JP2009541326A - ベータ酸に基づくタンパク質キナーゼ調節癌治療 - Google Patents

ベータ酸に基づくタンパク質キナーゼ調節癌治療 Download PDF

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Abstract

癌治療に向けた、タンパク質キナーゼ調節のための化合物および方法を開示する。開示される化合物および方法は、一般的にホップに見られるベータ酸に基づく。
【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
〔００１〕本特許出願は、２００６年６月２０日出願の米国仮出願第６０／８１５， ０６４号の優先権を主張する。
〔００２〕本発明は、概して、タンパク質キナーゼ調節の影響を受けやすい癌を治療または阻害するために使用することができる方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、化合物、または一般的にホップ、もしくは植物属アカシアの一員のいずれかから単離される派生物、またはそれらの組み合わせを利用する方法および組成物に関する。
〔００３〕シグナル伝達は、正常な恒常性の維持、または不安定な場合に、多数の疾病病因および状態に関連する原因もしくは寄与メカニズムとしての作用に重要な、包括的な制御メカニズムを提供する。細胞レベルでは、シグナル伝達とは、細胞の外部から細胞内部へのシグナルまたはシグナリング部分の動きを指す。その受容体標的に到達すると、シグナルは、多くの細胞事象に必要なリガンド−受容体相互作用を開始することができ、後続シグナルとしてさらに作用できるものもある。かかる相互作用は、連続カスケードのみでなく、さらに恒常作用の微調整された制御を提供することができるシグナル事象の複雑な相互作用ネットワークまたはウェブとして機能する。しかしこのネットワークは、無制御状態となる可能性があるため、細胞活動の変動、および応答細胞内に発現した遺伝子プログラムの変化をもたらす。例えば、インスリン感受性および抵抗性を調整する、相互作用キナーゼウェブの簡略版を表示する、図１を参照のこと。
〔００４〕シグナル伝達受容体は、概して３つのクラスに分類される。受容体の第１のクラスは、細胞膜を貫通し、一部の固有酵素活性を有する受容体である。固有酵素活性を有する代表的な受容体には、チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦ、インスリン、ＥＧＦ、およびＦＧＦ受容体）、チロシンホスファターゼ（例えば、Ｔ細胞およびマクロファージのＣＤ４５［クラスター決定因子４５］タンパク質）、グアニル酸シクラーゼ（例えば、ナトリウム利尿ペプチド受容体）およびセリン／トレオニンキナーゼ（例えば、アクチビンおよびＴＧＦ−β受容体）であるものを含む。固有チロシンキナーゼ活性を有する受容体は、自己リン酸化、ならびに他の基質のリン酸化を行うことができる。
〔００５〕第２のクラスの受容体は、細胞内のＧＴＰ結合および加水分解タンパク質（Ｇタンパク質と称される）に連結するものである。Ｇタンパク質と相互作用するこのクラスの受容体は、７つの膜貫通ドメインを特徴とする構造を有する。これらの受容体は、蛇行性（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）受容体と称される。このクラスの例は、アドレナリン受容体、嗅覚受容体、および一部のホルモン受容体（例えば、グルカゴン、アンジオテンシン、バソプレシン、およびブラジキニン）である。
〔００６〕受容体の第３のクラスは、リガンド結合の際に、細胞内に見られ、リガンド−受容体複合体が、直接遺伝子転写に影響を及ぼす中核へ移動する受容体として説明することができる。
〔００７〕受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコード化するタンパク質は、４つの主要ドメイン：ａ）膜貫通ドメイン、ｂ）細胞外リガンド結合ドメイン、ｃ）細胞内制御ドメイン、およびｄ）細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。ＲＴＫのアミノ酸配列は、ｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼ（ＡＴＰおよび基質結合領域内）のものにより高度に保存される。ＲＴＫタンパク質は、高システインドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、カドヘリンドメイン、高ロイシンドメイン、クリングルドメイン、酸性ドメイン、ＩＩＩ型フィブロネクチンリピート、ディスコイディンＩ様ドメイン、およびＥＧＦ様ドメインを含む、それらの細胞外部分における構造的特長に基づき、ファミリーに分類される。これらの種々の細胞外ドメインの存在に基づいて、ＲＴＫは、少なくとも１４の異なるファミリーに分割された。
〔００８〕リン酸化の際の固有チロシンキナーゼ活性を有する多くの受容体は、シグナルカスケードの他のタンパク質と相互作用する。これらの他のタンパク質は、ｃ−Ｓｒｃプロト癌遺伝子において最初に識別されたドメインと同種である、アミノ酸配列のドメインを含む。これらのドメインは、ＳＨ２ドメインと称される。
〔００９〕ＲＴＫ、またはチロシンキナーゼに関連する受容体を有するタンパク質を含むＳＨ２ドメインの相互作用は、タンパク質を含むＳＨ２のチロシンリン酸化につながる。結果として生じるリン酸化により、その活性に変動（陽性または陰性のいずれか）をもたらす。固有酵素活性を有するタンパク質を含むいくつかのＳＨ２は、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ｒａｓＧＡＰ）に関連するプロト癌遺伝子ｃ−Ｒａｓ、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）、ならびにタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のＳｒｃファミリーの要素を含む。
〔００１０〕非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、全般的にそれ自身の酵素活性に欠く細胞受容体に連結する。タンパク質相互作用を介する受容体シグナリングの例には、インスリン受容体（ＩＲ）を含む。この受容体は、固有チロシンキナーゼ活性を有するが、自己リン酸化後に、ＳＨ２ドメイン（例えば、ＰＩ−３ＫまたはＰＬＣ−γ）を含む酵素的活性タンパク質と直接相互作用しない。その代わりに、主要なＩＲ基質は、ＩＲＳ−１と称されるタンパク質である。
〔００１１〕ＴＧＦ−βスーパーファミリーに対する受容体は、原型的受容体セリン／トレオニンキナーゼ（ＲＳＴＫ）を示す。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多機能タンパク質は、アクチビン、インヒビン、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。これらのタンパク質は、細胞増殖または分化を誘発および／または阻害し、種々の細胞型の移動および付着を調整することができる。ＴＧＦ−βの１つの主要な効果は、細胞周期を通じた進行の制御である。さらに、ＴＧＦ−βへの細胞の反応に伴う１つの核タンパク質は、Ｍｙｃ結合要素を内部に有する遺伝子の発現に直接影響を及ぼすｃ−Ｍｙｃである。ＰＫＡ、ＰＫＣ、およびＭＡＰキナーゼは、非受容体セリン／トレオニンキナーゼの３つの主要なクラスを示す。
〔００１２〕キナーゼ活性と病状との関係は、現在、多くの研究所で調査中である。かかる関係は、その疾病自体の原因となるか、症候に関連する疾病の発現および進行に深く関連するかのいずれかである場合がある。自己免疫疾患である関節リウマチは、キナーゼと疾病との関係が現在調査されている一例である。
〔００１３〕自己免疫疾患は、体が、それ自身の臓器、組織、および細胞を攻撃（タンパク質リン酸化を介して媒介されるプロセス）する、自己抗体を生成する免疫系の機能障害に起因する。
〔００１４〕８０以上の臨床的に異なる自己免疫疾患が識別され、米国では合計約２４００万人が苦しんでいる。自己免疫疾患は、体のいかなる組織または臓器にも影響を及ぼし得る。この多様性により、自己免疫発作の部位に応じて、幅広い症状および臓器障害を引き起こす可能性がある。多くの自己免疫疾患に対する治療が存在するが、それらのうちのいずれに対しても明確な治療法はない。重篤性を軽減するための治療は、多くの場合、有害な副作用をもたらす。
〔００１５〕関節リウマチ（ＲＡ）は、最も多く見られ、自己免疫疾患では最もよく研究されており、世界の人口の約１％を苦しめ、理由は不明だが、他の自己免疫疾患と同様に増加している。ＲＡは、関節の進行性の骨および軟骨破壊をもたらす、慢性滑膜炎を特徴とする。サイトカイン、ケモカイン、およびプロスタグランジンは、炎症の主要なメディエータであり、活動性疾患の患者の間接および血液の両方で大量に見られる。例えば、ＰＧＥ２は、ＲＡ患者の滑液中に大量に存在する。ＰＧＥ２レベルの上昇は、炎症部位でのシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の誘導によって、媒介される。［例えば、van der Kraan PM and van den Berg WB. Anabolic and destructive mediators in osteoarthritis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care,3:205-211,2000;Choy EHS and Panayi GS.Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis. N Eng J Med.344:907-916,2001、およびWong BR,et al. Targeting Syk as a treatment for allergic and autoimmune disorders. Expert Opin Investig Drugs 13:743-762,2004を参照のこと。］
〔００１６〕ヒトにおけるＲＡの病因および病原性は、依然としてあまり理解されていないが、３段階で進行すると考えられている。初期段階では、樹状細胞が、自己反応性Ｔ細胞に対し、自己抗原を示す。Ｔ細胞は、自己抗体の生成をもたらすサイトカインを介して自己反応性Ｂ細胞を活性化し、同様に関節で免疫複合体を形成する。エフェクタ段階では、免疫複合体は、マクロファージ上のＦｃｆ受容体、およびマスト細胞に結合し、サイトカインおよびケモカインの放出、ならびに炎症および疼痛をもたらす。最終段階では、サイトカインおよびケモカインは、プロテアーゼ、酸、およびＯ２−等のＲＯＳを放出する滑膜線維芽細胞、破骨細胞、および多形核好中球を活性化させ、動員し、不可逆的な軟骨および骨破壊をもたらす。
〔００１７〕コラーゲン誘導性ＲＡ動物モデルにおいては、ＴおよびＢ細胞の関与が、疾患を開始するのに必要となる。Ｂ細胞活性化により、抗原受容体の始動の後に、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）およびホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介してシグナルを送る［Ward SG,Finan P.Isoform-specific phosphoinositide 3-kinase inhibitors as therapeutic agents. Curr Opin Pharmacol. Aug;3(4):426-34,(2003)］。Ｂ細胞に抗原受容体が連結した後、Ｓｙｋは３つのチロシンでリン酸化する。Ｓｙｋは、免疫認識受容体を多数の下流シグナル経路に連結する上で、中心的な役割を担う、７２−ｋＤａタンパク質−チロシンキナーゼである。この機能は、その触媒活性と、ＳＨ２ドメインを含むエフェクタタンパク質との相互作用に関与するその能力との両方の性質である。Ｔｙｒ−３１７、−３４２、および−３４６のリン酸化により、タンパク質を含む多数のＳＨ２ドメインに対するドッキング部位を創出する。［Hutchcroft,J.E.,Harrison,M.L.& Geahlen,R.L.(1992). Association of the 72-kDa protein-tyrosine kinase Ptk72 with the B-cell antigen receptor.J.Biol.Chem. 267: 8613-8619,(1992)、およびYamada,T.,Taniguchi,T.,Yang,C.,Yasue,S.,Saito,H.& Yamamura,H.Association with B-cell antigen cell antigen receptor with protein-tyrosine kinase-P72(Syk)and activation by engagement of membrane IgM.Eur.J.Biochem.213:455-459,(1993)］
〔００１８〕Ｓｙｋは、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）、およびマクロファージ、または好中球Ｆｃ受容体の連結を含む、種々のシグナルに応えて、ＰＩ３Ｋの活性化に必要であることが示されてきた。［Crowley,M.T.,et al,. J.Exp.Med.186: 1027-1039,(1997);Raeder,E.M.,et al.,J.Immunol.163,6785-6793,(1999)、およびJiang,K.,et al.,Blood 101,236-244,(2003)を参照のこと。］Ｂ細胞では、ＢＣＲ刺激性のＰＩ３Ｋの活性化は、ＰＩ３Ｋのｐ８５制御サブユニットのための結合部位を創出する、ＢＣＡＰ、ＣＤ１９、またはＧａｂ１等のアダプタタンパク質のリン酸化を通じて達成され得る。多くのＩｇＧ受容体によって送信されたシグナルは、ＳｙｋとＰＩ３Ｋの両方の活性、およびクラスター化した受容体の部位へのそれらの動員を必要とする。好中球および単球では、リン酸化免疫受容体チロシンに基づく、ＦｃｇＲＩＩＡ上の活性化モチーフ配列との直接的な関連が、受容体へのＰＩ３Ｋの動員のためのメカニズムとして提案された。また近年、ＳｙｋとＰＩ３Ｋとの直接的な分子相互作用が報告されている［Moon KD,et al.,Molecular Basis for a Direct Interaction between the Syk Protein-tyrosine Kinase and Phosphoinositide3-Kinase.J.Biol.Chem.280,No.2,Issue of January 14,pp.1543-1551,(2005)］。
〔００１９〕多くの研究によって、ＣＯＸ−２活性の阻害剤は、ＰＧＥ２生成の減少をもたらし、ＲＡ等の慢性的な関節炎状態の患者のための鎮痛において効果的であることが示されてきた。しかし、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の両方が、胃腸系および心血管系等の組織における重要な維持機能に関与することから、ＣＯＸ酵素活性を阻害する製剤の悪影響が疑問視されてきた。したがって、これらの患者の鎮痛を図る、安全な長期治療アプローチを設計することが必要である。ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳ合成の誘導剤は、Ｓｙｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８、ＥＲＫ１／２、およびＮＦ−ｋＢ依存性経路を介してシグナルを送ることから、これらの経路の阻害剤は、自己免疫状態、特にＲＡ患者の炎症および変性した関節において治療的であり得る。
〔００２０〕ホップ派生物Ｒｈｏイソアルファ酸（ＲＩＡＡ）が、炎症のＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージモデルにおけるＰＧＥ２阻害のためのスクリーニングで発見された。本研究で、我々は、ＲＩＡＡが直接的なＣＯＸ酵素阻害剤であるかどうか、および／またはＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの誘導を阻害するかどうかを調査した。ＲＩＡＡは、直接ＣＯＸ酵素活性を阻害しないが、代わりにＮＦ−ｋＢ駆動酵素誘導を阻害するという我々の所見から、ＲＩＡＡがキナーゼ阻害剤であるかどうかを調査するに至った。ＲＩＡＡがＳｙｋとＰＩ３Ｋの両方を阻害するという我々の所見から、種々の自己免疫疾患を罹患する患者における、試験的研究の有効性を試験するに至った。
〔００２１〕疾患の症候との関連について現在調査中である他のキナーゼには、オーロラ、ＦＧＦＢ、ＭＳＫ、ＲＳＥ、およびＳＹＫが含まれる。
〔００２２〕オーロラ−細胞分裂の重要なレギュレータである、セリン／トレオニンキナーゼのオーロラファミリーには、オーロラＡ、Ｂ、およびＣが含まれる。オーロラＡおよびＢキナーゼは、有糸分裂において、直接的だが、異なった役割を有することが識別されてきた。これらの３つのイソフォームの過剰発現は、白血病、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、および子宮頸癌を含む、広範囲のヒト腫瘍のタイプに関連付けられてきた。
〔００２３〕線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼである。この受容体の変異は、受容体の二量化による構成的活性化、キナーゼ活性化、およびＦＧＦへの親和性の増加をもたらし得る。ＦＧＦＲは、軟骨形成不全、血管形成、および先天性疾患に関連するとみなされてきている。
〔００２４〕ＭＳＫ（マイトジェンおよびストレス活性化タンパク質キナーゼ）１およびＭＳＫ２は、体内ＥＲＫ（細胞外シグナル調整キナーゼ）１／２またはｐ３８ ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）経路のいずれかのキナーゼ活性下流であり、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）およびヒストンＨ３のリン酸化に必要とされる。
〔００２５〕Ｒｓｅは、ほとんどの場合、脳に発現する。Ｂｒｔ、ＢＹＫ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ３、Ｓｋｙ、Ｔｉｆ、またはＳｅａ関連の受容体チロシンキナーゼとしても既知であるＲｓｅは、アポトーシスからニューロンを保護することが主要な役割である、受容体チロシンキナーゼである。Ｒｓｅ、Ａｘｌ、およびＭｅｒは、細胞付着分子関連受容体チロシンキナーゼの新たに識別されたファミリーに属する。ＧＡＳ６は、チロシンキナーゼ受容体Ｒｓｅ、Ａｘｌ、およびＭｅｒに対するリガンドである。ＧＡＳ６は、静止ＥＣによって生成され、炎症性刺激がＥＣの接着性機構を刺激した際に消耗される、生理学的抗炎症剤として機能する。
〔００２６〕２つのイソフォームに存在するグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）が、グリコーゲン代謝の制御に関与する酵素として識別されており、細胞増殖および細胞死のレギュレータとして作用し得る。多くのセリン−トレオニンタンパク質キナーゼとは異なり、ＧＳＫ−３は、構成的に活性があり、インスリンまたは成長因子に応じて阻害される。筋グリコーゲン合成のインスリン刺激におけるその役割により、それは、糖尿病およびメタボリック症候群の治療的介入のための興味を引く標的となる。
〔００２７〕 ＧＳＫ−３制御異常は、インスリン抵抗性の発達における焦点であると示されてきた。ＧＳＫ３の阻害は、グルコース処理率の増加ばかりでなく、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよび肝細胞のグルコース−６−ホスファターゼ等の糖新生遺伝子の阻害によって、インスリン抵抗性を改善する。さらに、選択的ＧＳＫ３阻害剤は、体外および体内で筋肉内のグルコース輸送および利用のインスリン依存性の活性化を強化する。またＧＳＫ３は、インスリン受容体基質１のセリン／トレオニン残基を直接リン酸化し、インスリンシグナリング障害を引き起こす。ＧＳＫ３は、インスリンシグナリング経路において重要な役割を果たし、インスリンの非存在下で、グリコーゲン合成酵素をリン酸化し、阻害する［Parker,P.J.,Caudwell,F.B.,and Cohen,P.(1983)Eur.J.Biochem.130:227-234］。証拠が増加することにより、骨格筋グルコース輸送活性の制御における、ＧＳＫ−３の負の役割を支持する。例えば、選択的ＧＳＫ−３阻害剤によるインスリン抵抗性のげっ歯類の急性治療は、全身のインスリン感受性および筋グルコース輸送でのインスリン作用を改善する。特定のＧＳＫ−３阻害剤による、インスリン抵抗性の前糖尿病の肥満体Ｚｕｃｋｅｒラットの慢性治療は、傾向的なグルコース耐性および全身のインスリン感受性を高め、脂質異常症の改善と、骨格筋におけるＩＲＳ−１依存性インスリンシグナリングの向上に関連する。これらの結果は、筋肉内のＧＳＫ−３の選択的標的化が、肥満関連のインスリン抵抗性の治療のための効果的な介入となり得るという証拠を提供する。
〔００２８〕Ｓｙｋは、Ｂ細胞受容体およびＩｇＥ受容体からのシグナリングに関与するＺＡＰ−７０に関連した非受容体チロシンキナーゼである。Ｓｙｋは、これらの受容体内のＩＴＡＭモチーフに結合し、Ｒａｓ、ＰＩ３キナーゼ、およびＰＬＣｇシグナリング経路を介してシグナリングを開始する。Ｓｙｋは、細胞内シグナリングで重要な役割を果たすので、炎症性疾患および呼吸器障害の重要な標的である。
〔００２９〕したがって、単一または多数の選択されたキナーゼの発現または活性を調節する方法および組成物を識別するのに有用であろう。種々のタンパク質キナーゼおよびキナーゼ経路間の関係と相互作用の複雑性の認識により、多数のキナーゼまたは多数のキナーゼ経路に有益な活性を有するタンパク質キナーゼモジュレータ、レギュレータ、または阻害剤として作用することができる医薬品を開発することへの差し迫った必要性が強まる。１つのキナーゼまたは１つのキナーゼ経路を特異的に標的化する単一製剤によるアプローチは、例えば、糖尿病およびメタボリック症候群等の非常に複雑な疾患、状態、および障害を治療するには不十分である場合がある。多数のキナーゼの活性を調節することによって、さらに、単独のキナーゼ調節によっては達成し得ない、相乗的な治療効果を生むことができる。
〔００３０〕かかる調節および使用には、慢性状態に対する継続的な使用、または独自の一状態、もしくは多くの疾患および状態の不可欠な構成要素のいずれかとして、例えば、炎症の場合に必要とされるような、断続的使用が必要となる。さらに、キナーゼのモジュレータとして作用する組成物は、哺乳類の体内の広範囲の障害に影響を及ぼし得る。本発明は、キナーゼ活性を制御するために使用することができる化合物、およびホップまたはアカシアから得られた抽出物を記載することにより、生活の質の向上に伴う症状に関連する多数の疾患を治療する手段を提供する。
〔００３１〕本発明は、概して、タンパク質キナーゼ調節の影響を受けやすい癌を治療または阻害するために使用することができる方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、化合物、または一般的にホップ、もしくは植物属アカシアの一員のいずれかから単離される派生物、またはその組み合わせを利用する方法および組成物に関する。
〔００３２〕本発明の第１の実施形態は、必要とする哺乳類において、タンパク質キナーゼ調節に反応する癌を治療する方法を説明する。当該方法は、哺乳類に治療有効量のベータ酸を投与するステップを含む。
〔００３３〕本発明の第２の実施形態は、必要とする哺乳類において、タンパク質キナーゼ調節に反応する癌を治療するための組成物を説明し、当該組成物は、治療有効量のベータ酸を含み、当該治療有効量は、タンパク質キナーゼに関連する癌を調節する。
〔００３４〕 図１は、インスリン感受性および抵抗性を制御する一部のキナーゼネットワークを図解する。 〔００３５〕 図２は、ＭｇＲＩＡＡ（ｍｇＲｈｏ）による、５つの選択されたキナーゼの阻害を図解する。 〔００３６〕 図３は、５つのホップ成分およびアラビアゴムモドキ抽出物による、ＰＩ３Ｋイソフォームの阻害を図解する。 〔００３７〕 図４は、ＣＯＸ−２発現のＬＰＳ刺激後（白色バー）、または試験物質の添加前の終夜のＬＰＳによる刺激後（灰色バー）に添加した際のＰＧＥ２生合成のＲＩＡＡ［パネルＡ］およびＩＡＡ［パネルＢ］用量依存性阻害を図示する。 〔００３８〕 図５は、ＲＡＷ２６４．７細胞で分析された、ＬＰＳ誘導ＣＯＸ−２媒介ＰＧＥ２生成における、セレコキシブ［パネルＡ］およびＭｇＲＩＡＡ［パネルＢ］の直接的酵素阻害グラフ表示を示す。ＰＧＥ２は、ｐｇ／ｍｌで測定および表示した。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝８）を表す。 〔００３９〕 図６は、ＣＯＸ−２タンパク質発現のウェスタンブロット検出を示す。ＣＯＸ−２およびＧＡＰＤＨ発現のために、合計細胞抽出物を、ウェスタンブロットで可視化した後［パネルＡ］、ＲＡＷ２６４．７細胞を、示される回数、ＬＰＳで刺激した。ＣＯＸ−２およびＧＡＰＤＨ結合の濃度測定を行った。グラフ［パネルＢ］は、ＧＡＰＤＨに対するＣＯＸ−２の割合を表す。 〔００４０〕 図７は、ｉＮＯＳタンパク質発現のウェスタンブロット検出を示す。ｉＮＯＳおよびＧＡＰＤＨ発現のために、合計細胞抽出物を、ウェスタンブロットで可視化した後［パネルＡ］、ＲＡＷ２６４．７細胞を、示される回数、ＬＰＳで刺激した。ｉＮＯＳおよびＧＡＰＤＨ結合の濃度測定を行った。グラフ［パネルＢ］は、ＧＡＰＤＨに対するｉＮＯＳの割合を表す。 〔００４１〕 図８は、９６ウェル形式を利用する、ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ−κＢキットの代表的な図式を示す。プレートに結合したオリゴヌクレオチドは、ＮＦ−κＢのコンセンサス結合部位を含む。主要な抗体は、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットを検出した。 〔００４２〕 図９は、ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ−κＢキットで判断した際のＮＦ−κＢの代表的な結合活性を示す。ＤＮＡ結合のパーセントは、ＬＰＳ対照（１００％）に対し、計算した。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝２）を表す。ＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例セクションに記載のとおり、試験化合物およびＬＰＳで４時間処理した。 〔００４３〕 図１０は、成熟中、および成熟脂肪細胞における、アカシアサンプル＃４９０９抽出物の脂質合成効果を評価するための代表的な試験手順の図式である。３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用して、脂肪細胞の脂質生成における、試験化合物の潜在的効果を研究した。 〔００４４〕 図１１は、アカシアサンプル＃４９０９抽出物、または溶媒対照に対する陽性対照インドメタシン、およびトログリタゾンで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の非極性脂質含量を図示するグラフ表示である。エラーバーは、９５％信頼限界（片側）を表す。 〔００４５〕 図１２は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌における、アカシアサンプル＃４９０９の水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の効果を評価するための代表的な試験手順の図式である。 〔００４６〕 図１３は、トログリタゾンの３つの用量と、アカシアサンプル＃４９０９の水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の４つの用量によって誘発された、２４時間のインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞による、最大アディポネクチン分泌を図示する代表的なバーグラフである。示された値は、溶媒対照に対するパーセントであり、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 〔００４７〕 図１４は、試験物質、ならびにＴＮＦα１０、２、または０．５ｎｇ／ｍｌで処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌における、アカシアサンプル＃４９０９の水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の効果を評価するための代表的な試験プロトコルの図式である。 〔００４８〕 図１５は、インドメタシン、またはアカシアサンプル＃４９０９抽出物で誘発された、成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞で処理したＴＮＦαによる、アディポネクチン分泌を表す代表的なバーグラフを図示する。示された値は、溶媒対照に対するパーセントであり、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。＊ＴＮＦα単独処理（ｐ＜０．０５）とは有意に異なる。 〔００４９〕 図１６は、異なる商業的供給源からのアセンヤクノキおよびアカシアニロチカ（Ａ．ｎｉｌｏｔｉｃａ）の種々の組成物による、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞内のトリグリセリド含量における、相対的増加を図解する。示された値は、溶媒対照に対するパーセントであり、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 〔００５０〕 図１７は、アセンヤクノキの種々の抽出物によって誘発された、最大相対アディポネクチン分泌の説明を図解する。示された値は、溶媒対照に対するパーセントであり、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 〔００５１〕 図１８は、ホップ化合物、または陽性対照インドメタシン、およびトログリタゾンで処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の脂質含量（溶媒対照に対する）を図解する。３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを使用して、脂肪細胞の脂質生成における試験化合物の潜在的効果を研究した。結果は、対照細胞の相対的な非極性脂質含量として表され、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 〔００５２〕 図１９は、４つの用量の試験物質によって誘発された、２４時間のインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞による最大アディポネクチン分泌の代表的なバーグラフである。示された値は、溶媒対照に対するパーセントであり、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。ＩＡＡ＝イソアルファ酸、ＲＩＡＡ＝Ｒｈｏイソアルファ酸、ＨＨＩＡ＝ヘキサヒドロイソアルファ酸、およびＴＨＩＡＡ＝テトラヒドロイソアルファ酸。 〔００５３〕 図２０Ａは、Ｒｈｏイソアルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、ホップかす、ヘキサヒドロコルプロン、および陽性対照トログリタゾンのＨｏｆｓｔｅｅプロットを図示する。溶媒対照に対する最大アディポネクチン分泌をｙ切片から推定したが、半分の最大アディポネクチン分泌に必要な試験物質の濃度は、勾配の負の値から算出した。 〔００５３〕 図２０Ｂは、Ｒｈｏイソアルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、ホップかす、ヘキサヒドロコルプロン、および陽性対照トログリタゾンのＨｏｆｓｔｅｅプロットを図示する。溶媒対照に対する最大アディポネクチン分泌をｙ切片から推定したが、半分の最大アディポネクチン分泌に必要な試験物質の濃度は、勾配の負の値から算出した。 〔００５４〕 図２１は、イソアルファ酸およびＲｈｏイソアルファ酸［パネルＡ］、ならびにヘキサヒドロイソアルファ酸およびテトラヒドロイソアルファ酸［パネルＢ］によって誘発された、ＴＮＦαで処理された成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞による相対的なアディポネクチン分泌を表す、２つのバーグラフを表示する。示された値は、溶媒対照に対するパーセントであり、エラーバーは、９５％信頼区間を表す。＊ＴＮＦα単独処理（ｐ＜０．０５）とは有意に異なる。 〔００５５〕 図２２は、ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌの添加の３時間後［パネルＡ］、および２４時間後［パネルＢ］の、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＮＦ−ｋＢ核転座を図示する。ピオグリタゾン、ＲＩＡＡ、およびキサントフモールを５．０（黒色バー）および２．５（ストリップ状のバー）μｇ／ｍｌで、添加した。細胞からのＪｕｒｋａｔ核抽出物は、採取直前に、２時間、３７℃で５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（ホルボール、１２−ミリスチン酸塩、１３アセテート）、および０．５μＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（ＣＩ）を補充した培地でに培養した。 〔００５６〕 図２３は、溶媒、メトホルミン、アカシアサンプル＃５６５９水性抽出物、またはメトホルミン／アセンヤクノキ抽出物１：１の組み合わせで処理した、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞の相対的なトリグリセリド含量を図解する。結果は、溶媒対照内の完全に分化した細胞の相対的なトリグリセリド含量として表される。 〔００５７〕 図２４は、ＲＬ９５−２子宮内膜の細胞株における細胞増殖への１０μｇ／ｍｌの溶媒対照（ＤＭＳＯ）、ＲＩＡＡ、イソアルファ酸（ＩＡＡ）、テトラヒドロイソアルファ酸（ＴＨＩＡＡ）、ＴＨＩＡＡおよびヘキサヒドロイソアルファ酸（ＨＨＩＡＡ）の１：１の混合物、キサントフモール（ＸＮ）、ＬＹ２４９００２（ＬＹ）、エタノール（ＥＴＯＨ）、アルファ酸（ＡＬＰＨＡ）、およびベータ酸（ＢＥＴＡ）の効果を図解する。 〔００５８〕 図２５は、ＨＴ−２９細胞株における細胞増殖への、ＴＨＩＡＡ、または還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）の種々の濃度の効果を図解する。 〔００５９〕 図２６は、ＳＷ４８０細胞株における細胞増殖への、ＴＨＩＡＡ、または還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）の種々の濃度の効果を図解する。 〔００６０〕 図２７は、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、血清グルコース［パネルＡ］、および血清インスリン［パネルＢ］を減少させるための還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）およびアカシアの種々の組み合わせの用量反応を図解する。 〔００６１〕 図２８は、薬学的な抗糖尿病化合物である、ロシグリタゾンおよびメトホルミンと比較して、ＲＩＡＡ：アカシアの５：１の組み合わせにより生成された、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける血清グルコース［パネルＡ］、および血清インスリン［パネルＢ］の減少を図解する。 〔００６２〕 図２９は、関節リウマチのマウスモデルにおける、関節炎指数への還元イソアルファ酸（ＲＩＡＡ）の効果を図解する。 〔００６３〕 図３０は、関節リウマチのマウスモデルにおける、関節炎指数へのＴＨＩＡＡの効果を図解する。 〔００６４〕 図３１は、コラーゲン誘発性の関節損傷へのＲＩＡＡおよびＴＨＩＡＡの効果を図で要約する。 〔００６５〕 図３２は、コラーゲン誘発性の関節炎動物モデルにおけるＩＬ−６レベルへのＲＩＡＡおよびＴＨＩＡＡの効果を図で要約する。 〔００６６〕 図３３は、空腹時および食後（ｐｐ）２時間後インスリン値へのＲＩＡＡ／アカシア（１：５）補充（１日３錠）の効果を図解する。ｐｐ２時間後のインスリン値評価では、対象は空腹１０〜１２時間後に現れ、７５ｇのグルコース（Ｔｒｕｔｏｌ １００，ＣＡＳＣＯ ＮＥＲＬ（ｒ） Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含んだ溶液を摂取し、グルコースチャレンジの２時間後に、血液を採取し、インスリン値のアッセイを行った（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，Ｔａｃｏｍａ，ＷＡ）。 〔００６７〕 図３４は、空腹時およびｐｐ２時間後のグルコース値へのＲＩＡＡ／アカシア（１：５）補充（１日３錠）の効果を図解する。ｐｐ２時間後のグルコース値評価では、対象は空腹１０〜１２時間後に現れ、７５ｇのグルコース（Ｔｒｕｔｏｌ １００，ＣＡＳＣＯ ＮＥＲＬ（ｒ） Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含んだ溶液を摂取し、グルコースチャレンジの２時間後に、血液を採取し、グルコース値のアッセイを行った（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，Ｔａｃｏｍａ，ＷＡ）。 〔００６８〕 図３５は、ＨＯＭＡスコアへのＲＩＡＡ／アカシア（１：５）補充（１日３錠）の効果を図解する。ＨＯＭＡスコアは、公開された方法［（インスリン（ｍｃＩＵ／ｍＬ）＊グルコース（ｍｇ／ｄＬ））／４０５］によって、空腹時インスリンおよびグルコースから計算した。 〔００６９〕 図３６は、血清ＴＧレベルへのＲＩＡＡ／アカシア（１：５）補充（１日３錠）の効果を図解する。 〔００７０〕 図３７ ＲＩＡＡまたはセレコキシブ：クルクミン（１：３）による、（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の阻害率。 〔００７１〕 図３８ ＩＡＡ、セレコキシブ：クルクミン（１：３）、またはＬＹ２９４００２による（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の阻害率。 〔００７２〕 図３９ ＴＨＩＡＡまたはセレコキシブ：クルクミン（１：３）による（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の阻害率。 〔００７３〕 図４０ ＨＨＩＡＡおよびセレコキシブ：クルクミン（１：３）による（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の阻害率。 〔００７４〕 図４１ ＸＮまたはセレコキシブ：クルクミン（１：３）による（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の阻害率。 〔００７５〕 図４２ セレコキシブおよびＲＩＡＡの組み合わせによる、（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の観察および予測された阻害。 〔００７６〕 図４３ セレコキシブおよびＴＨＩＡＡの組み合わせによる、（Ａ）ＨＴ−２９、（Ｂ）Ｃａｃｏ−２、または（Ｃ）ＳＷ４８０結腸癌細胞の観察および予測された阻害。 〔００７７〕 図４４は、９４０ｍｇのＴＨＩＡＡの摂取後の、経時的な血清内のＴＨＩＡＡの検出を図で表示する。 〔００７８〕 図４５は、対照に対する、血清内の検出可能なＴＨＩＡＡのプロファイルを表示する。 〔００７９〕 図４６は、ＣＹＰ２Ｃ９＊１によるＴＨＩＡＡの代謝を図示する。
〔００８０〕本発明は、概して、タンパク質キナーゼ調節の影響を受けやすい癌を治療または阻害するために使用することができる、方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、化合物、または一般的にホップ、もしくは植物属アカシアの一員のいずれかから単離される派生物、またはその組み合わせを利用する方法および組成物に関する。
〔００８１〕本願で参照される特許、公開出願、および科学文献は、当業者の知識を確立し、それぞれが、参照することによって組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと、同一程度に、参照することによりその全体が本願に組み込まれる。本願に引用されるいずれの参考文献と、本明細書の特定の教示との間にいずれの矛盾かがある場合、後者を支持するものとする。同様に、当該技術分野で理解される用語または語句の定義と、本明細書で具体的に教示される用語または語句の定義との間のいかなる矛盾も、後者を支持して解決されるものとする。
〔００８２〕本願で使用される技術的かつ科学的用語は、別途定義がない限り、本発明が関連する、当業者が一般的に理解する意味を有する。本願では、当業者に既知の種々の方法論および材料を参照する。組み換えＤＮＡ技術の一般原理を記載する標準参考資料には、Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1989)、Kaufman et al.,Eds.,Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine,CRC Press,Boca Raton(1995)、McPherson,Ed.,Directed Mutagenesis: A Practical Approach,IRL Press,Oxford(1991)を含む。薬理学の一般原理を記載する標準参考資料には、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,11th Ed.,McGraw Hill Companies Inc.,New York(2006)を含む。
〔００８３〕本明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形は、複数の対象を含む。本明細書において、単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、当該内容が別途明確に指示しない限り、それらが指す用語の複数形も具体的に包含する。さらに、別途具体的に指示がない限り、本願に用いられる「または（もしくは）」という用語は、「いずれか／または」という「排他的」意味においてではなく、「および／または」という「包含的」意味において使用される。「約」という用語は、本願では、およそ、概略的に、または前後といった意味を有するように使用される。「約」という用語が数値域と併せて使用される場合、記載される数値の上下の境界を拡張することにより、その範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、本願では、２０％の差異で記述された値の上下の数値を修正するように使用される。
〔００８４〕本願に用いられる、変数の数値域の記述は、本発明が、その範囲内の任意の数値に等しい変数で実践することができることを伝えることを目的とする。したがって、本質的に別個の変数に関して、当該変数は、当該範囲の終点を含む、数値域のいずれの整数値に等しい可能性がある。同様に、本質的に連続的な変数に関して、当該変数は、当該範囲の終点を含む、数値域のいずれの実値に等しい可能性がある。一例として、０から２の値を有すると記載される変数は、本質的に別個の変数として、０、１、または２である可能性があり、０．０、０．１、０．０１、０．００１、または本質的に連続的な変数として他の任意の値である可能性がある。
〔００８５〕以降、本発明の特定の実施形態を詳細に参照する。本発明は、これらの特定の実施形態と併せて記載されるが、かかる特定の実施形態に本発明を制限することを目的としない。一方、添付の特許請求の範囲に定義される、本発明の精神および範囲内に含まれ得るように、代替、修正、同等のものを扱うことを目的とする。本発明の完全な理解を提供するために、以下の説明において、多数の特定の詳細を記述する。本発明は、これらの特定の詳細の一部またはすべてを用いることなく実践することが可能である。他の例では、本発明を不必要に不明確にすることがないように、周知のプロセス操作を詳述していない。
〔００８６〕当業者に既知のいかなる適切な材料および／または方法も、本発明を実施する上で利用することができる。しかし、好適な材料および方法を記載する。以下の説明および実施例において参照される材料、試薬等は、別途記載がない限り、商業的供給源より入手可能である。
〔００８７〕本発明の第１の実施形態は、必要とする哺乳類において、タンパク質キナーゼ調節に反応する癌を治療するための方法を開示するが、当該方法は、哺乳類に治療有効量のベータ酸を投与するステップを含む。本実施形態の一部の態様において、ベータ酸は、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎｅ）、コルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）、アドルプロン（ａｄｌｕｐｕｌｏｎｅ）、およびプレルプロン（ｐｒｅｌｕｐｕｌｏｎｅ）からなる群から選択される。
〔００８８〕本実施形態のさらに他の態様において、調節されるタンパク質キナーゼは、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、オーロラＡ、ＢＴＫ、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＣＨＫ１、ＣＫ１γ１、ＣＫ１γ２、ＣＫ１γ３、ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｈ）、ｃＳＲＣ、ＤＡＰＫ２、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｒｂＢ４、Ｆｅｒ、ＦＧＦＲ２、Ｆｌｔ４、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＡＫ１、ＪＡＫ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ３、ＰＡＫ５、ＰｈＫγ２、ＰＩ３Ｋ、Ｐｉｍ−１、ＰＫＡ、ＰＫＡ（ｂ）、ＰＫＣβＩＩ、ＰＲＡＫ、ＰｒＫＸ、Ｒｏｎ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、ＳＧＫ２、Ｓｙｋ、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＺＩＰＫからなる群から選択される。
〔００８９〕さらに他の態様において、キナーゼ調節に反応する癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、および子宮癌からなる群から選択される。
〔００９０〕本実施形態の方法に使用される組成物は、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、および炭水化物、またはコーティング剤、等浸透性および吸収遅延剤、結合剤、接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、洗浄剤、および乳化剤からなる群から選択される、薬学的に許容可能な賦形剤からなる群から選択される１つ以上の要素をさらに含んでもよい。
〔００９１〕本願に用いられる「キナーゼに関連する疾患」とは、それらの個々のタンパク質キナーゼ、または直接疾患の原因となるか、その活性化が、問題となる疾患の症状を悪化させる作用を行う経路に関連するかのいずれかである、キナーゼの群もしくはファミリーを意味する。
〔００９２〕「タンパク質キナーゼ調節は、対象の健康に有益である」という語句は、キナーゼ調節（上方または下方制御のいずれか）が、疾患の症状の軽減、予防、および／または後退をもたらす、もしくは二次的治療法の働きを増大させるものを指す。
〔００９３〕「タンパク質キナーゼ調節に反応する癌」という語句は、本発明の化合物の投与により、ａ）癌細胞のキナーゼを直接調節し、その調節が、対象の健康に有益な効果（例えば、標的癌細胞のアポトーシス、または成長阻害）をもたらす、またはｂ）二次的キナーゼを調節し、その調節により、対象の健康に有益な効果をもたらすキナーゼの調節を段階的に行う、または促進する、もしくはｃ）調節される標的キナーゼが、癌細胞を、より二次的治療法（例えば、化学療法または放射線治療）の影響を受けやすいものにする、いずれかの例を指す。
〔００９４〕本明細書では、移行句または特許請求の範囲の本文に関わらず、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、変更可能な意味を有するものとして解釈されるものとする。すなわち、当該用語は、「少なくとも〜を有する」または「少なくとも〜を含む」という語句と同意語として解釈されるものとする。プロセスに関連して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、当該プロセスが、少なくとも記載されるステップを含むが、付加的なステップも含んでもよいことを意味する。化合物または組成物に関連して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、当該化合物または組成物が、少なくとも記載される性質または化合物を含むが、さらなる性質または化合物も含んでもよいことを意味する。
〔００９５〕本願に用いられる「派生物」または「派生された」物質という用語は、別の物質に構造上関連する化学物質、およびそれから理論上取得可能な化学物質、すなわち、別の物質から作製することができる物質を指す。派生物には、化学反応によって取得可能な化合物を含むことができる。
〔００９６〕本願に用いられる「ホップ抽出物」という用語は、（１）ホップ植物生成物を溶媒に暴露すること、（２）溶媒をホップ植物生成物から分離すること、および（３）溶媒を除去することに起因する固体物質を指す。「ホップかす」とは、ホップ抽出手順後に残存する、ホップ植物生成物を指す。ホップの化学性質を詳述するために、参照することによりその全体が本願に組み込まれる、Verzele,M.and De Keukeleire,D.,Developments in Food Science 27: Chemistry and Analysis of Hop and Beer Bitter Acids,Elsevier Science Pub. Co.,1991,New York,USAを参照のこと。ＲＩＡＡに言及する場合、本願に用いられる「Ｒｈｏ」とは、それらの還元イソアルファ酸を指し、その還元は、４−メチル−３−ペンテノイル側鎖のカルボニル基の還元である。
〔００９７〕本願に用いられる「溶媒」という用語は、ホップ植物生成物から固体物質を抽出するために必要な特性を有する、水性または有機性の液体を指す。溶媒の例には、水、蒸気、過熱した水、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、液体ＣＯ２、液体Ｎ２、またはかかる物質の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
〔００９８〕本願に用いられる「ＣＯ２抽出物」という用語は、ＣＯ２のその後の除去前に、ホップ植物生成物を液体または超臨界ＣＯ２調製液に暴露することから生じる、固体物質を指す。
〔００９９〕「薬学的に許容可能な」という用語は、組成物の他の成分と相溶性があり、その受け手に有害ではないという意味で使用される。
〔００１００〕本願に用いられる「化合物」は、それらの化学構造、化学名、一般名のいずれかで識別されてもよい。化学構造と化学または一般名が矛盾する場合、化学構造が、化合物の同一性の決定要因となる。本願に記載の化合物は、１つ以上の不斉中心および／または二重結合を含んでもよく、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何学的異性体）、鏡像異性体、またはジアステレオマー等の立体異性体として存在してもよい。したがって、本願に図示される化学構造は、立体異性体的に純粋な形（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性体的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）、ならびに鏡像異性および立体異性混合物を含む、図解される、もしくは識別される化合物のすべての可能な鏡像異性体および立体異性体を包含する。鏡像異性および立体異性混合物は、当業者に周知の分離技術、またはキラル合成技術を用いて、それらを構成する鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。また、当該化合物は、エノール型、ケト型、およびその混合物を含む、いくつかの互変異性型に存在してもよい。したがって、本願に図示される化学構造は、図解される、または識別される化合物のすべての可能な互変異性型を包含する。また、記載される化合物は、１つ以上の原子が、自然界に従来見られる原子質量とは異なった原子質量を有する、同位体で標識された化合物も包含する。本発明の化合物に組み込むことができるアイソトープの例には、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ等を含むが、これらに限定されない。化合物は、水和形態を含む、溶媒和形態、およびＮ−オキシドのみでなく、非溶媒和形態にも存在し得る。一般に、化合物は、水和されても、溶媒和されても、Ｎ−オキシドであってもよい。ある化合物は、複数の結晶または非結晶形で存在し得る。また、化合物の同族体、類似体、加水分解生成物、代謝産物、および前駆体、またはプロドラッグも、本発明の範囲内で企図される。別途指示がない限り、一般に、すべての物理的形状は、本願に企図される使用に相当し、本発明の範囲内であることを意図する。
〔００１０１〕本発明による化合物は、塩として存在してもよい。特に当該化合物の薬学的に許容可能な塩が企図される。本発明の「薬学的に許容可能な塩」とは、本発明の化合物と、当該化合物によって、塩（例えば、「Ｍｇ」または「Ｍａｇ」として示されるマグネシウム塩等）を形成する酸または塩基のいずれかとの組み合わせであり、治療状態の対象が耐性を有するものである。一般に、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、１以上の治療的指数（最低治療有効量に対する、最低中毒量の割合）を有する。当業者は、最低の治療有効量は、対象によって、および適応によって異なるため、適宜調整することを認識するであろう。
〔００１０２〕本願に用いられる「ホップ」とは、醸造業で、細菌性作用を防止し、独特の苦味をビールに加えるために使用される、苦味のある芳香油を含む、フムルス（Ｈｕｍｕｌｕｓ）属の植物の球果を指す。より好適には、使用されるホップは、フムルスルプルス（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）に由来する。
〔００１０３〕本願に用いられる「アカシア」という用語は、マメ科の木、およびアカシア族の低木の任意の一員を指す。好適には、アカシアに由来する植物化合物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。
〔００１０４〕本発明の化合物は、場合によっては、希釈剤及び賦形剤を含む、いかなる周知の薬学的に許容されうる担体で薬学的に許容されうるベヒクル中に処方される（Remington’s Pnarmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, Mack Publising Co., Easton, PA 1990 and Remington; The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams ＆ Wilkins，1995を参照のこと。）本発明の組成物の生成に採用される薬学的に許容可能な担体／媒体のタイプは、哺乳類への組成物の投与方法によって異なるが、概して、薬学的に許容可能な担体は、生理学的に不活性および非毒性である。本発明による組成物の剤形は、治療される症状／状態の治療に有用な、他の任意の薬理学的活性成分、ならびに本発明の化合物の２つ以上のタイプを含んでもよい。
〔００１０５〕本願において、「調節する」または「調節」という用語は、それが言及する化合物、成分等による、酵素の発現または活性の上方または下方制御を意味するように使用される。
〔００１０６〕本願に用いられる「タンパク質キナーゼ」という用語は、ドナー分子からタンパク質のアミノ酸残基へ、リン酸基を移動させることができる、トランスフェラーゼクラスの酵素を表す。タンパク質キナーゼ、およびファミリー／群命名法についての詳述に関しては、参照することによりその全体が本願に組み込まれる、Kostich,M.,et al.,Human Members of the Eukaryotic Protein Kinases Family,Genome Biology 3(9):research0043.1-0043.12,2002を参照のこと。
〔００１０７〕キナーゼの非限定的な例の代表的なものには、Ａｂｌ、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、ＡＬＫ、ＡＬＫ４、ＡＭＰＫ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、ＡＲＫ５、ＡＳＫ１、オーロラＡ、Ａｘｌ、Ｂｌｋ、Ｂｍｘ、ＢＲＫ、ＢｒＳＫ１、ＢｒＳＫ２、ＢＴＫ、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３、ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＫ１（ｙ）、ＣＫ１δ、ＣＫ２、ＣＫ２α２、ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）、ｃＫｉｔ、ｃ−ＲＡＦ、ＣＳＫ、ｃＳＲＣ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＤＤＲ２、ＤＭＰＫ、ＤＲＡＫ１、ＤＹＲＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ）、ＥＧＦＲ（Ｌ８６１Ｑ）、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｒｂＢ４、Ｆｅｒ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、Ｆｇｒ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ３（Ｄ８３５Ｙ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ４、Ｆｍｓ、Ｆｙｎ、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＨＩＰＫ１、ＨＩＰＫ２、ＨＩＰＫ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＫＫβ、ＩＫＫα、ＩＲ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＩＲＲ、ＩＴＫ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＮＫ１α１、ＪＮＫ２α２、ＪＮＫ３、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、ＬＩＭＫ１、ＬＫＢ１、ＬＯＫ、Ｌｙｎ、Ｌｙｎ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＭＡＲＫ１、ＭＥＫ１、ＭＥＬＫ、Ｍｅｔ、ＭＩＮＫ、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７β、ＭＬＣＫ、ＭＬＫ１、Ｍｎｋ２、ＭＲＣＫβ、ＭＲＣＫα、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＭＳＳＫ１、ＭＳＴ１、ＭＳＴ２、ＭＳＴ３、ＭｕＳＫ、ＮＥＫ２、ＮＥＫ３、ＮＥＫ６、ＮＥＫ７、ＮＬＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＡＫ６、ＰＡＲ−１Ｂα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＫ１、ＰＩ３Ｋベータ、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋガンマ、Ｐｉｍ−１、Ｐｉｍ−２、ＰＫＡ（ｂ）、ＰＫＡ、ＰＫＢβ、ＰＫＢα、ＰＫＢγ、ＰＫＣμ、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣα、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣζ、ＰＫＣη、ＰＫＣθ、ＰＫＣι、ＰＫＤ２、ＰＫＧ１β、ＰＫＧ１α、Ｐｌｋ３、ＰＲＡＫ、ＰＲＫ２、ＰｒＫＸ、ＰＴＫ５、Ｐｙｋ２、Ｒｅｔ、ＲＩＰＫ２、ＲＯＣＫ−Ｉ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｎ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、Ｒｓｋ３、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ａ（Ｔ１０６Ｍ）、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、ＳＧＫ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、ＳＩＫ、Ｓｎｋ、ＳＲＰＫ１、ＳＲＰＫ２、ＳＴＫ３３、Ｓｙｋ、ＴＡＫ１、ＴＢＫ１、Ｔｉｅ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴＳＳＫ１、ＴＳＳＫ２、ＷＮＫ２、ＷＮＫ３、Ｙｅｓ、ＺＡＰ−７０、ＺＩＰＫを含む。一部の実施形態において、キナーゼは、ＡＬＫ、オーロラＡ、Ａｘｌ、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、Ｆｅｒ、ＦＧＦＲ４、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＪＮＫ２α２、ＭＳＫ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ３、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋガンマ、ＰＫＡ、ＰＫＢβ、ＰＫＢα、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、Ｓｙｋ、ＴｒｋＡ、およびＴＳＳＫ１であってもよい。さらに他の実施形態において、キナーゼは、ＡＢＬ、ＡＫＴ、オーロラ、ＣＤＫ、ＤＢＦ２／２０、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ／ＥＬＫ／ＥＣＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫＦＧＦＲ、ＧＳＫ３、ＩＫＫＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ ＤＯＭ１／２、ＭＡＲＫ／ＰＲＫＡＡ、ＭＥＫ／ＳＴＥ７、ＭＥＫＫ／ＳＴＥ１１、ＭＬＫ、ｍＴＯＲ、ＰＡＫ／ＳＴＥ２０、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＯＬＯ、ＳＲＣ、ＴＥＣ／ＡＴＫ、およびＺＡＰ／ＳＹＫからなる群から選択される。
〔００１０８〕本発明の方法および組成物は、本発明の方法の利益を経験し得る、任意の哺乳類での使用を目的とする。本発明は、限定することを目的としていないが、かかる哺乳類の中でも、ヒトが主要であり、家畜への使用に適用される。したがって、本発明によると、「哺乳類」または「必要とする哺乳類」は、限定されないが、特にネコ、イヌ、およびウマを含む、非ヒト哺乳類のみでなく、ヒトを含む。
〔００１０９〕本願に用いられる「自己免疫疾患」とは、宿主の系が、宿主自身の免疫系によって、攻撃された場合に生じる、それらの疾患、疾病、または状態を指す。自己免疫疾患の非限定的な例の代表的なものには、円形脱毛症、強直性脊椎炎、関節炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン疾患、自己免疫性溶血性貧血、内耳自己免疫疾患（メニエール病としても知られる）、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット疾患、クローン病、Ｉ型糖尿病、糸球体腎炎、グレイヴズ病、ギラン・バレー症候群、炎症性腸疾患、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、白斑、およびヴェゲナー肉芽腫症を含む。自己免疫疾患に関連するキナーゼの非限定的な例の代表的なものには、ＡＭＰＫ、ＢＴＫ、ＥＲＫ、ＦＧＦＲ、ＦＭＳ、ＧＳＫ、ＩＧＦＲ、ＩＫＫ、ＪＡＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＬＫ、ＲＯＣＫ、およびＶＥＧＦＲを含む。
〔００１１０〕本願に用いられる「アレルギー性疾患」は、平均的個人への同等効果を有しない、物質、状況、または物理的状態に対する、過度もしくは病的反応（くしゃみ、呼吸困難、かゆみ、または皮膚発疹等による）を指す。本願に用いられる「炎症性疾患」とは、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、熱、疼痛、腫れ、および多くの場合、機能の損失を特徴とし、有害物質および損傷した組織の排出を開始するメカニズムとして機能する、細胞傷害への反応（通常、局所的）を意味する。アレルギー性または炎症性疾患の例には、ぜんそく、鼻炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、良性腫瘍、ポリープ、遺伝性ポリープ症候群、結腸癌、直腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、消化器の潰瘍性疾患、狭心症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年性認知症、および脳血管疾患を含むが、これらに限定されない。アレルギー性疾患に関連するキナーゼの非限定的な例の代表的なものには、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、ＢＴＫ、ＣＨＫ、ＥＧＦＲ、ＦＹＮ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＫＫＢ、ＩＴＫ、ＪＡＫ、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＰＰＡＲ、ＲＯＣＫ、ＳＲＣ、ＳＹＫ、およびＺＡＰを含む。
〔００１１１〕本願に用いられる「メタボリック症候群」および「糖尿病関連疾患」とは、インスリン関連疾患、すなわち、インスリンに対する反応が、疾患の原因となるか、疾患または状態の進行もしくは抑制に関与してきた、それらの疾患または状態を指す。インスリン関連疾患の代表的な例には、糖尿病、糖尿病性合併症、インスリン感受性、多嚢胞性卵巣疾患、高血糖、脂質異常症、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、肥満、体重増加、炎症性疾患、消化器の疾患、狭心症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年性認知症、および脳血管性認知症を含むが、これらに限定されない。Harrison's Principles of Internal Medicine,16h Ed.,McGraw Hill Companies Inc.,New York(2005)を参照のこと。炎症状態の例には、消化器の疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、消化器の良性腫瘍、消化器ポリープ、遺伝性ポリープ症候群、結腸癌、直腸癌、胃癌、および消化器の潰瘍性疾患等）、狭心症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年性認知症、脳血管性認知症、免疫疾患、および一般に、癌を含むが、これらに限定されない。メタボリック症候群に関連するキナーゼの非限定的な例には、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、ＣＤＫ、ＣＳＫ、ＥＲＫ、ＧＳＫ、ＩＧＦＲ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、およびＰＫＣを含むことができる。
〔００１１２〕「インスリン抵抗性」とは、体内のインスリン依存性プロセスの活性の低下、またはインスリン産生の増加、もしくはその両方にいたる、これらのプロセスによる、インスリンへの感受性の減少を指す。インスリン抵抗性は、ＩＩ型糖尿病に特有であるが、糖尿病がない場合でも生じ得る。
〔００１１３〕本願に用いられる「糖尿病性合併症」には、網膜症、筋梗塞、特発性骨増殖症および骨量の損失、足部潰瘍、神経障害、動脈硬化、呼吸器の自律神経障害、ならびに胸部および肺実質の構造的異常、左心室肥大、心臓血管疾患の罹患、進行性の腎機能損失、ならびに貧血を含むが、これらに限定されない。
〔００１１４〕本願に用いられる「癌」とは、未分化細胞の増殖を特徴とし、悪性の場合、周辺組織に侵入し、新たな身体部位に転移する傾向がある、種々の良性または悪性新生物のいずれかを指す。本発明の範囲内で考慮される癌の非限定的な例の代表的なものには、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、および前立腺癌を含む。本発明の範囲内で考慮される癌関連のタンパク質キナーゼの非限定的な例には、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、オーロラ、ＢＲＫ、ＣＤＫ、ＣＨＫ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＩＴ、ＭＡＰＫ、ｍＴＯＲ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、およびＳＲＣを含む。
〔００１１５〕「眼疾患」とは、発達異常、疾患、損傷、年齢、または毒素に起因する、眼の構造または機能の障害を指す。本発明の範囲内で考慮される眼疾患の非限定的な例には、網膜症、黄斑変性、または糖尿病性網膜症を含む。眼疾患関連のキナーゼには、ＡＭＰＫ、オーロラ、ＥＰＨ、ＥＲＢ、ＥＲＫ、ＦＭＳ、ＩＧＦＲ、ＭＥＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＳＲＣ、およびＶＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない。
〔００１１６〕本願に用いられる「神経障害」とは、発達異常、疾患、損傷、または毒素に起因する、中枢神経系の構造または機能の障害のいずれを指す。神経障害の非限定的な例の代表的なものには、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、ハンチントン病、神経認知機能障害、老年性認知症、および気分障害を含む。神経障害に関連するタンパク質キナーゼには、ＡＭＰＫ、ＣＤＫ、ＦＹＮ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣ、ＲＯＣＫ、ＲＴＫ、ＳＲＣ、およびＶＥＧＦＲを含み得るが、これらに限定されない。
〔００１１７〕本願に用いられる「心血管疾患」または「ＣＶＤ」とは、心臓組織または血管の機能を低下、または破壊する、それらの病変または状態を指す。心血管疾患関連のキナーゼには、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、ＧＲＫ、ＧＳＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＫＫＢ、ＪＡＫ、ＪＵＮ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣ、ＲＨＯ、ＲＯＣＫ、およびＴＯＲを含むが、これらに限定されない。
〔００１１８〕本願に用いられる「骨粗しょう症」とは、骨が過度に多孔質となることによって、より骨折の影響を受けやすくなり、治癒力が低下する疾患を指す。骨粗しょう症に関連するタンパク質キナーゼには、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、ＣＡＭＫ、ＩＲＡＫ−Ｍ、ＭＡＰＫ、ｍＴＯＲ、ＰＰＡＲ、ＲＨＯ、ＲＯＳ、ＳＲＣ、ＳＹＲ、およびＶＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない。
〔００１１９〕本発明の実施形態では、必要とする哺乳類において、タンパク質キナーゼ調節に反応する癌を治療するための組成物を説明する。当該組成物は、治療有効量のベータ酸を含み、前記治療有効量は、癌関連のタンパク質キナーゼを調節する。本実施形態の一部の態様において、ベータ酸は、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎｅ）、コルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）、アドルプロン（ａｄｌｕｐｕｌｏｎｅ）、およびプレルプロン（ｐｒｅｌｕｐｕｌｏｎｅ）からなる群から選択される。
〔００１２０〕本実施形態の他の態様において、当該組成物は、コーティング剤、等浸透性および吸収遅延剤、結合剤、接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、洗浄剤、および乳化剤からなる群から選択される、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。
〔００１２１〕さらに他の態様において、当該組成物は、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、および炭水化物からなる群から選択される１つ以上の要素をさらに含む。
〔００１２２〕本願に用いられる「治療する」とは、本発明による治療を受けない個人の症状と比較して、本発明の化合物が投与された個人の症状の軽減、予防、および／または後退を意味する。専門家は、本願に記載の化合物、組成物、および方法が、高度な専門家（医師または獣医）による継続的な臨床評価と併用されるべきであることを理解するであろう。したがって、治療後、専門家は、標準的な方法論に従って、肺炎の治療において改善があるか評価するであろう。かかる評価は、特定の治療用量、投与方法等を増加、軽減、もしくは継続するか否かの評価を行う上で、手助けとなり、情報を提供する。
〔００１２３〕本発明の化合物を投与する対象は、必ずしも特定の外傷性状態に見舞われるわけではないことを理解されたい。実際に、本発明の化合物は、症状が発生する前に、予防的に投与してもよい。「治療的」、「治療的に」という用語、およびこれらの用語の置き換えは、予防的使用のみでなく、治療的、緩和的使用を包含するように使用される。したがって、本願に用いられる「症状を治療または緩和する」とは、かかる投与を受けていない個人の症状と比較して、本発明の化合物を投与した個人の症状の軽減、予防、および／または後退を意味する。
〔００１２４〕「治療有効量」という用語は、求められる治療的結果を達成するのに有効な用量での、治療を示すように使用される。さらに、当業者は、微調整すること、および／または２つ以上の本発明の化合物を投与すること、もしくは別の化合物とともに本発明の化合物を投与することによって、本発明の化合物の治療有効量を、減少または増加してもよいことを理解するであろう。例えば、Meiner,C.L.,「Clinical Trials: Design,Conduct,and Analysis」,Monographs in Epidemiology and Biostatistics,Vol.8 Oxford University Press,USA(1986)を参照のこと。したがって、本発明は、所与の哺乳類に特有の特定の危急に対する投与／治療を調整する方法を提供する。以下の実施例に図示されるように、治療有効量は、例えば、実験的に、比較的低用量での開始、および有益な効果の同時評価とともに段階的な増加によって、容易に決定されてもよい。
〔００１２５〕当業者であれば、本発明による化合物の投与回数は、当該哺乳類の年齢、体重、および状態、ならびに選択された投与経路等の他の臨床要因を含む、その時々の患者の特定の医学的状態に基づき、患者によって異なることを、理解するであろう。
〔００１２６〕本願に用いられる「症状」とは、患者が経験する、また特定の疾患に関連する、身体機能における任意の感覚または変化、すなわち、「Ｘ」に伴って生じ、「Ｘ」の存在の兆候と見なされるもの、を示す。症状は、疾患または状態によって異なることが認識されよう。非限定的な例として、自己免疫疾患に関連する症状には、疲労、目まい、倦怠感、臓器または組織のサイズの増加（例えば、グレーブス病における甲状腺拡大）、もしくは臓器または組織の機能低下をもたらす、臓器または組織の破壊（例えば、膵臓の膵島細胞は、糖尿病で破壊される）を含む。
〔００１２７〕アレルギー関連の疾患または状態の代表的な症候には、放心、アナフィラキシー、ぜんそく、目の刺激感、便秘、咳、目の下または周辺のくま、皮膚炎、うつ、下痢、嚥下困難、集中力散漫または困難、目まい、湿疹、機能障害、疲労、紅潮、頭痛、心臓の動悸、じんましん、嗅覚低下、過敏性／行動問題、鼻、または皮膚、もしくは喉のかゆみ、関節痛、筋肉痛、鼻づまり、鼻ポリープ、吐き気、後鼻の排液（後鼻漏）、速脈、鼻漏（鼻水）、耳鳴りまたは耳のつまり、息切れ、皮膚発疹、睡眠困難、くしゃみ、腫れ（血管性浮腫）、喉の嗄声、鼻のうずき、疲れ、回転性目まい、嘔吐、涙目、または目のかゆみ、もしくは目の発赤、および喘鳴を含む。
〔００１２８〕本願に用いられる「炎症」または「炎症状態」とは、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、熱、疼痛、腫れ、および多くの場合、機能喪失を特徴とし、有害物質および損傷した組織の排除を開始するメカニズムとして作用する、細胞傷害への局所反応を指す。炎症または炎症状態の代表的な症状には、関節に限定した場合、さわると温かい発赤、関節腫脹、関節痛および硬直、ならびに関節機能の喪失を含む。全身炎症反応は、例えば、発熱、寒気、疲労／エネルギーの喪失、頭痛、食欲喪失、筋肉の硬直等の「インフルエンザのような」症状をもたらし得る。
〔００１２９〕糖尿病およびメタボリック症候群は、それらの症状の多くが、無害と考えられることから、多くの場合、診断されないままになる。例えば、一部の糖尿病症状には、頻尿、過度の口渇、極度の空腹感、異常な体重減少、疲労の増加、過敏性、および視界不良を含むが、これらに限定されない。
〔００１３０〕神経障害の症候は可変的であり、無感覚、うずき、知覚過敏（感受性の増加）、麻痺、局所的な衰弱、構音障害（言語障害）、失語（発話不能）、嚥下障害（嚥下困難）、二重視（複視）、認知問題（例えば、集中力の欠如）、記憶喪失、一過性黒内障（片眼の一時的な失明）、歩行困難、協調失調、振戦、発作、錯乱、眠気、認知症、せん妄、および昏睡を含み得るが、これらに限定されない。
〔００１３１〕以下の実施例は、本発明の一部の好適な実施形態をさらに図示することを目的とし、決して限定するものではない。当業者は、通常の実験をさらに用いることなく、本願に記載の特定の物質および手順の多数の同等物を認識、もしくは確認することができるであろう。
〔実施例〕
実施例１
タンパク質キナーゼに対する、修飾ホップ成分の効果
〔００１３２〕上述のとおり、キナーゼは、リン酸基をドナー分子（通常、ＡＴＰ）からタンパク質のアミノ酸残基（通常、トレオニン、セリン、またはチロシン）へ転移することができる、トランスフェラーゼクラス酵素を示す。キナーゼは、酵素の制御のためのシグナル伝達において使用される、すなわち、コレステロール生合成、アミノ酸形質転換、またはグリコーゲン代謝回転等において、酵素の作用を阻害または活性化することができる。ほとんどのキナーゼは、単一の種類のアミノ酸残基に特化しているが、２つの異なる種類のアミノ酸をリン酸化することができるという点で、二重の作用を呈するキナーゼもある。図１に図示されるとおり、キナーゼは、シグナル伝達および翻訳において機能する。
〔００１３３〕方法−ヒトキナーゼ活性における、本発明の１０μｇのＲＩＡＡ／ｍｌの阻害効果を、ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ Ａｓｓａｙ（Upstate Cell Signaling Solutions,Upstate USA,Inc.,Charlottesville,VA.,USA）で２００以上のキナーゼのパネルで試験した。特定のキナーゼに対するアッセイプロトコルは、http://www.upstate.com/img/pdf/kp_protocols_full.pdf（最近のアクセスは、２００６年６月１２日）に要約する。
〔００１３４〕結果−ちょうど２０５以上のヒトキナーゼを、無細胞系でアッセイを行った。驚くべきことに、我々は、試験を行ったホップ化合物が、２０５のうちの２５のキナーゼを１０％以上阻害したことを発見した。２０５のうちの８個は、＞２０％阻害され、２０５のうちの５個は、＞３０％阻害され、２個は役５０％阻害された。
〔００１３５〕特にＰＩ３キナーゼ経路において、ホップは、ＰＩ３Ｋγ、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋβ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｐ７０Ｓ６Ｋを阻害する。ｍＴＯＲは試験用に使用不可であったことを留意されたい。
〔００１３６〕被験キナーゼに対する、ホップ化合物ＲＩＡＡの阻害効果を以下の表１に示す。
〔００１３７〕例えば、５１％の阻害であったＡｋｔ１のように、ＰＩ３Ｋ経路のいくつかのキナーゼは、ＲＩＡＡによって選択的に阻害されていることに留意されたい。興味深いことに、３つのＡｋｔイソフォームが存在する。Ａｋｔ１ヌルマウスは、生存能力があるが、発育が悪い［Cho et al.,Science 292:1728-1731(2001)］。Ａｋｔ１が不足したショウジョウバエの眼細胞は、サイズが減少し［Verdu et al.,Nat Cell Biol 1:500-505(1999)］し、過剰発現により、正常なサイズよりも増加する。Ａｋｔ２ヌルマウスは、生存能力があるが、グルコース制御を妨げた［Cho et al.,J Biol Chem 276:38345-38352(2001)］。したがって、Ａｋｔ１は、サイズ決定を行う役割を果たし、Ａｋｔ２は、インスリンシグナリングに関与すると考えられる。
〔００１３８〕ＰＩ３Ｋ経路は、種々の癌遺伝子タンパク質および炎症経路タンパク質の、異なるタンパク質発現をもたらす、ｍＲＮＡの安定性およびｍＲＮＡ翻訳選択において、主要な役割を果たすことが知られている。５’−ＴＯＰを示す、特定の５’ｍＲＮＡ構造は、ｍＲＮＡ翻訳選択の制御において、主要な構造であることが示されている。
〔００１３９〕ｃＰＬＡの文献およびＤＮＡ配列を再考すると、ヒトｃＰＬＡ２の５’ｍＲＮＡは、同様に５’ＴＯＰ構造を有することを示す、コンセンサス（同様に制御された既知の癌遺伝子と８２％の相同性）配列を含むことを示す。炎症に関与することでも知られるｓＰＬＡも、この同一の５’−ＴＯＰを有する。さらに、このことは、ｃＰＬＡ２およびおそらく他のＰＬＡは、ｃＰＬＡ２タンパク質の増加をもたらす、ｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡの翻訳選択の増加を通じて、ＰＩ３Ｋ経路によって上方制御されるということを示す。反対に、ＰＩ３Ｋの阻害剤は、ｃＰＬＡ２の量を減少させ、ＣＯＸ２経路によって行われるＰＧＥ２形成を減少させるはずである。
〔００１４０〕まとめると、キナーゼデータ、およびホップ化合物が、ｃＰＬＡ２タンパク質発現（ウェスタンブロット、データは図示せず）を阻害するが、ｍＲＮＡは阻害しないことを発見した、我々の結果は、ホップ化合物の抗炎症作用機序は、ｃＰＬＡ２タンパク質レベルを低減することによって、およびおそらく、より具体的には、ＴＯＰ ｍＲＮＡ翻訳の活性化の阻害をもたらす、ＰＩ３Ｋ経路を阻害することによって、ＣＯＸ２への基質利用性を低減することによるものであり得ることを示唆する。
〔００１４１〕活性の正確な経路は不明である。一部の報告は、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）の６つのイソフォームのうちの１つ以上のリン酸化によって活性化するというモデルと一致する。ＲＰＳ６は、タンパク質への効率的な翻訳を可能とする、５’ＴＯＰ ｍＲＮＡを分解すると報告されている。しかし、Stolovich et al. Mol Cell Biol Dec,8101-8113(2002)は、本モデルに異議を唱え、Ａｋｔ１が、ＴＯＰ ｍＲＮＡ翻訳を可能にする、不明な翻訳因子Ｘをリン酸化する、と提示している。
実施例２
選択されたタンパク質キナーゼに対する、ホップまたはアカシア成分の用量反応効果
〔００１４２〕実施例１のプロトコルに従い、６０の選択されたタンパク質キナーゼにおいて、ｍｇＲｈｏの用量反応性を約１０、５０、および１００μｇ／ｍｌで試験した。以下の表２Ａおよび２Ｂに示す。最も阻害された５つのキナーゼを図２に図で表示する。
〔００１４３〕ＴＨＩＡＡ調製液のキナーゼ阻害（対照のパーセントで報告）に対する用量反応性を、以下の表３に示される、８６の選択されたキナーゼに、約１、１０、２５、および５０μｇ／ｍｌで試験した。同様に、実施例１のプロトコルに従い、２３０以上の選択されたタンパク質キナーゼにおいて、約１、５、および２５μｇ／ｍｌで、アカシア調製液を試験した。以下の表４に示す。また、８６の選択されたキナーゼにおいて、約１、１０、２５、および５０μｇ／ｍｌで、イソアルファ酸（ＩＡＡ）、ヘクサヒドロイソアルファ酸（ＨＨＩＡＡ）、ベータ酸、およびキサントフモールの調製液も試験した。用量反応性の結果を、それぞれ以下の表５〜８に示す。
〔００１４４〕結果−種々の被験化合物による、キナーゼ活性調節における効果は、以下に列挙した代表的な例により、特定のキナーゼおよび被験化合物（表２〜８）に応じて、幅広い調節効果を示した。
〔００１４５〕例えば、関節リウマチおよび紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患に強力に関与するキナーゼである、ＰＩ３Ｋδは、ＭｇＲｈｏに対し、それぞれ１０、５０、ならびに１００μｇ／ｍｌで３６％、７８％、および８７％のキナーゼ活性を阻害する反応を呈した。ＭｇＲｈｏは、用量依存的に、それぞれ１０、５０、および１００μｇ／ｍｌで、２１％、５４％、および７２％の阻害率でＳｙｋを阻害した。また、ＧＳＫ、すなわちグリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫアルファおよびベータの両方）は、ｍｇＲｈｏ暴露（１０、５０、１００μｇ／ｍｌでそれぞれアルファは３５、３６、８７％の阻害、ベータは３５、８３、７４％の阻害）後に阻害を示した。表２を参照のこと。
〔００１４６〕ＴＨＩＡＡは、検査したキナーゼの多くに対し、それぞれ１、５、２５、および５０μｇ／ｍｌで、７％、１６％、７７％、および９１％のＦＧＦＲ２の阻害といった、キナーゼ活性の用量依存的な阻害を示した。同様の結果が、それぞれ１、５、２５、および５０μｇ／ｍｌのＦＧＦＲ３（０％、６％、６１％、および８４％）、ならびにＴｒｋＡ（２４％、４５％、９３％、および９４％）でも認められた。表３を参照のこと。
〔００１４７〕試験を行ったアカシア抽出物（アカシアニロチカ（Ａ．ｎｉｌｏｔｉｃａ））は、検査したキナーゼ活性（表４）の最も有力な阻害剤であると考えられ、すべて１μｇ／ｍｌの暴露で、Ｓｙｋ（９８％）、Ｌｙｎ（９６％）、ＧＳＫ３α（９５％）、オーロラＡ（９２％）、Ｆｌｔ４（８８％）、ＭＳＳＫ１（８８％）、ＧＳＫ３β（８７％）、ＢＴＫ（８５％）、ＰＲＡＫ（８２％）、およびＴｒｋＡ（８０％）等のキナーゼに対し、８０％以上の活性の阻害を実証した。
実施例３
ＰＩ３Ｋ活性に対するホップ成分の効果
〔００１４８〕ホップ成分キサントフモール、ならびにベータ酸、イソアルファ酸（Ｍｇ−ＩＡＡ）、テトラヒドロ−イソアルファ酸（Ｍｇ−ＴＨＩＡＡ）、およびヘキサヒドロ−イソアルファ酸（Ｍｇ−ＨＨＩＡＡ）のマグネシウム塩のヒトＰＩ３Ｋ−β、ＰＩ３Ｋ−γ、およびＰＩ３Ｋ−δの阻害効果を、実施例１の手順およびプロトコルに従い、検査した。さらに、アラビアゴムモドキ心材抽出物を検査した。すべての化合物は、５０μｇ／ｍｌで試験した。結果を図３に図解する。
〔００１４９〕試験を行ったホップ化合物のすべては、Ｍｇ−ＴＨＩＡＡでＰＩ３Ｋ活性の＞５０％の阻害を示し、最大の全体的な阻害（試験を行ったすべてのＰＩ３Ｋイソフォームに対し、＞８０％の阻害）をもたらしたことに留意されたい。さらに、キサントフモールおよびＭｇ−ベータ酸の両方は、ＰＩ３Ｋ−βまたはＰＩ３Ｋ−δよりもＰＩ３Ｋ−γに対し、より阻害性を有することに留意されたい。Ｍｇ−ＩＡＡは、ＰＩ３Ｋ−γまたはＰＩ３Ｋ−δよりもＰＩ３Ｋ−βに対して、約３倍阻害性を有する。アラビアゴムモドキ心材抽出物は、ＰＩ３Ｋ−βまたはＰＩ３Ｋ−δ活性を刺激すると考えられた。同様の結果が、ＳｙｋおよびＧＳＫキナーゼ（データは図示せず）に対しても得られた。
実施例４
ホップ化合物および派生物による、刺激を受けた、および刺激を受けていないマウスマクロファージにおけるＰＧＥ２合成の阻害
〔００１５０〕本実施例の目的は、ホップ派生物が、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージモデルにおいて、ＰＧＥ２のＣＯＸ−１合成以上に、選択的にＰＧＥ２のＣＯＸ−２合成を阻害する程度を評価することである。ＲＡＷ２６４．７細胞株は、試験剤の抗炎症作用を評価するための、十分に確立されたモデルである。細菌性リポ多糖によるＲＡＷ２６４．７細胞の刺激は、ＣＯＸ−２の発現、およびＰＧＥ２の産生を誘発する。ＰＧＥ２合成の阻害は、試験剤の抗炎症作用の測定基準として使用される。装置、化学物質、試薬、ＰＧＥ２アッセイ、および計算は以下に記載する。
〔００１５１〕装置−本実施例で使用した装置には、ＯＨＡＳモデル＃Ｅ０１１４０分析用てんびん、Ｆｏｒｍａモデル＃Ｆ１２１４生物安全キャビネット（Marietta,Ohio）、０．１から１００μｌ（VWR,Rochester,NY）を送達するための種々のピペット、細胞手動計数器（ＶＷＲカタログ＃２３６０９−１０２，Rochester,NY）、Ｆｏｒｍａモデル＃Ｆ３２１０ ＣＯ２インキュベータ（Marietta,Ohio）、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒモデル＃１４９２、Horsham,PA）、Ｌｅｉｃａモデル＃ＤＭ ＩＬ倒立顕微鏡（Wetzlar,Germany）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（U.S.Filter,Lowell,MA）、４℃の冷蔵装置（Ｆｏｒｍａモデル＃Ｆ３７７５，Marietta,Ohio）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲカタログ＃３３９９４−３０６，Rochester,NY）、３７℃の水浴（Ｓｈｅｌ Ｌａｂモデル＃１２０３，Cornelius,OR）を含む。
〔００１５２〕化学物質および試薬−細菌性リポ多糖（ＬＰＳ；Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５）は、Ｓｉｇｍａ（St.Louis,MO）からの入手した。加熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ−ＨＩ Ｃａｔ． ＃３５−０１１ＣＶ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ Ｃａｔ＃１０−０１３ＣＶ）をＭｅｄｉａｔｅｃｈ（Herndon,VA）より購入した。ホップ分画、（１）アルファホップ（１％アルファ酸；ＡＡ）、（２）アロマホップＯＥ（１０％ベータ酸および２％異性化アルファ酸、（３）イソホップ（異性化アルファ酸；ＩＡＡ）、（４）ベータ酸溶液（ベータ酸ＢＡ）、（５）ヘキサホップゴールド（ヘキサヒドロ異性化アルファ酸；ＨＨＩＡＡ）、（６）レディホップ（ｒｅｄｉｈｏｐ）（還元異性化−アルファ酸；ＲＩＡＡ）、（７）テトラホップ（テトラヒドロ−イソ−アルファ酸ＴＨＩＡＡ）、および（８）ホップかすは、Ｂｅｔａｔｅｃｈ Ｈｏｐｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Washington,D.C.,U.S.A.）から入手した。ホップかすは、同量の無水エタノールで２回抽出した。濃茶色の残基が残るまで、４０℃で加熱することにより、エタノールを除去した。この残基を、ＲＡＷ２６４．７細胞で試験するために、ＤＭＳＯで分解した。
〔００１５３〕 試験物質−表１２に記載のホップ派生物を使用した。ＣＯＸ−１選択的阻害剤アスピリンおよびＣＯＸ−２選択的阻害剤セレコキシブを陽性対照として使用した。アスピリンは、Ｓｉｇｍａ（St.Louis,MO）から入手し、セレコキシブの市販製剤（CelebrexTM,Searle & Co.,Chicago,IL）を使用した。
〔００１５４〕 試験物質による細胞培養および処理-American Type Culture Collection（カタログ＃ＴＩＢ−７１、Manassas,VA）から入手したＲＡＷ２６４．７細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Mediatech、Herndon,VA)で増殖させ、対数期に維持した。ＤＭＥＭ増殖培地は、５０ｍｌの加熱不活性化したＦＢＳおよび５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを、５００ｍｌボトルのＤＭＥＭに添加し、４℃で保存することによって、作製した。使用前に、増殖培地を水浴で３７℃に温めた。
〔００１５５〕ＣＯＸ−２に関連するＰＧＥ２合成に関して、１日目に準備された細胞プレートのそれぞれのウェルから１００μｌの培地を除去し、平衡化した２倍最終濃度の１００μｌの試験化合物で置換した。次いで、細胞を９０分間インキュベートした。ＬＰＳ１μｇ／ｍｌの最終濃度を達成するように、２０μｌのＬＰＳを、それぞれのウェルの細胞に添加し、刺激させ、細胞を４時間インキュベートした。この細胞を５μＭアラキドン酸で１５分間さらにインキュベートした。培地に放出されたＰＧＥ２の測定のために、それぞれのウェルからの２５μｌの上清培地を、清潔なマイクロフュージチューブに移した。
〔００１５６〕ＣＯＸ−１に関連するＰＧＥ２合成に関して、１日目に準備された細胞プレートのそれぞれのウェルから１００μｌの培地を除去し、平衡化した２倍最終濃度の１００μｌの試験化合物で置換した。細胞を９０分間インキュベートした。次に、ＬＰＳ刺激の代わりに、細胞を１００μＭのアラキドン酸で１５分間インキュベートした。培地に放出されたＰＧＥ２の測定のために、それぞれのウェルからの２５μｌの上清培地を、清潔なマイクロフュージチューブに移した。
〔００１５７〕細胞の概観を観察し、生存能力を可視的に評価した。当該化合物のいずれに関しても、試験を行った最高濃度では、明らかな毒性は認められなかった。培地に放出されたＰＧＥ２の測定のために、それぞれのウェルからの２５μｌの上清培地を、清潔なマイクロフュージチューブに移した。あらかじめ以下に記載したように、ＰＧＥ２を測定し、報告した。
〔００１５８〕ＰＧＥ２アッセイ−ＰＧＥ２の定量化のため、商業的な非放射性の手順を採用し（Caymen Chemical,Ann Arbor,MI）、修正を行うことなく、製造業者の推奨する手順を用いた。簡潔に、ＰＧＥ２標準サンプルの連続希釈とともに、２５μｌの培地を、適切な量のアセチルコリンエステラーゼで標識したトレーサー、およびＰＧＥ２抗血清と混合し、室温で１８時間インキュベートした。ウェルを空にし、洗浄バッファですすいだ後、アセチルコリンエステラーゼの基質を含んだ、２００μｌのＥｌｌｍａｎ試薬を添加した。室温で１時間、反応物を低速振とう機に維持し、４１５ｎｍでの吸収度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（モデル＃Ｅｌｘ８００、Winooski,VT）ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。ＰＧＥ２濃度は、ｍｌ当たりのピコグラムで表した。本アッセイに関する製造者の仕様には、＜１０％の変動の内部アッセイ係数、１％未満のＰＧＤ２およびＰＧＦ２との交差反応、ならびに１０〜１０００ｐｇ ｍｌ−１の範囲にわたる直線性を含む。ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の両方からのＰＧＥ２合成の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、以下に記載のとおりに計算した。
〔００１５９〕計算−ＰＧＥ２合成の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＣａｌｃｕＳｙｎ（BIOSOFT，Ferguson,MO）を用いて計算した。最低４つの濃度のそれぞれの試験物質または陽性対照を、算出のために用いた。この統計パッケージは、Ｔ．Ｃ Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｐ．Ｔａｌａｌａｙ［Chou,T.C.and P.Talalay.Quantitative analysis of dose-effect relationships;the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55,(1984)］によって説明され、参照することによって本願に組み込まれる、５０％効果（Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ）方法を用いて、複数の薬剤の用量効果の計算を行う。３つの異なる日に、３回実験を繰り返した。それぞれの用量での阻害率を、３つの独立した実験で平均し、報告された５０％阻害濃度を計算するために用いた。
〔００１６０〕５０％阻害濃度は、４つの任意のカテゴリーに順位付けした。（１）それらの製剤に対する、０．１の０．３μｇ／ｍｌ以内のＩＣ５０値の最も高い抗炎症反応、（２）それらの製剤に対する、１．０の０．７μｇ／ｍｌ以内のＩＣ５０値の高い抗炎症反応、（３）それらの製剤に対する、２から７μｇ／ｍｌのＩＣ５０値の中間の抗炎症反応、（４）それらの製剤に対する、１２μｇ／ｍｌ、試験を行った最高濃度以上のＩＣ５０値の低い抗炎症反応。
〔００１６１〕結果−アスピリンおよびセレコキシブ陽性対照は、本モデルシステムにおいて、それらのそれぞれのシクロオキシゲナーゼ選択性を実証した（表９）。アスピリンは、ＣＯＸ−１に対し、約１０００倍選択的であったが、セレコキシブは、ＣＯＸ−２に対し、１１４倍選択的であった。すべてのホップ物質は、それぞれ３６３および１３８倍であった、最高のＣＯＸ−２選択性を実証した、Ｒｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸でＣＯＸ−２選択的であった。低い５０％阻害濃度と相まった、このように高いＣＯＸ−２選択性は、その他のソースからの天然産物ではこれまでに報告されていない。残りのホップ派生物のうち、アロマホップオイルのみが、３倍の限界的なＣＯＸ−２選択性を呈した。体外データから臨床的有効性を推定するには、５倍以上のＣＯＸ−２選択性が、臨床的に有意な胃粘膜の保護のための可能性を示すということが一般的に想定される。この基準の下、ベータ酸、ＣＯ２ホップ抽出物、ホップかすＣＯ２／エタノール、テトラヒドロイソアルファ酸、およびヘキサヒドロイソアルファ酸が、臨床的に関連性のあるＣＯＸ−２選択性である可能性を示した。
実施例５
ＬＰＳ刺激性のＲａｗ２６４．７細胞における、還元異性化アルファ酸または異性化アルファ酸による、直接的なＰＧＥ２阻害の欠如
〔００１６２〕本研究の目的は、ホップ派生物である、還元イソアルファ酸および異性化アルファ酸が、炎症のＲＡＷ２６４．７細胞モデルにおける、ＣＯＸ−２媒介のＰＧＥ２生合成の直接的な阻害剤として、独立して機能する能力を評価することであった。本実施例では、実施例４に記載のＲＡＷ２６４．７細胞株を使用した。装置、化学物質および試薬、ＰＧＥ２アッセイ、ならびに計算は、実施例４に記載のものとした。
〔００１６３〕試験物質−表１２に記載のホップ派生物である、還元イソアルファ酸および異性化アルファ酸を使用した。ＣＯＸ−１選択的陽性対照のアスピリンは、Ｓｉｇｍａ（St.Louis,MO）から入手した。
〔００１６４〕試験物質による細胞培養および処理−ＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１）をAmerican Type Culture Collection（Manassas,VA）から入手し、実施例４に記載のとおり、継代培養した。５％のＣＯ２によって３７℃で終夜インキュベートした後、増殖培地を吸引し、ＦＢＳまたはペニシリン／ストレプトマイシンを含まない、２００μｌのＤＭＥＭで置換した。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳで刺激し、終夜インキュベートして、ＣＯＸ−２発現を誘発した。ＬＰＳ刺激の１８時間後、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加の６０分後に、試験物質を添加した。試験物質を、２５０倍の原液として、ＤＭＳＯに分解した。４μｌのこの２５０倍の試験物質の原料調製液を１ｍｌのＤＭＥＭに添加し、続いて２００μｌのこの溶液を試験物質のそれぞれの用量の８つのウェルに添加した。３０分後、ＰＧＥ２測定のために上清培地をサンプリングした。５０％阻害濃度を、実施例４に記載の２つの独立した実験における最低４つの濃度から算出した。
〔００１６５〕ＰＧＥ２の測定−ＰＧＥ２の定量化のため、商業的な非放射性の手順を採用し（Caymen Chemical,Ann Arbor,MI）、実施例４に記載のとおり、修正を行うことなく、製造業者の推奨する手順を用いた。
〔００１６６〕細胞生存能力−ＰＧＥ２アッセイのため、培地をサンプリングした直前または直後に、細胞の顕微鏡検査によって、細胞生存能力を評価した。試験を行った濃度のいずれにおいても、明らかな細胞死は観察されなかった。
〔００１６７〕計算−ＣａｌｃｕＳｙｎ（BIOSOFT、Ferguson,MO）を使用して、用量反応曲線を導き出し、９５％信頼区間で培地阻害濃度（ＩＣ５０ｓ）を算出するために、４つの濃度、０．１０、１．０、１０、および１００μｇ／ｍｌを用いた。
〔００１６８〕結果−ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２産生のＬＰＳの刺激は、刺激を受けていない細胞に対して、１．４倍から２．１倍に及んだ。アスピリン陽性対照に対して算出された、８．７μｇ／ｍｌのＩＣ５０値（９５％ＣＬ＝３．９〜１９）は、１．４から５０μｇ／ｍｌに及ぶ、直接的なＣＯＸ−２の阻害に関する公開された値［Warner,T.D.et al. Nonsteroidal drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:7563-7568,(1999)］、およびＡ５４９細胞株で３．２μｇ／ｍｌという本研究所の歴史的データ（９５％ＣＬ＝０．５５〜１９）に一致していた。
〔００１６９〕ＣＯＸ−２誘導後、ＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳによる添加を行った際、ＲＩＡＡおよびＩＡＡの両方は、ＰＧＥ２の適度な用量依存性の阻害のみをもたらした。ＲＩＡＡおよびＩＡＡに関し、試験物質の濃度を１０００倍以上に増加させた場合、それぞれ１４および１０パーセントのみの阻害の増加が認められた。この緩い用量反応の傾斜は、ＲＩＡＡ（３６ｍｇ／ｍｌ）およびＩＡＡ（＞１０００ｍｇ／ｍｌ）のｍｇ／ｍｌ範囲のＩＣ５０値（表１０）をもたらした。用量の３つのログ単位の反応で認められた微小変化は、この細胞ベースのアッセイにおける、ホップ派生物の認められたＰＧＥ２阻害効果が、細胞に対する副次的効果であり、ＣＯＸ−２酵素活性の直接的な阻害ではない可能性があることを示唆している。
〔００１７０〕図４Ａおよび４Ｂは、用量反応データを、ＲＩＡＡおよびＩＡＡは白色バーで、本実施例からの用量反応データは灰色バーでそれぞれ図示する。添加順序の効果が明らかに見られ、ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないという推論を支持する。
〔００１７１〕（１）ホップ物質は、体外のＰＧＥ２生合成を阻害する能力によって評価した際に、試験を行った抗炎症天然産物のうちで最も活性があった、（２）ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、ＣＯＸ−２誘導に関する、その阻害パターンに基づき、直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤であるとは考えられない、ならびに（３）ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、ＣＯＸ−２酵素阻害ではなく、ＣＯＸ−２発現の阻害に基づいて現れる、ＣＯＸ−２を選択的に有する、ということが考えられる。この選択性は、特異な酵素阻害に基づく選択性を有するセレコキシブとは異なる。
実施例６
ホップ化合物および派生物は、Ａ５４９肺上皮細胞において、直接的なシクロオキシゲナーゼ酵素阻害剤ではない
〔００１７２〕化学物質−本実施例で使用するホップおよびホップ派生物は、実施例４で前述した。他のすべての化学物質は、実施例４に記載の供給元から入手した。
〔００１７３〕装置、ＰＧＥ２アッセイ、および計算は、実施例４に記載のとおりとした。
〔００１７４〕細胞−Ａ５４９（ヒト肺上皮）細胞をAmerican Type Culture Collection（Manassas,VA）から入手し、供給元の指示に従い継代培養した。この細胞を、１０％のＦＢＳを含んだＲＰＭＩ １６４０の５％ＣＯ２、ペニシリン５０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、およびＬ−グルタミン５ｍＭにより、３７℃で定期的に培養した。実験日に、指数関数的に増殖する細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ １６４０で洗浄した。
〔００１７５〕９６ウェル組織培養プレートで、ウェル当たり０．２ｍｌの増殖培地において、ウェル当たり８×１０４の細胞に対数期Ａ５４９細胞をプレートした。試験化合物によるＰＧＥ２阻害の測定には、ＷＨＭＡ−ＣＯＸ−２プロトコルとしても知られる、Ｗａｒｎｅｒら ［Nonsteroid drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo- oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: a full in vitro analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 96,7563-7568,(1999)］の手順に修正することなく従った。簡潔に、Ａ５４９細胞をプレートした２４時間後、インターロイキン−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、ＣＯＸ−２の発現を誘発した。２４時間後、細胞を無血清ＲＰＭＩ １６４０で洗浄した。続いて、ＤＭＳＯおよび無血清ＲＰＭＩに分解した試験物質をウェルに添加し、２５、５．０、０．５、および０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。それぞれの濃度を２通りで行った。試験ウェルに含まれるものと等体積のＤＭＳＯを対照ウェルに添加した。６０分後、Ａ２３１８７（５０μＭ）をウェルに添加し、アラキドン酸を放出した。ＰＧＥ２測定のため、３０分後にウェルから２５μｌの培地をサンプリングした。
〔００１７６〕細胞生存能力を視覚的に評価したところ、化合物のいずれに対しても試験を行った最高濃度では明らかな毒性は認められなかった。上清培地のＰＧＥ２を測定し、実施例４に前述したとおり報告した。ＰＧＥ２合成に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、実施例４に前述したとおり計算した。
〔００１７７〕結果−試験を行った用量では、実験プロトコルは、ホップ抽出物または派生物のいずれにおいても５０％有効濃度を捕捉することができなかった。このプロトコルは、試験化合物を添加する前に、ＣＯＸ−２発現の刺激を必要とすることから、試験物質がＰＧＥ２合成を阻害できなかったことは、それらの作用のメカニズムが、ＣＯＸ−２アイソザイムの発現を阻害するものであり、活性を直接阻害するものではないと考えられる。ＷＨＭＡ−ＣＯＸ−２プロトコルを用いると、直接阻害が一部認められたが、この手順は、ホップ化合物、またはホップ化合物の派生物の抗炎症特性を評価する上で、不適切であると考えられる。
実施例７
ホップ派生物は、Ａ５４９肺上皮細胞において、ＰＧＥ２生合成のイエダニアレルゲンの活性化を阻害する
〔００１７８〕化学物質−本実施例に使用したホップおよびホップ派生物、（１）アルファホップ（１％アルファ酸；ＡＡ）、（２）アロマホップＯＥ（１０％ベータ酸および２％異性化アルファ酸、（３）イソホップ（異性化アルファ酸；ＩＡＡ）、（４）ベータ酸溶液（ベータ酸；ＢＡ）、（５）ヘキサホップゴールド（ヘキサヒドロ異性化アルファ酸；ＨＨＩＡＡ）、（６）レディホップ（ｒｅｄｉｈｏｐ）（還元異性化−アルファ酸；ＲＩＡＡ）、および（７）テトラホップ（テトラヒドロ−イソ−アルファ酸；ＴＨＩＡＡ）は、実施例１に前述した。他のすべての化学物質は、実施例４に記載の供給元より入手した。１０μｇ／ｍｌの最終濃度での試験物質を、イエダニアレルゲンの添加６０分前に添加した。
〔００１７９〕装置、ＰＧＥ２アッセイ、および計算は、実施例４に記載のものとした。
〔００１８０〕イエダニアレルゲンの単離−コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）は、アメリカのイエダニである。Ｄ．ｆａｒｉｎａｅを、室温、および湿度７５％で、Ｐｕｒｉｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｏｗ（Ralston Purina,Co,St.Louis,MO）と、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎの粒状ドライイースト（Standard Brands,Inc.New York,NY）を１：１の割合で育てた。生きたダニが培地から移動した際に培養コンテナから吸引し、凍結によって殺滅し、乾燥させ、湿度０％で保存した。大気温度で、イエダニのアレルギー成分を水で抽出した。５００ｍｇのダニ粉末を１５ｍｌの円錐形の遠心分離管（VWR,Rochester,NY）の５ｍｌの水（１：１０ ｗ／ｖ）に添加し、１分間振とうし、大気温度で終夜静置した。翌日、０．２μｍの使い捨てシリンジフィルタ（Nalgene,Rochester,NY）を用いて、水相をろ過した。ろ液をイエダニアレルゲンと称し、これを用いて、Ａ５４９肺上皮細胞における、ＰＧＥ２生合成の誘導を試験した。
〔００１８１〕細胞培養および処理−ヒト気道上皮細胞株、Ａ５４９（American Type Culture Collection，Bethesda,MD）を培養し、実施例６に前述したとおり処理した。ダニアレルゲンを培地に添加し、１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。１８時間後、ＰＧＥ２測定のため、培地をサンプリングした。
〔００１８２〕結果−表１１は、イエダニアレルゲンによって刺激したＡ５４９肺細胞における、ＰＧＥ２生合成のホップ派生物による阻害の程度を図示する。試験を行ったすべてのホップ派生物は、イエダニアレルゲンの刺激効果を有意に阻害することができた。
〔００１８３〕本実施例は、ホップ派生物が、Ａ５４９肺細胞において、イエダニアレルゲンのＰＧＥ２刺激効果を阻害できることを図解する。
実施例８
還元イソアルファ酸による、直接的なＣＯＸ−２阻害の欠如
〔００１８４〕本実施例の目的は、マグネシウム還元イソアルファ酸が、ＣＯＸ−２酵素活性の直接的な阻害剤として作用することができるかどうかを判断することである。
〔００１８５〕材料−試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で調製し、−２０℃で保存した。ＬＰＳは、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)より購入した。ＭｇＲＩＡＡは、Metagenics(San Clemente,CA)より供給され、セレコキシブの市販製剤を使用した（CelebrexTM,Searle&Co.,Chicago,IL）。
〔００１８６〕細胞培養−マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株をＡＴＣＣ（Manassas,VA）より購入し、該社の指示に従って維持した。細胞をウェル当たり８×１０４の細胞密度で９６ウェルプレートに継代培養し、約２日で９０％コンフルエンスに達した。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを単独で細胞培地に添加し、１２時間インキュベートした。培地をウェルから除去し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）と、ＤＭＳＯおよび無血清ＲＰＭＩに分解した試験化合物とをウェルに添加し、２０、５．０、１．０、および０．１μｇ／ｍｌでＭｇＲＩＡＡ、１００、１０、１、および０．１ｎｇ／ｍｌでセレコキシブの最終濃度を達成した。それぞれの濃度を、８通りで実行した。試験化合物によるインキュベートの１時間後、細胞培地を除去し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を伴う試験化合物を有する新鮮な培地で置換し、１時間インキュベートした。培地をウェルから除去し、ＰＧＥ２合成を分析した。
〔００１８７〕ＰＧＥ２アッセイ−ＰＧＥ２の定量化のため、商業的な非放射性の手順を採用した（Cayman Chemical,Ann Arbor,MI）。サンプルをＥＩＡバッファで１０回希釈し、修正を行うことなく、製造業者の推奨する手順を用いた。ＰＧＥ２濃度は、ｍｌ当たりピコグラムで表した。このアッセイのための製造業者の仕様には、＜１０％の変動の内部アッセイ係数、１％未満のＰＧＤ２およびＰＧＦ２の交差反応、ならびに１０〜１０００ｐｇ ｍｌ−１の直線性を含む。
〔００１８８〕ＣＯＸ−２特有の阻害剤セレコキシブは、ＣＯＸ−２媒介のＰＧＥ２合成を用量依存的に阻害した（１００、１０、１、および０．１ｎｇ／ｍｌ）が、ＭｇＲＩＡＡでは有意なＰＧＥ２阻害は認められなかった。データは、ＭｇＲＩＡＡが、セロコキシブのような直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないことを示唆する（図５）。
実施例９
ＭｇＲＩＡＡによるｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２タンパク質発現の阻害
〔００１８９〕ＭｇＲＩＡＡで処理し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞抽出物を、ウェスタンブロット法で、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２タンパク質についてアッセイを行った。
〔００１９０〕材料−試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で調製し、−２０℃で保存した。ＭｇＲＩＡＡは、Metagenics（San Clemente,CA）より供給された。パルテノライドは、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)より購入した。ＰＩ３Ｋ阻害剤ウォートマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）およびＬＹ２９４００２は、EMD Biosciences(San Diego,CA)より購入した。ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳに対して生成された抗体は、Cayman Chemical(Ann Arbor,MI)より購入した。ＧＡＰＤＨに対して生成された抗体は、Novus Biological(Littleton,CO)より購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結した２次抗体は、Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)より購入した。
〔００１９１〕細胞培養−マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株を、ＡＴＣＣ（Manassas,VA）より購入し、該社の指示に従って維持した。細胞を増殖させ、２４ウェルプレートにウェル当たり３×１０５の細胞密度で継代培養し、約２日で９０％コンフルエンスに達した。０．４％ＤＭＳＯの最終濃度で、試験化合物を無血清培地の細胞に添加した。試験化合物によるインキュベートの１時間後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはリン酸緩衝生理食塩水を単独で細胞ウェルに添加し、インキュベートを示される時間継続した。
〔００１９２〕 ウェスタンブロット法−細胞抽出物を、バッファＥ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％トリトンＸ−１００；１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム；アプロチニン ５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン ５μｇ／ｍｌ；フッ化フェニルメタンスルホニル １ｍＭ）で調製した。簡潔に、細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄し、バッファＥを添加した。細胞を清潔な管にスクラップし、４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した後、総細胞抽出物として上清を採取した。細胞抽出物（５０μｇ）を、プレキャストした４％〜２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Bio-Rad,Hercules,CA）で、前面の色素移動がゲルの底部から５ｍｍに達するまで、電気泳動した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のセミドライシステムを用いて、タンパク質をニトロセルロース膜に移動した。膜を洗浄し、５％乾燥粉乳で１時間、室温でブロックした。１次抗体、次いで２次抗体によるインキュベートは、それぞれ室温で１時間とした。等容量のルミノール／エンハンサー溶液、および適切な過酸化水溶液の、室温で５分間のインキュベートにより、Pierce Biotechnology(Rockford,IL)のSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いて、化学発光を行った。冷却したＣＣＤ Ｋｏｄａｋ（ｒ） （Rochester,NY）ＩＳ１０００画像化システムを用いて、ウェスタンブロット画像を捕捉した。Ｋｏｄａｋ（ｒ） ソフトウェアを用いて、濃度測定を行った。
〔００１９３〕ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳタンパク質発現のパーセントをウェスタンブロット検出で評価した。ＣＯＸ−２の発現は、ＬＰＳによる刺激の２０時間後に認められた。ＤＭＳＯの溶媒対照と比較して、ＭｇＲＩＡＡによるＣＯＸ−２タンパク質発現に５５％の減少が見られた（図６）。特定のＮＦ−ｋＢ阻害剤パルテノライドは、タンパク質発現を２２．５％阻害したが、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤は、ＣＯＸ−２発現を約４７％減少させた（図６）。さらに、ＭｇＲＩＡＡによって、ＬＰＳによる刺激の２０時間後に、ｉＮＯＳタンパク質発現の７３％の減少が認められた（図７）。
実施例１０
ＮＦ−κＢ核転座およびＤＮＡ結合
〔００１９４〕ＭｇＲＩＡＡで処理し、ＬＰＳで４時間刺激した、ＲＡＷ２６４．７細胞からの核抽出物を、ＤＮＡへのＮＦ−κＢ結合についてアッセイを行った。
〔００１９５〕材料−試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で調製し、−２０℃で保存した。ＭｇＲＩＡＡは、Metagenics(San Clemente,CA)により供給された。ＮＦ−ｋＢ活性化に対する特定の阻害剤である、パルテノライドは、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)より購入した。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は、EMD Biosciences(San Diego,CA)より購入した。
〔００１９６〕細胞培養−マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株を、ＡＴＣＣ（Manassas,VA）より購入し、該社の指示に従って維持した。ウェル当たり１．５×１０６の細胞密度で、６ウェルプレートに細胞を継体培養し、約２日で、９０％コンフルエンスに達した。試験化合物ＭｇＲＩＡＡ（５５および１４μｇ／ｍｌ）、パルテノライド（８０μＭ）、およびＬＹ２９４００２（２５μＭ）を、０．４％ＤＭＳＯの最終濃度で、無血清培地の細胞に添加した。試験化合物によるインキュベートの１時間後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを単独で、細胞培地に添加し、インキュベートをさらに４時間継続した。
〔００１９７〕ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ結合−本質的に、Ｄｉｇｎａｍら［Nucl Acids Res 11:1475-1489,(1983)］によって説明されるように、核抽出物を調製した。簡潔に、細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄し、次いでバッファＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＫＣｌ；０．１％ ＮＰ−４０；アプロチニン ５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン ５μｇ／ｍｌ；フッ化フェニルメタンスルホニル １ｍＭ）を添加し、１５分間、氷上に静置した。次いで細胞を清潔な管にスクラップし、凍結／解凍の３つのサイクルで処理した。４℃で５分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した後の上清層は、細胞質分画であった。残存するペレットをバッファＣ（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１．５ｍＭ ＫＣｌ；４２０ｍＭ ＫＣｌ；２５％グリセロール；０．２Ｍ ＥＤＴＡ；アプロチニン ５μｇ／ｍｌ；ペプスタチンＡ １μｇ／ｍｌ；ロイペプチン ５μｇ／ｍｌ；フッ化フェニルメタンスルホニル １ｍＭ）に再懸濁し、１５分間、氷上に静置した。核抽出物分画を、４℃で５分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した後、上清層として回収した。Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ−κＢキットを用いて、製造者の指示どおり、核抽出物のＮＦ−ｋＢ ＤＮＡ結合を評価した。図８に見られるように、ＴｒａｎｓＡＭキットは、９６ウェル形式で、コンセンサス配列へのＮＦ−κＢ結合のｐ５０サブユニットを検出した。タンパク質濃度を測定し（Bio-Radアッセイ）、１０μｇの核タンパク質抽出物を２通りでアッセイを行った。
〔００１９８〕核抽出物（タンパク質１０μｇ）の分析を２通りで行い、結果を図９に図示する。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）による刺激により、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合の２倍の増加をもたらした。ＬＹ２９４００２（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）による処理は、先述の文献報告から予測されるようなＮＦ−κＢ結合の軽度の低下をもたらした。また、パルテノライドは、予想されるようなＮＦ−κＢ結合の有意な減少をもたらした。ＮＦ−κＢ結合の大幅な減少がＭｇＲＩＡＡで認められた。この効果は用量反応的に認められた。ＮＦ−κＢ結合の減少は、ＣＯＸ−２、ｉＮＯＳ、およびＴＮＦαを含む、標的遺伝子の転写活性化の減少をもたらし得る。
〔００１９９〕この結果は、ＭｇＤＨＩＡＡで認められたＮＦ−κＢ結合の減少が、ＣＯＸ−２タンパク質発現の減少をもたらし、最終的にはＰＧＥ２産生の減少につながり得ることを示唆する。
実施例１１
アカシア樹皮の水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画により誘発される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂質生成の増加
〔００２００〕モデル−３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いて、脂肪細胞分化および脂質生成における化合物の潜在的効果を研究する。この細胞株は、脂肪細胞への分化を制御するものとは別に、前脂肪細胞の複製を制御する刺激およびメカニズム［Fasshauer, M., Klein, J., Neumann, S., Eszlinger, M., and Paschke, R. Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes. Biochem Biophys Res Commun, 290: 1084-1089, (2002); Li, Y. and Lazar, M. A. Differential gene regulation by PPARgamma agonist and constitutively active PPARgamma2. Mol Endocrinol, 16: 1040-1048, (2002)］、ならびに試験剤のインスリン感作およびトリグリセリド低下能力［Raz, I., Eldor, R., Cernea, S., and Shafrir, E. Diabetes: insulin resistance and derangements in lipid metabolism. Cure through intervention in fat transport and storage. Diabetes Metab Res Rev, 21: 3-14, (2005)］の調査を可能にする。
〔００２０１〕前脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞は、線維芽細胞の外観を有する。それらは、細胞−細胞の接触が、Ｇ０／Ｇ１増殖停止を引き起こす後、融合性単層を形成するまで複製する。脂肪細胞への３Ｔ３−Ｌ１細胞の最終分化は、コンフルエント前およびコンフルエント後の前脂肪細胞の両方の増殖に依存する。２日間の３−イソブチル−１−メチルキサンタン、デキサメタゾン、および高用量のインスリン（ＭＤＩ）によるその後の刺激は、これらの細胞が、コンフルエント後の分裂のクローン性増殖を行い、細胞周期を逸脱し、脂肪細胞に特異的な遺伝子を発現し始めるように促す。分化の誘導の約５日後、９０％を上回る細胞が、特徴的な脂質に満ちた脂肪細胞の表現型を示した。３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド合成を評価することにより、試験剤のインスリン感作能力の有効なモデルを提供する。
〔００２０２〕脂肪細胞の脂質摂取を促す薬剤が、インスリン感受性を改善するはずであるということは逆説的であると考えられる。この矛盾を説明するために、いくつかの仮説が提示されてきた。研究支援を得続けてきた１つの前提は、「ｆａｔｔ ａｃｉｄ ｓｔｅａｌ」という概念、またはグルコース摂取の同時向上による、筋肉内の脂肪酸の相対的減少を引き起こす、血漿から脂肪細胞への脂肪酸の取り込みである［Martin,G.,K.Schoonjans,et al. PPARgamma activators improve glucose homeostasis by stimulating fatty acid uptake in the adipocytes. Atherosclerosis 137 Suppl: S75-80,(1998)］。トログリタゾンおよびピオグリタゾン等のチアゾリジンジオンは、脂肪分解のより優れたインスリン抑制、または血漿への脂肪酸の放出をもたらす、脂肪細胞における脂肪合成活性を選択的に刺激することが示されてきた［Yamauchi,T.,J.Kamon,et al. The mechanisms by which both heterozygous peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARgamma)deficiency and PPARgamma agonist improve insulin resistance. J Biol Chem 276(44): 41245-54,(2001);Oakes,N.D.,P.G. Thalen,et al. Thiazolidinediones increase plasma-adipose tissue FFA exchange capacity and enhance insulin-mediated control of systemic FFA availability. Diabetes 50(5): 1158-65,(2001)］。この作用による他の組織への利用可能な遊離脂肪酸の放出はより少ない［Yang,W.S.,W.J. Lee,et al. Weight reduction increases plasma levels of an adipose-derived anti-inflammatory protein,adiponectin. J Clin Endocrinol Metab 86(8):3815-9,(2001)］。したがって、筋肉および肝臓内の遊離脂肪酸のインスリン脱感作効果は、チアゾリジンジオン処理の結果として、減少するであろう。これらの体外結果は、臨床的に確認されてきた［Boden,G. Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM. Diabetes 46(1): 3-10,(1997);Stumvoll,M. and H.U. Haring Glitazones: clinical effects and molecular mechanisms. Ann Med 34(3):217-24,(2002)］。
〔００２０３〕試験物質−トログリタゾンは、Cayman Chemicals(Ann Arbor,MI)より入手し、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシン、オイルレッドＯ、およびインスリンは、Sigma(St. Louis,MO)より入手した。試験物質は、アカシア（ＡｃＥ）サンプル＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）の水／アルコール抽出物から産生された暗褐色粉末であり、Bayir Chemicals(No.68,South Cross Road,Basavanagudi,India)より入手した。含まれるエピカテキンが２０％未満とならないように、抽出物を標準化した。本実施例で用いたバッチＮｏ．Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析で測定されたように、２０．８％のエピカテキンを含んでいた。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ変法イーグル培地ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）はMediatech(Herndon,VA)、１０％ＦＢＳ−ＨＩ（加熱不活性化したウシ胎児血清）はMediatech and Hyclone(Logan,UT)のものとした。他のすべての標準試薬は、別途指示がない限り、Ｓｉｇｍａから購入した。
〔００２０４〕細胞培養および処理−マウス線維芽細胞細胞株３Ｔ３−Ｌ１をAmerican Type Culture Collection（Manassas,VA）から購入し、供給元の指示に従い継体培養した。実験前、細胞を、ペニシリン５０単位／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した、１０％ＦＢＳ−ＨＩを含むＤＭＥＭに培養し、実験計画前の対数期に維持した。細胞を３７℃で、５％ＣＯ２加湿インキュベータで増殖させた。コンフルエント前の培地の成分には、（１）グルコース４．５ｇ／Ｌを含んだ、１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ、（２）ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、および（３）ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌが含まれていた。５０ｍｌの加熱不活性化したＦＢＳ、および５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを５００ｍｌのＤＭＥＭに添加することにより、増殖培地を製作した。この培地を４℃で保存した。使用前、培地を水浴で３７℃に温めた。
〔００２０５〕２４ウェルプレートに６×１０４の細胞／ｃｍ２の初期密度で、３Ｔ３−Ｔ１細胞を播種した。２日間、この細胞を増殖させ、コンフルエンスに達した。コンフルエンス後、分化培地を添加することによって、細胞を強制的に脂肪細胞に分化させたが、培地は、（１）１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）、（２）メチルイソブチルキサンチン０．５ｍＭ、（３）デキサメタゾン０．５μＭ、および（４）インスリン１０μｇ／ｍｌ（ＭＤＩ培地）で構成された。３日後、培地を１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭに１０μｇ／ｍｌのインスリンを含んだ、分化後培地に変えた。
〔００２０６〕ＡｃＥをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に部分的に分解し、培養培地に添加し、分化０日目、および成熟期（６または７日目（Ｄ６／７））を通じて、５０μｇ／ｍｌの濃度を達成した。新鮮な培地を添加するごとに、新鮮な試験物質も添加した。その極性、および水性の細胞培地と混和性があることから、ＤＭＳＯを選択した。陽性対照として、インドメタシンおよびトログリタゾンをそれぞれ添加し、５．０および４．４μｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。分化したＤ６／Ｄ７ ３Ｔ３−Ｌ１細胞を、０．３６％のオイルレッドＯまたは０．００１％のＢＯＤＩＰＹで染色した。試験物質による細胞の分化および処理の完全な手順を図１０に図式的に概略する。
〔００２０７〕オイルレッドＯ染色−Ｄ６／Ｄ７の分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド含量を、ＫａｓｔｕｒｉおよびＪｏｓｈｉ［Kasturi, R. and Joshi, V. C. Hormonal regulation of stearoyl coenzyme A desaturase activity and lipogenesis during adipose conversion of 3T3-L1 cells. J Biol Chem, 257: 12224-12230, 1982］の方法に従って、オイルレッドＯで推定した。単層細胞は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Mediatech）で洗浄し、１０％のホルムアルデヒドで１０分間固定した。固定した細胞は、３部の０．６％のオイルレッドＯ／イソプロパノール原液と２部の水とのオイルレッドＯ作用液で、１時間染色し、余分な染色は水で洗浄した。結果として得られたオイルの液滴をイソプロパノールで細胞から抽出し、５４０ｎｍで分光光度分析により定量化した（MEL312e BIO-KINETICS READER,Bio-Tek Instruments,Winooski,VT）。試験物質、ならびに陽性対照のインドメタシンおよびトログリタゾンの結果は、溶媒対照の５４０ｎｍ吸光度に対して表した。
〔００２０８〕ＢＯＤＩＰＹ染色−細胞の中性および非極性脂質を定量化するために、４，４−ジフルオロ−１，３，５，７，８−ペンタ−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（BODIPY493/503;Molecular Probes,Eugene,OR）を用いた。簡潔に、培地を除去し、細胞を非滅菌ＰＢＳで１回洗浄した。１ｍｇのＢＯＤＩＰＹを１ｍｌのＤＭＳＯに分解することによって（ＢＯＤＩＰＹ１，０００μｇ／ｍｌ）、１０００Ｘ ＢＯＤＩＰＹ／ＤＭＳＯ原液を製作した。次いで、０．０１μｇ／μｌの作用液でＢＯＤＩＰＹ最終濃度となるように、１０μｌの原液を９９０μｌのＰＢＳに添加することによって、ＢＯＤＩＰＹ作用液を製作した。１００μｌの作用液（１μｇ ＢＯＤＩＰＹ）を９６ウェルマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加した。１５分後、大気温度でオービタルシェイカー（DS-500,VWR Scientific Products,South Plainfield,NJ）で、細胞を１００μｌのＰＢＳで洗浄し、細胞へのＢＯＤＩＰＹの取り組みの分光蛍光定量を判断するために、１００μｌのＰＢＳを添加した。Packard Fluorocount蛍光分光計（モデル＃ＢＦ１００００，Meridan,CT）を４８５ｎｍの励起に設定し、ＢＯＤＩＰＹ蛍光の定量化のために５３０ｎｍの発光を用いた。試験物質、インドメタシン、およびトログリタゾンの結果は、溶媒対照の蛍光に対し、報告した。
〔００２０９〕すべての中性および非極性脂質のＢＯＤＩＰＹ定量化と、Ｄ７の３Ｔ３−Ｌ１細胞内のトリグリセリド含量のオイルレッドＯ測定との関係のカイ二乗分析では、ｐ＜０．００１およびオッズ比４．６４による２つの方法間の有意な関係を示した。
〔００２１０〕統計的計算および解釈−ＡｃＥおよびインドメタシンを２通りで最低３回アッセイを行った。溶媒およびトログリタゾン対照も２通りで８回複製した。非極性脂質の取り組みは、溶媒対照の十分に分化した細胞の非極性脂質の蓄積に対して表した。有効反応は、溶媒対照のそれぞれの上方９５％信頼区間を上回る、オイルレッドＯまたはＢＯＤＩＰＹ染色によって評価される、脂質蓄積の増加として定義した（片側、Ｅｘｃｅｌ；Microsoft,Redmond,WA）。ＡｃＥはさらに、溶媒反応に対するトログリタゾン陽性対照よりも良好、あるいは同等の脂質生成の増加を特徴としたが、この評価には、Ｅｘｃｅｌのスチューデントｔ検定機能を用いた。
〔００２１１〕結果−陽性対照である、インドメタシンおよびトログリタゾンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞で同程度の脂質生成を誘発した（図１１）。意外にも、ＡｃＥは、陽性対照であるインドメタシンおよびトログリタゾンのいずれかを上回る脂肪生成反応を産生した。
〔００２１２〕３Ｔ３−Ｌ１細胞では脂質生成の可能性が実証され、水性アカシアサンプル＃４９０９抽出物のジメチルスルホキシド可溶性成分は、インスリンへの不感受性の兆候もしくは症状を呈する、ヒトまたは他の動物におけるインスリン感受性の増加への可能性を実証する。
実施例１２
アカシアの水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画により誘発される、
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチン分泌の増加
〔００２１３〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００２１４〕試験物質−トログリタゾンは、Cayman Chemical(Ann Arbor,MI)より購入し、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、およびインスリンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。試験物質は、アカシアサンプル＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）の水／アルコール抽出物から産生された濃茶色の粉末であり、Bayir Chemicals(No.68,South Cross Road,Basavanagudi,India)より入手した。抽出物は、含まれるエピカテキンが２０％未満にならないように標準化した。本実施例で用いたバッチＮｏ．Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析で測定されるように、２０．８％のエピカテキンを含んでいた。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）はMediatech(Herndon,VA)、１０％ＦＢＳ−ＨＩ（加熱不活性化したウシ胎児血清）はＭｅｄｉａｔｅｃｈ ａｎｄ Ｈｙｃｌｏｎｅ（Logan,UT）のものとした。別途指示がない限り、他のすべての標準試薬は、Ｓｉｇｍａより購入した。
〔００２１５〕細胞培養および処理−６日目に分化した脂肪細胞を産生するために、実施例１０に記載のとおり、マウス線維芽細胞細胞株３Ｔ３−Ｌ１の培養を行った。９６ウェルプレートに１×１０４の細胞／ｃｍ２の初期密度で、３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種した。２日間、細胞を増殖させ、コンフルエンスに達した。コンフルエンス後、分化培地の添加によって、細胞を強制的に脂肪細胞に分化させた。この培地は、（１）１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）、（２）０．５ｍＭのメチルイソブチルキサンチン、（３）０．５μＭのデキサメタゾン、および（４）１０μｇ／ｍｌのインスリン（ＭＤＩ培地）で構成された。３日目から５日目は、培地を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに１０μｇ／ｍｌのインスリンからなる分化後培地に変えた。
〔００２１６〕Ｆａｓｓｈａｕｅｒら ［Fasshauer,et al. Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes. BBRC 290:1084-1089,(2002)］により説明される手順の修正を用いて、インスリン抵抗性成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるアカシアの効果を評価した。簡潔に、６日目に細胞を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んだ無血清培地に３時間維持し、次いでインスリン１μｇ／ｍｌと溶媒、またはインスリンと試験物質で処理した。トログリタゾンをジメチルスルホキシドに分解し、添加して、５、２．５、１．２５、および０．６２５μｇ／ｍｌの濃度を達成した。アカシア抽出物を５０、２５、１２．５、および６．２５μｇ／ｍｌで試験した。２４時間後、アディポネクチン測定のために、上清培地をサンプリングした。試験物質による細胞の分化および処理のための完全な手順は、図１２に図式的に概略する。
〔００２１７〕アディポネクチンアッセイ−培地に分泌されたアディポネクチンを、修正を行うことなくMouse Adiponectin Quantikine(r) Immunoassayキット（R&D Systems,Minneapolis,MN）を用いて定量化した。製造業者から供給された情報は、マウス細胞培地にスパイクしたアディポネクチンの回収が、平均で１０３％であり、検出可能な最小アディポネクチン濃度は、０．００１から０．００７ｎｇ／ｍｌに及ぶことを示した。
〔００２１８〕統計的計算および解釈−すべてのアッセイは２通りで行った。統計的分析のため、アディポネクチン分泌におけるアカシアの効果を溶媒対照に対して算出した。多重比較のため、補正を行わずにスチューデントｔ検定を用いて、用量間の相違を判断した。わずか５パーセントの第１種の過誤の確率を選択した。
〔００２１９〕試験物質の効力を、明らかなミカエリス定数および最大速度を判断するための、Ｈｏｆｓｔｅｅ［Hofstee,B.H.Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics. Nature 184:1296-1298,(1959)］の方法の修正を用いて推定した。独立変数ｖ／［Ｓ］に｛相対的アディポネクチン分泌／［濃度］｝、従属変数｛ｖ｝に｛相対的アディポネクチン分泌｝を代用すると、ｙ＝ｍｘ＋ｂの形式の関係になる。溶媒対照に対する最大アディポネクチン分泌は、ｙ切片から推定したが、最大アディポネクチン分泌の半分に必要な試験物質の濃度は、勾配の負の値から算出した。
〔００２２０〕結果−陽性対照トログリタゾンに対して試験を行ったすべての濃度は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞で、溶媒対照に対し、２．５μｇ／ｍｌで２．４４倍の最大刺激で、アディポネクチン分泌を高めた（図１３）。アカシア５０および２５μｇ／ｍｌの両方の濃度では、溶媒対照に対し、それぞれ１．７６および１．７０倍のアディポネクチン分泌を増加させた。これらの濃度のアカシアのどちらも、トログリタゾンで認められた最大アディポネクチン分泌と等しくなかったが、１．２５および０．６２５μｇ／ｍｌのトログリタゾンの濃度に相当した。
〔００２２１〕修正したＨｏｆｓｔｅｅプロットから得られた最大アディポネクチン分泌の推定値は、最大刺激の半分に必要な濃度の大幅な相違で、アディポネクチン分泌における同等の相対的増加を示した。トログリタゾンおよびアセンヤクノキのｙ切片から推定された最大アディポネクチン分泌は、溶媒対照に対しそれぞれ２．２９および１．８８倍であった。しかし、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞における最大アディポネクチン分泌の半分の刺激に必要な濃度は、トログリタゾンでは０．０８５μｇ／ｍｌ、アカシアでは５．３８μｇ／ｍｌであった。２０％の最小エピカテキン含量を算出すると、このアカシアの後者の数字は、約１．０μｇ／ｍｌとなる。
〔００２２２〕インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞において、アディポネクチン分泌を高める能力に基づき、アカシア、および／またはエピカテキンは、血漿アディポネクチン濃度が減少する、臨床病理学における好ましい効果を有すると期待され得る。
実施例１３
アカシアの水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画により誘発された、ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチンの増加
〔００２２３〕モデル−これらの実験では、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００２２４〕試験物質−インドメタシン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、およびインスリンは、Sigma(St.Louis,MO)より入手した。試験物質は、アカシアサンプル＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）の水／アルコール抽出物から産生された濃茶色の粉末であり、Bayir Chemicals(No.68,South Cross Road,Basavanagudi,India)から入手した。抽出物は、含まれるエピカテキンが２０％未満とならないように標準化した。本実施例で用いたバッチＮｏ． Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析で測定されるように、２０．８％のエピカテキンを含んでいた。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）はMediatech(Herndon,VA)からのものとし、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ａｎｄ Ｈｙｃｌｏｎｅ（Logan,UT）でキャラクタライズしたものとした。別途指示がない限り、他のすべての標準試薬は、Ｓｉｇｍａより購入した。
〔００２２５〕細胞培養および処理−３日目に分化した脂肪細胞を産生するため、実施例１０に記載のとおり、マウス線維芽細胞細胞株３Ｔ３−Ｌ１の培養を行った。９６ウェルプレートに１×１０４の細胞／ｃｍ２の初期密度で、３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種した。２日間、細胞を増殖させ、コンフルエンスに達した。コンフルエンス後、分化培地の添加によって、細胞を強制的に脂肪細胞に分化させた。この培地は、（１）１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）、（２）メチルイソブチルキサンチン０．５ｍＭ、（３）デキサメタゾン０．５μＭ、および（４）インスリン１０μｇ／ｍｌ（ＭＤＩ培地）で構成された。３日目から５日目は、培地をＤＭＥＭに１０％ＦＢＳからなる分化後培地に変えた。５日目、培地を、インドメタシンまたはアカシア抽出物を含む、もしくは含まない、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭにＴＮＦα１０、２、または０．５ｎｇ／ｍｌを含んだ試験培地に変えた。インドメタシンをジメチルスルホキシドに分解し、添加して、５、２．５、１．２５、および０．６２５μｇ／ｍｌの濃度を達成した。アカシア抽出物を５０、２５、１２．５、および６．２５μｇ／ｍｌで試験した。６日目に、アディポネクチン測定のため、上清培地をサンプリングした。試験物質による細胞の分化および処理のための完全な手順は、図１４に図式的に概略する。
〔００２２６〕アディポネクチンアッセイ−培地に分泌されたアディポネクチンを、修正を行うことなくMouse Adiponectin Quantikine(r) Immunoassayキット（R&D Systems,Minneapolis,MN）を用いて定量化した。製造業者から供給された情報は、マウス細胞培地にスパイクしたアディポネクチンの回収は、平均で１０３％であり、検出可能な最小アディポネクチン濃度は、０．００１から０．００７ｎｇ／ｍｌに及ぶことを示した。
〔００２２７〕統計的計算および解釈−すべてのアッセイは２通りで行った。統計的分析のため、アディポネクチン分泌におけるアカシアの効果を溶媒対照に対して算出した。多重比較のため、補正を行わずにスチューデントｔ検定を用いて、用量間の相違を判断した。わずか５パーセントの第１種の過誤の確率を選択した。
〔００２２８〕結果−ＴＮＦαは、１０および２ｎｇ／ｍｌの濃度で、成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞において、溶媒対照に対し、それぞれアディポネクチン分泌を６５および２９％有意に（ｐ＜０．０５）減少し、０．５ｎｇ／ｍｌではアディポネクチン分泌への明らかな効果はなかった（図１５）。ＴＮＦα１０および２ｎｇ／ｍｌで、インドメタシンは、試験を行ったすべての用量でのＴＮＦα単独に対し、アディポネクチン分泌を高めた（ｐ＜０．０５）が、溶媒対照のレベルにアディポネクチン分泌を回復することはできなかった。ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌの存在下でのアカシア処理により、インドメタシンに対し、減衰したが、同様のアディポネクチン増加をもたらした。アセンヤクノキとインドメタシンとの間のアディポネクチン刺激の相違は、４つの漸増用量において、それぞれ１４、２０、３２、および４１％であった。用量間の倍数は、インドメタシンおよびアカシアで同一であったことから、これらの結果は、超生理学的濃度のＴＮＦαの存在下で、３Ｔ３−Ｌ１細胞へのアディポネクチン分泌を回復する際、インドメタシンの効力が、アカシア内の活性物質を上回ることを示唆する。
〔００２２９〕２ｎｇのＴＮＦαおよびアカシアによる３Ｔ３−Ｌ１細胞の処理は、ＴＮＦα単独に対し、アディポネクチン分泌の増加をもたらし、６．２５、２５、および５０μｇ／ｍｌで有意（ｐ＜０．０５）であった。しかし、ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌによる処理とは異なり、アカシアとインドメタシンとの間の相違は小さく、明らかに用量に関連していたわけではなく、試験を行った４つすべての濃度で平均５．５％であった。インドメタシンで認められたように、アカシアは、溶媒対照に認められたレベルにアディポネクチン分泌を回復しなかった。
〔００２３０〕ＴＮＦα０．５ｎｇ／ｍｌで、インドメタシンは、アディポネクチン分泌の用量依存的な減少をもたらし、２．５および５．０μｇ／ｍｌの濃度で有意（ｐ＜０．０５）であった。興味深いことに、インドメタシンとは異なり、アセンヤクノキは、５０μｇ／ｍｌで、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、試験を行ったＴＮＦαおよび溶媒の両方に対し、アディポネクチン分泌を増加した。したがって、生理的濃度に匹敵するＴＮＦαの濃度では、アセンヤクノキは、ＴＮＦαおよび溶媒対照の両方に対し、アディポネクチン分泌を高め、驚くべきことに、インドメタシンにまさっていた。
〔００２３１〕ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチン分泌を高める能力に基づき、アセンヤクノキおよび／またはエピカテキンは、すべての臨床病理に、ＴＮＦαレベルが上昇し、血漿アディポネクチン濃度が減少するという好ましい効果を有すると期待される。
実施例１４
種々の市販のアカシアサンプルは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルの脂質生成を増加する
〔００２３２〕モデル−これらの実験では、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。オイルレッドＯアッセイのみを行って、アセンヤクノキにより誘発される細胞のトリグリセリド含量を評価した点を除き、用いたすべての化学物質および手順は、実施例１１に記載のとおりとした。アセンヤクノキ サンプル＃５６６９は、Natural Remedies（364,2nd Floor,16th Main,4th T Block Bangalore,Karnataka 560041 India）から入手し、サンプル＃４９０９、＃５６６７、および＃５６６８は、Bayir Chemicals(No.10,Doddanna Industrial Estate,Penya II Stage,Bangalore,560091 Karnataka,India）から入手した。アラビアゴムモドキサンプル＃５６３９、＃５６４０、および＃５６５９は、KDN-Vita International,Inc.(121 Stryker Lane,Units4&6 Hillsborough,NJ 08844）より購入した。サンプル＃５６４０は樹皮、サンプル＃５６６７はゴム樹脂、サンプル＃５６６９は心材粉末として記載した。別途指示がない限り、すべての他のサンプルは、アセンヤクノキ樹皮の商標権を有するメタノール抽出物として記載した。
〔００２３３〕結果−検査を行ったすべてのアカシアサンプルは、好ましい脂質合成反応をもたらした（図１６）。サンプル＃５６６９ 心材粉末（１．２７）、＃５６５９ メタノール抽出物（１．３１）、＃５６４０ ＤＭＳＯ抽出物（１．２９）、および＃４９０９ メタノール抽出物（１．３１）から、最も高い脂質合成反応を達成した。
〔００２３４〕本実施例は、インスリン作用の増加を支援する、脂肪細胞の生理の好ましい方向への修正が可能なアセンヤクノキ内の多数の化合物の存在をさらに実証する。
実施例１５
種々の市販のアカシアサンプルは、ＴＮＦα−３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルのアディポネクチン分泌を増加する
〔００２３５〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。実施例１１および１３に記述のとおりに、標準化学物質を用いて、細胞の処理を行った。細胞をＴＮＦα２または１０ｎｇ／ｍｌに暴露した点のみは、ＴＮＦαによる３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の処理は、実施例１２とは異なった。６日目に、実施例１２に記載のとおり、培養上清培地をアディポネクチンについてアッセイを行った。アカシアサンプル＃４９０９、＃５６３９、＃５６５９、＃５６６７、＃５６６８、＃５６４０、および＃５６６９の製剤は、実施例１３に記載のとおりとした。
〔００２３６〕結果−２ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαは、溶媒対照から３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアディポネクチン分泌を２７％減少したが、アディポネクチン分泌は、ＴＮＦα溶媒対照から、インドメタシン１．２５μｇ／ｍｌで最大１１％上昇した（表１２）。アカシア製剤＃５５５９のみが、試験を行った４つの用量のいずれにおいても、アディポネクチン分泌を増加することができなかった。アカシアの他のすべての製剤は、１０から１５％に及ぶアディポネクチン分泌の同等の最大の増加をもたらした。しかし、最大アディポネクチン分泌が種々のアカシア製剤で誘発される濃度に関して、相違が認められた。最も強力な製剤は、１２．５μｇ／ｍｌで達成されたアディポネクチン刺激の最大刺激をもたらした＃５６４０であり、次いで２５μｇ／ｍｌで＃４９０９および＃５６６８、最後に５０μｇ／ｍｌで＃５６３９、＃５６６７、および＃５６６９であった。
〔００２３７〕１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαは、溶媒対照から３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアディポネクチン分泌を５４％減少したが、アディポネクチン分泌は、ＴＮＦα溶媒対照からインドメタシン５．０μｇ／ｍｌで最大６７％上昇した（表１３）。トログリタゾンは、試験を行った最低用量０．６２５μｇ／ｍｌで、アディポネクチン分泌を最大で５１％増加した。アカシア製剤＃５５５９は、２５μｇ／ｍｌで１２％の最も低い有意な増加（ｐ＜０．０５）をもたらした。アカシアの他のすべての製剤は、５０μｇ／ｍｌで、１７から４１％に及ぶアディポネクチン分泌の最大の増加をもたらした。最も強力な製剤は、ＴＮＦα溶媒対照でそれぞれ４１および４０％のアディポネクチン分泌の増加で、＃４９０９および＃５６６９であった。
〔００２３８〕メタボリック症候群のこの第２のモデルにおいて同様の反応を誘発するという見解は、インスリン作用の増加を支援する、脂肪細胞の生理の好ましい方向への修正が可能なアカシア内の多数の化合物の存在をさらに実証する。
実施例１６
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルのアディポネクチン分泌を増加することができる
アセンヤクノキからの極性および非極性溶媒抽出物化合物
〔００２３９〕モデル−これらの実験では、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。用いた標準化学物質は、実施例１１および１３の記述のとおりとする。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、実施例１３に記載のとおり、ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌで処理した。実施例１３に詳述するように、６日目にアディポネクチンについて培養上清培地のアッセイを行った。
〔００２４０〕試験物質−アセンヤクノキサンプル＃５６６９心材の大きな片（それぞれの片は、重さ５〜１０ｇ）に、低速の標準パワードリルを用いて、５／８”金属ドリルビットで穿設した。木の削りくずを粉削機に集め、液体Ｎ２で凍結させながら細かい粉末に粉砕する。次いでこの粉末を２５０ミクロンのスクリーンで篩過し、約１０ｇの細かい流動性（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）粉末の状態にした。
〔００２４１〕この粉末を６つのガラスアンバーバイアル（１５０ｍｇ／バイアル）に分注し、表１４に記載の２ｍｌの溶媒で、４０℃で約１０時間抽出した。この抽出の後、心材／溶媒懸濁液を遠心分離（５８００ｘｇ、１０分）にかけた。遠心分離からの上清分画を０．４５ミクロンのＰＴＦＥシリンジフィルタで、別個のアンバーグラスバイアルにろ過した。これらのサンプルのそれぞれを真空で濃縮した。表７に見られるように、ＤＭＳＯアセンヤクノキ心材から最も多くの物質を抽出し、クロロホルムは最も少なかった。すべての抽出物サンプルは、５０、２５、１２．５、および６．２５μｇ／ｍｌで試験を行った。
〔００２４２〕ピオグリタゾンは、Ａｃｔｏｓ（ｒ）（Takeda Pharmaceuticals,Lincolnshire,IL）としての商業的供給源より４５ｍｇピオグリタゾン錠で入手した。この錠剤を細かい粉末に粉砕し、ピオグリタゾン５．０、２．５、１．２５、および０．６２５μｇ／ｍｌで試験した。付加的な陽性対照として、インドメタシンも含む。
〔００２４３〕結果−陽性対照のピオグリタゾンおよびインドメタシンの両方は、ＴＮＦαの存在下で、脂肪細胞によるアディポネクチン分泌をそれぞれ１１５および９４％増加した（図１７）。最適なピオグリタゾンおよびインドメタシン濃度は、それぞれ１．２５および２．５μｇ／ｍｌであった。ＴＮＦα処理に対し、アセンヤクノキサンプル＃５６６９のすべての抽出物は、アディポネクチン分泌を増加した。抽出物の中でも、ＤＭＳＯ抽出物は、抽出物６．２５μｇ／ｍｌで認められた最大活性により、アディポネクチン分泌の最も強力な誘導剤であった。この結果は、幅広い、種々の極性の物質を抽出する、ＤＭＳＯの能力である可能性がある。図１７の検査は、水抽出物（極性化合物）およびクロロホルム抽出物（非極性化合物）の両方が、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルのアディポネクチン分泌を増加する能力において類似していたことを示す。これらの抽出物が同様の化合物を含んでいるとは考えにくい。本実施例は、炎症性刺激の存在下で、脂肪細胞からのアディポネクチン分泌を増加することができる、アセンヤクノキ心材からの化合物を抽出する、異なる極性を有する溶媒の能力を図解する。
実施例１７
アセンヤクノキの酸性および塩基性分画は、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルのアディポネクチン分泌を増加することができる
〔００２４４〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。使用した標準化学物質は、実施例１１および１３の記述のとおりとした。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、実施例１３に記載のとおり、ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌで処理した。実施例１３に詳述するように、６日目にアディポネクチンについて培養上清培地のアッセイを行った。
〔００２４５〕試験物質−アセンヤクノキサンプル＃５６６９を以下の手順に従い抽出した。アルカリ性イソプロピルアルコール溶液（１％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中１．５ＮのＮａＯＨ）を５０ｍｌ管の約５０ｍｇの乾燥アセンヤクノキ心材粉末＃５６６９へ添加した。次いでサンプルを簡潔に混合し、３０分間超音波分解し、１時間遠心分離して、残存する固体物質をペレット化する。次いで上清液を０．４５ミクロンのフィルタ紙でろ過する。使用した塩基性イソプロパノールのｐＨはｐＨ８．０であったが、収集した液体のｐＨはｐＨ７．０であった。ろ過した透明な液体の一部を真空で乾固すると、白色固体となった。このサンプルを乾燥したアルカリ性抽出物と称した。
〔００２４６〕残存するペレット化した物質を酸性イソプロピルアルコール溶液（１％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中１０％ＨＣｌ）で赤色溶液にした。このサンプルをペレット物質が十分に液中に分散するまで混合し、次いで３０分間遠心分離して、残存する固体を再びペレット化した。淡黄色の上清液を０．４５ミクロンのフィルタ紙に通過させた。収集した液体のｐＨはｐＨ３．０であり、サンプルのｐＨをｐＨ８〜９に挙げる際、赤褐色の沈殿物を形成した（乾燥した沈殿物）ことが明らかとなった。沈殿物を収集し、乾燥させ、赤褐色の固体を得た。上清液を再び０．４５ミクロンのフィルタに通過させ、いずれかの残存する沈殿物を除去した。この液体は、濃黄色であった。この残存液を乾固し、茶色一色のサンプルを得、これを乾燥した酸性抽出物を称した。３つの分画の回収を表１５に記載する。すべての試験物質は、５０、２５、１２．５、および６．２５μｇ／ｍｌでアッセイを行ったが、ピオグリタゾン陽性対照は、５．０、２．５、１．２５、および０．６２５μｇ／ｍｌで試験した。
〔００２４７〕結果 ＴＮＦαは、溶媒対照に対し、アディポネクチン分泌を４６％減少した。ピオグリタゾンによるアディポネクチン分泌の最大回復は、１．２５μｇ／ｍｌで認められたＴＮＦα処理の１．４７倍であった（表１６）。試験物質のうち、乾燥した沈殿剤のみが、ＴＮＦαのみの対照を有意に上回るアディポネクチン分泌を増加することができなかった。酸性抽出物および心材粉末（出発物質）は、ＴＮＦαの存在下でアディポネクチン分泌を増加する能力において類似していたが、アルカリ性抽出物は、最高用量の５０μｇ／ｍｌでのみ、アディポネクチン分泌を増加した。
実施例１８
アカシアの水性抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画による、ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのインターロイキン−６分泌の減少
〔００２４８〕インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、宿主防衛、急性期反応、免疫反応、神経細胞機能、造血およびメタボリック症候群に重要な役割を果たす、多機能サイトカインである。これは、脂肪細胞等の種々の正常な、および形質転換したリンパおよび非リンパ細胞により発現する。ＩＬ−６の産生は、分裂または抗原刺激、リポ多糖、カルシウムイオノフォア、サイトカイン、およびウイルス等の、多数のシグナルにより上方制御される［Hibi,M.,Nakajima,K.,Hirano T. IL-6 cytokine family and signal transduction: a model of the cytokine system. J Mol Med.74(1):1-12,(Jan 1996)］。血清レベルの上昇は、細菌性およびウイルス感染、外傷、自己免疫疾患、悪性腫瘍、ならびにメタボリック症候群を含む、多くの病的状態に認められてきた［Arner,P.Insulin resistance in type 2 diabetes--role of the adipokines. Curr Mol Med.;5(3):333-9,(May 2005)］。
〔００２４９〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。使用した標準化学物質は、実施例１１および１３の記述のとおりとした。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、実施例１３に記載のとおり、ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌで処理した。実施例１３に詳述するように、６日目にアディポネクチンについて培養上清培地のアッセイを行った。
〔００２５０〕試験物質−インドメタシン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、およびインスリンは、Sigma(St.Louis,MO)より入手した。試験物質は、アセンヤクノキサンプル＃４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）の水／アルコール抽出物から産生された濃茶色粉末であり、Bayir Chemicals(No.68,South Cross Road,Basavanagudi,India)より入手した。抽出物は、含まれるエピカテキンが２０％未満とならないように標準化した。本実施例で用いたバッチＮｏ．Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析で測定されるように、２０．８％のエピカテキンを含んでいた。ペニシリン、ストレプトマイシン、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）はMediatech(Herndon,VA)からのものとし、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）はＭｅｄｉａｔｅｃｈ ａｎｄ Ｈｙｃｌｏｎｅ（Logan,UT)でキャラクタライス゛したのものとした。別途指示がない限り、他のすべての標準試薬は、Sigmaより購入した。
〔００２５１〕 インターロイキン−６アッセイ−培地に分泌されたＩＬ−６を、修正を行うことなくMouse Adiponectin Quantikine(r) Immunoassayキット（R&D Systems,Minneapolis,MN）を用いて定量化した。製造業者から供給された情報は、マウス細胞培地にスパイクしたＩＬ−６の回収が１：２の希釈で平均９９％であり、検出可能な最小ＩＬ−６濃度が１．３から１．８ｐｇ／ｍｌに及ぶことを示した。すべての上清培地サンプルは希釈せずにアッセイを行った。
〔００２５２〕統計的計算および解釈−すべてのアッセイは、２通りで行った。統計的分析のため、溶媒対照に対する、アディポネクチンまたはＩＬ−６分泌におけるアカシアの効果を算出した。多重比較のため、補正を行わずにスチューデントｔ検定を用いて、用量間の相違を判断した。わずか５パーセントの第１種の過誤の確率（片側）を選択した。
〔００２５３〕結果−先述の実施例に見られるように、ＴＮＦαは劇的にアディポネクチン分泌を減少したが、インドメタシンおよびアセンヤクノキ抽出物の両方は、ＴＮＦαの存在下でアディポネクチン分泌を増加した。インドメタシン陽性対照およびアセンヤクノキ抽出物の両方は、アディポネクチン分泌における用量依存性の増加を実証したが、ＴＮＦαなしでジメチルスルホキシド対照に見られたものへ、アディポネクチン濃度を回復した物質はなかった（表１７）。アセンヤクノキ抽出物は、ＴＮＦαの存在下で、ＩＬ−６分泌の強力な用量依存性の阻害を実証したが、インドメタシンは、抗炎症作用を実証しなかった。
〔００２５４〕炎症性ＩＬ−６に対する抗炎症アディポネクチンの割合の検査は、インドメタシンおよびアセンヤクノキ抽出物の両方への相対的な抗炎症活性において、優れた用量依存性の増加をもたらした。
〔００２５５〕アセンヤクノキサンプル＃４９０９は、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルで二重の抗炎症作用を実証した。アセンヤクノキ抽出物の成分は、アディポネクチン分泌を増加したが、ＩＬ−６分泌を減少した。アセンヤクノキの全体的な効果は、ＴＮＦα対照に対し、強い抗炎症効果であった。これらの結果は、インスリン抵抗性の体重増加、肥満、心血管疾患、および癌を減少させる、脂肪細胞の生理を修正するためのアセンヤクノキの使用を支持する。
実施例１９
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチン、ＩＬ−６、およびレジスチンの分泌における、水性アカシア抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画の効果
〔００２５６〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。手順使用した標準化学物質および統計的は、実施例１１および１２に記述のとおりとした。ＩＬ６は、実施例１８に記載のとおりにアッセイを行った。
〔００２５７〕レジスチンアッセイ−修正を行わずにQuantikine(r) Mouse Resistin Immunoassayキット（R&D Systems,Minneapolis,MN）を用いて、培地に分泌されたレジスチンの量を定量化した。製造業者から供給された情報は、マウス細胞培地にスパイクしたレジスチンの回収が、１：２の希釈で平均９９％であり、検出可能な最小レジスチン濃度が、１．３から１．８ｐｇ／ｍｌに及ぶことを示した。すべての上清培地サンプルは、アッセイ前に、製造業者から供給された希釈培地と１：２０で希釈した。
〔００２５８〕統計的計算および解釈−すべてのアッセイは、２通りで行った。統計的分析のため、溶媒対照に対する、アディポネクチンまたはＩＬ−６分泌へのアセンヤクノキの効果を算出した。多重比較のため、補正を行わずにスチューデントｔ検定を用いて、用量間の相違を判断した。わずか５パーセントの第１種の過誤の確率（片側）を選択した。
〔００２５９〕結果−トログリタゾンおよびアカシアサンプル＃４９０９の両方は、高濃度のインスリンの存在下で、用量依存的にアディポネクチン分泌を増加した（表１８）。アセンヤクノキは、６．２５μｇ／ｍｌの濃度のみでＩＬ−６の減少により抗炎症作用を呈したが、トログリタゾンは、５．００および１．２５μｇ／ｍｌの濃度で炎症性であり、他の２つの濃度では効果は認められなかった。レジスチン分泌は、トログリタゾンにより用量依存的に増加したが、アセンヤクノキは、同様に用量依存的にレジスチン発現を減少した。
〔００２６０〕実施例１８に見られるように、アセンヤクノキサンプル＃４９０９は、高インスリン症／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて、二重の抗炎症作用を再び実証した。アセンヤクノキ抽出物の成分は、アディポネクチン分泌を増加したが、ＩＬ−６分泌を減少した。したがって、高インスリン対照に対し、アセンヤクノキの全体的な効果は、抗炎症効果であった。高インスリン濃度の存在下でのレジスチン分泌へのアセンヤクノキの効果は、トログリタゾンとは反対であった。トログリタゾンは、レジスチン発現を増加したが、アセンヤクノキは、レジスチン発現をさらに減少した。これらのデータは、複合アセンヤクノキ抽出物が、ＰＰＡＲγ受容体を介して機能していないことを示唆する。これらの結果はさらに、インスリン抵抗性の体重増加、肥満、心血管疾患、および癌を減少する、脂肪細胞の生理の修正のためのアセンヤクノキの使用を支持する。
実施例２０
ホップから派生した植物化学物質による、脂肪細胞内の脂質生成の増加
〔００２６１〕モデル−これらの実験では、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。用いた標準化学物質および統計的手順は、実施例１１に記述のとおりとした。
〔００２６２〕試験物質−本試験で使用したホップ植物化学物質を、表１９に記載する。これらはBetatech Hops Products(Washington,D.C.,U.S.A.)より入手した。
〔００２６３〕細胞培養および処理−ホップ化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に分解し、添加して、分化０日目で１０、５、４、または２μｇ／ｍｌの濃度を達成し、成熟期（６または７日目）を通じて維持した。ホップかすは、５０μｇ／ｍｌで試験した。新鮮な培地を添加するごとに、新鮮な試験物質も添加した。その極性、および水性細胞培地に混和性があることからＤＭＳＯを選択した。陽性対照として、インドメタシンおよびトログリタゾンをそれぞれ添加し、５．０および４．４μｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。分化した６日目／７日目の３Ｔ３−Ｌ１細胞を、０．３６％オイルレッドＯまたは０．００１％ＢＯＤＩＰＹで染色した。
〔００２６４〕結果−陽性対照のインドメタシンおよびトログリタゾンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞と同程度の脂質生成を誘発した（図１８）。意外なことに、ホップ属のうちの４つが、陽性対照のインドメタシンおよびトログリタゾンを上回る、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での脂質生成反応をもたらした。これらの４属には、イソアルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、およびヘキサヒドロイソアルファ酸を含む。個々のイソフムロンのＰＰＡＲγとの結合が、強力なＰＰＡＲγゴニストピオグリタゾンの約１／３から１／４であったという、公開報告を踏まえると、この所見は驚くべきものである［Yajima, H., Ikeshima, E., Shiraki, M., Kanaya, T., Fujiwara, D., Odai, H., Tsuboyama-Kasaoka, N., Ezaki, O., Oikawa, S., and Kondo, K. Isohumulones, bitter acids derived from hops, activate both peroxisome proliferator-activated receptor alpha and gamma and reduce insulin resistance. J Biol Chem, 279: 33456-33462, (2004)］。
〔００２６５〕キサントフモール、アルファ酸、およびベータ酸の脂質生成反応は、インドメタシンおよびトログリタゾンに匹敵するが、ホップかすおよびヘキサヒドロコルプロンは、溶媒対照を上回る脂質合成反応を誘発することができなかった。
〔００２６６〕３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるそれらの脂質生成の可能性に基づき、異性化アルファ酸、アルファ酸、およびベータ酸、ならびにキサントフモールを含む、本研究の好ましいホップ植物化学物質の属は、インスリンへの不感受性の兆候または症状を呈する、ヒトまたは他の動物において、インスリン感受性を増加し、血清トリグリセリドを減少することが期待され得る。
実施例２１
ホップ植物化学物質は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で、アディポネクチン分泌を増加する
〔００２６７〕モデル−本実施例では、実施例１１および１２に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。標準化学物質、ホップ化合物ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、キサントフモール、ヘキサヒドロコルプロン、ホップかすはそれぞれ、実施例１２および２０に記載のものとした。
〔００２６８〕細胞培養および処理−細胞を実施例１２に記載のとおりに培養し、前述のとおりにホップ植物化学物質で処理した。アディポネクチンアッセイおよび統計的解釈は、実施例１２に記載のとおりとした。明らかなミカエリス定数および最大速度を判断するための、Ｈｏｆｓｔｅｅの方法の修正を用いて、試験物質の効力を推定した。独立変数ｖ／［Ｓ］に｛相対的アディポネクチン分泌／［濃度］｝、従属変数｛ｖ｝に｛相対的アディポネクチン分泌｝を代用すると、ｙ＝ｍｘ＋ｂの形式の関係になる。溶媒対照に対する最大アディポネクチン分泌は、ｙ切片から推定したが、最大アディポネクチン分泌の半分に必要な試験物質の濃度は、勾配の負の値から算出した。
〔００２６９〕結果−陽性対照のトログリタゾンは、最大でアディポネクチン分泌をインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞において、２．５μｇ／ｍｌで溶媒対照の２．４４倍高めた（図１９）。試験を行ったすべてのホップ植物化学物質は、溶媒対照に対し、アディポネクチン分泌の促進を実証し、イソアルファ酸は、トログリタゾンよりも有意にアディポネクチン分泌をもたらした（対照に対し２．９７倍）。試験を行った４つの用量のうち、最大アディポネクチン分泌は最高用量の５μｇ／ｍｌでイソアルファ酸、Ｒｈｏイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、およびテトラヒドロイソアルファ酸に認められた。キサントフモール、ホップかす、およびヘキサヒドロコルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）では、認められたアディポネクチン分泌の最大の増加は、それぞれ１．２５、２５、および１２．５μｇ／ｍｌで見られた。認められた最大の相対的アディポネクチン発現は、キサントフモール、Ｒｈｏイソアルファ酸、およびホップかすではトログリタゾンには匹敵し、トログリタゾンを下回ったが、ヘキサヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロコルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）、およびテトラヒドロイソアルファ酸では対照を上回った。
〔００２７０〕表２０に見られるように、修正したＨｏｆｓｔｅｅプロットから得た最大アディポネクチン分泌の推定値（図２０）は、上述した見解を支持する。最大アディポネクチン分泌のｙ切片推定値を、おおまかに３つの群：（１）イソアルファ酸、（２）キサントフモール、Ｒｈｏイソアルファ酸、トログリタゾン、およびホップかす、ならびに（３）ヘキサヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロコルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）、およびテトラヒドロイソアルファ酸に分離した。インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞において、最大アディポネクチン分泌の半分の刺激に必要な試験物質の濃度、約０．１μｇ／ｍｌは、トログリタゾン、Ｒｈｏイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、およびヘキサヒドロイソアルファ酸と類似していた。最大アディポネクチン分泌の半分でのイソアルファ酸の濃度、０．４９μｇ／ｍｌは、ほぼ５倍上回った。キサントフモールは、０．０３７μｇ／ｍｌで推定された、最大アディポネクチン分泌の半分に対し、最低用量を呈した。推定された最大アディポネクチン分泌の半分の変数の最高濃度は、ホップかすおよびヘキサヒドロコルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）でそれぞれ２．８および３．２μｇ／ｍｌであった。
〔００２７１〕インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞でアディポネクチン分泌を高めるそれらの能力に基づき、本研究に見られた好ましいホップ植物化学物質属である、イソアルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、ホップかす、ならびにヘキサヒドロコルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）は、血漿アディポネクチン濃度が減少する、すべての臨床病理に好ましい効果を有することが期待され得る。
実施例２２
ホップ植物化学物質は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、インターロイキン−６分泌のアディポネクチン分泌および阻害の増進により抗炎症活性を呈する
〔００２７２〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。アディポネクチンおよびＩＬ−６は、実施例１２および１８に記載のとおり、それぞれアッセイを行った。標準化学物質、ホップ化合物ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、キサントフモール、ヘキサヒドロコルプロン、ホップかすは、実施例１２および２０に記載のとおりとした。
〔００２７３〕統計的計算および解釈−すべてのアッセイは２通りで行った。統計的分析のため、溶媒対照に対する、アディポネクチンまたはＩＬ−６分泌へのホップ派生物の効果を算出した。多重比較のため、補正を行わずに分散分析を用いて、用量間の相違を判断した。わずか５パーセントの第１種の過誤の確率を選択した。
〔００２７４〕結果−試験を行ったトログリタゾンおよびすべてのホップ派生物は、高濃度のインスリンの存在下でアディポネクチン分泌を増加した（表２１）。本モデルでは、トログリタゾンは、ＩＬ−６分泌を減少しなかった。実際、トログリタゾンおよびＨＨＣＬは、ＩＬ−６分泌が上昇した２つの濃度を呈したが、ＴＨＩＡＡおよびホップかすは最高濃度でＩＬ−６を減少し、他の濃度では効果はなかった。ＩＬ−６分泌への他のホップ派生物の効果は、概して、二相性であった。試験を行った最高濃度で、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、およびＸＮはＩＬ−６分泌を増加し、ＩＡＡのみが増加しなかった。ＩＬ−６分泌の有意な減少は、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、およびＸＮに認められた。
〔００２７５〕全体的な抗炎症有効性の測定基準である、アディポネクチン／ＩＬ−６の割合は、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＨＨＩＡ、およびＸＮで強陽性（＞２．００）であった。ＴＨＩＡＡ、ＨＨＣＬ、およびホップかすは、わずかに低いが陽性のアディポネクチン／ＩＬ−６割合を呈した。トログリタゾンでは、アディポネクチン／ＩＬ−６の割合は、２．５および０．６２５μｇ／ｍｌでの強度の有効反応、５．０または１．２５μｇ／ｍｌでの無効果と混在していた。
〔００２７６〕このデータは、高インスリン血の炎症性効果が、ホップ派生物ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＨＨＩＡ、ＴＨＩＡＡ、ＸＮ、ＨＨＣＬ、およびホップかすによって、脂肪細胞内で減衰する可能性があることを示唆する。一般に、ＴＮＦαによる合併がない高インスリン血状態の高インスリン血における、ホップ派生物の抗炎症作用は、トログリタゾンのものよりも一貫性がある。
実施例２３
ホップ植物化学物質は、ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアディポネクチン分泌を増加する
〔００２７７〕モデル−これらの実験では、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。標準化学物質、ならびにホップ化合物ＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、およびＴＨＩＡＡは、それぞれ実施例１３および２０に記載のとおりとした。ホップ派生物は、０．６２５、１．２５、２．５、および５．０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。アディポネクチンは、実施例１２に記載のとおりにアッセイを行った。
〔００２７８〕結果−ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌによる、５日目（Ｄ５）の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の終夜の処理は、アディポネクチン分泌を顕著に抑制した（図２１）。ホップ派生物ＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、およびＴＨＩＡＡはすべて、ＴＮＦα／溶媒対照に対し、アディポネクチン分泌を増加した。直線状の用量反応曲線が、ＲＩＡＡおよびＨＨＩＡＡに認められ、試験を行った最高濃度の５．０μｇ／ｍｌで最大阻害をもたらした。ＩＡＡは、１．２５μｇ／ｍｌでアディポネクチンの最大分泌を誘発したが、ＴＨＩＡＡは、５．０μｇ／ｍｌで最大アディポネクチン分泌の曲線をなす反応を呈した。
〔００２７９〕超生理学的濃度のＴＮＦαの存在下で、脂肪細胞のアディポネクチン分泌を増加する、ホップ派生物ＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、およびＴＨＩＡＡの能力は、準最適な脂肪細胞機能を伴う、炎症状態の予防または処理における、これらの化合物の有用性を支持する。
実施例２４
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の脂質生成およびアディポネクチン分泌を変化させる、ホップ派生物とのアセンヤクノキ製剤の相乗的な相互作用
〔００２８０〕モデル−これらの実験には、実施例１１および１３に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００２８１〕試験化学物質および処理−使用した標準化学物質は、実施例１１および１３に記述のとおりとした。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、脂質合成指数を算出するため、実施例１１のとおり、分化の前に、またはアディポネクチン指数を評価するため、実施例１２の記載のとおり、ＴＮＦαで処理した。実施例１４に記載のアセンヤクノキサンプル＃５６６９を、先述のホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびイソアルファ酸とともに用いた。アセンヤクノキ、ならびに５：１と１０：１のアカシア：ＲＩＡＡおよびアカシア：ＩＡＡの組み合わせを、５０、１０、５．０、および１．０μｇ／ｍｌで試験した。ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、独立して５．０、２．５、１．２５、および０．６２５μｇ／ｍｌで試験した。
〔００２８２〕計算−アカシア／ホップの組み合わせの予想される脂質合成反応およびアディポネクチン分泌の推定、および相乗効果の測定を先述のとおり行った。
〔００２８３〕結果−試験を行ったすべての組み合わせは、試験を行った１つ以上の濃度で、脂質合成の相乗効果を呈した（表２２）。アカシア：ＲＩＡＡの組み合わせは、概して、アカシア：ＩＡＡの組み合わせよりも活性であり、アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］は、すべての用量で相乗効果を実証し、アカシア：ＲＩＡＡ［１０：１］は、１０および５．０μｇ／ｍｌで相乗性があり、試験を行ったいずれの濃度でも拮抗性はなかった。アカシア：ＩＡＡ［１０：１］の組み合わせも、２つの中用量で相乗性があり、拮抗作用は示さなかった。アカシア：ＩＡＡ［５：１］は、５０μｇ／ｍｌの濃度で相乗性があったが、５．０μｇ／ｍｌの用量では拮抗性があった。
〔００２８４〕同様に、すべての組み合わせは、試験を行った１つ以上の濃度で、アディポネクチン分泌の増加に関し、相乗効果を実証した（表２３）。アカシア：ＩＡＡ［１０：１］は、すべての用量で相乗効果を呈したが、アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］およびアカシア：ＲＩＡＡ［１０：１］は、３つの用量で相乗性があり、１つの濃度で拮抗性があった。アカシア：ＩＡＡ［５：１］の組み合わせは、１．０μｇ／ｍｌで相乗性があり、より高い１０μｇ／ｍｌでは拮抗性があった。
〔００２８５〕アセンヤクノキと、ホップ派生物Ｒｈｏイソアルファ酸またはイソアルファ酸との組み合わせは、脂肪細胞の脂質の取り込みの増加、および脂肪細胞からのアディポネクチン分泌の増加に関し、相乗的な組み合わせ、およびわずかに拮抗的な組み合わせを呈した。
実施例２５
リポ多糖／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、ホップ派生物の抗炎症活性
〔００２８６〕モデル−これらの実験には、実施例１１および１３に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪細胞モデルを用いた。
〔００２８７〕試験化学物質および処理−標準化学物質は、実施例１１および１３に記述されるものとしたが、５日目にＴＮＦαの代わりに１００ｎｇ／ｍｌの細菌性リポ多糖（LPS、Sigma,St.Louis,MO）を用いた。使用したホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびイソアルファ酸は、実施例２０に記載のとおりとした。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）アスピリン、サリチル酸、およびイブプロフェンは、Sigmaより入手した。セレコキシブ（CelebrexTM、G.D.Searle&Co.Chicago,IL）の市販のカプセル製剤を使用し、活性成分の含量に基づき、細胞に投薬した。ホップ派生物、イブプロフェンおよびセレコキシブを５．００、２．５０、１．２５、および０．６２５μｇ／ｍｌで投薬した。インドメタシン、トログリタゾン、およびピオグリタゾンは、１０、５．０、１．０、および０．５０μｇ／ｍｌで試験した。アスピリンの濃度は、１００、５０．０、２５．０、および１２．５μｇ／ｍｌであったが、サリチル酸の濃度は、２００、１００、５０．０、および２５．０μｇ／ｍｌであった。ＩＬ−６については実施例１８に、アディポネクチンについては実施例１３に先述するように、ＩＬ−６およびアディポネクチンのアッセイを行い、データを分析し、一覧にした。
〔００２８８〕結果−ＬＰＳは、５日目の脂肪細胞内のＩＬ−６の１２倍の刺激を与えた。すべての試験剤は、ＬＰＳ刺激性の脂肪細胞によるＩＬ−６分泌をさまざまな程度に減少した。ＩＬ−６の最大阻害、およびこの最大阻害が認められた濃度を表２４に表す。比較的大きな処理内分散により、ＩＬ−６の最大阻害の程度は、試験物質間で異ならなかった。しかし、最大阻害が生じた用量は、大幅に異なった。ＩＬ−６阻害の効力の順序は、イブプロフェン＞ＲＩＡＡ＝ＩＡＡ＞セレコキシブ＞ピオグリタゾン＝インドメタシン＞トログリタゾン＞アスピリン＞サリチル酸であった。定性的には、インドメタシン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、イブプロフェン、およびセレコキシブは、試験を行ったすべての濃度でＩＬ−６分泌を阻害したが、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、およびアスピリンは、最低濃度でＩＬ−６を有意に阻害しなかった（データは図示せず）。
〔００２８９〕５日目の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＬＰＳ処理では、ＤＭＳＯ対照に対し、アディポネクチン分泌を減少した（表２５）。すべての試験化合物が、分泌をある程度阻害した、ＩＬ−６阻害とは異なり、アスピリン、サリチル酸およびセレコキシブは、試験を行ったいずれの用量でも、ＬＰＳで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアディポネクチン分泌を誘発することができなかった。０．６２５μｇ／ｍｌでトログリタゾン、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、およびイブプロフェンの最大アディポネクチン刺激が、それぞれ１５、１７、２０、および２２％認められた。ピオグリタゾンは、効力順の次位で、アディポネクチン刺激は１．２５μｇ／ｍｌで１２％であった。２．５０μｇ／ｍｌで９％のアディポネクチン分泌の刺激であったインドメタシンは、最も効力が弱い活性試験物質であった。
〔００２９０〕ＬＰＳ／３Ｔ３−Ｌ１モデルにおいて、おそらく体内で得られる濃度で、ホップ派生物ＲＩＡＡおよびＩＡＡ、ならびにイブプロフェンは、ＩＬ−６分泌を減少し、アディポネクチン分泌を増加した。チアゾリジンジオン、トログリタゾン、およびピオグリタゾンは、ＩＬ−６分泌の阻害剤として、効力がより弱く、ホップ派生物よりも高い用量を必要とするが、アディポネクチン刺激に関しては、ホップ派生物に類似する。マクロファージモデルおよび脂肪細胞モデルにおける、抗炎症活性の一貫した関係は、ＮＳＡＩＤのインドメタシン、アスピリン、イブプロフェン、およびセレコキシブでは認められなかった。
実施例２６
ＴＮＦα／３Ｔ３−ｌモデルにおける、クルクミンまたはキサントフモールと組み合わせたアセンヤクノキまたはホップ派生物の相乗効果
〔００２９１〕モデル−これらの実験には、実施例１１および１３に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００２９２〕試験化学物質および処理−使用した標準化学物質は、実施例１１および１３に記述されるとおりとした。アディポネクチン指数を評価するため、実施例１３に記載のとおり、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をＴＮＦαで刺激した。実施例１４に記載のアセンヤクノキサンプル＃５６６９、実施例２０に記載のホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびキサントフモール、ならびにMetagenics（Gig Harbor,WA）により提供されたクルクミンをこれらの実験に使用した。アセンヤクノキ、ならびにアカシア：クルクミンとアカシア：キサントフモールの５：１の組み合わせを、５０、１０、５．０、および１．０μｇ／ｍｌで試験した。ＲＩＡＡ、およびクルクミンとＸＮの１：１の組み合わせを、１０、５、１．０、および０．５０μｇ／ｍｌで試験した。
〔００２９３〕計算−この組み合わせの予測されたアディポネクチン指数の推定、および相乗効果の測定を前述のとおり行った。
〔００２９４〕結果−ＴＮＦαは、アディポネクチン分泌を、溶媒のみの対照の約５０パーセントまで減少した。陽性対照のピオグリタゾンは、アディポネクチン分泌を８０パーセント増加した（表２６）。クルクミンまたはＸＮとのアカシアの組み合わせは、より高い濃度で拮抗性、より低い濃度で相乗性があることを証明した。同様に、ＲＩＡＡおよびクルクミンは、３つのより高い用量で拮抗性があったが、最低用量１．０μｇ／ｍｌでは極めて相乗性があった。２つのホップ派生物ＲＩＡＡおよびＸＮは、ＴＮＦαで刺激された３Ｔ３−Ｌ１細胞からのアディポネクチン分泌における相乗効果を実証しなかった。
〔００２９５〕ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞では、アカシアおよびＲＩＡＡの両方は、アディポネクチン分泌を相乗的に増加したが、アカシアのみがＸＮとの相乗効果を実証した。
実施例２７
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、ホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸と組み合わせた共役リノール酸による、脂質生成の体外相乗効果
〔００２９６〕モデル−これらの実験には、実施例１１および１３に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００２９７〕試験化学物質および処理−使用した標準化学物質は、実施例１１に記述されるとおりとした。脂質合成指数を算出するため、実施例１１のとおり、分化前に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処理した。粉末化ＣＬＡはLipid Nutrition(Channahon,IL)より入手し、ｃ９ｔ１１およびｔ１０ｃ１２異性体の１：１の混合物として記載した。ＣＬＡ、およびＣＬＡ：ＲＩＡＡの５：１の組み合わせを５０、１０、５．０、および１．０μｇ／ｍｌで試験した。ＲＩＡＡは、先述のとおり、予測される脂質合成指数を計算するため、１０、１．０、および０．１μｇ／ｍｌで試験した。
〔００２９８〕結果−ＲＩＡＡは、ＣＬＡとの組み合わせで、トリグリセリド含量を相乗的に増加した。相乗効果はすべての用量で認められた（表２７）。
〔００２９９〕ＣＬＡとＲＩＡＡとの間の相乗効果は、幅広い範囲の用量で認められ、ＣＬＡのインスリン感作効力を増加するために、潜在的に使用され得る。
実施例２８
ホップ植物化学物質は、ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＮＦ−ｋＢ活性化を阻害する
〔００３００〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００３０１〕細胞培養および処理−分化後、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を分化後培地でさらに４０日間維持した。標準化学物質、培地、およびホップ化合物ＲＩＡＡならびにキサントフモールは、実施例１３および２０に記載のとおりとした。ホップ派生物および陽性対照ピオグリタゾンは、２．５、および５．０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。試験物質をＴＮＦαによる処理の１時間前に添加し、ＴＮＦαによる処理の３時間、および２４時間後、核抽出物を調製した。
〔００３０２〕ＥＬＩＳＡ−分化後、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を増殖培地で４０日間維持した。Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（Carlsbad,CA）のＴｒａｎｓＡＭＴＭ ＮＦ−ｋＢキットを修正を行わずに用いて、核ＮＦ−ｋＢｐ６５を測定した。キットに提供されるＪｕｒｋａｔ核抽出物は、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（ホルボール、１２−ミリスチン酸塩、１３アセテート）、および０．５μＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を３７℃で２時間補充した培地で培養した細胞から得られた。
〔００３０３〕タンパク質アッセイ−Active Motif Fluorescent Protein Quantification Kitを用いて、核タンパク質を定量化した。
〔００３０４〕統計的分析−片側スチューデントｔ検定を用いて、比較を行った。第１種の過誤の確率は、わずか５パーセントのレベルに設定した。
〔００３０５〕結果−ＴＰＡで処理されたＪｕｒｋａｔ核抽出物は、ＮＦ−ｋＢｐ６５の予測された増加を呈し、キット試薬の十分な性能を示す（図２２）。３時間（図２２Ａ）または２４時間（図２２Ｂ）のＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌによるＤ４０ ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の処理では、それぞれ核ＮＦ−ｋＢｐ６５を２．１倍および２．２倍増加した。予測どおり、ＰＰＡＲγアゴニストピオグリタゾンは、ＴＮＦα処理の３時間または２４時間のいずれにおいても、核ＮＦ−ｋＢｐ６５の量を阻害しなかった。ＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座は、ＴＮＦαの３時間にＲＩＡＡ５．０および２．５μｇ／ｍｌで、それぞれ９．４および２５％阻害された。２４時間の時点で、ＲＩＡＡ５．０μｇ／ｍｌの処理のみがＮＦ−ｋＢｐ６５核転座の有意な（ｐ＜０．０５）阻害を呈した。キサントフモールは、５．０および２．５μｇ／ｍｌで、ＴＮＦα処理の３時間後に１５．６および６．９％、２４時間後に１３．４および８．０％のＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座を阻害した。
〔００３０６〕ＲＩＡＡおよびキサントフモールの両方は、ＴＮＦαで処理した、成熟したインスリン抵抗性脂肪細胞において、ＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座の小規模だが一貫した阻害を実証した。この結果は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座を阻害すると示されていない、ＰＰＡＲγアゴニストについての記載とは異なる。
実施例２９
アセンヤクノキ抽出物およびメトホルミンは、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でのトリグリセリドの取り組みを、相乗的に増加する
〔００３０７〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。使用したすべての化学物質および手順は、実施例１１に記載のとおりとした。
〔００３０８〕試験化学物質および処理−メトホルミンはSigma(St.Louis,MO)より入手した。分化の０日目と、成熟期（６／７日目）中は２日毎に、ジメチルスルホキシドに試験物質を添加した。陽性対照として、トログリタゾンを添加し、最終濃度の４．４μｇ／ｍｌを達成した。メトホルミン、アセンヤクノキサンプル＃５６６９およびメトホルミン／アカシアの１：１（ｗ／ｗ）の組み合わせを、試験物質５０μｇ／ｍｌで試験した。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、０．２％オイルレッドＯで染色した。結果として得られた染色オイルの液滴をイソプロパノールで分解し、５３０ｎｍで分光光度分析により定量化した。結果は、溶媒対照内の十分に分化した細胞の相対的なトリグリセリド含量として表した。
〔００３０９〕計算−メトホルミン／アセンヤクノキ抽出物の予測される脂質生成効果の推定を、以下の関係を用いて行った：ＬＩ＝脂質合成指数、ＸおよびＹが、試験混合物のそれぞれの成分の相対的分画であり、Ｘ＋Ｙ＝１である場合、１／ＬＩ＝Ｘ／ＬＩｘ＋Ｙ／ＬＩｙ。推定されるＬＩの平均が、対応する認められた分画の推定値の９５％信頼区間から外れた場合、相乗効果を推測した。その成分のそれぞれとの組み合わせの効果の比較を伴う、相乗効果のこの定義は、Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ［Berenbaum, M. C. What is synergy? Pharmacol Rev 41 (2), 93-141,(1989)］により説明された。
〔００３１０〕結果−アセンヤクノキ抽出物は、高度に脂質合成を行うものであり、３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド含量を３２パーセント増加し（図２３）、１．３２の脂質合成指数をもたらす。０．７９の脂質合成指数では、メトホルミン単独では脂質合成を行わなかった。メトホルミン／アセンヤクノキ抽出物の組み合わせは、観察された１．３５の脂質合成指数を実証した。９８の予測された脂質合成指数では、観察された脂質合成指数は、予測された値に対し、９５％上方信頼限界から２パーセント外れたが、メトホルミン／アセンヤクノキ抽出物は、相乗効果を実証した。
〔００３１１〕３Ｔ３−Ｌ１細胞で実証された、脂質合成の可能性に基づき、メトホルミンとアセンヤクノキ抽出物の１：１の組み合わせは、臨床用途において相乗的に作用すると予測されるであろう。かかる組み合わせは、血漿トリグリセリドの減少、またはメトホルミン有効性の期間の拡張等、メトホルミン治療の好ましい利点の範囲を広げるために有用であろう。
実施例３０
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、ホップ派生物および
チアゾリジンジオンによる脂質生成の体外相乗効果
〔００３１２〕モデル−これらの実験には、実施例１１および１３に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。
〔００３１３〕試験化学物質および処理−使用した標準化学物質は、実施例１１に記載のとおりとした。脂質合成指数を算出するため、実施例１１のとおり、分化の前に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処理した。トログリタゾンは、Cayman Chemicals(Chicago,IL)より入手した。ピオグリタゾンは、市販の錠剤化した製剤（ＡＣＴＯＳＥ（ｒ）、Takeda Pharmaceuticals,Lincolnshire,IL）として入手した。この錠剤を粉砕し、すべての粉末をアッセイに使用した。すべての結果は、活性成分含量に基づき算出した。使用したホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびイソアルファ酸は、実施例２０に記載のとおりとした。ＲＩＡＡおよびＩＡＡと組み合わせたトログリタゾンは、４．０μｇ／ｍｌで試験したが、より強力なピオグリタゾンは、２．５μｇ／ｍｌで、ＲＩＡＡおよびＩＡＡとの１：１の組み合わせで試験した。すべての物質も、実施例３４に記載のとおり、予測される脂質合成指数を計算するため、４．０および２．５μｇ／ｍｌで独立して試験した。
〔００３１４〕結果−それぞれ４．０および２．５μｇ／ｍｌで、トログリタゾンまたはピオグリタゾンで試験した場合、Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびイソアルファ酸の両方は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて、チアゾリジンジオンと相乗的に、トリグリセリド合成を増加した（表２８）。
〔００３１５〕ホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびイソアルファ酸は、チアゾリジンジオンのインスリン感作効果を相乗的に増加し、減量、または好ましく反応する患者数の増加という、潜在的な臨床的利点をもたらし得る。
実施例３１
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける、Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびメトホルミンの体外相乗効果
〔００３１６〕モデル−これらの実験には、実施例１１に記載の３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞モデルを用いた。使用した標準化学物質、およびＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌによる脂肪細胞の処理は、それぞれ実施例１１および１３に記述されるとおりとした。
〔００３１７〕試験物質および細胞処理−メトホルミンはSigma(St.Louis,MO)より入手し、Ｒｈｏ−イソアルファ酸は実施例２０に記載のとおりとした。ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌと合わせて、ＲＩＡＡ１μｇ／ｍｌを含まない、または含むメトホルミンを、５日目の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に、５０、１０、５．０、または１．０μｇ／ｍｌ添加した。実施例１１に記載のとおり、６日目にＩＬ−６について培養上清培地のアッセイを行った。ＩＬ−６阻害に対する、メトホルミン：ＲＩＡＡの混合物の予測される効果の推定を先述のとおり行った。
〔００３１８〕結果−ＴＮＦαは、５日目の脂肪細胞で、ＩＬ−６分泌の６倍の増加をもたらした。１μｇ／ｍｌでトログリタゾンは、対照に対し、ＩＬ−６分泌を３４パーセント阻害したが、ＲＩＡＡ１μｇは、対照に対し、ＩＬ−６分泌を２４パーセント阻害した（表２９）。ＲＩＡＡ１μｇ／ｍｌと組み合わせたメトホルミンは、５０μｇ／ｍｌの濃度で相乗効果を、１μｇ／ｍｌの濃度で強い相乗効果を実証した。メトホルミン５０μｇ／ｍｌでは、１μｇのＲＩＡＡは、混合物において、さらに１０パーセントの阻害をもたらしたが、１μｇのメトホルミンでは、１μｇのＲＩＡＡはＩＬ−６阻害を３５パーセント増加した。２つの中用量で、メトホルミン：ＲＩＡＡの組み合わせの拮抗作用および効果なしであることがわかった。
〔００３１９〕メトホルミンおよびＲｈｏ−イソアルファ酸の組み合わせは、高および低濃度の両方で相乗的に機能し、ＴＮＦαで処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのＩＬ−６分泌を減少する。
実施例３２
体外での癌細胞増殖への試験化合物の効果
〔００３２０〕この実験は、本発明の多くの試験化合物における、体外での癌細胞増殖への直接的な阻害効果を実証する。
〔００３２１〕方法−本発明の試験化合物の癌細胞増殖への阻害効果を、ＲＬ ９５−２子宮内膜癌細胞モデル（ＡＫＴキナーゼのオーバーエクスプレッサー（ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ））、ならびにＨＴ−２９（構成的にＣＯＸ−２を発現）およびＳＷ４８０（構成的に活性化したＡＫＴキナーゼを発現）結腸癌細胞モデルで検査した。簡潔に、標的細胞を９６ウェル組織培養プレートにプレートし、サブコンフルエンスまで増殖させた。次いで、細胞を実施例４に記載のとおり、種々の量の試験化合物で７２時間処理し、相対的な細胞増殖をＣｙＱｕａｎｔ（Invitrogen,Carlsbad,CA）商業用蛍光アッセイで測定した。
〔００３２２〕結果−ＲＬ９５−２細胞を、１０μｇ／ｍｌのＭｇＤＨＩＡＡ（ｍｇＲｈｏ）、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＴＨ−ＨＨＩＡＡ（ＴＨＩＡＡおよびＨＨＩＡＡの１：１の混合物）、Ｘｎ（キサントフモール）、ＬＹ（ＬＹ２４９００２、ＰＩ３Ｋ阻害剤）、ＥｔＯＨ（エタノール）、アルファ（アルファ酸混合物）、およびベータ（ベータ酸混合物）で７２時間処理した。細胞増殖への相対的な阻害図２４に表す。ＤＭＳＯ溶媒対照に対し、キサントフモールでは５０％を上回る阻害を示す。図２５および２６は、ＨＴ−２９およびＳＷ４８０癌細胞への、種々の濃度のＲＩＡＡまたはＴＨＩＡＡの用量反応結果をそれぞれ表示する。ＲＩＡＡおよびＴＨＩＡＡの５０％阻害濃度は、ＨＴ−２９細胞株で３１および１０μＭ、ＳＷ４８０細胞株で３８および３．２μＭであった。
実施例３３
ＫＫ−Ａｙマウス糖尿病モデルにおける、アラビアゴムモドキおよびホップ派生物の体内血糖降下作用
〔００３２３〕モデル−平均４０±５ｇの雄の９週齢のＫＫ−Ａｙ／Ｔａマウスを用いて、空腹時の血清グルコースまたはインスリン濃度を低減する試験物質の可能性を評価した。このマウス株は、１９４０年代に糖尿病のモデルとして開発されたＫＫ株と、Ａｙ／ａ遺伝子型とのハイブリダイゼーションの結果によるものである。認められた表現型は、未だ十分に特徴づけがなされていないが、少なくとも４つの量的形質遺伝子座が同定されている、多遺伝子変異の結果によるものである。これらのうちの１つは、レプチン受容体のミスセンス変異にリンクしている。この変異にもかかわらず、受容体は完全に効率的ではない可能性もあるが、依然として機能的である。ＫＫ株は、明白な高血糖ではないが、インスリンおよびグルコース耐性への感受性に関連する、糖尿病を発症する。Ａｙ変異体の導入により、肥満および高血糖を誘発する。Ａｙ変異体は、アグーチルーカス（ａｇｏｕｔｉ ｌｏｃｕｓ）への５’に位置するＲａｌｙ遺伝子の１７０ｋｂの欠失であり、アグーチをＲａｌｙプロモーターの制御下に置く。ホモ接合体動物は、インプランテーション前に死亡する。
〔００３２４〕試験物質−実施例１４に記載のアラビアゴムモドキサンプル＃５６５９、ならびに実施例２０に記載のホップ派生物Ｒｈｏ−イソアルファ酸、イソアルファ酸、およびキサントフモールを用いた。アラビアゴムモドキ、ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与したが、ＸＮは２０ｍｇ／ｋｇで投薬した。さらに、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、およびＸＮとのアラビアゴムモドキの５：１および１０：１の組み合わせを処方し、１００ｍｇ／ｋｇ／日で投薬した。
〔００３２５〕試験手順−検体を０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０でチューブによって、１群当たり５匹の動物に毎日投与した。最初の投薬前と、３回目および最終投薬の９０分後に、血清を後眼窩洞（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から採取した。非空腹時血清グルコースをムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法により酵素的に測定し、血清インスリンをマウス特有のＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）により測定した。
〔００３２６〕データ分析−検体が、対照に対し、血清グルコースまたはインスリンのいずれかを減少するかどうかを評価するため、最初に投薬後のグルコースおよびインスリン値を、それぞれのマウスの前処理の割合として、投薬前の濃度に対し、正常化した。前処理の割合の臨界値（対照マウスに対する片側、下方９５％信頼区間）を、グルコースおよびインスリン変数の両方について算出した。試験物質における前処理のそれぞれの割合の値を、対照の臨界値と比較した。対照に対して臨界値未満であった、試験物質におけるこれらの前処理の割合の値は、対照と有意に異なる（ｐ＜０．０５）と想定された。
〔００３２７〕結果−３日間の処理期間中、対照マウスで、非空腹時の血清グルコースは、２．６％上昇したが、血清インスリンは６．７％減少した。ロシグリタゾン、アラビアゴムモドキ、ＸＮ：アカシア［１：５］、ＸＮ：アカシア［１：１０］、アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］、キサントフモール、アカシア：ＩＡＡ［５：１］、異性化アルファ酸、およびＲｈｏ−イソアルファ酸は、すべて血清インスリンに影響を及ぼすことなく、対照に対して、非空腹時血清グルコースを減少した。アカシア：ＲＩＡＡ［１０：１］およびアカシア：ＩＡＡ［１０：１］は、血清グルコースまたはインスリンのいずれに対しても効果はなかった（表３０）。
〔００３２８〕ＩＩ型糖尿病のＫＫ−Ａｙマウスモデルにおける、アラビアゴムモドキサンプル＃５６５９、キサントフモール、異性化アルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、およびそれらの種々の組み合わせの急速な血糖低下作用は、高血糖に関連するヒト疾患の治療において、臨床的有効性の可能性を支持する。
実施例３４
糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、アラビアゴムモドキおよびホップ派生物の
体内相乗効果
〔００３２９〕モデル−雄のＣ５７ＢＬＫＳ／Ｊｍ＋／ｍ＋Ｌｅｐｒｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）マウスを使用して、空腹時血清グルコースまたはインスリン濃度を低減するための試験物質の可能性を評価した。この株のマウスは、機能するレプチン受容体がないために、レプチンに耐性がある。血漿インスリンの上昇は１０から１４日で、血糖の上昇は４から８週で開始した。試験時、（９週）動物は、著しく肥満（５０±５ｇ）であり、膵島肥大の兆候を呈していた。
〔００３３０〕試験物質−陽性対照のメトホルミンおよびロシグリタゾンを各連続３日間、３００ｍｇ／ｋｇ／日および１．０ｍｇ／ｋｇ／日でそれぞれ投薬した。アラビアゴムモドキ サンプル＃５６５９、ホップ派生物、およびそれらの組み合わせを先述のとおり投薬した。
〔００３３１〕試験手順−検体を０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０でチューブによって、毎日投与した。最初の投薬前と、３回目および最終投薬の９０分後に、血清を後眼窩洞（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から採取した。非空腹時血清グルコースをムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法により酵素的に測定し、血清インスリンをマウス特有のＥＬＩＳＡにより測定した。
〔００３３２〕結果−陽性対照のメトホルミンおよびロシグリタゾンは、対照に対し、血清グルコースおよびインスリン濃度の両方を減少した（表３１）。ＲＩＡＡおよびＸＮだけは、単一の試験物質として許容範囲の結果を実証した。ＲＩＡＡは、血清インスリンを低減したが、ＸＮは、インスリンへ影響を及ぼすことなく、血清グルコースの低減をもたらした。アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］は、試験を行ったもののうち、血清インスリン濃度を低減するには最も有効な薬剤であり、ビグアニドメトホルミンによるインスリン濃度の１７パーセントの低減、およびチアゾリジンジオンロシグリタゾンによる１５パーセントの減少に対し、血清インスリン値の２１パーセントの低減をもたらした。このアカシア：ＲＩＡＡ［５：１］の組み合わせの反応は、いずれの個々の成分の反応も上回り、相乗効果の可能性を呈した。アラビアゴムモドキ単独では、血清グルコースまたはインスリンのいずれかを低減することができなかったが、ＲＩＡＡは、メトホルミンと同様の程度に血清インスリンを低減した。残りの試験物質のうち、アカシア：ＩＡＡ［１０：１］の組み合わせも血清インスリン濃度の低減に効果的であった。
〔００３３３〕ＩＩ型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、Ｒｈｏ−イソアルファ酸の影響を受けた血清インスリンの急速な低減、およびキサントフモールによる血清グルコースの低減は、インスリン不感受性および高血糖に関連するヒト疾患の治療での、臨床的有効性の可能性を支持する。さらに、Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびアセンヤクノキの５：１の組み合わせは、ｄｂ／ｄｂマウス糖尿病モデルで相乗効果を示した。糖尿病の２匹の独立した動物モデル、および３つの対外モデルにおける、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、キサントフモール、およびアカシア：ＲＩＡＡ［５：１］製剤が呈した有効反応は、血清グルコースの低減、またはインスリン感受性の向上を必要とする、臨床的状況での潜在的な有用性を支持する。
実施例３５
糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、アラビアゴムモドキおよびホップ派生物の割合の体内最適化
〔００３３４〕モデル−雄のＣ５７ＢＬＫＳ／Ｊｍ＋／ｍ＋Ｌｅｐｒｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）マウスを使用して、空腹時血清グルコースまたはインスリン濃度を低減するための試験物質の可能性を評価した。この株のマウスは、機能するレプチン受容体がないために、レプチンに耐性がある。血漿インスリンの上昇は１０から１４日で、血糖の上昇は４から８週で開始した。試験時、（９週）動物は、著しく肥満（５０±５ｇ）であり、膵島肥大の兆候を呈していた。
〔００３３５〕試験物質−陽性対照のメトホルミンおよびロシグリタゾンを各連続５日間、３００ｍｇ／ｋｇ／日および１．０ｍｇ／ｋｇ／日でそれぞれ投薬した。１：９９、１：５、１：２、１：１、２：１、および５：１の割合のホップ派生物ＲＩＡＡ、およびアラビアゴムモドキサンプル＃５６５９を１００ｍｇ／ｋｇで投薬した。
〔００３３６〕 試験手順−検体を０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０でチューブによって、毎日投与した。最初の投薬前と、５回目および最終投薬の９０分後に、血清を後眼窩洞（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から採取した。非空腹時血清グルコースをムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法により酵素的に測定し、血清インスリンをマウス特有のＥＬＩＳＡにより測定した。
〔００３３７〕結果−陽性対照のメトホルミンおよびロシグリタゾンは、対照に対し、血清グルコースおよびインスリン濃度の両方を減少した（ｐ＜０．０５、結果は図示せず）。個別に、５日間１００ｍｇ／ｋｇのＲＩＡＡおよびアカシアは、対照に対し、血清グルコースをそれぞれ７．４および７．６パーセント低減した（ｐ＜０．０５）。ＲＩＡＡおよびアカシアの１：９９、１：５、または１：１の組み合わせは、拮抗性を示したが、２：１および５：１の割合のＲＩＡＡ：アカシアは、対照に対し、血清グルコースをそれぞれ１１および２２パーセント減少した。この反応は、ＲＩＡＡまたはアカシアのいずれかの単独を上回り、２つの成分間で相乗効果を暗示する。同様の効果は、血清インスリン濃度の減少とともに見られた（図２７）。
〔００３３８〕メトホルミンおよびロシグリタゾン（２つの製薬は現在、糖尿病の治療に使用されている）に対し、Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびアカシアの５：１の組み合わせをさらにこのモデルで試験した。結果（図２８）は、Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびアカシアの５：１の組み合わせは、血清グルコース（パネルＡ）および血清インスリン（パネルＢ）を低減する点で、この医薬品に適合する結果をもたらしたことを示す。
〔００３３９〕Ｒｈｏ−イソアルファ酸およびアカシアの２：１および５：１の組み合わせは、ｄｂ／ｄｂマウス糖尿病モデルにおいて相乗効果を示し、これは、血清グルコースの低減、またはインスリン感受性の向上を必要とする、臨床的状況での潜在的な有用性を支持する。
実施例３６
コラーゲン誘発性関節リウマチマウスモデルにおける、ホップ試験化合物の効果
〔００３４０〕本実施例は、関節リウマチモデルにおいて、炎症および関節炎の症候を低減する上での２つのホップ化合物、Ｍｇ ＲｈｏおよびＴＨＩＡＡの有効性を実証するものであり、かかる炎症および症状は、多くのタンパク質キナーゼにより、一部媒介されることが知られている。
〔００３４１〕モデル−雌のＤＢＡ／Ｊマウス（１０匹／群）を標準状態の明るさおよび暗さの下で飼育し、制約なしで食餌させた。１００μｇのＩＩ型コラーゲンと、スクアレン中１００μｇの結核菌とを含んだ混合物を、０日目にマウスに皮内注射した。２１日目のブースター注射を繰り返した。無応答のマウスを本研究から除外して、関節炎の兆候について、２２〜２７日目にマウスを検査した。マウスをチューブにより試験化合物で、１４日間（２８日目に開始し、４２日目に終了）毎日処理した。本実施例で使用した試験化合物は、ＲＩＡＡ（ＭｇＲｈｏ）が１０ｍｇ／ｋｇ（低）、５０ｍｇ／ｋｇ（中）、または２５０ｍｇ／ｋｇ（高）；ＴＨＩＡＡが１０ｍｇ／ｋｇ（低）、５０ｍｇ／ｋｇ（中）、または２５０ｍｇ／ｋｇ（高）；セレコキシブが２０ｍｇ／ｋｇ；およびプレドニジロンが１０ｍｇ／ｋｇであった。
〔００３４２〕関節炎の症候（スコア０〜４）を、以下に記載の関節炎指数を用いて、それぞれの足について評価した。この関節炎指数では、０＝視覚的兆候なし；１＝浮腫および／または紅斑：単一の指；２＝浮腫および／または紅斑： ２つの関節；３＝浮腫および／または紅斑：３つ以上の関節；ならびに４＝関節強直および変形に関連する、足全体および指の重度の関節炎。
〔００３４３〕組織学的検査−実験終了時に、マウスを安楽死させ、１つの肢を取り、緩衝ホルマリンに保存した。関節炎指数が有望であることが明らかとなった分析後、Ｈ＆Ｅ染色による組織学的分析のため、２匹の動物をそれぞれの処理群から無作為に選択した。軟組織、関節および骨の変化を、重度の損傷を示す４スコアの４段階評価で監視した。
〔００３４４〕サイトカイン分析−サイトカイン分析のため、実験終了時にマウスから血清を採取した。サンプル容量が低い（約０．２〜０．３ｍｌ／マウス）ため、１０匹のマウスからのサンプルを、それぞれ５匹の動物の２つのプールに無作為に割り当てた。これは分析を繰り返すことができるように行われ、それぞれの分析は最低２回行われた。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６は、マウス特有の試薬（R&D Systems,Minneapolis,MN）を用いて、製造業者の指示に従い分析した。２６のプールのうち５つのみが検出可能なレベルのＴＮＦ−αをもたらし、その中には媒体で処理した対照動物群もいた。
〔００３４５〕結果−関節炎指数へのＲＩＡＡの効果を図２９に図示する。有意な低減（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）は、プレドニゾロンが１０ｍｇ／ｋｇ（３０〜４２日目）で、セレコキシブが２０ｍｇ／ｋｇ（３２〜４２日目）で、ＲＩＡＡが２５０ｍｇ／ｋｇ（３４〜４２日目）で、ＲＩＡＡが５０ｍｇ／ｋｇ（３８〜４０日目）で認められ、ＲＩＡＡでは５０または２５０ｍｇ／ｋｇで抗関節炎有効性を実証した。図３０は、関節炎指数へのＴＨＩＡＡの効果を示す。ここでは、有意な低減は、セレコキシブ（３２〜４２日目）、ＴＨＩＡＡが２５０ｍｇ／ｋｇ（３４〜４２日目）で、ＴＨＩＡＡが５０ｍｇ／ｋｇ（３４〜４０日目）で認められ、抗関節炎剤としてのＴＨＩＡＡの有効性も実証された。
〔００３４６〕関節組織損傷の組織学的検査からの結果を図３１に示す。これは、ＴＨＩＡＡで処理した個体における関節破壊の非存在またはわずかな兆候を示す。用量反応の明らかな兆候があり、２５０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇでの組織学スコアの低減はそれぞれ４０％および２８％である。これは、関節破壊のスコアが軽度であった、セレコキシブ処理群に引けを取らない。セレコキシブ（２０ｍｇ／ｋｇ）の場合、組織学スコアは、実際３３％増加したことに留意されたい。個々の動物間で明らかな相違があり、例えば、媒体で処理した動物のうちの１つは、中程度の関節破壊の兆候を示したが、他は損傷が外見上なかった。プレドニゾロン処理群の１匹の動物を除き、滑膜炎がすべての処理群に存在した。
〔００３４７〕ＩＬ−６のサイトカイン分析の結果を図３２に要約する。プレドニゾロンのみが統計的有意性に達したが、セレコキシブを除き、すべての処理に対する高用量のＲｈｏは、血清ＩＬ−６レベルを低減した。
実施例３７
ヒトにおけるメタボリック症候群へのＲＩＡＡ：アカシア（１：５）の効果
〔００３４８〕本実験では、メタボリック症候群を罹患するボランティア患者における、多くの臨床的に関連性があるマーカーへのＲＩＡＡ：アカシア（１：５）製剤による処理の効果を検査した。
〔００３４９〕方法および試験デザイン−本試験は、単一の研究場所（Functional Medicine Research Center,Gig Harbor,WA）で実施された、無作為化した二重盲検プラセボ対照試験であった。本研究の試験対象基準では、対象（１８から７０歳）は以下を満たすことを要件とした： （ｉ）ＢＭＩが２５から４２．５ｋｇ／ｍ２、（ｉｉ）ＴＧ／ＨＤＬ−Ｃ率が≧３．５、（ｉｉｉ）空腹時インスリンが≧１０ｍｃＩＵ／ｍｌ。さらに対象は、以下の５つの基準の３つを満たさなければならなかった：（ｉ）ウエスト周辺が＞３５インチ（女性）および＞４０インチ（男性）、（ｉｉ）ＴＧが≧１５０ｍｇ／ｄＬ、（ｉｉｉ）ＨＤＬが＜５０ｍｇ／ｄＬ（女性）、および＜４０ｍｇ／ｄＬ（男性）、（ｉｖ）血圧が≧１３０／８５、または高血圧と診断され薬物治療中、ならびに（ｖ）空腹時グルコースが≧１００ｍｇ／ｄＬ。
〔００３５０〕試験対象基準を満たした対象を、４つの治療群： （ｉ）１錠のＲＩＡＡ／アカシアの組み合わせ（１錠当たりＲＩＡＡ１００ｍｇおよびアラビアゴムモドキ心材抽出物５００ｍｇを含む）を１日３回服用する対象、（ｉｉ）２錠のＲＩＡＡ／アカシアの組み合わせを１日３回服用する対象、（ｉｉｉ）１錠のプラセボを１日３回、および（ｉｖ）２錠のプラセボを１日３回、の１つに無作為化した。試験の継続時間は１２週であった。１日目、８週目および１２週目に対象から血液を採取し、メタボリック症候群の種々のパラメータにおける補充の効果を評価した。
〔００３５１〕結果−本試験に志願した対象の初期の人口統計学的および生化学的特長（プールしたプラセボ群およびＲＩＡＡ／アカシアを１日３錠服用した対象）を表３２に示す。初期の空腹時血液グルコースおよび食後２時間の（２ｈ ｐｐ）のグルコース値は、ＲＩＡＡ／アカシアとプラセボ群（それぞれ９９．０ｖｓ．９６．５ｍｇ／ｄＬおよび１２８．４ｖｓ．１０９．２ｍｇ／ｄＬ）との間では類似していた。さらに、両方のグルコース値は概して、実験室での参照範囲（空腹時血液グルコースで４０〜１１０ｍｇ／ｄＬ、および２ｈ ｐｐグルコースで７０〜１５０ｍｇ／ｄＬ）内であった。２ｈ ｐｐインスリン反応の変動は、後期のメタボリック症候群および明らかな糖尿病に見られる、グルコースおよび空腹時インスリンの上昇に先行することから、このことは予測されたことであった。
〔００３５２〕空腹時血中インスリン測定値は類似しており、概して参照範囲内であり、初期値はＲＩＡＡ／アカシア群で１７．５ｍｃＩＵ／ｍｌ、ならびにプラセボ群で１３．２ｍｃＩＵ／ｍｌ（参照範囲３〜３０ｍｃＩＵ／ｍｌ）であった。２ｈ ｐｐインスリン値は参照範囲（９９．３ｖｓ．８０．２ｍｃＩＵ／ｍｌ）を超えて上昇し、空腹時インスリンまたはグルコース測定値を上回る可変性を示した。初期値は類似していたが、ＲＩＡＡ／アカシア群は、空腹時インスリンおよび２ｈ ｐｐインスリン、ならびにプロトコルの８週間後の２ｈ ｐｐ血液グルコースのより大きな減少を示した（図３３および３４）。
〔００３５３〕恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）スコアは、インスリン抵抗性の公開された測定基準である。すべての対象のＨＯＭＡスコアの変化を図３５に示す。メタボリック症候群の対象のインスリンおよびグルコース値に見られた可変性により、空腹時インスリンが＞１５ｍｃＩＵ／ｍｌのそれらの対象のみの部分群も評価した。この部分群のＨＯＭＡスコアを表３３に示す。これは、プラセボ群と比較し、ＲＩＡＡ／アカシア群で有意な減少が認められたことを示す。
〔００３５４〕群間の相違は、８週目で有意であった（ｐ＜０．０５）。ＨＯＭＡスコアは、公開された方法［（インスリン（ｍｃＩＵ／ｍｌ）＊グルコース（ｍｇ／ｄＬ））／４０５］により、空腹時インスリンおよびグルコースから計算した。
〔００３５５〕トリグリセリド（ＴＧ）の上昇もメタボリック症候群の重要な示唆的指標である。表３４および図３６は、ＲＩＡＡ／アカシア補充が、プラセボと比較して、８週間後のＴＧの有意な減少をもたらした（ｐ＜０．０５）ことを示す。ＴＧ／ＨＤＬ−Ｃ率もＲＩＡＡ／アカシア群で大幅に減少した（６．４０から５．２８）ことを示したが、プラセボ群では減少は認められなかった（５．８１から５．９２）。
〔００３５６〕メタボリック症候群の対象に、８週間の間、１日３錠のｒｈｏ−イソ−アルファ酸１００ｍｇおよびアラビアゴムモドキ心材抽出物５００ｍｇからなる配合錠で補充すると、プラセボと比較して、２ｈ ｐｐインスリン値のより大きな低減をもたらした。さらに、プラセボを摂取した対象に対し、空腹時インスリン、空腹時および２ｈ ｐｐグルコース、空腹時トリグリセリド、ならびにＨＯＭＡスコアのより大きな減少が、ＲＩＡＡ／アカシアサプリメント（１日３錠）を摂取した対象で認められた。これらの結果は、メタボリック症候群を罹患する対象において、ＲＩＡＡ／アカシア補充が、インスリン恒常性の維持に有用である可能性があることを示す。
実施例３８
体外の癌細胞増殖への試験化合物の効果
〔００３５７〕本実験では、本発明の多くの試験化合物に関する、体外の癌細胞増殖への直接的な阻害効果を実証する。
〔００３５８〕方法−結腸直腸癌細胞株ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２、およびＳＷ４８０を、３×１０３の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、終夜インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。それぞれの濃度の試験物質を８回複製した。７２時間後、CyQUANT(r) Cell Proliferation Assay Kitを使用して、生存細胞の合計について細胞のアッセイを行った。ＤＭＳＯ溶媒対照に対する、生存細胞の減少率を算出した。グラフ化した値は、８つの観察値±９５％信頼区間の平均である。
〔００３５９〕結果−図３７〜４１は、ＲＩＡＡ（図３７）、ＩＡＡ（図３８）、ＴＨＩＡＡ（図３９）、ＨＨＩＡＡ（図４０）、およびキサントフモール（ＸＮ；図４１）の阻害効果を図示する。
実施例３９
体外の癌細胞増殖へのセレコキシブおよび試験化合物の効果
〔００３６０〕本実験では、セレコキシブと組み合わせたＲＩＡＡまたはＴＨＩＡＡの、体外の癌細胞増殖への予測された阻害効果に対し、観察された阻害効果を比較する。
〔００３６１〕方法−結腸直腸癌細胞株を、３×１０３の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、終夜インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。それぞれの濃度の試験物質を８回複製した。７２時間後、CyQUANT(r) Cell Proliferation Assay Kitを使用して、生存細胞の合計について細胞のアッセイを行った。ＤＭＳＯ溶媒対照に対する、生存細胞の観察された減少率を算出した。セレコキシブ、およびＲＩＡＡまたはＴＨＩＡＡの組み合わせの予測される細胞毒性効果の推定を、関係：Ｔ＝阻害された増殖または死滅した細胞の分画として表される細胞毒性、ＸおよびＹは、試験混合物内のぞれぞれの成分の相対的分画、ならびにＸ＋Ｙ＝１である場合、１／［Ｔ］ｃ＝Ｘ／［Ｔ］ｘ＋Ｙ／［Ｔ］ｙを用いて行った。グラフ化した観察された値は、８つの観察値±９５％信頼区間の平均である。推定された減少率が、対応する観察された分画の９５％信頼区間を下回った場合、相乗効果が推測された。
〔００３６２〕図４２および４３は、癌細胞増殖へのＲＩＡＡ（図４２）またはＴＨＩＡＡ（図４３）の観察された阻害効果と予測された阻害効果との比較を図示する。これらの結果は、セレコキシブと組み合わせた被験化合物が、ほとんどの例で数学的に予想されたものを上回る程度に癌細胞増殖を阻害したことを示す。
実施例４０
経口投薬後の血清内ＴＨＩＡＡの検出
〔００３６３〕本実験の目的は、経口投薬後、ＴＨＩＡＡが代謝され、検出可能であるかどうかを判断することである。
〔００３６４〕方法−服用前の血液を採取した後、遊離酸（ＰＲ Ｔｅｔｒａ Ｓｔａｎｄａｌｏｎｅ Ｓｏｆｔｇｅｌ． ＯＧ＃ ２２１０ ＫＰ−２４７．Ｌｏｔ Ｃ４２３３１１１１）として９４０ｍｇのＴＨＩＡＡを送達する５つのソフトゲル（ＴＨＩＡＡ１８８ｍｇ／ソフトゲル）を摂取し、直ちに容器１個のフルーツヨーグルトを摂取した。カフェイン抜きのコーヒー以外、ＴＨＩＡＡ摂取後４時間は、追加の食料を摂取しなかった。４５分間隔で、サンプルを凝固促進剤を用いずにＣｏｒｖａｃ Ｓｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ管に採取した。サンプルを室温で４５分間凝固させ、血清を４℃で１０分間、１８００ｘｇの遠心分離により分離した。０．３ｍｌの血清を添加するため、０．５％ＨＯＡｃを含んだ０．９ｍｌのＭｅＣＮを添加し、−２０℃で４５〜９０分間維持した。混合物を１５０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、２つの相が明らかとなり、ＨＰＬＣ分析のために上相をサンプリングした。スパイクサンプルを用いて回収を測定したが、９５％を上回っていた。
〔００３６５〕結果−結果を図４４〜４６に図示する。図４４は、９４０ｍｇのＴＨＩＡＡを摂取した後の経時的な血清内のＴＨＩＡＡの検出を図で表示する。図４５は、摂取の２２５分後、体外試験を行ったＴＨＩＡＡレベルのものに匹敵するレベルで、ＴＨＩＡＡが血清内に検出されたことを実証する。図４６は、ＣＹＰ２Ｃ９＊１によるＴＨＩＡＡの代謝を図示する。
〔００３６６〕ここに本発明を十分に記載してきたが、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正をそれに行うことができることは、当業者には明らかであろう。

Claims (8)

  1. それを必要とする哺乳類において、タンパク質キナーゼ調節に反応する癌を治療する方法であって、前記哺乳類に治療有効量のベータ酸を投与するステップを備える、方法。
  2. 前記ベータ酸は、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎｅ）、コルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）、アドルプロン（ａｄｌｕｐｕｌｏｎｅ）、およびプレルプロン（ｐｒｅｌｕｐｕｌｏｎｅ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 調節される前記タンパク質キナーゼは、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、オーロラＡ、ＢＴＫ、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、ＣＨＫ１、ＣＫ１γ１、ＣＫ１γ２、ＣＫ１γ３、ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｈ）、ｃＳＲＣ、ＤＡＰＫ２、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｒｂＢ４、Ｆｅｒ、ＦＧＦＲ２、Ｆｌｔ４、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３α、Ｈｃｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＡＫ１、ＪＡＫ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ３、ＰＡＫ５、ＰｈＫγ２、ＰＩ３Ｋ、Ｐｉｍ−１、ＰＫＡ、ＰＫＡ（ｂ）、ＰＫＣβＩＩ、ＰＲＡＫ、ＰｒＫＸ、Ｒｏｎ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、ＳＧＫ２、Ｓｙｋ、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＺＩＰＫからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記キナーゼ調節に反応する癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、および子宮癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. それを必要とする哺乳類において、タンパク質キナーゼ調節に反応する癌を治療する組成物であって、前記組成物は、治療有効量のベータ酸を含み、前記治療有効量は、タンパク質キナーゼに関連する癌を調節する、組成物。
  6. 前記ベータ酸は、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎｅ）、コルプロン（ｃｏｌｕｐｕｌｏｎｅ）、アドルプロン（ａｄｌｕｐｕｌｏｎｅ）、およびプレルプロン（ｐｒｅｌｕｐｕｌｏｎｅ）からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記組成物は、コーティング剤、等浸透性および吸収遅延剤、結合剤、接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、洗浄剤、ならびに乳化剤からなる群から選択される薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記組成物は、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、および炭水化物からなる群から選択される１つ以上の要素をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
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