JP2010043064A - 脂肪細胞分化抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、又は脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することが可能な新規抗肥満剤の提供。
【解決手段】少なくとも1種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤。ホップ苦味成分として、好ましくはベータ酸及び還元型イソアルファ酸が特に好適である。ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられる。また、還元型イソアルファ酸としては、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸が挙げられる。
【選択図】なし
【解決手段】少なくとも1種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤。ホップ苦味成分として、好ましくはベータ酸及び還元型イソアルファ酸が特に好適である。ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられる。また、還元型イソアルファ酸としては、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸が挙げられる。
【選択図】なし
Description
本発明は、脂肪細胞分化抑制剤に関する。
肥満は、糖尿病、脂質代謝異常症、高血圧等の生活習慣病のリスクファクターとして問題となっている。抗肥満剤としては、例えば、小麦蛋白質の加水分解物を含有するものが知られている(特許文献1参照)。
肥満は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞(成熟脂肪細胞)へと分化し、その数が増加すること、又は脂肪細胞に脂肪が蓄積されることにより形成されるので、肥満を抑制するには、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、又は脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制するのが効果的である。そのような作用を有する抗肥満剤は種々知られている(例えば、上記特許文献1参照)が、未だ、消費者の多様な需要を満たすのに十分ではなく、更なる選択肢が強く求められている。
そこで、本発明は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、又は脂肪細胞への脂肪の蓄積を十分に抑制することが可能な新規の抗肥満剤を提供することを課題とする。
本発明は、少なくとも1種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤を提供する。また、本発明は、少なくとも1種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤を提供する。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、脂肪細胞分化(前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化)及び脂肪蓄積(脂肪細胞への脂肪の蓄積)を十分に抑制することができ、そのような作用により、肥満及びそれに起因する種々の症状若しくは疾患(例えば、糖尿病、脂質代謝異常症、高血圧)の予防、治療又は軽減を可能とする。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤において、ホップ苦味成分としては、より高い脂肪細胞分化抑制効果及び脂肪蓄積抑制効果が得られる点で、例えば、ベータ酸及び還元型イソアルファ酸が特に好適である。
ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、ルプロン、コルプロン及びアドルプロンが好適である。
還元型イソアルファ酸とは、イソアルファ酸のケトン基及び/又はプレニル基の二重結合を還元することによって得ることが可能な化合物を意味し、例えば、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸が挙げられる。
テトラヒドロイソアルファ酸としては、例えば、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン、テトラヒドロイソアドフムロン、テトラヒドロイソポストフムロン及びテトラヒドロイソプレフムロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンが好適である。
ローイソアルファ酸としては、例えば、ローイソフムロン、ローイソコフムロン、ローイソアドフムロン、ローイソポストフムロン及びローイソプレフムロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロンが好適である。
ヘキサヒドロイソアルファ酸としては、例えば、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン、ヘキサヒドロイソアドフムロン、ヘキサヒドロイソポストフムロン及びヘキサヒドロイソプレフムロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロンが好適である。
ベータ酸、還元型イソアルファ酸を始めとするホップ苦味成分は、生体に対する安全性が高く、長年に渡ってビール系飲料で利用されてきたものである。従って、ホップ苦味成分を有効成分とする本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤も、生体に対する安全性が高く、長期間継続的に摂取可能であり、医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等の成分として使用するのに好適である。すなわち、本発明はまた、上記脂肪細胞分化抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤を含有する医薬品、飲食品、飼料等を提供する。
本発明によれば、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を十分に抑制することが可能な新規の抗肥満剤が提供される。また、そのような抗肥満剤を含有する医薬品、飲食品、飼料等が提供される。
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、少なくとも1種のホップ苦味成分を有効成分として含有する。
ホップ苦味成分としては、例えば、ベータ酸、アルファ酸、イソアルファ酸及び還元型イソアルファ酸(テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸等)が挙げられる。
ベータ酸、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、それぞれ、下記一般式(1)〜(6)で表される化合物である。一般式(1)〜(6)中、Rは、−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3、−CH2CH2CH(CH3)2等から選択される基を表す。
ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられる。ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンは、それぞれ、一般式(1)で表される化合物のうち、Rが−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3及び−CH2CH2CH(CH3)2である化合物である。
アルファ酸としては、例えば、フムロン、コフムロン、アドフムロン、ポストフムロン及びプレフムロンが挙げられる。フムロン、コフムロン、アドフムロン、ポストフムロン及びプレフムロンは、それぞれ、一般式(2)で表される化合物のうち、Rが−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3及び−CH2CH2CH(CH3)2である化合物である。
イソアルファ酸としては、例えば、イソフムロン、イソコフムロン、イソアドフムロン、イソポストフムロン及びイソプレフムロンが挙げられる。イソフムロン、イソコフムロン、イソアドフムロン、イソポストフムロン及びイソプレフムロンは、それぞれ、一般式(3)で表される化合物のうち、Rが−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3及び−CH2CH2CH(CH3)2である化合物である。
テトラヒドロイソアルファ酸としては、例えば、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン、テトラヒドロイソアドフムロン、テトラヒドロイソポストフムロン及びテトラヒドロイソプレフムロンが挙げられる。テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン、テトラヒドロイソアドフムロン、テトラヒドロイソポストフムロン及びテトラヒドロイソプレフムロンは、それぞれ、一般式(4)で表される化合物のうち、Rが−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3及び−CH2CH2CH(CH3)2である化合物である。
ローイソアルファ酸としては、例えば、ローイソフムロン、ローイソコフムロン、ローイソアドフムロン、ローイソポストフムロン及びローイソプレフムロンが挙げられる。ローイソフムロン、ローイソコフムロン、ローイソアドフムロン、ローイソポストフムロン及びローイソプレフムロンは、それぞれ、一般式(5)で表される化合物のうち、Rが−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3及び−CH2CH2CH(CH3)2である化合物である。
ヘキサヒドロイソアルファ酸としては、例えば、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン、ヘキサヒドロイソアドフムロン、ヘキサヒドロイソポストフムロン及びヘキサヒドロイソプレフムロンが挙げられる。ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン、ヘキサヒドロイソアドフムロン、ヘキサヒドロイソポストフムロン及びヘキサヒドロイソプレフムロンは、それぞれ、一般式(6)で表される化合物のうち、Rが−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3及び−CH2CH2CH(CH3)2である化合物である。
ホップ苦味成分は、公知の方法(例えば、特開平7−330594号公報に記載の方法)に従って、天然のホップを抽出し、抽出物を分画・精製することによって得ることができる。また、ホップ苦味成分は、所望の成分を含有する市販のホップエキスから、HPLC等を用いて分取することによって得ることもできる。
また、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、例えば、下記反応式で表される方法に従って得ることができる。下記反応式において、一般式(2)〜(6)は、それぞれ、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸を表す。また、一般式(2)〜(6)中、Rは、−CH2CH(CH3)2、−CH(CH3)2、−CH(CH3)CH2CH3、−CH2CH3、−CH2CH2CH(CH3)2等から選択される基を表す。
このように、イソアルファ酸は、アルファ酸をアルカリ条件下で加熱することによって得ることができる。また、テトラヒドロイソアルファ酸は、イソアルファ酸をパラジウム付活性炭の存在下、水素ガスで接触還元させることによって得ることができる。また、ローイソアルファ酸は、イソアルファ酸を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって得ることができる。また、ヘキサヒドロイソアルファ酸は、テトラヒドロイソアルファ酸を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって得ることができる。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、固体(例えば、凍結乾燥させて得られる粉末)、液体(水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液)、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤等のいずれの剤形をとってもよい。また、本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、少なくとも1種のホップ苦味成分からなるものであってもよい。
上述の各種製剤は、少なくとも1種のホップ苦味成分と、薬学的に許容される添加剤(賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等)と、を混和することによって調製することができる。
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Tween 60、Tween 80、Span 80、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油(DHA、EPA等)、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Tween 80等が挙げられる。懸濁化剤としては、上述の界面活性剤の他、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等の成分として使用することができる。医薬品、飲食品、飼料等には、他の脂肪細胞分化抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤が含有されてもよい。
例えば、本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂;グルコース、フルクトース等の単糖類;スクロース等の二糖類;デキストロース、デンプン等の多糖類;エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類;ビタミンC等のビタミン類、が挙げられる。本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、ヒトに投与されても、非ヒト哺乳動物に投与されてもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
[実施例1]
(試験サンプルの調製)
ベータ酸(主としてルプロン、コルプロン及びアドルプロン)及びアルファ酸(主としてフムロン、コフムロン及びアドフムロン)の混合物(HPLC用標準品、ICE−2、Labor Veritas)を85%CH3OH/4.5%CH3COOHで5mg/mLの濃度に調整し、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけた後、HPLCによりアルファ酸を除去してベータ酸画分を得た。得られたベータ酸画分から、減圧濃縮及び凍結乾燥により水分を除去し、20%DMSO溶液で段階希釈して、所定濃度の試験サンプルを得た。なお、ベータ酸を含有しない20%DMSO溶液をコントロールとした。HPLCの条件は下記の通りである。
・カラム: C18カラム(資生堂 CAPCELLPAK C18;10mm×250mm)
・移動層: 85%CH3OH/4.5%CH3COOH
・流速: 3mL/分
(試験サンプルの調製)
ベータ酸(主としてルプロン、コルプロン及びアドルプロン)及びアルファ酸(主としてフムロン、コフムロン及びアドフムロン)の混合物(HPLC用標準品、ICE−2、Labor Veritas)を85%CH3OH/4.5%CH3COOHで5mg/mLの濃度に調整し、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけた後、HPLCによりアルファ酸を除去してベータ酸画分を得た。得られたベータ酸画分から、減圧濃縮及び凍結乾燥により水分を除去し、20%DMSO溶液で段階希釈して、所定濃度の試験サンプルを得た。なお、ベータ酸を含有しない20%DMSO溶液をコントロールとした。HPLCの条件は下記の通りである。
・カラム: C18カラム(資生堂 CAPCELLPAK C18;10mm×250mm)
・移動層: 85%CH3OH/4.5%CH3COOH
・流速: 3mL/分
(前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導)
マウス由来前駆脂肪細胞(3T3−L1細胞、IFO50416)を24ウェルプレートに1×104cells/well播種し、10%FBS添加DMEM培地を用いて、37℃の5%CO2インキュベータ内で4日間培養した(2日目に培地交換を行った)。
マウス由来前駆脂肪細胞(3T3−L1細胞、IFO50416)を24ウェルプレートに1×104cells/well播種し、10%FBS添加DMEM培地を用いて、37℃の5%CO2インキュベータ内で4日間培養した(2日目に培地交換を行った)。
培養開始から4日目に、デキサメタゾン250nM、1−メチル−3−イソブチルキサンチン500μM及びインスリン10μg/mLを含む10%FBS添加DMEM培地に培地交換して分化誘導を行った。3日間の分化誘導の後、試験サンプルを含有する10%FBS添加DMEM培地に培地交換して、更に7日間培養した(試験サンプル含有培地への培地交換から4日目に、試験サンプルを含有しない10%FBS添加DMEM培地に培地交換した)。
(オイルレッドO染色)
オイルレッドO染色液の調製:
オイルレッドO粉末0.5gを2−プロパノール100mLに溶解し、3000rpmで5分間遠心分離し、上清をシリンジフィルター(0.45μm)で濾過して、オイルレッドO染色原液を得た。オイルレッドO染色の際に、原液6mLに蒸留水4mLを加えて1時間静置した後、シリンジフィルター(0.45μm)で濾過して、オイルレッドO染色液を得た。
オイルレッドO染色液の調製:
オイルレッドO粉末0.5gを2−プロパノール100mLに溶解し、3000rpmで5分間遠心分離し、上清をシリンジフィルター(0.45μm)で濾過して、オイルレッドO染色原液を得た。オイルレッドO染色の際に、原液6mLに蒸留水4mLを加えて1時間静置した後、シリンジフィルター(0.45μm)で濾過して、オイルレッドO染色液を得た。
オイルレッドO染色:
培養終了後、ウェルから培地を除去し、PBS 500μLで細胞を洗浄した後、10%ホルマリン溶液500μLを添加し、4℃で1時間静置して細胞をウェル上に固定した。ホルマリン除去後、蒸留水500μLで細胞を洗浄し、オイルレッドO染色液300μLを添加し、室温で15分間静置して細胞内の脂肪滴を染色した。染色液除去後、蒸留水で細胞を洗浄し、光学顕微鏡(IMT−2、オリンパス社)を用いて100倍で観察した。更に、2−プロパノール500μLを添加して細胞から色素を抽出し、色素抽出液の吸光度(550nm)をプレートリーダーで測定した。
培養終了後、ウェルから培地を除去し、PBS 500μLで細胞を洗浄した後、10%ホルマリン溶液500μLを添加し、4℃で1時間静置して細胞をウェル上に固定した。ホルマリン除去後、蒸留水500μLで細胞を洗浄し、オイルレッドO染色液300μLを添加し、室温で15分間静置して細胞内の脂肪滴を染色した。染色液除去後、蒸留水で細胞を洗浄し、光学顕微鏡(IMT−2、オリンパス社)を用いて100倍で観察した。更に、2−プロパノール500μLを添加して細胞から色素を抽出し、色素抽出液の吸光度(550nm)をプレートリーダーで測定した。
(結果)
結果を図1〜5に示す。図1は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図1において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図2〜5は、オイルレッドO染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸0ppm(コントロール)、1ppm、5ppm、10ppmの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴(赤色に染色された部分)が少ないことが確認された。
結果を図1〜5に示す。図1は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図1において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図2〜5は、オイルレッドO染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸0ppm(コントロール)、1ppm、5ppm、10ppmの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴(赤色に染色された部分)が少ないことが確認された。
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
[実施例2]
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例1と同様にして、試験サンプルの調製、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドO染色を行った。
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例1と同様にして、試験サンプルの調製、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドO染色を行った。
結果を図6〜9に示す。図6は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図6において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図7〜9は、オイルレッドO染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸0ppm(コントロール)、1ppm、5ppmの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴(赤色に染色された部分)が少ないことが確認された。
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
[実施例3]
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例1と同様にして、試験サンプルの調製、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドO染色を行った。
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例1と同様にして、試験サンプルの調製、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドO染色を行った。
結果を図10〜14に示す。図10は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図10において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図11〜14は、オイルレッドO染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸0ppm(コントロール)、2ppm、4ppm、8ppmの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴(赤色に染色された部分)が少ないことが確認された。
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
[実施例4]
テトラヒドロイソアルファ酸(主としてテトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロン)を含有する試薬(Tetra(ICS−T2)、Labor Veritas、純度:99.4%)を20%DMSO溶液で段階希釈して、所定濃度の試験サンプルを得た。なお、テトラヒドロイソアルファ酸を含有しない20%DMSO溶液をコントロールとした。
テトラヒドロイソアルファ酸(主としてテトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロン)を含有する試薬(Tetra(ICS−T2)、Labor Veritas、純度:99.4%)を20%DMSO溶液で段階希釈して、所定濃度の試験サンプルを得た。なお、テトラヒドロイソアルファ酸を含有しない20%DMSO溶液をコントロールとした。
得られた試験サンプルについて、実施例1と同様にして、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドO染色を行った。
結果を図15〜17に示す。図15は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図15において、テトラヒドロイソアルファ酸(THIAA)濃度は、培養に用いた培地中のテトラヒドロイソアルファ酸濃度を示す。図16、17は、オイルレッドO染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、テトラヒドロイソアルファ酸0ppm(コントロール)、30ppmの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、テトラヒドロイソアルファ酸30ppmの場合の方が、コントロールと比較して脂肪滴(赤色に染色された部分)が少ないことが確認された。
上記結果から明らかなように、テトラヒドロイソアルファ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
[実施例5]
(試験サンプルの調製)
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例1と同様にして、試験サンプルを調製した。
(試験サンプルの調製)
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例1と同様にして、試験サンプルを調製した。
(前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導)
マウス由来前駆脂肪細胞(3T3−L1細胞、IFO50416)を24ウェルプレートに1×104cells/well播種し、10%FBS添加DMEM培地を用いて、37℃の5%CO2インキュベータ内で4日間培養した。
マウス由来前駆脂肪細胞(3T3−L1細胞、IFO50416)を24ウェルプレートに1×104cells/well播種し、10%FBS添加DMEM培地を用いて、37℃の5%CO2インキュベータ内で4日間培養した。
培養開始から4日目に、デキサメタゾン250nM、1−メチル−3−イソブチルキサンチン500μM及びインスリン10μg/mLを含む10%FBS添加DMEM培地に培地交換して分化誘導を行った。3日間の分化誘導の後、試験サンプルを含有する10%FBS添加DMEM培地に培地交換して、更に11日間培養した(試験サンプル含有培地への培地交換から4日目、10日目に、試験サンプルを含有しない10%FBS添加DMEM培地に培地交換した)。
(GPDH活性の測定)
細胞抽出用緩衝液の調製:
TES 1.146g、EDTA・2Na 37.2mg及び2−メルカプトエタノール6.97μLに蒸留水を添加し、pHを7.5に調整した後、蒸留水で1000mLにメスアップして細胞抽出用緩衝液を得た。
細胞抽出用緩衝液の調製:
TES 1.146g、EDTA・2Na 37.2mg及び2−メルカプトエタノール6.97μLに蒸留水を添加し、pHを7.5に調整した後、蒸留水で1000mLにメスアップして細胞抽出用緩衝液を得た。
反応用緩衝液の調製:
トリエタノールアミン2.321g、EDTA・2Na 1.163g及び2−メルカプトエタノール872μLに蒸留水を添加し、pHを7.5に調整した後、蒸留水で100mLにメスアップして反応用緩衝液を得た。
トリエタノールアミン2.321g、EDTA・2Na 1.163g及び2−メルカプトエタノール872μLに蒸留水を添加し、pHを7.5に調整した後、蒸留水で100mLにメスアップして反応用緩衝液を得た。
GPDH活性の測定:
培養終了後、ウェルから培地を除去し、PBS 500μLで細胞を2回洗浄した後、トリプシン−EDTA(0.05%)100μLを添加し、37℃で3分間インキュベートした。その後、細胞抽出用緩衝液150μLを添加し、氷冷した水中で5分間、超音波処理を行った。超音波処理後、室温下、10000rpmで5分間遠心分離し、上清を回収して細胞抽出液を得た。
培養終了後、ウェルから培地を除去し、PBS 500μLで細胞を2回洗浄した後、トリプシン−EDTA(0.05%)100μLを添加し、37℃で3分間インキュベートした。その後、細胞抽出用緩衝液150μLを添加し、氷冷した水中で5分間、超音波処理を行った。超音波処理後、室温下、10000rpmで5分間遠心分離し、上清を回収して細胞抽出液を得た。
細胞抽出液10μLを、反応用緩衝液70μL、1mM NADH 10μL及び2mM DHA 10μLと共にウェルに入れて酵素反応を開始させ、反応混合液の吸光度(340nm)を30秒毎に10分間測定した。測定結果に基づいて、下記式により脂肪細胞のGPDH(グリセロール−3−リン酸脱水素酵素)活性を求めた。
GPDH活性(U/mL)=ΔO.D.×0.482
[式中、ΔO.D.は、1分間当たりの吸光度の変化量(平均)を表す。]
GPDH活性(U/mL)=ΔO.D.×0.482
[式中、ΔO.D.は、1分間当たりの吸光度の変化量(平均)を表す。]
(結果)
結果を図18、19に示す。図18は、反応混合液の吸光度の経時的変化を示すグラフである。図19は、脂肪細胞のGPDH活性を示すグラフである。図18、19において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。
結果を図18、19に示す。図18は、反応混合液の吸光度の経時的変化を示すグラフである。図19は、脂肪細胞のGPDH活性を示すグラフである。図18、19において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を顕著に抑制した。
[実施例6]
(試験飼料の調製)
液状の10%ベータ酸含有エキスであるBetastab 10A(登録商標)(BARTH−HAAS社)を粉末飼料AIN93Gに混合して、ベータ酸を0.5重量%含有するベータ酸含有飼料を調製した。AIN93G及びベータ酸含有試料の組成は表1(各成分量の単位はg/kg飼料)の通りである。
(試験飼料の調製)
液状の10%ベータ酸含有エキスであるBetastab 10A(登録商標)(BARTH−HAAS社)を粉末飼料AIN93Gに混合して、ベータ酸を0.5重量%含有するベータ酸含有飼料を調製した。AIN93G及びベータ酸含有試料の組成は表1(各成分量の単位はg/kg飼料)の通りである。
(試験飼料の投与)
7週齢の雌性ddyマウス(日本エスエルシー社)を1週間馴化飼育した後、一般状態が良好であった24匹を選抜し、体重(平均)が群間でバラつかないように各群8頭の3群(偽手術群、コントロール群、ベータ酸投与群)に分け、コントロール群及びベータ酸投与群のマウスには卵巣摘出手術(切開したマウスの背部から左右の卵巣を摘出し、摘出後、切開した部位を縫合)を、また、偽手術群のマウスには偽手術を施した。なお、卵巣が摘出されると、エストロゲンが欠乏して脂質代謝異常が生じ、脂肪重量及び体重が増加することが知られている。
7週齢の雌性ddyマウス(日本エスエルシー社)を1週間馴化飼育した後、一般状態が良好であった24匹を選抜し、体重(平均)が群間でバラつかないように各群8頭の3群(偽手術群、コントロール群、ベータ酸投与群)に分け、コントロール群及びベータ酸投与群のマウスには卵巣摘出手術(切開したマウスの背部から左右の卵巣を摘出し、摘出後、切開した部位を縫合)を、また、偽手術群のマウスには偽手術を施した。なお、卵巣が摘出されると、エストロゲンが欠乏して脂質代謝異常が生じ、脂肪重量及び体重が増加することが知られている。
手術後、偽手術群及びコントロール群のマウスにはAIN93G及び水道水を、また、ベータ酸投与群のマウスにはベータ酸含有飼料及び水道水を6週間自由摂取させた。
馴化期間(1週間)及びその後の試験期間(6週間)を通じて、マウスは、SPF環境下、温度23±2℃、湿度55±5%、明暗サイクル12時間(明期:8時30分〜20時30分;暗期:20時30分〜8時30分)の条件で個別に飼育した。馴化期間中は、飼料としてAIN93Gをそのまま使用した。
(体重、脂肪重量、血清脂質値の測定)
試験期間終了後、各群のマウスについて体重を測定した。また、エーテル麻酔下、解剖及び心採血を行って、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値を測定した(後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量及び腸間膜脂肪重量の測定は、コントロール群及びベータ酸投与群についてのみ行った)。血清総コレステロール値及び血清リン脂質値の測定は、テストワコー(和光純薬工業)を用いて行った。
試験期間終了後、各群のマウスについて体重を測定した。また、エーテル麻酔下、解剖及び心採血を行って、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値を測定した(後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量及び腸間膜脂肪重量の測定は、コントロール群及びベータ酸投与群についてのみ行った)。血清総コレステロール値及び血清リン脂質値の測定は、テストワコー(和光純薬工業)を用いて行った。
(結果)
結果(平均±標準誤差)を表2〜5及び図20〜22に示す。図20は、各群のマウスの後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量及び腹腔内総脂肪重量を示すグラフである。図21は、各群のマウスの血清総コレステロール値を示すグラフである。図22は、各群のマウスの血清リン脂質値を示すグラフである。なお、腹腔内総脂肪重量は、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量及び腸間膜脂肪重量の合計に相当する。
結果(平均±標準誤差)を表2〜5及び図20〜22に示す。図20は、各群のマウスの後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量及び腹腔内総脂肪重量を示すグラフである。図21は、各群のマウスの血清総コレステロール値を示すグラフである。図22は、各群のマウスの血清リン脂質値を示すグラフである。なお、腹腔内総脂肪重量は、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量及び腸間膜脂肪重量の合計に相当する。
表2から明らかなように、試験期間中の体重増加は、コントロール群において、偽手術群と比較して顕著に大きかった。そして、ベータ酸投与群では、偽手術群及びコントロール群と比較して体重増加が顕著に抑制された。
表3、4及び図20から明らかなように、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量及び腹腔内総脂肪重量はいずれも、ベータ酸投与群において、コントロール群と比較して顕著に小さかった。
表5及び図21、22から明らかなように、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値はいずれも、卵巣摘出手術を施した2群(コントロール群、ベータ酸投与群)において、偽手術群と比較して顕著に高かった。そして、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値のいずれも、ベータ酸投与群ではコントロール群と比較して顕著に低かった。
以上の実施例により、本発明の脂肪細胞分化抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤を使用すれば、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制することが可能となることが示された。
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は肥満予防等に有用である。
Claims (8)
- 少なくとも1種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤。
- ベータ酸を有効成分として含有する、請求項1に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
- 前記ベータ酸が、ルプロン、コルプロン及びアドルプロンのうちの少なくとも1種である、請求項2に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
- 還元型イソアルファ酸を有効成分として含有する、請求項1に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
- 前記還元型イソアルファ酸がテトラヒドロイソアルファ酸である、請求項4に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
- 前記テトラヒドロイソアルファ酸が、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンのうちの少なくとも1種である、請求項5に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する医薬品。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する飲食品。
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