌。呈現的數值表示相對於溶劑控制的百分率；誤差槓表示95%信賴區間。*明顯不同於TNFa 單獨處理（p<〇.〇5)。 [〇〇49]圖16圖形化示範來自不同商業性來源之相思樹屬兒余及阿拉伯金合歡之各種成份，造成抗胰島素脂，母細胞三甘油酯含量之相對性增加。數值呈現為相對於溶劑控制組之百分比；錯誤棒代表信賴區間。 ^〇]圖17圖形化描繪代相思樹屬兒茶各種萃取物誘發之=2目對性脂聯素分泌。數值呈現為相對於溶劑控制组刀比，錯誤棒代表95%信賴區間。 [0051]圖18圖形化描繪以蛇，朵美辛及曲格列_理之3如員::，控制組 (相斜於溶劑控制組）。使用3T3_L 胞脂質含量研究待測化合物對脂肪母細胞脂肪生細胞模型 :目姆於控制組細胞，代表非極性脂以在:應。結果 95/〇信賴區間。、里，錯誤棒代表四次投劑24 [〇〇52]圖19為代表性長條圖，表示待測物質

162 H 200819120 hr中誘發之抗胰島素3T3-L1細胞最大脂聯素分泌。數值以相對於溶劑控制組百分比呈現；錯誤棒代表95%信賴區間。IA A =異阿伐酸，RIA A二Rho異阿伐酸’ HHIA〆六氫異阿伐酸及THIAA二四氫異阿伐酸。 [0053] 圖20描繪Hofsteeplots下之Rho異阿伐酸、異阿伐酸、四氫異阿伐酸、六氫異阿伐酸、黃腐醇、失效蛇麻子類、六氫附蛇麻蘆酮及陽性控制組曲格列酮。相對於溶劑控制組之最大脂聯素分泌自y-截面估計，而自峰值之負值計算最大脂聯素分泌半數值之待測物質必需濃度。 [0054] 圖21顯示二長條圖，代表異阿伐酸及Rho異阿伐酸[組A]及六氳異阿伐酸類及四氫異阿伐酸[組B]，誘發經TNFa處理之成熟3T3-L1細胞相對性脂聯素分泌。數值呈現為相對於溶劑控制組之百分比；錯誤棒代表 95%信賴區間。*顯著相異於僅TNFa處理者（ρ<0·05)。 [0055] 圖22描繪添加lOngTNFalml於抗胰島素3T3-L I脂肪母細胞[組A] 3及[組B] 24 hr後之NF-κΒ核易位。添加鹽酸吡格列酮、RIAA及黃腐醇5.0 (黑棒)及2.5 (帶紋棒）pg/ml。Jurkat核萃取物，係來自補充50 ng/ml ΤΡΑ (phorbol，12-myristate，13 acetate)之培養基細胞，於 37°C 於採取之前二小時立即0·5μΜ鈣離子電泳A23187 (CI)。 [0056] 圖23圖形化敘述相對以溶劑處理者，二甲雙胍、相思樹屬樣本#5659水性萃取物或二曱雙脈/相思樹屬兒茶萃取物之1:1混合對於抗胰島素3T3-L1細胞之三甘 163 200819120 油酉日含量。結果以浴劑控制組完全分化細胞相對性三甘油醋含量代表。 [0057] 圖24圖形化描繪i〇gg/mi溶劑控制組（dMSO)、 RIAA、異阿伐酸(IAA)、四氫異阿伐酸(THIAA)、ΤΉΙΑΑ/ 六氫異阿伐酸（m-IIAA)l:l混合物、黃腐醇（XN)、 LY249002(LY)、乙醇（ETOH)、阿伐酸（阿伐）及貝他酸 (BETA)對RL 95-2子宮内膜細胞系之細胞增殖效應。 [0058] 圖25圖形化描繪各種濃度之THIAA或還原異阿伐酸（RIAA)對HT-29細胞系細胞增瘦效應。 [0059] 圖26圖形化描繪各種濃度之THIAA或還原異阿伐酸（RIAA)對SW480細胞系細胞增殖效應。 [0060] 圖27圖形化描繪各種還原異阿伐酸（riaa)及相思樹屬混合降低db/db鼠模型血清葡萄糖[組A]及血清胰島素[組B]之劑量反應。 [0061] 圖28圖形化描繪RIAA:相思樹屬5:1混合造成 db/db紙权型血清葡词糖[組A]及血清騰島素[組B] 降低，與醫藥用抗-糖尿病化合物羅格列酮及二甲雙胍比較。 [0062] 圖29圖形化描繪還原異阿伐酸（riAA)於鼠類風濕性關節炎模型對關節炎指標之效應。 10063]圖30圖形化描繪THIAA於鼠類風濕性關節炎模变對關節炎指標之效應。 [0064]圖31圖形化總結RIAA及THIAA對膠原誘發關 164 200819120 節損害之效應。 [0065] 圖32圖形化總結rIAA及THIAA對動物膠原謗發關節炎模型IL-6濃度之效應。乂… [0066] 圖33圖形化描繪rl\A/相思樹屬（1:5)補充（每 5 曰3藥片）對禁食及2 h食後（PP)胰島素濃度之效應。於2hpp胰島素濃度評估，對象i〇_12h斷食並攝取包含 75 g 葡萄糖（Tmtol 1〇〇, CASCO NERL⑧ Diagnostics)之 ® 溶液；葡萄糖刺激2 h後，抽取血液並鑑定胰島素濃度（實驗室 ies Northwest, Tacoma，WA)。 ίο [0067]圖34圖形化描繪RIAA/相思樹屬（1··5)補充（每曰3藥片）對禁食及2 h食後（ΡΡ)葡萄糖濃度之效應。於2 hpp胰島素濃度評估，對象10-12 h斷食並攝取包含 75 g 葡萄糖（Trutol 100, CASCO NERL⑧ Diagnostics)之溶液；葡萄糖刺激2h後，抽取血液並鑑定葡萄糖濃度(實 15 驗室 ies Northwest，Tacoma, WA)。 w [0068]圖35圖形化描繪RIAA/相思樹屬（1:5)補充（每曰3藥片）對HOMA評分之效應。HOMA評分係以經發表之方法計算自禁食胰島素及葡萄糖[(胰島素(mcIUImL)*葡萄糖(mg/dL))/405]。 2〇 [0069]圖36圖形化描繪RIAA/相思樹屬（1:5)補充（每曰3藥片）對血清濃度之效應。 [0070]圖37 RIAA或塞來考昔：薑黃素（1:3)對（A) HT-29、（B)Caco-2或（C)SW480結腸癌細胞之抑制百 165 200819120 分比。 [0〇71]圖38 IAA、塞來考昔·薑黃素（1:3)或LY294〇〇2 對（A) HT-29、（B) Caco-2 或（C) SW480 結腸癌細胞之抑制百分比。圖39 THIAA或塞來考昔：薑黃素（1:3)對（A) 八29、（B)Caco-2或（〇SW480結腸癌細胞之抑制百分比 10 _ 圖40 HHIAA及塞來考昔：薑黃素（1:3)對（A) 分比、（B)Caco_2或（Q SW480結腸癌細胞之抑制百 HT-29圖41紐或塞來考昔··薑黃素（1:3)對（A) 分比（B) Caco_2或（C) SW480結腸癌細胞之抑制百或（c])，42 塞來考昔及 RIAA 混合對(A) HT-29,（B) Caco-2 ^480結腸癌細胞抑制作用之觀察及預期值。 [0076]圖一

Cac〇.2 ^ 3 塞來考昔及 THIAA 混合對(a) HT-29,（B) 期值。或（C) SW480結腸癌細胞抑制作用之觀察及預 [〇077]圖 44 闻 THIAA佶、圖形化顯示攝取940 mg THIAA後之血清谓填!|。 [〇〇78]圖 45 g [〇〇7 頌不血清THIAA可偵測之輪廓與控制組比較。圖 4 描 I會 the 代謝〇fTHIAAbyCYP2C9*l。 166 20

Claims

200819120 十、申請專利範圍： 1 · 一種治療需要之哺乳類易感於蛋白激酶調節癌症之方法，其包括對11甫乳類有效治療量之四氫·異阿伐酸投藥。 5 2. 申請專利範圍第1項之方法，其中四氫-異阿伐酸係選自下組：包括四氫·異蛇麻卓嗣、四氫-異類蛇麻草酮及四氫-附蛇麻草酮。 ® 3· 申請專利範圍第1項之方法，其中調節之蛋白激酶係選自下組·· Abl(T3151)、Aurora_A、Bmx、BTK、 10 CaMKI、CaMKI3、CDK2/細胞週期素 A、CDK3/細胞週期素E、CDK9/細胞週期素ΤΙ、CKl(y)、CKlyl、 CK1Y2、<：ΚΙγ3、CK16、cSRC、DAPK1、DAPK2、 DRAK1、EphA2、EphA8、Fer、FGFR2、FGFR3、Fgr、 Flt4、JNK3、PI3K、Pim-1、Pim-2、PKA、PKA(b)、 15 ΡΚΒβ、ΡΚΒα、ΡΚΒγ、PRAK、PrKX、Ron、Rsld、 _ Rsk2、SGK2、Syk、Tie2、TrkA 及 TrkB。 4·申請專利範圍第1項之方法，其中對激酶調節反應之癌症係選自下組··包括膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、直腸癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、曱狀腺 20 癌及子宮癌。 5· 一種治療需要之哺乳類易感於蛋白激酶調節癌症之組成物，其包括有效治癒量之四氩_異阿伐酸；其中該有效治療量調節癌症相關之蛋白激酶。 167 200819120 6. 申請專利範圍第5項之組成物，其中四氫-異阿伐酸係選自下組·包括四氮·•異蛇麻卓嗣、四氮-異類蛇麻草酮及四氫-附蛇麻草酸I。 7. 申請專利範圍第5項之組成物，其中該組成物進一步 5 包括選自下組之醫藥可接受賦形劑：塗覆物、等張性及吸收延遲劑、結合劑、附著劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、香味劑、增甜劑、吸收劑、清潔劑及乳化劑。 i 8. 申請專利範圍第5項之組成物，其中該組成物進一步包括一或多種選自下組之成員：抗氧化劑、維生素、 10 礦物質、蛋白質、脂肪及碳水化合物。

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