TW200816982A

TW200816982A - Xanthohumol and tetrahydro-isoalpha acid based protein kinase modulation cancer treatment

Info

Publication number: TW200816982A
Application number: TW096122216A
Authority: TW
Inventors: Matthew L Tripp; John G Babish; Jeffrey S Bland; Amy Hall; Veera Konda; Linda M Pacioretty; Anu Desai
Original assignee: Metaproteomics Llc
Priority date: 2006-06-20
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2008-04-16
Also published as: AU2007261400A1; TW200817027A; EP2046353A4; TW200817023A; US20080031894A1; WO2007149505A2; EP2043622A4; WO2007149523A3; WO2007149523A2; WO2007149505A3; WO2007149481A2; WO2007149504A2; JP2009541325A; JP2009541326A; AU2007261399A1; TW200819121A; WO2007149504A3; TW200816980A; US20080026088A1; EP2046355A2

Description

200816982 九、發明說明：相關申請案之交互參照本專利申請案為2003年6月18曰申請之美國申請案序號10, 464, 410之部分接續申請案，其係為2003年3月26 曰申請之美國申請案序號1〇/4〇〇,293及2003年3月26日申請之美國申請案序號10/401,283之部分接續申請案，二者係依35 U.S.C..§ 119(e)主張2003年2月25日申請之臨時申請案第60/450, 237號及2002年10月21日申請之臨時申請案第60/420, 383號之利益；且為一 2003年6月18日申請之美國專利申請案序號10/464,834之部分接續申請案’其為2003年3月26曰申請之美國申請案序號 107400, 293之部分接續申請案及2003年3月26日申請之美國申請案序號10/401,283之部分接續申請案，二者係依35 U· S· C· · § 119(e)主張2003年2月25曰申請之臨時申請案第60/450, 237號及2002年10月21日申請之臨時申請案第 60/420, 383號之利益。此申請案亦為2001年6月20日申請之美國申請案序號09/885, 72Ί並獲頒為U.S. 7, 205, 151之部分接續申請案且亦為2002年6月20日申請之美國申請案序號10/480, 145及獲頒為U· S· 7, 195, 785之部分接續申請案。這些早期申請案之内容係以引用的方式併入本中就如同引述其全文。【發明所屬之技術領域】本發明一般係關於可用於治療或抑制易受蛋白質激酶調節影響之癌症之方法及組合物。更特而言之，本發明係關 5 200816982 於利用通常由蛇麻草（hop)或由相思樹（Jack)屬植物成員中分離出之化合物或衍生物，或其組合物之方法及組合物。【先前技術】訊號傳導提供了一個對於維持正常體内平衡重要的拱形（overarching)調節機制，或若經擾動，係作為引起或造成與許多疾病病理及症狀有關之機制。在細胞層級上，訊號傳導係指訊號之移動或由細胞外部傳遞訊號至細胞内部。訊號，——旦到達其受體目標，可引發許多細胞事件所必需之配體-受體交互作用，其中某些可進一步作為後續訊號.這些交互作用不僅作為串集，同時亦為能提供微調控制體内平衡過程之錯綜衩雜的訊號情事之交互作用網路或網絡。然而這些網路可變成失調，因而導致細胞活性改變以及在反應細胞間表現之基因作用方式改變。參見，例如圖1係顯示交互作用的激酶網調節胰島素敏感性及阻抗性之簡圖。訊號傳導受體一般係分為三類。第一類受體為穿透細胞膜並具有一些内生酵素活性之受體。具有内生酵素活性之代表性受體包括酪胺酸激酶（例如PDGF、胰島素、EGF及FGF受體）、酪胺酸磷酸酶（例如T細胞及巨噬細胞之CD45[群集決定因子（cheer 45]蛋白）、鳥苷酸環化酶（例如納尿肽受體）及絲胺酸/蘇胺酸激酶（例如激活素及TGF - /5 受體）。具有内升性酿胺酸激酶活性之受體能自動碟酸化以及將其他基質磷酸化。第二類受體為在細胞内與GTP-結合及水解蛋白（稱為G一蛋白）偶合之受體。這類與G-蛋白作用之受體具有特徵為7 6 200816982 個跨膜區域之結構。這些受體稱為蛇形（serpentine)受體。此類之實例有腎上腺素受體、氣味受體及某些荷爾蒙受體 (例如’升糖素、血管收縮素（angiotensin)、血管升壓素 (vasopressin)及緩激肽（bradykinin))。第三類受體可描述為在細胞内發現及經與配體結合後，遷移至配體-受體複合物係直接影響基因轉錄之細胞核的受體。編碼受體酪胺酸激酶（RTK)之蛋白質含有四個主要區域，其為·· a)—跨膜區、b)—胞外配體結合區、c)一胞内調節區及d) —胞内酪胺酸激酶區。RTK之胺基酸序列係高度地以cAMP-依賴蛋白質激酶（在ATP及基質結合區内）之胺基酸保留。RTK蛋白質係分類為以其胞外蛋白結構特性為基礎之家族，其包括富含半胱胺酸區、類免疫球蛋白區、鈣黏附素 (cadherin)區、富含白胺酸區、環餅區（Kringle domain)、酸性區、纖連蛋白（^]31'0116(：1^11)第111型重複區、類盤狀 Kdiscoidin I-like)區及類EGF區。依照這些存在之不同胞外區，RTK已再細分為至少14個不同的家族。許多具有内生性酪胺酸激酶活性之受體因磷酸化而與其他訊號傳遞聯集之蛋白相互作用。這些其他蛋白包含一胺激酸序列區，其係與首先原致癌基因中辨識出之區域同源。這些區域稱為SH2區。含有SH2區之蛋白質與RTK或受體相關之酪胺酸激酶之相互作用導致含SH2蛋白質之酪胺酸磷酸化。所生成的磷酸化產生活性上之改變（正向或負向）。數個具有内生性酵素活 7 200816982 性之含SH2蛋白質包括磷脂酶C- 7 (PLC- r )、原致癌基因 c-Ras相關之GTP酶活化蛋白（rasGAP)、磷酯醯肌醇-3-激酶 (PI-3K)、蛋白質酪胺酸磷酸酶-IC(PTPIC)，以及蛋白質酪胺酸激酶（PTK)Src家族之成員。非受體蛋白質酪胺酸激酶（PTK)係藉由及大量與本身缺

乏酵素活性之細胞受體偶合。經由蛋白相互作用之受體訊號傳遞實例包括胰島素受體（IR)。此受體具有内生性酪胺酸激酶活性，但不直接在自體磷酸化後與含SH2區之酵素活性蛋白質（例如PI-3K或PLC-r )作用。取而代之的，此主要的IR 受質為一種稱為IRS-1之蛋白。卜7(^—泠超家族之受體代表原型化受體絲胺酸/蘇胺酸激酶（RSTK)。多功能之了GF—石超家族蛋白質包括激活素 =CtlJin)、抑制素（inhibin)及骨形成蛋白質（BMPs)。這些 a白貝可引發及/或抑制細胞增生或分化並調節各種細胞類和黏附°TGF1之—主要效用為經由細胞週期調節和涉及細胞對TGF^反應之核蛋白為一c，其激酶代矣-你七而。疋常之基因的表現。PKA、PKC及MAP …^二種要非雙體絲胺酸/蘇胺酸激酶之種领。之研錢躲_性及疾緣態關係症狀學之本权原因⑲切與疾病相連的疾病為-目前研；=:類風濕性關節炎’ -種自體免疫』研九中之激酶與疾病關係之實例。 ^免疫疾病係因免疫所產生自我抗體，攻擊其本身致，其中身體身.、我及細胞-一種經由蛋 8 200816982 白質磷酸化介導之過程。超過80種臨床上不同的自體免疫疾病已辨識出，且在美國總計約有2仟4百萬人為其所苦。自體免疫疾病可影響身體的組織或态官。因為此多變性，依照自體免疫攻擊的值置，其可造成大範圍的症狀及器官損傷。雖然目前存有許多自體免疫疾病之治療，但對其仍無任何決定性的治療。降低嚴重度之治療常常具有不利的副作用。類風濕性關節炎（RA)為最普遍及最佳自體免疫疾病之研究，且全世界約有1%的人口為其所苦，而如同其他自體免疫疾病’原因仍未知，且患病人口仍在增加。RA的特徵為慢性滑囊發炎造成漸進式關節之骨骼及軟骨破壞。細胞激素、趨化激素及前列腺素為主要的發炎傳遞因子，並可在活性疾病病患之關節和血液中大量發現。例如，PGE2係大量地存在 RA病患的滑囊液中。PGE2量增加係由導入環氧化酶-2 (COX-2 ；) 所引起並在發炎位置能引發一氧化氮合成酶（iN〇S)。[參見，例如van derKraanPM及van den Berg WB· Anabolic and destructive mediators in osteoarthritis. Curr Opin Clin NutrMetab Care, 3:205-211，2000 ; ChoyEHS及Panayi GS. Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis· N Eng J Med· 344:907-916，2001; 及 Wong BR，#A，TargetingSykasatreatmentfor allergic and autoimmune disorders. Expert Opin

Investig Drugs 13:743-762， 2004·] 對人類RA之病源學及致病病理了解仍貧乏，但其進程可 9 200816982 分三階段來看。開始期，在此期樹突細胞出現對抗自體反應 T細胞之自身抗原。τ細胞經由細胞激素活化了自體反應b細胞，導致自身抗體產生，其依次於關節上形成免疫複合物。在效應物期，免疫複合物於巨噬細胞及肥大細胞上與Fcf受體結合’導致細胞激素及趨化激素、發炎和疼痛釋放出。在最終期，細胞激素及趨化激素活化及招募滑囊纖維母細胞、破骨細胞及多形核嗜中性細胞，釋放蛋白酶、酸及R0S例如 02- ，導致不可逆之軟骨和骨質破壞。在膠原蛋白引發RA的動物模型中，T及B細胞的參與對引發疾病是必須的。在抗原受體觸發後，B細胞活化經由脾臟酪胺酸激酶（Syk)及磷酯醯肌醇3-激酶（PI3K)傳遞訊號 [Ward SG， Finan P. Isoform-specific phosphoinositide

3- kinase inhibitors as therapeutic agents· Curr Op in Pharmacol· Aug;3(4):426-34，（2003)]。待抗原受體在B 細胞上接合後，Sky於三個酪胺酸上磷酸化。Syk為一種 72-kDa蛋白質-路胺酸激酶，其在將免疫識別受體偶合至多下游訊號傳遞路徑上扮演著一個中樞性的角色。這個功能為其催化活性及其參與含SH2區作用蛋白質相互作用能力之性質。Tyr-317、-342及-346之磷酸化創造了含多個SH2區蛋白之停泊位點[Hutchcroii;，J. E.，Harrison, M. L. & Geahlen, R. L. (1992). Association of the 72-kDa protein-tyrosine kinase Ptk72 with the B-cell antigen receptor. J· Biol. Chem. 267: 8613 —8619，（1992)及 Yamada，T·，Taniguchi，T., Yang，C.，Yasue，S.，Saito, 10 200816982 Η. & Yamamura, H. Association with B-cell antigen cell antigen receptor with protein-tyrosine kinase-P72(Syk) and activation by engagement of membrane IgM. Eur. I. Biochem. 213: 455—459，（1993)]。

Syk已顯示為活化PI3K，回應包括B細胞抗原受體（BO) 及巨噬細胞或嗜中性細胞Fc受體接合之各種訊號所必須。 [參見Crowley，Μ· T·，等人，.J. Exp· Med· /從，1027— 1039，（1997); Raeder，Ε· M·，等人，J. lmmun〇i· 163， 6785 — 6793，（1999);及 Jiang，K·，等人，Blood 101， 236-244，（2003)]。在B細胞中，BCR-刺激PI3K之活化作用可經由銜接蛋白質例如BCAP、CD19或Gabl之麟酸化來進行，其創造了 PI3K之p85調節亞單位之結合位置。藉由許多igG 受體傳輸訊號需要活化Syk及PI3K二者，及並將其招募至群集受體之位置。在嗜中性細胞及單核細胞中，以FcgRIIA上之活化模體序列為基準之PI3K與磷酸化免疫受體酪胺酸之直接結合被認為是招募PI3K至受體之機制。且最近已有報告指出Syk及PI3K間之直接分子交互作用[Moon KD，等人， Molecular Basis for a Direct Interaction between the Syk Protein-tyrosine kinase and Phosphoinositide 3-kinase· J· Biol· Chem· 280， No· 2， Issue of January 14， pp· 1543-1551，（2005)]。許多的研究已顯示COX-2活性之抑制劑會導致p(jE2產生減少並有效的舒緩患有慢性關節炎症狀（例如RA)病患之疼痛。然而，因為C0X-1及C0X-2涉及重要的組織例如胃腸道及 11 200816982 伽1糸ι功能維護，所以對抑制cqx酵素活性藥劑之不夜t T之關注逐漸升高。因此，設計一種供這些病患舒緩 1嗝之安全、長期治療方法是必須的。因為cox—2及iNOS合、^引务劑係經由Syk、PI3K、p38，ERK1/2及NF-kB依賴路徑傳送訊號，這祕徑之抑制射為自體免疫症狀之治療劑，特別是用於RA病患之發炎及退化中的關節。，RAW 264·7小鼠發炎之巨噬細胞模型中對PGE2抑制作用之篩選，發現了蛇麻草衍生物Rh〇異阿伐酸（is〇alpha acid) (RIAA)。在本研究中，吾等評估了RIM是否為一直接的⑶义酵素抑制劑及/或其是否抑制了 C0X-2及iNOS之引入。吾等發現RIAA無法直接抑制cox酵素活性，但取而代之的，抑制了 NF-kB驅動酵素引入，而使吾等研究以―是否為一激酶抑制劑。吾等發現，rIAA抑制了 Syk及pi3K二者，而使吾等以先驅研究试驗其在患有各種自體免疫疾病之病患中之效力。目别正在研究其與疾病症狀關聯性之其他激酶，包括

Aurora、FGFB、MSK、RSE及SYK。

Aurora-重要的細胞分裂調節劑，絲胺酸/蘇胺酸激酶之 Aurora豕族包括Aurora A、B及C。Aurora A及B激酶已辨識出在有絲分裂中具有直接但不同的作用。這三種同質物 (isoform)之過度表現與各種範圍的人類腫瘤類型，包括白血病、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤及子宮頸癌相關聯。纖維母細胞生長因子受體（FGFR)為一種受體酷胺酸激 12 200816982 酶。此受體之突變可導致經由受體二聚化作用之持續活化、激酶活化及增加對FGF之親和力。;FGFR已與軟骨發育不全、血管新生及先天性疾病相關聯。 MSK(促分裂原-及壓力-活化蛋白質激酶）〗&MSK2為在活體中活化ERK(胞外-訊號-調節激酶）ι/2或抑8 (促分裂原活化蛋白質激酶）路徑下游之激酶，且為CREB(cAMp反應元件結合蛋白）及組蛋白H3之磷酸化所必須。

Rse主要係高度地表現於腦中。Rse亦稱為Brt、BYK、 Dtk、Etk3、Sky、T i f或海-相關受體路胺酸激酶，係為一種受體路胺酸激酶’其主要的作用為保護神經元免於调亡。 Rse、Axl及Mer屬於新_識出之細胞黏时子相關受體胳胺酸激酶之家族。GAS6為-路胺酸激酶受體Rse、―及^ 之配體。GAS6係作為生理抗發炎劑，係由靜止的職產生且當前發炎刺激啟動EC之前黏附機制時耗盡。 =合朗激酶-3(GSK_3)存在有二種同f物’經辨識為-涉=制肝醣代謝之酵素，且可作為細胞增生及細胞死亡之調㈣彳。不同於許㈣絲賊/蘇胺酸成性活性且如職島域生長时較啦卩制。其在肌二肝醣合成讀島素触巾的翻使其絲狀治療介人之引人注意的目標。減代谢症 r二:5Γ已顯示為胰島素阻抗發生之焦點。抑制 GSK3’不僅I由增加葡萄糖處理率同時亦藉由抑制肝中的醣質新生基ϋ例如魏料丙喊羧基激酶: 麟酸酶來改善胰島素阻抗。再者，選擇性的_抑^劑，在 200816982 活體外或活體中賦予肌肉葡萄糖運輪及利用之胰島素依賴活化作用。GSK3亦直接磷酸化胰島素受體基質—丨之絲胺酸/ 蘇胺酸殘基，其導致了胰島素訊號傳遞減損。GSK3在胰島素訊號傳遞路徑中扮演一個重要的角色，且其在缺乏胰島素下磷酸化及抑制肝醣合成[parker，p· j·，Caudweli，F. 及Cohen，Ρ· (1983)及/厂 / 万130:227-234]。有越來越多的證據支持GSK-3在調節骨骨各肌葡萄糖運輸活性中之負面的角色。例如，以選擇性GSK-3抑制急性治療胰島素阻抗嚅齒動物改善了整體胰島素敏感性及胰島素在肌肉葡萄糖運輸之作用。以專一性GSK-3抑制劑慢性治療胰島素阻抗糖尿病前期肥胖的Zucker大鼠增進了口服葡萄糖财受性及整體胰島素敏感性，並與改善血脂異常及改善骨骼肌之 IRS-1-依賴性胰島素訊號傳遞。這些結果提供了肌肉中 G S K - 3之選擇性訂定目標可作為治療肥胖症有關的胰島素阻抗之有效干預之證據。

Syk為一涉及由B細胞受體及IgE受體傳遞訊號之與 ZAP-70有關的非受體酪胺酸激酶。Syk在這些受體間與丨丁雇部分結合’及引發經由Ras、PI 3-激酶及PLCg訊號傳遞路徑之訊5虎傳遞。Syk在胞内訊號傳遞扮演一個重要的角色，且因此為發炎疾病和呼吸疾病之重要的目標。因此’找出能調節單一或多種選擇的激酶之表現或活性之方法及組合物係為有用的。了解各種蛋白質激酶及激酶路徑間之關係和相互作用的複雜性，增強了發展能作為對多種激酶或多種激酶路徑具有有利活性之蛋白質激酶調節劑、調 14 200816982 酶路=抑制劑之樂劑的迫切需求。特定以一種激酶或一種激複雜=為路徑為目標之單一藥劑方式，可能不適合治療非常夕種& =病、症狀及病症，例如糖尿病及代謝症候群。調節酶之活性可另外產生協乘性治療效用，其經由單-激酶调郎是無法得到的。

#用此凋即及使用可能需要持續的用於慢性症狀或間歇的性成j八發炎時（為症狀本身或為許多疾病和症狀之整體用於:而要。此外，作為激酶調節劑之組合物可廣泛的作 U '種哺乳動物之病症。本發明係描述由蛇麻草或相思樹性，生出之化合物及萃取物，其可用於調節激酶活方法而提供了治療許多疾病相關症狀伴隨增加生活品質之【發明内容】明—般係關於可用於治療或抑制易受蛋白質激酶 i::ί癌症之方法及組合物。更特而言之，本發明係關中由蛇麻草（h°p)或料思樹调植物成員刀，出之化合物或衍生物，或其組合物之方法及組合物。物ιΐί發㈣—具體例巾係描述治療有此需要之哺乳動此哺^蛋白該_節之癌症之方法。财法包括投予自礼動—治療:上有效量之查爾酮（chalcone) 物一具體例中係描述治療有此需要之哺乳動 :二4=調節之癌症之'组合物，其令該組合物係症有關的蛋白質激2查而該治療上有效量調節了癌 15 200816982 在本發明另-具體例中係描述治療有此需要之哺乳動物其反應蛋白質輯調節之癌症之組合物。該方法包括投予此哺乳動一治療上有效量之四氫異阿伐酸。在本發明另-具體例中係描述治療有此需要之哺乳動物其反應蛋白質激酶調節之癌症之組合物，其中該組合物係包含-治療上有效量之四氫異阿賊，而該治療效節了癌症有關的蛋白質激酶。 _ 【實施方式】本發明-般係關於可用於治療或抑㈣受蛋白質激酶洞喊影響之癌症之方法及組合物。更特而言之，本發明係關於利用通常由蛇麻草（hop)或由相思樹（也此/3)屬植物成/ 中分離出之化合物或衍生物，或其組合物之方法及組合物。本文所指之專利、公開+請案及科學文獻係為熟習本項技術者所知且其全文係以引用的方式併入本文中，就如同其特定及各別地提出併人作為參考。任何本文所引述的參考文獻與舰明書巾特定的教導間妹何衝突，應以利於後者來決定。同樣地j何字詞或片語之技術所了解的定義與本說明書中#疋教&之子3或片語之定義間的衝突，應以利於後者來決定。本文所用之技術及科學術語具有熟習本項技術者-般所了解之意義’除非另有定義否則亦適用於本發明。本文係言及熟習本項技術者已知之各種方法學及物質。敘述重組 DNA技術一般原理之標準參考文獻包括Sambr〇〇k等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold 16 200816982

Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Kaufman #乂，Eds.，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine，CRC Press，Boca Raton (1995) ; McPherson， Ed·， Directed Mutagenesis: A Practical Approach，IRL Press，Oxford (1991)。敘述藥學一般原理之標準參考文獻包括Goodman及Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., McGraw Hill Companies Inc·， New York (2006)。在說明書及所附的申請專利範圍中，除非文中清楚的指出，否則單數形式包括複數的指示物。除非文中清楚的指出，否則如本說明書中所用，單數形式「一（a、an及the)」亦特定涵蓋其所指術語之複數形式。此外，除非有特別指出否則如本文中所用之「或」一詞係用在「及/或」所「包括 (inclusive)」的意義且不「排除（exciusive)」在「或 (either/or)」意義之外。術語「約」用於本文係指大約、在範圍内、大致或在附近。當術語「約」輿數字範圍聯合使用時’其係藉由將所述的數值界線向上或向下延伸修改範圍。一般而言，術語「約」於本文係用於以20%變化向上及向下修改所述之值。如本文所用，詳述變數之數字範圍係希望傳達本發明能以可變的相當於範圍内之任何值來施行。因此，就本質上為不連續的變數而言，該變數可等於數字範圍内之任何^數… 值，包括範圍的末端值。同樣的，就本質上為連續的變數而言，該變數可等於數字範圍之任何實數，包括範圍的末端 17 200816982 。例如’描述具有介於G及2間之值之變數，可為j 就本質上為不連續的變數，並可為G. G、（U、〇 G、卜〇 _ 或任何其他本質上為連續的變數之實數。 .1 耐：地論及本發明之特定具體例。當本發明與這二寸疋，、體例&㈣料，應了解，並不希望將本發 =等特定的具體例中。相反的，如所附的申請專圍之定義，在可包含於本發明的精神後X、方案、修改及同等物多:望涵蓋選擇 “月以k t、王面了解本發明。在無某些或所有這些下，亦可施行本發明。在其他實财，熟知詳述，以便於不會—制使本發日賴顧 *作亚恶熟習本項技術者已知之任何適合的物質及/或方用於進打本發明m描職佳_質及方法 =明^則下列說明及實例财及之物f、試劑及其類似物口口可從市面上購得。 /、、 1易具?例係揭示治療有此需要之哺乳動物 /、易又虫白貝激_調節影響之癌症之方法， t投予哺乳動物-治療上有效量之查_。在此== 皂方面，查爾酮為黃腐酚或異黃腐酚。 /、又在此具體例之其他方面，調節之蛋白質組成之群中選出：Abl (Τ315Ι)、ω4、Auiwa、m =r=trDK〜週期素E、CDK5/P35、CDK6/週期素D3、闇 CHKl.CHK2^CKl(y)^CKlrl.CKlr2.CKlr3；fKi5； 200816982 cKit(D816H)、cSRC、DAPKl、DAPK2、DRAKl、EpM8、EphBl、 ErbB4、Fer、Fes、FGFR2、Fgr、Flt4、Fyn、GSK3/3、GSK3a、 Hck、HIPK2、ΙΚΚΘ、IRAIQ、JAK3、Lyn、MAPK1、ΜΑΡΚΑΡ-K2、 MAPKAP-K3、MINK、MSKI、MSK2、MSSK1、p70S6K、PAK3、PAK5、 PAK6、PMr 2、PI3K、Pim-1、Pim-2、PKA、PKA(b)、PKB/5、 PKB α、PKB r、PRAK、PrKX、Rsld、Rsk2、SGK、SGK2、Syk、 TBK1、Tie2、TrkA、TrkB 及 TSSK2。又其他方面，易對激酶調節反應之癌症係由下列組成之群中選出：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、肺癌、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌及子宮癌。在本發明另一具體例係揭示治療有此需要之哺乳動物其易受蛋白質激酶調節影響之癌症之方法，其中該方法係包括投予此哺乳動物一治療上有效量之四氫異阿伐酸。在此具體例之某些方面，該四氫異阿伐酸係由四氫異律草酮 (tetrahydro-isohumulone)、四氫異類蘀草酮 (tetrahydro-isocohumulone)及四氫異近蘀草酮 (tetrahydro-isoadhumulone)組成之群中選出。又在此具體例之其他方面，調節之蛋白質激酶係由下列組成之群中選出：Abl(T315I)、Aurora-A、Bmx、BTK、CaMKI、 CaMKI d、CDK2/週期素 A、CDK3/週期素 e、CDK9/週期素 ΤΙ、 CKl(y)、CK1 r 1、CK1 r 2、CK1 τ 3、CK1 、cSRC、DAPK1、 DAPK2 ' DRAK1 、 EphA2 、 EphA8 、 Fer 、 FGFR2 、 FGFR3 、 Fgr 、 Flt4、JNK3、P13K、Pim-1、Pim-2、PKA、PKA(b)、PKB/3、 PKB α、PKB r、PRAK、PrKX、Ron、Rskh Rsk2、SGK2、Syk、 19 200816982

Tie2、TrkA 及 TrkB。又在此具體例之其他方由下列組成之群中選出：取⑽匆對破酶調節反應之癌症係勝癌、Ί广

肺癌、白血病、黑色素瘤、乂孔頰、子宮頸癌、大腸癌、用於此具體例方法:組:列腺癌、甲狀腺癌及子宮癌。下列組成之群中選出之成員，物y進一步包含一或多種由蛋白質、油脂及碳水化合物或氧化物、維生素、礦物質、群中選出之賦形劑：包膜、樂上可接受之由下列組成之著劑、潤滑劑、崩解劑、I :、張及及收延遲劑、結著劑、黏 j考色劑、二田+丄洗滌劑及乳化劑。 ’味劑、甜味劑、吸收劑、如文中所用，「疾病相激酶或激酶之群族或家族破_」係指該等各別蛋白質作為加劇所論及之疾病症妝直接疾病之原因或其活性係與片語「蛋白質激酶調節=;關者。蛋白質激酶調節（上調或下曾；又4者之健康」係指其中病之症狀或增加第二種治形—欠減少、預防及/或逆轉疾片語「易對蛋白質激酶調性之該等例子。本發明化合物a)直接調節癌細胞 j指其中制）；b)調如目標癌細胞之社或生長抑節產生右二轉’其中該調節聯集或給予之激酶3 即產生有利於受試者健康之了〈构》周使癌細胞更易感受第二種；：:二目標激酶致之該等例子。絲式（例如化療或放射線治療）如本明書+所用’無論是在轉折#語或申請專利範圍 20 200816982 本體中，術語「包含（comprise及comprising)」係應解釋為具有開放式意義。亦即，該術語應解釋為與片語「具有至少」或「包括至少」同義。當用於製程之内容中時，術語「包括」係4曰該製程包括至少所提及之步驟，但可包括另外的步驟。當用於化合物或組合物之内容中時，術語「包含」係指該化合物包含至少此所提的特性或化合物，但亦可包括另外的特性或化合物。如文中所用，術語「衍生物」或「衍生」一事係指一化學物質在結構上與另一物質相關，且理論上可由其得之，亦即可從另一物質製造之物質。衍生物可包括經由化學反應得來之化合物。如文中所用，術語「蛇麻草萃取物」係指（1)將蛇麻草植物產品暴露於溶劑中，（2)將溶劑由蛇麻草植物產品中分離出，及（3)去除溶劑所產生之固體物質。「酒花粕（spent hop)」係指蛇麻草萃取製程後，蛇麻草植物產品之殘渣。蛇麻草化學之詳細論述請參見Verzele，M·及De Keukeleire， D·，Developments in Food Science 27: Chemistry and Analysis of Hop and Beer Bitter Acids, Elsevier Science Pub· Co·，1991，New York，USA，其全文係以引用的方式併入本文中。如文中所用，當有關RIAA，「Rh〇」係指該等還原的異阿伐酸，其中該還原係將4-曱基-3-戊烯醯基側鏈之羰基基團還原。如文中所用，術語「溶劑」係指具有從蛇麻草植物產品中萃取固體物質之必要特性之水性或有機性質之液體。溶劑 21 200816982 之實例包括（但不限於）水、蒸氣、過熱水、甲醇、乙醇、己烷、氯仿、液態c〇2、液態沁或任何此等物質之組合物。如文中所用，術語「C〇2萃取物」係指將蛇麻草植物產品暴露於液態或超臨界c〇2製備物中，接著隨後移除c〇2所產生之固體物質。術浯「醫樂上可接党」係在與組合物之其他成份相容及對其賦形劑無害的觀念下使用。

如文中所用’「化合物」可由其化學結構、化學名稱或俗名來辨識。當化學結構及化學名稱或俗名相衝突時，化學結構為辨識化合物之決定要件。本文所述的化合物可含有一或多個對掌甲心及/或雙鍵’因此可以立體異構物存在，例如雙鍵異構物（亦㈣何異構物）、鏡像異構物或非對映異構物。因此’本文所描繪的化學結構伽蓋所說明或辨識化合物之所有可能的鏡像異構物及立體異構物，包括純立體異構形式（例如純幾何異構形、純鏡像異構形或純非對映異構形）及=異構形和立體異構形混合物。鏡像異構形和立體異構 =:,σ_物可使用熟習本項技術者已知之分離技術或對掌合、術解析成其成份鏡像異構物或立體異構物。化合物亦可 2種互變異構物形式存在，包括騎形式、_式及其混 1Γ因此’核所描_化學結構餘蓋所說明或辨識化有可能的互變異構物形式。所述之化合物亦涵蓋其 :或夕個原子具有之分子量與天然界發現習知之分子量勺:冋位素標定化合物。可併人化合物中之同位素之實例。括（但不限於)¾、m 15ν、18〇、17〇等。化合物可 22 200816982 以非溶劑化物形式以及溶劑化物形式存在，包及為N—氧化物形式。-般而言，化合物可為水合、或N-氧化物。某些化合物可以多晶體鱗晶形式存在二物之同類物、獅物、水解產物、代嶋及前㈣或前^ 涵盖在本發明之範圍内。-般而言，除非另有指出則本文所涵蓋之贱’所有物理形式皆轉歸 =

範圍中。 X

本發明之化合物可以鹽類存在。特別是涵蓋化合物之殺藥上可接受翻。本發明之「醫藥上可接受鹽」為本發明: 合物與酸紐化合，與該化合物形成鹽（例如，鎂_ 係指"Mg”或”Mag”），且在治療狀況下可為受試者^受…妒而言，本發明化合物之醫藥上可接受鹽類具有丨或更大之= 療指數（最低毒_量與最低治療上有效缝之比率）。熟^ 本項技術者應了解’最储療上有效鮮將依受試者及^ 症而不同，並因而據此作調整。 “ ^^t^(hoph〇ps)j##^(Humuius) f之植物果實，其含有苦芳香油，係用於釀、肚業防止細菌 =及於相中添加特殊苦味。更佳地，所㈣蛇麻草係由 kMXHumulus hipulus)々H。如文巾所用’術語「相思樹（aeaeia)」制旨任何豆科樹成貝及相_屬之灌木。較佳地，從相思樹衍生之植物化合物係由兒茶樹（如奶·5如)或阿拉伯金合歡（如心 n/Jot/ca)所衍±。本發明化合物係視需要與熟知之醫藥上可接受載劑，包 23 200816982 括稀釋劑及賦形劑調配於醫藥上可接受媒劑中（參見 Remington s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. , Gennaro,

Mack Publishing Co·，Easton，PA 1990 及 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins，1995)。用於產生本發明組合物之醫藥上可接受載劑/媒劑將依組合物投予哺乳動物之模式而不同，一般醫藥上可接受載劑為生理上惰性及無毒的。本發明組合物之調配物可含有一種以上的本發明化合物以及任何其他可用於治療所欲治療之癥狀/症狀之藥理活性成份。如文中所用之術語「調節（modulate或modulation)」係指以所指之化合物、成份等上調或下調酵素之表現或活性。如文中所用，術語「蛋白質激酶」係代表轉移酶類酵素，其能將麟酸基團由捐贈分子轉移至蛋白質之胺基酸殘基上。就蛋白質激酶及家族/群族命名之詳細論述請參見 Kostich, Μ., Human Members of the Eukaryotic

Protein kinases Family, Genome Biology 3(9) · research 0043· 1-0043· 12，2002’其全文係以引用的方式併入本文中。激酶之代表性、非限制實例包括AM、Abl(T3151)、ALK、 ALK4、AMPK、Arg、Arg、ARKS、ASIQ、Aurora-A、Ax、Blk、 Bmx 、 BRK 、 BrSKl 、 BrSK2 、 BTK 、 CaMKI 、 CaMKII 、 CaMKIV 、 CDK1/週期素B、CDK2/週期素A、CDK2/週期素E、CDK3/週期素 E、CDK5/p25、CM5/p35、CDK6/週期素 D3、CDK7/週期素 H/MAT1、CDK9/週期素 ΤΙ、CHD、CHK2、CK1 (y)、CK1 6、CK2、 CK2a2、cKit(D816V)、CKit、c-RAF、CSK、cSRC、DAPK1、 24 200816982 DAPK2、DDR2、DMPK、DRAKl、DYRK2、EGFR、EGFRCL858R)、 EGFR(L861Q)、EphAl、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA7、 EphA8、EphBl、EphB2、EphB3、EphB4、ErbB4、Fer、Fes、 FGFR卜 FGFR2、FGFR3、FGFR4、Fgr、Fit卜 Flt3(D835Y)、 FIt3、FIt4、Fms、Fyn、GSK3 /3、GSK3 a、Hck、HIPK1、HIPK2、 HIPK3、IGF-1R、IKK/3、IKKa、IR、IRAKI、IRAK4、IRR、 ITK、JAK2、JAK3、JNKI a 1、JNK2 a 2、JNK3、KDR、Lck、 LIMK1、LKB1、LOK、Lyn、Lyn、MAPK1、MAPK2、MAPK2、 MAPKAP-K2 、 MAPKAP-K3 、 MARK1 、 MEK1 、 MELK 、 Met 、 MINK 、 MKK4、MKK6、MKK7 石、MLCK、MLK1、Mnk2、MRCK /3、MRCK a、 MSIO、MSK2、MSSK1、MST1、MST2、MST3、MuSK、NEK2、NEK3、 NEK6、NEK7、NLK、p70S6K、PAK2、PAK3、PAK4、PAK6、PAR-IB a、PDGFR石、PDGFRa、PDIQ、PI3K/3、PI3IU、PI3Kr、 Pim-1、Pim-2、PKA(b)、PKA、PKB/5、PKBa、PKBr、PKC/z、 PKC/5 I、PKC/3 II、PKCa、PKCr、PKC5、PKCe、PKCr、 PKC ;/、PKC Θ、PKC i、PKD2、PKG1 β、PKG1 a、Plk3、PRAK、 PRK2、PrKX、PTK5、Pyk2、Ret、RIPK2、ROCK-1、ROCK-11、 ROCK-11、Ron、Ros、Rse、Rsld、Rsk I、Rsk2、Rsk3、SAPK2a、 SAPK2a(T106M)、SAPK2b、SAPK3、SAPK4、SGK、SGK2、SGK3、 SIK、Snk、SRPK1、SRPK2、STK33、Syk、TAK1、TBK1、Tie2、 TrkA、TrkB、TSSK1、TSSK2、WNK2、WNK3、Yes、ZAP-70、 ZIPK。在某些具體例中，該激酶可為ALK、Aurora-A、Axl、 CDK9/週期素 ΤΙ、DAPK1、DAPK2、Fer、FGFR4、GSK3B、GSK3 a、Hck、JNK2 a 2、MSK2、p70S6K、PAK3、PI3K (5、PI3K t、 25 200816982 ΡΚΑ、PKByS、ΡΚΒα、Rse、Rsk2、Syk、TrkA 及 TSSK1。又在其他具體例中，該激酶係由下列組成之群中選出：abl、 AKT 、 AURORA 、 CM 、 DBF2/20 、 EGFR 、 EPH/ELK/ECK 、 ERK/MAPKFGFR、GSK3、IKKB、INSR、JAK DOM 1/2、MARK/PRKAA、 MEK/STE7 、 MEKK/STE11 、 MLK 、 mlOR 、 PAK/STE20 、 PDGFR 、 PI3K、PKC、POLO、SRC、TEC/ATK 及 ZAP/SYK。本發明之方法及組合物係可望用於任何哺乳動物，其可瞻經驗本發明方法之利益。此等哺乳動物中最重要的為人類，雖然並不希望就此限制本發明，但亦能應用於獸醫用途。因此，依據本發明，「哺乳動物」或「有需要之哺乳動物」包括人類以及非人類之哺乳動物，特別是飼養的動物，其包括 (但不限於）貓、狗及馬。如文中所用，「自體免疫病症」係指該等當宿主之系統被宿主自身之免疫系統攻擊時，所引起之疾病、病症及症狀。自體免疫疾病之代表性、非限定實例包括斑禿、僵直性 _ 脊椎炎、關節炎、抗磷脂質症候群、自體免疫性艾迪生疾病 (Addison’s disease)、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性内耳疾病（亦稱為梅尼爾氏症）、自體免疫性淋巴增生症^ 群（ALPS)、自體免疫性血小板缺乏紫斑症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性肝炎、白塞氏病（Bechet，s dise⑽、克隆氏症（Crohn，s disease)、第丨型糖尿病、腎絲球腎炎、葛瑞夫兹氏病（Graves’ disease)、吉藍-古巴症候群 (Guillain-Bane syndrome)、發炎性腸疾病、狼瘡性腎炎、多發性硬化症、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血、結節性多 26 200816982 動脈炎、多發性肌炎、原發性膽汁性肝硬化、乾癬、風濕熱、類風濕性關節炎、硬皮症、修格連氏症（Sj0gren，s syndrome)、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性結腸炎、白化症及韋格納肉芽腫（Wegener，s granulamatosis)。與自體免疫疾病有關的激酶之代表性、非限制實例包括AMPK、BTK、ERK、 FGFR、FMS、GSK、IGFR、IKK、JAK、PDGFR、PI3K、PKC、PLK、 ROCK 及 VEGFR。如文中所用，「過敏疾病」係指對物質、情況環境或身體狀態之異常或病理反應（例如打喷嗓、呼吸窘迫、癢或皮膚起疹子），其在一般個體並無可相比之效應。如文中所用，「發炎疾病」係指對細胞傷害之反應（通常為局部的），其表徵為毛細孔擴張、白血球浸潤、發紅、發熱、疼痛、腫服及經常功能喪失，且其係作為引發消除毒性劑及受損組織之機制。過敏或發炎病症之實例包括（但不限於）氣喘、關節炎、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、胰臟炎、胃炎、良性腫瘤、息肉、这傳性息肉症候群、大腸癌、直腸癌、乳癌、前列腺癌、胃癌、消化器官之潰瘍性疾病、心絞痛、動脈硬化、心肌梗塞、心絞痛及心肌梗塞之後遺症、老年失智症及腦血管疾病。與過敏病症有關的激酶之代表性、非限制實例包括AKT、AMPK、 BTK、CHK、EGFR、FYN、IGF-1R、IKKB、ITK、JAK、KIT、LCK、 LYN、ΜΑΡΚ、MEK、mTOR、PDGFR、PI3K、PKC、PPAR、ROCK、 SRC、SYK 及 ZAP。如文中所用，「代謝症候群」及「糖尿病相關病症」係指胰島素相關病症，亦即對胰島素之反應為疾病之原因或與 27 200816982 疾病或症狀之惡化或抑制有關聯之疾病或症狀。胰島素相關病症之代表性實例包括（但不限於）糖尿素、糖尿病併發症、胰島素敏感性、多囊性卵巢疾病、高血糖、如脂異常、胰島素阻抗、代謝症候群、肥胖症、體重增加、發炎疾病、消化器官疾病、心絞痛、心肌梗塞、心絞痛及心肌梗塞後遺症、老年失智症及腦血管性失智。參見，Harrison's Prinnipipc；〇I.Internal Medicine^ 16h Ed·，McGraw Hill Companies Inc·，New York (2005)。發炎症狀之非限定實例包括消化裔官之疾病（例如潰瘍性結腸炎、克隆氏症、胰臟炎、胃炎、消化器官之良性腫瘤、消化道息肉、遺傳性息肉症候群、大腸炎、直腸癌、胃癌及消化器官之潰瘍性疾病）、心絞痛、心肌梗塞、心絞痛及心肌梗塞後遺症、老年失智症、腦血管性失智、免疫疾病及一般的癌症。與代謝症候群有關的激酶之非限制實例可包括 AKT、AMPK、CDK、CSK、ERK、GSK、IGFR、 JNK、MAPK、MEK、PI3K 及 PKC。「胰島素阻抗」係指，因身體之胰島素依賴過程對胰島素敏感性降低，導致這些過程活性降低或胰島素產生增加或二者。胰島素阻抗為第2型糖尿病之典型，但在無糖尿病時亦可能發生。如文中所用’「糖屎病併發症」包括（但不限於）視網膜病變、心肌梗塞、瀰漫性特異性過度骨化及骨流失、足潰瘍、神經病變、動脈硬化、呼吸自主神經病變及胸腔和肺薄壁組織結構性紊亂、左心室肥大、心血管疾病、腎功能逐漸喪失及貧血。 28 200816982 如文中所用，「癌症」係指任何各種良性或惡性腫瘤其特徵為退行性發育細胞之增生，若為惡性則傾向侵入組織周圍及轉移至新的身體部位。被視為在本發明範圍内之癌症之代表性、非限制實例包括腦癌、乳癌、大腸癌、腎癌、1癌、肝癌、肺癌及前列腺癌。被視為在本發明範圍内與癌症有關的蛋白質激酶之非限制實例包括ABL、AKT、AMPK、Aurora、 BRK、CDK、CHK、EGFR、ERB、FGFR、IGFR、KIT、MAPK、mTOR、 PDGFR、PI3K、PKC 及 SRC。「眼部疾病」係指因發育異常、疾病、損傷或毒素所引起之眼部結構或功能之任何干擾。被視為在本發明範圍内之眼部病症之非限制實例包括視網膜病變、黃斑部退化或糖尿病視網膜病變。與眼部病症有關的激酶包括（但不限於）AMPK、Aurora、EPH、ERB、ERK、FMS、IGFR、MEK、PDGFR、 PI3K、PKC、SRC 及 VEGFR。如文中所用，「神經病症」係指因發育異常、疾病、損傷或毒素所引起之中樞神經系統結構或功能之任何干擾。神經病症之代表性、非限制實例包括阿茲海默症、帕金森氏症、多發性硬化症、肌萎縮性脊髓侧索硬化症（ALS或路•蓋里格氏病（Lou Gehrig，s Disease))、亨丁頓氏症、神經性 <知功此p早礙、老年失智症及情緒障礙疾病。與神經病症有關的蛋白質激酶包括（但不限於）AMPK、CDK、FYN、JNK、MAPI、 PKC、ROCK、RTK、SRC 及 VEGFR。如文中所用，「心血管疾病」或「CVD」係指心臟組織或血管之功能損壞或破壞。與心血管疾病有關的激酶包括（但 29 200816982 不限於）ΑΚΤ、AMPK、GRK、GSK、IGF-1R、ΙΚΚΒ、JAK、JUN、 MAPK、PKC、RHO、ROCK 及 TOR。如文中所用，「骨質疏鬆症」係指其中骨質已變得極度多孔，因而使得骨骼更容易碎裂且復原更缓慢之疾病。與骨質疏鬆症有關的蛋白質激酶包括（但不限於）、AMPK、

CAMK、IRAK-Μ、MAPK、mTOR、PPAR、_、_、SRC、SYR 及 VEGFR。

本發明一具體例係描述於有此需要之哺乳動物中治療易對蛋白質激酶調節反應之癌症之組合物。該組合物係包括 —治療上有效4之查其中該治療上有效量調節了與癌，有關的蛋白質激酶。在此具體例之某些方面，該查爾嗣為 !腐酚或異黃腐酚。 ^此具體例其他方面，組合物進—步係包含由下列組成可接受賦形劑：包膜、等張及吸收延遲月！、名口者劑、黏者劑、潤潛為I、山細甜味劑、吸_、洗_及|色劑、調味劑、成之君又組合物進一步係包含-或多種由下列組士子中l出之成貝.抗氧化物、維生油脂及碳水化合物。 r观貝虫曰貝 ~治療上有效量：二!症之組合物。該組合物係包括了心== 伐酸;其中該治療上有效量調節氫異激酶。在此具體例之某些方面，該四、° I、目H異料_、四氫異類料_及四氮異近 30 200816982 樣草酮組成之群中選出。具體例其他方面，組合物進—步係包含由下列組成二群士造出之醫藥上可接受賦形劑：包膜、等張及吸收延遲劑、^著劑、黏著劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑、甜味劑、吸收劑、洗蘇劑及乳化劑。又在此具體例之其他方面，組合物進—步係包含一或多種由下》丨、、、且成之群巾之成貞：抗氧化物、維生素、礦物 _ 質、蛋白質、油脂及碳水化合物。如文中所用，「治療」係指與非經本發明治療之個體的症狀相比較’能減少、預防及/或逆轉已給予本發明化合物個體者之錄。施行者應了解，文巾所狀化合物、組合物及方法可與熟習技術施行者（醫師或獸醫師）之持續臨床評估共同使用’用以決定後續治療。目此，根據標準方法，治療後施行者將可評估任何肺部發炎治療之改善。此評估將幫助及告知評估是否增加、減少崎續特定的治療劑量、給藥 0 模式等。應了解’投予本發明化合物之對象不需忍受㈣的創傷狀態。事實上，本發明化合物可在任何症狀發生前預防性地給藥。術語「治療」、「治療上」及這些術語之變換係用來包含治療、減緩以及預防用途。因此，如文中所用，「治療或減緩症狀」係指與未接受此給藥之個體的症狀相比較，能減少、預防及/或逆轉已給予本發明化合物個體者之症狀。術語「治療上有效量」係用來表示能有效達到所尋治療結果之治療劑量。再者，熟習技術者應了解，可藉由系、 31 200816982 微調整及/或給予一種以上本發明化合物，或將本發明化合物與另一種化合物共同投予來降低或增加本發明化合物之治療上有效量。參見，例如Meiner，C.L.，”ciinicai Trials: Design, Conduct, and Analysis," Monographs in Epidemiology and Biostatistics, Vol. 8 〇xf〇rd

University Press, USA (1986)。因此，本發明係提供一種對特定所指哺乳動物之特別緊急事件量身訂做的給藥/治療之方法。如下列實例所朗，治療上有效量可容易地決定， =以經驗為主，由較低量開始並㈣評估有_效用逐步熟習本項技術者應了解，本發明化合物之給藥數量，係 1任何料的時間_定病患的醫療 ==齡、體重及哺乳動物的狀況及所選之給藥= 基準’將隨病患而不同。為曰「γ寸疋疾病有關，亦即伴隨「X』之任何事且被認症^之^1 的存在之象徵。請明瞭及了解，徵狀將隨疾病或勺枯、庙放5而變。與自體免疫病症有關的徵狀之非限定實例夕田4、眩暈、不適、器官或組織變大（例如葛瑞夫兹氏低m如大腺種大）或器官或組織破壞導致器官或組織功能降低(1 如。’糖尿病中胰臟之胰島細胞破壞）。 J·生伏吞、過敏有11的疾病或症狀之代紐徵狀包括失神、過敏古廣^_灼' 便秘、咳漱、眼睛周圍及下黑眼圈、胃人巾鬱、腹渴、吞麵難、分心、或注意力集中困難、 32 200816982 晕眩、濕療、窘迫、疲勞、潮紅、心悍、尊麻療“臭覺減損、易怒/行為問題、鼻子、皮膚或喉鱗、關節痛肌肉疼痛、鼻塞、鼻息肉、如、鼻弟倒流（鼻洋後滴）、脈膊跳動快速、鼻漏（流鼻洋）、耳部兵砰響或耳悶脹、呼吸短促、纟膚療子、睡眠困難:打噴嚷、腫脹（血管性水腫）、喉嚨聲新、鼻刺痛、疲倦、眩暈”區吐、流淚或疼或僵硬、或紅眼及喘息。如文中所用’「發炎」或「發炎症狀」係指對細胞傷害 • 《局部反應（通常為局部的），其表徵為毛細孔擴張、白血球浸潤、發紅、魏、疼痛、腫脹聽纽魏喪失，且其係作為引發消除毒性劑及受損組織之機制。發炎或發炎症狀之代表徵狀，若範圍在關節上，則包括發紅、關節腫服其觸摸時為熱的、關節疼痛及關節功能喪失。全身性的發炎反應可產生「類流行性感g」之徵狀，例如發燒、發冷、疲勞/無力、頭痛、沒胃口及肌肉僵硬。 _ 糖尿病及代谢症候群通常無法診斷，因為其許多徵狀似 φ 乎是無害的。例如，某些糖尿病徵狀包括（但不限於）：頻尿、過度口渴、極度飢餓、不正常的體重減輕、疲勞增加、煩躁及視力模糊。神經病症之徵狀為多變的且可包括（但不限於）發麻、刺痛、感覺過敏（敏感性增加）、麻痒、局部化虛弱、構音障礙 (說話困難）、衩視（雙重影像）、認知問題（例如，無法集中注思）、記憶丧失暫日守性黑視（单眼暫時性喪失視力）、走路困難、顫抖、痙攣、困惑、昏睡、失智、譫妄及昏迷。下列實例係意欲進一步說明本發明某些較佳的具體例 33 200816982 且本質上不受p艮。僅使財文所述之例行的實驗、許多特定物質之，物及製程，熟習柄_者魏了解，或應能確定。實例實例1 如上所述，激酶係代表轉移酶類酵素，其能將磷酸基團 • ㈣贈分子（通常為·)轉移至蛋白（通常為蘇驗、絲胺酸或酪胺酸）之胺基酸殘基上。激酶係用於酵素調節之訊號傳導，亦即其可抑制或活化酵素活性，例如在膽固醇生物合成、胺基酸轉化或肝醣週轉中。大多數的激酶係特定在單一種類的胺基酸殘基中，某些激酶具有雙重活性，其中其可磷酸化二種不同的胺基酸。如圖1所示，激酶的功能為訊號傳導及轉譯。才10 /zg RIAA/ml的本發明化合物對人類激酶活 φ 性之抑制效用係於超過200種激酶的面板上以激酶

ProfilerTM 分析（Upstate Cell Signaling Solutions， Upstate USA’ Inc·，Charlottesville，VA，，USA)來進行試驗。特定激酶之分析方法係總述於 htj：|);_//yww· upstate· com/img/Ddf/kD protocols filLL pdf中(最後一次春訪網站僥於2006年〇潜果-在無細胞系統中分析超過205種人類激酶。令人驚訝的，吾等發現所試驗的蛇麻草化合物以10%或更大抑制了 205種中的25種激酶。205種中的八（8)種抑制>20% ; 2〇5 34 200816982 種中的5種抑制>30% ; 2種抑制約50%。特別是在PI3激酶路徑中，蛇麻草抑制了 ΡΙ3Κτ、PI3K 5、ΡΊ3Κβ、Aktl、Akt2、GSK3 a、GSK3/3、P70S6K。應注意，試驗中並無mTOR。蛇麻草化合物RIAA對所試驗的激酶之抑制效用係如下表1所示。表1

於激酶Prof i lerTM分析試驗10 “ g/ml之RIAA對激酶抑制 F用激酶控制％激酶控制％ Abl 93 MAPKAP-K2 98 Abl 102 MAPKAP-K3 97 Abl(T3151) 121 MARK1 101 ALK 84 MEK1 113 ALK4 109 MELK 98 m?m 103 Met 109 Arg 96 MINK 109 Arg 95 MKK4 94 ARK5 103 MKK6 114 ASK1 116 MKK7 冷 113 Aurora-A 77 MLCK 114 Axl 89 MLKi 109 Blk 115 Mnk2 116 35 200816982

Bmx 108 MRCK β 114 BRK 112 MRCKa 119 BrSKl 108 MSI1 97 BrSK2 100 MSK2 89 BTK 97 MSSK1 92 CaMKI 96 MST1 105 CaMKII 119 MST2 103 CaMKIV 115 MST3 104 CM1/週期素B 109 MuSK 100 CDK2/週期素A 94 NEK2 99 CDK2/週期素E 122 NEKS 109 CDK3/週期素E 104 NEK6 98 CDK5/p25 100 NEK7 98 CDK5/p35 103 NLK 109 CDK6/週期素D3 110 p70S6K 87 CDK7/週期素 H/MAT1 108 PAK2 92 CDK9/週期素T1 84 PAK3 54 CHK1 102 PAK4 99 CHK2 98 PAK6 109 CKl(y) 109 PAR-1Ba 109 CK1 5 104 PDGFR/3 109 CK2 122 PDGFR a 101 CK2a2 126 PDK1 118 cKit(D816V) 135 PI3K/3 95 36 200816982 cKit 103 PI3K5 88 c-RAF 101 PI3Ir 80 CSK 108 Pim-1 133 cSRC 103 Pim-2 112 DAPK1 78 PKA(b) 99 DAPK2 67 PKA 66 DDR2 108 PKB/3 87 DMPK 121 PKBa 49 DRAK1 111 PKBr 100 DYRK2 112 PKC// 100 EGFR 120 PKC/3 I 112 EGFRCL858R) 113 PKC /5 11 99 EGFR(L861Q) 122 PKCa 109 EphAl 105 PKCr 109 EphA2 ,115 PKC 5 101 EphA3 93 PKCe 99 EphA4 108 PKcr 107 EphA5 120 PKC 119 EphA7 127 PKC0 117 EphAB 112 PKC i 96 EphBl 134 PKD2 115 EphB2 110 PKGI 冷 99 EphB3 101 PKGla 110 EphB4 113 Plk3 98 37 200816982

ErbB4 123 FRAK 100 Fer 80 PRK2 102 Fes 121 PrKX 94 FGFR1 96 PTK5 104 FGFR2 103 Pyk2 112 FGFR3 109 Ret 96 FGFR4 83 RIPK2 98 Fgr 102 ROCK-I 105 Fltl 102 ROCK-11 90 Flt3(D835Y) 103 ROCK-11 105 Flt3 108 Ron 102 Flt4 110 Ros 94 Fms 105 Rse 84 Fyn 100 Rskl 93 GSK3/5 82 Rskl 95 GSK3a 89 Rsk2 89 Hck 83 Rsk3 95 HIPK1 98 SAPK2a 111 HIPK2 113 SAPK2a(T106M) 108 HIPK3 119 SAPK2b 100 IGF-1R 97 SAPK3 98 IKK/3 117 SAPK4 98 IKK a 117 SGK 94 1R 95 SGK2 96 38 200816982

IRAKI 109 SGK3 107 IRAK4 110 SIK 90 IRR 102 Snk 98 ITK 117 SRPK1 117 JAK2 112 SRPK2 110 JAK3 111 STK33 94 JNK1 a 1 104 Syk 82 JNK2a2 84 TAK1 109 JNK3 98 TBK1 121 KDR 101 Tie2 95 Lck 94 TrkA 85 LIMKI 102 TrkB 91 LKB1 106 TSSK1 51 LOK 127 TSSK2 97 Lyn 100 WNK2 102 Lyn 109 WNK3 104 MAPK1 95 Yes 92 MAPK2 101 ZAP-70 113 MAPK2 113 rZIPK 91 應注意，PI3K路徑中的數種激酶較佳地係以RIAA抑制，例如Aktl有51%抑制。有利的注意到，有三種Akt同質物存在。Aktl裸小鼠可存活，但生長遲緩[Cho等人， Science 292:1728-1731 (2001)]。Aktl 缺陷之果繩眼細胞之大小減小[Verdu 等人，Nat cell Biol 1:500-505 39 200816982 (1999)];過度表現導致大小比正常的還大。Akt2裸小鼠可存活但具有葡萄糖控制之障礙[Cho等人，J Biol Chem 276:38345-38352 (2001)]。因此，其顯示 Aktl 參與了大小之決定，且Akt2係涉及胰島素之訊號傳遞。] 已知PI3K路徑在mRNA穩定性及mRNA轉譯選擇上扮演一個關鍵的角色，係導致各種致癌基因蛋白及發炎路徑蛋白之差異的蛋白表現。表示5’-TOP之一特定的5, mRNA結構已 • 顯示為調節mRNA轉譯選擇上之關鍵結構。 cPLA文獻及DNA序列之觀點指出人類CPLA2之5, _财含有相同的（與類似調節的已知致癌基因具82%同源性）序列，顯示其亦具有一 5, TOP結構。sPLAs亦已知與發炎有關，同時具有此相同的5，-TOP。再者，其指出藉由PI3K路徑，經由增加cPLA2 mRNA之轉譯選擇導致CPLA2蛋白增加，而可能上調CPLA2及其他PLAs。相反地，PI3K抑制劑可降低 cPLA2之量及減少經由C0X2路徑所產生之PGE2形成。一 • 將激酶數據及吾等之結果整合，其中吾等發現，蛇麻化合物抑制了 CPLA2蛋白表現（西方墨點，數據並無顯示而不是mRNA，顯示蛇麻草化合物之抗發炎作用模式可減少C0X2之可取得物質，藉由降低cPLA2蛋白之量，許更特別是，藉由抑制PI3K路徑產生抑制T〇PmR ^或活化。和#之活化之確切的路徑尚未明瞭。某些報告堅持，活化由六個核糖體蛋白S6(RPS6)同質物中的一或多個之碟=鉍所發生之模式。報告指出RPS6使5, TOP mRNA得有效的=化 200816982 進入蛋白L，StGiGvich等人，Mq1 CeU _⑹， 8101-8113 (2_)對此模式有爭論，且認為侃丨碟酸化一未知的轉譯因子X，其使得T0P mRNA轉譯發生。實例2 選擇的激醢之劑量反應效用 mgRho之劑量反應係以約1〇、5〇及1〇〇 #g/ml於超過六十個選擇的激酶中，根據實例丨之方法來試驗，係如下表 2A & 2B所不。最受到抑制之五種激酶係如圖2中之圖形所示。 THIAA製備物對激酶抑制作用（以控制之百分比表示）之劑量反應係以約1、1〇、25及50 Ug/ml於86種選擇的激酶中試驗，係如下表3所示。同樣地，相思樹製備物係以約 1、5及25 ug/ml於超過230種選擇的蛋白質激酶中，根據貫例1之方法來试驗，並如下表4所示。異阿伐酸（iaa)、六氫異阿伐酸（HHIAA)、貝他酸及黄腐酚之製備物亦以約i、 10、25及50 ug/ml於86種選擇的激酶中試驗，而劑量反應結果係分別如下表5-8所示。

表2A

Rho對選擇的激酶之劑|及廄效用（對照組之％) 激酶 10 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml f.j里/人m夕又m 激酶 vw m 10 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml Abl 103 82 65 MSSK1 120 31 26 ALK 79 93 109 P70S6K 105 86 69 AMPK 107 105 110 PAK2 99 84 89 200816982

Arg 94 76 64 PAK5 99 94 78 Aurora-A 96 59 33 PASK 105 111 102 Axl 101 87 85 PDK1 98 90 78 CaMKI 95 85 77 PI3K/5(est) 74 49 39 CM2/週期素A 106 81 59 PI3K5 (est) 64 22 13 CM9/週期素 T1 100 88 101 PI3Kr (est) 85 69 55 c-RAF 105 109 103 PKA 103 95 92 DAPK1 82 56 51 PKCe 96 93 91 DAPK2 64 51 45 PKC ^ 100 94 96 EphA3 103 64 55 PrKX 100 105 90 Fer 87 74 83 ROCK-11 102 101 99 FGFR1 98 99 93 Ros 105 86 90 FGFR4 111 68 35 Rse 71 39 22 GSK3 冷 65 17 26 Rsk2 108 79 56 GSK3a 65 64 13 Rsk3 108 102 86 Hck 86 72 59 SAPK2a 96 105 109 ΙΚΚβ 104 91 92 SAPK2a(T106M) 100 107 107 Ilia 104 101 96 SAPK2b 101 102 106 IR 87 85 78 SAPK3 110 109 110 JNK1 a 1 105 115 106 SAPK4 97 107 109 JNK2a2 119 136 124 SGK 111 105 94 JNK3 98 98 86 SIK 130 125 117 Lck 105 83 81 STK33 99 96 103 42 200816982 MAPK1 77 53 44 Syk 79 46 28 MAPK2 101 104 106 Tie2 113 74 56 MAPKAP-K2 111 99 49 TrkA 127 115 93 MAPKAP-K3 109 106 73 TrkB 106 105 81 MEK1 106 104 91 TSSK1 105 100 95 MKK4 110 110 98 Yes 100 105 100 MSK2 92 54 43 ZIPK 92 62 83

表2B mgRho對選擇的激酶之劍量反應效用（對照組之％) 激酶 1 5 25 50 ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml AMPK(r) 102 98 99 91 CaMKI(h) 100 106 106 87 CaMKIIB(h) 101 87 114 97 CaMKIIy(h) 85 97 97 90 CaMKIS(h) 117 110 105 90 CaMKIIS(h) 100 97 102 96 CaMKIV(h) 109 101 73 95 FGFR 1(h) 103 108 106 103 FGFRI(V561M)(h) 104 108 110 102 FGFR2(h) 96 90 94 55 FGFR3(h) 100 113 91 40 FGFR4(h) 115 110 100 71 GSK3 a (h) 51 77 63 38 43 200816982 GSK3 β (h) 95 86 71 51 Hck(h) 89 96 87 95 IGF-IR(h) 76 65 65 102 ΙΚΚα (h) 126 125 145 144 ΙΚΚβ (h) 130 118 105 89 IRAKI(h) 101 104 107 99 JAK3(h) 89 93 89 76 JNK1 a 1(h) 103 78 72 70 JNK2a2(h) 95 97 97 92 皿 3(h) 88 92 91 98 KDR(h) 108 103 102 109 Lck(h) 99 102 90 92 LKBI(h) 135 135 140 140 MAPKl(h) 98 90 90 80 MAPK2(h) 112 110 111 1 07 MAPKAP-K2(h) 103 100 92 68 MAPKAP-K3(h) 108 99 94 87 MSKl(h) 134 110 111 101 MSK2(h) 117 97 102 86 MSSKl(h) 103 103 81 69 p70S6K(h) 100 103 100 89 PKC/3 11(h) 98 100 77 58 pkc r (h) 106 99 105 92 PKC δ (h) 103 102 91 85 44 200816982

PKC ε (h) 107 104 93 85 ?10η (h) 108 106 99 89 PKC i (h) 84 94 94 101 PKC β (h) 88 97 95 89 PKC0 (h) 110 105 102 100 PKC r(h) 96 100 100 103 Syk(h) 101 109 90 84 TrkA(h) 97 98 51 41 TrkB(h) 91 87 91 97 表3 THIAA對選擇的激酶之劑量反應效用（對照組之Q/〇) 激酶 1 5 25 50 ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml Abl(T315〇 104 95 68 10 ALK4 127 112 108 AMPK 135 136 139 62 Aurora-A 102 86 50 5 Bmx 110 105 57 30 BTK 104 86 58 48 CaMKI 163 132 65 16 CaMKII^ 106 102 90 71 CaMKII r 99 101 87 81 CaMKII δ 99 103 80 76 CaMKIV 99 117 120 126 45 200816982

CaMKI δ 91 95 61 43 CDKI/週期素B 82 101 77 66 CDK2/週期素A 118 113 87 50 CM2/週期素E 87 79 73 57 CDK3/週期素E 113 111 105 32 CDK5/p25 102 100 85 54 CM5/p35 109 106 89 80 CDK6/週期素D3 114 113 112 70 CDK9/週期素T1 106 93 66 36 CM1 116 118 149 148 CHK2 111 116 98 68 CKl(y) 101 101 55 CK1 r 1 101 100 42 43 cKi r 2 94 85 33 48 cki r 3 99 91 23 18 CKI (5 109 97 65 42 cKit(D816H) 113 113 69 75 CSK 110 113 92 137 cSRC 105 103 91 17 DAPK1 62 34 21 14 DAPK2 60 54 41 17 DRAK1 113 116 75 18 EphA2 110 112 85 31 EphA8 110 110 83 43 46 200816982

EphBl 153 177 196 53 ErbB4 124 125 75 56 Fer 85 41 24 12 Fes 112 134 116 57 FGFR1 109 110 110 111 FGFRKV561M) 97 106 91 92 FGFR2 126 115 58 7 FGFR3 112 94 39 16 FGFR4 122 93 83 58 Fgr 121 120 110 47 Flt4 126 119 85 31 IKK a 139 140 140 102 JNKIal 71 118 118 107 JNK2a2 94 97 98 101 JNK3 121 78 58 44 KDR 106 107 104 126 Lck 97 105 125 88 LKB1 145 144 140 140 MAPK2 99 109 112 102 Pim-1 103 100 44 44 Pim-2 103 109 83 22 PKA(b) 104 77 32 0 PKA 104 101 90 25 PKB/3 117 102 27 33 47 200816982 ΡΚΒα 103 101 49 50 PKBr 107 109 99 33 PKC/z 90 90 93 87 PKC/3 II 99 107 103 64 PKCa 110 111 112 102 PKCr 86 95 77 62 PKC5 97 93 84 87 PKCe 76 88 88 90 PKcr 93 100 107 103 PKCt? 82 99 103 90 ?ice 93 95 86 90 PKC c 77 90 93 134 PRAK 99 81 21 33 PrKX 92 76 32 38 Ron 120 110 97 42 Ros 105 105 94 93 Rskl 101 87 48 31 Rsk2 100 85 40 14 SGK 98 103 79 77 SGK2 117 110 45 18 Syk 99 93 55 17 TBKI 101 100 82 56 Tie2 109 115 100 32 TrkA 107 65 30 15 48 200816982

TrkB 97 96 72 21 TSSK2 112 111 87 66 ΖΙΡΚ 106 101 74 59 表4相思樹對選擇的蛋白質激酶之劑量反應效用（對照組之Q/〇) 激酶 1 ug/ml 5 ug/ml 25 ug/ml 激酶 1 ug/ml 5 ug/ml 25 ug/ml AM 53 27 2 LOK 103 72 27 Abl(T315I) 57 26 11 Lyn 4 1 2 ALK 102 52 10 MAPK1 115 38 15 ALK4 84 96 98 MAPK2 108 90 48 AMPK 108 101 77 MAPK2 99 78 45 Arg 86 53 23 MAPKAP-K2 67 12 1 Arg 106 55 18 MAPKAP-K3 82 28 1 ARKS 36 13 6 MARK1 52 20 4 ASK1 100 70 23 MEK1 117 94 41 Aurora-A 8 -1 3 MELK 61 27 2 Axl 64 17 4 Mer 95 74 5 Blk 31 - 2 -3 Met 168 21 7 Bmx 101 51 0 MINK 79 57 18 BRK 47 19 7 MKK4 103 135 13 BrSKl 58 6 2 MKK6 113 105 50 BrSK2 82 16 4 Mmp 91 44 9 49 200816982

BTK 15 -1 - 3 MLCK 83 38 52 CaMKI 97 90 49 MLK1 92 75 42 CaMKII 83 50 6 Mnk2 103 71 29 CaMKI I/3 87 45 10 MRCK 石 95 52 18 CaMKIIr 90 51 12 MRCK a 96 76 32 CaMKII ¢5 25 13 6 MSK1 105 97 33 CaMKIV 89 44 44 MSK2 56 22 12 CaMKIδ 69 19 10 MSSK1 12 4 4 CDK1/週期素B 62 48 9 MST1 58 36 17 CDK2/週期素A 69 15 5 MST2 106 104 38 CDK2/週期素E 51 14 8 MST3 50 10 2 CDK3/週期素E 41 13 4 MuSK 97 83 63 CDK5/p25 82 41 7 NEK11 89 58 19 CDK5/p35 77 46 13 NEK2 99 100 37 CDK6/週期素D3 100 54 5 NEK3 79 41 18 CDK7/週期素 H/MAT1 124 90 42 NEK6 78 43 4 CDK9/週期素T1 79 21 4 NEK7 110 94 27 CHK1 87 52 17 NLK 103 90 44 CHK2 52 16 5 P70S6K 43 17 10 CKl(y) 77 32 3 PAK2 103 79 16 CK1 r 1 51 7 - 4 PAK3 43 5 3 cki r 2 31 5 1 PAK4 99 91 58 50 200816982

cki r 3 49 16 0 PAK5 69 6 2 CKl 5 60 15 6 PAK6 77 22 1 CK2 157 162 128 PAR-lBa 70 20 8 CK2a 2 95 83 51 PASK 136 114 26 cKit(D816H) 27 7 2 PDGFRyS 59 19 9 cKit(D816V) 111 91 41 PDGFRa(D842V) 60 11 5 cKit 94 68 24 PDGFRa 100 106 51 cKit(V560G) 49 5 0 PDGFRa(V561D) 59 11 7 cKit(V654A) 30 8 3 PDK1 97 57 16 CLK3 33 16 6 PhKr 2 67 62 16 c-RAF 105 100 87 Pim-1 44 9 2 CSK 74 19 1 . Pira-2 82 17 10 cSRC 99 12 0 PKA(b) 104 52 7 DAPK1 90 72 12 PKA 99 _ 85 16 DAPK2 75 31 4 PKB/3 61 9 -1 DCAMKL2 107 106 77 PKBa 98 67 8 DDR2 84 91 45 PKBr 86 50 5 DMPK 105 106 116 PKC/i 90 81 44 DRAK1 92 40 11 PKC/3 I 108 112 100 DYRK2 83 55 25 PKC^ II 71 47 30 eEF-2K 103 97 59 PKCa 75 34 32 EGFR 76 26 6 PKCr 72 47 27 EGFRCL858R) 99 40 1 ?IC6 105 94 63 EGFR(L861Q) 90 49 1 ?lCe 108 90 59 51 200816982

EGFR(T790M) 93 29 7 PKcr 34 10 2 EGFR(T790M，L8 58R) 74 30 4 PKC77 107 99 84 EphAl 106 43 9 vice 88 31 21 EphA2 94 82 6 PKC i 66 69 63 j EphA3 94 83 50 PKD2 106 108 81 EphA4 55 12 6 PKG1/3 31 16 5 - EphA5 100 28 10 PKGla 41 18 7 EphA7 103 80 6 PIk3 114 106 115 EphA8 113 84 19 PRAK 18 18 35 EphB 1 116 63 8 PRK2 92 35 8 EphB2 30 5 2 PrKX 49 14 16 EphB3 109 35 1 PTK5 99 95 88 EphB4 30 11 3 Pyk2 90 45 9 ErbB4 61 8 0 Ret 23 -1 -2 FAK 106 78 2 RIPK2 103 95 64 Fer 106 134 28 ROCK-I 95 90 54 Fes 143 74 43 ROCK-II 100 66 39 FGFR1 125 26 3 ROCK-II 91 59 39 FGFR1(V561M) 92 50 2 Ron 32 2 4 FGFR2 73 -2 -5 Ros 95 40 35 FGFR3 21 3 1 Rse 35 14 0 FGFR4 30 7 5 Rskl 45 9 4 Fgr 78 18 7 Rskl 75 8 5 52 200816982

Fit! 41 12 1 Rsk2 60 4 3 Flt3(D835Y) 65 15 -1 Rsk3 78 31 7 Flt3 76 16 3 Rsk4 71 25 12 Flt4 12 3 2 SAPK2a 99 106 106 Fms 94 73' 19 SAPK2a(T106M) 110 106 80 Fyn 23 5 1 SAPK2b 99 100 77 GRK5 96 91 81 SAPK3 108 79 40 GRK6 117 117 94 SAPK4 103 86 57 GSK3^ 13 5 4 SGK 89 34 2 GSK3a 5 2 1 SGK2 102 36 5 Hck 87 29 -2 SGK3 103 96 34 HIPK1 110 112 62 SIK 115 28 5 HIPK2 92 71 24 Snk 93 96 61 HIPK3 106 92 56 SRPK1 56 14 6 IGF-1R 148 122 41 SRPK2 37 15 4 ΙΙΙβ 30 6 3 STK33 100 94 64 IKK a 120 86 11 Syk 2 2 3 IR 121 123 129 TAK1 105 101 86 IRAKI 98 85 49 TA02 97 64 25 IRAK4 117 95 47 TBK1 37 5 12 IRR 91 70 28 Tie2 97 67 7 Itk 121 114 48 TrkA 20 4 2 JAK2 83 69 23 TrkB 22 0 0 JAK3 24 7 1 TSSK1 89 10 5 53 200816982

JNK1 α 1 118 110 75 TSSK2 97 29 2 ΙΝΚ2α2 99 106 102 VRK2 98 88 67 JNK3 52 23 3 WNK2 96 75 21 KDR 90 60 18 WNK3 110 98 38 Lck 92 93 25 Yes 63 33 3 LIMK1 108 104 53 ZAP-70 57 19 10 LKB 1 126 122 98 ZIPK 104 81 28 表 IAA對選擇的蛋白質丨敫酶之劑量反應效用（對照、组之％) 激酶 1 5 25 50 ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml Abl(T315I) 104 119 84 56 ALK4 92 110 113 AMPK 122 121 86 49 Aurora-A 103 106 61 20 Brax 90 125 108 43 BTK 96 102 62 48 CaMKI 126 139 146 54 CDK1/週期素B 96 102 86 69 CM2/週期素A 102 111 98 59 CM2/週期素E 81 89 72 55 CDK3/週期素E 99 121 107 62 54 200816982 CDK5/p25 88 108 95 69 CM5/p35 92 117 100 73 CM6/週期素D3 111 119 108 64 CDK9/週期素ΤΙ 87 109 77 51 CHK1 105 117 140 159 CHK2 102 106 75 46 CKl(y) 94 105 103 cki r i 98 102 69 21 cki r 2 89 88 39 42 cki r 3 91 87 26 17 CKI 5 95 111 90 56 cKit(D816H) 98 117 100 59 CSK 95 111 72 86 cSRC 99 111 100 53 DAPK1 73 52 36 21 DAPK2 59 54 50 47 DRAK1 102 123 129 75 EphA2 104 118 108 88 EphA8 113 120 117 98 EphBl 112 151 220 208 ErbB4 93 107 110 20 Fer 95 76 49 38 Fes 101 110 120 59 FGFR2 85 122 97 5 55 200816982

Fgr 99 120 119 70 Flt4 85 37 74 33 Fyn 90 88 92 90 GSK3/3 86 77 47 14 GSK3 a 85 83 56 17 Hck 88 81 76 4 HIPK2 101 107 107 84 HIPK3 97 101 127 84 IGF-1R 132 229 278 301 IKK/5 103 116 93 56 IR 110 107 121 131 IRAKI 115 143 156 122 JAK3 88 98 83 74 Lyn 82 114 41 73 MAPK1 81 87 55 55 MAPKAP-K2 100 98 82 36 MAPKAP-K3 108 113 106 80 MINK 102 122 118 127 MSK1 99 103 66 61 MSK2 95 90 44 45 MSSK1 90 78 52 52 p70S6K 94 98 84 58 PAK3 91 66 21 11 PAK5 101 108 106 59 56 200816982 PAK6 98 109 106 102 PhK r 2 103 109 102 66 Pim-1 104 106 77 46 Pim-2 101 108 88 60 PKA(b) 104 115 86 12 PKA 110 102 99 106 PKB/3 104 110 57 76 PKBa 98 103 91 72 PKBr 103 108 104 76 ΫΙΟβΙΙ 1、03 103 102 59 PKCa 106 104 89 46 PRAK 99 91 38 18 PrKX 94 92 91 58 Ron 117 113 113 40 Ros 101 108 84 T5 Rskl 96 101 72 48 Rsk2 95 101 76 36 SGK 102 110 100 96 SGK2 99 128 105 60 Syk 85 92 53 7 TBK1 100 105 82 86 Tie2 101 124 113 40 TrkA 112 139 24 20 TrkB 97 111 90 59 57 200816982 TSSK2 99 112 109 75 ZIPK 102 102 95 73 表6 HHIAA對選擇的蛋白質激酶之劑量反應效用（對照組之％) 激酶 1 5 25 50 ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml Abl(T315I) 113 109 84 38 ALK4 123 121 108 AMPK 133 130 137 87 Aurora-A 111 107 64 27 Bmx 103 102 106 44 BTK 110 105 67 61 CaMKI 148 151 140 56 CDK1/週期素B 118 115 98 85 CDK2/週期素A 109 112 82 60 CDK2/週期素E 83 84 70 88 CDK3/週期素E 115 119 108 85 CDK5/p25 101 94 69 51 CDK5/p35 110 103 73 68 CM6/週期素D3 119 124 117 83 CDK9/週期素T1 106 96 66 40 cm 127 124 140 144 CHK2 119 117 110 82 CKl(y) 102 102 100 58 200816982 CKi r i 105 103 68 30 cki r 2 99 99 45 49 CKir 3 104 98 28 22 CKI 5 110 115 89 56 cKit(D816H) 116 109 91 68 CSK 100 108 109 112 cSRC 105 114 103 37 DAPK1 94 67 37 27 DAPK2 72 58 46 47 DRAK1 110 119 103 69 EphA2 106 127 115 68 EphA8 133 109 89 74 EphBl 154 162 200 164 ErbB4 141 122 85 14 Fer 90 62 13 20 Fes 137 126 111 81 FGFR2 116 120 71 7 Fgr 122 127 118 91 Flt4 135 116 88 58 Fyn 104 119 82 81 GSK3 β 138 84 51 10 GSK3 a 89 82 58 18 Hck 93 99 73 77 HIPK2 103 105 100 98 59 200816982 HIPK3 117 121 118 29 IGF-1R 138 173 207 159 IKK/3 123 116 98 79 IR 129 95 105 81 IRAKI 142 140 152 120 JAK3 104 103 61 90 Lyn 115 113 56 80 MAPK1 100 88 55 67 MAPKAP-K2 104 99 71 29 MAPKAP-K3 111 109 99 77 MINK 107 102 114 123 MSK1 105 101 58 69 MSK2 101 86 39 48 MSSK1 98 ^ 78 41 60 P70S6K 108 99 78 56 PAK3 113 24 14 10 PAK5 109 105 89 36 PAK6 106 106 88 71 PhKr 2 105 109 85 54 Pim-1 107 110 81 50 Piffl-2 111 106 98 58 PKA(b) 105 119 67 12 PKA 98 107 102 91 PKB冷 121 142 50 42 60 200816982 PKB α 105 108 81 57 PKBr 115 116 107 42 PKC ^ 11 113 115 109 95 ?lCa 110 90 105 103 PRAK 109 89 41 33 PrKX 86 88 77 59 Ron 114 106 129 74 Ros 113 107 109 98 Rskl 101 102 53 60 Rsk2 105 103 58 25 SGK 108 114 112 64 SGK2 120 121 96 63 Syk 100 95 68 17 TBK1 115 103 99 114 Tie2 109 120 95 43 TrkA 87 73 41 24 TrkB 100 107 97 13 TSSK2 115 112 109 71 ZIPK 109 109 96 8 表7 貝他酸對選擇的激酶之劑量反應效用（對照組之％) 激酶 1 5 25 50 ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml Abl(T315I) 101 101 70 29 61 200816982 ALK4 108 114 90 AMPK 136 131 135 77 Aurora-A 110 85 43 2 Bmx 111 100 93 54 BTK 96 90 14 37 CaMKI 142 142 131 57 CDK1/週期素B 116 120 95 65 CDK2/週期素A 106 104 94 64 CDK2/週期素E 93 86 81 65 CDK3/週期素E 119 115 96 53 CDK5/p25 97 97 95 96 CDK5/p35 109 106 90 50 CDK6/週期素D3 107 117 101 76 CDK9/週期素T1 101 104 88 35 CHK1 111 125 144 164 CHK2 103 100 94 69 CKl(y) 102 104 83 cki r i 100 95 82 33 cki r 2 97 83 55 44 cki r 3 99 75 40 21 CKI 5 103 98 81 54 cKit(D816H) 103 112 100 18 CSK 107 111 108 145 cSRC 104 99 90 19 62 200816982 DAPK1 109 106 88 59 DAPK2 97 76 57 45 DRAK1 124 134 107 51 EphA2 116 122 115 80 EphA8 107 105 86 36 EphBl 130 164 204 207 ErbB4 111 118 116 28 Fer 78 69 30 18 Fes 120 106 114 79 FGFR2 130 118 99 7 Fgr 119 119 127 62 FIt4 104 96 65 22 Fyn 99 94 86 78 GSK3/3 83 67 27 4 GSK3a 70 71 31 1 Hck 102 88 61 22 HIPK2 101 104 99 94 HIPK3 109 119 118 83 IGF-1R 101 163 262 260 IKK" 110 113 85 59 IR 106 106 108 95 IRAKI 143 155 165 158 JAK3 100 98 64 38 Lyn 114 120 68 59 63 200816982 MAPK1 88 75 51 37 MAPKAP-K2 111 104 65 22 MAPKAP-K3 108 106 102 69 MINK 102 103 123 140 MSK1 106 97 54 36 MSK2 96 86 28 25 MSSK1 95 82 61 67 p70S6K 89 95 69 44 PAK3 103 40 16 11 PAK5 103 99 81 44 PAK6 103 98 82 83 PhK r 2 108 103 79 40 Pim-1 104 97 57 21 Pim-2 103 101 68 73 PKA(b) 120 104 51 3 PKA 103 105 102 28 P_ 114 108 56 52 PKBa 98 95 80 58 PKB r 105 104 101 52 PKC^ II 107 105 100 49 PKCa 108 104 98 54 PRAK 105 81 24 11 PrKX 93 86 68 29 Ron 108 119 98 44 64 200816982

Ros 107 103 80 98 Rskl 103 99 69 17 Rsk2 98 96 56 8 SGK 109 111 98 100 SGK2 123 113 84 0 Syk 92 81 62 16 TBK1 110 103 80 78 Tie2 110 100 106 79 TrkA 97 66 53 18 TrkB 105 100 86 11 TSSK2 112 109 103 62 ZIPK 105 110 85 37 表8 黃腐酴對選擇的蛋白質激酶之劑量反應效用（對照組之％) 激酶 1 5 25 50 ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml Abl(T315I) 126 115 16 4 ALK4 116 100 71 49 AMPK 122 113 90 81 Aurora-A 83 27 3 8 Bmx 108 97 22 0 BTK 109 57 2 20 CaMKI 142 83 3 4 CDK1/週期素B 118 103 46 18 65 200816982 CM2/週期素A ; 107 96 57 6 CDK2/週期素E 82 86 18 9 CDK3/週期素E 101 100 37 8 CDK5/p25 97 97 24 87 CDK5/p35 103 102 41 44 CDK6/週期素D3 110 79 23 7 CM9/週期素ΤΙ 110 107 45 31 CHK1 121 126 142 149 CHK2 25 5 3 2 CKl(y) 91 63 37 9 cki r i 101 79 50 26 CKir 2 92 48 30 12 CKir 3 98 51 22 15 CKI 5 75 32 16 12 cKit(D816H) 94 45 14 CSK 113 113 93 100 cSRC 92 50 27 21 DAPK1 113 85 49 20 DAPK2 105 88 45 26 DRAKI 133 40 19 -5 EphA2 124 113 121 52 EphA8 103 92 29 19 EphBl 92 122 175 161 ErbB4 132 85 52 27 66 200816982

Fer 55 20 10 1 Fes 131 106 102 26 FGFR2 116 89 36 4 Fgr 101 36 10 0 Flt4 74 10 11 4 Fyn 104 66 42 18 GSK3/S 120 99 25 3 GSK3 a 102 81 11 -4 Hck 85 35 17 0 HIPK2 110 98 75 37 HIPK3 106 102 90 59 IGF-1R 107 113 129 139 IKK13 145 118 61 44 IR 120 108 97 103 IRAKI 129 104 81 36 JAK3 104 84 17 5 Lyn 97 40 4 2 MAPK1 91 64 19 17 MAPKAP-K2* 99 95 6 8 MAPKAP-K3 100 99 17 7 MINK 42 10 5 7 MSK1 114 92 31 9 MSK2 126 61 8 19 MSSK1 47 11 7 5 67 200816982 p70S6K 94 48 19 7 PAK3 21 18 8 4 PAK5 106 99 42 5 PAK6 105 94 14 2 PhKy2 106 60 11 5 Pim-1 88 35 4 3 Pim-2 104 48 14 6 PKA(b) 137 113 33 2 PKA 105 109 98 21 PKB/5 146 102 1 8 PKBa 102 81 18 5 PKBr 104 104 12 4 PKCyS II 108 108 71 79 PKCa 100 100 75 83 PRAK 101 53 2 2 PrKX 92 75 2 3 Ron 135 127 60 69 Ros 101 99 85 94 Rskl 34 49 4 0 Rsk2 96 43 3 4 SGK 111 84 0 3 SGK2 130 110 2 - 4 Syk 95 60 32 17 TBK1 104 71 45 42 68 200816982

Tie2 94 96 100 35 TrkA 36 19 8 3 TrkB 95 89 58 3 TSSK2 102 95 61 48 ZIP! 115 74 20 70 ，替漯-各種試驗化合物之激酶活性調節效用，依照特定激酶及所試驗的化合物（表2—8)顯示廣範圍之調節效應，並如下列列舉之代表性實例所示。 PI3K5，一種與自體免疫疾病（例如類風濕性關節炎及紅斑性狼瘡）密切相關之激酶，MgRh〇在1〇、5〇及1〇〇收/mi 分別具有抑制36%、78%及87%激酶活性之反應。MgRho以劑量依賴的方式抑制了 Syk，其在1〇、50及loo a g/ml分別具有21%、54%之72%抑制作用。此外，在mgRh〇暴露後，GSK 或肝糖合成酶（GSKa及冷兩者）出現抑制作用（在ι〇、5〇、1〇〇 /zg/ml時，α分別為35、36、87%抑制；/3分別為35、83、 74%抑制）。茶見表2。對所檢驗的許多激酶，ΤΗΙΑΑ展現一劑量依賴之激酶活性抑制，其在1、5、25及50 //g/ml時分別具有7%、16%、 77%及91%之FGFR2抑制作用。分別在1、5、25及50 //g/ml 時，於 FGFR3(0%、6%、61%及 84%)及 TrkA (24%、45%、93% 及94%)觀察到類似的結果。所試驗的相思樹萃取物（阿拉伯金合歡）似乎為對所檢驗的激酶活性之最強力抑制劑（表4)，對該等激酶例如 Syk(98%)、Lyn (96%)、GSK3a (95%)、Aurora-A(92%)、 69 200816982 ΡΗ4(88%)^Μ88Κ1(88%)^8Κ3^ (87%)^BTK(85%)^PRAK(82%) 及TrkA(80%)(所有皆暴露於1 Ag/M)，係展現8〇%或更大活性抑制作用。實例3 里組成份鉗ΡΙ3Κ活性之效用蛇麻草組成份黄腐酚及貝他酸之鎂鹽酸、異阿伐酸之鎂鹽酸（Mg-ΙΑΑ)、四氫異阿伐酸之鎂鹽（Mg—ΤΗΙΑΑ)及六氫異阿伐酸之鎂鹽（Mg-ΗΗΙΑΑ)對人類 ΡΙ3Κ-/5、ΡΙ3Κ-γ 及 ΡΙ3Κ- 占之抑制效應係根據實例1之程序及方法來檢驗。另外檢驗阿拉伯金合歡心材之萃取物。所有的化合物皆以50 |ug/mi 來試驗。結果係如圖3之圖示所示。應注意，所有試驗的蛇麻草化合物顯示〉5〇%之pi3K活性抑制作用，而Mg-THIAA產生了最大的整體抑制作作用（對所有試驗的PI3K同質物皆>80%抑制）。進一步請注意，黃腐酚及Mg〜貝他酸對？13〖-7比對pI3K—召或ρϊ3Κ-δ更具有抑制性。Mg-ΙΑΑ對ΡΙ3Κ-/3之抑制大約為ΡΙ3Κ—7或ρΐ3Κ_ά 之一倍。阿拉伯金合歡心材萃取物顯現刺激PI3Κ-冷或 ΡΙ3Κ〜δ活性。得到Syk及GSK激酶之相類似結果（數據未顯示）。 ’、實例4 盘及未經刺激的鼠中以蛇麻箪化合物另 & 生物抑此男' 例之目才示係於既科RAW 264· 7巨嗤細胞模型中評估虫匕麻草衍生物抑制PGE2之C0X-2合成優於pGE2之⑶X—i合成之 70 200816982 程度。RAW 264· 7細胞株為一用於評估試驗劑之抗發炎活性之完全建立模型。以細菌脂多糖刺激RAW 264· 7細胞，以引發C0X-2表現並產生PGE2。PGE〗合成之抑制係用來作為試驗劑之抗發炎活性之度量。設備、化合物及試劑、？此2分析及計算係如下所述。設用於此實例之設備包括一OHAS Model#E01140分析平衡、Forma Model #F1214生物安全櫃（Marietta，馨 Ohio)、遞送0.1至100 " 1之各種吸液管（vwR，Rochester， NY)、細胞手壓式計數器（VWR Catalog #23609-102、 Rochester、NY)、Forma Model #F3210 C〇2培養箱（Marietta、 Ohio)、血球計婁久器（Hausser Model #1492，Horsham，PA)、 a Leica Model #DM IL倒立顯微鏡（Wetzlar，Germany)、 PURELAB Plus純水系統（U.S· Filter, Lowell，MA)、4°C 冷藏櫃（Forma Model #F3775，Marietta，Ohio)、旋渦混合器（VWR Catalog #33994-306、Rochester，NY)及37°C水浴 ⑩ （Shel Lab Model #1203 、 Cornelius， OR)。允合與及铽扇/-細菌脂多糖（LPS;BE. coli 055:B5) 係購自 Sigma (St· Louis, MO)。熱滅胎牛血清（FBS-HI Cat. #35-011(^)及011比6〇(：〇’3修改之£&21七’3培養基（01^：1103言 #10-013CV)係購自 Media1:ech(Herndon，VA)。蛇麻草顧分物 (1)阿伐蛇麻草（1%阿伐酸；AA)、（2)aromahop OE(10%貝他酸及2%異構化阿伐酸、（3)isohop(異構化阿伐酸；ΙΑΑ)、（4) 貝他酸溶液（貝他酸BA)、（5)hexahopgold(六氫異構化阿伐酸；ΗΗΙΑΑ)、（6)redihop(還原的異構物化阿伐酸；RIAA)、 71 200816982 (Otetrahop(四氫-異-阿伐酸THIAA)及（8)酒花粕係得自 Betatech Hops Products 公司（Washington, D·C·， U· S· A·)。將酒花粕以相同體積之無水乙醇萃取二次。於4〇 °C加熱移除乙醇，直到僅剩下濃稠的棕色殘餘物。將此殘餘物溶於DMS0以供RAW 264. 7細胞試驗用。試驗物質一係使用如表12所述之蛇麻草衍生物。使用 COX-1選擇性抑制劑阿斯匹靈（aspirin)及⑶X—2選擇性抑制劑西樂保（cel ecoxib)作為陽性對照組。阿斯匹靈係得自 Sigma公司（St· Louis，M0)並使用西樂保之市售調配物 (Celebrex™, Searle& Co·，Chicago，IL)。細應踣赛！议緣驗#览處理一將得自美國菌種保存中心（American Type Culture Col lection)之RAW 264. 7細胞 (Catalog #TIB-71，Manassas，VA)培養於Dulbecco’s修改之Eagle’s培養基中（DMEM，Mediatech，Herndon，VA)並維持在對數期。藉由將50 ml熱滅FBS及5 ml的青黴素 (penici 11 in)/鏈黴素（streptomycin)加至500 ml 的 DMEM瓶中製成DMEM生長培養基並儲存於4°C。使用前以水浴將生長培養基加溫至37QC。就C0X-2有關的PGE2合成’係從第一天培養的細胞盤的每個孔槽中移出1〇〇 //1的培養基，並以100 μ1平衡的2X最終濃度之試驗化合物替代。然後將細胞培養9〇分鐘。於所欲刺激的細胞各孔槽中加入20//1的LPS，以達到1/zg LPS/ml 之敢終濃度並將細胞培養4小時。將細胞以5 // Μ的花生四稀酸再培養15分鐘。將各孔槽中25// 1的上清液轉置於透明的 72 200816982 微量離心管中以測定釋出到培養基中的PGE2。就COX-1有關的PGE2合成，係從第一天培養的細胞盤的每個孔槽中移除100 //1的培養基，並以100 μΐ平衡的2X最終濃度之試驗化合物替代。然後將細胞培養90分鐘。然後，不進行LPS刺激，而是將細胞以100 /ζΜ的花生四烯酸培養15 分鐘。將各孔槽中25// 1的上清液轉置於透明的微量離心管中以測定釋出到培養基中的PGE2。觀察細胞的外觀，並以目視評估生長力。任何的化合物在最高試驗濃度時並無觀察到明顯的毒性。將各孔槽中25 // 1的上清液轉置於透明的微量離心管中以測定釋出到培養基中的PGEz。PGE2之測定及報告係如前面所提，描述於下。分使用市售、無放射活性之PGE2定量程序 (Caymen Chemical，Ann Arbor，MI)及使用製造商建議之程序並無修改。簡言之，將25/z 1的培養基與連續稀釋的pGE2 標準樣本以適量的經乙醯膽酯酶標定的追蹤劑及PGE2抗血清混合，並於室溫下培養18小時。在清空孔槽及以沖洗緩衝液清洗後，加入200 // 1含有乙醯膽酯酶之受質的伊爾曼試劑 (Ellman’ s reagent)。將反應置於緩慢的震1器中於室溫下震盪1小時，並於Bio-Tek Instruments (Model #Ε1χ800,

Winooski，VT)ELISA盤式判讀機中測定415 nm之吸收度。 PGE2濃度係以每毫升（ml)之皮克（picogram)數來表示。此分析之製造商規格包括t化〈10%之内分析係數，與PGj)2和PGF2 之交互作用低於1%且線性係在10-1000 pg ml l之範圍。 C0X-2及C0X-1二者對PGE,合成之半數抑制濃度（IC5Q)係如下 73 200816982 所述來計算。合成之半數抑制濃度（iCsg)係使用CalcuSyn (BI0S0FT，Ferguson，M0)來計算。各試驗物質至少使用四種濃度或使用陽性對照組來計算。此統計套裝係使用如T. C Chou 及 P· Talalay [Chou, Τ· C·及 Ρ· Talalay. Quantitative analysis of dose^effect relationships i the combined effects of multiple drugs or enzyme

inhibitors· Adv Enzyme Regul 22: 27-55，（1984)]所述之半數效用方法來進行多藥劑劑量效用計算，該文獻係以引用的方式併入本文中。於三個不同的日期重複實驗三次。各劑I之百分比抑制作用為此三次獨立實驗之平均並用於計算所提出的半數抑制濃度。、半數抑制濃度係排列成四種任意的類別：（1)最高抗發炎反應之該等藥劑，具有‘值在G1至G 3pg/mi内；⑵ 高抗發炎反應之該等藥劑，具有IC5Q值在G7至1G pg/ml 内；（3)中等抗發炎反應之該等_，具有Ic禮在2至” g/ml間；及（4)低抗發炎反應之該等藥劑，且於12 g/mK最高試驗濃度)之ic5G值。八、尤表-在此模型系統中，阿斯 + 驗證其各別的環氧化酶選擇性(表9二阿之選擇性約為圆-倍多，西樂保對⑽、2 ^擇性約 114-倍多。所有蛇麻草物質皆為c〇x一2 ' 田伐酸及異阿麟展現最高的GQX_2 ' f ’以Rh0異

Z k擇性，分別A 勝倍。此高C0X-2選擇性與低半數抑制濃度、= 74 200816982 來源的天然產品中而言，之前並未提出過。在其餘的蛇麻草衍生物中，僅ar〇mah〇P油具有3倍臨界的C0X-2選擇性。以活體外之數據推斷臨床效用，〜般係假設5倍或5倍以上的C0X-2選擇性顯出有臨床上明顯的胃黏液保護之潛力。在此準則下，貝他酸、C〇2蛇麻草萃取物、酒花粕、四氫異阿伐酸及六氫異阿伐酸顯示潛在臨床上相應的C0X-2選擇性。表9

RAW 264· 7細胞中顧仓座及衍生验崖C0X-2及C0X-1 作用試驗物質 IC50 C0X-2 ------ ---—— ICso COX-1 COX-1/COX-2 [ug/mi] —-----—______ [^g/ml] Rho異阿伐酸〇. 08 29 363 異阿伐酸〇. 13 --------———— 18 138 貝他酸 0. 54 29 54 C〇2蛇麻草萃取物〇. 22 6. 3 29 阿伐酸〇. 26 6.2 24 翌_^粕C〇2/乙醇 0.88 21 24 阿伐酸〇. 20 4. 0 20 伐酸〇. 29 3. 0 10 1· 6 4. 1 3. 0 照組 1. 16 0. 0009 0.0008 〇. 005 0.57 114 75 200816982 實例5 在屢LPS刺激之RAW 264· 7細胞中還原之異構复異阿伐酸或 1構化阿伐酸缺乏直接的PGE2抑制此研究之目的係於RAW 264· 7細胞之發炎模型評估蛇麻草衍生物還原之異阿伐酸及異構化阿伐酸獨立作為介導pgE2 生物合成之COX-2直接抑制劑之能力。此實例中係使用如實例4中所述之RAW 264· 7細胞。設備、化學品和試劑、？(^;2分析及計算係如實例4所述。弑發-係使用如表12中所述之蛇麻草衍生物還原之兴阿伐酸及異構化阿伐酸。阿斯匹靈，一種1選擇陽性對照組’係得自Sigma公司（st· Louis，M0)。鈿應培#! /义緣驗奏見處理—RAW 264. 7細胞（ΉΒ—71) 係得自美國菌種保存中心（Manassas，VA)並如實例4所述進行繼代培養。於37°C以5% C〇2培養至隔夜後，將生長培養基吸出並以200 μ1無fbs或青黴素/鏈黴素之dmeM替代。將RAW 264· 7細胞以LPS刺激並培養至隔夜以引發c〇x—2表現。Lps_ 刺激後八小時，加入試驗化合物，6〇分鐘後加入鈣離子載體 A23187。將試驗物質溶於MS〇中成為25〇_倍儲存溶液。將4 μ1 之此250-倍儲存試驗物質製備物加到丨瓜丨的膽跏中，及後續將200 μΐ之此溶液加到八個孔槽之各劑量的試驗物質中。3〇为釦後，取樣上清液培養基供PGL測定。如實例4所述由最少四種m度之二個獨立的實驗中計算出半數抑制濃度。外芯之源定—如實例4所述，使用市售、無放射活性之PGE2 疋里紅序（Caymen Chemical，Ann Arbor，MI)及使用製造商 76 200816982 建礒之程序並無修改。 /細應存活鹿力-細胞之存活能力係在pGE2分析之培養基採I後立即以頭微鏡檢驗細胞來評估。在所試驗的任何濃度並無觀察到明顯的細胞死亡。縿真-使用四種濃度〇· 1〇、^ 〇、1〇及1⑽Vg/M產生劑置反應曲線，並以95%信賴區間使用CalcuSyn(BI〇S〇FT，

Ferguson，M0)計算半數抑制濃度（IC5Qs)。 Φ 、结果—於RAW 264· 7細胞中，相對於未經刺激之細胞，經 LPS-刺激之PGE2產生範圍從1· 4-倍至2· 1-倍。所計算之阿斯匹靈陽性對照組之IC5Q值為8·7 /zg/ml (95% CL二3·9-19) 與已發表範圍從1· 4至50 a g/ml之直接⑶χ-2抑制作用相符 [Warner，T.D.事乂，Nonsteroidal drug selectivities for eyelo-oxygenase-1 rather than eyelo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA φ 96:7563-7568，（1999)]且此實驗室A549細胞株之歷史資料為3· 2 //g/ml (95% CL 二 0.55-19)。當在RAW 264. 7細胞以LPS誘發C0X-2後，加入RIAA及IAA 僅產生適度的、劑量相關的PGE2抑制。在增加超過1000—倍試驗物質之濃度中，對RIAA及IAA僅觀察到分別增加14及10百分比之抑制。劑量反應斜率之淺度產生mg/ml範圍之RIAA (36 mg/ml)及IAA(>1000 mg/ml)之ICs〇值（表1〇)。於三對數單位劑量之反應觀察到之最小改變顯示，在此細胞基礎分析中所觀察到的蛇麻草衍生物對PGE2抑制效用，可能為細胞之二級 77 200816982 效用，而非直接抑制C0X-2酵素活性。圖4A及4B以白色長條分別描繪RIAA及IAA之劑量反靡數據，而此實例之劑量反應數據為灰色長條。添加順序之二用可明顯看出，且支持RIAA及IAA不為直接c〇X-2酵素抑制劑之推論。其顯示，（1)以其在活體外抑制PGE2生物合成之能力作評估，蛇麻草物質為其中最具活性抗發炎的天然產品；（2)依照其有關C0X-2引發之抑制模式，riAA及IAA似乎不為直接的 C0X-2酵素抑制劑；及（3)riaa及IAA具有C0X-2選擇性，其似乎係以抑制C0X-2表現為基礎’而非抑制c〇X-2酵素。此選擇性與以差異的酵素抑制作用為基礎之西樂保選擇性不同。表10

加入試驗物皙，RAW2fil L細胞中RIAA、TAA ___________________ 红數抑制濃度試驗物質 IC50 Uxg/ml] 95%信賴區間 Uxg/ml] —---- __RIAA **—— 36, 000 17, 000-9, 000 >1，000,000 — — 陽性對照組 ---- IC50 [βg/ml] 95%信賴區間 [β g/ml] ~ ~— —___^Pirin 8·7 pg/ml 3.9 - 19 ——--- 78 200816982 將RAW 264· 7細胞以LPS刺激並培養至隔夜以引現。LPS-刺激十八小時後’加人試驗物質，叫表 mm。30分鐘後，取樣上清液培養基供咖測定八重複之四種濃度的二個獨立實驗計算出半數抑制濃度广實例6 故丄5邦肺表皮細胞中蛇接的環惠化蜂莖i抑制劍 #

/6合參-用於此貫例之蛇麻草及蛇麻草衍生物係如前面實例4所述。所有其他化合物係如實例4所述來自供應商。言免備、PGE2分析及計算儀、如衰辦&所遂。細應-A549細胞（人類肺表皮細胞）係得自美國菌種保存中心（Manassas，VA)及根據供應商之指示進行繼代培養。將細胞例行地以5%⑶2於37°C於含有1〇% FBS、50單位^黴素' /ml、50 //g鏈黴素/ml、5 mM丙酮酸鈉及5 mM L-麩胺酸之 RPMI 1640中培養。在實驗當天，收集指數性生長之細胞並以無血清RPMI 1640清洗。將對數期A549細胞以每孔8 X 104個細胞置於每孔含〇 2 ml生長培養基之96-孔的組‘織培養盤中。就以試驗化合物測定PGE2抑制作用，係依照farner等人[N〇nsteroid drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo-〇xygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: a full in vitro analysis. Proc NaH Acad Sci U S A 96，7563-7568，（1999)]之過程，又稱為WHMA-COX-2法，並無修改。簡言之，植入A549細 79 200816982 胞24小日守後，加入介白素-1沒ng/mi)以引發〔οχ一2之表現。24小時後，將細胞以無血清之RPMI 164〇清洗。隨後，將溶於DMS0及無血清RPMI之試驗物質加到孔槽中使最終濃度達到25、5· 0、0· 5及0· 05 // g/mi。重複進行各濃度。將 DMS0以與試驗孔槽等體積之量加到對照孔槽中。六^分鐘後，將A23187(50 //M)加到孔槽中以釋放花生四烯酸。3〇分鐘後由孔槽中取出25// 1培養基之樣本，進行pGE2測定。參細胞存活力係以目視評估，任何的化合物在最高試驗濃度時並無觀察到明顯的毒性。上清培養基中之pGE2係如前面實例4所述來測定及報告。PGE2合成之半數抑制濃度（1(^)係如前面貫例4所述來計算。 ’ 綹漯-於所試驗的劑量，此實驗方法無法得到任何蛇麻草萃取物或衍生物之半數有效濃度。因為此方法需要在加入試驗物質前先刺激C0X-2表現，所以咸信，試驗物質無法抑制PGE2合成係因為其作用機制為抑制⑶χ—2酵素表現而非直 • 接抑制活性。雖然使用WHMA-C0X-2方法可觀察到一些直接抑制作用，此過程顯然不適用於評估蛇麻草化合物或蛇麻草化合物之衍生物之抗發炎特性。實例7 迄廬玉JL生物於Α549肺表皮細及中抑制塵蟮過敏原活化t £gE2生物合成允合# -用於此實例之蛇麻草及蛇麻草衍生物阿伐蛇麻草（1%阿伐酸；ΑΑ)、（2)aromahop ΟΕ(1〇%貝他酸及2%異構化）（3)is〇h〇P(異構化阿伐酸；ΙΑΑ)、（4)貝他酸溶液（貝 80 200816982 他酸BA)、（5)hexahop gold(六氫異構化阿伐酸；HHIAA)、 (6)redihop(還原的異構化-阿伐酸；RIAA)及（7)tetrahop (四氫-異-阿伐酸THIAA)係於描述於前面實例1中。所有其他合物係如實例4所述，得自供應商。加入塵瞒過敏原前60分鐘’先加入最終濃度10 /zg/ml之試驗物質。设備、PGE2分析及計算银如章例4所遂。塵蟎過敏原之分離-类辦屬媒(Derma tophagoi des ►為美國居家之塵蟎。將美旅蔡鵪置於1:1比率之 Purina Laboratory飼料（Ralston Purina，Co，St. Louis， MO)及Fleischmann’ s顆粒乾酵母（Standard Brands，Inc· New York, NY)中於室溫及75%溼度下培養。將活的塵螨由培養谷器中吸出’當將其從培養基中移出時，以冷;東殺死’脫水並儲存於〇%溼度下。將塵蟎的過敏成份在周圍溫度下以水萃取出。於15 ml圓錐離心試管中（VWR，Rochester, NY)，將五百克的塵蟎粉末加到5 ml的水中（1:1〇重量/體積），震盪一分鐘並於周圍溫度下放置隔夜。隔天，將水層使用〇· 2 //m丟棄式注射過濾器（Nalgene，Rochester，NY)過濾。該濾液即為塵蟎過敏原，並用於A549肺表皮細胞中試驗PGE2生物合成之引發。細廣培#及處理-將人類氣管表皮細胞株A 5 4 9 (American Type Culture Collection，Bethesda，MD)如前面實例6所述培養及處理。將塵蜗過敏原加到培養基中使最終濃度達到1000 ng/m卜十八小時後，由培養基中取樣供PGE2 測定。 81 200816982 ，妓-表ii餘述於經_過敏原刺㈣A5 胞中，蛇麻草衍生物郷E2生物合成之抑制程度。所有^驗的蛇麻物生物皆能顯著地抑制钱過敏原之刺激作用。表11 逆應•，蛇麻草衍生物夕 PGE2#fiU|m Aromahop 0E 阿伐蛇麻草（AA) Isohop(IAA) 貝他酸(BA) Hexahop(HHIAA) Redihop(RIAA) Tetrahop(THIAA)

此實例係說明蛇麻草衍生物能抑制A549肺表皮細胞之廣蟎過敏原之PGE2刺激作用。 f經塵蟎過敏原刺激的A54Qfl^ 試驗物質

實例8 一還屋的異阿伐酸缺乏眘接的C0X-2抑髮此實例之目的係測定還原的異阿伐酸鎂是否可作為 COX』酵素活性之直接抑制劑。 -於二甲亞石風（DMS0)中製備試驗化合物，並儲存於一2〇°〇LPS 係購自 Sigma-Aldrich 公司（St· Louis，M0)。 ggRlAA 係由 Metagenics 公司（San Clemente，CA)提供，並橡用西樂保之市售調配物（CelebrexTM，Searle & Co.， 82 200816982

Chicago， IL) 〇細廣居赛-鼠科巨嗤細胞RAW 264· 7細胞係購自atCC (Manassas，VA)並根據其指示養護。將細胞以每孔8χ 1〇4 個細胞之密度於96孔盤中進行繼代培養，並使其達到9〇0/〇的滿度，大約2天。將LPS(l/zg /ml)或PBS單獨加到細胞培養基中並培養12小時。從孔槽中移除培養基及將lps (1 //g/ml)與溶於DMS0及無血清RPMI之試驗化合物加到孔槽 _ 中使MgRIAA之最終濃度為20、5.0、1.0及O.lvg/w，而西樂保為100、10、1及〇· 1 ng/ml。各濃度進行8重複。以試驗化合物培養1小時後，移除細胞培養基，以帶有試驗化合物及LPS(l//g/ml)之培養基置換並培養。由孔槽中移除培養基並分析PGE2合成。 ° /¾¾合成-使用市售、無放射活性程序（Cayman Chem i ca】， Ann Arbor，MI)進行PGE2定量分析。於βΐa緩衝液中將樣本稀釋倍並使用製造商所建議之程序並無修改。pGE2濃度籲係以每笔升之皮克數來表示。此分析之製造商規格包括變化 <10%之分㈣係數，與PGD々 PGF2之交互作祕於1%且線性在10-1000 pg ml-1之範圍。雖然並無觀察到明顯的MgRIAA之PGE2抑制，C0X-2專一抑制劑西樂保係以劑量依賴性抑制c〇x—2介導心合成 (100 10 1及G.lng/mi)。該數據顯示，如同西樂保，贼不為直接的COX-2酵素抑制劑（圖5)。實例9 丛及丄巡—2蛋白复表現 83 200816982 將以MgRIAA處理及經LPS刺激之RAW 264. 7細胞之細胞萃取物以西方墨點分析iNOS及C0X-2蛋白。參# -於二甲亞石風（DMS0)中製備試驗化合物，並儲存於 -20°C。MgRIAA 係由 Metagenics 公司（San Clemente，CA) 所供應。小白菊内酯（Parthenolide)係購自Sigma-Aldrich 公司（St· Louis，M0)°PI3K抑制劑渥曼青黴素（wortmannin) 及 LY294002 係購自 EMD Bi〇SCiences 公司（San Diego, _ CA)。所產生的抗COX-2及iNOS抗體係講自Cayman Chemical 公司(^111^1^〇1%11)。所產生抗〇4?011之抗體係購自？^^1^ Biological公司（Littleton, C0)。與山葵過氧化酶偶合之一級抗體係購自 Amersham Biosciences 公司（Piscatawav NJ)。，細應培# -鼠科巨噬細胞RAW 264·7細胞株係購自 ATCC (Manassas，VA)並根據其指示養護。將細胞以每孔 3xl05個細胞之密度於24孔盤中進行細胞培養及繼代培養， • 亚使其達到的滿度，大約2天。將試驗化合物加到溶於無血清細胞培養基最終濃度為0.4% DMS0之細胞中。以試驗物質培養1小時後，將LPS (1；ag/mlM石粦酸緩衝鹽水單獨加到細胞孔槽中並持續培養至指定的時間。西才羞,點-於緩衝液E中（5〇mMHEPES，pH7. 0 ; i50mM triton X-l00、1 Mm原鈒酸鈉、胰酶抑狀素 (aprotinin)5/zg/ml、月 it抑肽素 A(pepStatin a)i# g/ml、亮抑酶肽（leupeptin)5"g/mi、苯基甲磺醯氣】製備細胞萃取液。簡言之，將細胞以冷的pBS清洗二次並加 84 200816982 入緩衝液E。將細胞刮至乾淨的試管中，於4〇c以14, 〇⑽rpm 離心10分鐘後，取出上清液係為總細胞萃取液。將細胞萃取液（50/zg)經由預注入 4%-2〇% Tris—HCi Criteri〇n 凝膠 (Bio-Rad，Hercules，CA)進行電泳分析，直到前面遷移的染色達到距底部凝膠5 mm。使用Bi〇_Rad (Hercules，CA) 之半乾煉系統，將蛋白質移轉至硝基纖維素膜。於室溫下清洗該膜並以5%乾奶粉阻斷1小時。先以初級抗體，之後以二級抗體於室溫下各培養一小時。使用pierce

Biotechnology 公司（R0Ckf0rd，il)之 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 藉由以等體積的魯米諾（luminol)/增強劑溶液及穩定的過氧化物溶液於室溫下培養5分鐘，來進行化學發光。使用冷式ccd Kodak'Rochester，NY) IS1000影像系統補捉西方墨點之影像。使用Kodak®軟體進行密度分析。 C0X-2及iNOS蛋白表現之百分比係使用西方墨點偵測來評估。以LPS刺激20小時後，觀察C〇x—2之表現。當與 DMS0之溶劑對照組相比較，可看到MgRIAA之c〇x—2蛋白表現降低了 55%(圖6)。專一的NF-kB抑制劑小白菊内酯，抑制了蛋白表現22· 5%，而ΡΊ3-激酶抑制劑降低的cox—2表現約47%(圖6)。此外，以LPS刺激2〇小時後，觀察到MgRIAA 之iNOS蛋白表現降低了 73%(圖7)。實例10 NF- /c B核轉位及DNA結合將經MgRIAA處理及經LPS刺激4小時之RAW 264· 7細 85 200816982 胞之核萃取物進行NF-/cB與DM結合之分析。 ##—於二甲亞砜（DMS0)中製備試驗化合物，並儲存於

20 C。MgRIAA 係由 Metagenics 公司（San Clemente, CA) 所供應。小白菊内酯（Parthenolide)係購自Sigma-Aldrich 公司（St· Louis, M〇hPI3K 抑制劑 LY294002 係購自 EMD

Biosciences 公司（San Diego，CA)。細廣培# -鼠科巨噬細胞RAW 264. 7細胞株係購自ATCC (Manassas，VA)並根據其指示養護。將細胞以每孔1.5xl06 個細胞之密度於6孔盤中進行細胞培養及繼代培養，並使其達到90%的滿度，大約2天。將試驗化合物MgRIAA(55及14 口g/ml)、小白菊内酯（8〇 μΜ)及LY294002(25 μΜ)加到溶於無血清細胞培養基最終濃度為0.4% DMS0之細胞中。以試驗物質培養1小時後，將LPS( 1 # g/ml)或PBS單獨加到細胞培養基中並再持續培養四小時。 NF-/cB-iWJ ·结合一核萃取物基本上係如Dignam等人所述[Nucl Acids Res 11:1475 -1489，（1983)]來製備。簡言之，將細胞以冷的PBS清洗二次，然後加入缓衝液a(1〇 mM HEPES, pH 7.0 ； L 5 mM MgCL· ； 10 mM KC1 ；〇. 1% NP-40 ；胰酶抑肽素（aprotinin)5 ug/ml;胃酶抑肽素 A(pepStatin A) 1 pg/ml ;亮抑酶肽（leupeptin)5 //g/ml;苯基甲磺醯氟i mM) 並置於冰上15分鐘。然後將細胞到至乾淨的試管中，及經由三個循環之冷凍-融解處理。於4°C以1〇, 〇〇〇 X g離心5 分鐘後，上清液層即為細胞質之顧份物。將剩餘的團塊再懸

浮於緩衝液 C 中（20 mM HEPES，pH 7· 0 ; 1· 5 mM KC1 ; 420 mM 86 200816982

KCl ; 25%甘油；0.2 M EDTA ;胰酶抑肽素（3?1^〇1：辻111)5 Ug/ml ;胃酶抑肽素A(pepstatin A) 1 pg/rnl ;亮抑酶肽 (leupeptin) 5 Mg/ml ;苯基甲磺醯氟1 mM)並於冰上放置 15分鐘。於4°C以10,000 X g離心5分鐘後，收集核萃取液之上清液層。使用Active Motif公司（Carlsbad, CA)之 TransAMNF-/cB套組，如各製造商之指示，評估核萃取液之 NF-/cB DNA結合。如圖8中所見，在於96孔之模式中， TransAM套組彳貞測到p50亞單位之NF- /c B結合至相同序列。測量蛋白質濃度（Bio-Rad分析）並以雙重試驗分析1〇 ug之核蛋白萃取液。核萃取物之分析（10 蛋白質）係以雙重複來進行，# 果係如圖9之圖示所示。以LPS (1 // g/ml)刺激導致Np r、κΒ ΜΑ結合增加二倍。以LY294002(—種ΡΙ3激酶抑制添，理，如前面文獻報告所預期，產生NF-κΒ結合適度增力σ。义白菊内酯亦如預期對NF-κΒ結合產生明顯的下降。^ MgRIAA，觀察到NF-κΒ結合大量降低。觀察到的效用為叫f 反應方式。NF-κΒ結合降低可導致目標基因，包括c〇x二里 iNOS及TNFa之轉錄活化降低。就MgDHIAA，結果顯示所觀察到的NF-κΒ結合降低可、曾致C0X-2蛋白表現降低，最後導致pGE2產生降低。 ^ 實例11 鱼相思樹幹主牲萃取物之可溶於二甲某亞礙之餾 1T3-L1脂肪細胞脂質生成增加模垄使用3T3-L1鼠科纖維母細胞模型研究化合物對月匕 87 200816982 肪細胞分化及脂質生成之潛在效用。此細胞株係研究調節前脂肪細胞複製與調節脂肪細胞分化之刺激和機制之分別 [Fasshauer， M·， Klein, J·， Neumann, S·， Eszlinger， M·， and Paschke, R. Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L 1 adipocytes. Biochem Biophys Res Coramun，290: 1084-1089，（2002); Li，Y·及Lazar, M· A· Differential gene regulation by PPARgamma agonist and constitutively active PPARgamma2. Mol Endocrinol, 16: 1040-1048，（2002)]以及試驗藥劑之胰導素敏化及降低三酸甘油醋能力[Raz，I·，Eldor，R·，Cernea，S·及Shafrir，E· Diabetes: insulin resistance and derangements in lipid metabolism. Cure through intervention in fat transport and storage. Diabetes Metab Res Rev, 21: 3-14, (2005)]。如前脂肪細胞，3T3-L1細胞具有纖維母細胞之表徵。其在培養中複製直到形成聚滿單層，之後細胞-細胞接觸觸發 Go/G!生長阻滯。3T3-L1細胞對脂肪細胞之終端分化係依照聚滿前-及後-的前脂肪細胞之增生而定。隨後以3-異丁基-1-曱基黃原膠、甲基黃原膠（methy Ixanthane)、地塞米松 (dexamethasone)及高劑量胰島素（mdi)刺激二天，促進這些細胞歷經聚滿後有絲分裂複製擴張，退出細胞週期並開始表現脂肪細胞專一性基因。大約在引發分化五天後，有多於90% 的細胞展現具特色的脂質填補脂肪細胞表現型。評估3T3-L1 細胞之三酸甘油酯合成提供了試驗藥劑之胰島素—敏化能力 88 200816982 之有效模型。在脂肪細胞中促進脂質吸收之藥劑應能改善胰島素敏感性顯得很吊說。已有數種假設提出試圖要解釋此種矛盾。一種已持續得到研究支持之提論為「脂肪酸偷竊」之觀念或脂肪酸由血漿中併入脂肪細胞造成肌肉中相當的脂肪酸消耗’伴隨葡萄糖吸收增加[Martin，g·，L Schoonjans等人， PPARgamma activators improve glucose homeostasis by stimulating fatty acid uptake in the adipocytes.

Atherosclerosis 137 Suppl: S75-80，（1998)]。噻唑啶二酮’例如曲格列酮（troglitazone)及吼格列酮 (piogl i tazone)已顯示可選擇性刺激脂肪細胞之脂肪生成活性，產生較大的胰島素抑制脂質分解，或釋放脂肪酸至血漿中[Yamauchi，T·，J· Kamon #乂，The mechanisms by which both heterozygous peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARga丽a) deficiency and PPARgamma agonist improve insulin resistance. J Biol Chem 276(44): 41245-54, (2001)； Oakes，N· D·，P· G· Thalen，#乂，Thiazolidinediones increase plasma-adipose tissue FFA exchange capacity and enhance insulin-mediated control of systemic FFA availability. Diabetes 50(5): 1158-65，（2001)]。此作用會使其他組織可用的脂肪酸變少[Yang, W· S·，W· J. Lee，等人，Weight reduction increases plasma levels of an adipose-derived anti-inflammatory protein, 89 200816982 adiponectin· J Clin Endocrinol Metab 86(8): 3815-9， (2001)]。因此，以σ塞嗤咬二酮治療的結果，會使在肌肉及肝臟中游離的脂肪酸之騰島素去敏化效用降低。這些活體外結果已經臨床確認[Boden，G· Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM. Diabetes 46(1): 3-10, (1997) ； Stumvoll, M. and H. U. Haring

Glitazones: clinical effects and molecular mechanisms. Ann Med 34(3)·· 217-24，（2002)]。緣驗-曲格列酮係得自Cayman Chemicals公司（Ann Arbor, MI)，而甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松、吲哚美辛 (indomethacin)、油紅0及胰島素係得自Sigma公司（St. Lou i s，M0 )。試驗化合物為深棕色粉末，係由相思樹樹膠（acE ) 樣本#4909之50··50(ν/ν)水/酒精萃取物所製造的，並得自 Bayir Chemicals 公司（No· 68， South Cross Road, Basavanagudi，India)。此萃取物經標準化，含有20%以上之apecatechin。用於此實例批號A Cat/2304，經UV分析測量含有20· 8%的apecatechin。青黴素、鏈黴素、Dulbecco’ s 修改Eagle’s培養基（MEM)係購自Mediatech公司（Herndon, VA)，而10% FBS-HI (胎牛血清-熱滅式）係來自Mediated! and Hyclone公司（Logan，UT)。除非另有說明，否則所有其他的標準試劑係購自Sigma公司。刼應培#及4理-鼠科纖維母細胞株3T3-L1係購自美國菌種保存中心（Manassas，VA)及根據供應商之指示進行繼代培養。實驗前，將細胞置於含有10% FBS-HI及添加50單位青 90 200816982 黴素/ml及50 //g鏈黴素/ml之DMEM中培養，並在實驗前保持在對數期。將細胞置於5% C〇2潮濕的培養箱中於37°C下培養。聚滿前培養基之成份包括（1)含有4.5 2葡萄糖几之1〇% FBS/DMEM ; (2)50 U/ml青黴素及（3)50 /zg/ml鏈黴素。生長培養基係藉由將50 ml的熱滅性FBS及5 ml的青黴素/鏈黴素加到500 ml DMEM所製成。將此培養基儲存於4Ϊ。使用前，將培養基以水浴加熱至37Ϊ。將3Τ3-Τ1細胞以起初6x104細胞/cm2之密度植入24-孔盤中。二天，讓細胞生長達到全滿。全滿後，藉由添加分化培養基促使細胞分化成脂肪細胞；此培養基含有（1)1〇〇/0 FBS/MEM(高葡萄糖）；（2)0·5 ιιιΜ曱基異丁基黃嘌呤;(3)0.5 //Μ地塞米松及（4)10 /zg/ml胰島素（MDI培養基）。三天後，將培養基換成含有10 /zg/ml胰島素之10% FBS/DMEM溶液之分化後培養基。將AcE部分溶解於二曱基亞砜（DMSO)並加入培養基以在分化的第0天及整個成熟期（第6或7天（D6/7))達到50 // g/ml之濃度。無論新鮮的培養基是在何時加入，同時亦加入新鮮的試驗物質。DMSO係因其極性及其可與水性細胞培養基混合之事實所選擇。分別加入吲哚美辛及曲格列酮，以達到 5· 〇及4· 4//g/ml之最終濃度，作為陽性對照組。以〇. 36%油紅0或0· 001% BODIPY將分化的、D6/D7 3T3-L1細胞染色。完整的分化及以試驗物質處理細胞之過程係以圖表概述於圖 10中。游、袭毯-D6/D7-分化的3T3-L1細胞之三酸甘油酯含 91 200816982 量係以油紅〇根據Kasturi及Joshi之方法來估算[Kasturi，R. 及Joshi，V· C· Horroonal regulation of stearoyl coenzyme A desaturase activity and lipogenesis during adipose conversion of 3T3-L1 cells. J Biol Chem， 257: 12224-12230，1982]。以PBS(磷酸緩衝食鹽水）清洗單層細胞並以10%的曱醛固定十分鐘。將固定的細胞以三部分〇.6% 油紅溶液/異丙醇儲存溶液及二部分水之油紅〇作用溶液染色一小時，並將多餘的染劑以水清洗一次。將生成的染色油滴以丙醇從細胞中萃取出並於54〇 nm以分光光度分析定量 (MEL312e BIO-KINETICS READER, Bio^Tek Instruments, Winooski，VT)。試驗物質及陽性對照組吲哚美辛和曲格列酮之結果係以相對於溶劑對照之54〇⑽吸收度來表示。卿//Ψ袭β —使用4, 4-二氟-1，3, 5, 7, 8-五-甲基-4-硼 -3&，43-二氮雜-3-笨并二茚（即1)11^ 493/5〇3;此1^111虹 Probes，Eugene，OR)進行細胞中性及非極性脂質之定量。簡吕之，移除培養基並將細胞以未滅菌的pBS清洗一次。將i mg B0DIPY溶於 1 ml DMS0 (1，〇〇〇 pg B〇DIPY/ml)來製造ΐοοοχ BODIPY/腿G儲存溶液。然後將1Q//丨的儲存溶液加到99〇# } 的PBS製造BQDIPY作用溶液，使作用溶液中最終的·Ιργ濃度為0· 01 //g//z 1。將1〇0// !的此作用溶液G B〇DIpY)加到96孔的微量滴定盤中。於周圍溫度下，在水平迴轉式振盪 ^(DS-500, VWR Scientific Products, South Plainfield, 0)15分釦後，以loo# ! ?沾清洗細胞，接著加入1〇〇#丨pBS 供分光光度測定B0DIPY併入細胞之判讀。使用設定在485 nm 92 200816982 激發光及530歷發射光之Packard螢光光譜儀 (Model#BFI0000，Meridan，CT)定量B0DIPY螢光。試驗物質、吲哚美辛及曲格列酮之結果係以相對於溶劑對照組之螢光來表示。所有中性及非極性脂質之BODIPY定量及3T3-L1細胞中在D7以油紅0測定三酸甘油酯含量間之卡方（chi-square)分析關係，以ρ<0· 001及4. 64之勝算比（Odds Ratio)，顯示二種分法間有顯著的關係。巍妒#禀及庳摩-AcE及吲哚美辛以雙重複最少分析三次。溶劑及曲格列酮對照亦以雙重複，重複八次。非極性脂質併入係以相對於溶劑對照中完全分化細胞之非極性脂質累積來表示。陽性反應係定義為以油紅〇或B0DIY染色評估脂質堆積增加大於溶劑對照組之各別的上方95%信賴區間（單尾，Excel ; Microsoft，Redmond，WA)。AcE另外的特徵為相對於溶劑反應，脂質生成增加大於或等於曲格列酮陽性對戶、?、組’使用Exce 1之學生t試驗功能作為此次之評估。綹采-陽性對照吲哚美辛及曲格列酮在3T3-L1細胞中引發脂質生成之量相類似（圖11)。令人意外地，AcE產生的脂肪生成反應大於陽性對照吲哚美辛及曲格列酮任一項。 3T3-L1細胞中水性相思樹樣本#490 9萃取物之可溶於二甲基亞砜成份所展現的脂質生成潛力，證實了其在具有對騰島素不敏感現象或徵狀之人類或其他哺乳動物中增加姨島素敏感性之潛力。 93 200816982 實例12 以皮性相思樹萃取物文可溶於二曱基亞砜餾份引發腌崑音阻抗的3T3 -L1脂肪纟翌胞之脂聯素（3(11〇〇116(：1^11)分泌增加禮麥-這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。試驗物質一曲格列酮係購自Cayman Chemical (Ann Arbor，MI)，而甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松及胰島素係得自Sigma公司（St· Louis，M0)。試驗化合物為深棕色粉末，係由相思樹樹膠（AcE)樣本#4909之50··50(體積/體積）水/酒精萃取物所製造的，並得自Bayir Chemicals公司（No. 68, South Cross Road，Basavanagudi，India)。此萃取物經標準化’含有不低於20%之apecatechin。用於此實例之批號a

Cat/2304 ’經UV分析測量含有20· 8%的apecatechin。青黴素、鏈Μ素、Dulbecco’s修改Eagle，s培養基（DMEM)係購自 Mediatec]il 公司（Herndon，VA)，而 10% FBS-HI (胎牛血清— 熱滅式）係來自 Mediatech and Hyclone 公司（Logan，UT)。除非另有說明，否則所有其他的標準試劑係購自Sigma公司。釦應培#及處理-如實例10所述，進行鼠科纖維母細月已株3T3 L1.培養以產生第6天分化脂肪細胞。將mg—τι細月匕以起初1χ1〇4細胞/cm2之密度植入96-孔盤中。二天，事 =胞生長達到全滿。全滿後，藉由添加分化培養基促使細胞分化成脂肪細胞；此培養基含有（1)10% FBS/DMEM(高葡萄糖);⑵0·5 mM甲基異丁基黃嘌呤;⑶0.5…也塞米松及（4)1^ //g/ml胰島素（MDI培養基）。從第3天至第5天二 94 200816982 將培養基換成含有10 //g/ml胰島素之10% FBS/DMEM溶液之分化後培養基。

評估相思樹對胰島素阻抗之效用，係將成熟的3T3一L1 細胞使用如Fasshauer等人所述之修改過程來進行 [Fasshauer, Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-LI adipocytes. BBRC 290:1084-1089,（2002)]。簡言之，在第6天將細胞保持在含有0. 5%牛血清白蛋白之無血清培養基中三小時，然後以工胰島素/ml加上溶劑或胰島素加上試驗物質處理。將曲格列酮洛於一甲基亞礙並加入以達到5、2· &、1· 25及〇· 625 # g/ml之濃度。相思樹萃取物係以、25、12. 5及6. 25 从g/ml進行試驗。二十四小時後，將取樣上清培養基供脂聯素測定。完整的分化及以試驗物質處理之過程細胞係以圖表概述於圖12中。脂聯素分析-分泌至培養基之脂聯素係使用小鼠脂聯素 Qimntikine®免疫分析套組（R&D Systems，Minneap〇lis， MN)來定量，並無修改。製造商所提供的資料指出，在小鼠、、、田胞培養基中脂聯素阻礙之恢復平均為1〇3%及最低可偵測的脂聯素濃度範圍從〇. 〇〇1至〇· 0〇7 ng/ml。八硗#診真及摩華-所有的分析係以雙重複進行。就統計二析，相思樹對脂聯素分泌之效用係以相對於溶劑對照所計 ^ ”彳昼間的差異性係使用學生t-試驗來測定並無對多重比較進行校正；選擇名目上五個百分比之型I誤差機率。試驗化合物之效力係使用修改的H〇f stee之方法 95 200816982 [Hofstee，Β· H· Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics· Nature 184:1296-1298，（1959)]測定表觀米氏常數（apparent Michaelis constant)及最大速度來估算。以{相對脂聯素分泌/[濃度]}取代獨立變數v/[S]及以{相對脂聯素分泌}取代獨立變數{v}，產生y=mx+b形式之關係。相對於溶劑對照組之最大脂聯素分泌係由y軸截距來估异’而半數最大脂聯素分泌所需之試驗化合物之濃度係由斜率的負數值來計算。結果一在胰島素阻抗3T3-L1細胞中，陽性對照組曲格列酮之所有試驗濃度，相對於溶劑對照組，在2. 5 # g/ml時係以2· 44-倍之最大刺激，增進脂聯素分泌（圖丨3)。相對於溶劑對照組’在50及25 /zg相思樹/mi濃度增加脂聯素分泌分別為1 · 76-及1 · 70-倍。雖然這些相思樹濃度皆不等於以曲格列酮所觀察到的最大脂聯素分泌，但可與丨.25及〇· 625 /zg/ml濃度之曲格列酮相比。估算衍生自修改的Hofstee圖之最大脂聯素分泌中顯示半數最大刺激所需的濃度之大差異數產生可相比的相對脂聯素分泌增加。由y截距估算曲格列酮及兒茶樹之最大脂聯素分泌’相對於溶劑對照組，分別為2· 29-及1. 88-倍。然而，在胰島素阻抗3T3-L1細胞中，刺激半數最大脂聯素分泌所需之曲格列酮濃度為0.085yag/ml，而相思樹濃度為 5· 38 // g/ml。依照20%之最低apecatechin含量所計算，後者相思樹之值變為大約1. 〇# g/ml。在胰島素阻抗3T3-L1細胞中，依其增進脂聯素分泌之 96 200816982 能力’可預期相思樹及/或apecatechin在抑制血漿脂聯素濃度之臨床病理上，具有正面效用。實例13

IMLi處理之3T3-L1脂肪細胞之脂聯至佥泌增力^ 模至-這些實驗係使用如實例π所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。試發允合#-吲哚美辛、曱基異丁基黃嘌呤、地塞米松及胰島素係得自Sigma公司（St· Louis，M0)。試驗化合物為深棕色粉末’係由相思樹樹膠樣本#4909之50:50(體積/體積）水/酒精萃取物所製造的，並得自Bayir Chemicals公司（Ν〇· 68，South Cross Road，Basavanagudi，India)。此萃取物經標準化’含有20%以上之apecatechin。用於此實例之批號 A Cat/2304 ’經UV分析測量含有20· 8%的apecatechin。青黴素、鏈黴素、Dulbecco, s修改Eagle，s培養基（DMEM)係購自 Mediated!公司（Herndon，VA)，而 10% FBS-HI(胎牛血清一熱滅式）係來自 Mediatech and Hyclone公司（Logan，UT)。除非另有說明，否則所有其他的標準試劑係購自Sigma公司。細廣培赛及處禮-如實例1〇所述，進行鼠科纖維母細胞株3T3-L1培養以產生第3天分化的脂肪細胞。將3T3-T1細胞以起初IxlO4細胞/cm2之密度植入96—孔盤中。二天，讓細胞生長達到全滿。全滿後，藉由添加分化培養基促使細胞分化成脂肪細胞；此培養基含有（〗)〗〇% FBS/DMEM(高葡萄糖）； (2)0· 5 mM曱基異丁基黃嘌呤；(3)〇. 5 μ μ地塞米松及（4)10 97 200816982 //g/ml胰島素（MDI培養基）。從第3天至第5天，將培養基換成含有10% FBS/DMEM溶液之分化後培養基。在第5天，將培養基換成含有10、2或〇·5 ng TNFa/ml之10% FBS/DMEM溶液’有或無吲哚美辛或相思樹萃取物之試驗培養基。將吲哚美辛溶於二甲基亞砜並加入使濃度達到5、2· 5、丨· 25及〇. 625 //g/m卜將相思樹萃取物以50、25、12· 5及6· 25心/^試驗。在第6天，取樣上清培養基供脂聯素測定。完整的分化及以試驗物質處理細胞之過程係以圖表概述於圖14中。廢游責分#-分泌至培養基之脂聯素係使用小鼠脂聯素Quantikine®免疫分析套組（脱D Systems，Minneap〇lis， MN)來定量，並無修改。製造商所提供的資料指出，在小鼠細胞培養基中脂聯素阻礙之恢復平均為丨〇3%及最低可偵測的脂聯素濃度範圍從0·001至0.007 ng/ml。巍妒妒异及摩舉-所有的分析係以雙重複進行。就統計分析，吲哚美辛、兒茶樹對脂聯素分泌之效用係以相對於溶劑對照所計算。劑量及試驗藥劑間的差異性係使用學生士一試驗來測定並無對多重比較進行校正；選擇名目五個百分比之型I誤差機率。、结耒一在成熟的3T3-LUm胞中，1〇及2 ng/ml濃度之 TNFa分別以65及29%顯著地（ρ<〇· 05)抑制脂聯素分泌，而在〇· 5 ng/ml時對脂聯素分泌無明顯效用（圖15)。相對於試驗的TNFa之單獨所有劑量，於1()及2 ng TNF^/mw "引嗓美辛促進了（P<G· G5)脂聯素分泌，但無法將脂聯素分泌恢復至浴劑對照組之量。相思樹治療在1〇 ng TNFa/ml之存在下， 98 200816982 相對於％哚美辛，儘管是遞減，產生類似之脂聯素增加。在四個增加的劑量，兒茶樹及吲哚美辛間脂聯素刺激之差異分別為14 ’ 2〇，32及41%。因為劑量間之多重性對吲哚美辛及相思树為相同的，所以這些結果顯示，就恢復3T3-L1之脂聯素分泌，在超生理濃度之TNFa存在下，吲哚美辛之效力大於相思樹中之活性物質。

以2 ng TNFa及相思樹處理3T3-L1細胞，相對於以丁冊 α單獨處理者產生脂聯素分泌增加，其在6· 25、25及50

Pg/ml時為顯著的（Ρ<〇· 05)。然而，不像10 ng TNFa/ml處理’相思樹及吲哚美辛間之差異較小且明顯與劑量較不相關，四種§式驗濃度之總平均為5· 5%。如n引π朵美辛中所觀疼到，相思樹並沒有將脂聯素分泌恢復至溶劑對照中所觀客^ 之量。 π 在0.5 ng TNFa/ml時，吲哚美辛產生劑量依賴之脂聯素分泌降低，其在2. 5及5. 0 Ug/ml濃度時為顯著的" (P<0.05)。有利地，不像吲哚美辛，相對於經及溶叫處理之3T3-L1脂肪細胞，兒茶樹在50^41增加了沪聯、泌。因此，當TNFa濃度接近生理量時，兒茶樹促分泌，相較於TNFa及溶劑對照組，令人驚訝地優於;:美在經TNFa ~處理之3T3-L1細胞中，依其增進脂聯素八泌之能力，可預期相思樹及/或叩比也冰七在其中ΤΝρ^旦、高且血漿脂聯素濃度受到抑制之所有臨床病理上，具有^ = 99 200816982 實例14 敍細胞掇剞中各種市售相思樹樣本增加脂質生成禮堃—這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。所用的所有化合物及程序係如實例11中所述，但是僅進行油紅0分析來評估兒茶樹引發的細胞之三酸甘油醋量。兒茶樹樣本#5669係得自Natural Remedies公司（364, 2nd Floor, 16th Main, 4th T Block Bangalore, Karnataka 560041 India);而樣本 #4909、#5667 及 #5668 係得自 Bayir Chemicals 公司（Μ〇· 10，Doddanna Industrial Estate， Penya II Stage， Bangalore， 560091 Karnataka， India)。阿拉伯金合歡樣本#5639、#5640及#5659係購自KDN-Vita International, Inc. (121 Stryker Lane, Units 4 & 6 Hillsborough，NJ 08844)。樣本#5640說明為樹幹，樣本 #5667為樹膠而樣本#5669為心材粉末。除非另有指出，否則所有的其他樣本係為兒茶樹幹之專屬甲醇萃取物。潜采-所有檢測的相思樹樣本皆產生陽性脂質生成反應（圖16)。最高的脂質生成反應係由樣本#5669心材粉末 (1· 27)、#5659—甲醇萃取物（1· 31)、#564〇 — DMS〇萃取物 (L29)及#4909—甲醇萃取物（131)所達成。此實例另外驗證兒茶樹中有多重化合物存在，其能正向修改脂肪細胞生理支持增加胰島素作用。實例15 脂超赵廬篮型中各種市售相ϋ樣本增加 II聯素分泌 100 200816982 薦麥-這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。所用的標準化合物及細胞處理係如實例Π及13 中所記載來進行。然而，以TNFa處理之3T3-L1脂肪細胞與實例12中的不同，其中細胞僅暴露於2或10 ngTNFa/ml中。在弟6天將培養的上清培養基如實例12所詳述進行脂聯素分析。相思樹樣本#4909、#5639、#5659、#5667、#5668、#5640 及#5669係如實例13所述。 • 結果-相對溶劑對照，2 ng/ml TNFa降低了 3T3-L1脂肪細胞之脂聯素分泌27% ’而相對TNF α溶劑對照，1 · 25 弓卜朵美辛/ml之脂聯素分泌最大上升η%(表12)。僅相思樹調配物 #5559在任何四個所試驗的劑量無法增加脂聯素分泌。所有其他的相思樹調配物皆產生範圍從1 〇至15%之可相匹敵的最大脂聯素分泌增加。然而，有關由各種相思樹調配物引發最大脂聯素分泌之濃度，觀察到具差異。最強效的調配物為 #5640，在12.5 ng/ml時達到最大脂聯素刺激，接著是#49〇9 φ 及#5668係在25Vg/ml及#5639、#5667及#5669係在50 pg/ml 時。表12 ng 查立jr由各種相思樹調配物引發3T3_L1 _塵屋相對最大脂聯素分泌試驗化合物濃度[Mg/ml] 脂聯素指數t 2ngTNFa/ml±95°/〇CI — 1·00±0·05 溶劑對照組 _ 1.27^ 吲哚美辛 1.25 1. 11* 101 200816982 萃取物） 25.0 1，15* 材⑽s〇萃取物） 50.0 1. 14* 9樹幹（甲醇萃取物） 25 1. 02 甲醇萃取物) 50.0 1. 10* 屋茶#/#5668(樹膠） 25.0 1· 15* 0樹幹（DMS0萃取物） 12. 5 1. 14* j ##/#5669，^^粉末（DMS0 萃取物） 50.0 1. 14^ t脂聯素指數=[脂聯素;^/ [脂聯素]TNFa對照 *相對TNFa溶劑反應為顯著增加（p<〇. 〇5) 相對溶劑對照組，10 ng/ml TNFa降低了 3T3-L1脂肪細胞之脂聯素分泌54%，而相對TNF a溶劑對照組，5. Q pg 吲哚美辛/ml之最大脂聯素分泌上升67%(表13)。曲格列酮在最低試驗劑量0· 625 yg/ml時，最大增加脂聯素分泌 51%。相思樹調配物#5559在25yg/ml時產生12%之最低顯著的增加（ρ<0· 05)。所有其他的相思樹調配物在5〇 lag/mi時皆產生範圍從17至41%之最大脂聯素分泌增加。最強效的調配物為#4909及#5669，相對TNFa溶劑對照組，分別具有 41及40%之脂聯素分泌增加。表13 在10 ng TNFa /ml的存在下由各種相思榭調配物引發 3T3-L1脂肪_細胞之相對最大脂聯素分泌試驗物質濃度[Ug/ml] 脂聯素指數t 10 ng TNFa/ml±95°/〇CI - 1·00±0·10 溶劑對照組 — 1.54* 102 200816982 吲哚美辛 5· 0 曲格列酮 0. 625 尤茶#/#490 9樹幹（甲醇萃取物） 50 /T拉泠金合歡#5639心材（DMS0 萃取物） 50 在命金合嶔#5659樹幹（甲醇萃取物） ——— 25 龙##/#56 6 7樹幹（甲醇萃取物） 50 名茶藏#5668(樹膠） 50 斤在泠金合翁#5640樹幹（DMS0萃取物） 50 龙茶藏#5669心材粉末（Duso萃取物） 50 1.40* *相對TNFa溶劑反應為顯著增加（ρ<〇· 05) 在代謝症候群之第二模型中，觀察到不同的相思樹樣本或调配物引起類似反應，另外驗證了相思樹中多重化合物之存在，能正向修改脂肪細胞生理支持增加胰島素作用。

1.12*

實例16 息差樹之極性及非掩篮溶劑之萃取化厶物能增加TNFa L1脂竖|gj^模型之脂！^分泌輕-這些實驗係使用如實例u所述之3T3_Ll鼠科纖，㈣㈣。所用的標準化合物係如實例n及财所記载。如實例13中所述以10 ng TNFa/ral處理3T3_L1脂肪 103 200816982 細胞。在第6天將培養的上清培養基如實例13所詳述進行脂聯素分析。試I##-將大塊的！茶#/樣本#5669心材（每片重量 5 -10克）以5/8"金屬鑽頭使用標準動力鑽於低速鑽動。將木刨片收集至研绰中，並磨成細粉，並於液態N2下冷凍。然後將此粉末以250微米的篩子過篩，得到約1〇 g自由流動性之細粉末。表14 供脂聯素分折之彦裏///萃取樣本之說明萃取溶劑萃取物之重量[mg] 萃取之百分比胃液1 16 11 二甲基亞礙 40 27 氯仿 0.2 0. 13 甲醇/水ρΗ=2 95:5 20 13 水 10 6. 7 乙酸乙酯 4 2. 7 104 1 胃液含有2· 90 g NaCl、7. 0 ml濃HC1水溶液、3. 2 g 胃蛋白酶C800-2500活性單位/mg)，以水稀釋成looo ml。最、冬的pH為1 · 2。就此萃取，係將胃液-心材懸浮液保持在 40 C —小時’接著真空移除胃液。然後將剩餘的殘餘物溶於MeOH，以0.45微米的pTFEs射過濾器過濾並真空濃縮。將此物末为政於六支坡璃褐色的樣品瓶中（15 0 mg/瓶）並以2 ml之下表14中所列的溶劑於40T下萃取約10小時。萃取後，將心材/溶劑懸浮液離心（5800 xg，10分鐘）。 200816982 將離心後的上清液部分以0.45微米PTFE注射過濾器過濾至分開的褐色玻璃樣品瓶中。將這些樣本各自真空濃縮。如表 7中所見’以DMS0由兒茶樹心材萃取大部分的物質及最後以氯仿萃取❹所有的萃取樣本係以別^卜以^及匕烈呢/“ 來試驗。 "比格列_係由市售來源Actos®(Takeda

Pharmaceuticals，Lincolnshire，IL)得來之 45 mg 的吼格列酮錠劑。將錠劑磨成細粉並以5· 〇、2· 5、L 25及〇. 625收吼格列酮/ml進行試驗。同時亦包括吲哚美辛，作為額外陽性對照組。潜果-1%性對照組π比格列酮及叫卜朵美辛二者，在tnf «的存在下增加脂肪細胞之脂聯素分泌分別為115及 94%(圖17)。吡格列酮及吲哚美辛之最適濃度分別為丨.25 及2· 5 pg/ml。兒茶樹樣本#5669之所有萃取物，相對於TNF α處理，皆增加了脂聯素分泌。在萃取物中，dms〇萃取物為最有效力的脂聯素分泌引發劑，觀察到最大的活性係在 6· 25 nig萃取物/ml。此結果可能係因為而〇S萃取廣泛各種極性物質之能力。檢視圖17指出水萃取物（極性化合物)及氣仿萃取物（非極性化合物）二者在TNFa/3T3-L1脂肪細胞模型中，其增加脂聯素分泌之能力相似。這些萃取物未必含有相似的化合物。此實例說明，具有不同極性之溶劑由戈茶 #/心材中萃取化合物之能力，其在前發炎刺激物之存在下，能增加脂肪細胞之脂聯素分泌。 105 200816982 f例17

能增加脂聯音公泌禮堃-這些實驗係使用如實例〗〗所述之3T3—u鼠科纖維母細胞模型。所用的標準化合物係如實例〗〗*^中所記載。3T3—Ll 脂肪細胞係如實例13中所述以1〇 ng TNFa/ml處理。在第6天將培養物上清培養基如實例13所詳述進行脂聯素分析。緣驗兒茶樹樣本#5669係根據下列程序來萃取：將鹼性異丙醇溶液（1%(體積/體積）h 5N Na〇H之異丙醇溶液）加到含約50 mg乾燥兒茶樹心材粉末#5669之5〇射試管中。然後將樣本短暫混合，以超音波處理3〇分鐘及離心一小時讓剩餘的固體物質形成團塊。然後將上清液以〇 · 4 5微米的濾紙過濾。所用的鹼性異丙醇之pH為ρΗ 8·〇，而所收集的液體邱為pH 7· 0。取一部分澄清過濾的液體進行真空乾燥，並出現白色固體。此樣本即為乾燥鹼性萃取物。將剩餘的團塊物質置於酸性異丙醇溶液（1%(體積7體積）10% HC1之異丙醇溶液），為紅色溶液。將此樣本混合直到團塊物質完全分散於液體中，然後離心3〇分鐘得到剩餘之團塊。將淡黃色的上清液通過〇·45微米濾紙濾。所收集的液體pH為pH 3.0且發現當樣本的pH升至pH 8-9，有紅標色沉殿 (乾沉澱）形成。收集沉澱並乾燥，得到紅棕色固體。再次將上清液通過0· 45微米過濾器以移除任何殘餘的沉澱；此液體為深黃色。將剩餘的液體乾燥產生固體棕色樣本即為乾燥酸性萃取物。三種回收之餾份係如表15所列。所有的試驗化 106 200816982 合物係於50、25、12· 5及6· 25 ug/ml分析，而吼格列酮陽性對肊係於5. 〇 ' 2· 5、1· 25及0· 625 pg/ml進行試驗。表15 ——---皇艺蚊粉末之試驗物質Θ你減驗物質 —_所收集mgU兒茶樹樣本#5669) 乾燥驗性萃取物 -_ 0.9 (1.8) 乾燥沉殿 1.2 (2.4) 乾燥酸性萃取物 1.5 (3.0) …耒·相對於溶劑對照組，了α降低脂聯素分泌46%。比格列酮之脂聯素分泌之最大恢復為在〗· 25 ，，中所觀祭到的1· 47倍（表16)。在試驗物質中，僅乾燥沉肩又I法顯著地將脂聯素分泌增加至僅有TNF α之對照組之上。酸性萃取物及心材粉末（起始物質）在TNFa存在下，其立曰加知聯素分泌之能力相似，而鹼性萃取物僅在最高劑量5 〇 Mg/ml時增加脂聯素分泌。表16 量所引鉻夕噩大脂聯音合泌試驗物質濃度[Hg /ml] 脂聯素指數f DMS0對照組 - .__^ 1.86 TNFa±95%CI --- 1. 00±0. lift - 龙##/#^#5669心材粉太 ^. 1. 14 乾燥驗性萃取物 ^^___ 50 1. 19 乾燥沉澱 ^.......... 6. 25 L 09 乾燥酸性萃取物 —— 6. 25 1· 16 107 200816982 ^^格列酮_1_1. 25__1. 47 t脂聯素指數二[脂聯素]試驗/ [脂聯素]TNFa對照 *值>1. 11為顯著與TNFa對照組不同（p<〇.〇5) 實例18 猃經TNFa-處理之3T3-L1脂肪細胞中以相思樹水性萃取物之可溶於二甲某亞颯餾份物降低介合音-6分泌介白素-6(IL-6)為多功能細胞激素，其在宿主防禦、急性期反應、免疫反應、神經細胞功能、造血作用及代謝症候群中扮演一個重要角色。其係藉由各種正常及轉化的淋巴或非淋巴細胞（例如脂肪細胞）來表現。IL-6之產生係藉由許多訊號例如有絲分裂原或抗原刺激、脂多糖、鈣離子載體、細胞激素及病毒向上調整[Hibi，M·，Nakajima，K·，Hirano Τ· IL-6 cytokine family and signal transduction: a model of the cytokine system. J Mol Med. 74(1):1-12, (Jan 1996)]。在許多病理症狀包括細菌及病毒感染、創傷、自體免疫疾病、惡性腫瘤及代謝症候群已觀察到血清含量上升[Amer， P· Insulin resistance in type 2 diabetes — role of the adipokines. Curr Mol Med. ;5(3) :333-9, (May 2005)]。與垄^這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。所用的標準化合物係如實例11及13中所記載。 3T3-L1脂肪細胞係如實例13中所述以10 ng TNFa/ml處理。在第6天將培養物上清培養基如實例13所詳述進行脂聯素分析0 108 200816982 弑發#貧一吲哚美辛、曱基異丁基黃嘌呤、地塞米松及胰島素係得自Sigma公司（St. Louis，M0)。試驗化合物為珠棕色粉末，係由兒茶樹膠樣本#4909之50:50(體積/體積）水/ 酒精萃取物所製造的，並得自Bayir Chemicals公司（No· 68,

South Cross Road, Basavanagudi，India)。此萃取物經標準化’含有不低於20%之apecatechin。用於此實例之批號A

Cat/2304 ’經UV分析測量含有20·8%的apecatechin。青徽素、鏈黴素、Dulbecco, s修改Eagle，s培養基（DMEM)係購自 Mediatech公司（Herndon，VA)，而 10% FBS(胎牛血清）係來自 Mediatech and Hyclone公司（Logan, UT)。除非另有指出’否則所有其他的標準試劑係購自Sigma公司。分泠沒分# -分泌至培養基之几_6係使用小鼠脂聯素Quantikin^小鼠IL-6免疫分析套組（R&D办紂⑽匕

Minneapolis，MN)來定量，並無修改。製造商所提供的資料指出，在λ!、氣細胞培養基中’以1:2稀釋，IL_6阻礙之恢復平均為99%，及最低可_眺_6濃度範圍從丨如8 pg/nd。所有上清培養基樣本分析時皆未稀釋。旄輯算及麟-所有的分析係以雙重複進行。分析’相思樹對脂聯素或㈣分二计照所計算。劑量間的差異性係使用學則對 ^比較進恤正，補名目五個百分比之型Μ差機率泌，而在ΤΝΡ α的存在下，吲喵蓋 I刀 3丨木果辛及兒茶樹萃取物增力口了 109 200816982 脂聯素分泌。雖然吲哚美辛陽性對照組及兒茶樹萃取物二者展現劑量相關之脂聯素分泌增加，但是沒有物質將脂聯素濃度恢復至無TNFa之二曱基亞砜對照組中所見到之濃度（表 17)。在TNF a的存在下’兒舍樹卒取液展現強力、劑量相關之IL-6分泌之抑制作用，而吲哚美辛卻驗證無抗發炎效用。檢驗抗發炎脂聯素對前發炎IL-6之比率，吲哚美辛及兒茶樹萃取物在相對的抗發炎活性上產生良好的劑量相關增加。表17 在TNFa/3T3-Ll模型中以兒茶樹樣本#4909引起IL-6分泌降低及月旨聯素分泌增力口試驗物質濃度 [Mg/ml] 脂聯素指數卞 IL-6 指數η 脂聯素/IL-6 DMS0對照組 — 2.87* 0.46* 6. 24^ TNF α對照組 ±95% CI - 1·00±0·079 1·00±0·08 1·00±0.08 吲哚美辛 5. 00 2. 69* 1.10* 2. 45* 2. 50 2. 08* 1. 04 2. 00* 1.25 1. 71* 1. 01 1. 69* 0.625 1. 54* 1. 37* 1. 12^ 兒茶樹樣本 #4909 50. 0 1.51 * 0· 27* 5. 55* 110 200816982 25. 0 L 19* 0. 71* L 1.68* 12.5 1. 13* 0. 78* —__ 1. 45* 6.25 1.15$ 0. 93 —-_ 1. 23^ 將兒茶樹試驗物質或吲哚美辛一致以10 ng TNFa/ml加到 D5 3T3〜L1脂肪細胞中。在隔天，自上清培養基取樣進行脂聯素及IL-6測定。所有的值係以TNF a對照組為指數。卞月日耳外素指數=[脂聯素]試驗/ [脂聯素]TNF a對照 • mL-6 指數二[il-6 試驗-IL-6 對照]/[ IL-6，r IL-6 對照] *顯著地與TNFa對照組不同（ρ<〇· 〇5)。龙茶#/樣本#4909在TNFa/3T3-L1脂肪細胞中，證實有雙重抗發炎作用。兒茶樹萃取物之成份增加脂聯素分泌同時增加IL-6分泌。相對於TNFa對照組，兒茶樹整體之效用係具強力的抗發炎性。這些結果支持兒茶樹於修改脂肪細胞生理降低胰島素阻抗、體重增加、肥胖、心血管疾病及癌症之用途。 ⑩ 實例19 3T3-L〗j旨肪細胞中水溶性相思樹萃取物之1 顧分勒對脂聯素、IL-6及抵抗素（res i st iη 1 合泌之效用模#-這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。所用的標準化合物係如實例Η及丨2中所記载。11-6係如實例所述進行分析。邊成資分分泌至培養基之抵抗素之量係使用小鼠脂聯素Quantikine®小鼠抵抗素免疫分析套組（R&D Systems, 111 200816982

Minneapolis，MN)來定量，並無修改。製造商所提供的資料才曰出，在小a細胞培養基中，以1:2稀釋，抵抗素阻礙之恢復平均為99%，及最低可偵測的抵抗素濃度範圍從1.3至1.8 pg/ml。分析前，所有上清培養基樣本皆以製造商提供之稀釋培養基稀釋成1:2〇。處說命桌及摩摩—所有的分析係以雙重複進行。就統計分析’相思樹對脂聯素或IL-6分泌之效用係以相對於溶劑對照組所計算。劑量間的差異性係使用學生t-試驗來測定並然對夕重比較進行校正；選擇名目五個百分比之型I誤差機率（單尾）。潜采一在高濃度胰島素的存在下，曲格列酮及相思樹樣本#4909以^里相關的方式增加脂聯素分泌（表a)。兒茶樹在僅6· 25 ug/mi濃度時，經由降低6展現抗發炎效用，而曲格列酮在5·00及1·25 Mg/ral時具前發炎性，在其他二，濃度時並無觀察到效用。對曲格列酮，抵抗素分泌係以劑置依賴之方式增加，然而，兒茶樹降低抵抗素表現同樣係以劑量依賴之方式。如貝例18所見’在高胰島素血症/3T3-L1脂肪細胞模型中，兒荼樹樣本#4909再次驗證雙重抗發炎作用。兒茶樹萃取物之成份增加脂聯素分泌同時降低IL—6分泌。因此，相對於高=島素㈣’兒茶樹之整體效用係具抗發炎性。在高胰島素派度下兒茶樹對抵抗素分泌之效用係與曲格列_相反·曲格列酮增加抵抗素表現，而兒茶樹則進一步降低抵抗素表現。這些數據顯示複合的兒茶樹萃取物並非經由 112 200816982 文體來作用。這些結果提供了兒茶樹於修改脂肪細胞生理降低胰島素阻抗、體重增加、肥胖、心金管疾病及癌症之用途之另外的支持。表18 在底赢模.型中兒對脂聯素、τ“ 試驗物質濃度 Uxg/ml] 脂聯素指數t 胰島素對照組 — 1.00+0.30* 曲格列酮 5· 00 1.47 2. 50 2.44 1.25 1. 87 0. 625 2. 07 兒茶樹樣本 #4909 50, 0 1. 76 25. 0 1.70 12. 5 1. 08 6· 25 1· 05 IL〜6指數tt lj〇±0. 23 1.31 1. 06 • 46 隔天’取樣上清培養基進行脂聯素、 6及抵抗素蚊。所有的值係以僅有姨島素對照組為指 1. 00

抵抗素指數 ttf 1·00±0·13 1.43 1.22 .28 0.89 0. 50 0.61 0.86 0. 93 ·μ ,匕於，‘丄㈣喚島素同樣加到D5 113 200816982 t脂聯素指數=[脂聯素]紐/[脂聯素]心素對照 tm_6 指數二[IL-6 試驗]/[IL-6 胰島素對照] 卞忖抵抗素指數=[抵抗素試驗]/[抵抗素胰島素對照] *指數值係代表平均值±95%信賴區間，係由變異數分析之餘差平均平方來計算。值大於或低於胰島素對照組±95%CI為具ρ<0· 05之顯著性差異。實例20 以蛇麻草衍生之植物性化合物（phytochemi cal)增加脂肪細胞之脂質生成這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。所用的標準化合物及統計程序係如實例11 中所記載。試/驗# # -此試驗中所用之蛇麻草植物性化合物係如表 19中所述且係得自Betatech Hops Products公司 (Washington，D· C·，U· S· Α·)。表19 蛇麻草試驗物質之說明蛇麻草試驗物質說明阿伐酸溶液以體積計82%異阿伐酸/2· 7%貝他酸/2· 95%異阿伐酸。阿伐酸包括異蘀草酮、異近蘀草酮及異類葎草酮 Rho異阿伐酸 (R1AA) Rho-異葎草酮、Rho-異近葎草酮及rho—異類葎草酮 114 200816982 異阿伐酸（ΙΑΑ) 以體積计25· 3%異阿伐酸。包括順式及反式異葎草酮、順式及反式異近蘀草酮及順式及反式異類糖草酮四氫異阿伐酸 (ΤΗΙΑΑ) 複合蛇麻草-以體積計8· 9% ΤΗΙΑΑ。包括順式及反式四氫-異葎草酮、順式及反式四氫-異近葎草酮及順式及反式四氫-異類蘀草酮六氫異阿伐酸 (ΗΗΙΑΑ) 以體積計3· 9% ΤΗΙΑΑ ; 4· 4% ΗΗΙΑΑ。ΗΗΙΑΑ 異構物包括包括六氫-異葎草酮、六氫-異近葎草酮及六氫-異類#草酮。貝他酸溶液以體積計10%貝他酸，〈2%阿伐酸。貝他酸包括蛇麻酮（lupulone)、輔蛇麻g同（colupulone、聚蛇麻酮（adlupulone)及前蛇麻酮 (prelupulone) 〇黃腐紛（ΧΝ) 以重量計>80%黃腐紛。包括黃腐紛、黃腐盼A、黃腐酚B、黃腐酚C、黃腐酚D、黃腐酚E、黃腐齡F、黃腐紛G、黃腐驗Η、去甲基黃腐盼、 xanthogalenol、4’“0-甲基黃腐紛、3’-香葉基查爾酮柚皮素、3’，5’二異戊烯基查爾酮柚皮素、5’ -異戊嫦黃腐驗、f lavokawin、ab-二氫黃腐紛及異-二氫環黃腐紛水合物 115 200816982

黃腐紛、黃腐紛A、黃腐酚B、普腐盼c、黃腐_、黃腐_、黃輕F、普觸g、反式基黃腐二氫黃腐紛c、去甲基黃腐盼B、去甲基黃腐齡】、黃腐紛、去甲基黃腐紛、異黃腐紛、ab—二氫貫腐酚、二異戊烯基黃腐酚、5"—羥基音腐酚、5’-異戊烯基黃腐酚、6, 二異戊晞基柚皮素、8-異戊烯基柚皮素、6_異戊烯基柚皮素、異黃腐酚、律草靈酮 (humulinone)、副律草靈酉同 (cohumulinone)、4-羥基笨曱醛及谷留醇一計 1 % 六皇容液知應居#及處座—將蛇麻草化合物溶解於二曱基亞颯 (DMS0)並加入以便在分化的第〇天達到1〇、5、4或2 之濃度並維持至整個成熟期（第6或7天）。酒花粕係以5〇 # g/ml進行減驗。恶論新鮮的培養基是在何時增加，同時亦加入新鮮的試驗物質。·S0係因其極性及其可與水性細胞培養基混合之事實所選擇。作為陽性對照組，分別加入吲哚美辛及曲格列酮’以達到5· 〇及4· 4//g/ml之最終濃度。以0.36% 由紅〇或0· 001% B0DIPY將分化的、D6/D7 3T3-L1細胞染色。潜果—陽性對照組吲哚美辛及曲格列酮在3T3-L1細胞中引發脂質生成之程度相類似（圖18)。令人意外地，四類的蛇麻草在3T3-L1脂肪細胞產生促脂肪生成反應大於陽性對 116 200816982 照組吲哚美辛及曲格列酮任一項。這四類包括異阿伐酸、 Rho-異阿伐酸、四氫異阿伐酸及六氫異阿伐酸。由已發表的報告來看，此發現令人驚譯，個別的異蘀草酮與PPARr之結合大約為PPAR r促進劑吡格列酮之三分之一至四分之一 [Yajima, Η·，Ikeshima，Ε·，Shiraki，Μ·，Kanaya，Τ·， Fujiwara，D·，Odai，Η·，Tsuboyama-Kasaoka, Ν·，Ezaki， 0·，Oikawa，S·，and Kondo, K. Isohumulones，bitter acids derived from hops, activate both peroxisome pro!iferator-activated receptor alpha and gamma and reduce insulin resistance. J Biol Chem， 279: 33456-33462，（2004)]。黃腐酚、阿伐酸及貝他酸之脂肪生成反應可與吲哚美辛及曲格列酮相匹敵，而酒花粕及六氫輔蛇麻酮無法引起大於溶劑對照組之脂質生成反應。依照其在3T3-L1細胞中之脂質生成效力，在此研究中陽性的蛇麻草植物性化合物種類包括異構化阿伐酸、阿伐酸及貝他酸以及黃腐酚，其可預期於具有胰島素不敏感現象或徵狀之人類或其他哺乳動物中增加胰島素敏感性並降低血清三酸甘油醋。實例21 皇激_島素阻抗的3T3-L1脂肪細胞中蛇窳草植物性化合物增加脂聯素分泌這些實驗係使用如實例11及12所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。標準化合物，蛇麻草化合物RIAA、IAA、 117 200816982 THIAA、HHIAA、黃腐酚、六氫輔蛇麻酮、酒花粕係分別如實例12及20中所述。知愈禮赛义屢禮〜細胞係如實例12中所述培養並如前述以蛇麻草植物性化合物處理。脂聯素分析及統計解釋係如實例12中所述。試驗化合物之效力係使用修改的此化七找之方法，測定表觀米氏常數及最大速度來估算。以丨相對脂聯素分泌/ [濃度]}取代獨立變數v/ [ S ]及以{相對脂聯素分泌} 取代獨立變數{V}，產生y=mX+b形式之關係。相對於溶劑對照組之最大脂聯素分泌係由y軸截距來估算，而半數最大脂聯素分泌所需之試驗化合物之濃度係由斜率的負數值來計算。、潜采-在胰島素阻抗3T3-L1細胞中，陽性對照組曲格列酮，相對於溶劑對照組，在2· 5//g/ml時係以2· 44-倍之最大刺激，增進脂聯素分泌（圖19)。相對於溶劑對照組，所有試驗的蛇麻草植物性化合物驗證促進脂聯素分泌，而異阿伐酸產生比曲格列S同（相對於對知組為2 · 9 7 -倍）更顯著的脂聯素。在四種所試驗的劑量中，最大的脂聯素分泌係在5 μ g/ml(最高劑量）之異阿伐酸、Rho異阿伐酸、六氫異阿伐酸及四氫異阿伐酸中觀察到。就黃腐酚、酒花粕及六氫辅蛇麻酮分別係在1· 25、25及12· 5 時觀察到最大脂聯素分泌增加。觀察到的最大相對脂聯素表現，黃腐酚、Rho異阿伐酸及酒花粕可與曲格列酮相匹敵，而六氫異阿伐酸、六氫輔蛇麻嗣及四氩異阿伐酸則低於曲格列酮但高於對照組。 m 200816982 表20 以v軸截距4Jof stee圖斜率盒恩估算最大脂聯素分泌^^ _數最大脂聯素分泌所需#試驗物質濃度試驗物質最大脂聯素分泌⑴ [相對於對照組之倍數1 ·—----- — 」半數最大分泌時之言< 驗物質[// g/mL] 異阿伐酸 3· 17 0.49 黃腐酴 2. 47 0. 037 Rho異阿伐酸 2.38 0. 10 曲格列酮1 2 2.29 0. 085 酒花粕 2.21 2. 8 六氫異阿伐酸2 1.89 0. 092 六氫辅蛇麻酮2 1.83 3· 2 四氫異阿伐酸 1.60 0. 11 119 1 使用所試驗四種所有的濃度由Hofstee圖之直線回歸來估算 2 去除一種極端值使用三種濃度用於劑量—反應估算如表20中所見，衍生自Hofstee圖（圖20)之最大脂聯素分泌之估算支持上列所記載之觀察。γ截距估算最大脂聯素分泌粗略分成三組：（1)異阿伐酸、（2)黃腐盼、Rho異阿伐酸、曲格列酮及酒花粕及（3)六氫異阿伐酸、六氫輔蛇麻酮及四氫異阿伐酸。在胰島素阻抗3T3-L1細胞中，刺激半數最大脂聯素分泌所需之试驗物質之濃度大約0· 1 // g/mi，與曲格列酮、Rh〇異阿伐酸、四氫異阿伐酸及六氫異阿伐酸相似。在半數最大脂聯素分泌時異阿伐酸濃度〇· 49//g/ml近乎為5—倍多。黃腐酚在半數最大脂聯素分泌時具有之最低劑量預估在〇· 037从 200816982 g/ml。估算半數最大脂聯素分泌變數之最高濃度係在酒花粕及六氫輔蛇麻酮中見到，分別為2. 8及3.2 #g/ml。依照其在3T3-L1細胞中之促進脂聯素分泌之能力，在此研究中可見到的陽性的蛇麻草植物性化合物種類異阿伐酸、Rho異阿伐酸、四氫異阿伐酸、六氫異阿伐酸、黃腐紛、酒花粕及六氫輔蛇麻酮，可預期在血漿脂聯素濃度受到抑制之所有臨床病理上，具有正面效用。 _ 實例22 查屋烏素阻抗3T3-L1脂肪細胞中，經由促造脂聯素分泌;^ 趣_制介白素-6分泌，蛇麻草植物性化合物展現抗發炎活小峰輿垄這些實驗係使用如實例11所述之3T3-L1鼠科纖維母細胞模型。脂聯素及IL-6分析係分別如實例12及18中所述。標準化合物，蛇麻草化合物RIAA、IAA、THIAA、HHIAA、黃腐酚、六氫辅蛇麻酮、酒花粕係如實例12及20中所述。 •銘妒診算！摩舉-所有的分析係以雙重複進行。就統計分 % 析’蛇麻草衍生物對脂聯素或IL-6分泌之效用係以相對於溶劑對照所計算。劑量間的差異性係使用學生t-試驗來測定並無對多重比較進行校正；選擇名目五個百分比之型丨誤差機率。一在高濃度胰島素的存在下，曲格列酮及所有試驗的蛇麻草衍生物皆增加脂聯素分泌（表21)。曲格列酮在此模型中並無降低IL-6分泌。事實上，曲格列酮及HHCL在二種濃度時IL-6分泌增加，而THIAA及酒花粕在最高濃度時增加 IL-6，但在其他濃度時無效用。在最高試驗濃度時，RIM、 HIAA及XN增加IL-6分泌，僅IAA無增加IL-6分泌。RiAA、IAA、 120 200816982 THIAA及XN顯著降低IL-6分泌。表21 在胰島素阻抗3了3-11脂肪細胞中，蛇麻草化合物對脂聯素及介白素—β分泌、之效用試驗物質濃度 [Mg/ml] 脂聯素指數言 IL-6指數tt 脂聯素/IL-6 指數胰島素對照組 ±95°/〇CI — 1. 00±0. 30木 1· 00±0· 23 1·00±0·30 曲格列酮 5.00 L47# 1. 31# 1. 12 2.50 2.44# 1.06 2. 30# L25 1.87# 1. 46# L 28 0. 625 2· 07# 1. 00 2. 07# Rho異阿伐酸 5.0 2.42# 1.28# 1. 89# (RIAA) 2.5 2. 27# 0.83 2. 73# L25 2· 07# 0. 67# 3. 09# 0. 625 2. 09# 0. 49# 4. 27# 異阿伐酸 5· 0 2.97# 0.78 3.81# (IAA) 2. 5 2.49# 0. 63# 3. 95# 1.25 2.44# 0.60# 4. 07# 0.625 1.73# 0.46# 3. 76# 121 200816982 四氫異阿伐酸 5.0 1. 64# 1. 58# 1.04 (THIAA) 2. 5 1.42# 0. 89 1. 60# 1.25 L 55# 0. 94 1.65# 0.625 1.35# 0. 80 1. 69# 六氫異阿伐酸 5.0 L 94# 1.49# 1.30# (HHIAA) 2.5 1.53# 0.74# 2. 07# 1.25 1.64# 0. 67# 2.45# 0.625 1.69# 0. 73# 2.32# 黃腐紛 5. 0 2.41# 1. 23# 1. 96# (XN) 2. 5 2. 11# 0.96 2.20# 1.25 2.50# 0. 92 2.72# 0. 625 2.29# 0. 64# 3. 58# 六氫辅蛇麻酮 50. 0 1· 65# 2. 77# 0. 60# (HHCL) 25· 0 1.62# 1. 19 1.36# 12.5 L71# 0.94 1. 82# 6.25 1.05 1.00 1· 05 酒花粕 50. 0 1.92# 1. 58# 1.22# 25. 0 2. 17# 0.86 2. 52# 12· 5 1.84# 1.03 1.79# 6.25 1.46# 1.03 L42# 122 200816982 • 將兒余樹試驗物質或吲哚美辛與166 nM胰島素同樣加到！)5 Q rp Q I 1 ^ 1旨肪細胞中。在隔天，取樣上清培養基進行脂聯素、及抵抗素測定。所有的值係以僅有胰島素對照為指數。馬p素^數=[脂聯素]躲/[脂聯素]膜島素對照 t1^L—6 指數=[IL-6 試驗]/[IL-6 胰島素對照] *指數值為平均值±95%信賴區間，係由變異數分析之餘差平方來計算。就脂聯素或脂聯素AL-6，值<0.7或>1·3為 _ f著與胰島素對照組不同，就IL-6，值<〇·77或>1· 23為顯著與胰島素對照組不同。 #顯著與胰島素對照組p<0. 05不同。脂聯素/IL-6比例，整體抗發炎效用之度量，RIAA、IAA、 HHIA及XN為強烈陽性（>2 00)。THIAA、HHCL及酒花粕為陽性’儘管脂聯素/IL-6比例較低。對曲格列酮，脂聯素/IL-6 比例為混合性的，在2· 5及0.625 μ g/ml時具強烈性反應而在5· 0或1· 25 /z g/ml時無效用。 ⑩ 數據指出，在脂肪細胞中蛇麻草衍生物RIAA、IAA、 HHIA、XN、HHCL及酒花粕對高胰島素血症之前發炎效用可為遞減的。一般雨言，蛇麻草衍生物對未併發TNFa高胰島素 A症之高胰島素血症症狀之抗發炎效用比曲格列酮更具一致性。實例23 查氣INFa處理之3T3-L1腊肪細胞中，蛇麻草植物性化合物增加脂聯素分泌禮麥-這些實驗係使用如實例11所述之3 T 3 - L1鼠科纖維 123 200816982 母細胞模型。標準化合物及蛇麻草化合物IAA、RIAA、匪IAA 及ΤΗ IAA係为別如貫例13及2〇中所述。蛇麻草衍生物係於 0.625、1·25、2·5及Sj/zg/ml之濃度進行試驗。脂聯素係如實例12所述來分析。 …、、结采-將以10 ng TNFa/mi處理至隔夜之第5天（D5)的 3T3-L1脂肪細胞，明顯的抑制脂聯素分泌（圖21)。所有的蛇麻草衍生物IAA、RIAA、HHIAA及THIAA，相對於TNFa/溶劑 • 對照，皆增加脂聯素分泌。觀察線性劑量-反應曲線，以二及HHIAA在最高試驗濃度5〇jag/ml產生最大抑制

Mg/ml時引發最大脂聯素分泌，而THIMs5 〇收/ml時具有最大脂聯素分泌之曲線反應。在超生理濃度之TNF a存在下，蛇麻草衍生物iaa、 RIAA、HHIAA及THIAA增加月旨肪細月包脂聯素分泌之能力支持這些化合物於預防或治療涉及次優化脂肪細胞作用之發炎症狀之用途。馨實例24 在_3T3-L1脂肪細虹^與蛇麻蕈從生盤乘 ^ 脂聯素分遂戲這些實驗係使用如實例11及13所述之3T3-L1 鼠科纖維母細胞模型。麟/6合场及4理-標準化合物係如實例u及13中所記載。將3T3-L1脂肪細胞中在分化前如實例u處理以計算脂^生成指數或如實例12以τ.評估脂聯素指數。使用如實例14所述之尤茶截樣本#5669與前述之蛇麻草衍生物 124 200816982

Rho-異阿伐酸及異阿伐酸。龙茶翁及5:1和10:1的相思樹：RIAA及相思樹：IAA之組合物係以50、10、5.0及1.0 Ug/ml進行試驗。RIAA及IAA獨立地以5· 0、2· 5、1· 25及 0· 625 pg/ml進行試驗。妒覃-如前述估算相思樹/蛇麻草組合物之預期的脂質生成反應及脂聯素分泌並測定協乘作用。

、结果-所有試驗的組合物在一或多種試驗濃度時皆具有脂質生成協乘性（表22)。一般而言相思樹：RIAA組合物比相思樹：IAA組合物更具活性，在所有的劑量之相思樹：RIAA[5:1 ]中，及在1〇及5. Opg/ml之相思樹：尺^八]；：^·；!] 中驗證具協乘性，而在任何試驗濃度皆不具拮抗性。相思樹：IAA[ 10:1]組合物在二種中等劑量時亦具協乘性且並^ 顯現拮抗性。雖然相思樹：IAA[5:1]在50iUg/ml濃度時具協乘性，但在5· 0 pg/rnl劑量具拮抗性。、同樣的，所有的組合物在一或多種濃度時對增進脂聯分泌驗證具協乘性（表23)。相思樹：IAA[1(hl]在所有的1 量皆展現協乘性，而相思樹：RIAA[5:1]及相思樹：RlAA[1f 在三種劑量具協乘性，在一種濃度時具拮抗性。相思 ·1] 樹:ΙΑΑ[5··1]組合物在1〇 pg/mi時具協乘性而在高於i 〇吨/ml時具拮抗性。 ‘ 表22 遠屋Afcy充之3T3-L1模型中由尤引發之實際和預期的脂質~ 125 200816982 脂質生成指數1* 試驗物質濃度[ug/ml] 實際值預計值結果相思樹/RIAA [5:1]1 50 1.05 0. 98 協乘 10 0.96 0.89 協乘 5.0 0.93 0. 90 協乘 1.0 0. 92 0. 89 協乘相思樹/IAA [5:1]2 50 1.06 0.98 協乘 10 0. 93 0· 95 無影響 5· 0 0. 90 0. 98 枯抗 1·0 0. 96 0. 98 無效用相思樹/RIAA [10:1]3 50 0.99 1. 03 無效用 10 1.00 0. 90 協乘 5.0 1. 00 0. 90 協乘 1.0 0. 94 0.89 無效用相思樹/IAA [10:1]4 50 1. 37 1.29 協乘 10 1. 16 1· 15 無效用 5.0 1.08 L09 無效用 1.0 1. 00 0. 99 無效用 126 200816982 t脂質生成指數=[〇D]試驗/[OD]dms〇對照 1) 南於95%½賴界限為1 · 〇3具有最小顯著差異。 2) 南於95%¼賴界限為1 · 〇3具有最小顯著差異=〇。 3) 南於95%彳s賴界限為1.07具有最小顯著差異〇γ。 4) 高於95%信賴界限為1· 〇2具有最小顯著差異=〇〇2。表23 在_T_Z3J3-1模型中由龙#複益

實際和預期的脂質f音^^ 指數 t —-- 試驗物質濃度[Mg/ml] 實際值預計值結果相思樹/RIAA [5:1]1 50 1· 27 1. 08 協乘 10 0. 99 1· 25 拮抗 5.0 1. 02 0. 92 協乘 1.0 1· 19 _1· 07 協乘相思樹/1AA [5:1]1 50 1. 13 1· 16 無效用 10 0. 92 1· 13 括抗 5. 0 1· 04 1·09 無效用 1.0 1· 25 1. 13 協乘相思樹/RIAA [Uhl]2 50 1. 29 1· 11 協乘 127 200816982 10 L07 0.95 協乘 5. 0 0· 94 1· 06 拮抗 1.0 1· 03 0. 94 協乘相思樹/IAA [10:1]2 50 1.28. 0. 82 協乘 10 1· 12 1· 07 協乘 5· 〇 1· 11 0· 99 協乘 1.0 1· 30 1. 05 協乘 t脂聯素指數=[脂聯素][脂聯素]TNFa 1) 高於95%信賴界限為1. 07具有最小顯著差異=〇. 07。 2) 馬於95%彳§賴界限為1· 〇3具有最小顯著差異=〇. 〇3。名含翁及蛇麻％衍生物Rho異阿伐酸或異阿伐酸之組合物對增加脂肪細胞之脂質併入及增加脂肪細胞之脂聯素分泌顯現協乘組合及僅有些許拮抗組合。 • 實例25 在JI,多—I唐/3T3-L1月旨肪細胞模型中蛇廠草衍生物之抗發炎活性蔡垄^這些實驗係使用如實例11及13所述之3T3-L1 鼠科纖維母細胞模型。 #4'驗光合#及處理-標準化合物，係如實例11及中所記載，然而在D5使用100 ng/ml之細菌脂多糖（LPS，

Sigma，St· Louis，M0)取代TNFa。所用的蛇麻草衍生物 Rho-異阿伐酸及異阿伐酸係如實例2〇所述。非類固醇抗發 k樂（NSAID)阿斯匹靈，水揚酸及布洛芬（ibupr〇fen)係得 128 200816982 自Sigma。使用西樂保之市售的膠囊調配物（CelebrexTM，G. D. Searle & Co· Chicago，IL)並依照活性成份之含量給予細胞劑量。蛇麻草衍生物、布洛芬及西樂保係以5. 00、2. 50、 1 · 25及0· 625 tug/ml投樂。u引σ朵美辛、曲格列酮及π比格列酮係以10、5· 0、1· 0及〇· 50 jug/rnl進行試驗。阿斯匹靈

之濃度為100、50· 0、25· 0及12· 5 pg/ml，而水揚酸之濃度為200、100、50· 0及25.0收/1111。如前面實例18之1丄-6 及貫例13之脂聯素中所述，進行IL-6及脂聯素評估和分析數據並列成表。、々、〜调肥提供一 IL-6之12-倍刺激。所有的試驗_皆以不同程度降低了經哪_刺激^ ::胞…分泌。在所觀察到的最大抑制曰 =濃度係如表2"所述。因為處理變異相當大二大抑制之私度在些試驗物質中並1差显。麸 :發生時之劑量相當不同。對IL-6抑制之效力:行:二抑布洛芬〉RIAA二IAA>西樂保>σ比狄丨、，丁 I員序為阿斯匹靈〉水揚酸。以定性為基準，5 2錢辛〉曲格列_> 吼袼列_、布洛芬及西樂伴在^ π，斜、曲格列酉同、巧，而一Μ及二==_抑錢、6 頭著（數據並無顯現）。、辰又日寸抑制IL〜6並不相對於DMS0對照組，虎饰降低脂聯素分泌(表25)。與处之D5 3Τ3-L1脂肪細胞驗化合物抑制某程度之分泌），=^同（其中所有的試在任何試驗濃度皆無法 '、i、水揚酸及西樂保

Lps'處理之阳-u脂肪細胞 129 200816982 其脂聯素分泌。曲格列酮、RIAA、IAA及布洛芬在〇· 625 pg/ml時所觀察到之最大脂聯素刺激分別為15、17、20及 22%。效力順序其次為吼格列酮在1· 25 pg/ml時具有12% 之脂聯素刺激。吲哚美辛在2· 50 ug/ml時具有9%之脂聯素分泌刺激，為活性試驗物質中效力最小者。

在LPS/3T3-L1模型中，蛇麻草衍生物RIAA和IAA以及布洛芬降低IL-6分泌及增加脂聯素分泌之濃度與活體中所得到相類似。噻唑啶二酮之曲格列酮及吡格列酮為較低效力之IL-6抑制劑，比蛇麻草衍生物需要較高劑量，但對於脂聯素刺激，則與蛇麻草衍生物類似。在巨噬細胞模及脂肪細胞模型中觀察到NSAID吲哚美辛、阿斯匹翁果，洛分及西樂保之抗發炎活性間無一致關係。布表24 在LP-?/—213-L1脂I細胞中蛇麻箪赶▲物及試驗物質濃度Ug/ml] 6指數t _ 0.09* 1.00 +0 30 DMS0對照組 LPS對照組±95% CI 吲哚美辛 5.00 ---- 0. 47* 曲格列酮 10. 0 __0· 31 氺 σ比格列酮 5. 00 〇. 37* Rho-異阿伐酸 1.25 0. 63* 異阿伐酸 1.25 0. 61* ---- 130 200816982 阿斯匹靈 25.0 0.61* 39* 水揚酸 50. 0 0. 52* 48* 布洛分 0. 625 0.46* 54* 西樂保 2.50 0. 39* 61* 將試驗化合物以100 ng LPS/ml加到D5 3T3-L1脂肪細胞中。在隔天，取樣上清培養基測定IL-6。所有的值皆以下列所記載之LPS對照組為指標。所顯示的濃度代表提供最大 IL-6分泌抑制之劑量且此等值低於（L 70為顯著低於LPS對照組（p<0. 05)。 11L—6 指數二[I L_6 試驗—IL—6 對照]/ [ IL—6lps — IL-6 對照] *與LPS對照組顯著不同（p<0. 05)。表25 在LPS/3T3-L1脂肪細胞中蛇麻箪衍生物及選擇的NSAID之最大月旨禅f素分?必刺淺文

試驗物質濃度[Ug/ml] 脂聯素指數t 刺激% DMSO對照組 — 1. 24 LPS對照組±95% CI — 1.00 吲哚美辛 2· 50 1. 09* 9 曲格列酮 0.625 1. 15* 15 吼格列酮 1.25 L 12* 12 Rho-異阿伐酸 0.625 ι· m 17 異阿伐酸 0.625 1.20* 20 阿斯匹靈 113 1. 02 NS 131 200816982

西樂保 f脂聯素指數=[脂聯素]料/[脂聯素]】 *值大於1. 07為與LPS對照顯著不同p<〇. 〇5). 1 Lps對照 NS=與LPS對照組無顯著不同實例26

支里或蛇麻菜糾从 #堃—這些實驗係使用如實例11及13所述之3T3_L1 鼠科纖維母細胞模型。緣驗允合鈐及處逻—所用之標準化合物，係如實例π 及13中所記載。如實例13中所述以TNFa刺激3T3_L1脂肪細胞以評估脂聯素指數。這些實驗係使用如實例14所述之兒茶樹樣本#5669、如實例20所述之蛇麻草衍生物仙〇-異阿伐酸和黃腐酚以及由Metagenics公司（Gig Harbor，WA) 所才疋供之量黃素。兒茶樹及5:1的相思樹：畺黃素組合物以及相思樹：黃腐齡組合物係以50、1 〇、5· 0及1 · 〇 pg/jq 1進 4亍试驗。RIAA與叠黃素和XN之1:1組合物係以1 〇、5、1 · 0 及〇· 50 ,ug/ml進行試驗。多产專-如前述估算組合物之預計的脂聯素指數及測定協乘作用。綹耒-TNFa降低脂聯素分泌約為溶劑對照組之50%。陽性對照組吡格列酮增加脂聯素分泌約80%(表26)。相思樹與 132 200816982 薑黃素或XN之組合物證明在較高濃度時具拮抗性而在較低濃度時具協乘性。同樣地，RIAA及薑黃素有三個較高的劑量具協乘性，但在最低劑量1. 0 pg/ml時具高度協乘性。二種蛇麻草衍生物RIAA及XN在經TNFa -刺激之3T3-L1細胞中對脂聯素分泌不具協乘性。在經TNFa-刺激之3T3-L1脂肪細胞中，相思樹及RIAA 二者協乘性地增加脂聯素分泌，而僅相思樹與XN具協乘性。表26 在TNF α /3T3-模型中兒茶榇f及蛇麻草衍生物與薑黃素或黃腐酚組合之協乘作用脂聯素指數f 試驗物質濃度[Ug/ml] 實際預計說明 DMS0對照組 - 2. 07 — 一 TNFa± 95% CI — L0 土 0.049 — — 吼格列酮 1.0 1. 80 - - 相思樹/薑黃素 [5：!]1 50 0. 56 0. 94 枯抗 10 1. 01 1. 07 抬抗 5.0 1. 19 1· 02 協乘 L0 1· 22 1. 16 協乘一相思樹/XNDil]1 50 0. 54 0.85 抬抗 133 200816982 10 0. 95 L06 括抗 5.0 0. 97 1· 01 拮抗 L0 L26 1· 15 協乘 RIAA/薑黃素 [1:1]1 5 0.46 0.79 括抗 1 1. 03 1. 11 枯抗 5.0 1. 12 1.28 抬抗 1.0 1· 30 1· 08 協乘 RIAA/XNfl:!]1 50 0.31 0. 63 枯抗 10 0.81 1· 06 枯抗 5.0 1· 09 1· 25 枯抗 L0 1. 09 1· 06 無效用 t脂聯素指數二[脂聯素]試驗/[脂聯素]TNFa對照 1)95%信賴界限為0.961至1.049具有最小顯著差異=0.049。實例27 在胰島素阻抗之3T3-L1脂肪細胞模型中共軛亞麻油酸與蛇麻草衍生物Rho-異阿伐酸組合於活體外之脂質生成協乘作用禮麥-這些實驗係使用如實例11及13所述之3T3-L1 鼠科纖維母細胞模型。試着/6合赛及處逻-所甩之標準化合物，係如實例11 中所記載。在分化前如實例11中所述處理3T3-L1脂肪細胞以計算脂質生成指數。CLA粉末係得自Lipid Nutrition公 134 200816982 司（Channahon，IL)且為c9tll及tl〇cl2異構物之1:1混合物。CLA及5:1之CLA:RIAA組合物係以50、、5. 0及1. 〇 pg/ml進行試驗。RIAA係以10、1· 〇及〇·進行試驗供計算如前述之預期的脂質生成指數。、結采-RIAA與CLA組合協乘性地增加三酸甘油酯量。所有的劑量皆有協乘性（表27)。 CLA及RIAA間之協乘作用在廣泛的劑量範圍中皆有觀察到且潛在上能用於增加CLA之胰島素敏化效力。表27 在胰島素阻抗之3T3-ΤΊ肐肪細胞屋UPl'A贬農瘦麻草衍生物Rh〇-異阿伐酸玉遽羞產声Si-乘幾脂質生盛試驗物質濃度 [ug/ml] CLA:RIAA[5:1] 50 10 5· 1· — f際預計說明 • 26 1. 15 協乘 • 16 1.06 協乘 .16 1. 10 協乘 ----- ’ • 17 1.06 協乘 t脂質生成指數二[0D ]試驗/ [ 0D ] DMS0對照 1)高於95%信賴界限為丨.05具有最小顯著差異=〇. 05 ° 實例28 ^ 在經TNFa處理之3T3-L1脂肪細座立多座是疫物性化.金並抑剎 NF- ，η所述之3T3-L1鼠科纖無麥-14些實驗係使用如實例11所 135 200816982 維母細胞模型。細廣培#岌虞座-分化後將3T3—L1脂肪細胞保持在分化後培養基40天。標準化合物、培養基及蛇麻草化合物RIAA 及黃腐酚如實例13及20所述。蛇麻草衍生物及陽性對照組吡格列酮係以2· 5及5· 0 pg/ml之濃度進行試驗。試驗化合物係在1小時前加入而核萃取物係在以TNF α處理後三及24 小時所製備。 ⑩ 泓/沿-分化後，將3Τ3-L1脂肪細胞保持在生長培養基中 40 天。使用 Active Motif 公司（Carlsbad，CA)之 TransAM™ NF-kB套組測定核NF-kBp65，並無修改。套組中所提供之 Jurkat合萃取物係衍生自於添加50 ng/ml TPA(佛波醇 (phorbol)，12-莖蔬酸，13乙S旨）及0·5 μΜΙ弓離子載體 Α23187之培養基中在37°c培養二小時後立即收取之細胞。蛋Θ質分析一使用活化模體螢光蛋白定量套組（ActiVe

Motif Fluorescent Protein Quantification Kit)進行核蛋白定量。 •絲者分脊—使用單尾學生t-試驗進行比對。型i誤差之機率係定在名目五個百分比量。、4果一經TPA-處理之Jurkat核萃取物展現預期的冊―kBp65增加，顯示套組試劑之足夠表現（圖22)。以i〇n TNFa：/na分別處理三（圖22A)或24小時（圖22B)之D40 3T3—U脂肪細胞增加核NF-kBp65 2· 1-及2· 2-倍。如預期 1、’,，TNFa處理後，ppARr促進劑。比格列酮在三或％時亚無抑制核NF—kBp65之量。NF_k_之核轉位受到抑 136 200816982 制，在TNFa後三小時於5 〇及2 5|L(g RIM/ml分別為4 及25%。在24小時，僅5· 〇 RIAA/ml處理展現顯著的（ρ<〇· 〇5) NF-kBp65核轉位抑制作用。黄腐酚抑制NF—kBp65之核轉位’於5· 0及2· 5 tug/ml時在TNFa處理後三小時分別為15, 6 及6· 9% ’而在24小時後為13· 4及8· 〇%。在經TNFa處理之成熟的胰島素阻抗脂肪細胞中，riAa 及黃腐酚對NF-kBp65之核轉位，儘管小，驗證了一致性。此結果與ppARr促進劑中所述不同，其在3T3_U脂肪細跑中並無顯現NF-kBp65之核轉位。實例29 增加三酸甘油酯#入無f -這些實驗係使用如實例n所述之3T3_L1鼠科織維母細胞模型。所使用之所有化合物及程序係如實例n 述。緣驗允合#及處理-美弗明係得自sigma (st· Louis，肌）。在分化的第0天及整個成熟期（第6/7天）每二天將試驗化合物加到二甲基亞砜中。加入曲格列酮使最終濃度達到 4·4 pg/mi，作為陽性對照組。美弗明、兒茶樹樣本#5669 及1:1(重量/重量）之美弗明/相思樹組合物係以5〇 pg試驗物質/ml進行試驗。以〇·2%的油紅〇將分化的3T3_U細胞染色。將生成的染色油滴溶於異丙醇並以分光光度分析於 530 nm疋里。結果係以溶劑對照組中完全分化細胞之相對的三酸甘油酯含量來表示。 137 200816982 轉—制下關係絲算美㈣/兒茶解取物之預期的脂肪生成效用·· 1/u=x/LIx+Y/Uy，其中u_—脂、指數’ X及γ為試驗混合物中各組份之相對部分，mi。若估算的LI之平均落在轉的對織察部分之信賴區。間外，則推論具縣性。此協乘作狀定義，涉及與其各組份組合之效用比較，係由Berenbaum [Berenbaum，M C What is synergy? Pharmacol Rev 41(2)，93一 141，（1989)]所述。潜果-兒茶樹萃取物具高度脂質生成性，增加3T3—u 細胞之三酸甘油酯含量32百分比（圖23)產生丨.32之脂質生成才曰數。具有〇· 79之脂質升成指數，單獨的美弗明不具脂質生成性。美弗明/兒茶樹萃取物組合具有h 35之觀察的脂質生成指數。具有預期的98之脂質生成指數，美弗明/兒茶樹萃取物證實具協乘作用，如觀察到的脂質生成指數係落在預期值之二個百分比95%以上信賴界限之外。依照3T3-L1細胞中驗證的脂質生成潛力，1:1的美弗明及兒余樹萃取物之組合物在臨床用途上可預期具協乘性表現。此專組合可用於增加美弗明治療之正面利益範圍，例如增加血漿三酸甘油酯或延長美弗明效用時期。實例30 在數烏素里杭之胞模型中踏應盖|生_4勿及隻 & 脂質生成協 -這些實驗係使用如實例n及13所述之3T3-L1 鼠科纖維母細胞模型。緣驗/6合#及處逻-所用之標準化合物，係如實例11 138 200816982 中所記載。在分化前如實例11中所述處理3T3-L1脂肪細胞以計算脂質生成指數。曲格列_係得自Cayman Chemicals 公司（Chicago，IL)。吡格列酮為市售之錠劑調配物（ACTOSE' Takeda Pharmaceuticals, Lincolnshire，IL)。將錠劑磨碎並將全部粉末用於此分析。所有的結果係以活性成份含量為基準來計算。所用的蛇麻草衍生物Rho-異阿伐酸及異阿伐酸係如實例20所述。曲格列酮與RIAA和IAA之組合係以 • 4·0 Mg/ml進行試驗，而更強力的吡格列酮係以與riaa和 IAA之1:1組合物及2· 5 pg/ml來進行試驗。所有的物質亦獨立地以4. 0及2· 5 yg/ml進行試驗，如實例34所述，用於計算預期的脂質生成指數。潜耒一當曲格列酮或吡格列酮分別以4· 〇及2. 5 Mg/ml 進行試驗時，在胰島素阻抗之3T3-L1脂肪細胞模型中，Rho-異阿伐酸及異阿伐酸二者與嗟唾σ定二酮協乘性地增加三酸甘油酯合成（表28)。 φ 蛇麻草衍生物肋〇-異阿伐酸及異阿伐酸能協乘性地增加噻嗤啶二酮之胰島素敏化效用，產生降低劑量之潛在的臨床利益或增加反應良好病患之數目。表28 在_败島素阻抗之3T3-L1脂肪細胞模型中菩麻草衍生物及唉於活體外之協奭作1 脂質生成指數言試驗化合物濃度 Ug/ml] 實際預計說明 139 200816982 曲格列酮/RIAA[1:1]1 4. 0 1.23 1. 06 協乘曲格列酮/IAAU:；!]1 4.0 1· 1. 02 Vi/4 >(V 協乘^ 吡格列酮/RIAA[1:1]2 2.5 1· 19 1· 00 F//V /J、協乘口比格列酮/IAA[1:1 ]2 2· 5 1.16 0. 95 vJ/J v. 協乘 t月曰貝生成4日數-[0D]試驗/[〇d]ms〇對照 1) 南於95%彳§賴界限為ι· Q2具有最小顯著差異。 2) 咼於95%信賴界限為1· 〇5具有最小顯著差異=〇· 〇5。

實例31 查JNF a_/3T3-阿伐酸及美弗明上

适盤外之協乘作I 麵-這些實驗係使用如實例n所述之3T3_u氣 t母t胞模型。所用之標準化合物及以1〇 ng ,a/ml處理之脂肪細胞分別如實例n及13中記載。 n合糾續叙—美弗明係得自8聊版 Loins，M0)而Rho-異阿伐酸係如實 ^ 加^隨ml之美弗明以5〇、=斤^ 10 ng TNFa/ml 同樣加到 D5 3 _或 h 0 與 W斤詳述，在第6天將培養物上清4=胞:。如八貫例如前述估算美弗明地混合物=析。，㈣-在D5脂肪細胞中TNF ，„放用。增加。曲格列酮在丨/ /、，、-乜之IL-6分泌 29) 1 μ§ RIfjf ^ #f，J IL-6 24% 具有協乘作用， ml之組合在50 pg/ml濃度時在lMg/ml濃度時具強烈的協乘作用。在 140 200816982 混合物中，50pg美弗明/ml、1 pg RIAA提供額外的10%抑制作用；而Ipg美弗明、l,ug RIAA增加IL-6抑制作用35%。美弗明：RIAA組合物在二個中等劑量時，可見到分別為拮抗及無效用。美弗明及Rho-異阿伐酸之組合在高及低濃度時協乘性作用，降低了經TNFa處理之3T3-L1脂肪細胞比-6之分泌。表29 在TMFa/3T3-Ll脂肪細胞中蛇麻箪Rho-異阿伐酸及美弗明協乘抑制IL-6分泌試驗物質濃度 [μδ/πιΐ] IL-6指數f 抑制％說明 DMS0對照組 — 0. 16 一 — TNF α對照組+95% CI — 1.00 土 0.07* 0 — 曲格列酮 1. 0 0. 66 34 — RIAA 1.0 0.76 24 — 美弗明 50 0.78 22 — 美弗明/lug RIAA 50 0. 68 32 協乘美弗明 10 0.78 22 — 美弗明/liug RIAA 10 0. 86 14 枯抗美弗明 5,0 0.96 4 — 美弗明/ltug RIAA 5.0 0.91 9 無效果美弗明 1·0 0.91 9 — 美弗明Apg RIAA 1.0 0.56 44 協乘 141 200816982 试驗化合物係以所述的濃度與10 ng TNFa/ml同樣加到！)5 =3—L1脂肪細胞中。隔天，自上清培養基取樣進行IL-6測定。所有的值係以TNFa對照組為指數。 tIL-6 指數=[IL—6 試驗-IL-6 對照]/[IL-- IL-6 對照] *值低於〇·93為顯著地（Ρ<0·05)低於TNFa對照。實例32 驗化合物對痛細胞增生之效用此實驗係驗證本發明之許多試驗化合物在活體外對癌細胞增生之直接的抑制效用。才I本查明之試驗化合物對癌細胞增生之抑制效用係於RL 95-2内皮癌細胞模型（AKT激酶之過度表現因子）和於 HT-29(固疋表現c〇X-2)及SW480(固定表現活化的AKT激酶) 大腸癌細胞模型中檢驗。簡言之，將目標細胞置入96孔組織培養盤中並使其生長至聚滿前期。然後如實例4所述將細胞以各種量之試驗化合物處理72小時，並以CyQuant (Invitrogen，Carlsbad，CA)商業螢光分析測定相對的細胞增生。采-將 RL 95-2 細胞以 1〇 iug/mi 的 MgDHIAA (mgRh〇)、 ΙΑΑ、THIAA、ΤΗ-HHIAA(1 ·· 1 之 THIAA& HHIAA 混合物）、Xn(黃腐酚）、LY(LY 249002，一種 PI3K 抑制劑）、£tOH(乙醇）、阿伐（阿伐酸混合物）及貝他（貝他酸混合物）處理72小時。對細胞增生之相對抑制作用係如圖24所示，相對於DMS溶劑對照組’黃腐紛顯不大於50%抑制作用。圖25 & 26分別顯示各種濃度之RIAA或THIAA對HT-29及SW480癌細胞之 142 200816982 劑里反應結果。RIAA及THIAA對ΗΤ-29細胞之半數抑制濃度為31及1〇 μΜ，對SW480細胞株為38及3. 2 μΜ。實例33

2舌體内之降血释作q 輿麥-使用雄性、九星期大、平均4〇±5克之KK-Ay/Ta小鼠來評估試驗物質對降低禁食的血清葡萄糖或胰島素濃度之月b力。此小鼠品系為1940年代發展出作為糖尿病模型之κκ品糸與A /a之基因型品系間混血之結果。觀察到的表型為多基因大變之結果’其尚未完全定性出，但至少四種數量性狀基因座已辨識出。其中一項係與廋體素（leptin)受體中之錯義突變有關連。儘管突變，此受體仍有功能，雖然可能不具完全功效。KK品系發展出與胰島素不敏感有關之糖尿病及葡萄糖耐受不良而非明顯的高血糖症。導入Ay突變引發肥胖症及高血糖症。Ay突變為一種办//羞冱之170kb缺失，其係位於至 agouti位點之5’及將agouti之控制置於Raly啟動子之下。純合子動物在植入前死亡。轼驗##一使用如實例14所述之阿拉伯金合歡樣本 #5659及如實例20所述之蛇麻草衍生物Rho-異阿伐酸、異阿伐酸及黃腐紛。阿拉伯金合歡、RIAA及IAA係以1〇〇毫克/公斤/天給藥，同時XN係以20 mg/kg投藥。此外，調配阿拉伯金合歡與RIAA、IAA及XN之5:1及10:1的組合物並以100毫克/ 公斤/天投藥。轼驗過輕-試驗物質係溶於0· 2% Tween_80每天以管灌給 143 200816982 樂母組五隻動物。在開始前及在第三和最分鐘，收集眼窩後竇之血清。藉由變旋酶/葡九十以酵素測定無禁食之i清葡萄糖，並，化扭法連結免疫吸时析）败4之胰島素。4複1SA(酵素

雜麵-投藥後葡萄糖及胰島素值先相對於义農度正=化’作為各小鼠預治療百分比，以評估相組’磁物質是科低血清葡雜或胰島素。就及胰島素二變數，計算預治療百分比之臨界值（單尾，低於對照小鼠之95%信賴區間）。將各試驗物質之預治療百分比與對照組之臨界值相比較。這些試驗物質之預治療百分比低於對照組的臨界值者係視為顯著地與對照組不同（p<〇. 〇5)。，结耒—在三天的治療期間，在對照組小鼠中，無禁食的血清葡萄糖提升2· 6%，而血清胰島素降低6· 7%。相對於對照組對血清胰島素無效用，所有的羅格列酮、阿拉伯金合歡、 XN:相思樹[1:5]、XN:相思樹[1:10]、相思樹：RIAA[5:1]、黄腐酚、相思樹：IAA[5:1]、異構化阿伐酸及Rho-異阿伐酸皆降低無禁食血清葡萄糖。相思樹：RIAA[ 10:1 ]及相思樹：IA A [ 10:1 ]對血清葡萄糖或肤鳥素無政用（表3 0 )。在第2型糖尿病之KK-Ay小鼠模型中，阿拉伯金合歡樣本 #5659、黃腐酚、異構化阿伐酸和他〇-異阿伐酸以及其各種組合之快速降血糖效用支持其在治療與高金糖有關的人類疾病上之臨床功效潛力。表30 在KK-Av糖尿病小鼠^^伯金金廚ϋ生物 144 200816982

^=^ΛμΜ糖及胰島素之效用試驗物質投藥t 葡萄糖騰島专 [mg/kg-天] [預治療％] 1 ίδ、、人丄對照組（臨界值〉一 102·6(98·7) — 羅格列酮 1· 0 80. 3# 〇 r\ _ 阿拉伯金合歡樣本 100 89. 1# ^Γ：^- #5659 95· 3 XN:相思樹[丨·ρ；Ί ---— -i 100 91· 5# XN ··相思樹[1 . 1 〇 1 100 91. 7# 5 相思樹πΐΑΑ [5·1 ] 100 92. 6# 4 黄腐酚 ~~-—-- 20 93,8# 1 Απ Λ 相思樹：ΙΑΑ「5· 1 ] 100 98. 0# 異構化阿伐酸 —~~~~-— 100 98. 1# Rho-異阿伐酸 100 98. 3# 1 A /x 相思樹：RIAA「HM J 100 101· 6 相思樹：IAAflO: 1J 100 104· 3 t對每組五隻動物每天進行一次投藥，連續三天 #顯著低於對照組（ρ<〇. 〇5)。實例34 支楂暴病db/db小鼠模型中阿拉伯金合歡及蛇麻草活體内之協乘作用蔡垄/—使用雄性、C57BLKS/JmVm+LeprW(db/db)小鼠評估試驗物質降低禁食血清葡萄糖或胰島素濃度之潛力。此品系之小鼠係藉由缺乏痩體素功能之效力而對痩體素具抗性。血 145 200816982 漿胰島素之升高係於第1G至14天開始，血糖係於第4至8 星期開始升高。在試驗時間（第9週）動物為明顯的肥胖5〇± 5 g及展現島細胞肥大之實證。試發##—各連續三天分別給予陽性對照美弗明及羅格列酮300 mg/kg-天及1· 〇 mg/kg—天之劑量。如前述給予阿拉伯金合歡樣本#5659、蛇麻草衍生物及其組合物。緣驗遜衮-試驗物質係溶於0·2% Tween-8〇每天以管灌 ⑩ 給藥。在開始投藥前及在第三和最終投藥後九十分鐘，收集眼窩後竇之血清。藉由變旋酶/葡萄糖氧化酶法以酵素測^ 熟禁食之血清葡萄糖，並以小鼠特定ELISA測定血清之胰素。 … 綹耒-相對於對照組，陽性對照組美弗明及羅格列酮降低血清葡萄糖或胰島素濃度（表31)。僅及狀驗證為可接受結果之單一的試驗物質。RIAA降低血清胰島素，而χΝ 產生血清葡萄糖降低但對胰島素無效用。相思樹：riaa[5:1] 馨為最有效的卜低血清肤島素濃度之試驗藥劑，提供21%降低血清胰島素量加上雙胍美弗明之17%降低胰島素濃度及噻唑咬二酮羅格列酮之15%降低。此相思樹：RIAA[5:1]|合物之反應大於各別的組份之反應，因此具有協乘作用之潛力。阿拉伯金合歡單獨無法降低血清葡萄糖或胰島素，而RIAAw 同美弗明降低血清胰島素至類似程度。其餘的試驗物質中，相思树：IAA[ 10:1 ]組合物亦有效的降低血清胰島素濃度。在弟2型糖尿病之db/db小鼠模型中，受仙0—異阿伐酸影響之快速血清胰島素下降及黃腐酚影響之血清葡萄糖下 146 200816982 降支持其在治療與胰島素不敏感及高企糖有關的人類疾病上之臨床功效潛力。再者，Rh〇-異阿伐酸及兒茶樹之5:1解合物在db/db鼠科糖尿病模型中出現協乘作用。Rh〇—異阿伐酸、黃腐酚及相思樹：RIAA [5:1]調配物在二個獨立的糖尿病動物模型中及三個活體外模型中展現陽性反應，支持其於需要降低血清葡萄糖或促進胰島素敏感性之臨床狀況上之潛在用途。表31 查盤屋jj db/db小鼠土益伯金合歡及蛇廠 --j血或膝島素之效用試驗物質投藥f [毫克/公斤-天] 葡萄糖 [預治療％1 94. 3 (9ιλ π\ 對照組（臨界值） — 103.6 (98· 4) 相思樹:RIAA[5:1] 100 99· 6 —— 7 0 Q J1 美弗明 67· 6# -0# RQ Q4f Rho-異阿伐酸 __!〇〇 102.3 -—off 相思樹：IAA[10:1] 100 104.3 -—〇# 34 a # 羅格列酮 1.0 83. 0# ' s____ 84 7# XN:相思樹[1:10] 100 101.5 —-— qi i 叫阿拉伯金合歡樣本 #5659 100 100.4 91. 9 相思樹:RIAA [1〇：1] ' 100 101.6 ~^—- 93· 5 異構化阿伐酸 100 100.8 QK 〇 147 200816982 黄腐盼 20 97.8# 101.6 XN:相思樹[1:5] 100 104· 1 105.6 相思樹：IAA[5:1] 100 102.7 109· 1 t對每組五隻動物每天進行一次投藥，連續三天。 #顯著低於各別的對照組（p<0. 05)。實例35 在糖尿病db/db小鼠模型中阿拉伯金合歡及蛇廠箪衍

生物於活體中之最適化作用禮里使用雄性、C57BLKS/Jm+/m+Lepri/Z?(db/db)小鼠評估試驗物質降低禁食血清葡萄糖或胰島素濃度之潛力。此品系之小鼠係藉由缺乏瘦體素功能之效力而對瘦體素具抗性。血漿胰島素之評估係於第1〇至14天開始，血糖係於第 4至8星期。在試驗時間（第9週）動物為明顯的肥胖5〇珏& 及展現島細胞肥大之實證。叫领效身-谷逑躓五天分別給予陽性對照美弗明及列酮300毫克/公斤—天及〇毫克、σ 軒峰鉍ΡΤΑΛ Α ^ 毛見/ A斤―天之劑1。蛇麻草 /物RIAA與阿拉伯金合歡樣本#5659比例為ι:9 1:2、1:1、2:1及5:1係以1〇〇毫克/公斤投筚。· 給華H额㈣絲於q.2%tw咖，每天以管灌眼窩後竇之血清。藉由變旋酶錢十》鐘，收集 …不艮之血清葡萄糖，並开矛、州疋素。 j乳特疋ELISA測定血清之胰島，结果〜相對於對照組陽性對照城㈣及羅格列酮降 148 200816982 低金清葡萄糖及胰島素濃度（ρ<0· 05,結果無顯示)。個別地’相對於對照組，RIAA及相思樹於1⑽mg/kg時五天皆降低了企清葡萄糖，分別為7· 4及7· 6%(ρ<0· 05)。RIAA及相思樹之1:99、1:5或1:1之組合物出現拮抗性，而2:1及5:1 比率之RIAA:相思樹，相對於對照組，降低了血清葡萄糖或胰島素分別為11及22%。此反應大於單獨之RIAA或相思樹反應’並意味著二種組份間之協乘效用。可見到類似的降低 _ 血清胰島素濃度之效用（圖27)。另外於此模型中試驗Rho-異阿伐酸及相思樹之5:1組合物對抗美弗明及羅格列酮（二種目前用於治療糖尿病之醫藥劑）。結果（圖28)指出，5·· 1之Rho-異阿伐酸及相思樹組合物在降低血清葡萄糖（A圖）或金清胰島素（B圖）上產生與醫藥劑可相並立之結果。 2:1及5··1之Rho-異阿伐酸及相思樹組合物在db/db鼠科糖尿病模型中出現協乘作用，支持其於需要降低A清葡萄 _ 糖或促進胰島素敏感性之臨床狀況上之潛在用途。實例36 丨發類風濕關節炎ϋ科模型中蛇麻草試驗化合物之效用此實例係於類風濕關節炎模型中驗證二種蛇麻草化合物Mg Rho及ΤΗΙΑΑ於降低發炎及關節炎症狀之效力，而此發炎及症狀已知，部分係由許多蛋白質基酶所介導。輿赉-將雌性DBA/J小鼠（10/組)豢養於標準的亮光及黑暗的條件下並隨其任意飲食。於第〇天以皮下注射含100 149 200816982 pg第II型膠原蛋白及100 pg結核分枝桿菌之絞鯊烯溶液之混合物。在第21天重複推入注射。於第22-27天檢驗小鼠之關節炎現象，將無反應之小鼠從研究中剔除。於第28天開始將小鼠每天灌食試驗化合物達14天，並於第42天結束。如此實例中所用，試驗化合物RIAA(MgRho)為1〇 mg/kg(低）、50 mg/kg(中）或 250 mg/kg(Tij)，ΤΈΙΑΑ為 10 mg/kg(低）、50 mg/kg(中）或250 mg/kg(高）；西樂保為20 mg/kg ;及潑尼松龍（prednisolone)為10 mg/kg。使用如下述之關節炎指數評估各鼠掌之關節炎症狀（記分0 - 4) 〇在此關節炎指數下〇二無可見的現象·，1二水腫及/ 或紅斑··單一；2=水腫及/或紅斑：二處關節；3=水腫或紅斑：多於一處關郎，及4=整個鼠掌及指頭與關節僵直及崎形有關之嚴重關節炎。僉，鱗V免驗-在實驗終了時，將小鼠殺死，切下一肢並將其保存於緩衝的福馬林（formalin)中。以關節炎指數分析得到支持後，由個治療組中隨機選擇二隻動物以H&E染色進行組織學分析。以4種顯示嚴重傷害之評分於四點標度上檢視軟組織、關節及骨改變。細廣/激#分务—在實驗終了時，由小鼠中收集血清進行細胞激素分析。樣本體積低（〜〇·2- 0.3 ml/小鼠），將十隻小鼠之樣本隨機放在二個各五隻動物之儲庫中。進行此操作以便能重複分析；各分析最少進行二次。使用小鼠特定試劑 (R&D Systems，Minneapolis，MN)，根據製造商之指示進行 TNF-α及IL-6分析。二十六個儲庫中僅五個產生町偵測之 150 200816982 TNF_a量；以媒劑處理之對照動物組係在其中。潜耒-RIAA對關節炎指數之效用係如圖29以圖形表示。潑尼松龍在10 mg/kg(第30-42天），西樂保在2Ό mg/kg(第 32-2天）’ RIAA在 250 mg/kg(第 34-2天）及RIAA在 50 mg/kg (第38-2天）觀察到顯著下降（p<〇. 〇5,雙尾卜試驗），其驗證 RIAA在50或250 mg/kg時之抗關節炎功效。圖30顯示THIAA 對關節炎指數之效用。此處西樂保（第32—42天），ria^25〇

mg/kg(第 34-42天）及THIAA在 50 mg/kg(第 34-42 天）觀察到顯著下降’亦驗證THIAA作為抗關節炎藥劑之效用。關節組織傷害之組織檢驗結果係如圖31所示，在經 THIAA治療之個體中缺乏或顯示極少的關節破壞證據。在25〇 =/kg及50 mg/kg時有清楚的劑量反應現象及組織評分下 P牛，分別為40%及28%。將此與其中關節破壞評分為中等之經 =樂保治療之群組相比較。請注意在西樂保之情況下，組織予:分實際增加了 33%。個體動物間有明顯的不同，例如其中個經媒劑治療的動物顯現緩和關節破壞之證據而另一 :摘地a損傷。除了經潑尼松龍治療群組中的—隻動物在所有的治療群族中皆出現滑膜炎。 Μ ^之細胞激素分析結果係概括於目32中。雖然僅潑尼對^古ϋ統社的顯著性，但除了西樂保外，高劑量之— 子所有的治療皆降低了 IL-6量。

Li 矣群之效用灵驗係於患有代謝症候群之自願病患中檢驗RIAA:相 151 200816982 思樹（1:5)調配物治療對許多臨床上相關標記之效用。才法及緣驗設If-此試驗為在單一研究位置（功能性醫學研究中心（the Functional Medicine Research Center)， Gig Harbor，WA)進行之隨機、安慰劑對照、雙盲試驗。研究所需的受試者之包括標準（介於18至70歲）需滿足下列： (i) BMI 介於25至42.5 1^/1112;(1〇丁6/肋1^(：比率之3.5;〇^) 禁食胰島素U0 mcIU/mL。此外，受試者必須符合下列5項標準中的其中3項：（i)腰圍>35’’（女性）及>40”（男性）； (ii) TG2l50 mg/dL ; (iii)HDL<50 mg/dL(女性），及<40 mg/dL(男性）；（iv)血壓U30/85或醫學上診斷出高血壓；及 (V)禁食葡萄糖2100 mg/dL。滿足包括標準之受試者隨機分配至四組中的其中一組： (i)以每次1錠每天三次服用RIAA/相思樹組合物之受試者 (每錠含有100 mg RIAA及500 mg兒茶樹心材萃取物）；（ii) 以每次2錠每天三次服用RIAA/相思樹組合物之受試者； (iii) 安慰劑，每次1錠每天三次；及（iv)安慰劑，每次2 錠每天三次。整個試驗期間為12星期。在第1天、在第8 星期及12星期從受試者抽jk以評估對各種代謝症候群之參數之增補效用。潜采-試驗中所登記的受試者之起初的人口統計及生化特性（聯合安慰劑組及每天服用3錠之RIAA/相思樹）係如表 32所示。起初的禁食血液葡萄糖及進食後2小時（2h pp)葡萄糖值，RIAA/相思樹及安慰劑組間為相似的（分別為99· 〇 vs· 96· 5 mg/dl，及 128· 4 vs· 1〇9· 2 mg/dL)。此外，二種 152 200816982 «=值=係在實驗室^範園内（禁食血液葡萄糖為产:，而2h PP葡萄糖為70-150 mg/dL)。此結果 ^人叫2Η PP胰島素反應之變化優先於葡萄糖及 ^食胰島素之提升，其在鮮代謝症候群及真正的糖尿病中可發現。表32 ---&本生化特性_ 慰劑_RIAA/相思樹^3旋/天） 35 35 性別男性 ----- 11 (31%) 12 (34%) 女性 --- 24 ce 丨9%) 23 (66°/〇) ----z 、l 平均 SD 平均年齡（歲） ' -— 46.0 13.2 47. 9 重量（磅） ---— 220. 6 35.2 219.5 BMI(kg/m2) ----— 35.0 4. 0 35.4 收縮BP(mm) —---- 131.0 15. 1 129.7 舒張BP(匪） 83； 7 8· 5 82. 6 腰圍（吋） ---— 42.9 4·9 42.9 臀圍（吋） 47. 1 4.0 47.6 禁食胰島素（mcIU/mL) __R2 5.2 17.5 2h ρρ胰島素（mcIU/mL) 80. 2 52. 1 99·3* 禁食葡萄糖（mg/dL) 96. 5 9.0 99.0 2h ρρ葡萄糖（mg/dL) 109.2 30·5 128.4 SD 13· 31.6 4. 13. 9 7.8 4· 5 3.2 12. 1 59· 2* 10.3 36. 9 153 200816982 兔食 TG(mg/dL) 231.2 132. 255. —J——二▲·二 ^0. b 1 90 mrr除至分析外’因為不正常的2h卯胰島素值，BMI，基本代謝指數；Bp，血壓；TG，三酸甘高密度脂蛋白㈤，肌，氺

禁食血液胰島素測量值相類似且一般亦在參考範圍内，RIAA/相思樹組之起始值為17·5 mcIU/mL，安慰劑組為 13.2 mcIU/mLI(參考範圍 3-3〇 mcIU/mL)。2h 卯胰島素量 =高超過參考範圍（99.3 vs· 80·2 mcIU/mL)，並顯示比^ 食胰島素或葡萄糖測量值變化更大。雖然，起始值相似，: 在此試驗中8星期後riaA/相思樹在禁食胰島素及2h卯胰島素以及2h pp血液葡萄糖顯示下降更多（圖33及34)。體内平衡模式評估（H0MA)評分係一種公開的胰島素阻抗之測量。所有受試者H0MA評分之變化係如圖35所示。因為在代謝症候群受試者之胰島素及葡萄糖值中見到之多變性’所以亦對該等僅禁食胰島素>15 mcIU/mL之受試者亞群族進行評估。此亞群族之H0MA評分係如表33所示，並顯示與安慰劑組相比，在RIAA/相思樹組中觀察到顯著的下降。表33 查產食胰島素-15 mcIU/mL之受試者中Rig/相思街^ 免（3錠/天）對H0MA $分之效用 HOMAI^ F分治療 N 起初 8星期後安慰劑 9 4.39 4.67 RIAA/相思樹 13 5.84 4.04 154 200816982 群組間之差異在8星期時為顯著的（ρ〈0· 05)。Η0ΜΑ評分係由禁食胰島素及葡萄糖利用公開的方法[(胰島素 (mcIU/mL)*葡萄糖（mg/dL))/405]來計算。三酸甘油酯（TG)之升高亦為代謝症候群重要的建議指標。表34及圖36指出，與安慰劑相比，RIAA/相思樹補充在8 星期後使TG明顯的降低（ρ<〇· 05)。RIAA/相思樹組之 TG/HDL-C比率亦顯示實質下降（由6· 40降至5· 28)，而安慰劑組則無觀察到降低（由5. 81至5· 92)。表34 R_IAA/相思樹補充對TG量及TG/HDL-膽固醇比例之#用禁食 TG(mg/dL) TG/HDL 補充起始 8星期後改變起初 8星期後改變安慰劑 231. 2 229· 8 -1.4 5.81 5.92 +〇· 11 RIAA/相思樹 (每天3錠劑） 258. 6 209· 6 -49. 0 6.40 5.28 -1· 12 .在8星期期間以1〇〇 mg rh〇-異阿伐酸及goo呢兒茶樹心材萃取物組成之組合錠每天3錠補充之代謝症候群受試者，與安慰劑相比，產生較大的2 h pp胰島素下降。再者，禁食胰島素、禁食及2 h PP葡萄糖、禁食三酸甘油酯及ho·評分之較大的下降係在服用RIAA/相思樹補充劑（每天定）之受忒者及服用安慰劑之受試者中觀察到。這些結果指出相思樹補充可有效的維持代謝症候群之受試者其胰島素體内恆定。 155 200816982 實例38 癌細胞增生此實驗係驗證本發明之許多試驗化合物在活體外對癌細胞增生之直接抑制效用。才法-將大腸直腸癌細胞株HT—29、Caco_2及sw48〇以 3xl03細胞/孔植入96孔盤中，並培養至隔夜使細胞黏附在盤上。各濃度之試驗物質係複製8次。七十二小時後，使用 • cyQUANT®細胞增生分析套組對所有存活的細胞進行分析。計算相對DMS0溶劑對照組之存活細胞下降百分比。作圖之值為八個觀察值之平均±95%信賴區間。潜求-圖37 - 41係以圖示表示riaa(圖37)、IAA(圖 38)、THIAA(圖39)、HHIAA(圖40)及黃腐紛⑽；圖41)之抑制效用。實例39 西Ifr保及5式驗化合物在活體外對癌細胞增生之效用 ⑩ 此實驗係比較RIAA或THIAA與西樂保組合在活體外對癌細胞增生之實際及預期的抑制效用。才法-將大腸直腸癌細胞株以3x103細胞/孔植入96孔盤中，並培養至隔夜使細胞黏附在盤上。各濃度之試驗物質係複製8次。七十二小時後，使用CyQUANT®細胞增生分析套組對所有存活的細胞進行分析。計算相對DMS0溶劑對照組之存活細胞之實質下降百分比。作圖之值為八個觀察值之平均 ±95%信賴區間。使用關係式：l/[T]x=X/[T]x+Y/[T]y來估算預計的西樂保及RIAA或ΤΗ IAA組合物之細胞毒性效用，其 156 200816982 中τ=毒性代表生長受抑制及被殺死的細胞之部分，χ&γ為試驗混合物中各組份之相對部分，χ+γ=1。作圖之實際值為八個觀察值之平均±95%信賴關。當下降的估算百分比落在對應的實際雜之_謂區間町時，職為具協乘作用。圖42及43係以圖示表示RiAA(圖42^tTHIAA(圖43) 對癌細胞增生之實際及預計的抑制作用間之比較。這些結果顯示試驗的化合物與西樂保組合抑制癌細胞增生之程度大於大多數實例中數學上預計之程度。實例40 在口服投樂後铺漸清中ΤΗ I a a 此實驗之目的係測定THIAA在口服投藥後是否會代謝及是否可偵測。才法-在投樂前抽血後，服用五個軟膠囊（188mgTjjiAA/ soitgel)給予 940 mg 游離酸 THIAA(PR Tetra Standalone Softgel· 0G# 2210 KP-247· Lot C42331111)並立即給予一瓶水果優格。除了無咖啡因之咖啡外，在服用Tin AA後四小時内不再食用額外的食物。以45分鐘的間隔將樣本抽至無促凝固劑之Corvac血清分離管中。讓樣本於室溫下凝結45 分鐘並於4T以1800 xg離心10分鐘使血清分離。於0.3 ml 的血清中加入含有〇.5%HOAc之0· 9ml的MeCN並保持在一2〇 °C達45-90分鐘。將混合物於4°C以15000 X g離心10分鐘。離心後明顯的分成二層；於上層取樣〇· 6 ml進行Hplc 分析。使用添加樣本測定復原率，且復原率大於95%。、结求-結果係如圖44 - 46之圖示所示。圖44之圖式顯示 157 200816982 在服用940 mg的THIAA後一段時間，於血清中所偵測的 ΤΉΙΑΑ。圖45顯示服用後225分鐘，無清中偵測之ΤΉΙΑΑ量與活體外試驗之THIAA量之比較。圖46係描繪CYP2C9*1之THIAA 代謝。本發明已完全描述，熟習本項技術之一般技術者應了解，在不悖離所附的申請專利範圍之精神及範圍下，其可做許多改變及修改。【圖式簡單說明】圖1係以圖示描繪調節胰島素敏感性及阻抗之激酶網路的一部分。圖2係以圖示描繪MgRJAA(mgRho)對五種選擇激酶之抑制作用。圖3係以圖示描纟會五種蛇麻草成份及阿拉伯金合歡 /7//加/ea)粹取物對PI3K同質物之抑制作用。圖4係描繪在LPS刺激C0X-2表現（白色條帶）之前加入咬在LPS-刺激隔夜後加入試驗物質（灰色條帶），pgE2生物合成之RIAA[A圖]及IAA[B圖]劑量相關抑制作用。圖5係提供於RAW 264· 7細胞中分析西樂保 (celecoxib)[A 圖]及 MgRIAA[B 圖]對 LPS 引發 C01-2 介導 PGE2產生之直接酵素抑制作用之圖示。測量pge2並以pg/m 1 表示。錯誤長條係代表標準偏差（n=8)。圖6係提供西方墨點彳貞測C0X-2蛋白之表現。在指定的時間以LPS刺激RAW 264· 7細胞’之後將總細胞之萃取物以西方墨點為C0X-2及GAPDH表現[A圖]顯像。進行C0X—2及GAPDH條 158 200816982 帶之密度測量。圖[B圖]係代表COX-2與GAPDH之比率。圖7係提供西方墨點偵測iNOS蛋白之表現。在指定的時間以LPS刺激RAW 264· 7細胞，之後將總細胞之萃取物以西方墨點為iNOS及GAPDH表現[A圖]顯像。進行請〇8及 GAPDH條▼之禮度測置。圖[β圖]係代表c〇x—2與GAPDH之比率。圖8係提供利用96孔模式之TransAMNF-/cB套組之代表性概圖。與盤結合之养核苦酸含有NF-/cB相同的结合位置。原生抗體偵測NF-/c B之p50亞單位。圖9係以TransAM NF-/cB套組測量，提供NFib之代表結合活性。DNA結合百分比係以相對LPS對照組（1〇〇%)所計异。誤差長條係代表標準偏差（n = 2)。如實例部分所述，將RAW 264· 7細胞以試驗化合物及LPS處理4小時。圖10為評估相思樹樣本#4909萃取物對脂肪細胞發育及成熟之月曰貝生成效用之代表性試驗過程之圖示。使用1 鼠科纖維母細胞模型，研究試驗化合物對脂肪細胞脂肪新生之潛在效用。圖11為描繪相對溶劑對照組，經相思樹樣本#49〇9萃取物或陽性對照組1 u朵美辛（i nd〇me thac i η )及曲格列酮 (trogl i tazone)處理之3Τ3-L1脂肪細胞之非極性脂質量之圖示。誤差長條係代表95%信賴界線（單尾）。圖12為評估相思樹樣本#49〇9水溶性萃取物之可溶於二甲基亞砜餾分物對胰島素阻抗3T3—L1脂肪細胞分泌脂聯素 (adiponectin)之效用之代表性試驗過程之圖示。 159 200816982 圖13為一代表性長條圖，係描繪於24小時内，由三劑量之曲;f。列酮及四剤里之相思樹樣本纟仙⑽水溶性萃取物之可令於一曱基亞顯分物所引起的胰島素阻抗⑽—u脂肪細胞之最大脂聯素分泌。顯示的值為相對溶劑比；誤差長條係代表95%信賴區間。圖14為-代表性試驗方法之_，制於評估相思樹樣 '本#4909水溶性萃取物之可溶於二甲基亞颯顧分物對經試驗

物質及10、2或0.5 ng TNFa/ml處理過之3T3_L1脂肪細胞分泌脂聯素之效用。圖15描繪代表㈣長條圖，係代表由啊齡或相思樹樣本#4_萃取物引起經1Q ng/ml (A)、2 ng/mi⑻或〇 5 ng/ml (C) TNFa處理的成熟3T3_L1細胞分泌之脂聯素。顧示的值為相對溶劑對照組之百分比；誤差長條係代表95%作賴區間。*明顯地不同於TNFa單獨處理者（p<〇〇5)。圖16係以圖示說明在胰島素阻抗3T3_L1脂肪細胞中各種不同的市售兒茶樹（如caiec/?e及阿拉伯金合歡之組合物所引起之相對的三酸甘㈣增加量。顯㈣值為相對溶劑對照組之百分比；誤差長條係代表95%信賴區間。圖17係以圖示描緣由各種兒茶樹萃取物所引起之最大相對脂聯素分泌之代表。顯示的值為相對溶劑對照組之百分比；誤差長條係代表95%信賴區間。刀圖18係以圖示描繪經蛇麻草化合物或陽性對照組吲。朵美辛及曲格列酮處理之3T3-L1脂肪細胞其脂質含量（相對於溶劑對照）。使用3T3-L1鼠科纖維母細胞模型、，研究試驗化 160 200816982 合物對脂肪細胞脂肪新生之潛在效用。結果係以對照細胞之相對非極性脂質含量表示；誤差長條係代表95%信賴區間。圖19為一24小時内由試驗物質四種劑量引起胰島素睜抗3T3-L1脂肪細胞之最大脂聯素分泌之代表長條圖。顯系的值為相對溶劑對照組之百分比；誤差長條係代表95%信賴匾間。IAA=異阿伐酸，RUA=Rho異阿伐酸，HHIA=六氫異阿我酸及THIAAz四氫異阿伐酸。圖20係描述Rho異阿伐酸、異阿伐酸、四氫異阿伐酸、六氫異阿伐酸、更腐驗（xanthohumol)、酒花柏、六氫輔蛇麻酮（hexahydrocolupui〇ne)及陽性對照組曲格列g同之 Hofstee圖。由y-截距估算相對溶劑對照組之最大脂聯素分泌，同時由斜率之負數值計算出半數最大脂聯素分泌所需的試驗化合物濃度。圖21係顯示二個長條圖，代表由異阿伐酸和他0異阿伐酸[A圖]及六氫異阿伐酸和四氳異阿伐酸[b圖]引起經tnf α 處理的成熟3T3-L1細胞之相對脂聯素分泌。顯示的值為相對浴齊彳對如組之百分比，誤差長條係代表95%信賴區間。)κ明顯地不同於TNF α單獨處理者（〆().Q5)。圖22係描繪加入1〇 ng TNFa/ml三小時後[A圖]及24小時後[B圖]，騰島素阻抗3T3-L1脂肪細胞中之NF-kB核轉位。吡格列酮（Piog 1 i tazone)、RIAA及黃腐酚係以5· 〇 (黑色長條）及2· 5(帶狀長條）//g/ml加入。由細胞得來之Jurkat核萃取物係置於添加50 ng/ml TPA (佛波醇（phorbol)，12-肉豆蔻酯（myristate)，13乙酯）及〇·5 //M鈣離子載體（calcium 161 200816982 i〇nophore)A23187(CI)之培養基中於37°C培養二小時，之後立即收集。圖23係以圖示描述經溶劑、美弗明（metformin)、相思樹樣本#5659水性萃取物或1:1的美弗明/兒茶樹萃取物組合物處理之胰島素阻抗3T3-L1脂肪細胞之相對三酸甘油酯含量。結果係以溶劑對照組中完全分化細胞之相對的三酸甘油醋含量表示。 • 圖24係以圖示描述1〇 #g/ml之溶劑對照組（DMS0)、 RIAA、異阿伐酸（IAA)、四氫異阿伐酸（THIAA)、1:1之THIAA 及六氫異阿伐酸（HHIAA)混合物、黃腐酚（XN)、LY 249002 (LY)、乙醇（ETON)、阿伐酸（ALPHA)及貝他酸（BETA)對RL 95-2子宮内膜細胞株之細胞增生之效用。圖25係以圖示描繪各種濃度之THIAA或還原的異阿伐酸 (RIAA)對HT-29細胞株之細胞增生之效用。圖26係以圖示描繪各種濃度之THIAA或還原的異阿伐酸 _ (RIAA)對SW480細胞株之細胞增生之效用。圖27係以圖示描繪各種還原的異阿伐酸（RIAA)及相思樹之組合物於db/db小鼠模型中對降低血清葡萄糖[A圖]及血清胰島素[B圖]之劑量反應。圖28係以圖示描繪於db/db小鼠模型中，相較於醫藥扳糖尿病化合物羅格列酮（roziglitazone)及美弗明，由5:1 的RIAA:相思樹組合所產生之血清葡萄糖[A圖]及血清胰島素[B圖]之降低。圖2 9係以圖示描繪還原的異阿伐酸（RIA A)在類風濕關 162 200816982 節炎之鼠科模型中對關節炎指數之影響。圖30係以圖示描纟會THIAA在類風濕關節炎之鼠科模型中對關節炎指數之影響。圖31係以圖示概述RIAA及THIAA對膠原蛋白引發關節損傷之影響。圖32係以圖示概述在膠原蛋白引發關節炎的動物模型中RIAA及THIAA對IL-6量之影響。馨圖33係以圖示描繪RIAA/相思樹（1 ·· 5)補充（每天3錠)對禁食及進食後2小時（pp)胰島素量之影響。就2小時pp之胰島素量評估，係在受試者禁食10-12小時後，食用含75 g葡萄糖（Trutol 100，CASCO NERL® Diagnostics)溶液進行；給予葡萄糖2小時後，抽出血液並進行胰島素量分析 (Laboratories Northwest， Tac⑽a， WA)。圖34係以圖示描繪RIAA/相思樹（1: 5)補充（每天3錠）對禁食及進食後2小時葡萄糖量之影響。就2小時pp之葡萄糖量 _ 評估，係在受試者禁食10-12小時後，食用含75 g葡萄糖 (Trutol 100，CASCO NERL® Diagnostics)溶液進行；給予葡萄糖2小時後，抽出血液並進行葡萄糖量分析 (Laboratories Northwest， Tacoma， WA)。圖35係以圖示描繪RIAA/相思樹（1:5)補充（每天3錠)對 H0MA評分之影響。H0MA評分係由禁食之胰島素及葡萄糖以已公開之方法[(胰島素（mclU/mL)*葡萄糖（mg/dL))/405]所計算出。圖36係以圖示描繪RIAA/相思樹（1:5)補充（每天3錠） 163 200816982 對血清TG量之影響。圖37.顯或©樂保：薑黃素（Cureumin)( HT-29、（B)CaC〇-2或（C)SW4別大腸癌細胞之抑制百分比。圖38.IAA或西樂保：薑黃素（1:3rLY294〇〇2對刀(a) HT-29、⑻C_-2或（⑽彻大腸癌細胞之抑制百分比。圖39.THIM或西純：薑黃素（1:3)對（a)ht_29、⑻

Caco-2或（C)SW480大腸癌細胞之抑制百分比。圖40.HHIAA或西樂保·畺黃素（1:3)對（a)町—的、（B) Caco-2或（C) SW480大腸癌細胞之抑制百分比。圖41 · NX或西樂保:薑黃素（i ·· 3)對（A)HT—別、⑻—〇一2 或（C)SW480大腸癌細胞之抑制百分比。圖42·西樂保及RIAA之組合物對（a)ht-29、（B)Cac〇-2或 (C)SW480大腸癌細胞之實際及預期的抑制作用。圖43·西樂保及THIAA之組合物對（a)ht-29、（B)Caco-2 或（C ) S W4 8 0大腸癌細胞之實際及預期的抑制作用。圖44係以圖示顯示在攝取940 mg的thiaa後於某段時間偵測血清中之THIAA。圖45係顯示血清及對照組中可偵測到之態樣。圖46係描繪CYP2C9W對THIAA之代謝。【主要元件符號說明】益 164

Claims

200816982 十、申請專利範圍： 1· 一種於有需要之哺乳動物中治療對蛋白質激酶調節有反應=癌症之方法，該方法包括投予此哺乳動物一治療上有效量之查爾酮（chalcone)。 2·如申請專利範圍第w之方法，其中該查__為黃腐盼或異黄腐驗。 3·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該調節之蛋白質激酶 • 係由下列組成之群中選出：Abl(T315I)、ALK4、Aurora-A、 Bmx、BTK、CaMKI、CDK1/週期素 b、CDK2/週期素 a、CDK2/ 週期素E、CDK3/週期素E、CDK5/p35、CDK6/週期素D3、 CM9/週期素 T卜 CHO、CHK2、CK1 (y)、CK1 r 1、CK1 r 2、 CD r 3、CK1 5、cKit(D816H)、cSRC、DAPKl、DAPK2、DRAKl、 EphA8 、 EphBl 、 ErbB4 、 Fer 、 Fes 、 FGFR2 、 Fgr 、 Flt4 、 Fyn、GSK3y5、GSK3a、Hck、HIPK2、IKK/5、IRAKI、JAK3、 Lyn、MAPK1、ΜΑΡΚΑΡ-K2、MAPKAP-K3、MINK、MSKI、MSK2、 MSSK1、p70S6K、PAK3、PAK5、PAK6、PhKr 2、PI3K、Pim-1、 ® Pim-2、PKA、PKA(b)、PKB 0、PKB α、PKB r、PRAK、PrKX、 RsM、Rsk2、SGK、SGK2、Syk、ΤΒΠ、Tie2、TrkA、TrkB 及 TSSK2 。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該對蛋白質激酶調節有反應之癌症係由下列組成之群中選出：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、肺癌、白企病、黑色素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌及子宮癌。 5. —種於有需要之哺乳動物中治療對蛋白質激酶調節有反 165 200816982 應之癌症之組合物，該組合物包括一治療上有效量之查爾酮，其中該治療上有效量係調節與癌症相關之蛋白質激酶。 6.如申請專利範圍第5項之組合物，其中該查爾酮為黃腐酚或異黄腐酚。 7·如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物進一步係包括由下列組成之群中選出之醫藥上可接受賦形劑：包膜、等張及吸收延遲劑、黏合劑、黏著劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑、甜味劑、吸收劑、洗滌劑及乳化劑。 8·如申請專利範圍第5項之組合物，其中該組合物進一步係包含一或多種由下列組成之群中選出之成員：抗氧化物、維生素、礦物質、蛋白質、脂肪及碳水化合物。 9· 一種於有需要之哺乳動物中治療對蛋白質激酶調節有反應之癌症之方法，該方法包括投予此哺乳動一治療上有效量之四氫異阿伐酸。 10·如申請專利範圍第8項之方法，其中該四氫異阿伐酸係由四氫異蘀草酮（is〇humulone)、四氫異類蘀草酉同 (i socohumu 1 one )及四氫異近# 草酮（i soadhumu 1 one )組成之群中選出。 11.如申請專利範圍第8項之方法，其中該調節之蛋白質激酶係由下列組成之群中選出：Abl(T315I)、Aurora-A、 Bmx、BTK、CaMKI、CaMKI (5、CDK2/週期素 A、CDK3/週期素 E、CDK9/週期素 T1、CKl(y)、CK1 r 卜 CKlr2、CK1 r 3、CK1 δ、cSRC、MPK1、DAPK2、DRAK1、EphA2、EphA8、 166 200816982 Fer、Fes、FGFR2、FGFR3、Fgr、jNK3、PI3K、Pim—i、 Pim-2、PKA、PKA(b)、PKB /3、ΡΚΒ α、PKB 7、PRAK、PrKX、 Ron、Rskl、Rsk2、SGK2、Syk、Tie2、TrkA 及 TrkB。 12. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該對蛋白質激酶調節有反應之癌症係由下顺成之群中選出：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、肺癌、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、曱狀腺癌及子宮癌。 13. :種用於治療有需要之哺乳動物對蛋白f激酶調節有反應^症之組合物，該組合物包括—治療上有铺；其巾絲療上有效量係· 蛋白質激酶。另 14·如申請專利範圍第13項之方、本^ 由四氫異律草酮、四氫里轉=该四f異阿伐酸係成之群中選出。1、科早_及四虱異近蘀草酮組戈申凊專利範圍第13項人甘士 —人，由下列組成之群中選出:醫;步包祺、笨苹另戍收；,、^, 心酉市上了接又賦形劑： #張及及收l遲制、結著月月解劑、著色劑、調 =札月劑、乳化劑。甜未劑、吸收劑、洗滌劑及虫申清專利範圍第13項之组人板使士兮*人 , 、准生素、礦物質、蛋白質、脂肪魏水化合物 167