CN101505770A - 基于还原异α酸蛋白激酶调节的癌症治疗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于癌症治疗的蛋白激酶调节的化合物和方法。本发明公开的化合物和方法基于酒花中常见的还原异α酸。

Description

基于还原异α酸蛋白激酶调节的癌症治疗

相关申请的交叉引用

[001]本专利申请要求享有2006年6月20日提交的美国临时申请专利号60/815,064的优先权。

发明背景

发明领域

[002]本发明主要涉及对蛋白激酶调节敏感的癌症进行治疗或抑制所需要的方法和混合物。具体地讲，本发明涉及多种方法和混合物，它们通常利用从酒花或植物类家族成员金合欢属或它的混合物中分离出的化合物或衍生物。

发明内容

[003]信号转导提供一个重要的保持正常稳态的总体调控机制，或者若受到扰动，便作为一种与众多疾病病理和病况相关的诱发或协助机制。在细胞级上，信号转导是指信号或信号基从细胞外部运动到细胞内部。到达受体目标的信号可激活许多细胞活动需要的配体-受体相互作用，其中一些细胞活动还可作为后续信号。这种相互作用不仅作为一系列级联，而且作为一种复杂的相互作用网络或信号事件网络，该网络能对稳态过程提供精调控制。但是，此网络一旦失去控制，会引发细胞活动的改变，并引起反应细胞内基因表达程序的改变。参见图1，它显示了对胰岛素敏感性和抵抗进行调节的相互作用激酶网络的简化图。

[004]信号转导受体一般分为三类。第一类受体是渗入质膜并具有某些内在酶活性的受体。这类受体的典型代表包括酪氨酸激酶(例如PDGF、胰岛素、EGF和FGF受体)、酪氨酸磷酸酶(例如T细胞和巨噬细胞的CD45[集束行列式-45]蛋白质)、鸟苷酸环化酶(例如钠尿肽受体)和丝氨酸/苏氨酸激酶(例如活化素和TGF-β受体)。具有内在酪氨酸激酶活性的受体自身可发生磷酸化作用，还可磷酸化其它底物。

[005]第二类受体是在细胞内与GTP结合蛋白以及水解蛋白耦联的受体(称为G蛋白)。与G蛋白发生相互作用的这一类受体的结构特征为具有7个跨膜域。这些受体称为蛇型受体。例如肾上腺素能受体、气味受体和某些激素受体(例如胰高血糖素、血管紧张素、加压素和缓激肽)等。

[006]第三类受体可描述为存在于细胞内并经配体结合迁移到细胞核内的受体，其中配体受体复合物直接影响基因转录。

[007]为受体酪氨酸激酶(RTK)编码的蛋白质包括四个主要域，分别为：a)跨膜域；b)细胞外配体结合域；c)细胞内调节域；和d)细胞内酪氨酸激酶域。RTK的氨基酸序列与cAMP依赖性蛋白激酶的氨基酸序列(在ATP和底物结合域内)是高度保守的。RTK蛋白质根据其胞外部位的结构特征分为半胱氨酸富含域、免疫球蛋白样结构域、钙黏蛋白结构域、亮氨酸富含域、Kringle结构域、酸性域、纤连蛋白III型重复单元、盘状I样结构域以及EGF样域。基于这些不同胞外域，RTK已细分为至少14个不同类别。

[008]具有内在酪氨酸激酶活性的许多受体通过磷酸化作用与其它的信号级联中的蛋白质发生相互作用。这些其它的蛋白质包括氨基酸序列域，它与首次在c-Src原癌基因中发现的域同源。这些域称为SH2域。

[009]SH2域中的蛋白质与RTK或受体相关酪氨酸激酶相互作用会使该蛋白质酪氨酸磷酸化。由此引起的磷酸化会(积极地或消极地)改变活性。SH2中具有内在酶活性的若干蛋白质包括磷脂酶C-γ(PLC-γ)、原癌基因c-Ras相关的GTP酶激活蛋白(rasGAP)、磷脂酰环己六醇-3-激酶(PI-3K)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1C(PTP1C)以及其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)Src家族成员。

[0010]非受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)基本上与自身不具有酶活性的细胞受体耦连。通过蛋白质相互作用进行信号传导的受体实例包含胰岛素受体(IR)。此受体具有内在酪氨酸激酶活性，但遵照自身磷酸化作用它并不直接与SH2域(例如PI-3K或PLC-γ)中的促酶活性的蛋白质发生相互作用。相反，主要的IR底物是名为IRS-1的蛋白质。

[0011]TGF-β超家族的受体属于原型受体丝氨酸/苏氨酸激酶(RSTK)。TGF-β超家族的多功能蛋白质包含活化素、抑制素和骨形态发生蛋白质(BMP)。这些蛋白质可诱导和/或抑制细胞增值或变异，并控制各种类型的细胞迁移和黏附。TGF-β的一个主要作用是通过细胞周期调控进展。此外，参与对TGF-β反应的细胞核蛋白是c-Myc，它直接影响含有Myc-结合元素的基因表达。PKA、PKC和MAP激酶代表非受体丝氨酸/苏氨酸激酶的三大类别。

[0012]目前许多实验室正在研究激酶活性和疾病状态之间的关系。这种关系可能是由于疾病本身引起，或者与疾病相关的症候学表达和进展密切相关。类风湿关节炎(一种自身免疫性疾病)就是其中一个实例(目前正在研究的激酶和疾病之间的关系)。

[0013]自身免疫性疾病起因于免疫系统的功能障碍，即自身机体产生攻击自身器官、组织和细胞的自身抗体—一个通过蛋白质磷酸化介导的过程。

[0014]目前已确定80多种临床上不同的自身免疫性疾病，美国大约2400万人正饱受此疾病的折磨。自身免疫性疾病可影响身体的任何组织或器官。因为这种变异，它们可根据自身免疫性攻击点引发一系列病症并导致器官损伤。尽管许多自身免疫性疾病存在治疗方案，但针对任何这类疾病并没有彻底治愈的方法。用来缓解病情的治疗方法常常具有很多负作用。

[0015]类风湿关节炎(RA)是最常见且研究最多的自身免疫病，它使全球1％的人群饱受困扰，而且原因不明，和其它自身免疫性疾病一样，正与日俱增。RA的特点是慢性滑膜炎症，造成关节逐步骨化以及关节软骨破坏。细胞因子、趋化因子和前列腺素是炎症的关键性介质，它们富含在患者疾病活期的关节和血液中。例如，RA患者的滑液中富含PGE2。在发炎点位上环氧合酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)诱导作用会介导PGE2含量的增加。[参见，例如van derKraan PM和van den Berg WB，骨关节炎中的同化和破坏性介体。Curr Opin ClinNutr Metab Care，3：205-211，2000；Choy EHS和Panayi GS，类风湿性关节中的细胞因子通路和关节炎症，N Eng J Med.344：907-916，2001；Wong BR等人，将Syk作为过敏性和自身免疫性疾病的一种治疗方法，Expert Opin Investig Drugs 13：743-762，2004。

[0016]虽然对人类RA的病因和发病机理仍知之甚少，但其发展过程可分为三个阶段。在启始阶段，树突状细胞对自身反应性T细胞表现出自体抗原性。T细胞通过细胞因子激活自身反应性B细胞，产生自身抗体，反过来又在关节中形成免疫复合物。效应阶段，免疫复合物结合巨噬细胞和肥大细胞上的Fcf受体，从而释放细胞因子、趋化因子、炎症和疼痛。最后阶段，细胞因子和趋化因子激活并募集滑膜细胞、破骨细胞和中性粒细胞，它们可释放蛋白酶、氨基酸和诸如O2-的ROS，从而对软骨和骨造成不可逆转的破坏。

[0017]在胶原诱导的RA动物模型中，需要T细胞和B细胞的参与来诱发该疾病。通过脾酪氨酸激酶(Syk)和磷脂肌醇3激酶(PI3K)，抗原受体触发后，B细胞激活信号[Ward SG，Finan P.将异构体特异性磷脂肌醇3激酶抑制剂作为治疗剂；Curr Opin Pharmacol.8月；3(4)：426-34，(2003)]。参与B细胞上的抗原受体后，Syk对三种酪氨酸进行磷酸化作用。Syk是一种72-kDa蛋白质酪氨酸激酶，它在将免疫识别受体耦连到若干下游信号传导通路中发挥重要作用。此作用的特性就是催化活性以及与含有SH2域的效应蛋白发生相互作用的能力。Tyr-317、Tyr-342和Tyr-346的磷酸化作用为含蛋白质的若干SH2域产生停泊位点。[Hutchcroft，J.E.、Harrison，M.L.与Geahlen，R.L.(1992)：72-kDa蛋白质酪氨酸激酶Ptk72与B细胞抗原受体结合。  J.Biol.Chem.267：8613-8619，(1992)以及Yamada，T.、Taniguchi，T.、Yang，C.、Yasue，S.、Saito，H.和Yamamura，H.与带有蛋白质酪氨酸激酶P72(Syk)的B细胞抗原细胞抗原受体结合并通过膜IgM激活，Eur.J.Biochem.213：455-459，(1993)]。

[0018]已证明Syk用来激活响应大量信号的PI3K，其中B细胞抗原受体(BCR)和巨噬细胞或中性粒细胞Fc受体参与此激活。[参见Crowley，M.T.等人J.Exp.Med.186：1027-1039，(1997)；Raeder，E.M.等人，J.Immunol.163，6785-6793，(1999)：和Jiang，K.等人，Blood 101，236-244，(2003)]。在B细胞中，可以通过接头蛋白(例如BCAP、CD19或Gab1)的磷化作用激活BCR刺激的PI3K，该激活产生用于PI3K调节亚基P85的结合位点。由许多IgG受体传递的信号需要Syk和PI3K的参与活动，并需要募集它们的集群受体点。在中性粒细胞和单核细胞中，有人建议将PI3K与FcgRIIA上磷酸化的免疫受体酪氨酸活化基序序列直接结合，作为受体的PI3K募集机理。而最近一篇文章报道了Syk和PI3K之间的分子直接相互作用[Moon KD，等人，Syk蛋白质酪氨酸激酶和磷脂肌醇3激酶间直接相互作用的分子基础J.Biol.Chem.280，No.2，Issue ofJanuary 14，pp.1543-1551，(2005)]。

[0019]大量研究表明COX-2活性抑制剂可减少PGE2的生成，并能有效缓解慢性关节炎(例如RA)患者的疼痛。既然COX-1和COX-2参与组织(胃肠和心血管系统)的重要修复工作，COX抑制酶活性制剂的副作用就更令人担忧。所以，必须设计一个安全的、长期的治疗方法以缓解患者的疼痛。既然通过Syk、PI3K、p38、ERK1/2和NF-kB依赖性通路，COX-2和iNOS合成信号诱导剂，那么这些通路抑制剂会对自身免疫疾病尤其对RA患者关节发炎和变形病症产生疗效。

[0020]在RAW 264.7老鼠巨噬细胞炎症模型内抑制PGE2生成的筛选过程中，发现酒花衍生物ρ异α酸(RIAA)。在本发明中，我们对RIAA能否直接抑制COX酶活性和/或它能否抑制COX-2和iNOS的诱导作用进行研究。我们发现RIAA并不直接抑制COX酶活性，而是抑制NF-kB驱动的酶诱导，这引导我们对RIAA是否是一种激酶抑制剂进行研究。我们发现RIAA同时抑制Syk和PI3K，这使我们可测定针对各种自身免疫性疾病患者进行的试点研究的疗效。

[0021]目前正在研究的与疾病症状相关的其它激酶包括Aurora、FGFB、MSK、RSE和SYK。

[0022]Aurora—细胞分裂的重要调节剂，丝氨酸/苏氨酸激酶的Aurora家族包括Aurora A、B和C。经证实Aurora A和B激酶在有丝分裂中发挥着直接而不同的作用。这三种亚型的过度表达已与各种类型的人类肿瘤疾病相关，包括白血病、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、胰脏癌、黑素瘤以及子宫颈癌。

[0023]成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是一种酪氨酸激酶受体。通过FGF的受体二聚化、激酶活化、亲和力增强，此受体的突变可引发组成性激活。FGFR与软骨发育不全、血管生成以及先天性疾病有关。

[0024]MSK(丝裂原活化和应激活化蛋白激酶)1和MSK 2是在活体内激活ERK(胞外信号调节激酶)1/2或p38 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)通路的下游激酶，并用于CREB(cAMP反应元件结合蛋白)和组蛋白H3的磷酸化。

[0025]Rse主要在大脑中高度表达。Rse，也被称为Brt、BYK、Dtk、Etk3、Sky、Tif或sea有关的受体酪氨酸激酶，它是一种主要保护神经元免于凋亡的受体酪氨酸激酶。Rse、Axl和Mer是新确认的细胞黏附分子相关的受体酪氨酸激酶家族成员。GAS6是酪氨酸激酶受体Rse、Axl和Meris的配体。GAS6的作用是作为由残存EC生成的生理抗炎剂，并当促炎剂刺激源开启EC的亲胶粘剂时耗尽。

[0026]糖原合成酶激酶3(GSK-3)，目前存在两种亚型，经确认它是一种参与控制糖代谢并可调控细胞增值和细胞凋亡的酶。与许多丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶不同，GSK-3结构上是活性的并受胰岛素或生长因子的抑制。GSK-3在肌糖原合成的胰岛素刺激中的作用使其成为糖尿病和代谢综合症干预治疗的极具吸引力的研究靶点。

[0027]GSK-3失调已成为胰岛素抵抗发展中的一大热点。可通过提高葡萄糖代谢清除率，并通过抑制糖异生基因(例如肝细胞中的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶)，抑制GSK3激酶从而提高胰岛素抵抗。而且，选择性GSK3抑制剂加强肌肉中体内和体外葡萄糖中胰岛素依赖性活化的转运和利用。GSK3还使胰岛素受体底物1的丝氨酸/苏氨酸残渣直接发生磷化作用，该作用导致胰岛素A信号受损。GSK3在胰岛素信号通路中发挥重要作用，而缺乏胰岛素时会磷化并抑制糖原合酶。[Parker，P.J.、Caudwell，F.B.、和Cohen，P.(1983)Eur.J.Biochem.130：227-234]。越来越多的证据证实GSK-3在调节骨骼肌葡萄糖转运活动中存在副作用。例如，使用选择性GSK-3抑制剂，针对抗胰岛素的啮齿类动物进行的急性治疗，可提高全身胰岛素敏感度，并可增强作用在肌肉葡萄糖转运上的胰岛素效应。使用特定GSK-3抑制剂，针对抗胰岛素、前期糖尿病肥胖的Zucker大鼠进行的慢性治疗，可提高口服耐药量和全身胰岛素敏感度，改善血脂异常并增强骨骼肌中IRS-1依赖性胰岛素信号传导。这些结果有力地证明在肌肉中选择性使用GSK-3可对肥胖相关的胰岛素抵抗进行有效干预治疗。

[0028]Syk为一种非受体酪氨酸激酶，它和参与来自B细胞受体以及IgE受体信号传导的ZAP-70有关。Syk在这些受体内与ITAM基序结合，并通过Ras、PI 3激酶和PLCg信号传导通路启动信号传导。Syk在胞内信号传导中发挥重要作用，因而它是炎症性疾病和呼吸障碍研究的重要靶点。

[0029]因此，这将有益于确认对单个或多个选择性激酶的表达或活性进行调节的方法和混合物。众所周知，各种蛋白激酶和激酶通路的关系以及相互作用非常复杂，这更迫切要求开发有益于多激酶或多激酶通路并能作为蛋白激酶调制剂、调节剂或抑制剂的药剂。专门针对一种激酶或一种激酶通路的单一试剂方法不能治疗非常复杂的疾病、病况和障碍，例如糖尿病和代谢综合症等。多激酶的活性调节可产生单一激酶调节所不能达到的附加协同疗效。

[0030]这种调节和使用对于慢性疾病而言要持续性使用，或在诸如炎症中间歇性使用，或作为自身调节或作为许多疾病和病况的必须组分使用。此外，作为蛋白激酶调节剂的混合物可影响哺乳动物机体的各类疾病。本发明描述了从酒花或金合欢属中提取的混合物和提取物，用以调节激酶活性，从而提供一种方法以治疗大量相关症状的疾病，提高人们的生活质量。

发明概述

[0031]本发明主要涉及对蛋白激酶调节敏感的癌症进行治疗或抑制所需要的方法和混合物。具体地说，本发明涉及的方法和组分通常是从酒花或植物属成员金合欢属或其混合物中分离出的化合物或衍生物。

[0032]本发明的第一个实施例描述了哺乳动物对所需蛋白激酶调节敏感的癌症治疗方法。本方法包括使用有效治疗剂量的还原异α酸对哺乳动物用药。

[0033]本发明的第二个实施例描述了哺乳动物对所需蛋白激酶调节敏感的癌症治疗混合物，该混合物包括有效治疗剂量的还原异α酸，这里有效治疗剂量调节与癌症相关的蛋白激酶。

附图简述

[0034]图1描绘了调节胰岛素敏感度和胰岛素抵抗的部分激酶网络。

[0035]图2描绘了MgRIAA(mgRho)对五种选择性激酶的抑制作用。

[0036]图3描绘了五种酒花组分和一种金合欢属尼罗提取物对PI3K亚型的抑制作用。

[0037]图4描绘了RIAA(图表A)  和IAA  (图表B)剂量相关的生物合成PGE₂的抑制作用，其中白色柱表示在加入COX-2表达的LPS刺激，灰色柱表示加入测试材料之前隔夜的LPS刺激。

[0038]图5描绘了塞来昔布(图A)和MgRIAA  (图B)对RAW 264.7细胞中分析得到的LPS诱导的COX-2介导的PGE₂生成的直接酶抑制作用。PGE₂的测量单位用pg/ml表示。误差带表示标准偏差(n＝8)。

[0039]图6描绘了使用免疫印迹法测定COX-2蛋白表达。为标明倍数关系，利用LPS刺激RAW 264.7细胞之后，对COX-2和GAPDH表达(图A)采用免疫印迹法形象化描述全部的细胞提取物。采用光密度分析法对COX-2和GAPDH带进行计算。图表(图B)表示COX-2与GAPDH的比值关系。

[0040]图7描绘了iNOS蛋白表达的免疫印迹法测定。为标明倍数关系，利用LPS激活RAW 264.7细胞之后，对iNOS和GAPDH表达(图A)采用免疫印迹法形象化描述全部的细胞提取物。采用光密度分析法对COX-2和GAPDH带进行计算。图表(图B)表示iNOS与GAPDH的比值关系。

[0041]图8给出了利用96-孔模式的TransAM NF-κB试剂盒的代表性示意图。与细胞板结合的寡核苷酸包括NF-κB的共有结合点位。第一抗体测定NF-κB的p50亚基。

[0042]图9给出了通过TransAM NF-κB试剂盒测定NF-κB结合活性的代表性示意图。相对于LPS对照(100％)计算DNA结合的百分比。误差带表示标准偏差(n＝2)。本实施例章节中描述了加入测试化合物和LPS四小时后来处理RAW 264.7细胞。

[0043]图10给出了评估金合欢属样品#4909提取物对生长中和成熟脂肪细胞的脂肪性效应的测定流程。使用3T3-L1小鼠成纤维细胞模型来研究测试化合物对脂肪细胞脂肪生成的潜在影响。

[0044]图11示意性描绘了相对于溶剂对照，利用金合欢属样品#4909提取物或作为阳性对照的吲哚美辛和曲格列酮处理3T3-L1脂肪细胞的非极性脂肪含量。误差带表示95％的置信区间(单尾)。

[0045]图12示意性给出了金合欢属样品#4909水提取物的二甲基亚砜可溶部分对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞的脂联素分泌物评估效应的测试流程。

[0046]图13给出了脂联素分泌最大值的条形图，通过三个剂量的曲格列酮和四个剂量的金合欢属样品#4909水提取物的二甲基亚砜可溶部分在24小时内诱发抗胰岛素3T3-L1细胞而得到脂联素分泌。图中的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95％的置信区间。

[0047]图14是一个代表性的测试方案，该方案评估了金合欢属样品#4909水提取物二甲基亚砜可溶部分对脂联素分泌的影响，该脂联素分泌利用浓度为10、2或0.5ng/ml的TNFα外加测试材料诱发3T3-L1脂肪细胞而获得。

[0048]图15是代表性条形图，描述了利用吲哚美辛或金合欢属样品#4909提取物诱发TNFα处理过的成熟性3T3-L1细胞的脂联素分泌。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95％的置信区间。*与仅用TNFα处理的结果有着显著性差异(p<0.05)。

[0049]图16用图表阐明了通过使用不同商业来源的金合欢属儿茶和尼罗各种混合物，抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞中甘油三酯含量的相对增加。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95％的置信区间。

[0050]图17用图表描述了通过各种金合欢属儿茶提取物诱发的脂联素分泌相对最大值。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95％的置信区间。

[0051]图18描绘了酒花化合物或阳性对照吲哚美辛和曲格列酮处理过的3T3-L1脂肪细胞的脂肪含量(相对于溶剂对照)。使用3T3-L1小鼠成纤维细胞模型来研究测试化合物对脂肪细胞脂肪生成的潜在影响。结果显示对照细胞的相对非极性脂肪含量；误差带表示95％的置信区间。

[0052]图19是代表性条形图，它给出了利用四个剂量的测试材料24hr内诱发的抗胰岛素3T3-L1细胞的脂联素分泌最大值。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95％的置信区间。IAA＝异α酸，RIAA＝ρ异α酸，HHIA＝六氢异α酸，THIAA＝四氢异α酸。

[0053]图20描述了ρ异α酸、异α酸、四氢异α酸、六氢异α酸、黄腐酚、酒花残留物、六氢β酸和阳性对照曲格列酮的Hofstee图。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算脂联素分泌半最大值处测试材料所需的浓度。

[0054]图21给出两个条形图，分别表示通过异α酸和ρ异α酸(图A)以及六氢异α酸和四氢异α酸(图B)诱发TNFα处理过的成熟3T3-L1细胞的相对脂联素分泌情况。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95％的置信区间。*与仅用TNFα处理的结果有着显著性差异(p<0.05)。

[0055]图22描述了加入浓度为10ng/ml的TNFα 3 hr(图A)  和24hr(图B)后抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞内NF-kB核转位情况。在浓度为5.0μg/ml(黑色柱)和2.5μg/ml(条状柱)时加入吡格列酮、RIAA和黄腐酚。Jurkat核是在37℃条件下利用50ng/ml TPA(佛波、12肉豆蔻、13醋酸)和0.5μM钙离子载体A23187(CI)在培养基培育2小时后的细胞中提取而来。

[0056]图23图示了利用溶剂、二甲双胍和金合欢属样品#5659水提取物或二甲双胍/金合欢属儿茶提取物1:1混合物处理过的抗胰岛素3T3-L1细胞的相对甘油三酯含量。结果显示溶剂对照中完全分化的细胞的相对甘油三酯含量。

[0057]图24图示了10μg/ml的溶剂对照(DMSO)、RIAA、异α酸(IAA)、四氢异α酸(THIAA)、THIAA和六氢异α酸(HHIAA)1:1混合物、黄腐酚(XN)、LY 249002(LY)、乙醇(ETOH)、α酸(ALPHA)和β酸(BETA)对RL95-2子宫内膜细胞系细胞增值的作用。

[0058]图25图示了不同浓度的THIAA或还原异α酸(RIAA)对HT-29细胞系细胞增值的作用。

[0059]图26图示了不同浓度的THIAA或还原异α酸(RIAA)对SW480细胞系细胞增值的作用。

[0060]图27图示了db/db小鼠模型中用于降低血糖(图A)和血清胰岛素(图B)的还原异α酸(RIAA)各种混合物的剂量反应。

[0061]图28图示了db/db小鼠模型中由RIAA和金合欢属5:1混合物相对于医药抗糖尿病化合物罗格列酮和二甲双胍所引起的血糖(图A)和血清胰岛素(图B)的降低情况。

[0062]图29图示了患有风湿性关节炎的小鼠模型中还原异α酸(RIAA)对关节炎指数的影响。

[0063]图30图示了患有风湿性关节炎的小鼠模型中THIAA对关节炎指数的影响。

[0064]图31概述了RIAA和THIAA对胶原诱导的关节损伤的影响。

[0065]图32概述了RIAA和THIAA对胶原诱导性关节炎动物模型中IL-6水平的影响。

[0066]图33图示了RIAA/金合欢属(1:5)片剂(每天3片)对禁食和饭后2小时(2hpp)胰岛素水平的影响。对于2hpp胰岛素水平评估，经过10-12小时禁食的受试者摄入含有75g葡萄糖  (Trutol 100、CASCO 诊断学)的溶液；葡萄糖筛查后2小时，抽取血液并进行分析以评估胰岛素水平(美国华盛顿州塔科马西北实验室)。

[0067]图34图示了RIAA/金合欢属(1:5)片剂(每天3片)对禁食和饭后2h血糖水平的影响。对于2hpp血糖水平评估，经过10-12小时禁食的受试者摄入含有75g葡萄糖(Trutol 100、CASCO 诊断学)的溶液；葡萄糖筛查后2小时，抽取血液并进行分析以评估血糖水平(美国华盛顿州塔科马西北实验室)。

[0068]图35图示了RIAA/金合欢属(1:5)片剂(每天3片)对HOMA得分的影响。使用公开的方法[胰岛素(mcIU/mL)*血糖(mg/dL))/405]计算空腹胰岛素和血糖的HOMA得分。

[0069]图36图示了RIAA/金合欢属(1:5)片剂(每天3片)对血清TG水平的影响。

[0070]图37给出了RIAA或塞来昔布:姜黄素(1:3)对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。

[0071]图38给出IAA、塞来昔布:姜黄素(1:3)或LY294002对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。

[0072]图39给出THIAA或塞来昔布:姜黄素(1:3)对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。

[0073]图40给出HHIAA和塞来昔布:姜黄素(1:3)对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。

[0074]图41给出XN或塞来昔布:姜黄素(1:3)对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞的抑制百分比。

[0075]图42给出塞来昔布和RIAA混合物对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞抑制作用的观测值和预期值。

[0076]图43给出塞来昔布和THIAA混合物对(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480结肠癌细胞抑制作用的观测值和预期值。

[0077]图44图示了摄入940mg THIAA后，血清中所检测的THIAA随时间的变化情况。

[0078]图45显示了与对照相比，血清中检测到的THIAA随时间的变化曲线。

[0079]图46描述了通过CYP2C9*1进行的THIAA新陈代谢随时间的变化情况。

发明详述

[0080]本发明主要涉及对蛋白激酶调节敏感的癌症进行治疗或抑制所需的方法和混合物。具体地讲，本发明涉及多种方法和混合物，它们通常利用从酒花或植物类家族成员金合欢属或它的混合物中分离出的化合物或衍生物。

[0081]本文所提及的专利、已公开申请和科学文献涵盖了本领域技术人员的知识并以全文引用的方式并入，其引用程度就如同将其中每一个都特定且个别地以全文引用的方式并入。本文所引用的任何参考与本说明书中具体讲解的内容间发生任何冲突时，以本说明书为准。同样，单词或短语技术理解上的定义与本说明书专门阐释的单词或短语定义间发生冲突时，以本说明书为准。

[0082]本文使用的技术和科学术语可被本发明涉及的任何一位技术人员所理解，除非另有界定。本文所提及的各种技术和材料为技术人员熟知。规定DNA重组技术一般原则的标准参考著作包括Sambrook等人的《分子克隆：一本实验室手册》，第二版，美国冷泉港实验室出版社，纽约(1989)；  Kaufman等人，Eds.，《生物医学中分子和细胞方法手册》，CRC出版社，博卡拉顿(1995)；McPherson，Ed.，《定向诱变：一种实用方法》，IRL出版社，牛津(1991)。规定药理学一般原则的标准参考著作包括古德曼和吉尔曼的《治疗学的药理基础》，第11版，麦格劳·希尔公司，纽约(2006)。

[0083]在本说明书和随附的权利要求中，单数形式包括复数引用，除非文中另有明确规定。本说明书中使用的单数形式“一个”和“这(那)个，这些(那些)”也包含术语所指的复数形式，除非文中另有明确规定。此外，除非特别声明，本文所用的单词“或”具有“和/或”的“包括”含义，并不是“要么/或”的“除外”含义。本文所用的术语“大约”意思是大概、接近、大致或左右。术语“大约”与数值范围共同使用时，表示在所给数值的上下浮动。一般来讲，本文所用的术语“大约”以上下浮动20％修改所给的数值。

[0084]本文所用变量数值范围的详细列举意在表示利用与这一范围内任何数值相等的变量均可实施本发明。所以，对于本身离散的变量，它可与数值范围内任何整数值相等，这包括此范围的端点值。同样，对于本身连续的变量，它可与数值范围内任何实数相等，这包括此范围的端点值。例如，用来描述0和2之间数值的变量可以是本身离散的变量0、1和2，还可以是本身连续的变量0.0、0.1、0.01、0.001或其它任何实数。

[0085]本发明的特定实施例将在下文中进行详细描述。虽然本发明连同这些特定实施例将在下文进行描述，应该明白它并不意图将本发明的范围限制在这些特定实施例中。相反，它意图涵盖可列入本发明所附权利要求定义的精神和范围内的任何替代物、改良物和等价物。为深入了解本发明，在以下描述中，将对大量具体细节进行详细解释。没有这些部分或全部具体细节仍可实施本发明。在其它实施例中，为避免对本发明造成不必要的混淆，并未对公知的试验过程进行详述。

[0086]技术人员公知的任何适宜材料和/或方法均可用来实施本发明。然而，本发明描述了首选的材料和方法。材料、试剂以及以下说明和实施例中所参考的类似物均可从商业来源中获得，除非另有说明。

[0087]本发明的第一个实施例公开了哺乳动物中对所需蛋白激酶调节敏感的癌症治疗方法，该方法包含使用有效治疗剂量的还原异α酸给哺乳动物用药。在本实施例的某些方面，还原异α酸选择以下组群中：二氢异律草酮、二氢异类律草酮、二氢聚律草酮和ρ异α酸。

[0088]在本实施例的另一些方面中，参与调节作用的蛋白激酶选自以下组群：Aurora-A、DAPK2、FGFR3、FGER4、GSK3β、GSK3α、MAPK1、MAPKAP-K2、MSK2、MSSK1、PI3Kβ、PI3Kδ、Rse、Syk和TrkA。

[0089]在其它方面中，对激酶调节敏感的癌症选自以下组群：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、和甲状腺癌。

[0090]本实施例方法中所用的混合物还可选自以下组群的一个或多个成员：抗氧化剂、维生素、矿物质、蛋白质、脂肪和碳水化合物，或药用可接受的赋形剂：涂料、等渗和吸收延缓剂、粘结剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、甜味剂、吸收剂、去污剂和乳化剂。

[0091]本文所用的“疾病相关激酶”意指单个蛋白激酶或激酶组群或激酶家族，它们可能是导致疾病的直接原因，或者该疾病的激活与恶化该病症状的通路相关。

[0092]“蛋白激酶调节有助于受试者的身体健康”这一短语是指那些可减轻、预防和/或扭转疾病症状或可提高继发治疗方式活力的激酶调节(无论增量还是减量调节)的实例。

[0093]短语“对蛋白质激酶调节敏感的癌症”是指可使用本发明的化合物调节以下情况的实例，a)直接调节癌症细胞中的激酶，该调节会对主体健康产生有益影响(例如，靶向癌细胞的凋亡和生长抑制)；或者b)调节二级激酶，该调节分多级进行或为能对主体健康产生有益影响的激酶调节提供原料；以及c)靶向激酶调节，其会使肿瘤细胞对二级治疗调节更敏感(例如，化学疗法或放射疗法)。

[0094]本说明书中，不管是在过渡语还是在权利要求主体中所使用的术语“包含”和“包含的”均具有开放式的含义。也就是说，这些术语可解释为词组“至少具有”或者“至少包括”的同义词。当用在过程的上下文中时，术语“包含的”表示该过程至少包括说明书中所列举的流程，但也可能包括其它的流程。当用于表示化合物或混合物的上下文中时，术语“包含”表示化合物或混合物至少包含说明书中所列举的特征或化合物，但也可能包含其它的特征或化合物。

[0095]这里所用到的术语“衍生物”或“衍生而来的”物质意指如下化学物质：与另一物质在结构上具有相关性，并在理论上可由另一物质得到，亦即一种物质可由另一物质制备而来。衍生物可包括通过化学反应得到的化合物。

[0096]此处所用的术语“酒花提取物”是指经过(1)将酒花植物产品浸入溶剂中，(2)将溶剂从酒花植物产品中分离，以及(3)去除溶剂后得到的固体物质。“酒花残留物”指的是经过酒花提取程序后得到的酒花植物产品残留。参看Verzele，M.和De Keukeleire，D.的食品科学进展27：酒花和啤酒苦味酸的化学 及分析，Elsevier科学出版公司，1991，美国纽约，这里以全文引入的方式整体并入本说明书，以对酒花化学进行详细讨论。本文涉及RIAA时，“ρ_”是指那些还原异α酸，其还原是在4-甲基-3-戊烯酸酰侧链上的羧基团处进行的。

[0097]这里所用到的术语“溶剂”是指具有水溶液或有机性质的液体，其本质特点是能从酒花植物产品中提取固态物质。这类溶剂的例子包括，但不仅限于以下几种：水、蒸汽、过热水、甲醇、乙醇、正己烷、液态CO₂、液态N₂或这些物质的任意混合。

[0098]本文所用到的术语“CO₂提取物”是指将酒花植物产品浸入到液体或超临界CO₂制剂中，随后除去CO₂后得到固态物质。

[0099]术语“药用可接受的”含义为能与药物成分中的其它组分共存并对受体无害。

[00100]本文所用到的“化合物”可根据它们的化学结构、化学名称或者通用名称进行鉴定。当化学结构与化学名称或通用名称冲突时，化学结构就成为鉴定化合物的决定因素。本文描述的化合物可能包含一个或多个手性中心和/或双键，以及因此会以立体异构体形式存在，例如双键异构体(即，几何异构体)、对映异构体或非对映异构体。所以，本文描述的化学结构包含已说明或已鉴定化合物所有可能的对映异构体和立体异构体，该化合物包括立体异构的纯粹形态(例如，几何纯粹、对映异构纯粹或非对映异构纯粹)以及对映异构体和立体异构体的混合物。可使用熟练技工公知的分离技术或手性合成技术将映体和立体异构体混合物分解为它们的对映异构体和立体异构体单组分。化合物也可以若干互变异构形式存在，包括烯醇式、酮式和其混合物。所以，本文所述的化学结构包含已说明或已鉴定化合物所有可能的互变异构形式。本文所述的化合物还包含同位素标记的化合物，即化合物中的一个或多个原子的原子量与自然界中常见的该类原子的原子量不同。本发明所述化合物所包含的同位素实例包括，但不仅限于：²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O以及¹⁷O等。化合物可能会以非溶剂化形式和溶剂化形式(包括水合形式和N-氧化物形式)存在。一般来讲，化合物可被水合、溶剂化或N-氧化。某些化合物还可能以多晶形态或非晶形态存在。本发明的范围意图涵盖包括化合物的同类物、类似物、水解产物、代谢产物以及前驱物或药物前体。一般来讲，除非另有说明，所有物理形态应满足说明书中所考虑到的用途并要在本发明所示的范围内。

[00101]根据本发明，化合物可以盐类形式存在。尤指那些药用可接受的化合物盐类。本发明中“药用可接受的盐类物质”是将本发明的化合物与酸或碱结合，从而形成含有该化合物的(例如，镁盐，本文以符号“Mg”或“Mag”进行标记)，并能在一定治疗条件下为受试者所承受的盐类物质。总的来说，本发明中的药用可接受化合物盐类物质将具有等于或大于1的治疗指数(最低中毒剂量和最低有效治疗剂量之比)。熟知此技术的人员将认识到最低有效治疗剂量会随受试者及其症状的不同而变化，于是根据实际情况对剂量进行调整。

[00102]本文所用到的“酒花”意指葎草属植物的球果，葎草中含有苦味芳烃油，可用于啤酒酿造业中以抑制细菌的活动，并能为啤酒加入特有的苦味。如选用取自葎草啤酒花中的酒花则更为合适。

[00103]本文所用的术语“金合欢属”是指金合欢属植物中的任意一种豆科乔木及灌木。如选用取自金合欢属儿茶或金合欢属尼罗中的金合欢属植物化合物则更为合适。

[00104]本发明的化合物是使用公知的任何药用可接受载体的药用可接受介质进行选择配制的，该载体包括稀释剂和赋形剂(参见Remington的药物科学，第18版，Gennaro，Mack出版公司，伊斯顿，PA 1990和Remington：药剂学科学与实践，利平科特，Williams & Wilkins出版公司，1995年)。虽然用于生成本发明混合物的这类药用可接受载体/介质，会根据对哺乳动物的成分给药模式的不同而变化，但是一般来讲这类药用可接受载体应是生理惰性和无毒性的。根据本发明的复合配方制剂可能包括本发明中一种以上的化合物，以及对受治疗的症状/疾病的治疗过程有帮助的任何其它药用活性组分。

[00105]本文所用的术语“调节”是指使用配方、组分等对酶表达或酶活性进行增量或减量调节。

[00106]本文所用的术语“蛋白激酶”表示能将施主分子中的磷酸基团转移到蛋白质氨基酸残基上的这类转移酶。参见Kostich，M.，等人，真核蛋白激酶家族的成员，基因组生物学3(9)：research0043.1-0043.12，2002，这里以全文引入的方式整体并入本说明书，以便对蛋白激酶及其家族/组群的命名进行详细论述。

[00107]具代表性的激酶实例包括但不限于：Abl、Abl(T315I)、ALK、ALK4、AMPK、Arg、Arg、ARK5、ASK1、Aurora-A、Axl、Blk、Bmx、BRK、BrSK1、BrSK2、BTK、CaMKI、CaMKII、CaMKIV、CDK1/cyclinB、CDK2/cyclinA、CDK2/cyclinE、CDK3/cyclinE、CDK5/p25、CDK5/p35、CDK6/cyclinD3、CDK7/cyclinH/MAT1、CDK9/cyclinT1、CHK1、CHK2、CK1(y)、CK1δ、CK2、CK2α2、cKit(D816V)、cKit、c-RAF、CSK、cSRC、DAPK1、DAPK2、DDR2、DMPK、DRAK1、DYRK2、EGFR、EGFR(L858R)、EGFR(L861Q)、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、ErbB4、Fer、Fes、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、Fgr、Flt1、Flt3(D835Y)、Flt3、Flt4、Fms、Fyn、GSK3β、GSK3α、Hck、HIPK1、HIPK2、HIPK3、IGF-1R、IKKβ、IKKα、IR、IRAK1、IRAK4、IRR、ITK、JAK2、JAK3、JNK1α1、JNK2α2、JNK3、KDR、Lck、LIMK1、LKB1、LOK、Lyn、Lyn、MAPK1、MAPK2、MAPK2、MAPKAP-K2、MAPKAP-K3、MARK1、MEK1、MELK、Met、MINK、MKK4、MKK6、MKK7β、MLCK、MLK1、Mnk2、MRCKβ、MRCKα、MSK1、MSK2、MSSK1、MST1、MST2、MST3、MuSK、NEK2、NEK3、NEK6、NEK7、NLK、p70S6K、PAK2、PAK3、PAK4、PAK6、PAR-1Bα、PDGFRβ、PDGFRα、PDK1、PI3K beta、PI3K delta、PI3Kgamma、Pim-1、Pim-2、PKA(b)、PKA、PKBβ、PKBα、PKBγ、PKCμ、PKCβI、PKCβII、PKCα、PKCγ、PKCδ、PKCε、PKCζ、PKCη、PKCθ、PKCι、PKD2、PKG1β、PKG1α、Plk3、PRAK、PRK2、PrKX、PTK5、Pyk2、Ret、RIPK2、ROCK-I、ROCK-II、ROCK-II、Ron、Ros、Rse、Rsk1、Rsk1、Rsk2、Rsk3、SAPK2a、SAPK2a(T106M)、SAPK2b、SAPK3、SAPK4、SGK、SGK2、SGK3、SIK、Snk、SRPK1、SRPK2、STK33、Syk、TAK1、TBK1、Tie2、TrkA、TrkB、TSSK1、TSSK2、WNK2、WNK3、Yes、ZAP-70，以及ZIPK激酶。在某些实施例中，激酶可以是ALK、Aurora-A、Axl、CDK9/cyclin T1、DAPK1、DAPK2、Fer、FGFR4、GSK3β、GSK3α、Hck、JNK2α2、MSK2、p70S6K、PAK3、PI3Kδ、PI3K γ、PKA、PKBβ、PKBα、Rse、Rsk2、Syk、TrkA，以及TSSK1激酶。在另一些实施例中，激酶可从以下组群中选择：ABL、AKT、AURORA、CDK、DBF2/20、EGFR、EPH/ELK/ECK、ERK/MAPKFGFR、GSK3、IKKB、INSR、JAK DOM 1/2、MARK/PRKAA、MEK/STE7、MEKK/STE11、MLK、mTOR、PAK/STE20、PDGFR、PI3K、PKC、POLO、SRC、TEC/ATK，以及ZAP/SYK激酶。

[00108]本发明的方法和混合物旨在用于会从本发明中获益的任何哺乳动物。在这些哺乳动物中最重要的是人类，尽管本发明的初衷并不受此类限制，它同样可适用于兽医学应用。所以，依据本发明，“哺乳动物”或“需治疗的哺乳动物”包括人类以及所有非人类哺乳动物，特别是驯养动物，这其中包括，但不仅限于猫、狗和马。

[00109]本文所用的“自身免疫性疾病”指的是当宿主自身系统遭遇来自宿主自身免疫系统攻击时所引发的疾病、身体不适或其它病症。典型的自身免疫性疾病包括，但不仅限于以下实例：斑秃、强直性脊柱炎、关节炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性内耳病(又称梅尼埃尔氏病)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、白塞氏病、克罗恩病、I型糖尿病、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、炎症性肠疾病、狼疮性肾炎、多发性硬化症、重症肌无力症、天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。与自身免疫性疾病相关的非限制性典型激酶实例包括：AMPK、BTK、ERK、FGFR、FMS、GSK、IGFR、IKK、JAK、PDGFR、PI3K、PKC、PLK、ROCK，以及VEGFR激酶。

[00110]本文所用的“过敏性疾病”，是指对物质、环境或物理状态的夸大或病理反应(例如打喷嚏、呼吸窘迫、瘙痒、皮疹)，这在平均个体上无类似效应。本文所使用的“发炎性疾病”是指由于细胞损伤而引起的反应(通常是局部反应)，其特征是毛细管扩张、白细胞浸润、发红、发热、疼痛、肿胀，并且往往还伴随启动去除毒素和受损组织机能和机能的丧失。过敏性或发炎性疾病包括，但不仅限于以下实例：哮喘、鼻炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、胰腺炎、胃炎、良性肿瘤、息肉、遗传性息肉综合征、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、消化器官溃疡病、心绞痛、动脉粥样硬化、心肌梗塞、心绞痛或心肌梗塞后遗症、老年性痴呆以及脑血管疾病。而与过敏性疾病相关的非限制性典型激酶实例包括：AKT、AMPK、BTK、CHK、EGFR、FYN、IGF-1R、IKKB、ITK、JAK、KIT、LCK、LYN、MAPK、MEK、mTOR、PDGFR、PI3K、PKC、PPAR、ROCK、SRC、SYK，以及ZAP激酶。

[00111]此处所用的“代谢综合征”与“糖尿病相关疾病”是指胰岛素相关的疾病，即这类疾病或病况是由对胰岛素的反应引起，或者与它们的发展或抑制相关。典型的胰岛素相关疾病包括，但不仅限于以下实例：糖尿病、糖尿病并发症、胰岛素敏感症、多囊卵巢病、高血糖症、异常血脂症、胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖症、体重增加、炎症性疾病、消化器官疾病、心绞痛、心肌梗塞、心绞痛或心肌梗塞后遗症、老年痴呆症以及脑血管痴呆症。参见，《哈里森的内科医学原理》，第16版，麦格罗·希尔出版公司，纽约(2005)。所述炎症包括但不仅限于以下实例：消化器官疾病(如溃疡性结肠炎、克罗恩病、胰脏炎、胃炎、消化器官的良性肿瘤、消化道息肉、遗传性息肉综合症、结肠癌、直肠癌、胃癌和消化器官的溃疡性疾病)、心绞痛、心肌梗塞、心绞痛或心肌梗塞并发症、老年痴呆症、脑血管性痴呆以及常见的免疫性疾病和癌症。与代谢综合征相关的非限制性激酶实例包括：AKT、AMPK、CDK、CSK、ERK、GSK、IGFR、JNK、MAPK、MEK、PI3K，以及PKC激酶。

[00112]“抗胰岛抵抗”是指由于身体的胰岛素依赖过程降低了身体对胰岛素的敏感度，从而导致这些过程活性的降低或胰岛素产物的增加，或二者兼而有之。胰岛素抵抗是II型糖尿病的典型症状，但是也可能在患者未罹患糖尿病的情况下发生。

[00113]此处所用的“糖尿病并发症”包括，但不仅限于：视网膜病变、肌肉梗死、特发性骨质增生症及骨质疏松、足部溃疡、神经疾病、动脉粥样硬化、胸肺实质的呼吸性自主神经病变及结构紊乱、左心室肥大、心血管疾病、肾功能进行性丧失以及贫血症。

[00114]这里所用的“癌”是指以间变性细胞增殖为特征的各种良性或恶性肿瘤，如果是恶性肿瘤，它还会侵入周围组织并转移到身体的其它部位。考虑到本发明的适用范围，典型的癌非限制性实例包括：脑癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌和前列腺癌。考虑到本发明的适用范围，与癌相关的蛋白激酶非限制性实例包括：ABL、AKT、AMPK、Aurora、BRK、CDK、CHK、EGFR、ERB、FGFR、IGFR、KIT、MAPK、mTOR、PDGFR、PI3K、PKC，以及SRC激酶。

[00115]“眼部疾病”是指由于发育异常、疾病、损伤、年龄或毒素导致的眼部结构与功能紊乱。本发明范围内所考虑的眼部疾病非限制性实例包括视网膜病、黄斑变性以及糖尿病性视网膜病变。与眼部疾病相关的激酶包括，但不仅限于AMPK、Aurora、EPH、ERB、ERK、FMS、IGFR、MEK、PDGFR、PI3K、PKC、SRC，以及VEGFR激酶。

[00116]这里所用到的“神经性疾病”是指由于发育异常、疾病、损伤或毒素导致的中枢神经系统结构和功能障碍。具有代表性的神经性疾病包括但不仅限于以下实例：阿尔茨海默病、帕金森氏症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症(ALS或卢伽雷病)、亨廷顿氏病、神经性认知功能障碍、老年性痴呆以及情绪障碍性疾病。与神经性疾病相关的蛋白激酶包括，但不仅限于：AMPK、CDK、FYN、JNK、MAPK、PKC、ROCK、RTK、SRC，以及VEGFR激酶。

[00117]这里用到的“心血管疾病”或“CVD”，是指破坏心肌组织及血管本身或损害其功能的疾病或病征。与心血管疾病相关的激酶包括但不仅限于以下实例：AKT、AMPK、GPK、GSK、IGF-1R、IKKB、JAK、JUN、MAPK、PKC、RHO、ROCK以及TOR激酶。

[00118]这里所用到的“骨质疏松症”是指一种表现为骨骼疏松多孔，从而易于骨折且愈合缓慢的疾病。与骨质疏松症相关的蛋白激酶包括，但不仅限于：AKT、AMPK、CAMK、IRAK-M、MAPK、mTOR、PPAR、RHO、ROS、SRC、SYR，以及VEGFR激酶。

[00119]本发明的一个实施例描述了治疗哺乳动物体内对蛋白激酶调控迅速感应的癌症时，所需的复合物。复合物包含有效治疗剂量的还原异α酸；此处所说有效治疗剂量调节癌症相关的蛋白激酶。在此实施例的一些方面中，还原异α酸可从以下组群中进行选择：二氢异律草酮、二氢异类律草酮、二氢聚律草酮和ρ异α酸。

[00120]在此实施例的其它方面中，复合物还包含药用可接受的辅料，其可从以下组群中选择：涂料、等渗和吸收延缓剂剂、粘结剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、甜味剂、吸收剂、去污剂以及乳化剂。

[00121]还是在本实施例其他方面，复合物可进一步包含如下组试剂内的一种或多种：抗氧化剂、维生素、矿物质、蛋白质、脂肪以及碳水化合物。

[00122]这里所用“治疗”的意思是与未根据本发明进行治疗的患病个体病症进行比较的情况下，将本发明的化合物对患病个体用药以检验其缓解病症、阻止病情发展及逆转病情的效果。医师将体会到此处所述的化合物、复合物及治疗方法将同持续性临床评估一起被有经验的医师(内科医生或兽医)使用以确定后续疗法。因此，在后续治疗中医师将根据标准治疗方法对肺部炎症治疗中的任何改进进行评估。这样的评估将帮助和提醒医师应提高、降低还是维持特定的治疗剂量，用药方式等。

[00123]应当了解的是受试者在接受本发明化合物的用药后不会罹患特异性创伤症。甚至在症状发展前，可使用本发明的化合物进行预防性用药。术语“治疗”、“在治疗上”和这些术语的其它变换形式可用来描述包括治疗、缓解及预防的一系列用途。所以，这里所用的“治疗或缓解症状”的意思是与未根据本发明进行治疗的患病个体病症进行比较的情况下，将发明的化合物对患病个体用药以检验其缓解病症、阻止病情发展及逆转病情的效果。

[00124]术语“有效治疗剂量”是指能有效达到既定治疗效果的治疗剂量。此外，熟练的医师将体会到通过精确调整和/或给药本发明中一种以上的化合物，或通过将本发明中的化合物同另一化合物一起给药来增加或减少本发明化合物的有效治疗剂量。例如，参见Meiner，C.L.，“临床试验：设计、实施和分析，”流行病学与生物统计学专题著作，第8卷牛津大学出版社，美国(1986)。因此，本发明可针对给定哺乳动物的特定紧急需要来提供调整给药/治疗的方法。如以下实例所述，例如医师根据经验，可在开始时用相对较低的剂量进行给药，然后逐步增大剂量同时评估剂量的有益影响，从而比较容易地确定有效治疗剂量。

[00125]有经验的医师将意识到根据本发明进行给药所涉及的化合物种类将随病患个体的不同而进行改变，这是由于不同病患在任一特定时间会具有特定的医学状态，包括诸如哺乳动物年龄、体重、健康状况，以及所选用药途径等其它临床因素。

[00126]这里所用的“症状”是指患者所感受到的或与特定疾病相关的身体机能的任何知觉和改变，即伴随“X”并作为“X”存在标示的一切事物。人们对症状的认识和理解会随疾病与病况的不同而发生改变。自身免疫性疾病相关的病症实例包括但不仅限于疲劳、眩晕症、精神萎靡、器官或组织尺寸增大(例如甲状腺功能亢进症中的甲状腺肿大)、或者器官或组织损坏而导致的器官或组织功能衰竭(例如，糖尿病中胰腺的胰岛细胞损坏)。

[00127]过敏性相关疾病和症状的代表性症状包括：精神恍惚、过敏性反应、哮喘、害眼、便秘、咳嗽、黑眼圈、皮炎、抑郁症、腹泻、吞咽困难、注意力分散或注意力难以集中、眩晕症、湿疹、局促不安、疲劳、面红、头痛、心悸、麻疹、嗅觉迟钝、易激动/行为障碍、鼻子、皮肤或喉咙发痒，关节肌肉疼痛、鼻塞、鼻息肉、恶心反胃，后鼻滴注(鼻后滴漏)、疾脉、鼻液溢(流鼻涕)、耳鸣、呼吸急促、皮疹、睡眠障碍、打喷嚏、肿胀(血管性水肿)、喉咙嘶哑、鼻子刺痛、疲倦、眩晕、呕吐、眼部水肿、发痒、暴躁或发红、喘鸣。

[00128]这里所使用的“炎症”或“炎症状况”是指由于细胞损伤而引起的局部反应，其特征是毛细管扩张、白细胞浸润、发红、发热、疼痛、肿胀，并且往往还伴随去除毒素和受损组织启动机能和功能的丧失。仅就关节而言，炎症或炎症病症的代表性症状包括：关节充血、发热肿胀、关节疼痛僵硬以及关节功能丧失。全身炎症反应可产生像“流感一样”的症状，例如发烧、发冷、疲劳/浑身无力、头痛、食欲不振以及肌肉僵硬。

[00129]由于许多症状看似无害，所以医生经常诊断不出糖尿病及代谢综合征。例如，糖尿病的一些症状包括但不仅限于：尿频、过度口渴、极度饥饿、体重异常减轻、疲劳度增加、易怒以及视力模糊。

[00130]神经性疾病症状是多种多样的，包括但不仅限于下述症状：神经麻痹、麻刺感、感觉过敏(敏感度增加)、中风、局部衰弱、构音障碍(发音困难)、失语症(无法说话)、吞咽障碍(吞咽困难)、复视(双重视觉)、认知问题(例如无法集中注意力)、记忆丧失、一时性黑蒙(单眼暂时性失明)、行走困难、动作失调、震颤、癫痫、紊乱、嗜睡症、智力衰退、谵妄以及昏迷。

[00131]下面的实施例旨在进一步解释本发明中特定的首选实施例，但事实上并不限于这些实施例。熟知此技术的人员将认识到或能确定可使用本发明所述不超过常规的试验方法，众多等价的特定物质和程序。

实施例

实施例1

改良的酒花成分对蛋白激酶的影响

[00132]如前所述，激酶表示能将施主分子(通常ATP)中的磷酸基团转移到蛋白质氨基酸残基(通常为苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸)上的这类转移酶。激酶用于信号转导中以调节酶素，也就是激酶可在诸如胆固醇合成、氨基酸转换或糖原转换中抑制或激活酶活性。虽然多数激酶专门针对单一种类的氨基酸残基，但是有些激酶由于能使两种不同种类的氨基酸发生磷酸化作用，从而表现出双重活性。如图1所示，激酶在信号转导和翻译中的作用。

[00133]方法—本发明利用KinaseProfiler^TM分析(Upstate的细胞信号转导解决方案，美国Upstate公司，美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔)对200多个激酶进行测定来研究10μg/ml RIAA对人类激酶活性的抑制作用。特定激酶分析协议的总结请参 见http://www.upstate.com/img/pdf/kp protocols full.pdf(last visited on June 12，2006)。

[00134]结论—在无细胞系统中只分析了205个人类激酶。令人惊奇的是，我们发现所测试的酒花化合物抑制了205个激酶中的25个，抑制百分数为10％或更高。205个中的8个，抑制百分数大于20％；205个中的5个，抑制百分数大于30％；205个中的2个，抑制百分数大于大约为50％。

[00135]尤其在PI3激酶通路中，酒花可抑制PI3K  、PI3K  、PI3K  、Akt1、Akt2、GSK3  、GSK3  以及P70S6K。应该指出的是mTOR并不能用于测试。

[00136]酒花化合物RIAA对激酶抑制作用的测试结果如以下表1所示。

表1

在KinaseProfiler ^TM 分析中浓度为10μg/ml时检测的RIAA对激酶的抑制作用

 

激酶	抑制百分比％		激酶	抑制百分比％
Abl	93		MAPKAP-K2	98
					Abl	102		MAPKAP-K3	97
Abl(T315I)	121		MARK1	101
					ALK	84		MEK1	113
ALK4	109		MELK	98
					AMPK	103		Met	109
Arg	96		MINK	109
					Arg	95		MKK4	94
ARK5	103		MKK6	114
					ASK1	116		MKK7β	113
Aurora-A	77		MLCK	114
					Axl	89		MLK1	109
Blk	115		Mnk2	116
					Bmx	108		MRCKβ	114
BRK	112		MRCKα	119
					BrSK1	108		MSK1	97
BrSK2	100		MSK2	89
					BTK	97		MSSK1	92
CaMKI	96		MSK1	105
					CaMKII	119		MSK2	103
CaMKIV	115		MSK3	104
					CDK1/cyclinB	109		MuSK	100
CDK2/cyclinA	94		NEK2	99

 

CDK2/cyclinE	122		NEK3	109
					CDK1/cyclinE	104		NEK6	98
CDK5/p25	100		NEK7	98
					CDK5/p25	103		NLK	109
CDK6/cyclinD3	110		p70S6K	87
					CDK7/cyclinH/MAT1	108		PAK2	92
CDK9/cyclinT1	84		PAK3	54
					CHK1	102		PAK4	99
CHK2	98		PAK6	109
					CK1(y)	109		PAR-1Bα	109
CK1δ	104		PDGFRβ	109
					CK2	122		PDGFRα	101
CK2α2	126		PDK1	118
					cKit(D816V)	135		PI3Kβ	95
cKit	103		PI3Kδ	88
					c-RAF	101		PI3Kγ	80
CSK	108		Pim-1	133
					cSRC	103		Pim-2	112
DAPK1	78		PKA(b)	99
					DAPK2	67		PKA	66
DDR2	108		PKBβ	87
					DMPK	121		PKBα	49
DRAK1	111		PKBγ	100
					DYRK2	112		PKCμ	100
EGFR	120		PKCβI	112
					EGFR(L858R)	113		PKCβII	99
EGFR(L861Q)	122		PKCα	109
					EphA1	105		PKCγ	109
EphA2	115		PKCδ	101
					EphA3	93		PKCε	99
EphA4	108		PKCζ	107
					EphA5	120		PKCη	119
EphA7	127		PKCθ	117
					EphA8	112		PKCι	96
EphB1	134		PKD2	115
					EphB2	110		DAP1β	99
EphB3	101		PKG1α	110
					EphB4	113		P1k3	98
ErbB4	123		PRAK	100
					Fer	80		PRK2	102
Fes	121		PrKX	94
					FGFR1	96		PTK5	104
FGFR2	103		Pyk2	112

 

FGFR3	109		Ret	96
					FGFR4	83		RIPK2	98
Fgr	102		ROCK-I	105
					Flt1	102		ROCK-II	90
Flt3(D835Y)	103		ROCK-II	105
					Flt3	108		Ron	102
Flt4	110		Ros	94
					Fms	105		Rse	84
Fyn	100		Rsk1	93
					GSK3β	82		Rsk1	95
GSK3α	89		Rsk2	89
					Hck	83		Rsk3	95
HIPK1	98		SAPK2a	111
					HIPK2	113		SAPK2a(T106M)	108
HIPK3	119		SAPK2b	100
					IGF-1R	97		SAPK3	98
IKKβ	117		SAPK4	98
					IKKα	117		SGK	94
IR	95		SGK2	96
					IRAK1	109		SGK3	107
IRAK4	110		SIK	90
					IRR	102		Snk	98
ITK	117		SRPK1	117
					JAK2	112		SRPK2	110
JAK3	111		STK33	94
					JNK1α1	104		Syk	82
JNK2α2	84		TAK1	109
					JNK3	98		TBK1	121
KDR	101		Tie2	95
					Lck	94		TrkA	85
LIMK1	102		TrkB	91
					LKB1	106		TSSK1	51
LOK	127		TSSK2	97
					Lyn	100		WNK2	102
Lyn	109		WNK3	104
					MAPK1	95		Yes	92
MAPK2	101		ZAP-70	113
					MAPK2	113		ZIPK	91

[00137]应该指出的是PI3K通路中的若干激酶首先被RIAA抑制，例如Akt1抑制百分比为51％。有趣的是我们注意到存在三种Akt亚型。不含Akt1的小鼠可存活，但发育迟缓(Cho等人，Science 292：1728-1731(2001))。缺乏Akt1的果蝇眼睛细胞尺寸在缩小(Verdu等人，Nat cell Biol 1：500-505(1999))；过度表达导致尺寸增加。不含Akt2的小鼠可存活，但使血糖控制异常[Cho等人，J Biol Chem 276：38345-38352(2001)]。所以，这显示Akt1在确定尺寸大小方面发挥重要作用，而Akt2参与胰岛素信号传导。

[00138]众所周知PI3K通路在mRNA稳定性和mRNA翻译选择方面发挥重要作用，mRNA引起各种癌基因蛋白质和炎症通路蛋白质的差异表达。一个特别的带有5’-TOP标志的5’mRNA结构已表明它在调节mRNA翻译选择中发挥重要作用。

[00139]一篇关于cPLA文献和DNA序列的评论文章指出人类cPLA2的5’mRNA包含一个标示它也具有一个5’TOP结构的一致(与类似的已知癌基因调节具有82％的同源性)序列。众所周知sPLAs也与炎症有关，它也具有相同的5’-TOP结构。此外，这表明可通过增加导致cPLA2蛋白质增长的cPLA2 mRNA的翻译选择由PI3K通路来对cPLA2及其它可能的PLAs进行上调。相反，PI3K的抑制作用应减低cPLA2的剂量并通过COX2通路降低PGE₂的生成。

[00140]激酶数据和我们自己的结果结合，其中我们发现酒花化合物可抑制cPLA2蛋白表达(免疫印迹法，数据未给出)而非mRNA，这表明酒花化合物作用的抗炎模式可能是通过降低cPLA2蛋白质水平，或许是更具体地通过抑制TOP mRNA翻译的活性来抑制PI3K通路，从而降低底物对COX2的可用性。

[00141]活性的精确通路目前仍不清楚。一些报告赞同通过核糖体蛋白S6(RPS6)六种亚型中的一个或多个磷酸化作用而激活的模型。据报道RPS6可解决5’TOPmRNA，从而对蛋白质实现有效翻译。然而，Stolovich等人，Mol Cell Biol Dec，8101-8113(2002)，对该模型提出异议并提出Akt1使允许TOP mRNA翻译的未知翻译因子x发生磷酸化作用。

实施例2

酒花和金合欢属组分对选择的蛋白激酶的剂量反应效应

[00142]根据下面表2A&2B给出的实施例1中的方案，mgRho在浓度大约为10、50和100μg/ml对60个以上选择性蛋白激酶检测得的剂量反应。受抑制作用最强的五个激酶显示在图2中。

[00143]对下面表3给出的86个选择性激酶，THIAA制剂分别在浓度大约为1、10、25和50ug/ml时，对激酶抑制(报告中以抑制百分比表示)测得的剂量反应。同样根据下面表4给出的实施例1中的方案，金合欢属制剂在浓度大约为1、5和25μg/ml对230个以上的选择性蛋白激酶测得的剂量反应。异α-酸(IAA)、六氢异α-酸、β酸和黄腐粉制剂在浓度大约为10、25和50μg/ml时针对86个选择性激酶分别测得的剂量反应结果分别显示在以下表5-8中。

表2A

mgRho对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml		激酶	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
									Abl	103	82	65		MSSK1	120	31	26
ALK	79	93	109		p70S6K	105	86	69
									AMPK	107	105	110		PAK2	99	84	89
Arg	94	76	64		PAK5	99	94	78
									Aurora-A	96	59	33		PASK	105	111	102
Axl	101	87	85		PDK1	98	90	78
									CaMKI	95	85	77		PI3Kβ(est)	74	49	39
CDK2/cyclinA	106	81	59		PI3Kδ(est)	64	22	13
									CDK9/cyclinT1	100	88	101		PI3Kγ(est)	85	69	55
c-RAF	105	109	103		PKA	103	95	92
									DAPK1	82	56	51		PKCε	96	93	91
DAPK2	64	51	45		PKCι	100	94	96
									EphA3	103	64	55		PrKX	100	105	90
Fer	87	74	83		ROCK-II	102	101	99
									FGFR1	98	99	93		Ros	105	86	90
FGFR4	111	68	35		Rse	71	39	22
									GSK3β	65	17	26		Rsk2	108	79	56
GSK3α	65	64	13		Rsk3	108	102	86
									Hck	86	72	59		SAPK2a	96	105	109
IKKβ	104	91	92		SAPK2a(T106M)	100	107	107
									IKKα	104	101	96		SAPK2b	101	102	106
IR	87	85	78		SAPK3	110	109	110
									JNK1α1	105	115	106		SAPK4	97	107	109
JNK2α2	119	136	124		SGK	111	105	94
									JNK3	98	98	86		SIK	130	125	117
Lck	105	83	81		STK33	99	96	103
									MAPK1	77	53	44		Syk	79	46	28
MAPK2	101	104	106		Tie2	113	74	56
									MAPKAP-K2	111	99	49		TrkA	127	115	93
MAPKAP-K3	109	106	73		TrkB	106	105	81
									MEK1	106	104	91		TSSK1	105	100	95

 

MKK4	110	110	98		Yes	100	105	100
									MSK2	92	54	43		ZIPK	92	62	83

表2B

mgRho对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml	50ug/ml
					AMPK(r)	102	98	99	91
CaMKI(h)	100	106	106	87
					CaMKIIβ(h)	101	87	114	97
CaMKIIγ(h)	85	97	97	90
					CaMKIδ(h)	117	110	105	90
CaMKIIδ(h)	100	97	102	96
					CaMKIV(h)	109	101	73	95
FGFR1(h)	103	108	106	103
					FGFR1(V561M)(h)	104	108	110	102
FGFR2(h)	96	90	94	55
					FGFR3(h)	100	113	91	40
FGFR4(h)	115	110	100	71
					GSK3α(h)	51	77	63	38
GSK3β(h)	95	86	71	51
					Hck(h)	89	96	87	95
IGF-1R(h)	76	65	65	102
					IKKα(h)	126	125	145	144
IKKβ(h)	130	118	105	89
					IRAK1(h)	101	104	107	99
JAK3(h)	89	93	89	76
					JNK1α1(h)	103	78	72	70
JNK2α2(h)	95	97	97	92
					JNK3(h)	88	92	91	98
KDR(h)	108	103	102	109
					Lck(h)	99	102	90	92
LKB1(h)	135	135	140	140
					MAPK1(h)	98	90	90	80
MAPK2(h)	112	110	111	107
					MAPKAP-K2(h)	103	100	92	68
MAPKAP-K3(h)	108	99	94	87
					MSK1(h)	134	110	111	101
MSK2(h)	117	97	102	86
					MSSK1(h)	103	103	81	69
p70S6K(h)	100	103	100	89
					PKCβII(h)	98	100	77	58
PKCγ(h)	106	99	105	92
					PKCδ(h)	103	102	91	85
PKCε(h)	107	104	93	85
					PKCη(h)	108	106	99	89
PKCι(h)	84	94	94	101

 

PKCμ(h)	88	97	95	89
					PKCθ(h)	110	105	102	100
PKCζ(h)	96	100	100	103
					Syk(h)	101	109	90	84
TrkA(h)	97	98	51	41
					TrkB(h)	91	87	91	97

表3

THIAA对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml	50ug/ml
					Abl(T315I)	104	95	68	10
ALK4	127	112	108
					AMPK	135	136	139	62
Aurora-A	102	86	50	5
					Bmx	110	105	57	30
BTK	104	86	58	48
					CaMKI	163	132	65	16
CaMKIIβ	106	102	90	71
					CaMKIIγ	99	101	87	81
CaMKIIδ	99	103	80	76
					CaMKIV	99	117	120	126
CaMKIδ	91	95	61	43
					CDK1/cyclinB	82	101	77	66
CDK2/cyclinA	118	113	87	50
					CDK2/cyclinE	87	79	73	57
CDK3/cyclinE	113	111	105	32
					CDK5/p25	102	100	85	54
CDK5/p35	109	106	89	80
					CDK6/cyclinD3	114	113	112	70
CDK9/cyclinT1	106	93	66	36
					CHK1	116	118	149	148
CHK2	111	116	98	68
					CK1(y)	101	101	55
CK1γ1	101	100	42	43
					CK1γ2	94	85	33	48
CK1γ3	99	91	23	18
					CK1δ	109	97	65	42
cKit(D816H)	113	113	69	75
					CSK	110	113	92	137
cSRC	105	103	91	17
					DAPK1	62	34	21	14
DAPK2	60	54	41	17
					DRAK1	113	116	75	18
EphA2	110	112	85	31
					EphA8	110	110	83	43

 

EphB1	153	177	196	53
					ErbB4	124	125	75	56
Fer	85	41	24	12
					Fes	112	134	116	57
FGFR1	109	110	110	111
					FGFR1(V561M)	97	106	91	92
FGFR2	126	115	58	7
					FGFR3	112	94	39	16
FGFR4	122	93	83	58
					Fgr	121	120	110	47
Flt4	126	119	85	31
					IKKα	139	140	140	102
JNK1α1	71	118	118	107
					JNK2α2	94	97	98	101
JNK3	121	78	58	44
					KDR	106	107	104	126
Lck	97	105	125	88
					LKB1	145	144	140	140
MAPK2	99	109	112	102
					Pim-1	103	100	44	44
Pim-2	103	109	83	22
					PKA(b)	104	77	32	0
PKA	104	101	90	25
					PKBβ	117	102	27	33
PKBα	103	101	49	50
					PKBγ	107	109	99	33
PKCμ	90	90	93	87
					PKCβII	99	107	103	64
PKCα	110	111	112	102
					PKCγ	86	95	77	62
PKCδ	97	93	84	87
					PKCε	76	88	88	90
PKCζ	93	100	107	103
					PKCη	82	99	103	90
PKCθ	93	95	86	90
					PKCι	77	90	93	134
PRAK	99	81	21	33
					PrKX	92	76	32	38
Ron	120	110	97	42
					Ros	105	105	94	93
Rsk1	101	87	48	31
					Rsk2	100	85	40	14
SGK	98	103	79	77
					SGK2	117	110	45	18
Syk	99	93	55	17
					TBK1	101	100	82	56
Tie2	109	115	100	32
					TrkA	107	65	30	15

 

TrkB	97	96	72	21
					TSSK2	112	111	87	66
ZIPK	106	101	74	59

表4

合金欢属对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml		激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml
									Abl	53	27	2		LOK	103	72	27
Abl(T315I)	57	26	11		Lyn	4	1	2
									ALK	102	52	10		MAPK1	115	38	15
ALK4	84	96	98		MAPK2	108	90	48
									AMPK	108	101	77		MAPK2	99	78	45
Arg	86	53	23		MAPKAP-K2	67	12	1
									Arg	106	55	18		MAPKAP-K3	82	28	1
ARK5	36	13	6		MARK1	52	20	4
									ASK1	100	70	23		MEK1	117	94	41
Aurora-A	8	-1	3		MELK	61	27	2
									Axl	64	17	4		Mer	95	74	5
Blk	31	-2	-3		Met	168	21	7
									Bmx	101	51	0		MINK	79	57	18
BRK	47	19	7		MKK4	103	135	13
									BrSK1	58	6	2		MKK6	113	105	50
BrSK2	82	16	4		MKK7β	91	44	9
									BTK	15	-1	-3		MLCK	83	38	52
CaMKI	97	90	49		MLK1	92	75	42
									CaMKII	83	50	6		Mnk2	103	71	29
CaMKIIβ	87	45	10		MRCKβ	95	52	18
									CaMKIIγ	90	51	12		MRCKα	96	76	32
CaMKIIδ	25	13	6		MSK1	105	97	33
									CaMKIV	89	44	44		MSK2	56	22	12
CaMKIδ	69	19	10		MSSK1	12	4	4
									CDK1/cyclinB	62	48	9		MST1	58	36	17
CDK2/cyclinA	69	15	5		MST2	106	104	38
									CDK2/cyclinE	51	14	8		MST3	50	10	2
CDK3/cyclinE	41	13	4		MuSK	97	83	63
									CDK5/p25	82	41	7		NEK11	89	58	19
CDK5/p35	77	46	13		NEK2	99	100	37
									CDK6/cyclinD3	100	54	5		NEK3	79	41	18
CDK7/cyclinH/MAT1	124	90	42		NEK6	78	43	4
									CDK9/cyclinT1	79	21	4		NEK7	110	94	27
CHK1	87	52	17		NLK	103	90	44
									CHK2	52	16	5		p70S6K	43	17	10

 

CK1(y)	77	32	3		PAK2	103	79	16
									CK1γ1	51	7	-4		PAK3	43	5	3
CK1γ2	31	5	1		PAK4	99	91	58
									CK1γ3	49	16	0		PAK5	69	6	2
CK1δ	60	15	6		PAK6	77	22	1
									CK2	157	162	128		PAR-1Bα	70	20	8
CK2α2	95	83	51		PASK	136	114	26
									cKit(D816H)	27	7	2		PDGFRβ	59	19	9
cKit(D816V)	111	91	41		PDGFRα(D842V)	60	11	5
									cKit	94	68	24		PDGFRα	100	106	51
cKit(V560G)	49	5	0		PDGFRα(V561D)	59	11	7
									cKit(V654A)	30	8	3		PDK1	97	57	16
CLK3	33	16	6		PhKγ2	67	62	16
									c-RAF	105	100	87		Pim-1	44	9	2
CSK	74	19	1		Pim-2	82	17	10
									cSRC	99	12	0		PKA(b)	104	52	7
DAPK1	90	72	12		PKA	99	85	16
									DAPK2	75	31	4		PKBβ	61	9	-1
DCAMKL2	107	106	77		PKBα	98	67	8
									DDR2	84	91	45		PKBγ	86	50	5
DMPK	105	106	116		PKCμ	90	81	44
									DRAK1	92	40	11		PKCβI	108	112	100
DYRK2	83	55	25		PKCβII	71	47	30
									eEF-2K	103	97	59		PKCα	75	34	32
EGFR	76	26	6		PKCγ	72	47	27
									EGFR(L858R)	99	40	1		PKCδ	105	94	63
EGFR(L861Q)	90	49	1		PKCε	108	90	59
									EGFR(T790M)	93	29	7		PKCζ	34	10	2
EGFR(T790M，L858R)	74	30	4		PKCη	107	99	84
									EphA1	106	43	9		PKCθ	88	31	21
EphA2	94	82	6		PKCι	66	69	63
									EphA3	94	83	50		PKD2	106	108	81
EphA4	55	12	6		PKG1β	31	16	5
									EphA5	100	28	10		PKG1α	41	18	7
EphA7	103	80	6		Plk3	114	106	115
									EphA8	113	84	19		PRAK	18	18	35
EphB1	116	63	8		PRK2	92	35	8
									EphB2	30	5	2		PrKX	49	14	16
EphB3	109	35	1		PTK5	99	95	88
									EphB4	30	11	3		Pyk2	90	45	9
ErbB4	61	8	0		Ret	23	-1	-2
									FAK	106	78	2		RIPK2	103	95	64
Fer	106	134	28		ROCK-I	95	90	54
									Fes	143	74	43		ROCK-II	100	66	39
FGFR1	125	26	3		ROCK-II	91	59	39
									FGFR1(V561M)	92	50	2		Ron	32	2	4
FGFR2	73	-2	-5		Ros	95	40	35
									FGFR3	21	3	1		Rse	35	14	0

 

FGFR4	30	7	5		Rsk1	45	9	4
									Fgr	78	18	7		Rsk1	75	8	5
Flt1	41	12	1		Rsk2	60	4	3
									Flt3(D835Y)	65	15	-1		Rsk3	78	31	7
Flt3	76	16	3		Rsk4	71	25	12
									Flt4	12	3	2		SAPK2a	99	106	106
Fms	94	73	19		SAPK2a(T106M)	110	106	80
									Fyn	23	5	1		SAPK2b	99	100	77
GRK5	96	91	81		SAPK3	108	79	40
									GRK6	117	117	94		SAPK4	103	86	57
GSK3β	13	5	4		SGK	89	34	2
									GSK3α	5	2	1		SGK2	102	36	5
Hck	87	29	-2		SGK3	103	96	34
									HIPK1	110	112	62		SIK	115	28	5
HIPK2	92	71	24		Snk	93	96	61
									HIPK3	106	92	56		SRPK1	56	14	6
IGF-1R	148	122	41		SRPK2	37	15	4
									IKKβ	30	6	3		STK33	100	94	64
IKKα	120	86	11		Syk	2	2	3
									IR	121	123	129		TAK1	105	101	86
IRAK1	98	85	49		TAO2	97	64	25
									IRAK4	117	95	47		TBK1	37	5	12
IRR	91	70	28		Tie2	97	67	7
									Itk	121	114	48		TrkA	20	4	2
JAK2	83	69	23		TrkB	22	0	0
									JAK3	24	7	1		TSSK1	89	10	5
JNK1α1	118	110	75		TSSK2	97	29	2
									JNK2α2	99	106	102		VRK2	98	88	67
JNK3	52	23	3		WNK2	96	75	21
									KDR	90	60	18		WNK3	110	98	38
Lck	92	93	25		Yes	63	33	3
									LIMK1	108	104	53		ZAP-70	57	19	10
LKB1	126	122	98		ZIPK	104	81	28

表5

IAA对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml	50ug/ml
					Abl(T315I)	104	119	84	56
ALK4	92	110	113
					AMPK	122	121	86	49
Aurora-A	103	106	61	20
					Bmx	90	125	108	43

 

BTK	96	102	62	48
					CaMKI	126	139	146	54
CDK1/cyclinB	96	102	86	69
					CDK2/cyclinA	102	111	98	59
CDK2/cyclinE	81	89	72	55
					CDK3/cyclinE	99	121	107	62
CDK5/p25	88	108	95	69
					CDK5/p35	92	117	100	73
CDK6/cyclinD3	111	119	108	64
					CDK9/cyclinT1	87	109	77	51
CHK1	105	117	140	159
					CHK2	102	106	75	46
CK1(y)	94	105	103
					CK1γ1	98	102	69	21
CK1γ2	89	88	39	42
					CK1γ3	91	87	26	17
CK1δ	95	111	90	56
					cKit(D816H)	98	117	100	59
CSK	95	111	72	86
					cSRC	99	111	100	53
DAPK1	73	52	36	21
					DAPK2	59	54	50	47
DRAK1	102	123	129	75
					EphA2	104	118	108	88
EphA8	113	120	117	98
					EphB1	112	151	220	208
ErbB4	93	107	110	20
					Fer	95	76	49	38
Fes	101	110	120	59
					FGFR2	85	122	97	5
Fgr	99	120	119	70
					Flt4	85	37	74	33
Fyn	90	88	92	90
					GSK3β	86	77	47	14
GSK3α	85	83	56	17
					Hck	88	81	76	4
HIPK2	101	107	107	84
					HIPK3	97	101	127	84
IGF-1R	132	229	278	301
					IKKβ	103	116	93	56
IR	110	107	121	131
					IRAK1	115	143	156	122
JAK3	88	98	83	74
					Lyn	82	114	41	73
MAPK1	81	87	55	55
					MAPKAP-K2	100	98	82	36
MAPKAP-K3	108	113	106	80
					MINK	102	122	118	127

 

MSK1	99	103	66	61
					MSK2	95	90	44	45
MSSK1	90	78	52	52
					p70S6K	94	98	84	58
PAK3	91	66	21	11
					PAK5	101	108	106	59
PAK6	98	109	106	102
					PhKγ2	103	109	102	66
Pim-1	104	106	77	46
					Pim-2	101	108	88	60
PKA(b)	104	115	86	12
					PKA	110	102	99	106
PKBβ	104	110	57	76
					PKBα	98	103	91	72
PKBγ	103	108	104	76
					PKCβII	103	103	102	59
PKCα	106	104	89	46
					PRAK	99	91	38	18
PrKX	94	92	91	58
					Ron	117	113	113	40
Ros	101	108	84	75
					Rsk1	96	101	72	48
Rsk2	95	101	76	36
					SGK	102	110	100	96
SGK2	99	128	105	60
					Syk	85	92	53	7
TBK1	100	105	82	86
					Tie2	101	124	113	40
TrkA	112	139	24	20
					TrkB	97	111	90	59
TSSK2	99	112	109	75
					ZIPK	102	102	95	73

表6

HHIAA对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml	50ug/ml
					Abl(T315I)	113	109	84	38
ALK4	123	121	108
					AMPK	133	130	137	87
Aurora-A	111	107	64	27
					Bmx	103	102	106	44
BTK	110	105	67	61

 

CaMKI	148	151	140	56
					CDK1/cyclinB	118	115	98	85
CDK2/cyclinA	109	112	82	60
					CDK2/cyclinE	83	84	70	88
CDK3/cyclinE	115	119	108	85
					CDK5/p25	101	94	69	51
CDK5/p35	110	103	73	68
					CDK6/cyclinD3	119	124	117	83
CDK9/cyclin T1	106	96	66	40
					CHK1	127	124	140	144
CHK2	119	117	110	82
					CK1(y)	102	102	100
CK1γ1	105	103	68	30
					CK1γ2	99	99	45	49
CK1γ3	104	98	28	22
					CK1δ	110	115	89	56
cKit(D816H)	116	109	91	68
					CSK	100	108	109	112
cSRC	105	114	103	37
					DAPK1	94	67	37	27
DAPK2	72	58	46	47
					DRAK1	110	119	103	69
EphA2	106	127	115	68
					EphA8	133	109	89	74
EphB1	154	162	200	164
					ErbB4	141	122	85	14
Fer	90	62	13	20
					Fes	137	126	111	81
FGFR2	116	120	71	7
					Fgr	122	127	118	91
Flt4	135	116	88	58
					Fyn	104	119	82	81
GSK3β	138	84	51	10
					GSK3α	89	82	58	18
Hck	93	99	73	77
					HIPK2	103	105	100	98
HIPK3	117	121	118	29
					IGF-1R	138	173	207	159
IKKβ	123	116	98	79
					IR	129	95	105	81
IRAK1	142	140	152	120
					JAK3	104	103	61	90
Lyn	115	113	56	80
					MAPK1	100	88	55	67
MAPKAP-K2	104	99	71	29
					MAPKAP-K3	111	109	99	77
MINK	107	102	114	123
					MSK1	105	101	58	69

 

MSK2	101	86	39	48
					MSSK1	98	78	41	60
p70S6K	108	99	78	56
					PAK3	113	24	14	10
PAK5	109	105	89	36
					PAK6	106	106	88	71
PhKγ2	105	109	85	54
					Pim-1	107	110	81	50
Pim-2	111	106	98	58
					PKA(b)	105	119	67	12
PKA	98	107	102	91
					PKBβ	121	142	50	42
PKBα	105	108	81	57
					PKBγ	115	116	107	42
PKCβII	113	115	109	95
					PKCα	110	90	105	103
PRAK	109	89	41	33
					PrKX	86	88	77	59
Ron	114	106	129	74
					Ros	113	107	109	98
Rsk1	101	102	53	60
					Rsk2	105	103	58	25
SGK	108	114	112	64
					SGK2	120	121	96	63
Syk	100	95	68	17
					TBK1	115	103	99	114
Tie2	109	120	95	43
					TrkA	87	73	41	24
TrkB	100	107	97	13
					TSSK2	115	112	109	71
ZIPK	109	109	96	8

表7

β酸对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml	50ug/ml
					Abl(T315I)	101	101	70	29
ALK4	108	114	90
					AMPK	136	131	135	77
Aurora-A	110	85	43	2
					Bmx	111	100	93	54
BTK	96	90	14	37
					CaMKI	142	142	131	57

 

CDK1/cyclinB	116	120	95	65
					CDK2/cyclinA	106	104	94	64
CDK2/cyclinE	93	86	81	65
					CDK3/cyclinE	119	115	96	53
CDK5/p25	97	97	95	96
					CDK5/p35	109	106	90	50
CDK6/cyclinD3	107	117	101	76
					CDK9/cyclinT1	101	104	88	35
CHK1	111	125	144	164
					CHK2	103	100	94	69
CK1(y)	102	104	83
					CK1γ1	100	95	82	33
CK1γ2	97	83	55	44
					CK1γ3	99	75	40	21
CK1δ	103	98	81	54
					cKit(D816H)	103	112	100	18
CSK	107	111	108	145
					cSRC	104	99	90	19
DAPK1	109	106	88	59
					DAPK2	97	76	57	45
DRAK1	124	134	107	51
					EphA2	116	122	115	80
EphA8	107	105	86	36
					EphB1	130	164	204	207
ErbB4	111	118	116	28
					Fer	78	69	30	18
Fes	120	106	114	79
					FGFR2	130	118	99	7
Fgr	119	119	127	62
					Flt4	104	96	65	22
Fyn	99	94	86	78
					GSK3β	83	67	27	4
GSK3α	70	71	31	1
					Hck	102	88	61	22
HIPK2	101	104	99	94
					HIPK3	109	119	118	83
IGF-1R	101	163	262	260
					IKKβ	110	113	85	59
IR	106	106	108	95
					IRAK1	143	155	165	158
JAK3	100	98	64	38
					Lyn	114	120	68	59
MAPK1	88	75	51	37
					MAPKAP-K2	111	104	65	22
MAPKAP-K3	108	106	102	69
					MINK	102	103	123	140
MSK1	106	97	54	36
					MSK2	96	86	28	25

 

MSSK1	95	82	61	67
					p70S6K	89	95	69	44
PAK3	103	40	16	11
					PAK5	103	99	81	44
PAK6	103	98	82	83
					PhKγ2	108	103	79	40
Pim-1	104	97	57	21
					Pim-2	103	101	68	73
PKA(b)	120	104	51	3
					PKA	103	105	102	28
PKBβ	114	108	56	52
					PKBα	98	95	80	58
PKBγ	105	104	101	52
					PKCβII	107	105	100	49
PKCα	108	104	98	54
					PRAK	105	81	24	11
PrKX	93	86	68	29
					Ron	108	119	98	44
Ros	107	103	80	98
					Rsk1	103	99	69	17
Rsk2	98	96	56	8
					SGK	109	111	98	100
SGK2	123	113	84	0
					Syk	92	81	62	16
TBK1	110	103	80	78
					Tie2	110	100	106	79
TrkA	97	66	53	18
					TrkB	105	100	86	11
TSSK2	112	109	103	62
					ZIPK	105	110	85	37

表8

黄腐粉对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)

 

激酶	1ug/ml	5ug/ml	25ug/ml	50ug/ml
					Abl(T315I)	126	115	16	4
ALK4	116	100	71	49
					AMPK	122	113	90	81
Aurora-A	83	27	3	8
					Bmx	108	97	22	0
BTK	109	57	2	20
					CaMKI	142	83	3	4
CDK1/cyclinB	118	103	46	18

 

CDK2/cyclinA	107	96	57	6
					CDK2/cyclinE	82	86	18	9
CDK3/cyclinE	101	100	37	8
					CDK5/p25	97	97	24	87
CDK5/p35	103	102	41	44
					CDK6/cyclinD3	110	79	23	7
CDK9/cyclinT1	110	107	45	31
					CHK1	121	126	142	149
CHK2	25	5	3	2
					CK1(y)	91	63	37	9
CK1γ1	101	79	50	26
					CK1γ2	92	48	30	12
CK1γ3	98	51	22	15
					CK1δ	75	32	16	12
cKit(D816H)	94	45	14
					CSK	113	113	93	100
cSRC	92	50	27	21
					DAPK1	113	85	49	20
DAPK2	105	88	45	26
					DRAK1	133	40	19	-5
EphA2	124	113	121	52
					EphA8	103	92	29	19
EphB1	92	122	175	161
					ErbB4	132	85	52	27
Fer	55	20	10	1
					Fes	131	106	102	26
FGFR2	116	89	36	4
					Fgr	101	36	10	0
Flt4	74	10	11	4
					Fyn	104	66	42	18
GSK3β	120	99	25	3
					GSK3α	102	81	11	-4
Hck	85	35	17	0
					HIPK2	110	98	75	37
HIPK3	106	102	90	59
					IGF-1R	107	113	129	139
IKKβ	145	118	61	44
					IR	120	108	97	103
IRAK1	129	104	81	36
					JAK3	104	84	17	5
Lyn	97	40	4	2
					MAPK1	91	64	19	17
MAPKAP-K2	99	95	6	8
					MAPKAP-K3	100	99	17	7
MINK	42	10	5	7
					MSK1	114	92	31	9
MSK2	126	61	8	19
					MSSK1	47	11	7	5

 

p70S6K	94	48	19	7
					PAK3	21	18	8	4
PAK5	106	99	42	5
					PAK6	105	94	14	2
PhKγ2	106	60	11	5
					Pim-1	88	35	4	3
Pim-2	104	48	14	6
					PKA(b)	137	113	33	2
PKA	105	109	98	21
					PKBβ	146	102	1	8
PKBα	102	81	18	5
					PKBγ	104	104	12	4
PKCβII	108	108	71	79
					PKCα	100	100	75	83
PRAK	101	53	2	2
					PrKX	92	75	2	3
Ron	135	127	60	69
					Ros	101	99	85	94
Rsk1	34	49	4	0
					Rsk2	96	43	3	4
SGK	111	84	0	3
					SGK2	130	110	2	-4
Syk	95	60	32	17
					TBK1	104	71	45	42
Tie2	94	96	100	35
					TrkA	36	19	8	3
TrkB	95	89	58	3
					TSSK2	102	95	61	48
ZIPK	115	74	20	70

[00144]结果——利用如下列举的典型实例，依据所检测的特定激酶和化合物(表2-8)，通过各种化合物测试的激酶活性呈现出众多不同的调节效应。

[00145]PI3Kδ是一种与自身免疫性疾病(例如，风湿性关节炎和红斑狼疮)密切相关的激酶，MgRho在浓度为10、50和100ug/ml时对该激酶活性的抑制百分比分别为36％、78％和87％。在剂量依赖性方式中MgRho在浓度为10、50和100μg/ml时对Syk的抑制比分别为21％、54％和72％。此外，GSK或糖原合酶激酶(GSK α和β)浸润在mgRho中呈现出的抑制作用如下：在浓度为10、50、00μg/ml时对GSK α和β抑制百分比分别为35、36、87％和35、83、74％)。参见表2。

[00146]THIAA对许多检测激酶活性抑制呈现剂量依赖性关系，在浓度为1、5、25和50μg/ml时对激酶FGFR2的抑制百分比分别为7％、16％、77％和91％。在浓度为1、5、25和50μg/ml时对激酶FGFR3(0％、6％、61％和84％)和TrkA(24％、45％、93％和94％)观测到类似的结果。参见表3。

[00147]所检测的合金欢属提取物(尼罗)对所测酶活性(表4)表现出的抑制作用最强，对以下酶活性呈现出80％或更高的抑制比：Syk(98％)、Lyn(96％)、GSK3α(95％)、Aurora-A(92％)、Flt4(88％)、MSSK1(88％)、GSK3β(87％)、BTK(85％)、PRAK(82％)和TrkA(80％)，所有结果均在合金欢属提取物浓度为1μg/ml时进行测定。

实施例3

酒花化成分对PI3K激酶活性的影响

[00148]实施例1所示的实验流程及方案可测定酒花中黄腐酚、β酸镁盐、异α酸(Mg-IAA)、四氢异α酸(Mg-THIAA)以及六氢异α酸(Mg-HHIAA)等化学成分对人类PI3K-β、PI3K-γ和PI3K-δ激酶的抑制作用。另外还可测定金合欢属尼罗的心材提取物。所有化合物的测试浓度均为50μg/ml。测试结果如图3所示。

[00149]需要指出的是，所有被测酒花化合物对PI3K激酶活性均显示大于50％的抑制百分比，利用Mg-THIAA可产生最大全面抑制作用(对所有被测PI3K激酶亚型的抑制百分比大于80％)。进一步注意到黄腐酚和Mg-β酸对PI3K-γ激酶的抑制百分比均高于对PI3K-β或PI3K-δ的抑制百分比。Mg-IAA对PI3K-β激酶的抑制百分比大约是PI3K-γ或PI3K-δ的3倍。金合欢属尼罗的心材提取物可促进对PI3K-β或PI3K-δ激酶的活性。实验中以Syk和GSK激酶进行实验所得结果作为比较(数据未给出)。

实施例4

受酒花化合物及其衍生物刺激和未受刺激的小鼠巨噬细胞PGE ₂ 激酶的合成抑制

[00150]本实施例的目的是在小鼠RAW 264.7巨噬细胞模型中，分析酒花化合物衍生物对PGE₂激酶COX-2合成抑制相对于COX-1合成抑制的优先程度。RAW 264.7细胞系是公认用以评估试剂抗炎症活性的典型细胞系。使用细菌脂多糖刺激RAW 264.7细胞会诱导COX-2的表达和PGE₂的生成。PGE₂的合成抑制可用来衡量试剂的抗炎症活性。实验装置、化学药品和试剂，以及PGE2的活性分析和相关计算描述如下。

[00151]实验装置—本实施例中所用实验装置包括OHAS E01140型分析天平、Forma F1214型生物安全柜(Marietta，Ohio)、0.1至100μl的各种移液管(VWR，Rochester，NY)、手动细胞计数器(VWR产品目录号23609-102，Rochester，NY)、Forma F3210型CO₂培养箱(Marietta，Ohio)、血细胞计数器(Hausser 1492型，Horsham，PA)、Leica DM IL型倒置显微镜(Wetzlar，Germany)、PURELAB Plus水冲刷系统(U.S.Filter，Lowell，MA)、4℃恒温冰箱(Forma F3775型，Marietta，Ohio)、旋涡混合器(VWR产品目录号33994-306，Rochester，NY)和37℃恒温水浴槽(Shel Lab 1203型，Cornelius，OR)。

[00152]化学药品和试剂—细菌脂多糖(LPS；B E.coli 055：B5)由Sigma公司(St.Louis，MO)购得。热灭活胎牛血清(FBS-HI产品目录号35-011CV)、达尔伯克氏改良Eagle培养基(DMEM产品序列号10-013CV)由Mediatech公司(Herndon，VA)购得。从Betatec酒花制品(Washington，D.C.，U.S.A.)中得到的酒花馏分为(1)α酒花(1％α酸，AA)；(2)香型酒花OE(10％β酸和2％异构α酸)；(3)异构酒花(异构α酸，IAA)；(4)β酸溶液(β酸BA)；(5)金牌六氢异构酒花(六氢异构α酸，HHIAA)；(6)还原异构酒花(还原异构α酸，RIAA)；(7)四氢异构酒花(四氢异构α酸，THIAA)；(8)酒花残留。将酒花残留以等体积无水乙醇萃取两次。然后通过在40℃加热除掉乙醇，最后仅剩一层厚厚的褐色残留物。将残留物溶解于二甲亚砜中以进行RAW 264.7细胞测试。

[00153]测试材料—实验中使用的是表12所述的酒花衍生物；实验中使用COX-1选择性抑制剂阿司匹林和COX-2选择性抑制剂塞来昔步作为阳性对照。阿司匹林由Sigma公司购得(St.Louis，MO)，塞来昔布则使用商品制剂(Celebrex^TM，Searle & Co.，Chicago，IL)。

[00154]细胞培养和测试材料的处理——RAW 264.7细胞，由美国组织细胞培养收集中心(产品目录号TIB-71，Manassas，VA)购得，使用达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Mediatech，Herndon，VA)进行培养并维持在对数生长期。通过向500ml瓶装DMEM中加入50ml热灭活的FBS和5ml青霉素/链霉素以制备DMEM生长培养基，并在4℃下恒温贮存，生长培养基使用前需在水浴中加热至37℃。

[00155]对于COX-2相关的PGE2合成实验，需从首日制备的细胞板的每个孔中移去100μl培养基，并代之以100μl相当于2X最终浓度的待测化合物。然后将细胞培育90分钟。向每孔待激细胞中加入20μl LPS以达到1μg LPS/ml的最终浓度，并将细胞培育4h。接着将细胞在5μM的花生四烯酸中进一步培育15min。从每孔中抽取25μl培养基上清液并转移至干净的离心管中，以测定培养基中PGE2的释放量。

[00156]对于COX-1相关的PGE2合成实验，需从首日制备的细胞板每个孔中移去100μl培养基，并代之以100μl相当于2X最终浓度的待测化合物。然后将细胞培育90分钟。下一步，在不进行LPS刺激的情况下，直接将细胞在100μM的花生四烯酸中培育15min。从每孔中抽取25μl培养基上清液并转移至干净的离心管中，以测定培养基中PGE₂的释放量。

[00157]观察细胞表观形貌，并用肉眼分辨其存活率。所有被测化合物在其最高浓度下均未观察到明显毒性。从每孔中抽取25μl培养基上清液并转移至干净的离心管中，以测定培养基中PGE₂的释放量。前述PGE₂的测定和报道如下。

[00158]PGE₂活性分析—本实验采用商业化的非放射性流程对PGE₂进行定量分析(Caymen Chemical，Ann Arbor，MI)，实验完全按生产商的推荐流程进行，未进行任何更改。简而言之，将25μl培养基连同一系列PGE₂标准样品的稀释样，与适量的乙酰胆碱酯酶标记的示踪剂及PGE2抗血清进行混合，并在室温下培育18h。在清空孔洞并用洗涤缓冲液漂洗后，加入200μl含乙酰胆碱酯酶底物的埃尔曼氏试剂。然后在慢速振动筛上室温反应1h并用Bio-Tek Instruments公司的酶标仪(Elx800型，Winooski，VT)测定其在415nm处的吸光度。PGE₂浓度以皮克每毫升表示。对此活性分析的生产商主要技术参数包含<10％的板间变异系数，低于1％的PGD₂和PGF₂交叉反应，以及0-1000pg ml^-1的线性范围。由COX-2和COX-1进行PGE₂合成的半数抑制浓度(IC₅₀)，其计算如下所示。

[00159]计算—PEG2合成的半数抑制浓度(IC₅₀)可通过CalcuSyn(BIOSOFT，Ferguson，MO)软件包进行计算。计算中使用每一测试材料或阳性对照的四种浓度中的最小值。这个统计软件包使用T.C Chou和P.Talalay所述的中值效应法完成多种药物剂量效应的计算，[Chou，T.C.和P.Talalay.剂量效应关系的定量分析；多种药物或酶抑制剂的综合效应。Adv Enzyme Regul 22：27-55，(1984)]，这里以引用的方式并入本文。实验须在三个不同的时间段重复进行三次。每种剂量的抑制率均采用三组独立实验后取平均值的方法获得，并可用以计算已报道的半数抑制浓度。

[00160]半数抑制浓度可随意分成以下四类：(1)IC₅₀值在0.1-0.3μg/ml范围内的试剂具有最强抗炎反应；(2)IC₅₀值在O.7-1.0μg/ml的试剂具有高度抗炎反应；(3)IC₅₀值在2-7μg/ml的试剂具有中度抗炎反应；(4)IC₅₀值大于12μg/ml(所测最大浓度)的试剂具有低抗炎反应。

[00161]结果—阿司匹林和塞来昔布的阳性对照证明了它们在此模型体系中各自的环氧合酶选择性(表9)。阿司匹林对COX-1的选择性接近1000倍，而塞来昔布对COX-2的选择性也达114倍。所有酒花原料都具有COX-2选择性，其中ρ-异α酸和异α酸已证实对COX-2具有最高选择性，分别为363倍和138倍。在低的半数抑制浓度下具有如此高的COX-2选择性，这在其它资源获得的天然产物的有关报道中还从未出现过。在剩余的酒花衍生物中，只有香型酒花精油呈现出微弱的COX-2选择性，仅为3倍。为了推测临床疗效的体外数据，通常假设当COX-2的选择性达到5倍或以上时，就表明具有显著保护胃粘膜层的临床应用潜力。基于这种标准，β酸，CO₂酒花提取物，酒花残留CO₂/乙醇，四氢化异α酸和六氢化异α酸都显示出在临床上潜在的COX-2相关选择性。

表9

酒花馏分及其衍生物在RAW264.7细胞中对COX-2和COX-1的抑制作用

实施例5

由受LPS刺激的RAW264.7细胞中还原异α酸或异构化α酸所导致的PGE ₂ 直接 抑制不足

[00162]本研究的目的是为了评估酒花衍生物还原异α酸和异构化α酸作为COX-2调节PGE2生物合成的直接抑制剂，分别作用在RAW264.7细胞炎症模型中的能力。本例中也使用了例4中所述的RAW264.7细胞系。实验装置、化学药品及试剂，以及PGE₂的活性分析和相关计算均参见例4所述。

[00163]测试材料—本实验使用表12中所示的酒花衍生物还原异α酸和异构化α酸。阿司匹林，从Sigma(St.Louis.MO)公司购得，其将作为COX-1选择性的阳性对照。

[00164]细胞培养和养试材料的处理—RAW 264.7细胞(TIB-71)，从美国组织细胞培养收集中心(Manassas，VA)购得，并按例4中所述进行传代培养。在温度为37℃，CO2浓度5％的培育条件下培育一整夜后，将培养基吸出并代之以200μl不加FBS或青霉素/链霉素的DMEM培养液。用LPS刺激RAW 264.7细胞，并过夜培养以诱导COX-2的表达。施加LPS-刺激18小时后，将测试材料加入到培养基中。60分钟后再加入钙离子载体A23187。将测试材料溶解在二甲亚砜中以制成250倍稀释的原液。先向1ml DMEM培养液中加入4μl这种250倍稀释后的测试材料制剂，随后向细胞板上的八个孔中针对测试材料所需的不同剂量添加200μl的这种溶液。30分钟后，抽取培养基上清液作为样品并进行PGE₂测定。半数抑制浓度是根据例4中描述的两组独立实验所得的四个浓度中的最小值进行计算的。

[00165]PGE₂测定—本实验采用商业化的非放射性流程对PGE₂进行定量分析(Caymen Chemical，Ann Arbor，MI)，实验完全按照例4中所述生产商的推荐流程进行，未进行任何更改。

[00166]细胞存活率—通过在显微镜下进行细胞观察评估细胞的存活率，这一步骤应在对培养基采样进行PGE₂活性分析之前或紧随其后进行。在任何测试浓度下均未观察到明显的细胞死亡。

[00167]计算—使用CalSyn(BIOSOFT，Ferguson，MO)软件包，根据0.10、1.0、10和100μg/ml四种浓度测得的相关数据，得出剂量反应曲线并计算置信区间为95％时的半数抑制浓度(IC50s)。

[00168]结果—受LPS刺激的RAW264.7细胞中PGE2的产量与未受刺激的细胞相比，比值为1.4-2.1倍。阿司匹林阳性对照计算出的8.7μg/ml的半数抑制浓度(95％置信区间＝3.9-19)与已报道的COX-2直接抑制值1.4到50μg/ml[Warner，T.D.等人[非甾体类药物对环氧化酶-1而非环氧化酶-2的选择性与人胃肠毒性有关：体外全面分析Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：7563-7568，(1999)]以及该实验室关于A549细胞系历史数据3.2μg/ml(95％置信区间＝0.55-0.19)相一致。

[00169]当向受LPS刺激的RAW264.7细胞中加入以下COX-2诱导物时，RIAA和IAA对PGE2只产生与剂量相关的普通抑制作用。测试材料浓度增加1000倍时，所观察到的RIAA和IAA的抑制率仅分别增加14％和10％。剂量反应曲线斜率的变缓导致RIAA(36mg/ml)和IAA(>1000mg/ml)的IC50值(表10)均在mg/ml范围内。实验中观察到的对以上三个对数单位剂量反应的极小变化，表明在此细胞基活性分析中所观察到的酒花衍生物PEG2抑制影响，可能只是对细胞的一个次要影响，而不是对COX-2的酶活性的直接抑制作用。

[00170]图4A和图4B分别描述了RIAA和IAA  (白色柱)以及本例(灰色柱)的剂量反应数据。加样顺序造成的影响非常明显，该结果支持了RIAA和IAA不是COX-2酶直接抑制剂的推断。

[00171]看来：(1)在所有经过体外抑制PGE₂生物合成能力评估测试的天然产品中，酒花材料具有最高的抗炎活性；(2)基于RIAA和IAA对COX-2诱导的抑制形式，可知它们似乎并不是COX-2酶的直接抑制剂；(3)RIAA和IAA对COX-2的选择性似乎是基于对COX-2表达的抑制，而非COX-2的酶抑制。该选择性不同于塞来昔布，塞来昔布的选择性是基于酶的分化抑制。

表10

施加LPS刺激过夜后加入测试材料时，RIAA和IAA在RAW 264.7细胞中的半数抑 制浓度。

 

测试材料	IC50[μg/ml]	95％置信区间[μg/ml]
RIAA	36,000	17,000-79,000
			IAA	>1,000,000	-
			阳性对照	IC50[μg/ml]	95％置信区间[μg/ml]
			阿司匹林	8.7μg/ml	3.9-19

用LPS刺激RAW 264.7细胞，并过夜培养以诱导COX-2的表达。施加LPS-刺激18小时后，将试验材料加入到培养基中，60分钟后再加入钙离子载体A23187。30分钟后，抽取培养基上清液作为样品并进行PGE₂测定。半数抑制浓度是根据例4中描述两组独立实验中分别在四个浓度下重复测定八次所得的最小值进行计算的。

实施例6

酒花化合物及其衍生物并不是A549肺上皮细胞中环氧化酶的直接抑制剂。

[00172]化学药品—本实施例中所使用的酒花及酒花衍生物如前面实施例4所述。其它所有化学品均从实施例4所述的供应商处购得。

[00173]实验装置、PGE2的活性分析，以及相关计算在实施例4中均有描述。

[00174]细胞—A549(人肺上皮)细胞购自美国组织细胞培养收集中心(Manassas，VA)，并根据供应商提供的使用说明进行传代培养。将这些细胞在37℃，5％CO2的培养环境中进行常规培养，所用培养液RPMI1640含10％FBS、50单位青霉素/ml、50μg链霉素/ml、5mM丙酮酸钠和5mM L-谷氨酸盐。实验当天，收集以指数生长的细胞，并用不含血清的RPMI1640培养液冲洗。

[00175]向一个96孔组织培养盘的每孔中加入8 x 10⁴个对数期A549细胞，并加入0.2ml的生长培养基。而关于待测化合物对PGE₂抑制作用的测定，则将完全按照Warner等人的实验流程[非甾体类药物对环氧化酶-1而非环氧化酶-2的选择性与人胃肠毒性有关：体外全面分析。Proc Natl Acad Sci U S A 96，7563-7568，(1999)]进行，未作任何修改，该流程也称WHMA-COX-2方案。简而言之，在植入A549细胞24小时后，加入白细胞介素-1β(10ng/ml)以诱导COX-2的表达。24小时后，用不含血清的RPMI 1640培养液出冲洗细胞。随后，将溶于二甲亚砜和不含血清的RPMI中的测试材料加入孔中以获得25、5.0、0.5和0.05μg/ml的最终浓度。每个浓度重复两次。向对照孔中加入与测试孔中液体等体积的二甲亚砜。60分钟后，将A23187(50μM)加入孔中以释放花生四烯酸。30分钟后从孔中取出25μl培养基进行PGE₂测定。

[00176]用肉眼评估细胞的存活率，结果所有被测试的化合物在其最高浓度下均未观察到明显毒性。培养基上清液中PGE2测定及报道如前面实施例4所述，PGE2合成半数抑制浓度(IC50)的计算如前面实施例4所述。

[00177]结果—在所有已测试的剂量下，该试验方案未能得到任何酒花提取物或衍生物的半数有效浓度。由于该方案要求对COX-2的表达刺激应在加入测试化合物之前进行，我们相信测试材料未能抑制PGE2合成的原因是它们的作用机理是抑制COX-2同工酶的表达，而不是直接活化。既然一些直接抑制作用是通过WHMA-COX-2方案观察到的，该流程似乎不适合对酒花或酒花衍生物的抗炎特性进行评估。

实施例7

酒花衍生物抑制尘螨过敏原对A549肺上皮细胞中PGE ₂ 生物合成的活化

[00178]化学药品—本实施例中所用的酒花及酒花衍生物如实施例1所述，(1)α酒花(1％α酸，AA)；(2)香型酒花OE(10％β酸和2％异构α酸)；(3)异构酒花(异构α酸，IAA)；(4)β酸溶液(β酸BA)；(5)金牌六氢异构酒花(六氢异构α酸，HHIAA)；(6)还原异构酒花(还原异构α酸，RIAA)；(7)四氢异构酒花(四氢异构α酸，THIAA)。其它所有化学品均从实施例4所述的供应商处购得。测试材料的最终浓度为10μg/ml，尘螨过敏原应在测试材料加入60分钟后加入。

[00179]实验装置、PGE₂的活性分析，以及相关计算在实施例4中均有描述。

[00180]螨尘过敏原分离—粉尘螨是美国室内的尘螨。粉尘螨在室温及75％湿度条件下饲育，所用饲料是Purina Laboratory Chow(Ralston Purina，Co，St.Louis，MO)和弗莱希曼氏颗粒状干酵母(Standard Brands，Inc.New York，NY)以1：1的比例进行配制的。当活螨虫从培养基中迁出时，将其从培养瓶中吸出冷冻杀死，然后制成干粉并在0％湿度条件下贮存。在室温下用水萃取螨尘的过敏原成分。将500mg螨粉加入到装有5ml水(1：10w/v)的15ml的圆锥形离心管(VWR，Rochester，NY)中，振摇1分钟并在室温中静置过夜。次日，将水相用0.2μm一次性注射式过滤器(Nalgene，Rochester，NY)过滤。滤液称为螨尘过敏原，用于在A549肺上皮细胞中对PGE₂生物合成进行诱导测试。

[00181]细胞培养和处理—将人气管上皮细胞系A549细胞系(美国组织细胞培养收集中心，Bethesda，MD)按实施例6所述进行培养和处理。将螨尘过敏原加入到培养基中并达到1000ng/ml的最终浓度。18小时后，对培养基取样并进行PGE₂测定。

[00182]结果—表11所示是酒花衍生物对受螨尘过敏原刺激的A549肺细胞中PGE₂生物合成的抑制程度。所有经测试的酒花衍生物均能显著抑制螨尘过敏原的刺激效应。

表11

酒花衍生物对受螨尘过敏原刺激的A549肺上皮细胞中PGE ₂ 的抑制

 

测试材料	PGE2抑制百分比
		α酒花	81
香型酒花OE	84
		异酒花(IAA)	78
β酸(BA)	83
		六氢异构酒花(HHIAA)	82
还原异构酒花(RIAA)	81
		四氢异构酒花(THIAA)	76

[00183]本实施例表明酒花衍生物能抑制螨尘过敏原对A549肺细胞中PGE₂的刺激效应。

实施例8

还原异α酸对COX-2直接抑制作用的缺失

[00184]本实施例旨在确定镁还原异α酸能否作为COX-2酶活性的直接抑制剂。

[00185]材料—待测化合物均在二甲亚砜(DMSO)中进行配制，并在-20℃条件下贮存。LPS从Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)购得。MgRIAA由Metagenics公司供应(San Clemente，CA)，塞来昔布则使用商品化制剂(Celebrex^TM，Searle & Co.，Chicago，IL)。

[00186]细胞培养—小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购自美国组织细胞培养收集中心(马纳萨斯，美国维吉尼亚州)，并根据供应商的使用说明进行培养。细胞在96孔细胞板中以每孔8 x 10⁴的细胞密度进行传代培养，以使其在2天左右的时间达到90％的富集。将LPS(1μg/ml)或PBS单独加到细胞培养基中，并培育12小时。将培养基从孔中移除并向孔中添加溶于二甲亚砜和无血清RPMI培养液中的LPS(1μg/ml)及待测化合物，以得到最终浓度分别为20、5.0、1.0和0.1μg/ml的MgRIAA和最终浓度为100、10、1和0.1ng/ml的塞来昔布。每个浓度都要重复测试8次。将细胞与待测化合物一起培育1小时后，移除细胞培养基，用含待测化合物和LPS(1μg/ml)的新鲜培养基替代，继续培育1小时。然后将培养基从孔中移除并进行PGE₂合成分析。

[00187]PGE₂分析—本实验采用商业化的非放射性流程对PGE₂进行定量分析(Cayman Chemical公司，安娜堡，美国密西根州)。将样品在EIA缓冲液中稀释10倍，并完全按制造商的推荐流程进行操作，未作任何修改。PGE₂浓度以皮克每毫升表示。对此活性分析的生产商主要技术参数包括板间变异系数<10％，与PGD₂和PGF₂交叉反应低于1％，以及线性范围在0-1000pg ml^-1之间。

[00188]COX-2的特异抑制剂塞来昔布对COX-2介导的PGE₂合成存在剂量依赖的抑制作用(100、10、1以及0.1ng/ml)，而MgRIAA对PGE₂未观察到显著的抑制作用。数据显示MgRIAA并非COX-2的酶直接抑制剂(图5)，这点和MgRIAA不同。

实施例9

MgRIAA对iNOS和COX-2蛋白表达的抑制作用

[00189]用MgRIAA处理RAW 264.7细胞的细胞提取物并用LPS施加刺激，之后通过免疫印记法对其中的iNOS和COX-2蛋白进行分析。

[00190]材料—待测化合物在二甲亚砜(DMSO)中配制，并在-20℃温度下贮存。MgRIAA购自Metagenics公司(圣克莱门特，美国加州)。小白菊内酯购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国密苏里州)。PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002购自EMD Biosciences公司(圣地亚哥，美国加州)。对应COX-2和iNOS的抗体购自Cayman Chemical公司(安娜堡，美国密西根州)。对应GAPDH的抗体购自Novus Biological公司(利特尔顿，美国科罗拉多州)。与辣根过氧化物酶发生结合的二级抗体购自Amersham Biosciences公司(皮斯卡塔韦，美国新泽西州)。

[00191]细胞培养—小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购自美国组织细胞培养收集中心(马纳萨斯，美国维吉尼亚州)，并根据供应商的使用说明进行培养。细胞在24孔细胞板中以每孔3 x 10⁵的细胞密度生长并传代培养，以使其在2天左右的时间达到90％的富集。将待测化合物加到无血清培养基的细胞中，最终浓度为0.4％DMSO。用待测化合物培育1小时后，将LPS(1μg/ml)或磷酸盐缓冲生理盐水单独加到细胞孔中，并继续培育到指定时间。

[00192]免疫印迹—在缓冲液E中配制细胞提取物(50mM HEPES，pH7.0；150mM氯化钠；1％ triton X-100；1mM原钒酸钠；抑肽酶5μg/ml；抑肽素A1μg/ml；亮肽素5μg/ml；苯甲基黄酰氟1mM)。简而言之，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)润洗细胞2次后加入缓冲液E。将细胞刮入一个干净的试管中，接着以每分钟14，000转的转速在4℃条件下离心作用10分钟，并将上清液取出作为全部的细胞提取液。用细胞提取物(50μg)在预制的4％-20％三羟甲基氨基甲烷盐酸盐标准凝胶(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，美国加州)中做电泳，直至染色泳移前沿到达胶底部有5mm处为止。使用Bio-Rad公司(赫拉克勒斯，美国加州)的半干系统将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后用5％的干奶粉在室温下对膜进行1小时的冲洗和封闭。用第一抗体在室温下培育1小时后，再用第二抗体在室温培育1小时。通过将等体积的鲁米诺/增强剂溶液和稳定的过氧化物溶液在室温下培育5分钟的方法，使用Pierce Biotechnology公司(罗克福德，美国伊利诺斯州)的SuperSignal West Femto最大敏感性基质便可进行化学发光。用冷却的CCD 

(罗彻斯特，美国纽约州)IS1000成像系统拍摄免疫印记的图像。使用

软件运行密度仪。

[00193]用免疫印记检测法对COX-2和iNOS蛋白表达的百分比进行评估。用LPS刺激20小时后观察COX-2的表达。同对照溶剂DMSO相比，可观察到使用MgRIAA时COX-2蛋白的表达下降了55％(图6)。NF-kB的特异性抑制剂小白菊内酯，会抑制22.5％的蛋白表达，而PI3-激酶抑制剂会使COX-2表达降低约47％(图6)。此外，用MgRIAA施加20小时的LPS刺激后，能观察到iNOS的蛋白表达下降了73％(图7)。

实施例10

NF-κB的核转位与DNA结合

[00194]通过MgRIAA对RAW264.7细胞的核提取物进行处理，再用LPS刺激4小时后分析NF-κB与DNA的结合情况。

[00195]材料—待测化合物在二甲亚砜(DMSO)中配制，并在-20℃温度下贮存。MgRIAA购自Metagenics公司(圣克莱门特，美国加州)。NF-kB活化的特异性抑制剂小白菊内酯，购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国密苏里州)。PI3K抑制剂LY294002购自EMDBiosciences公司(圣地亚哥，美国加州)。

[00196]细胞培养—小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购自美国组织细胞培养收集中心(马纳萨斯，美国维吉尼亚州)，并根据供应商的使用说明进行培养。细胞在6孔细胞板中以每孔1.5 x 10⁶的细胞密度进行传代培养，以使其在2天左右的时间达到90％的富集。将待测化合物MgRIAA(55和14  g/ml)、小白菊内酯(80μM)和LY294002(25μM)加到无血清培养基的细胞中，最终浓度为0.4％DMSO。用待测化合物培育1小时后，将LPS(1μg/ml)或PBS单独加到细胞培养基中，并继续培育4个小时。

[00197]NF-κB-DNA结合—核提取物的准备基本上根据Dignam等人的描述进行[Nucl Acids Res 11：1475-1489，(1983)]。简单来讲，先将细胞用冷PBS液润洗两次，然后加入缓冲液A(10mM HEPES，pH7.0；1.5mM MgCl₂；10mMKCl；0.1％NP-40；抑肽酶5μg/ml：胃酶抑素A1μg/ml；亮肽酶素5μg/ml；氟化磺酰甲苯1mM)并进行15分钟的冰浴。然后将细胞刮入一个干净的试管中，并循环冷冻与解冻三次。在4℃下10000xg加速度下离心5min所得上清液层即为细胞质的组分。将剩余物重新悬浮在缓冲液C(20mM HEPES，pH7.0；1.5mM KCl；420mM KCl；25％甘油；0.2M EDTA；抑肽酶5μg/ml；胃酶抑素A1μg/ml；亮肽酶素5μg/ml；氟化磺酰甲苯1mM)中，并进行15分钟的冰浴。在4℃下10000xg加速度下离心5min后收集上层核提取物组分。细胞核提取物的NF-kB DNA结合分析使用Active Motif公司(卡尔斯巴德，美国加州)的TransAM NF-κB试剂盒并按照生产商的使用说明来完成。如图8所示，TransAM测试盒检测96孔细胞板上结合到共有序列上的NF-κB的p50亚基。然后测定蛋白质浓度(Bio-Rad assay公司)并重复分析10μg核蛋白提取物。

[00198]重复进行核提取物(10μg蛋白质)的分析并将结果以图9所示的图形表现出来。LPS(1μg/ml)的刺激会使NF-κB基因结合率增加两倍。用LY294002(一种PI3激酶抑制剂)进行处理会导致NF-κB结合率降低，这和以往文献的报道相符。小白菊内酯也能导致NF-κB结合率显著降低，这点和我们的预期是一致的。使用MgRIAA时也能观察到NF-κB的结合率大幅降低。以剂量反应的方式也能观察到这一影响。NF-κB结合力的降低可能导致包括COX-2、iNOS以及TNFα在内的目标基因翻译活性降低。

[00199]本实验结果显示使用MgDHIAA所观察到的NF-κB结合率下降可能会导致COX-2蛋白表达下降，并最终导致PGE2产量的降低。

实施例11

金合欢属植物树皮水合提取物的二甲亚砜可溶成分诱发的3T3-L1脂肪细胞脂肪生成 增加。

[00200]模型—本实验使用3T3-L1小鼠成纤维细胞模型来研究脂肪细胞分化和脂肪生成过程中化合物的潜在影响。这个细胞系使人们可分别研究控制前成脂肪细胞的复制与控制前成脂肪细胞分化到脂肪细胞的动因和机理[Fasshauer，M.，Klein，J.，Neumann，S.，Eszlinger，M.，以及Paschke，R.3T3-L1脂肪细胞内脂联素基因表达的激素调节，Biochem Biophys Res Commun，290：1084-1089，(2002)；Li，Y.与Lazar，M.A.PPARγ激动剂和组成性激活突变型PPARγ2的区别性基因调节，Mol Endocrinol，16：1040-1048，(2002)]，人们还可对试剂的胰岛素增敏和甘油三酸脂沉降能力进行研究。

[00201]3T3-L1前成脂肪细胞和成纤维细胞在外观上十分类似。它们在培养基中不断中直至融合为一层，之后细胞与细胞的接触会引发G₀/G₁期的生长抑制。3T3-L1细胞能否最终分化为脂肪细胞取决于在融合之前和融合之后前成脂肪细胞的增殖。随后用3-异丁基-1-甲基黄原胶、地塞米松、高剂量胰岛素(MDI)对这些细胞施加两天的刺激，以促使这些细胞进行融合后的有丝分裂复制扩增，脱离细胞周期并开始表达脂肪细胞特异性基因。诱导分化大约五天后，超过90％的细胞会显示特有的充满脂质的脂肪细胞表型。对3T3-L1细胞的甘油三酸脂合成进行分析可为试剂的胰岛素增敏能力提供确凿的模型。

[00202]促进脂肪细胞摄取脂肪的试剂能够提高胰岛素敏感性，这看起来似乎是自相矛盾的。人们提出了若干假说，试图解释这种矛盾。继续获得研究支持的一个提案基于“脂肪酸窃取”概念，换言之，由于血浆中的脂肪细胞结合了脂肪酸，从而造成肌肉组织中脂肪酸含量相对匮乏，并引发葡萄糖摄取量的上升。[Martin，G.，K.Schoonjans，等人。PPARgamma催化剂通过刺激脂肪细胞对脂肪酸的摄取来促进体内葡萄糖的动态平衡。Atherosclerosis 137 Suppl：S75-80，(1998)]。噻唑烷二酮类，如曲格列酮和吡格列酮这类药物，已经显示出在脂肪细胞中能选择性刺激脂肪生成活性，从而得到更大的脂肪分解胰岛素抑制或将脂肪酸释放到血浆中[Yamauchi，T.，J.Kamon，等人，杂合过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)缺乏和PPARγ激动剂提高胰岛素抵抗性的机制J Biol Chem 276(44)：41245-54，(2001)；Oakes，N.D.，P.G.Thalen，等人，噻唑烷二酮类药物增加血浆-脂肪组织FFA交换容量并增强胰岛素介导游离脂肪酸体系控制的有效性，Diabetes50(5)：1158-65，(2001)]。该行为使其他组织可利用的游离脂肪酸更少[Yang，W.S.，W.J.Lee，等人.体重减轻会增加脂源型抗炎性蛋白质、脂联素的血浆水平。J Clin Endocrinol Metab 86(8)：3815-9，(2001)]。因此，肌肉和肝脏中游离脂肪酸的胰岛素减感效应将由于噻唑烷二酮处理的结果而减弱。这些体外结果已在临床上得到证实[Boden，G.不饱和脂肪酸在胰岛素抵抗和非胰岛素依赖型糖尿病发病机理中的作用。Diabetes 46(1)：3-10，  (1997)；Stumvoll，M.与H.U.Haring Glitazones：临床效果与分子机制.Ann Med 34(3)：217-24，(2002)]。

[00203]实验材料—曲格列酮购自Cayman化学制剂公司(安娜堡，美国密歇根州)，甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、茚甲新、油红O以及胰岛素购自Sigma公司(圣路易斯，美国密苏里州)。测试材料是一种深褐色粉末，购自Bayir化学制剂公司(南十字星路68号，  Basavanagudi，印度)，它是从金合欢属植物树胶脂第4909号样品的50:50(体积比)水/酒精的提取物中制得的。提取物中儿茶酚含量标准需不低于20％。本例中所用批号为A Cat/2304的提取物经紫外分析儿茶酚含量达20.8％。青霉素、链霉素、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)购自Mediatech(美国弗吉尼亚州赫顿市)公司，而10％FBS-HI(热灭活胎牛血清)购自Mediatech and Hyclone(Logan，UT)公司。所有其它标准试剂，除非另行说明，均购自Sigma公司。

[00204]细胞培养和处理—小鼠成纤维细胞系3T3-L1购自美国组织细胞培养收集中心(马纳萨斯，美国弗吉尼亚州)，并根据供应商的使用说明进行传代培养。实验之前，将细胞在含有10％ FBS-HI，50单位/ml青霉素以及50μm/ml链霉素的DMEM培养液中进行培养，并在实验开始前维持其生长对数期。37℃下细胞在CO2含量5％的加湿培养箱中生长。融合前，培养基的成分包括：(1)葡萄糖含量为4.5g/L的10％ FBS/DMEM；(2)50U/ml的青霉素；(3)50μg/ml的链霉素。通过向500ml DMEM中加入50ml的热灭活FBS以及5ml青霉素/链霉素可制得培养基。将培养基在4℃下贮存。使用前，培养基应在水浴中加热到37℃。

[00205]在24孔细胞板中接种3T3-T1细胞，接种密度为6 x 10⁴个细胞/cm²。细胞经过2天生长后达到融聚。融合后，加入分化培养基迫使细胞向脂肪细胞分化；培养基组成为：(1)10％的FBS/DMEM(高糖)；(2)0.5mM甲基异丁基黄嘌呤；(3)0.5μM地塞米松；(4)10μg/ml的胰岛素(MDI培养基)。三天后，将培养基换成后分化培养基，其组成为10％FBS/DMEM培养基中含10μg/ml胰岛素。

[00206]将AcE部分溶解于二甲亚砜(DMSO)中，在分化0天时加入培养基中使其浓度达到50μg/ml，并在整个成熟期内保持这一浓度(直到第6天或第7天，D6/7)。无论何时加入新鲜培养基，都需要加入新的实验材料。选择DMSO是因为它的极性并且它容易与液态细胞培养基混合的特性。分别加入吲哚美辛和曲格列酮作为阳性对照，二者最终浓度分别为5.0μg/ml和4.4μg/ml。用0.36％的油红0或0.001％氟硼二吡咯对分化后的D6/D7 3T3-L1细胞进行染色。使用实验材料对细胞进行分化和处理的完整流程概述于图10中。

[00207]油红O染色—D6/D7-分化的3T3-L1细胞中甘油三酯含量的估算所用到的油红O染色是根据Kasturi和Joshi的方法[Kasturi，R.and Joshi，V.C.3T3-L1细胞脂肪转化过程中十八酰基辅酶A脱饱和酶活性和脂肪生成的激素调节.J Biol Chem，257：12224-12230，1982]。用PBS(磷酸盐缓冲液，Mediatech)润洗单层细胞，然后用10％甲醛固定10min。将三份0.6％油红O/异丙醇原液与两份水混合得到油红O工作液，并将已固定的细胞在其中染色1小时，然后水洗一次去除过量的染料。用异丙醇从细胞中提取出染色油滴，并使用光谱光度测量技术在540nm波长下对其进行定量分析(MEL312e BIO-KINETICSREADER，Bio-Tek Instruments公司，文奴斯基，美国佛蒙特州)。实验材料和作为阳性对照的吲哚美辛以及曲格列酮的实验结果，以540 nm下溶剂的相对吸光度表示。

[00208]氟硼二吡咯染色—实验中使用4，4-二氟-1，3，5，7，8-五甲基-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-阴丹士(氟硼二吡咯493/503；Molecular Probes公司，尤金，俄勒冈州)对细胞的中性和非极性类脂含量进行定量分析。简而言之，先除去培养基，再用非无菌PBS润洗细胞1次。将1mg氟氮二吡咯溶解于1ml二甲亚砜中制备1000X氟氮二吡咯/二甲亚砜原液(氟氮二吡咯含量1,000μg/ml)。然后向990μl PBS中加入10μl原液，以配制浓度为0.01μg/μl氟氮二吡咯工作液。再向96孔细胞板每孔中加入100μl的工作液(1μg BODIPY)。在室温下于定轨振荡器上(DS-500，VWR公司科技产品，South Plainfield，NJ)上处理15min后，用100μl PBS润洗细胞，之后再加入100μl PBS以对氟氮二吡咯结合细胞的情况进行荧光光谱测定。用Packard公司的Fluorocount荧光分光光度计(BF10000型，马里丹，美国康涅狄格州)对氟氮二吡咯进行荧光定量分析，设置光度计的激发波长为485nm，发射波长为530nm。实验材料、吲哚美辛和曲格列酮的实验结果显示具有相对于溶剂对照的荧光。

[00209]无论是所有中性和非极性脂之间氟氮二吡咯定量关系的卡方分析结果，还是3T3-L1细胞中甘油三酯含量的油红O测定结果都说明二种方法间具有明显的关系(p<0.001，让步比为4.64)。

[00210]统计计算和解析—AcE和吲哚美辛至少应重复分析3次。溶剂和曲格列酮对照也应各重复8次。而非极性脂的结合则表示为相对于溶剂对照中完全分化的细胞非极性脂积累。阳性反应定义为用油红O或BODIPY染色分析时脂积累增加量大于各自溶剂对照的95％置信区间(单尾表，Excel；微软公司，雷德蒙德，美国华盛顿州)。此外，AcE在增加脂肪生成方面还具有大于或等于曲格列酮关于溶剂响应阳性对照的特征；此项评估是用Excel的学生t-测试功能来完成的。

[00211]结果—在3T3-L1细胞中，阳性对照吲哚美辛和曲格列酮诱导脂类的形成程度相似(图11)。然而出乎意料，AcE产生的生脂响应比吲哚美辛和曲格列酮阳性对照都更强。

[00212]3T3-L1细胞中经证实的脂肪形成潜力，以及金合欢属植物第4909号样品水相提取物中易溶于二甲亚砜的化学成份，已证实对胰岛素不敏感的人或其它动物具有增加胰岛素敏感性的应用潜力。

实施例12

通过金合欢属样品水提取物的二甲基亚砜可溶部分诱发抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞内 脂联素分泌的增加。

[00213]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00214]测试材料—曲格列酮购自Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)公司，而甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素购自Sigma(St.Louis，MO)公司。测试材料为一种黑褐色粉末，以50:50(体积比)水/酒精从金合欢属样品#4909的树胶脂提取而来，该材料购自Bayir化学制剂(No.68，South Cross Road，Basavanagudi，印度)公司。提取物中儿茶酚含量标准需不低于20％。本实施例中所用批号为A Cat/2304的提取物经紫外分析儿茶酚含量达20.8％。青霉素、链霉素、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)购自Mediatech(美国弗吉尼亚州赫顿市)公司，而10％FBS-HI(热灭活胎牛血清)购自Mediatech and Hyclone(Logan，UT)公司。所有其它的标准试剂，除非另有说明，均购自Sigma公司。

[00215]细胞培养和处理—小鼠成纤维细胞系3T3-L1培养第6日脂肪细胞开始分化，如实施例10所述。在96孔细胞板中接种3T3-L1细胞，接种密度为1 x 10⁴个细胞/cm。经过两天的生长，细胞实现融合。融合后，加入分化培养基迫使细胞向脂肪细胞分化；培养基组成：(1)10％的FBS/DMEM(高糖)；(2)0.5mM甲基异丁基黄嘌呤；(3)0.5M地塞米松；(4)10g/ml的胰岛素(MDI培养基)。从第3日到第5日，将培养基换成10％FBS/DMEM中含有10μg/ml胰岛素的后分化培养基。

[00216]使用Fasshauer等人描述的流程并进行修改，来测定金合欢属对抗胰岛素、成熟性3T3-L1细胞的影响。[Fasshauer等人3T3-L1脂肪细胞内脂联素基因表达的激素调节。BBRC 290：1084-1089，(2002)]。简而言之，第6日，将细胞在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)无血清的培养基中培养三个小时，接着利用1μg胰岛素/ml加溶剂或1μg胰岛素/ml加测试材料进行处理。将曲格列酮溶解在二甲基亚砜中以获得5、2.5、1.25和0.625μg/ml的浓度。金合欢属提取物测试浓度为50、25、12.5和6.25μg/ml。24小时后，对培养基上清液取样以进行脂联素测定。利用测试材料对细胞进行分化和处理的完整流程概述于图12中。

[00217]脂联素分析——培养基中的脂联素分泌完全采用Mouse Adiponectin Immunoassay测试盒进行定量分析，未作任何修改(R&D系统，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市)。生产商提供的信息指明施加在老鼠细胞培养液中脂联素回收率平均值为103％，而且检测到的最低脂联素浓度范围为0.001到0.007ng/ml。

[00218]  统计计算和解析—所有的分析实验均进行两次。在统计分析上，来计算金合欢属相对于溶剂对照对脂联素分泌的影响。通过采用多重比较的无修改的学生t测试方法确定剂量间的差异；选用标称5％的I型差误概率。

[00219]采用修改的Hofstee方法评估测试材料的效力[Hofstee，B.H.Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics。Nature 184：1296-1298，(1959)]以确定表观米氏常数和最大速度。利用自变量v/[S]替换{相对脂联素分泌/[浓度]}，而利用应变量{v}替换{相对脂联素分泌}，生成一个y＝mx+b的关系式。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算测试材料必要的半最大值处的脂联素分泌浓度。

[00220]结果—在抗胰岛素3T3-L1细胞中，利用2.5μg/ml的浓度，相对溶剂对照2.44倍的最大刺激，作为阳性对照的曲格列酮所有测试浓度增加了脂联素分泌(图13)。50和25μg/ml浓度的金合展属增加了脂联素分泌，分别为溶剂对照的1.76倍和1.70倍。虽然合金欢属的两个浓度均不等于利用曲格列酮测定的脂联素分泌最大值，但是它们可与浓度为1.25和0.625μg/ml曲格列酮作用相当。

[00221]源自修正的Hofstee plots脂联素分泌最大估算值，表明脂联素分泌的相对增加与半最大刺激处的浓度存在巨大差异。利用Y截距方法估算的曲格列酮和儿茶对脂联素分泌最大值分别为溶剂对照的2.29倍和1.88倍。而刺激抗胰岛素3T3-L1细胞中脂联素分泌的半最大值处曲格列酮和金合欢属浓度分别为0.085μg/ml和5.38μg/ml。根据最小的儿茶酚含量20％计算，金合欢属大约为1.0μg/ml。

[00222]由于合金欢属和/或儿茶酚能提高抗胰岛素3T3-L1细胞中脂联素分泌，它们有望对血浆脂联素分泌降低的临床病理学产生积极作用。

实施例13

通过金合欢属样品水提取物的二甲基亚砜可溶部分诱发TNFα-处理的3T3-L1脂肪细 胞内脂联素分泌的增加。

[00223]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00224]测试材料—吲哚美辛、甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素购自Sigma(St.Louis.MO)公司。测试材料是一种黑褐色粉末，以50：50(v/v)水/酒精从金合欢属样品#4909的树胶脂提取而来，购自Bayir化学制剂(No.68，South Cross Road，Basavanagudi，印度)公司。提取物中儿茶酚含量标准需不低于20％。本实施例中所用批号为A Cat/2304的提取物经紫外分析儿茶酚含量达20.8％。青霉素、链霉素、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)购自Mediatech(美国弗吉尼亚州赫顿市)公司，而10％FBS(胎牛血清)购自Mediatech andHyclone(Logan，UT)公司。所有其它的标准试剂，除非另有说明，均购自Sigma公司。

[00225]细胞培养和处理—小鼠成纤维细胞系3T3-L1培养第3日脂肪细胞开始分化，如实施例10所述。在96孔细胞板中接种3T3-L1细胞，接种密度为1 x 10⁴个细胞/cm。经过两天的生长，细胞实现融合。融合后，加入分化培养基迫使细胞向脂肪细胞分化；培养基组成：(1)10％的FBS/DMEM(高糖)；(2)0.5mM甲基异丁基黄嘌呤；(3)0.5M地塞米松；(4)10μg/ml的胰岛素(MDI培养基)。从第3日到第5日，将培养基换成10％FBS/DMEM中含有10μg/ml胰岛素的后分化培养基。第5日，将培养基换成10％FBS/DMEM含有浓度为10、2或0.5ng/ml的TNFα的待测培养基，该培养基中含或不含吲哚美辛或金合欢属提取物。将吲哚美辛溶解在二甲基亚砜中并根据需要添加以获得5、2.5、1.25和0.625μg/ml的浓度。金合欢属提取物测试浓度为50、25、12.5和6.25μg/ml。第6日，对培养基上清液取样以进行脂联素测定。利用测试材料对细胞进行分化和处理的完整流程概述于图14中。

[00226]脂联素分析—培养基中的脂联素分泌完全采用Mouse AdiponectinQuantikine免疫测试盒进行定量分析，未作任何修改(R&D系统，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市)。生产商提供的信息指明施加在老鼠细胞培养液中脂联素回收率平均值为103％，而检测到的最低脂联素浓度范围为0.001到0.007ng/ml。

[00227]统计计算和解析—所有的分析实验均重复进行两次。在统计分析上，计算吲哚美辛或金合欢属相对于溶剂对照对脂联素分泌的影响。对于多重比较使用无修改的学生t测试方法确定剂量和试剂间的差异；选用标称5％的I型差误概率。

[00228]结果—TNFα较大(p<0.05)降低了脂联素分泌，相对于溶剂对照而言，在浓度在10和2ng/ml情况下成熟3T3-L1细胞的降低比分别为65％和29％，而浓度在0.5ng/ml时对脂联素分泌并没有显著影响(图15)。TNFα浓度为10和2ng/ml时，在所有的测试剂量上与仅施加TNFα相比，吲哚美辛的加入提高了(p<0.05)脂联素分泌，但并不能将脂联素分泌恢复到溶剂对照的水平上。TNFα浓度为10ng/ml时，加入金合欢属进行处理与吲哚美辛相比，对脂联素分泌产生一个类似的、很微弱的增加。在逐渐增加的四种剂量上，金合欢属和吲哚美辛之间对脂联素分泌的差值分别为14、20、32和41％。既然金合欢属和吲哚美辛剂量间的倍数是相同的，这些结果表明在上述生理浓度TNFα存在的情况下，在重新恢复3T3-L1细胞脂联素分泌水平方面，吲哚美辛与金合欢属中的活性物质相比具有更高的效力。

[00229]利用2ng TNFα和金合欢属处理3T3-L1细胞，相对于只使用TNFα情况，显著提高了脂联素分泌，浓度为6.25、25和50μg/ml时结果明显(p<0.05)不同。然而，与TNFα浓度为10ng/ml处理结果不同，金合欢属与吲哚美辛间的差值更小，并且与剂量没有显著关系，在以上所有的测试浓度中平均差值为5.5％。与利用吲哚美辛所观察结果类似，金合欢属并不能将脂联素分泌恢复到溶剂对照中所测定的水平上。

[00230]TNFα浓度为0.5ng/ml时，吲哚美辛对脂联素分泌产生剂量依赖性减低，浓度为2.5和5.0μg/ml时效果显著(p<0.05)。有趣的是，与吲哚美辛不同，在浓度为50μg/ml时，相对于TNFα和溶剂处理3T3-L1脂肪细胞，儿茶提高脂联素分泌水平。因此，TNFα浓度接近生理水平时，相对于TNFα和溶剂而言，儿茶提高脂联素分泌水平，并且意外地明显优于吲哚美辛。

[00231]由于合金欢属儿茶和/或儿茶酚能提高TNFα-处理的3T3-L1细胞内脂联素分泌水平，它们有望对TNFα水平提高以及血浆脂联素分泌降低的所有临床病症产生积极作用。

实施例14

各种商业化合金欢属样品增加3T3-L1脂肪细胞模型中脂肪生成。

[00232]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。使用的所有的化学药品和流程如实施例11所述，唯一的不同是对油红0的进行分析以测定儿茶诱发的细胞甘油三酯含量。合金欢属儿茶样品#5669购自Natural Remedies(364，2nd Floor，16th Main，4th T Block Bangalore，Karnataka 560041印度)公司；而样品#4909、#5667和#5668购自Bayir化学制剂(No.10，Doddanna Industrial Estate，Penya II Stage，Bangalore，印度560091卡纳塔克邦)公司。金合欢属尼罗样品#5639，#5640和#5659购自KDN-VitaInternational公司(121 Stryker Lane，Units 4 & 6 Hillsborough，NJ 08844)。样品#5640为一种树皮，样品#5667为树脂胶，而样品#5669为心材粉末。所有的其它样品，除非另有说明，均为金合欢属尼罗专有甲醇提取物。

[00233]结果—检测的所有金合欢属样品均产生积极的脂肪生成反应作用(图16)。最高的脂肪生成反应来自样品#5669心材粉末(1.27)、#5659甲醇提取物(1.31)、#5640 DMSO二甲亚砜提取物(1.29)以及#4909甲醇提取物。

[00234]本实施例还表明金合欢属尼罗中存在多种能正向改变脂肪细胞生理机能以增强胰岛素作用的化合物。

实施例15

各种商业化合金欢属样品增加TNFα-3T3-L1脂肪细胞模型中脂肪生成。

[00235]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用的标准化学药品和细胞处理如实施例11和13所述。利用TNFα对3T3-L1脂肪细胞处理的结果不同于实施例12所述，这是由于细胞仅浸润TNFα浓度为2或10ng/ml溶液中。第6日，对培养基上清液脂联素进行分析如实施例12所述。合金欢属样品#4909、#5639、#5659、#5667、#5668、#5640和#5669制剂如实施例13所述。

[00236]结果—2ng/ml的TNFα相对于溶剂对照降低3T3-L1脂肪细胞中脂联素分泌为27％，而通过1.25μg/ml吲哚美辛刺激的来自TNFα溶剂对照的脂联素分泌最大值为11％(表12)。在测定的四个剂量上，只有金合欢属制剂#5559不能增加脂联素分泌水平。金合欢属的所有其它制剂使脂联素分泌产生比较相当大的增加，范围为10-15％。通过各种金合欢属制剂诱发的脂联素分泌最大值处的浓度差异均观测得到。在浓度为12.5μg/ml时获得脂联素分泌最大值时刺激最强的制剂是#5640，其次是浓度为25μg/ml时的#4909和#5668制剂，最后是浓度为50μg/ml的#5639、#5667和#5669制剂。

表12

TNFα浓度为2ng/ml时，通过各种金合欢属制剂诱发的脂联素分泌最大相对值。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_TNFα对照

*来自TNFα溶剂反应的显著增加(p<0.05)。

[00237]10ng/ml的TNFα相对于溶剂对照降低3T3-L1脂肪细胞中脂联素分泌为54％，而通过5.0μg/ml吲哚美辛刺激的来自TNFα溶剂对照的脂联素分泌最大值为67％(表13)。在最低测试剂量0.625μg/ml时曲格列酮最大增加脂联素分泌值为51％。金合欢属制剂#5559在浓度为25μg/ml时产生最小的显著增加12％(p<0.05)。金合欢属的所有其它制剂在浓度为50μg/ml时使脂联素分泌产生比较相当大的增加，范围为17-41％。相对于TNFα溶剂对照，抑制作用最强的制剂#4909和#5669抑制百分比分别为41％和40％。

表13

TNFα浓度为10ng/ml时，通过各种金合欢属制剂诱发的3T3-L1脂肪细胞脂联素 分泌最大相对值。

脂联素指数_＝[脂联素]_测试/[脂联素]_TNFα对照

*来自TNFα溶剂反应的显著增加(p<0.05)。

[00238]实验观察到不同金合欢属样品或制剂会在这种代谢综合征的第二模型中诱发相似的反应，这进一步证实金合欢属植物中存在多种能正向改变脂肪细胞生理机能以增强胰岛素作用的化合物。

实施例16

极性和非极性溶剂从金合欢属儿茶对能在TNFα/3T3-L1脂肪细胞模型中增加脂联素分 泌的化合物中进行提取。

[00239]模型—这些实验中用到的是实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。实验所用标准化学药品如实施例11和13所述。将3T3-L1脂肪细胞用浓度为10ng/ml的TNFα按实施例13所述方法进行处理。如实施例13详述在第6天时取出培养基上清液并对脂联素进行分析。

[00240]测试材料—使用5/8”金属钻头在标准功率下对大片金合欢属儿茶心材样品#5669(每片重量在5-10克之间)进行低速钻孔。然后将刨花收集到研钵中，在液氮冷冻下研磨至细粉状。然后将粉末通过一个250微米的筛网进行筛分以得到大约10g的自由流动精细粉末。

表14

用于3T3-L1脂联素分析的金合欢属儿茶提取物样品描述

 

提取溶剂	提取物质量	提取百分率
			胃液1二甲亚砜三氯甲烷甲醇/水pH＝295:5水乙酸乙酯	16400.220104	11270.13136.72.7

¹胃液组成为2.90g NaCl、7.0ml浓缩HCl水溶液、3.2g胃蛋白酶(800-2500活性单位/mg)，并加入1000ml水进行稀释。最终pH为1.2。对于本提取操作，胃液-心材悬浮液要在40℃下保温一小时，随后在真空中移除胃液。然后将剩余残留物溶解在甲醇中，通过0.45微米聚四氟乙烯注射式过滤器进行过滤并在真空中浓缩。

[00241]将粉末分配到六个琥珀色玻璃定量瓶中(150mg/瓶)，然后在40℃下用2ml表14中所列溶剂提取大约10小时。提取结束后，将心材/溶剂悬浮液进行离心分离(转速5800xg下离心10分钟)。随后将离心分离所得上清液部分通过0.45微米聚四氟乙烯注射式过滤器过滤到各自的琥珀色玻璃瓶中。每个样品都要在真空中进行浓缩。如表7所示，二甲亚砜从金合欢属儿茶植物心材中提取的原料最多，而三氯甲烷提取的量最少。所有提取物样品均在50、25、12.5和6.25μg/ml浓度下进行测试。

[00242]从

公司(Takeda Pharmaceuticals，林肯郡，美国伊利诺斯州)这样的商业渠道购得吡格列酮片剂并从中获取吡格列酮。片剂被磨碎为细粉状，并在5.0、2.5、1.25、0.625μg/ml浓度下进行测试。实验也使用了吲哚美辛作为附加的阳性对照。

[00243]结果—在TNFα存在下，阳极对照吡格列酮和吲哚美辛分别以115和94％的比例增加脂肪细胞的脂联素分泌(图17)。吡格列酮和吲哚美辛的最佳浓度分别为1.25和2.5μg/ml。所有的金合欢属儿茶样品#5669提取物均能增加有关TNFα处理的脂联素分泌。所有的提取物中，二甲亚砜提取物是最有效的脂联素分泌诱导剂，实验中观察到其活性最大值在提取物浓度6.25/ml时出现。此结果可能由于DMSO具有提取大范围的不同极性原料的能力。对图17的检验显示在TNFα/3T3-L1脂肪细胞模型中，水提取物(极性化合物)和三氯甲烷提取物(非极性化合物)在增加脂联素分泌上具有相似的能力。而这些提取物不大可能含有相似的化合物。本实施例说明不同极性的溶剂均能够从金合欢属儿茶心材中提取那些可从前炎症性刺激存在下的脂肪细胞中增加脂联素分泌的化合物。

实施例17

在TNFα/3T3-L1脂肪细胞模型中金合欢属儿茶酸性和碱性成分能够增加脂联素分泌。

[00244]模型—这些实验中用到的是实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。实验所用的标准化学药品如实施例11和13所述。将3T3-L1脂肪细胞用浓度为10ng/ml的TNFα按实施例13所述方法进行处理。如实施例13详述在第6天取出培养基上清液并对脂联素进行分析。

[00245]测试材料—金合欢属儿茶样品#5669根据以下流程进行提取：将碱性异丙醇溶液，  (含有1.5N NaOH的1％(体积比)异丙醇溶液，)加入到装有约50mg干燥金合欢属儿茶心材粉末#5669的50ml试管中。然后将样品简单混合处理，超声降解30分钟，再离心分离一个小时使剩余固体材料成粒。随后将上清液用0.45微米滤纸进行过滤。实验中用到的碱性异丙醇pH为8.0，收集液的pH为7.0。将过滤后的清液部分在真空中进行干燥后得到白色固体。该样品称为干燥碱性提取物。

[00246]将剩下的粒状材料置于红色的酸性异丙醇溶液(含10％HCl的1％(体积比)异丙醇溶液)中生长。搅动样品直至粒状材料充分分散到液体中，然后离心分离30分钟使剩余固体材料成粒。将浅黄色上清液通过0.45微米滤纸进行过滤。收集液的pH为3.0，若将样品pH提高到8-9，则会有红棕色沉淀形成(干燥沉淀)。将沉淀收集并干燥，得到红棕色固体。将上清液再次通过0.45微米过滤器以去除任何残余沉淀；此时上清液呈深黄色。将剩余液体干燥，得到棕色固体样品，该样品称为干燥酸性提取物。以上三部分回收物列于表15中。所有测试材料均在50、25、12.5及6.25ug/ml浓度下进行分析，而阳性对照吡格列酮则在5.0、2.5、1.25及0.625μg/ml浓度下进行测试。

表15

从金合欢儿茶心材粉末回收的测试材料

 

测试材料	收集到的质量mg(金合欢儿茶样品#5669)
		干燥碱性提取物	0.9(1.8)
干燥沉淀	1.2(2.4)
		干燥酸性提取物	1.5(3.0)

[00247]结果：相对于溶剂对照，TNFα能使脂联素分泌减少46％；在浓度为1.25μg/ml时，使用吡格列酮处理后脂联素分泌的最大恢复测定值是TNFα处理后数值的1.47倍(表16)。在测试材料中，只有干燥沉淀不能增加脂联素分泌方面超过TNFα单独对照。在TNFα存在时，酸性提取物和心材粉末(起始原料)在增加脂联素分泌的能力上十分类似，而碱性提取物只能在50μg/ml的高浓度下增加脂联素分泌。

表16

在TNFα/3T3-L1模型中使用超过四种剂量所诱导的最大脂联素分泌。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_TNFα对照

值>1.11与TNFα对照(p<0.05)存在显著性差异。

实施例18

通过金合欢属样品水提取物的二甲亚砜可溶部分诱导TNFα-处理的3T3-L1脂肪细 胞内白细胞介素-6分泌的减少。

[00248]白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞激素，在宿主防御、急性期反应、免疫反应、神经细胞功能、造血作用以及代谢综合征方面均发挥重要作用。它可被多种正常和变异淋巴细胞及诸如脂肪细胞的非淋巴细胞表达。IL-6的产量可通过诸如细胞分裂激素或抗原刺激、脂多糖、钙离子载体、细胞激素以及病毒等多种信号进行上调[Hibi，M.，Nakajima，K.，Hirano T.IL-6细胞激素族和信号转导：细胞激素系统模型。J Mol Med.74(1)：1-12，(Jan 1996)]。人们已经在包括细菌和病毒感染、外伤、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及代谢综合征等若干病理状态中观察到这种血清浓度水平的提高[Arner，P.II型糖尿病中的胰岛素抵抗——脂肪素的作用。Curr Mol Med.；5(3)：333-9，(May 2005)]。

[00249]模型—这些实验中使用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。实验所用的标准化学药品如实施例11和13所述。将3T3-L1脂肪细胞用浓度为10ng/ml的TNFα按实施例13所述方法进行处理。如实施例13详述在第6天取出培养基上清液并对脂联素进行分析。

[00250]测试材料—吲哚美辛、甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素购自Sigma(St.Louis.MO)公司。测试材料为一种黑褐色粉末，以50:50(体积比)水/酒精从金合欢属儿茶样品#4909的树胶脂中提取而来，该材料购自Bayir化学制剂(No.68，South Cross Road，Basavanagudi，印度)公司。提取物中儿茶酚含量标准需不低于20％。本实施例中所用批号为A Cat/2304的提取物经紫外分析儿茶酚含量达20.8％。青霉素、链霉素、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)购自Mediatech(美国弗吉尼亚州赫顿市)公司，而10％FBS(胎牛血清)购自Mediatechand Hyclone(美国犹他州罗根市)公司。所有其它的标准试剂，除非另有说明，均购自Sigma公司。

[00251]白细胞介素-6分析—培养基中IL-6的分泌完全采用鼠类IL-6免疫试剂盒进行定量分析，未作任何修改(R&D系统，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市)。生产商提供的信息指明施加在老鼠细胞培养液中IL-6回收率平均值为99％，而检测到的最低IL-6浓度范围为1.3到1.8pg/ml。所有的培养基上清液样品均在未稀释情况下进行分析。

[00252]统计计算和解析—所有的分析实验均重复进行两次。对于统计分析，需计算金合欢属相对于溶剂对照对脂联素或IL-6分泌的影响。使用无修改的多重比较的学生t测试方法确定剂量间的差值；选用公称5％的I型误差(单尾)概率。

[00253]结果—正如前述实施例中所示，TNFα能显著降低脂联素分泌，而吲哚美辛和金合欢属儿茶提取物会在TNFα存在条件下增加脂联素分泌。尽管吲哚美辛阳性对照和金合欢属儿茶提取物证明了脂联素分泌剂量相关增加，但是这两种材料均无法将脂联素水平恢复到含TNFα的二甲亚砜对照中所示的浓度(表17)。在TNFα存在条件下，金合欢属儿茶提取物显示出对IL-6分泌的有效剂量相关抑制，而吲哚美辛则显示无抗炎效应。

[00254]抗炎脂联素对前炎症性IL-6的比率测定结果表明吲哚美辛和金合欢属儿茶提取物在相对抗炎活性中呈现极大的剂量相关增加。

表17

在TNFα/3T3-L1模型中由金合欢属儿茶样品#4909引发的IL-6分泌下降和脂联素 分泌上升。

将金合欢属儿茶测试材料或吲哚美辛同浓度为10ng/ml的TNFα一并加入到D53T3-L1脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行吲哚美辛和IL-6测定。所有值都对TNFα对照取指数。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_TNFα对照

IL-6指数＝[IL-6_测试-IL-6_对照]/[IL-6_TNFα-IL-6_对照]

*这与TNFα对照有显著差异(p<0.05)。

[00255]在TNFα/3T3-L1脂肪细胞模型中，金合欢属儿茶样品#4909呈现双重抗炎作用。金合欢属儿茶提取物的成分会增加脂联素分泌而减少IL-6分泌。金合欢属儿茶的总体效果则会显示相对于TNFα对照的强效抗炎性。这些结论支持金合欢属儿茶在改变脂肪细胞生理机能以降低胰岛素抵抗方面的应用，从而可治疗由胰岛素抵抗引起的体重增加、肥胖、心血管病以及癌症。

实施例19

金合欢属水提取物的二甲亚砜可溶成分对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞中脂联素、IL-6 以及抵抗素分泌的影响。

[00256]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用的标准化学药品以及统计程序如实施例11和12所述。IL-6如实施例18所述进行分析。

[00257]抵抗素分析—培养基中的抵抗素分泌完全采用鼠类IL-6免疫测试盒进行定量分析，未作任何修改(R&D Systems公司，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市)。生产商提供的信息指明施加利用1:2的溶剂在老鼠细胞培养液中抵抗素回收率平均值为99％，而检测到的最低抵抗素浓度范围为1.3到1.8pg/ml。在分析前，应将所有的培养基上清液样品利用制造商提供的稀释液以1：20进行稀释。

[00258]统计计算和解析—所有的分析实验均重复进行两次。对于统计分析，需计算金合欢属儿茶相对于溶剂对照对脂联素或IL-6分泌的影响。剂量间差值采用无修正多重比较的学生t测试方法进行确定，选用概率为百分之五的I类公称误差(单尾)。

[00259]结果—在高浓度胰岛素存在条件下，曲格列酮和金合欢属样品#4909会以剂量相关的方式增加脂联素分泌(表18)。在金合欢属儿茶浓度仅为6.25μg/ml时，通过减少IL-6分泌显示出其抗炎作用，曲格列酮在浓度为5.00和1.25μg/ml时具有促炎性，在另外两个浓度下未观察到任何效果。使用曲格列酮时，抵抗素分泌以剂量依赖的方式增加；然而，金合欢属儿茶以同样的剂量依赖方式降低抵抗素的表达。

[00260]如实施例18所示，在高胰岛素血症/3T3-L1脂肪细胞模型中，金合欢属儿茶样品#4909又显示出双重抗炎作用。金合欢属儿茶提取物成分会增加脂联素分泌而减少IL-6分泌。因此，金合欢属儿茶的总体效果相对于高浓度胰岛素对照呈现抗炎性质。在高浓度胰岛素存在下，金合欢属儿茶对抵抗素分泌的影响同曲格列酮正好相反：曲格列酮促进抵抗素的表达，而金合欢属儿茶进一步抑制抵抗素的表达。这些数据说明金合欢属儿茶的复合提取物通过PPARγ受体时不起作用。这些结论进一步支持应用金合欢属儿茶可改变脂肪细胞生理机能以降低胰岛素抵抗，从而降低由胰岛素抵抗引起的体重增加、肥胖、心血管病以及癌症的发病几率。

表18

在胰岛素抵抗3T3-L1模型中金合欢属儿茶对脂联素、IL-6以及抵抗素分泌的影响。

将金合欢属儿茶测试材料或吲哚美辛同浓度为166nM的胰岛素一并加入到D53T3-L1脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行脂联素、IL-6以及抵抗素测定。所有值都对胰岛素单一对照取指数。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_{胰岛素对照}

IL-6指数＝[IL-6_测试]/[IL-6_{胰岛素对照}]

抵抗素指数＝[Resistin_测试]/[Resistin_{胰岛素对照}]

*指数值表示平均值±95％置信区间，它是根据方差分析的剩余均方计算而来。大于或小于胰岛素对照±95％置信区间的数值与p<0.05时存在显著差异。

实施例20

使用源自酒花的植物化学成分增加脂肪细胞中的脂肪生成。

[00261]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用的标准化学药品以及统计程序如实施例11所述。

[00262]测试材料—如表19中所述，测试中所用的酒花植物化学成分购自Betatech酒花产品公司(美国华盛顿特区)。

表19

酒花测试材料说明。

 

酒花测试材料

说明

 

α酸溶液	82％α酸/2.7％β酸/2.95％异构α酸(体积比)。α酸包括律草酮、聚律草酮和类律草酮。
		ρ异构α酸(RIAA)	ρ-异律草酮、ρ-异聚律草酮和ρ-异类律草酮。
异α酸(IAA)	以体积比计算，异α酸占25.3％。包括顺式和反式异律草酮、顺式和反式异聚律草酮以及顺式和反式异类律草酮。
		四氢异α酸(THIAA)	酒花复合物—以体积比计算，THIAA为8.9％。包括顺式和反式四氢异律草酮、顺式和反式四氢异聚律草酮以及顺式和反式四氢异类律草酮。
六氢异α酸(HHIAA)	以体积比计算，THIAA为3.9％，HHIAA为4.4％HHIAA异构体包括六氢异律草酮、六氢异聚律草酮和六氢异类律草酮。
		B酸溶液	以体积比计算，β酸为10％；α酸含量<2％。B酸包括蛇麻酮、类蛇麻酮、聚蛇麻酮和前蛇麻酮。
黄腐酚(XN)	以质量比计算，黄腐酚含量>80％。包括黄腐酚、黄腐酚A、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚D、黄腐酚E、黄腐酚G、黄腐酚H、脱甲基黄腐酚、黄原酚、4’-O-甲基黄腐酚、3’-香叶基酮-4，5，7-三羟黄烷酮、3’，5’-二异戊烯二基酮-4，5，7-三羟黄烷酮、5’-异戊二烯基黄腐酚、醉椒黄烷酮、脱二氢黄腐酚以及异脱氢环化水合物黄腐酚。
		酒花残留物	黄腐酚A、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚D、黄腐酚E、黄腐酚G、黄腐酚H、  反式羟基黄腐酚、1”0.2”-二羟基黄腐酚C，脱甲基黄腐酚B、脱甲基黄腐酚J、黄腐酚I、脱甲基黄腐酚、异黄腐酚、脱二氢黄腐酚、二异戊二烯基黄腐酚、5”-羟基黄腐酚、5’-异戊二烯基黄腐酚、6，8-二异戊二烯基柚皮素、8-异戊二烯-4，5，7-三羟黄烷酮、6-异戊二烯柚苷元、异黄腐酚、律草灵酮、副律草灵酮、4-羟基苯甲醛和谷甾醇-3-O-b-吡喃葡萄糖苷。
六氢类蛇麻酮	1％六氢类蛇麻酮(体积比，溶剂为KOH)

[00263]细胞培养和处理—将酒花化合物溶解于二甲亚砜(DMSO)中，在分化0天时加入培养基中使其浓度分别达到10、5、4或2μg/ml，并在整个成熟期内保持这—浓度(第6天或第7天，D6/D7)。酒花残留物的测试浓度为50μg/ml。无论何时加入新鲜培养基，都需要加入新的测试材料。选择DMSO是因为它的极性以及容易与液态细胞培养基混合的特点。分别加入吲哚美辛和曲格列酮作为阳性对照，二者最终浓度分别为5.0μg/ml和4.4μg/ml。用0.36％的油红0或0.001％氟硼二吡咯对分化后的D6/D73T3-L1细胞进行染色。

[00264]结果—在3T3-L1细胞中，阳性对照吲哚美辛和曲格列酮诱导脂类的形成程度相似(图18)。然而出乎意料的是，在3T3-L1脂肪细胞中四类酒花化合物比阳性对照吲哚美辛和曲格列酮拥有更大的脂肪形成响应。这四类化合物包括异α酸、ρ异α酸、四氢异构α酸和六氢异构α酸。这一发现令人吃惊，因为根据已发表的文献，异律草酮同PPARγ的单独结合率大约为其与PPARγ的有效激动剂吡格列酮结合率的1/4～1/3[Yajima，H.、Ikeshima，E.、Shiraki，M.、Kanaya，T.、Fujiwara，D.、Odai，H.、Tsuboyama-Kasaoka，N.、Ezaki，O.、Oikawa，S.和Kondo，K，源于酒花植物的苦味酸激活过氧化物酶体增殖活化受体α和γ并减少胰岛素抵抗。J Biol Chem，279：33456-33462，(2004)]。

[00265]黄腐酚、α酸和β酸和吲哚美辛及曲格列酮的脂肪生成反应相当，而酒花残留物和六氢类蛇麻酮则不能诱发比溶剂对照更大的脂肪生成反应。

[00266]本研究中阳性的酒花植物化学成分，包括异构化的α酸、α酸和β酸以及黄腐酚，根据它们在3T3-L1细胞中的脂肪生成潜力，预计可对胰岛素呈现不敏感症状的人或其它动物起到增强胰岛素敏感性并且降低血清甘油三酯的作用。

实施例21

酒花植物化学成分增加抗胰岛素的3T3-L1脂肪细胞中脂联素的分泌。

[00267]模型—在本实验中采用实施例11和12中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。标准化合物、酒花化合物RIAA、IAA、THIAA、HHIAA、黄腐酚、六氢类蛇麻酮以及酒花残留物分别如实施例12和20中所述。

[00268]细胞培养和处理—按实施例12所述进行细胞培养，并如前面所述利用酒花植化物对细胞进行处理。脂联素测定及统计说明如实施例12中所述。用修正的Hofstee方法测定表观米氏常数和最大速率，并估计测试材料的效力。利用自变量v/[S]替换{相对脂联素分泌/[浓度]}，而利用应变量{v}替换{相对脂联素分泌}，生成一个y＝mx+b的关系式。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算测试材料必要的半最大值处的脂联素分泌浓度。

[00269]结果—在抗胰岛素3T3-L1细胞中，阳性对照曲格列酮在浓度为2.5μg/ml时能最多能将脂联素分泌提高到溶剂对照的2.44倍(图19)。相对于溶剂对照，所有测试的酒花植物化学成分均证实对脂联素分泌有增强作用，其中异α酸能显著生成比曲格列酮更高的脂联素分泌(为对照的2.97倍)。实验中观察到测试的四个试剂中，异α酸、ρ异α酸、六氢异α酸和四氢异α酸可产生最大脂联素分泌的最大剂量为5μg/ml。对于黄腐酚、酒花残留物和六氢类蛇麻酮，脂联素分泌增加的最大值分别在其浓度为1.25、25和12.5μg/ml时观察到。黄腐酚、ρ异α酸和酒花残留物的最大相对脂联素表达与曲格列酮相当，而六氢异α酸、六氢类蛇麻酮和四氢异α酸的最大相对脂联素表达则比曲格列酮低而比对照高。

表20

分别从y截距和Hofstee点斜率估算最大脂联素分泌量及半数最高脂联素分泌所需的 测试材料浓度。

[1]根据四种测试浓度的Hofstee点线性回归分析估算

[2]忽略一个异常数据，使用其它三个浓度估计剂量反应

[00270]如表20所示，由修正后的Hofstee的点(图20)估计最大脂联素分泌可有效支持上述观察结果。最高脂联素分泌的y轴截距估计大致分为三组：(1)异α酸，(2)黄腐酚、ρ异α酸、曲格列酮和酒花残留物，以及(3)六氢异α酸、六氢类蛇麻酮和四氢异α酸。如表20所示，由修正后的Hofstee的点(图20)估计最大脂联素分泌可有效支持上述观察结果。最高脂联素分泌的y轴截距估计大致分为三组：(1)异α酸，(2)黄腐酚、ρ异构α酸、曲格列酮和忽布残留物，以及(3)六氢异α酸、六氢类蛇麻酮和四氢异α酸。刺激抗胰岛素的3T3-L1细胞产生半数最大量脂联素分泌所需测试材料的浓度大约为0.1μg/ml，曲格列酮、ρ异构α酸、四氢异α酸和六氢异α酸在这点上类似。达到半数最大脂联素分泌时，异α酸的浓度为0.49μg/ml，接近前面的5倍。黄腐酚显示对半数最大脂联素分泌所需的剂量最低，约为0.037μg/ml。达到半数最大脂联素分泌时所需浓度最高的是酒花残留物及六氢类蛇麻酮，分别为2.8μg/ml和3.2μg/ml。刺激抗胰岛素的3T3-L1细胞产生半数最大量脂联素分泌所需测试材料的浓度大约为0.1μg/ml，曲格列酮、ρ异α酸、四氢异α酸和六氢异α酸在这点上类似。达到半数最大脂联素分泌时，异α酸的浓度为0.49μg/ml，接近前面的5倍。黄腐酚显示对半数最大脂联素分泌所需的剂量最低，约为0.037μg/ml。达到半数最大脂联素分泌时所需浓度最高的是酒花残留物及六氢类蛇麻酮，分别为2.8μg/ml和3.2μg/ml。

[00271]基于它们增强抗胰岛素的3T3-L1细胞中脂联素分泌的能力，本研究发现阳性酒花植物化学成分：异α酸、ρ异α酸、四氢异α酸、六氢异α酸、黄腐酚、酒花残留物和六氢类蛇麻酮，预计对血浆脂联素降低的所有临床病症具有积极的影响。

实施例22

酒花植物化学成分通过增强抗胰岛素的3T3—L1脂肪细胞中脂联素的分泌以及抑制对 白细胞介素-6的分泌而呈现抗炎活性。

[00272]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。脂联素和IL-6根据实施例12和18中所述进行分析。标准化学药品、酒花化合物RIAA、IAA、THIAA、HHIAA、黄腐酚、六氢类蛇麻酮以及酒花残留物如实施例12和20所述。

[00273]统计计算和解析—所有的分析实验均重复进行两次。对于统计分析，需计算酒花衍生物相对于溶剂对照对脂联素或IL-6分泌的影响。剂量差值采用无修正多重比较的方差分析进行确定，选用概率为百分之五的I类公称误差。

[00274]结果—在高浓度胰岛素存在条件下，曲格列酮和所有测试过的酒花衍生物均能增加脂联素的分泌(表21)。在此模型中曲格列酮不会减少IL-6的分泌。事实上，曲格列酮和HHCL在两种浓度下显示增加IL-6分泌的能力，而THIAA和酒花残留物在最高浓度时可增加IL-6的分泌，在其它浓度下则不起作用。其它酒花衍生物对IL-6分泌的影响通常为双相的。在测试的最高浓度，除IAA外，RIAA、HHIAA和XN均可增加IL-6的分泌。而RIAA、IAA、THIAA和XN会显著降低IL-6的分泌。

表21

酒花化合物对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞中脂联素和白细胞介素-6分泌的影响。

将金合欢属儿茶测试材料或吲哚美辛同浓度为166nM的胰岛素一并加入到D5 3T3-L1脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行脂联素、IL-6以及抵抗素测定。所有值都对胰岛素单一对照取指数。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_{胰岛素对照}

IL-6指数＝[IL-6_测试]/[IL-6_{胰岛素对照}]

*指数值是平均值±95％置信区间，它是根据方差分析的剩余均方计算而来。对脂联素或脂联素/IL-6来说，数值<0.7或>1.3与胰岛素对照有显著差异；而对IL-6来说，数值<0.77或>1.23与胰岛素对照有显著差异。

#与胰岛素对照p<0.05有显著差异。

[00275]作为总抗炎效力的度量值的脂联素/IL-6比值，对RIAA、IAA、HHIA和XN来说都是强阳性的(>2.00)。THIAA、HHCL和酒花残留物的脂联素/IL-6比值尽管很低，但仍显示为阳性。在浓度为2.5和0.625μg/ml时，曲格列酮的脂联素/IL-6比值显示为强阳性，而在5.0和1.25μg/ml时却无效应。

[00276]以上数据说明酒花衍生物RIAA、IAA、HHIA、THIAA、XN、HHCL和酒花残留物可减弱脂肪细胞中由高胰岛素血症引起的促炎效应。总的来说，酒花衍生物在单纯由TNFα造成的高胰岛素血症条件下的抗炎效应要高于曲格列酮的抗炎效应。

实施例23

酒花植物化学成分增加TNFα处理后的3T3-L1脂肪细胞中脂联素的分泌。

[00277]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。标准化学药品和酒花化合物IAA、RIAA、HHIAA和THIAA分别如实施例13和20所述。酒花衍生物分别在浓度为0.625、1.25、2.5和5.0μg/ml时进行测试。脂联素的分析如实施例12所述。

[00278]结果—第5(D5)天利用浓度为10ng/ml的TNFα处理并隔夜放置的3T3-L1脂肪细胞可显著抑制脂联素分泌(图21)。与TNFα/溶剂对照相比，酒花衍生物IAA、RIAA、HHIAA和THIAA均可增加脂联素分泌。观察RIAA和HHIAA的线性剂量-反应曲线可发现在最高浓度为5.0μg/ml下抑制能力最强。IAA在浓度为1.25μg/ml时诱发最大的脂联素分泌，而THIAA在浓度为5.0μg/ml时诱发最大脂联素分泌的曲线反应。

[00279]在高于生理浓度的TNFα存在的情况下，酒花衍生物IAA、RIAA、HHIAA和THIAA增加脂肪细胞脂联素分泌的能力有力证明这些化合物对涉及脂肪细胞功能欠佳的炎症病况的预防或治疗有功效。

实施例24

金合欢属儿茶制品与酒花衍生物在改变3T3-L1脂肪细胞中脂肪生成和脂联素分泌的 协同作用。

[00280]模型—在这些实验中，采用实施例11和13中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00281]测试材料和处理—所用标准化学药品如实施例11和13所述。为计算脂肪生成指数，3T3-L1脂肪细胞在分化前按实施例11所述进行处理，或为分析脂联素指数按实施例12所述用TNFα进行处理。将实施例14所述的金合欢属儿茶样品#5669与前文所述的酒花衍生物  ρ异α酸和异α酸一起使用。金合欢属儿茶以及金合欢属：RIAA和金合欢属：IAA的5:1和10:1的混合物测试浓度为50、10、5.0和1.0μg/ml。RIAA和IAA均在5.0、2.5、1.25和0.625μg/ml浓度下单独进行测试。

[00282]计算—预期脂肪生成反应和金合欢属/酒花混合脂联素分泌的估计并确定协同作用如前文所述。

[00283]结果—所有已测试混合物在一个或多个测试浓度下均呈现脂肪生成的协同作用(表22)。金合欢属：RIAA混合的作用一般要比金合欢属：IAA混合的活性更强，金合欢属：RIAA[5:1]混合在所有剂量下均显示协同作用，而金合欢属：RIAA[10:1]在10和5.0μg/ml浓度下显示协同租用，并在其它任何测试浓度下均未发生拮抗。金合欢属：IAA[10:1]混合物在两个中等浓度下也呈现协同作用，并且未发生拮抗。而金合欢属：IAA[5:1]在浓度为50μg/ml时具有协同作用，在浓度为5.0μg/ml时发生拮抗。

[00284]类似地，所有混合物在一个或多个测试浓度下对增加脂联素分泌均显示协同作用(表23)。金合欢属：IAA[10:1]混合在所有剂量下均显示协同作用，而金合欢属：RIAA[5:1]和金合欢属：RIAA[10:1]在三种剂量下显示协同作用，而在一种浓度下发生拮抗。金合欢属：IAA[5:1]混合在浓度为1.0μg/ml时具有协同作用，在浓度高于10μg/ml时发生拮抗。

表22

抗胰岛素3T3-1模型中金合欢属儿茶和酒花衍生物诱发的脂肪生成反应的观测值和预 期值。

脂肪生成指数＝[OD]_测试/[OD]_DMSO对照。

1)95％置信区间上限是1.03，最小显著性差值＝0.03。

2)95％置信区间上限是1.03，最小显著性差异＝0.03。

3)95％置信区间上限是1.07，最小显著性差值＝0.07。

4)95％置信区间上限是1.02，最小显著性差值＝0.02。

表23

TNFα/3T3-1模型中金合欢属儿茶和酒花衍生物诱发的脂联素分泌观测值和预期值。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_TNFα对照

1)95％置信区间上限是1.07，最小显著性差值＝0.07。

2)95％置信区间上限是1.03，最小显著性差异＝0.03。

[00285]金合欢属儿茶和酒花衍生物ρ异α酸或异α酸的混合显示具有协同作用，只有极少的混合会在提高脂肪细胞中的脂质成分并增加脂肪细胞中脂联素的分泌上显示拮抗作用。

实施例25

酒花衍生物在脂多糖/3T3-L1脂肪细胞模型中的抗炎活性。

[00286]模型—在这些试验中，采用实施例11和13中所述的3T3-L1小鼠脂肪细胞模型。

[00287]测试化合物及处理—标准化学药品如实施例11和13中所述，而在第5天用100ng/ml的细菌脂多糖(LPS，Sigma公司，美国密苏里州圣路易斯市)代替TNFα。所用酒花衍生物ρ异α酸和异α酸如实施例20所述。非甾体类抗炎药物(NSAIDs)阿司匹林、水杨酸和布洛芬购自Sigma公司。实验中使用塞来昔布(Celebrex^TM，G.D.Searle & Co.美国伊利诺斯州芝加哥市)商品胶囊制剂，而基于活性成分含量为细胞用药。酒花衍生物、布洛芬和塞来昔布的给药浓度为5.00、2.50、1.25和0.625μg/ml。吲哚美辛、曲格列酮和吡格列酮的测试浓度为10、5.0、1.0和0.50μg/ml。阿司匹林的测试浓度为100、50.0、25.0和12.5μg/ml，而水杨酸的测试浓度为200、100、50.0和25.0μg/ml。对IL-6和脂联素进行测试，并对数据分别进行分析、列表，IL-6如前文实施例18所述，而脂联素如实施例13所述。

[00288]结果—LPS对D5脂肪细胞中IL-6的刺激是原先的12倍。所有试剂都在不同程度上减少了LPS所刺激的脂肪细胞中IL-6的分泌。IL-6的最大抑制及产生最大抑制的浓度如表24所示。由于处理方差相对较大，IL-6的最大抑制程度在测试材料中并无差异。然而，发生最大抑制的剂量却有明显的差异。对IL-6抑制能力的排列顺序为布洛芬>RIAA＝IAA>塞来昔布>吡格列酮＝吲哚美辛>曲格列酮>阿司匹林>水杨酸。在定性依据上，吲哚美辛、曲格列酮、吡格列酮、布洛芬和塞来昔布在所有测试浓度下均抑制IL-6的分泌，而RIAA、IAA和阿司匹林在最低浓度(数据未给出)下对IL-6无明显抑制。

[00289]与二甲亚砜对照相比，用LPS对D53T3-L1脂肪细胞进行处理会减少脂联素的分泌(表25)。与所有测试化合物在某种程度上均会抑制IL-6的分泌不同，阿司匹林、水杨酸和塞来昔布在任何测试剂量下都不能诱导LPS处理过的3T3-L1脂肪细胞中脂联素的分泌。实验中观察到在浓度为0.625μg/ml时，曲格列酮、RIAA、IAA和布洛芬对脂联素的最大刺激分别为15％、17％、20％和22％。接下来是吡格列酮，在浓度为1.25μg/ml时，吡格列酮对脂联素的刺激能力为12％。由于在2.50μg/ml浓度下对脂联素分泌仅有9％的刺激，吲哚美辛是药效最差的活性测试材料。

[00290]在LPS/3T3-L1模型中，在一定浓度下减少IL-6分泌并增加脂联素分泌的酒花衍生物RIAA和IAA及布洛芬很可能是在体内获得的。噻唑烷二酮类曲格列酮和吡格列酮抑制IL-6分泌的能力较弱，因此所需剂量要高于酒花衍生物，但对于脂联素刺激则与酒花衍生物类似。实验中并未观察到非甾体类抗炎药吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬以及塞来昔布在巨噬细胞模型和脂肪细胞模型之间的抗炎活性有一致关系。

表24

酒花衍生物和选用的非甾体抗炎药物对LPS/3T3-L1脂肪细胞中IL-6分泌的最大抑制。

将测试材料与100ng/ml的LPS一起加入到D53T3-L1脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行IL-6测定。所有数值均如下所示对LPS对照取指数。表中所示的浓度代表能提供IL-6分泌最大抑制的剂量，那些小于0.70的数值显著(p<0.05)低于LPS对照。

IL-6指数＝[IL-6_测试-IL-6_对照]/[IL-6_LPS-IL-6_对照]

^*这与LPS对照有显著差异(p<0.05)。

表25

酒花衍生物和选用的非甾体抗炎药物对LPS/3T3-L1脂肪细胞中脂联素分泌的最大刺激。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_LPS对照

^*数值大于1.07表示与LPS对照有显著差异(p<0.05)。

NS＝与LPS对照无明显差异。

实施例26

在TNFα/3T3-1模型中金合欢属儿茶或酒花衍生物与姜黄素或黄腐酚混合时的协同效应。

[00291]模型—在这些实验中，采用实施例11和13中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00292]测试化合物及处理—实验所用标准化学药品如实施例11和13所述。为分析脂联素指数，按实施例13所述用TNFα处理3T3-L1脂肪细胞。金合欢属儿茶样品#5669如实施例14所述，酒花衍生物ρ异α酸和黄腐酚如实施例20所述，这些实验中所用姜黄素由Metagenics公司(美国华盛顿州吉格港市)提供。金合欢属儿茶以及金合欢属：姜黄素和金合欢属：黄腐酚的5:1混合物分别在50、10、5.0和1.0μg/ml四个浓度下进行测试。RIAA及其姜黄素和XN 1:1的混合物在10、5、1.0和0.50μg/ml四个浓度下进行测试。

[00293]计算—对混合的预期脂联素指数进行估测，并如前文所述对协同作用进行测定。

[00294]结果—TNFα将脂联素分泌大约降低到溶剂单独对照的50％。阳性对照吡格列酮以80％的比例增加脂联素分泌(表26)。实验数据证明金合欢属与姜黄素或黄腐酚的混合物在高浓度时发生拮抗，而在低浓度时发生协同作用。类似地，RIAA和姜黄素在3个较高剂量下会发生拮抗，而在最低剂量1.0μg/ml下是高度协同的。两种酒花衍生物RIAA和XN对TNFα-刺激的3T3-L1细胞的脂联素分泌并未显示协同作用。

[00295]在用TNFα处理过的3T3-L1脂肪细胞中，金合欢属和RIAA均能协同增加脂联素的分泌，而只有金合欢属显示与黄腐酚有协同作用。

表26

TNFα/3T3-1模型中金合欢属儿茶和酒花衍生物与姜黄素或黄腐酚混合时的协同效应。

脂联素指数＝[脂联素]_测试/[脂联素]_TNFα对照

1)95％置信区间从0.961到1.049，最小显著性差异＝0.049。

实施例27

其轭亚油酸与酒花衍生物ρ异α酸混合在抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中对脂肪生 成的体外协同作用。

[00296]模型—在这些实验中，采用实施例11和13所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00297]测试化合物及处理—实验中用到的标准化学药品如实施例11所述。为计算脂肪生成指数，3T3-L1脂肪细胞须在发生分化前按实施例11中所述进行处理。粉状CLA购自Lipid Nutrition(美国伊利诺斯州Channahon)公司，其药品为同分异构体c9t11和t10c12的1：1混合物。CLA及CLA：RIAA的5:1的混合物在10、5、1.0和1.0μg/ml四个浓度下进行测试。为了计算预期的脂肪生成指数，将RIAA在10、1.0和0.1μg/ml三个浓度下按前述方法进行测试。

[00298]结果-RIAA与CLA混合可协同增加甘油三酯含量。在所有剂量下均观测到协同作用(表27)。

[00299]所观测到的CLA和RIAA间的协同剂量范围很广，可用于提高CLA的胰岛素敏感性。

表27

共轭亚油酸与ρ异α酸混合物在胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型中对脂肪生成的协 同效应。

脂肪生成指数＝[OD]_测试/[OD]_DMSO对照。

1)95％置信区间上限是1.05，最小显著性差异＝0.05。

实施例28

酒花植物化学成分抑制TNFα-处理后的3T3-L1脂肪细胞中NF-kB的活性。

[00300]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00301]细胞培养和处理-在3T3-L1脂肪细胞分化后将其置于后分化培养基中再培养40天。标准化学药品、培养基以及酒花化合物RIAA和黄腐酚如实施例13和20所述。在2.5和5.0μg/ml浓度下，对酒花衍生物和阳性对照吡格列酮进行测试。测试材料应在核提取物制备3小时和24小时前的1小时加入，随后用TNFα进行处理。

[00302]酶联免疫吸附测定—在3T3-L1脂肪细胞分化后将其置于生长培养基中培养40天。使用Active Motif(美国加州卡尔斯巴德镇)公司的TransAM^TMNF-kB试剂盒对核NF-kBp65进行测定，未做任何修改。试剂盒中的Jurkat核提取物源自在含有50ng/ml TPA(佛波醇，12-豆蔻酸，13醋酸盐)和0.5μM钙离子载体A23187的培养基中培养的细胞，该细胞在收集前在37℃下培养2小时。

[00303]蛋白质分析—核蛋白使用Active Motif荧光蛋白定量试剂盒进行定量分析。

[00304]统计分析—使用单尾学生t-测试进行比较。设定I类公称误差概率为百分之五水平。

[00305]结果—经TPA处理的Jurkat核提取物显示出预期的NF-kBp65增加，这表明试剂盒中试剂的性能能够满足需要(图22)。用浓度为10ng/ml的TNFα分别对D403T3-L1脂肪细胞处理3小时(图22A)或24小时(图22B)，核NF-kBp65会增加2.1和2.2倍。正如预期，TNFα处理3小时或24小时后PPARγ激动剂吡格列酮均未抑制核NF-kBp65的产量。TNFα处理3小时后，浓度为5.0和2.5μg/ml的RIAA对NF-kBp65核转位的抑制百分比分别为9.4％和25％。24小时后，只有经过5.0μg/ml RIAA处理的样品显示出NF-kBp65的核转位受到明显的抑制(p<0.05)。TNFα处理后的3小时，5.0μg/ml和2.5μg/ml的黄腐酚对NF-kBp65核转位的抑制分别为15.6％和6.9％，而24小时后分别为13.4％和8.0％。

[00306]RIAA和黄腐酚对经TNFα处理的成熟胰岛素抵抗脂肪细胞中NF-kBp65核移位的抑制尽管很小，但仍显示一致的抑制作用。该结果与PPARY激动剂的描述不同，后者对3T3-L1脂肪细胞中的NF-kBp65的核转位未呈现抑制作用。

实施例29

金合欢属儿茶提取物和二甲双胍协同增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中甘油三酯的 含量。

[00307]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用所有化学制剂和流程均如实施例11所述。

[00308]测试化学药品及处理—二甲双胍购自Sigma公司(美国密苏里州圣路易斯市)。将测试材料在分化的当天加入二甲亚砜中，之后每2天添加一次，直至成熟期结束(第6/7天)。加入作为阳性对照的曲格列酮使其最终浓度达到4.4μg/ml。将测试材料二甲双胍、金合欢属儿茶样品#5669以及二者1:1(w/w)混合物在50μg/ml的浓度下进行测试。分化后的3T3-L1细胞用0.2％的油红O染色，染色后的油滴用异丙醇溶解并在530nm下用分光光度法进行定量分析。结果显示溶剂对照中完全分化细胞的相对甘油三酯含量。

[00309]计算—用下列关系式估算二甲双胍/金合欢属儿茶提取物中的预期脂肪生成效应：1/LI＝X/LIx+Y/LIy，此处LI＝脂肪生成指数，X和Y是测试混合物中各成分的相对分数，并且X+Y＝1。如果估计的LI均值落在相应的观察分数估计值的95％置信区间之外，就可推断为协同。对协同的这种定义，包含对混合物中各成分效果的比较，由Berenbaum[Berenbaum，M.C.什么是协同作用？Pharmacol Rev 41(2)，93-141，(1989)]提出。

[00310]结果—金合欢属儿茶提取物具有很强的脂肪生成能力，可将3T3-L1细胞中甘油三酯含量提高32％(图23)，从而获得1.32的脂肪生成指数。由于脂肪生成指数为0.79，单独使用二甲双胍并不能促进脂肪生成。实验观测到二甲双胍/金合欢属儿茶提取物的混合物的脂肪生成指数为1.35。二甲双胍/金合欢属儿茶提取物的脂肪生成指数为98，该值落在期望值95％置信区间上限的2％以外，因而表明有协同作用。

[00311]根据3T3-L1细胞中所显示的脂肪生成潜力，二甲双胍和金合欢属儿茶提取物的1:1混合物有望在临床应用中呈现协同作用。这种混合物将用来增加二甲双胍疗法的正向效果范围，例如可降低血浆中甘油三酯含量或延长二甲双胍药物作用期。

实施例30

酒花衍生物和噻唑烷二酮类药物对抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中脂肪生成的体外 协同作用。

[00312]模型—在这些实验中，采用实施例11和13所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。

[00313]测试化合物及处理—实验中用到的标准化学药品如实施例11所述。为计算脂肪生成指数，3T3-L1脂肪细胞须在发生分化前按实施例11中所述进行处理。曲格列酮购自Cayman化学制剂公司(美国伊利诺斯州芝加哥市)。吡格列酮为商品片剂(

Takeda制药公司，美国伊利诺斯州林肯郡)。将片剂粉碎，所得全部药粉均用于分析。根据活性成分含量计算所有结果。所用酒花衍生物ρ异α酸和异α酸如实施例20所述。与RIAA和IAA混合的曲格列酮在4.0μg/ml浓度下进行测试，而效力更强的吡格列酮与RIAA和IAA以1:1混合后于2.5μg/ml浓度下进行测试。为计算实施例34中所述的脂肪生成指数，所有材料还在4.0μg/ml和2.5μg/ml两个浓度下分别进行测试。

[00314]结果—当在4.0μg/ml和2.5μg/ml两个浓度下分别对曲格列酮和吡格列酮进行测试时，ρ异α酸和异α酸均能与抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中的噻唑烷二酮类药物协同促进甘油三酯的合成(表28)。

[00315]酒花衍生物ρ异α酸和异α酸可协同增加噻唑烷二酮类药物的胰岛素增敏效应，这将带来剂量减少或良性反应的病人数量增加等一系列潜在临床优势。

表28

酒花衍生物和噻唑烷二酮类药物在抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中的体外协同作用。

脂肪生成指数＝[OD]_测试/[OD]_DMSO对照。

1)95％置信区间上限是1.02，最小显著性差异＝0.02。

2)95％置信区间上限是1.05，最小显著性差异＝0.05。

实施例31

ρ-异α酸和二甲双胍在TNFα/3T3-L1脂肪细胞中的体外协同作用

[00316]模型—在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用标准化学药品和以10ng/ml浓度的TNFα对脂肪细胞进行处理的方法分别如实施例11和实施例13中所述。

[00317]测试材料与细胞处理—二甲双胍购自Sigma公司(美国伊利诺斯州圣路易斯市)，ρ-异α酸如实施例20所述。将含有或不含1μg/ml RIAA的浓度为50、10、5.0或1.0μg/ml的二甲双胍连同浓度为10ng/ml的TNFα一并加入到D53T3-L1脂肪细胞中。在第6天用将培养基上清液如实施例11中所述进行IL-6测定。关于二甲双胍：RIAA混合物对IL-6抑制的预期效果也如前文所述进行估测。

[00318]结果—TNFα可使D5脂肪细胞中IL-6的分泌增加6倍。与对照相比，1μg/ml的曲格列酮抑制34％的IL-6分泌，而1μg RIAA抑制24％的IL-6分泌(表29)。与浓度为1μg/ml的RIAA混合的二甲双胍在50μg/ml浓度下显示协同作用，而在1μg/ml浓度下显示强大的协同作用。二甲双胍浓度为50μg/ml时，混合物中的1μg RIAA可额外增加10％抑制，而添加1μg二甲双胍和1μg RIAA可增加35％的IL-6抑制。实验中还观察到二甲双胍：RIAA混合物在2个中等剂量下分别显示拮抗作用和无效果。

[00319]二甲双胍和ρ-异α酸混合物在高浓度和低浓度均起协同作用，从而减少TNFα处理后的3T3-L1脂肪细胞中IL-6的分泌。

表29

酒花ρ-异α酸和二甲双胍对TNFα/3T3-L1脂肪细胞中IL-6分泌的协同抑制作用

在指定浓度下将测试材料连同10ng/ml的TNFα加入到D53T3-L1脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行IL-6测定。所有值均对TNFα对照取指数。

IL-6指数＝[IL-6_测试-IL-6_对照]/[IL-6_TNFα-IL-6_对照]

^*数值小于0.93显著(p<0.05)低于TNFα对照。

实施例32

测试化合物对癌症细胞体外增殖的影响

[00320]本实验证实本发明中若干测试化合物对癌细胞的体外增殖有直接的抑制作用。

[00321]方法—在RL95-2子宫内膜癌细胞模型(AKT激酶过度表达)、HT-29(组成性表达COX-2)模型和SW480(组成性表达激活的AKT激酶)肠癌细胞模型中检测本发明的测试化合物对癌细胞增殖的抑制效果。简而言之，将靶细胞植入96孔组织培养盘中使其不断生长直至接近汇合。然后如实施例4所述用不同剂量的测试化合物将细胞处理72小时，并用CyQuant(Invitrogen公司，美国加州卡尔斯巴德)商用荧光分析仪测定细胞相对增殖情况。

[00322]结果—用10μg/ml的MgDHIAA(mgRho)、IAA、THIAA、TH-HHIAA(THIAA和HHIAA的1:1混合物)、Xn(黄腐酚)、LY(LY 249002，PI3K抑制剂)、EtOH(乙醇)、alpha(α酸混合物)以及β(β酸混合物)对RL95-2细胞进行72小时处理。对细胞增殖的相对抑制情况如图24所示，相对于DMSO溶剂对照，黄腐酚的抑制程度要高于50％。图25和26所示是不同浓度的RIAA和THIAA对HT-29和SW480癌细胞各自的剂量反应结果。RIAA和THIAA对HT-29细胞系的半数抑制浓度分别为31μM和10μM，对SW480细胞系的半数抑制浓度分别为38μM和3.2μM。

实施例33

金合欢属尼罗和酒花衍生物对KK-A ^y 鼠糖尿病模型中的体外降血糖作用。

[00323]模型—使用九周龄大、平均重量为40±5克的KK-A^y/Ta雄性鼠对测试材料降低空腹血糖或胰岛素浓度的能力进行分析。该小鼠品系由KK系间杂交培育得到，其在20世纪40年代被发展为糖尿病的模型以及A^y/α基因型系。所观察到的表型是多基因变异的结果，尽管还需全面表征，但至少已识别出四个数量性状位点。其中一个与瘦素蛋白受体的错义突变有关。尽管发生了突变，受体虽不能保持全部但仍能保持部分机能。对于伴随有胰岛素不敏感和葡萄糖耐受不良但未呈现明显高血糖症的糖尿病，KK系还将继续发展其病情。Ay突变的引入会诱发肥胖症和高血糖血症。所谓A^y突变，是指Raly基因的170kb删除，该基因位于刺鼠色基因座5’位置，可在Raly促进剂存在下对刺鼠行为进行控制。纯合子动物在植入前就会死亡。

[00324]测试材料—金合欢属尼罗样品#5659如实施例14所述，而所用酒花衍生物ρ-异α酸、异α酸和黄腐酚如实施例20所述。金合欢属尼罗、RIAA和IAA每天按100mg/kg进行给药，而XN按20mg/kg进行给药。此外，将金合欢属尼罗和RIAA、IAA、以及XN以5:1和10:1配制混合物并按每天100mg/kg的剂量给药。

[00325]测试流程—将测试物质溶于0.2％的吐温—80中，每天对每组中的5只动物以强饲法进行给药。在首次给药前与第3次给药及最后1次给药后的90分钟从眼球后窦道采集血清。用变旋酶/葡萄糖氧化酶法对非空腹血糖进行酶促测定，用鼠特异性ELISA(酶联免疫吸附测定)对血清胰岛素进行测定。

[00326]数据分析—为分析测试物质相对于对照能否降低血糖或胰岛素含量，先将给服剂量后的血糖和胰岛素值相对于给服剂量前的浓度进行标准化作为每只老鼠的预治疗百分数。针对葡萄糖和胰岛素变量计算其预治疗百分数临界值(单尾，对照鼠的95％置信区间的下限)。将测试材料的每个预治疗百分数值同对照的临界值进行比较。低于对照临界值的测试材料预治疗百分数值被认为与对照存在显著差异(p<0.05)。

[00327]结果—在3天的治疗期间，对照鼠的非空腹血糖含量升高2.6％，而胰岛素含量降低6.7％。罗格列酮、金合欢属尼罗、XN：Acacia[1:5]混合物、XN：Acacia[1:10]混合物、Acacia：RIAA[5:1]混合物、黄腐酚、Acacia：IAA[5:1]混合物、异α酸和ρ-异α酸均可降低非空腹血糖，而对胰岛素无效果。Acacia：RIAA[10:1]混合物和Acacia：IAA[10:1]混合物对血糖和胰岛素均无效果(表30)。

[00328]金合欢属尼罗样品#5659、黄腐酚、异α酸、ρ-异α酸及它们的各种混合物在2型糖尿病KK-Ay鼠模型中快速降血糖效应证实它们在与人类高血糖症相关疾病的治疗方面具有潜在的临床效力。

表30

金合欢属尼罗和酒花衍生物对KK-Ay糖尿病鼠体内非空腹血糖和胰岛素的效应

对每组中的5个动物连续3天每天施加1次剂量。

#显著低于对照(p<0.05)。

实施例34

金合欢属尼罗和酒花衍生物在糖尿病db/db鼠模型中的体内协同作用。

[00329]模型—本实验使用C57BLKS/Jm+/m+Leprdb(db/db)雄鼠对测试材料降低空腹血糖或胰岛素浓度的能力进行分析。这一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受体而对瘦素产生抗性。血浆胰岛素从第10天到第14天这段时间开始升高，血糖从4到8周开始升高。在测试时(9周)动物体重显著增加50±5g，并呈现胰岛肥大的迹象。

[00330]测试材料—阳性对照二甲双胍和罗格列酮连续三天每天分别按300mg/kg和1.0mg/kg的剂量给药。金合欢属尼罗样品#5659、酒花衍生物和它们的混合物如前文所述进行给药。

[00331]测试流程—将测试物质溶于0.2％的吐温—80中，每天以强饲法给药。在首次给药前与第3次给药及最后1次给药后的90分钟从眼球后窦道采集血清。用变旋酶/葡萄糖氧化酶法对非空腹血清血糖进行酶促测定，并用特异性ELISA对血清胰岛素进行测定。

[00332]结果—相对于对照组，阳性对照二甲双胍和罗格列酮均可降低血糖和胰岛素浓度(表31)。仅RIAA和XN单独作为测试材料时显示出可接受的结果。RIAA降低血清胰岛素，而XN降低血糖，对胰岛素并无效果。在已测试的降低血清胰岛素含量的试剂中，金合欢属：RIAA[5:1]混合物最有效，使血清胰岛素水平降低21％，而二甲双胍只能使胰岛素浓度降低17％，噻唑烷二酮类罗格列酮使其降低15％。金合欢属：RIAA[5:1]混合物的反应要高于两者中的单独成分，从而可显示协同作用。单独使用金合欢属尼罗不能减少血清葡萄糖或血清胰岛素，而RIAA减少血清胰岛素的程度与二甲双胍相近。在剩余测试材料中，金合欢属：IAA[10:1]混合物还可有效降低血清胰岛素浓度。

[00333]在db/db鼠2型糖尿病模型中，由ρ-异α酸造成的血清胰岛素含量快速下降以及由黄腐酚造成的血糖含量下降，表明它们在治疗与胰岛素不敏感症和高血糖症有关的人类疾病方面具有潜在的临床疗效。此外，ρ-异α酸和金合欢属儿茶的5:1混合物在db/db鼠糖尿病模型中呈现协同效应。ρ-异α酸、黄腐酚和金合欢属：RIAA[5:1]成分对2个独立的糖尿病动物模型和3个体外模型的阳性反应表明它们可用于降低血糖或提高胰岛素敏感性的临床表现中。

表31

金合欢属尼罗和酒花衍生物对db/db糖尿病鼠体内非空腹血糖和胰岛素的效应。

对每组中的5个动物连续3天每天施加1次剂量。

#显著低于各自的对照(p<0.05)。

实施例35

在糖尿病db/db鼠模型中金合欢属尼罗和酒花衍生物比值的体内优化

[00334]模型—使用C57BLKS/J m+/m+Leprdb(db/db)雄鼠对测试材料降低空腹血糖或胰岛素浓度的能力进行分析。这一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受体而对瘦素产生抗性。血浆胰岛素从第10天到第14天这段时间开始升高，血糖从4到8周开始升高。在测试时(9周)动物体重显著增加50±5g，并呈现胰岛肥大的迹象。

[00335]测试材料—阳性对照二甲双胍和罗格列酮分别按每天300mg/kg和1.0mg/kg的剂量连续给药五天。在100mg/kg剂量下将酒花衍生物RIAA和金合欢属尼罗样品#5659分别以1:99、1:5、1:2、1:1、2:1和5:1的比例给药。

[00336]测试流程—将测试物质溶于0.2％的吐温—80中，每天以强饲法给药。在首次给药前与第5次及最后一次给药后的90分钟从眼球后窦道采集血清。用变旋酶/葡萄糖氧化酶法对非空腹血清血糖进行酶促测定，并用鼠特异性ELISA测定血清胰岛素。

[00337]结果—相对于对照组(p<0.05，结果未显示)，阳性对照二甲双胍和罗格列酮均降低血糖和胰岛素浓度。RIAA与金合欢属以100mg/kg的剂量单独给药五天，相对于对照(p<0.05)血糖浓度分别降低7.4％和7.6％。RIAA和金合欢属以1:99、1:5或1:1比例混合时显示拮抗作用，而将RIAA和金合欢属以2:1或者5:1的比例混合，相对于对照使血糖浓度分别降低11％和22％。这个反应要明显高出RIAA或金合欢属单独作用时的结果，这意味着两种组分之间存在协同作用。血清胰岛素浓度的减少也呈现相似的效应(图27)。

[00338]另外，在此模型中，还将ρ-异α酸和金合欢属的5:1混合物进行测试，并与目前用于治疗糖尿病的两种药物，二甲双胍和罗格列酮进行对比。结果(图28)说明使用ρ-异α酸和金合欢属的5：1混合物所得结果与降血糖(组A)和降血清胰岛素(组B)的药剂相一致。

[00339]在db/db糖尿病小鼠模型中，ρ-异α酸和金合欢属的2：1和5：1混合物显示协同作用，这有力支持它们可用于需要降低血糖浓度或增强胰岛素敏感性的临床表现上。

实施例36

酒花测试化合物在胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中的效果。

[00340]本实施例证实Mg Rho和THIAA这两种酒花化合物在类风湿性关节炎模型中减少炎症和关节炎症状的疗效，目前已知这种炎症和症状部分由许多蛋白激酶介导。

[00341]模型—雌性DBA/J小鼠(10只/组)在标准光照条件下进行笼养，并且允许随意进食。第0天向小鼠皮内注射含有100μgII型胶原和100μg结核分歧杆菌的角鲨烯混合物。第21天重复进行加强注射。第22-27天检查小鼠关节炎体征，从研究中移除那些无反应的小鼠。从第28天开始每天对小鼠用测试化合物以强饲法进行治疗，直到第42天结束，共持续14天。本实施例中所用化合物RIAA(MgRho)剂量分别为10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；THIAA剂量分别为10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；塞来昔布剂量为20mg/kg以及脱氢皮质(甾)醇剂量为10mg/kg。

[00342]使用以下所述的关节炎指数对每只脚爪的关节炎症状进行评估(分为0-4)。根据此关节炎指数，0＝无可见迹象；1＝水肿和/或红斑：单趾；2＝水肿和/或红斑：双关节；3＝水肿和/或红斑：超过两个关节；以及4＝整个脚爪和脚趾出现严重关节炎并伴随有关节强直和关节畸形。

[00343]组织学检测——在实验最后，对小鼠实施安乐死，并截取其一肢保存于福尔马林缓冲液中。在取得关节炎指数分析的满意结果之后，从每个治疗组中随机选取两个动物通过H&E染色进行组织学分析。软组织、关节和骨骼的变化以四分制进行评定，得分4表明严重损伤。

[00344]细胞因子分析—为进行细胞因子分析，在实验结束时收集小鼠血清。所需样本体积很少(～0.2-0.3ml/小鼠)，来自十只小鼠的样本随机平均分为两组。通过这种方法可进行重复分析；每次分析均应至少进行两次。用小鼠特效试剂(R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市)根据制造商说明对TNF-和IL-6进行分析。只有5/26的研究样本产生可检测的TNF-水平；其中包括治疗对照动物组的赋形剂。

[00345]结果—图29所示为以关节炎指数表示的RIAA效果。使用10mg/kg的脱氢皮质(甾)醇(30-42天)、20mg/kg的塞来昔布(32-42天)、250mg/kg的RIAA  (34-42天)、50mg/kg的RIAA(38-40天)均观测到指数显著降低(p<0.05，双尾t-检测)，这证实50或250mg/kg剂量下RIAA的抗关节炎效力。表30以关节炎指数显示了THIAA的效果。这里，使用塞来昔布(32-42天)、250mg/kg的THIAA(34-42天)以及50mg/kg的THIAA(34-40天)均观测到指数明显降低，这也表明THIAA作为抗关节炎药剂的效果。

[00346]图31显示关节组织损伤的组织学检测结果，并显示在THIAA处理的个体治疗中没有或极小存在关节损伤的迹象。这里有明确剂量反应标识并且在250mg/kg和50mg/kg下的组织学得分分别降低了40％和28％。这与关节组织只有轻微损伤的塞来昔布治疗组相差无几。需注意塞来西布(20mg/kg)治疗组的组织学得分实际上增加33％。动物个体间存在显著差异，例如一个经赋形剂处理的动物显示中度关节损伤迹象，而其他动物明显未受任何损伤。除了脱氢皮质(甾)醇治疗组的一个动物外，其他所有治疗组均呈现关节膜炎症状。

[00347]图32总结了IL-6细胞因子分析的结果。除了塞来西布，对于所有治疗组应用高剂量ρ均降低血清白细胞介素-6的水平，尽管只有脱氢皮质(甾)醇达到统计学意义。

实施例37

RIAA：金合欢属(1：5)混合物对人类代谢综合征的效果。

[00348]本实验将使用RIAA：金合欢属(1:5)制剂对罹患代谢综合征的患者志愿者体内诸多临床相关症状测定治疗效果。

[00349]方法和试验设计—本试验在单独的研究中心进行，是随机的、安慰剂对照的及双盲试验(美国华盛顿州吉格港功能性医学研究中心)。本实验所需实验主体(年龄在18至79岁之间)应满足下列纳入标准：(i)体质指数在25至42.5kg/m2之间；(ii)甘油三酯/高密度脂蛋白胆固醇比率≥3.5；(iii)空腹胰岛素浓度≥10mcIU/mL。此外，实验主体需还须满足以下5条标准中的3条：(i)腰围>35″(女性)及>40″  (男性)；(ii)甘油三酯≥150mg/dL；(iii)高密度脂蛋白<50mg/dL(女性)，及<40mg/dL(男性)；  (iv)血压≥130/85或确诊高血压；(v)空腹血糖≥100mg/dL。

[00350]将满足纳入标准的实验主体随机分为以下四种：(i)实验主体服用RIAA/金合欢属混合物(每片含100mg RIAA和500mg金合欢属尼罗心材提取物)每日3次，一次1片；(ii)实验主体服用RIAA/金合欢属混合物，每日3次，每次2片；(iii)安慰剂，每天3次，每次1片；(iv)安慰剂，每日3次，每次2片。整个试验持续12周。在第1天，第8周以及第12周从实验主体身上采集血样，以分析制剂对代谢综合征各种参数的效果。

[00351]结果—表32所示是参加试验的实验主体(合并安慰剂组和每天服用3片RIAA/金合欢属片剂的实验主体)的初始人口统计和生化特性。RIAA/金合欢属和安慰剂组(分别为99.0mg/dL对96.5mg/dL以及128.4mg/dL对109.2mg/dL)间初始空腹血糖值和餐后两小时血糖值十分接近。此外，两个血糖值均大体在实验室参考范围内(空腹血糖浓度在40-110mg/dL间，而餐后两小时血糖浓度在70-150mg/dL间)。这和预期相符合，因为餐后两小时胰岛素反应的改变要先于在代谢综合征和糖尿病后期阶段观察到的血糖和空腹胰岛素含量的上升。

表32

人口统计和基础生化特性

^*若实验主体胰岛素值、体质指数、基础代谢指数、血压值、甘油三酯和高密度脂蛋白值异常，则在分析时将其排除。

[00352]空腹血胰岛素浓度的测量结果类似，并大致在参考范围内，对于RIAA/金合欢属实验组，其初始值为17.5mcIU/mL，而安慰剂组的初始值为13.2mcIU/mL(参考范围为3-30mcIU/mL)。餐后两小时胰岛素水平升高，并超出参考范围(99.3mcIU/mL对80.2mcIU/mL)，并显示比空腹胰岛素或血糖测量值更大的可变性。尽管初始值相似，RIAA/金合欢属组显示，空腹胰岛素和血糖浓度以及8周后安慰剂组的餐后两小时血糖浓度测定值有更大程度的降低(图33和34)。

[00353]稳态模型评估(HOMA)得分是一种已公布的测定胰岛素抵抗的方法。所有实验主体的HOMA得分变化均显示在图35中。由于观察到代谢综合征主体胰岛素和血糖值的可变性，实验仅对空腹胰岛素浓度>15mcIU/mL的实验主体亚组进行评估。这一小组的HOMA得分显示在图33中，结果表明相对于安慰剂组，RIAA/金合欢属组的HOMA得分明显降低。

表33

RIAA/金合欢属的制剂(3片/天)对初始空腹胰岛素≥15mcIU/mL的实验主体体内 HOME得分的影响。

[00354]组之间的差异在第8周(p<0.05)时显著。使用已发表的方法[(胰岛素(mcIU/mL)*血糖(mg/dL))/405]计算空腹胰岛素和血糖的HOMA得分。

[00355]甘油三酯含量(TG)的提高也是代谢综合征的一个重要暗示性标志。表34和图36说明相对于安慰剂组(p<0.05)，RIAA/金合欢属制剂可显著降低TG含量。对于RIAA/金合欢属组，TC/HDL-C的比值也大幅减小(6.40至5.28)，但安慰剂组未出现减小的现象(5.81至5.92)。

表34

RIAA/金合欢属的片剂(3片/天)对TG水平和TG/高密度脂蛋白胆固醇比值的影响。

[00356]让罹患代谢综合征实验主体服用片剂，药片组分为100mg ρ-异α酸和500mg金合欢属尼罗心材提取物，每天3片共持续8周，其相对于安慰剂，大幅降低餐后两小时胰岛素水平。此外，相对于服用安慰剂的实验主体，服用RIAA/金合欢属片剂的实验主体空腹胰岛素、空腹和餐后两小时血糖、空腹甘油三酯和稳定模型得分都大幅度降低。这些结果说明RIAA/金合欢属片剂可用于维持患代谢综合征的主体内胰岛素平衡。

实施例38

测试化合物对癌细胞体外增值的影响

[00357]本实验表明本发明若干测试化合物对癌细胞体外增值的直接抑制效应。

[00358]方法—将大肠癌细胞系接种在96孔细胞板上，密度为3 x 10³个细胞/孔，过夜培养以使细胞贴壁生长。在每个浓度下对测试材料重复测定8次。72小时后，利用细胞增殖检测试剂盒分析细胞中活细胞总数。计算相对于二甲亚砜溶剂对照所观察到的活细胞减少百分数。图中数值是8个所测定的±95％置信区间的平均值。

[00359]结果—图37-41分别表示RIAA(图37)、IAA(图38)、THIAA(图39)、HHIAA(图40)和黄腐酚(XN；图41)的抑制作用。

实施例39

塞来昔布和测试化合物对癌症细胞体外增殖的影响

[00360]本实验比较RIAA或THIAA结合塞来昔布对癌细胞体外增殖的观察和预期抑制效应。

[00361]方法—将大肠癌细胞系接种在96孔细胞板上，密度为3 x 10³个细胞/孔，过夜培养以使细胞贴壁生长。在每个浓度下对测试材料重复测定8次。72小时后，利用

细胞增殖检测试剂盒分析细胞中活细胞总数。然后计算相对于二甲亚砜溶剂对照所观察到的活细胞减少百分数。塞来昔布和RIAA或THIAA混合物的细胞毒性效应的预期值用下列关系式进行估算：1/[T]c＝X/[T]x+Y/[T]y，式中T＝毒性，其代表生长受抑制或被杀死的细胞所占分数，X、Y是测试混合物每种成分的相对分数，且X+Y＝1。图示观察值是在95％置信区间内所得8个观察值的平均数。当估计的百分数下降落于相应观察分数的95％置信区间之下时，就表示具有协同作用。

[00362]图42和43以图表方式呈现了观察到的和预期的RIAA(图42)或THIAA(图43)对癌细胞扩增的抑制效应间的比较。这些结果说明与塞来昔布混合的测试化合物对癌细胞增殖的抑制程度在大多数情况下高于数学上的预测。

实施例40

口服剂量后血清中THIAA检测

[00363]本实验旨在确定口服剂量后THIAA是否经新陈代谢并可探测。

[00364]方法—前剂量血清提取后，5粒软胶囊(188mg THIAA/每粒软胶囊)以游离酸形式释放的940mg THIAA(PR Tetra独立软胶囊。OG# 2210 KP-247.Lot C42331111)被吸收，紧接着用水果酸奶容器收集。除了脱咖啡因咖啡外，在服下THIAA后四个小时内并没有其它食物被吸收。每隔45分钟取一次样并置入没有凝块催化物的血清分离管中。让样品在室温下凝结45分钟，并在4℃下1800xg加速度下离心10分钟。然后加入含有0.5％HOAc的0.9ml的MeCN的0.3ml血浆并在-20℃下放置45-90分钟。此混合物在4℃ 15000xg加速度下离心10分钟。离心作用后出现明显的两相；从0.6ml的上相中取样以进行HPLC分析。利用加样确定回收率，该值大于95％。

[00365]结果—该结果显示在图44-46中。图44显示摄入940mg THIAA后在血清中测定的THIAA随时间的变化情况。图45显示摄入THIAA 225分钟后，血清中测定的THIAA各水平相对于测定的体外THIAA水平的情况。图46显示通过CYP2C9*1产生的THIAA新陈代谢的变化情况。

[00366]现在本发明已充分描述完毕，显而易见本领域的技术人员在不背离随附权利要求的精神和范围内均可对本发明做出变更和修改。

Claims (8)

1.用以治疗哺乳动物中对其所需蛋白激酶调节敏感的癌症方法，其中所述方法包括使用有效治疗剂量的还原异α酸给哺乳动物用药。

2.权利要求1的方法中，还原异α酸选自以下组群中：二氢异律草酮、二氢异类律草酮、二氢聚律草酮和ρ异α酸。

3.权利要求1的方法中，进行调节的蛋白激酶选自以下组群中：Aurora-A、DAPK2，、FGFR3、FGFR4、GSK3β、GSK3α、MAPK1、MAPKAP-K2、MSK2、MSSK1、PI3K、PI3Kδ、Rse、Syk以及TrkA。

4.权利要求1的方法中，对激酶调节敏感的癌症选自以下组群中：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、和甲状腺癌。

5.哺乳动物中对其所需蛋白激酶调节敏感的癌症治疗混合物，其中混合物包括有效治疗剂量的还原异α酸，这里有效治疗剂量调节与癌症相关的蛋白激酶。

6.权利要求5的混合物中，还原异α酸从以下组群中进行选择：二氢异律草酮、二氢异类律草酮、二氢聚律草酮和ρ异α酸。

7.权利要求5的混合物中，还包括药用可接受的辅料，其可从以下组群中选择：涂料、等渗和吸收延缓剂剂、粘结剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、甜味剂、吸收剂、去污剂以及乳化剂。

8.权利要求5的混合物中，该混合物还包括选自以下组群的一种或多种成分：抗氧化剂、维生素、矿物质、蛋白质、脂肪以及碳水化合物。

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