TW200403340A

TW200403340A - Compositions and methods for restoring immune repertoire in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation

Info

Publication number: TW200403340A
Application number: TW092117630A
Authority: TW
Inventors: Ronald Berenson; Mark Bonyhadi; Dale Kalamasz
Original assignee: Xcyte Therapies Inc
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2004-03-01
Also published as: WO2004003142A3; AU2003253684A1; EP1539929A4; DK1539929T3; EP1539929B1; JP2006506987A; US20040151704A1; CA2490401A1; ES2422193T3; WO2004003142A2; EP1539929A2

Description

200403340 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】概略言之本發明係有關刺激τ細胞之方法，特別係有關由一混合τ細胞群去除非期望的（自體反應性、異體反應性、病原性）Τ細胞亞群，藉此恢復T細胞之正常免疫機能之方法。本發明亦係關於細胞組合物，該組合物包括具有已經恢復免疫機能之經刺激之τ細胞及其用途。【先前技術】

τ細胞辨識多種癌症或感染有機體之相關抗原範圍之能力係由Τ細胞抗原受體（TCR)所提供，Τ細胞抗原受體係由α 鏈及/5鏈或γ鏈及δ鏈組成。組成此等鏈之蛋白質係由DNA 編碼，蛋白質採用獨特機轉而產生大量TCR變化。此種多亞單元免疫辨識受體結合CD3複合物，以及結合抗原呈現細胞（APCs)表面由主要組織相容性複合物（MHC)I類及II類蛋白質呈現的胜肽。TCR結合至APC之抗原胜肽乃T細胞活化的中心事件，該事件發生於免疫接合處位在T細胞與APC 的接觸點。為了維持T細胞的活化，T淋巴細胞典型要求第二辅刺激信號。輔刺激典型需要τ助手細胞產生足量細胞激素濃度，該種細胞激素濃度可謗生純株擴大。Bretscher，今日免疫 13 ·· 74，1992 ; June等人，今日免疫 15 : 321，1994。主要輔刺激信號係出現於活化抗原呈現細胞（APC)之B7族群配位子之一成員（CD80(B7.1)或CD86(B7.2))結合至T細胞之 CD28之時。 86387 200403340 刺激T細胞之某些亞群擴大之方法可產生多種可用於免疫㈣之Τ細胞組成。經由藉有效刺激提高了細胞反應性及數里’可輔助成功的免疫治療。此外，於自身免疫或移植方面，經由去除非期望的自體反應性或異體反應性細胞可辅助成功地免疫治療。，多項可供擴大人類Τ細胞之技術主要係仰賴使用附屬細胞及/或外生性生長因子例如介白質_2(IL_2)。IL_2已經連同抗CD3抗體共同用來刺激T細胞的增生，主要係擴大τ細胞之CD8 +亞群。針對TCR/CD3複合物以及τ細胞表面之cd28 (APC信號相信為最佳化τ細胞活化作用、擴大作用以及組織再度灌流時τ細胞的長時間存活所需。要求MHC匹配之 APCs作為附屬細胞對長期培養系統造成一大問題，因ApCs 的壽命相當短。因此於長期培養系統中，必須由來源不斷獲得APCs且不斷補充APCs。需要更新供應附屬細胞對於附屬細胞受影響的免疫機能障礙的治療上成問題。此外，當治療病毒感染時，若附屬細胞攜帶有病毒，則於長期培養期間，該細胞可能污染整個T細胞族群。於播外生性生長因子或附屬細胞存在下，例如經由將細胞暴露於附著至固相表面（如珠粒表面）之CD3配位子及 CD28配位子，可將輔刺激信號傳遞至τ細胞群。參考c· June 等人（美國專利第5,858,358號）；C· June等人，WO 99/953823。雖然此等方法可達成治療有用之τ細胞群，但τ 細胞製劑之強勁度的増高以及製備上的容易仍不夠理想。先前業界方法係使用抗CD3及抗C28來擴大Τ細胞。此 86387 200403340 外’目前業界使用之方法目光集中在短期擴大τ細胞，或獲知更為強勁的τ細胞群及其有利效果。但此等方法皆未曾使用此種方法或類似方法來由Τ細胞群消除非期望的純株或寡純株Τ細胞群，也未曾說明其有利效果。此外，先前使用方法可能更進一步扭曲Τ細胞群的純株組成，而非由τ細胞群去除非期望的反應性純株，且恢復正常免疫機能。為了獲得最大活體内效果，理論上，活體外或活體内產生的活化Τ細胞群必須呈最大和諧狀態，而獲得對癌症、傳染病或其他疾病狀態之最高免疫反應。於自身免疫或移植方面，活化Τ細胞群須呈可重新恢復正常τ細胞機能狀態，極少存在有或％全未存在有自體反應性或可能為病原性之異體反應性細胞。目前患有自身免疫疾病病人接受長期免疫抑制治療來抑制自體反應性τ細胞引發的疾病。當停用免疫抑制劑時’疾病復發，經常伴隨重新出現疾病，造成此等病人體内重新出現τ細胞。造血幹細胞移植的一大問題為移植片對宿主病（GVHD)，GVHD係由於宿主的造血幹細胞製劑内存在有異體反應性Τ細胞所引起。器官移植時，由異體反應性宿主Τ細胞媒介的移植片排斥構成一大問題，該問題通常係藉長期免疫壓抑移植物接受者的免疫系統加以克服。本發明提供產生較多較高度活化且較為純質Τ細胞之方去’該等Τ細胞具有表面受體及細胞激素製造特性，該方法鮮員然比其他擴大方法更健康更正常，以及進一步提供減少成去除非期望之自體反應性或異體反應性Τ細胞族群之方法。本發明提供使用此種Τ細胞族群於自身免疫病、造血幹 86387 200403340 細胞移植及器官移植等方面之方法，以及需要重新恢復被消除、去除或以其他方式發生機能障礙之了細胞免疫系統之方面此外本發明提供任—種目標細胞之細胞群組合物， G括τ’.’田肊群及製造忒細胞群之參數，以及提供其他相關優點。此外’明確了解老化之免疫系統特徵為對外生性抗原及，腫瘤 < 反應性逐漸降低，加上自身免疫性異常升高（C·

Weyand等人，老化及發育機轉102 : 131-147，1998 ; D.

Schmidt 等人，分子藥物 2: 6〇8_618, 1996; GUuzz〇等人，· 循裱100 : 2135-2139，1999)。此等研究說明老化係與出現一種T助手細胞亞群有關，該τ助手細胞亞群之特徵為喪失 CD28的表現。CD4+CD28_ τ細胞之壽命長，典型於活體内進行純株擴大，且於試管試驗可與自體抗原產生反應。 CD28表現的喪失係與CD40配位子表現的缺乏有交互相關’讓此等CD4+ Τ細胞無法促進Β細胞的分化以及免疫球蛋白的分泌。與老化相關的CD4+CD28· Τ細胞積聚，結果導致 · 免疫情況朝向自體反應性反應扭曲，而偏離產生對外生性 — 抗原有高度親和力的Β細胞反應。【發明内容】 < 本發明之一方面提供一種有一個體由混合Τ細胞群去除，至少實質部分之一種純株Τ細胞群之方法，該方法包含提供一細胞群，其中至少部分包含Τ細胞；將該細胞群於活體外暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物，其中該項暴露誘使至少部分Τ細胞細胞凋亡；因而由混合群中去除至少實質部 86387 -9- 200403340 分之該純株τ細胞。

本發明提供一種由來自一個體之混合τ細胞群去除至少實質部分之一種純株Τ細胞亞群之方法，該方法包含一細胞群其中至少部分包含Τ細胞，將該細胞群暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物或生長抑制組合物，其中該暴露誘使存在於該混合Τ細胞群之至少一種純株Τ細胞群的至少實質部分細胞；周亡或抑制細胞生長，因而由該混合Τ細胞群去除至少實質部分之該純株Τ細胞群。一具體實施例中，該方法進一步包含經由讓其餘混合Τ細胞群暴露於前驅細胞凋亡組合物，而擴大該混合Τ細胞群，其中該暴露誘生該混合Τ細胞群之增生。一特定具體實施例中，前驅細胞凋亡組合物包含抗CD3及抗CD28抗體共同制動於一珠粒上。若干具體實施例中，用來由混合Τ細胞群去除至少實質部分之該純株 Τ細胞群之前驅細胞凋亡組合物係與用來擴大其餘混合Τ細胞群之組合物相同。

一具體實施例中，該方法進一步包含擴大其餘細胞群。另一具體實施例，該方法進一步包含經由讓其餘細胞群暴露於一表面而擴大其餘細胞群，其中該表面附著有一或多種反應劑，該反應劑可接合至少部分其餘Τ細胞之細胞表面部分，且刺激其餘Τ細胞。一相關具體實施例中，表面附著第一作用劑，該作用劑可接合Τ細胞之第一 Τ細胞表面部分，同一表面或第二表面附著第二作用劑，該作用劑可接合丁細胞之第二部分，其中經由第一及第二作用劑接合可謗使Τ細胞的增生。 86387 -10- 200403340 一具體實施例中，附著至表面之作用劑為抗體或抗體片段。另一具體實施例中，第一劑為抗體或其片段，而第二劑為抗體或其片段。一具體實施例中，第一劑及第二劑為不同抗體。特定具體實施例中，第一劑為抗CD3抗體、抗 CD2抗體、或抗CD3抗體或抗CD2抗體之抗體片段。另一具體實施例中，第二劑為抗CD28抗體或其抗體片段。又一具體實施例中，第一劑為抗CD3抗體，第二劑為抗CD28抗體。

另一具體實施例中，細胞暴露於本發明表面經歷一段足夠增加多株性的時間。若干具體實施例中，多株性的增加包含藉至少一種V/3、Va、νγ、或νδ族基因之乂召、Va、 νγ、或νδ型譜侧繪圖測量得由T細胞之單株性遷移至寡株性或遷移成多株性。本發明之前驅細胞凋亡組合物例如包括（但非限制性）抗 CD3抗體、抗CD2抗體、抗CD28抗體、抗CD20抗體、目標抗原、MHC-胜肽四元體、Fas配位子、抗Fas抗體、IL-2、

IL-4、TRAIL、洛里潘（rolipram)、朵索比辛（doxorubicin)、克洛布席（chlorambucil)、福達拉賓（fludarabine)、塞克伏伐麥（cyclophosphamide)、亞哲席平（azathioprine)、美索崔赛 (methotrexate)、環孢靈（cyclosporine)、黴酚酸鹽 (mycophenolate)、FK506、bcl-2抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、介白質_1卢轉換酶（ICE)結合劑，志賀氏桿菌（Shigella)IpaB 蛋白質、史洛孢靈（staurosporine)、紫外光照射、γ射線照射、腫瘤壞死因子、目標抗原核酸分子、蛋白質或胜肽以及非蛋白質或非多核苷酸化合物。若干具體實施例中，一或多 86387 -11- 200403340 種組合物可同時使用。本發明之若干具體實施例中，前驅細胞凋亡組合物包含自體抗原。本發明之自體抗原例如包括（但非限制性）骨髓磷脂鹼性蛋白質（MBP)、MBP 84-102、MBP 143-168、胰小島細胞抗原、膠原、CLIP-170、甲狀腺抗原、核酸、乙醯膽鹼受體、S抗原及II型膠原。本發明進一步提供根據前述任一種方法產生之一群T細胞。

本發明提供一種由得自個體之一混合T細胞群去除至少實質部分之鈍株T細胞亞群之方法，該方法包含一群細胞其中至少一邵份包含T細胞，將該群細胞暴露於一種或多種生長抑制組合物，其中該暴露可抑制存在於T細胞混合群中之至少一純株T細胞群之至少實質部分的生長；該方法包含擴大混合T細胞群，擴大方式係將未受生長抑制之細胞群，亦即其餘混合T細胞群暴露於一表面，該表面結合有一或多種可結合至細胞表面分子之作用劑。一具體實施例中，該表面包含抗CD3及抗CD28抗體共同制動於一珠粒上。本發明之一方面提供一種治療病人之自身免疫疾病之方法，包含對該病人投予本發明之T細胞群。一具體實施例中，病人於投予T細胞群之前已經接受化學治療劑處理。本發明之化學治療劑例如包括（但非限制性）康佩斯 (campath)、抗CD3抗體、胞毒素、福達拉賓（fludarabine)、環孢靈、FK506、黴酚酸、類固醇、FR901228及輻射。若干具體實施例中，病人於投予本發明之T細胞群之前接受T細 86387 -12- 200403340 胞消除治療處理。

本發明之一方面為一種由得自個體之τ細胞群去除至少實質部分之純株τ細胞群之方法，該方法包含提供一細胞群，其中至少郡分係包含τ細胞；將該細胞群暴露於一或多種作用劑，該作用劑可敏化至少部分τ細胞而進一步活化或刺激，將細胞群暴露於一表面，其中該表面附著一或多種作用劑，該作用劑可將細胞表面部分接合至少部分敏化τ 細胞且刺激該經過敏化之T細胞，其中該經敏化之T細胞暴露於該表面係經歷一段足夠锈使敏化T細胞細胞凋亡的時間；因而由該細胞群中去除該敏化後之T細胞。一具體實施例中，該方法進一步包含將該細胞群暴露於該表面經歷一段足夠刺激至少部分其餘τ細胞之時間，以及其中至少部分其餘細胞增生。又一具體實施例中，該方法提供表面附著第一劑，該第一劑可接合T細胞之第一 T細胞表面部分；以及該表面或第二表面附著第二劑，該第二劑接合T細胞之第二部分，其中該藉第一及第二劑接合可謗使τ細胞增生。一具體實施例中，至少一劑為抗體或抗體片段。另一具體實施例中，第一劑為抗體或其片段，第二劑為抗體或其片段。又另一具體實施例中，第一劑與第二劑為不同抗體。相關具體實施例中，第一劑為抗CD3抗體、抗CD2抗體、或抗CD3 抗體或抗CD2抗體片段。又另一具體實施例中，第二劑為抗CD28抗體或其抗體片段。另一具體實施例中，第一劑為抗CD3抗體，而第二劑為抗CD28抗體。另一具體實施例中，細胞暴露於該表面經歷一段足夠增 86387 -13- 200403340 加多株性的時間。若干具體實施例中，多株性的增加包含藉至少一種V冷、Voc、νγ、或νδ族基因之V /3、Va、νγ、或νδ型譜繪圖測量得由Τ細胞之單株性遷移至寡株性或遷移成多株性。若干具體實施例中，病人需要造血幹細胞移植。相關具體實施例中，敏化接受者PBMCs之組合物已經接受處理，故無法繼續分裂，細胞族群包含捐贈者T細胞。本發明也提供根據前述方法產生之T細胞群。本發明也提供接受造血幹細胞移植病人降低GVHD不良影響風險或嚴重性之方法，包含根據此處所述方法對該病人投予T細胞群。若干具體實施例中，欲接受本發明細胞的病人需做器官移植。相干具體實施例中，敏化組合物包含經過輕射照射之捐贈者細胞，其細胞群包含接受者T細胞。本發明也提供根據此種方法產生之細胞群。一具體實施例中，此等細胞投予接受器官移植病人來降低器官排斥風險。相關具體實施例中，器官移植病人於投予T細胞群之前使用T細胞消除治療處理。於本發明之一方面，敏化組合物包含自體抗原。本發明之自體抗原例如包括（但非限制性）骨髓磷脂鹼性蛋白質 (MBP)、MBP 84-102、MBP 143-168、胰小島細胞抗原、S 抗原及第II型膠原。本發明之具體實施例中，患有自身免疫病病人投予根據此種方法產生之T細胞群治療。相關具體實施例中，病人於投予T細胞群之前使用T細胞消除治療處理。本發明也提供一種由得自個體之B細胞群去除純株B細 86387 -14- 200403340 胞群之方法，該方法包含提供一細胞群，其中至少部分包含B細胞；將該細胞群暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物，其中該暴露誘使至少部分B細胞凋亡；因而由該族群去除該部分B細胞。一具體實施例中，該方法進一步包含暴露其餘細胞群於一表面，其中該表面附著一或多種作用劑，該作用劑可接合其餘B細胞之至少部分之細胞部分，且刺激其餘B細胞。若干具體實施例中，前驅細胞凋亡組合物包含一種自體抗原。

本發明也提供根據前述方法產生之B細胞組合物。本發明之一具體實施例中，患有自身免疫疾病病人使用一種組合物處理，該組合物包含使用本發明方法產生的B 細胞群。相關具體實施例中，病人於投予B細胞群之前使用 B細胞消除治療處理。

本發明之一方面提供一種由得自一個體之一 T細胞群產生實質純粹之T細胞群之方法，該方法包含提供一細胞群，其中至少部分包含T細胞；於活體外暴露該τ細胞群之一種組合物，該組合物可優先選擇及/或刺激表面CD3 +及CD28+ 分子，因而產生實質純粹之CD3+/CD28+ T細胞群。相關具體實施例中，產生的純粹T細胞群為實質純粹之CD4+/CD3+/ CD28+ T細胞群。一相關具體實施例中，該純粹T細胞群為一實質純粹之CD8+/CD3+/CD28+ T細胞群。於本發明之一方面，CD3+/CD28+ T細胞之純度至少為90% 純。又一具體實施例中，CD3+/CD28+ T細胞純度為91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%或 98%純。另一具體實 86387 -15- 200403340 施例中，CD3+/CD28+ T細胞純度為至少99%純。一相關具體實施例中，CD3+/CD28+ Τ細胞純度為至少99.9%純。因此本發明之一方面，為一種包含少於10% CD28·細胞之CD3+/ CD28+ Τ細胞群。若干具體實施例中，CD3+/CD28+ Τ細胞群包含低於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5% 或0.1%污染CD28_T細胞。一具體實施例中，CD3 +表面分子係使用抗CD3抗體刺激，CD28 +表面分子係使用抗CD28抗體刺激。

因此本發明也提供產生實質純粹之CD3+CD28+ Τ細胞群之方法，該細胞群包括CD4+CD3 + CD28+ Τ細胞及 CD8 + CD3 + CD28+ Τ細胞。此等Τ細胞群可用於治療患有自身免疫疾病病人，自身免疫疾病例如為類風濕性關節炎、多發性硬化、胰島素依賴型糖尿病、艾帝森氏病、腹腔疾病、慢性倦怠症候群、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏病、纖維肌痛、系統性紅斑性狼瘡、乾癖、修格連氏症候群、甲狀腺機能亢進/葛雷夫氏病、甲狀腺機能低下/橋本氏病、胰島素依賴型糖尿病（第1型）、重症肌無力、子宮内膜炎、硬皮病、惡性貧血、古德巴斯特氏症候群（Goodpasture syndrome)、韋吉納氏病（Wegener’s disease)、腎小球性腎炎、再生不良性貧血、陣發性夜間血尿、骨髓發育不良症候群、特發性血小板缺乏性紫斑、自身免疫性溶血性貧血、伊凡氏症候群、第VIII因子抑制劑症候群、系統性血管炎、皮肌炎、多發性肌炎、及風濕熱。本發明進一步提供一種藉細胞表面部分結合而活化其擴 86387 -16- 200403340 大τ細胞族群之方法，包含提供一細胞群，其中至少部分包含τ細胞，該細胞群接觸一表面，其中該表面附著一或多種作用劑，該作用劑可接合至少部分^胞之細胞表面部分且刺激Τ細胞，其中該表㈣以表面對細胞之—種比例存在，該存在_可於8日培養後讓至少實質部分之至少一抗原特異性如特異性Τ細胞群被刪除。本發明之—具體實施例中，該比例為約50 : 1至約5:卜若干具體實施例中，該比例為約100 : 1至約2 : 1。一具體實施例中，該比例至少為約45 · 1。若干具體實施例中，該比例至少為約4〇 ·· 1、^ ·· I - 30 . 1 - 25 . 1 - 20 : 1 λ 15 ： 1 ^ 14 : 1 > π : 1 λ 12 : 1 . II :卜 10 ·· 1、9 : 1、8 : 1、7 : 1、6 : 1、5 : 1、4 : 1、3 : 1或2: 1。一特定具體實施例中，該比例至少為約5: 1。本發明提供一種由得自一個體之混合Τ細胞群去除至少實質部分之一純株Τ細胞亞群之方法，該方法包含一細胞群其中至少部分包含Τ細胞，將該細胞群暴露於一或多種前驅細胞洞亡組合物，其中該暴露可謗使存在於該混合Τ細胞群之至少一純株Τ細胞群之至少實質部分細胞凋亡，因而由該混合物Τ細胞群消除至少實質部分之純株τ細胞群。【實施方式】於陳述本發明之前先了解後文使用之各術語定義。「生物相容性」一詞用於此處表示對活細胞大致無毒之性質。用於此處「刺激」一詞表示經由細胞表面部分接合謗生之一次反應。例如以受體為例，此種刺激涉及受體的接合 86387 -17- 200403340 乂及Ik後L號轉導事彳。至於τ細胞的刺激，此種刺激係指 Τ”田肊表面邯分的接合’該接合於一具體實施例隨後謗生信號轉導事件例如結合TCR/CD3複合物。此外，刺激事件可活化、、、田胞，以及向上調節或向下調節細胞表面分子（例如受心：或黏著分子）的表現，或向上調節或向下調節分子的分泌，例如向下調節腫瘤生長因子万（TGF_e)。如此即使於無直接信號轉導事件的存在下，細胞表面部分接合也可能 ;致細胞主幹結構的重新組織，或導致細胞表面部分的融合，其各自可用來提升、修改、或變更隨後之細胞反應。用於此處「活化」一詞表示於足量細胞表面部分接合而 #生可量測之形態、表現型及/或功能變化之細胞狀態。以 T細胞為例’此種活化為τ細胞已經被充分刺激而誘生細胞增生狀態。T細胞活化也誘使細胞激素的產生及/或分泌，以及細胞分子（例如受體或黏著分子）的向上調節或向下調節’或某些分子分泌的向上調節或向下調節，以及調節效應物或細胞分解效應物功能之執行。以其他細胞為例，此種「活化」一詞表示特定物理化學過程之向上調節或向下調節。「目標細胞」一詞用於此處表示意圖藉細胞表面部分接合而刺激之任一種細胞。「抗體」一詞用於此處包括多株抗體及單株抗體（mAb); 靈長類化（例如人化），氣；鼠·人；氣-靈長類，以及嚴合體；可為完整分子、其片段（例如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab，、及 F(ab)’2片段）或完整分子及/或片段之多元體或聚集體；可天 86387 -18- 200403340 ;、、：出現或例如經由免疫接種、合成或基因工程製造；「抗體片段」〜4 、巧用於此處表示由抗體衍生或抗體相關之片段，、二-片叙結合抗原’若干具體實施例中，抗體片段可經卜而/、有結構特色’該抗體片段例如經由結合半乳糖殘輔助凊除及攝取。抗體片段例如包括F(ab)、p(ab)，2、 scFv、輕鏈可變區（vL)、重鏈可變區（Vh)及其組合。虫白質」一詞用於此處包括蛋白、糖蛋白及其他細胞衍生之改性蛋白、多肽及胜肽；可為完整分子、其片段、或完整分子及/或其片段之多元體或聚集體；可天然出現或例如、纟k由合成（包括化學及/或酶學合成）或基因工程而製造。作用劑」、「配位子」或「結合細胞表面部分之作用劑」等1用木此處表示結合至特定一群細胞之分子。作用劑可結合任何細胞表面部分例如受體、抗原定子或存在於目標細胞群的其他結合位置。作用劑可為蛋白質、胜肽、抗體及抗體片段融合蛋白質、合成分子、有機分子（例如小分子）等。於本說明書及於τ細胞刺激案例，抗體係用作為此種作用劑之原型範例。「細胞表面邵分」一詞用於此處表示細胞表面受體、g 原定子或任何其他存在於目標細胞族群的結合位置。「結合細胞表面部分之作用劑」及「細胞表面部八 Μ 心刀」等同用於此處須視為顯示特定結合且通常有相當高親和力之分子互補/反互補集合。「輔刺激信號」一詞用於此處表示一信號及組合_ 4 86387 -19- 200403340 號（例如TCR/CD3接合）結果導致T細胞增生及/或活化。「分離」一詞用於此處包括任一種由另一成分實質上純化一種成分之任一種手段（例如藉過濾、親和力、浮力密度或磁性引力等）手段。「表面」一詞用於此處表示任一種可讓作用劑附著其上之表面，包括（但非限制性）金屬、玻璃、塑膠、共聚物、膠 m、脂質、細胞表面等。大致上任何表面皆可保有作用劑結合或附著於其上。早株性」一同用於此處用於T細胞群，表示藉型譜分析 (TCR V/3、Va、νγ、或νδ鏈高度可變區機能測量）界定可具有單一特異性之一細胞群。一 τ細胞群於一指定TcR Υβ、Va、νγ、及/或νδ族群之νβ、Va、νγ、及/或νδ型譜側繪圖有單一主要峰時，該Τ細胞群被視為單株（或單一特秀性）。型清分析可區別特定尺寸經過重排後的可變基因，而非序列。如此須了解單一尖峰表示一 Τ細胞群表現有限數目之經過重排的TCR可變基因（νβ、Va、νγ、或νδ)之任一者，該經過重排之TCR可變基因包含四個可能核苷酸（腺嘌吟（a)、鳥嗓呤（g)、胞嘧啶⑷或胸腺嘧啶⑴)之任一者，或* 個核荅酸於接合區的組合。若干本發明之具體實施何中，需要轉殖及定序特定帶來決定存在於表現特定長度之帶的經過重排之可變區序列。「暴株性」用於此處用於T細胞群表示一 τ細胞群其有複數但狹窄的抗原特異性。寡株性可藉型譜分析（TCR V冷、 Vex、νγ、或νδ鏈高度可變區機能測量值）定義。當一指定 _ 86387 200403340 TCR V泠、Voc、νγ、或νδ族群之VyS型譜側繪圖具有約2至 4個主峰時，一T細胞群被視為寡株性。也可由對感興趣抗原之抗原特異性純株的產生及特徵化決定。

「多株性」用於此處用於T細胞群表示一 T細胞群其有複數且寬廣的抗原特異性。多株性可藉型譜分析（TCR νβ、 Voc、νγ、或νδ鏈高度可變區機能測量值）定義。當一指定 TCR V/3、Va、νγ、或νδ族群之V/3型譜側繪圖具有多峰（典型為5個或5個以上的主峰），且大半情況下具有高斯分布時，則Τ細胞群被視為是多株。多株性也可由對感興趣抗原之抗原特異性純株的產生及特徵化決定。

「恢復或提高多株性」一詞用於此處表示藉譜型分析測量、或藉類似分析例如流動細胞計量術或序列分析測量，於Τ細胞群經過表現之TCR V/5、Va、νγ、及/或νδ基因，由單株遷移成寡株或遷移成多株，或由寡株遷移成多株之情況。於Τ細胞群由單株V/5、Va、νγ、及/或νδ表現遷移成寡株或遷移成多株，通常可見於至少一個TCR V /3、Va、 νγ、及/或νδ族群。於本發明之一具體實施例中，此項遷移可見於2、3、4或5個V万族群。本發明之若干具體實施例中，於6、7、8、9或10個V/3族群觀察得遷移。本發明之另一具體實施例中，於11、12、13或14個V/9族群觀察得遷移。本發明之另一具體實施例中，於15至20個V/5族群觀察得遷移。本發明之另一具體實施例中，於20至24個V/?族群觀察得遷移。於另一具體實施例中，全部V沒族群皆觀察得遷移。恢復或提高Τ細胞族群之多株性之功能意義為Τ細胞群 86387 -21- 200403340 义免疫潛力或對全部抗原之反應能力恢復或增高。於本發明之某此士& 一 ’一族群之若干T細胞之TCRs未藉此處陳述万去接合（例如T細胞之TCR表現向下調節）。但此等τ細胞係位在可藉此處所述方法活化之Τ細胞附近，經由該等τ細胞 7刀泌 < 因子，此等Τ細胞又可將其TCR表現向上調節，因而獲得Τ細胞族群多株性之進一步增高。多株性的恢復或提高也可藉測走對特定感興趣抗原之反應加以量測，例如測量由抗原特兴性細胞辨識之抗原決定部位數目加以量測。此項工作可使用於試管内產生及轉殖抗原特異性Τ細胞之標準技術進行。「純株Τ細胞族群」一詞用於此處表示對指定目標抗原具有指足特異性範圍之τ細胞族群。此種特異性可藉業界已知之任種檢定分析測定，例如於一指定族群產生及測量抗原特異性純株之特異性（亦即不同特異性數目）。純株τ細胞群也可藉型譜分析（測量TCR V召、Va、νγ、或¥5鏈高度可變區機能）定義之單株特異性或寡株特異性界定。「動物」或「哺乳動物」等詞用於此處涵蓋全部哺乳類包括人類。較佳本發明之動物為人。「暴露」一詞用於此處表示近日緊鄰附近或直接接觸之狀態或條件。「增生」一詞用於此處表示藉產生新細胞而生長或繁殖。免疫反應或反應性」一到用於此處表示免疫系統細胞包括（但非限制性）τ細胞的活化，因此謗生特定細胞之特定效應無功能。效應物功能包括（但非限制性）增生、分泌細胞 86387 -22- 200403340 激素、分泌抗體、表現調節分子及/或黏著分子以及謗生細胞分解能力。「刺激免疫系統」用於此處表示任一種刺激其可達成免疫系統細胞之效應物功能的活化及誘生。「免疫反應機能障礙」一詞用於此處表示免疫系統細胞之不當活化及/或增生或缺乏活化或增生，及/或細胞激素之不當分泌或缺乏，及/或免疫系統細胞之其他效應物之謗生不當或誘生不足，該等效應物功能例如為調節細胞、黏著細胞及/或導向受體的表現，以及細胞分解的誘生。「粒子」或「表面」用於此處包括膠體粒子、微球、奈米粒子、珠粒等。表面可為任一種有配位子結合其上或整合之表面，包括細胞表面（例如K562細胞表面），該表面為細胞相容，換言之，該表面對欲刺激的目標細胞實質無毒。各具體實施例中，可使用商用表面例如珠粒或其他粒子（例如米天易（Miltenyi)粒子、米天易生技公司，德國；希法羅斯（Sepharose)珠粒、法瑪西亞精密化學公司，瑞典；待納必（DYNABEADS頂），待諾（Dynal)公司，紐約；普珞必 (PURABEADS™)，波美提克（Pr〇metic)生科公司，得自伊牡康（Immunicon)公司賓州漢亭頓谷之磁珠、得自班恩（Bangs) 實驗室公司，印第安那州費雪之微球）。「順磁性粒子」一同用於此處表示可回應於磁場而定位之如前文定義之粒子。「刖驅細胞调r組合物」、「細胞〉周亡組合物」或「細胞凋亡誘生劑」用於此處表示任一種組合物或刺激，其當單 -23- 86387 200403340 獨投予或結合其他前驅細胞凋亡組合物投予時可提高細胞的細胞凋亡活性。用於本發明方法之前驅細胞凋亡組合物較佳可誘生經活化之T細胞、NKT、NK或B細胞的細胞凋亡。若干具體實施例中，本發明之前驅細胞凋亡組合物可未經進一步活化/刺激即誘生細胞凋亡。此種組合物或刺激例如包括（但非限制性）生長因子的缺乏、氧化條件、熱壓力、血清匱乏、佛波（phorbol)肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)及艾歐諾黴素（ionomycin)、超抗原（例如SEA、SEB等）、多種抗體例如抗CD2、抗CD3、抗CD28、抗CD20、抗Fas抗體或其任一種組合、MHC胜肽四元體或二元體、Fas配位子、IL-2、 IL-4、TRAIL、洛里潘、朵索比辛、克洛布席、福達拉賓、皮質類固醇、糖皮質固醇、環孢靈、塞克伏伐麥、FK506、亞哲席平、美索崔賽、黴驗酸鹽、亞尼辛（annexin)、卡斯伯蛋白酶（caspases)、bcl-2抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、介白質-1/3轉換酶（ICE)結合劑，志賀氏桿菌IpaB蛋白質、史洛孢靈、紫外光照射、γ射線照射、輻射、腫瘤壞死因子、多種組織腺去乙醯酶抑制劑、以及業界眾所周知之其他成分。若干具體實施例中，前驅細胞凋亡組合物包含一表面 (例如磁珠），該表面附著一或多種可結合細胞表面部分之作用劑。就此方面而言，該作用劑可為此處所述之任何作用劑。一具體實施例中，該表面至少附著抗CD3抗體。另一具體實施例中，該表面附著抗CD3及抗CD28抗體。此外細胞凋亡刺激劑可為多肽，該多肽可提高或謗生細胞之細胞凋亡活性。此種多肽包括可直接調節細胞凋亡路徑之多肽 86387 -24- 200403340 例如Bax、Bad、Bcl_xS ' Bak、Bik及活性卡斯伯蛋白酶以及間接調節細胞凋亡路徑之多肽。若干具體實施例中，前驅細胞洞亡組合物包含活化T細胞例如XCELLERATED T細胞㈣（例如述於美國專利申請案第1〇/133,236號之T細胞），特别用於B細胞群誘生細胞凋亡。其他前驅細胞凋亡組合物包括（但非限制性）經輻射照射細胞（例如捐贈者或接受者 (同種異基因）細胞）、目標抗原（例如經過界定之自身免疫目標抗原，例如於多發性硬化，目標抗原識別為骨髓磷脂鹼性蛋白質（MBP)MBP 84-102或MBP 143_168 ;胰小島細胞抗原，於葡萄膜炎，S抗原；或於類風濕性關節炎第η型或其他型膠原；於葛蕾夫氏病，甲狀腺受體；於重症肌無力，乙酿膽驗受體、胞質鏈結蛋白質l7〇(CLIP-17〇)、核酸分子、蛋白質或胜肽以及非蛋白質或非多核苷酸化合物。「可敏化細胞而進一步活化或刺激之組合物」或「敏化組合物」用於此處為任一種可敏化細胞對隨後之活化/刺激敏感之組合物。當隨後被活化/刺激時，敏化細胞進行細胞调ΤΓ。本發明之敏化組合物也造成細胞對前驅細胞凋亡組合物之影響變敏感。可敏化細胞對進一步活化、刺激或前驅細胞凋亡組合物之影響敏感之組合物包括已經接受處理因而無法繼續分裂的細胞，該等細胞例如藉照射處理（例如捐赠者或接受者（同種異基因）細胞）、超抗原（例如MA、SEB 等）、目標抗原（經界定之自身免疫目標抗原例如於多發性硬化’目標抗原識別為骨髓鱗脂驗性蛋白質（MBP)MBP 84-102 或MBP 143-168，胰小島細胞抗原；於葡萄膜炎，s抗原； 86387 -25- 200403340 或於類風濕性關節炎第π型或其他型膠原；於葛蕾夫氏病，甲狀腺受體；於重症肌無力，乙醯膽鹼受體、核酸分子、蛋白質或胜肽及非蛋白質或非多核铝酸化合物）、蛋白質、糖蛋白、胜肽、抗體/抗原複合物、細胞溶解產物、非可溶性細胞碎屑、細胞凋亡體、壞死細胞、得自細胞系已經接受處理因而無法繼續分裂的全細胞、天然或合成複合碳水化e物月曰蛋白、轉形細胞、或細胞系、轉移感染細胞或細胞系或轉導細胞或細胞系、或其任一種組合。供本發明目的之用，細胞凋亡定義為計畫性細胞死亡。細胞凋ΤΓ為計畫性細胞死亡，此乃普遍現象，於無數種生理過私及病理過程扮演關鍵性角色。細胞凋亡係發生於胚胎發生、變形、内分泌依賴性組織萎縮、正常組織周轉、及免疫胸腺細胞死亡（經由抗原_受體複合物誘生，或由糖皮質固醇誘生）時⑴吡等人，細胞66·· 233, 1991)。T細胞於胸腺成熟期間，辨識為自我抗原的τ細胞係經由細胞凋亡程序摧毁，而其他細胞則經陽性選擇。某些可辨識若干自我抗原決定部位之Τ細胞（例如特定自我蛋白質之未經有效處理及呈現的抗原定子）可能由此種删除過程脫逃，隨後於自身免疫病扮演某種角色（Gammon等人，今日免疫學12 : 193， 1991)。壞死是細胞意外死亡，壞死是細胞對多種有害情況及有毒物質的反應。細胞调亡於形態學上與壞死不同，細胞调亡係多種不同組織於各種條件下自然發生的細胞死亡形式。細M亡係以二階段發生。細胞進行胞核及胞質的縮合，最終破裂成多個與膜結合的片段其中含有結構完整 86387 -26 - 200403340 的細胞凋亡本體，該片段係由鄰近細胞呑噬而快速分解。另外進入細胞凋亡路徑的細胞可於退化成為細胞膜結合本體之前被呑噬。細胞凋亡出現於多種不同組織，包括健康及腫瘤組織、成熟及胚胎組織。死亡係自動發生，係由生理或無害的作用劑所謗生。細胞凋亡程序是一種於細胞族群調節上扮演重要角色之基本生理過程。

細胞凋亡程序之測量方法為業界眾所周知。細胞凋亡程序可由例如DNA梯級、電子顯微鏡或光學顯微鏡、流動細胞計量術以及市售多種細胞凋亡測量套件組等方法測定。

用於此處，「生長抑制組合物」為任一種可抑制細胞生長的物質，或當單獨投予或組合本發明之其他組合物投予時可以其他方式讓細胞產生機能障礙而無法分裂的物質。本發明方法使用之生長抑制組合物較佳可於經活化之T細胞、NKT、NK或B細胞抑制生長。此種組合物或刺激範例包括（但非限制性）生長因子的缺乏、氧化條件、熱壓力、血清匱乏、佛波（phorbol)肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)及艾歐諾黴素（ionomycin)、超抗原（例如SEA、SEB等）、多種抗體例如抗CD2、抗CD3、抗CD28、抗CD20、抗Fas抗體或其任一種組合、MHC胜肽四元體或二元體、Fas配位子、IL-2、IL-4、 TRAIL、洛里潘、朵索比辛、克洛布席、福達拉賓、皮質類固醇、糖皮質固醇、環孢靈、塞克伏伐麥、FK506、亞哲席平、美索崔赛、黴驗酸鹽、亞尼辛（annexin)、卡斯伯蛋白酶（caspases)、bcl-2抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、介白質 -1/3轉換酶（ICE)結合劑，志贺氏桿菌IpaB蛋白質、史洛孢 86387 -27- 200403340 靈、紫外光照射、γ射線照射、輻射、腫瘤壞死因子、多種組織腺去乙醯酶抑制劑、以及業界眾所周知之其他成分。若干具體實施例中，前驅細胞·亡組合物包含一表面（例如磁珠），該表面附著一或多種可結合細胞表面部分之作用劑。就此方面而言，該作用劑可為此處所述之任何作用劑。一具體實施例中，該表面至少附著抗CD3抗體。另一具體實施例中，該表面附著抗CD3及抗CD28抗體。此外，生長抑制組合物包含一種可抑制細胞生長之多肤。此種多肤包括可直接調節細胞凋亡路徑之多肽例如Bax、Bad、Bel-xS、 Bak、Bik及活性卡斯伯蛋白酶。其他前驅細胞凋亡組合物包括（但非限制性）經輻射照射細胞（例如捐贈者或接受者 (同種異基因）細胞）、目標抗原（例如經過界定之自身免疫目標抗原，例如於多發性硬化，目標抗原識別為骨髓磷脂鹼性蛋白質（]^16?)^18? 84-102或1^^? 143-168;胰小島細胞抗原；於葡萄膜炎，S抗原；或於類風濕性關節炎第II型或其他型膠原；於葛蕾夫氏病，甲狀腺受體；於重症肌無力，乙醯膽鹼受體、胞質鏈結蛋白質170(CLIP-170)、核酸分子、蛋白質或胜肽以及非蛋白質或非多核苷酸化合物。用於此處，「實質純粹」之CD3+/CD28+ T細胞群為一種包含至少約90% CD3+/CD28+ T細胞之細胞群。於本發明之某些方面，「實質純質」CD3+/CD28+ T細胞群為包含至少約 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、或 98% CD3+/CD28 + T細胞，較佳至少約99%及又更佳約99.9%或以上之細胞群。混合細胞群來源 86387 -28- 200403340 一具體實施例中，暴露於前驅細胞凋亡組合物或生長抑制組合物及/或敏化組合物之細胞係得自個體的循環血液’且係4于自一或多單位血液或血泳（aphereSiS)或白血球泳 (leukapheresis)。血泳產物典型含有淋巴細胞包括τ細胞、單核細胞、粒狀細胞、Β細胞、其他凝核白血球、紅血球及血小板。Τ細胞來源係得自個體，隨後才暴露於敏化組合物，接著經過活化及/或刺激。「個體」一詞意圖包括可提引出免疫反應的活有機體（例如哺乳類）。個體例如包括人、犬、貓、小鼠、大鼠及其轉移基因種屬。τ細胞可得自多個來源包括周邊血液單核細胞、骨髓、胸腺、組織生檢、腫瘤、淋巴節組織、腸道相關類淋巴組織、黏膜相關類淋巴組織、脾組織或其他類淋巴組織及腫瘤。Τ細胞可得自τ細胞系以及得自自體來源或同種異體來源。Τ細胞也可得自異種來源，例如得自小鼠、大鼠、非人靈長類及豬。本發明之若干具體實施例中，τ細胞可得自使用業界人士已知之多種技術例如菲可（ficoll)分離而由收集自個體的一單位血液獲得。較佳具體實施例中，得自個體循環血液之細胞可藉血永或白血球泳獲得。血泳產物典型含有淋巴細胞包括T 細胞、單核細胞、粒狀細胞、B細胞、其他凝核白血球、紅血球及血小板。一具體實施例中，藉血泳收集之細胞經洗滌而去除血漿部分，細胞置於適當緩衝液或介質内供隨後處理步騾。本發明之一具體實施例中，細胞係使用磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)洗滌。另一具體實施例中，洗滌溶液缺鈣’缺鎂，或缺多種（即使並非全部）二價陽離子。熟諳技藝 ι 86387 -29- 200403340 人士了解洗滌步驟可藉業界人士已知技術達成，例如根據製造商的指示使用半自動「流經式」離心機（例如柯伯 (Cobe)2991細胞處理器，巴司特（Baxter))。洗務後，細胞再懸浮於多種生物相容緩衝液，例如不含妈（Ca)、不含鍰（Mg) 之PBS。另外，血泳樣本之非期望成分可被去除，細胞直接再懸浮於培養基。另一具體實施例中，T細胞係藉分解或去除紅血球或去除單核細胞例如經由珀可（PERCOLLTM)梯度離心去除單核細胞而與周邊血液淋巴球分離。T細胞之特定亞群例如 CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及 CD45RO+ T細胞可進一步藉陽性選擇或陰性選擇技術分離。例如於較佳具體實施例，T細胞係經由於抗CD3/抗CD28(亦即3x28)軛合珠粒（例如待納必M-450 CD3/CD28 T)共同培養一段足夠陽性選擇預定T細胞之時間而予分離。一具體實施例中，該段時間約為30分鐘。又一具體實施例中，該時間為30分鐘至36小時或以上，以及介於其間的全部整數值。又一具體實施例中，該段時間至少為1、2、3、4、5或6小時。又另一具體實施例中，該時間為10至24小時。較佳具體實施例中，培養時間為24小時。為了由白血病病人分離T細胞，使用例如24 小時之培養時間可提高細胞產量。較長培養時間可用於T 細胞比其他細胞類型更少的任一種情況分離T細胞，該種情況例如由腫瘤組織或由免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL)。此外，使用較長培養時間可提高CD8+ T細胞的捕捉效率。例如CD3+、CD28+ T細胞可使用CD3/CD28軛合磁 86387 -30- 200403340

珠（例如待納必M-450 CD3/CD28 T細胞擴大器）陽性選擇。本發明之一方面，藉陰性選擇豐富Τ細胞群可經由使用針對經過陰性選擇細胞之獨特表面記號之抗體組合而達成。較佳方法係透過陰性磁性免疫附著細胞計量學或流動細胞計量學而進行細胞酚類及/或選擇，該細胞計量學係使用針對存在於經過陰性選擇細胞的細胞表面標記之單株抗體混合液。例如為了藉陰性選擇豐富CD4+細胞，單株抗體混合液典型包括抗 CD14、CD20、CDllb、CD16、HLA-DR 及 CD8

本發明之又一方面提供於敏化、刺激及擴大前，已經被耗盡或富含表現多種標記之細胞群之T細胞群或組合物，該等標記例如為CD62L、CD45RA或CD45RO、細胞激素（例如 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10)、細胞激素受體（例如 CD25)、ί白佛林（perforin)、黏著分子（例如 VLA-1、VLA-2、VLA-4、 LPAM-1、LFA-1)、及/或導向分子（例如勞喜拉亭 (L-Selectin))。一具體實施例中，可表現任一種標記的細胞係藉針對該標記之抗體或其他配位子/結合劑而被耗盡或經過陽性選擇。熟諳技藝人士可辨識多種特定方法用來耗盡或陽性選擇可表現預定標記之分子樣本。於活體外擴大前，單核群（例如CD 14+細胞）可藉多種方法而由血液製劑中耗盡，該等方法包括抗CD14塗覆珠粒或管柱，或利用此等細胞之呑嗟活性來輔助去除或透過黏著於塑膠來輔助去除。如此，一具體實施例中，本發明使用足夠被呑嗟細胞單核細胞所呑嗟的大小之順磁性粒子。若干 86387 -31 - 200403340 具體實施例中，順磁性粒子為市售珠粒例如待諾（Dynal)AS 以商品名DYNABEADSTM出售之粒子。就此方面而言之 DYNABEADST〜如為 M-280、M-450及 M-500 〇 —方面，其他非特定細胞係經由使用「非相關」蛋白質（例如血清蛋白或抗體）經由塗覆順磁性粒子而去除。非相關蛋白質及抗體包括未特定鎖定欲擴大之T細胞為目標的該等蛋白質及抗體或抗體片段。若干具體實施例中，非相關珠粒包括珠粒塗覆有羊抗小鼠抗體、山羊抗小鼠抗體及人血清白蛋白。簡言之，此種單核細胞之耗盡方式係將已經使用菲可 (Ficoll)分離自全血之PBMC或經過血泳之周邊血液與一種或多種非相關或非抗體偶合之順磁性粒子共同前培養，順磁性粒子之用量係足夠去除單核細胞之量（約20 : 1珠粒：細胞比），於22°C至37°C培養約30分鐘至2小時，接著藉磁力去除已經附著於或者已經呑嗟順磁性粒子的細胞。前培養也可於低抵3-4°C之溫度進行。此種分離可使用業界標準方法進行。例如可使用任一種磁力分離方法，包括多種商用方法（例如DYNAL^t性粒子濃縮器（DYNAL MPC®))。藉業界人士已知之多種方法可監視確保達成完全耗盡，該等方法包括於耗盡之前及之後藉流動細胞計量分析CD 14陽性細胞。暴露於前驅細胞凋亡組合物及/或敏化組合物以及隨後接受刺激之T細胞可於洗務步騾後冷凍，無需單核細胞去除步騾。不欲受任何理論所限，冷凍步驟及隨後之解凍步驟經由去除細胞群中的粒狀細胞以及去除單核細胞至某種程 86387 -32- 200403340 度，可提供較為均勾的產物。於洗滌去除血漿及血小板之步驟後’細胞懸浮於冷凍溶液。雖然業界已知多種冷柬溶液及冷凍參數且將用於此處，但一種方法涉及使用含終濃度10% DMSO及4%人血清白蛋白之PBS，以及其他適當細胞 Q /東介貝’然後將細胞以每分鐘1 °C之速率冷康至_ 8 〇〇c且儲存於液態氮儲存櫃之氣相。由混合細胞群去除非期望之細胞亞群直接暴露於前驅細胞凋亡組合物本發明提供由免疫細胞群去除部分非期望之細胞純株群 <方法’該等細胞典型為τ細胞、B細胞、NKT或NK細胞。本發明進一步提供包含細胞群其不再含有非期望之細胞或有顯著較少量非期望細胞之組合物，及其用途。非期望之細胞群可直接經由將該細胞暴露於前驅細胞凋 πτ組合物而去除或減少達統計上顯著量。暴露於前驅細胞 )周亡組合物可於活體内或試管内進行。不欲受特定理論所限’先前經活化的細胞相信比未經接觸或未經活化細胞，對細胞;周亡組合物更為敏感。因此使用可誘生細胞凋亡之劑量及條件’於活體内或試管内暴露於細胞凋亡組合物將選擇性殺纪病人體之高度活化細胞（例如非期望之自體反應性細胞）。本發明之較佳具體實施例中，欲去除之自體反應性細胞包含Τ細胞、ΝΚΤ、ΝΚ或Β細胞。如此’本發明提供一種由混合免疫細胞群去除至少實質量之任一種非期望之純株細胞亞群（例如Τ、Β、ΝΚΤ或ΝΚ 細胞）之方法。供本發明目的之用，實質量表示至少70%非 86387 •33- 200403340 期望之細胞亞群。若干具體實施例中，實質量表示75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%及更高之非期望之細胞亞群。細胞之去除可使用業界已知之任一種技術測量，包括（但非限制性）使用多種抗體及/或胜肽-MHC 四元體進行流動細胞計量分析，及功能性檢定分析例如增生檢定分析及路釋放檢定分析。前驅細胞调亡組合物或細胞调亡謗生劑表示任一種單獨投予或組合其他前驅細胞凋亡組合物投予時可增加細胞之細胞凋亡活性之任一種組合物或刺激。本發明方法有用之前驅細胞凋亡組合物較佳可於活化T細胞、NKT細胞、NK 細胞及B細胞謗生細胞凋亡。前驅細胞凋亡組合物謗生期望之細胞凋亡之數量及條件各異，可由熟諳技藝人士使用例常之最佳化辨法測定。若干具體實施例中，本發明之前驅細胞调亡組合物可未經進一步活化/刺激而誘生細胞凋亡。此種作用劑或刺激例如包括（但非限制性）去除生長因子、氧化條件、熱應力、冷柬-解滚應力、血清匱乏、多種抗體例如抗CD2、抗CD3、抗CD28、抗CD20或抗Fas抗體； MHC胜肽四元體；Fas配位子、TRAIL、FR901228(述於美國專利第6,403,555號）、FK506、亞尼辛、卡斯伯蛋白酶、細胞激素例如IL-2或IL-4、塞克伏伐麥、化學治療劑、紫外線、類固醇、皮質類固醇、糖皮質固醇、洛里潘、朵索比辛、克洛布席、福達拉賓、bcl-2抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、介白質-1 /5轉換酶（ICE)-結合劑、志贺氏桿菌IpaB蛋白質、史洛抱靈、紫外線照射、γ射線照射、輻射照射、腫瘤壞死 86387 -34- 200403340 因子、組織腺去乙祕抑·、以及業界㈣周知之其他作用劑或刺激。若干具體實施例中，前驅細胞計組合物包含表面（例如磁珠），該表面附著—或多種可結合至細胞表面部分之作用_。就此方面而言，作用劑可為此處所述之任-種作關。-具體實施例中，該表面附著至少抗⑽ 抗體。另一具體實施例中，該表面附著抗CD3及抗cD2“^ 體。此外，細胞洞亡刺激劑可為可提高或誘生細胞之細胞调亡活性之多肽。此等多肽包括可直接調節細胞调亡路徑之多肤例如Bax、Bad、Bcl_xL、Bak、Bik及活性卡斯伯蛋白酶’以及間接調節路徑之多肽。其他前驅細胞;周亡組合物例如包括（但非限制性）經過輕射照射之細胞（例如捐贈者或接受者（同種異基因）細胞）、目標抗原[例如特定自身免疫目標抗原如骨髓磷脂鹼性蛋白質（MBp)、胰小島細胞抗原、胞質聯結子蛋白質]7〇(CLIP_ i 7〇)、修格連氏症候群A抗原 (SS-A/Ro)、修格連氏症候群B抗原（SS_B/La)、修格連氏紅斑性狼瘡（SL)、硬皮病70抗原（Scl_7〇)]、核酸分子蛋白質或胜肽，以及非蛋白質或非多核芬酸化合物。於本發明之一方面，一或多種前驅細胞凋亡組合物組合醫藥可接受性賦形劑於活體内投予個體。前驅細胞凋亡組合物之任一種組合皆可投藥，例如抗CD3抗體組合細胞激素如IL-2或IL-4投藥，述於專利申請案冒〇9428926。如熟諳技藝人士已知，對本發明方法使用之任一種前驅細胞凋亡組合物進行實驗須於某個劑量範圍進行，俾測定·· 1)此等物貝之樂力學表現；及2)任一種非期望作用之安全性以及 S6387 -35- 200403340 任一種非期暫％作用之識別，3)於欲去除之細胞有效謗生細月包》周士 > b从、瑕佳剑量。如此組成第I期臨床試驗。如此，此 Y、使用之特定前驅細胞凋亡組合物需個別例行最佳化〇本於昍士 a Λ <則驅細胞凋亡組合物可局部、腸道外或藉 Υ仫技木。「腸這外」一詞包括皮下注射、靜脈、肌肉、 '内/主射或秦11》主技術。此等組合物典型含有有效量之前驅:胞;周亡組合物’可單獨或組合有效量之任何其他活性物=。組合物所含之劑量及預定藥物濃度係根據多項因素文又L括預走用途、哺乳類體重及年齡以及投藥途徑。初步劑T係根據動物試驗決定，供人體投藥之劑量可根據業界可接受之投藥規範進行。於本發明之一方面，細胞群於試管内暴露於一或多種前驅細胞’周亡組合物。如熟諳技藝人士已知，本發明方法使用 < 任一種丽驅細胞凋亡組合物進行測試例行係以某種劑量範圍進行俾測定：1)此等物質的表現；以及2)安全性以及識別任何非期望之副作用，3)於欲去除細胞有效誘生細胞凋K取佳劑量。如此此處方法採用之特定前驅細胞凋亡組合物需要個別進行例行最佳化。一特定具體實施例中，已經去除非期望之反應性細胞亞群之其餘細胞群可未經進一步刺激/活化或擴大而投予病人。本發明之一具體實施例中，細胞暴露於單獨前驅細胞凋亡組合物多次’或暴露於前驅細胞凋亡組合物與其他前驅細胞凋亡組合物之組合多次。於本發明之某些方面，較佳活化/刺激混合細胞群，某些情況下也擴大混合細胞群，如 86387 -36- 200403340 後文於名稱「細胞群之刺激/活化」以及「細胞群之擴大」等節所述，隨後細胞群暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物。一較佳具體實施例中，於暴露於本發明之前驅細胞凋亡組合物後’細胞群中剩餘之細胞於試管内經活化/刺激及擴大，如後文於「細胞群之刺激/活化」以及「細胞群之擴大」等節所述。若干具體實施例中，用於活化/刺激及擴大之前驅細胞调亡組合物與用於活化/刺激及擴大之組合物為相同組合物。一特定具體實施例中，如此處說明，附著有此處所述作用劑之表面用作為前驅細胞凋亡組合物，此外，用於活化/刺激及擴大混合細胞群。就此方面而言，族群中之若干純株細胞經誘導而進行細胞凋亡，而其他細胞係回應於組合物而被刺激/活化及增生。本内文中，可用於誘生τ細胞亞群之細胞凋亡以及刺激/活化與擴大混合丁細胞群之組合物例如包含抗CD3及抗CD28抗體共同制動於珠粒（3x28珠粒）。本發明惑另一具體實施例，暴露於一或多種細胞凋亡組合物後，其餘細胞進一步於活體内接受刺激/活化及擴大。本發明細胞之於活體内刺激及擴大可使用任一種細胞激素 (如IL-2及IL-4)或其他此處所述可刺激細胞之作用劑進行。本發明之又-具體實施例中，於暴露於—或多種前驅細胞岡亡組合物後，其餘細胞進一步於試管内使用表面及結合於表面之作用劑刺激/活化及擴大’如後文述於「細胞^ 之刺激/活化」以及「T細胞群之擴大」等節所述。未使用本I明表面進行細胞凋C之其餘細胞之刺激及活化可增加 86387 -37- 200403340 其餘τ細胞群之多株性，如該群細胞對指定抗原之反應測定。多株性之恢復或升高可經由測定對特定感興趣範圍之反應決定，例如測量抗原特異性細胞辨識之不同抗原決定部位數目測定。可使用於試管内產生及轉殖抗原特異性Τ 細胞之標準技術進行。

使用本發明表面刺激及活化未進行細胞凋亡之其餘細胞，如型譜分析指示，相較於表現之TCR基因，可恢復其餘Τ細胞群之多株性。本發明之Τ細胞組合物之多株性述於美國專利申請案第60/375,733號。型譜分析是一種Τ細胞發育之重組過程中使用Τ細胞匯集物以及核甞酸插入程度測量TCR V/3、Voc、νγ、或νδ基因之使用之方法（述於美國專利5,837,447)。型譜分析可用於測量Τ細胞免疫反應潛力之寬度或窄度。此外，型譜分析可用來決定特定純株Τ細胞群是否已經由混合Τ細胞群去除。

V、D及J基因節點共同組合之能力可將大量組合分集元素隨機導引入TCR機能。V、D及J節點接合之精確點而改變，造成結合處之局部胺基酸分集。確切核苷酸接合位置差異高達10殘基，結果導致由V、D及J基因節段末端去除核甞酸，因此於節段接合處產生密碼子變化。當未由基因節段編碼之額外胺基酸添加至接合基因節段間之接合處時，重排過程中之分集進一步增加（藉此方法引進之變化稱作為_ 「N區分集」）（免疫學，第四版，98及150，艾斯維爾（Elsevier) 科學公司/高爾藍（Garland)出版公司，1999年）。 T細胞機能之分集程度部分可經由評估於循環T細胞匯集 86387 -3S- 200403340 物中之個別T細胞採用TCRV/3、Va、Vy、或㈣而^ 以及經由插入V-DMV]基因接合處位在”基因旁之'左’ 機核甞酸數目測定。通常當循環τ細胞匯集物含有可表p TCR V/5、να、νγ、或vs鏈完整範園之τ細胞時，以及= 個別V區鏈係由基因重組事件（其利用最寬廣之插人核^ 陣列）時，免疫系統之T細胞係辨識潛在抗原之潛力為最大。當循環τ細胞池表現之TCR v區鏈之範圍有限或減: 時，以及當表現的TCR係藉帶有|限核#酸插入物之重組基因編碼之鏈時，免疫反應潛力範圍相對縮小。結果回應毛夕種杬原之能力減低，結果導致感染及癌症風險增高。 "、J足細胞凋亡之方法為業界已知，且述於例如，目前免疫學方案，約翰威利父子公司，紐約州紐約或美國專利 6,312,684。測量細胞凋亡之檢定分析例如包含]〇1^八梯級、私子或光學顯微術、流動細胞計量術及不同的市售細胞凋 X：測τ套件組。若干具體實施例中，觀察細胞之形態學改 k例如染色質縮合、細胞收縮、粒度增加以及其他業界人士已知之細胞凋亡指標。染色質縮合可藉標準方法例如染色細胞製劑之光學顯微術方法測定。細胞收縮及粒度方便藉測量細胞之光漫射性質而偵測（Kerr等人，參見上文及 Wyllie等人，參見上文）。觀察得單股或雙股DNA節段進入暴染色質單體梯級，經常為誘生細胞;周亡之另一項指標 (Arend等人，美國藥理期刊，136 : 593，1990 ; Wyllie等人，病理期刊，142 ·· 67，1984)。但若干細胞凋亡細胞不具有標準雙股染色質單體間DNA節段（Collins等人，國際輻射生物 86387 - 39- 200403340 學期刊’ 62 : 45 1992 ; Cohen等人，生物學期刊，286 : 331 1992);反而將觀察得單股dna斷片。單股DNA斷片方便使用原位DNA凹口端標記法偵測。此種方法由WylHe等人所述 (英國癌症期刊，67·· 20，1993)。暴露於細胞對進一步刺激/活化敏化用之組合物另外’至少實質部分之非期望之細胞群可經由下述方式去除，經由首先讓細胞對進一步刺激/活化敏化，然後經由讓細胞暴露於本發明表面而進一步刺激或活化細胞，而將非功立之細胞去除。此種額外刺激/活化於敏化後之細胞謗生細胞凋亡，結果導致細胞由族群中去除。本發明之敏化組合物也讓細胞對前文說明之前驅細胞洞亡組合物之效應敏化如此本發明提供經由暴露於一或多種組合物，該組合物可讓非期望之細胞群對進一步刺激/活化敏化、或經由暴露於前驅細胞洞亡組合物效應，而由一免疫細胞群去除立· / λ貝4刀之非期望純株細胞群，典型為τ細胞或b細胞之方法此外，本發明提供包含不再含有非期望細胞之細胞群之組合物及其用途。、、本發月之方面，一免疫細胞群暴露於對進一步活化或刺激敏化（組合物’纟中至少部分細胞例如為先前高度

活化之Τ細胞或Β細胞。較佳具體實施例中，敏化細胞包含非期望之自體反應性Τ細胞每R > 肊次B細胞。又一具體實施例中，敏化細胞包含存在於指瞒I、生、9者化血幹細胞之異體反應性細胞。又一具體實施例中，齡仆&队a ^ 破彳匕細胞包含得自器官移植接受者之異體反應性細胞。 86387 -40- 200403340

本發明之一具體實施例中，敏化組合物包含經輻射照射之細胞。一特定具體實施例中，經輪射照射之細胞係得自造血幹細胞移植接受者，欲敏化細胞係得自造血幹細胞移植捐贈者。另一具體實施例中，敏化組合物包含得自器官捐贈者只經過輻射照射之細胞，以及欲敏化之細胞為得自器官接受者之細胞。若干具體實施例中，欲敏化細胞為得自器官接受者移植後之細胞。細胞典型係使用約3000至 3600雷得且更佳約3300雷得範圍之珈瑪射線照射。其他本發明有用之經輻射照射細胞例如類淋巴母細胞或腫瘤細胞系典型係使用約6000至10,000雷得且更佳約8000雷得範圍之珈瑪射線照射。細胞也可藉其他手段處理，例如使用化學劑（如伊托波賽（etiposide)、米托黴素（mitomycin)等）處理。

本發明之敏化組合物包含任一種可讓免疫細胞如T、 NKT、NK或B細胞對隨後之刺激敏感，讓隨後之刺激或活化可誘生細胞凋亡之組合物或組合物組合。本發明之敏化組合物也包括任一種可讓免疫細胞如T細胞或B細胞對隨後暴露於前驅細胞调亡組合物敏化之組合物或組合物組合。本發明之敏化組合物包括（但非限制性）抗體例如抗CD2、抗 CD3、抗FAS; MHC-胜肽二元體或四元體，細胞激素如IL-2、 TRAIL，化合物如洛里潘、朵索比辛、克洛布席、及福達拉賓。敏化組合物也包括FAS配位子及CD2及CD3之天然配位子。敏化組合物也包括bcl-2抑制劑，例如美國專利第 6,277,844號所述；拓樸異構酶抑制劑如伊托波赛、CPT-11 及托波提肯（topotecan)及其他如美國專利第5,834,012號所 86387 -41 - 200403340 述。其他敏化組合物包括可謗生細胞凋亡之介白質-1 /3轉化酶（ICE)結合劑，例如志賀氏IpaB蛋白質述於美國專利第 5,972,899號或美國專利第 6,350,741、6,294,546及6,329,365 號所述化合物。

本發明之敏化組合物也包含自體抗原。自體抗原可為經過界定之自身免疫目標抗原，例如多發性硬化之經過界定之自身免疫目標抗原，該目標抗原經過識別為骨髓磷脂鹼性蛋白質（MBP)MBP 84-102或MBP143_168;胰小島細胞抗原；於葡萄膜炎，S抗原；或於類風濕性關節炎II型或其他型膠原；於SLE胞質聯結子蛋白質-170(CLIP-170);修格連氏症候群抗原A(SS-A/Ro)、修格連氏症候群抗原B(SS-B/ La)、修格連氏狼瘡抗原（SL);硬皮病抗原70(Scl-70);葛蕾夫氏病，甲狀腺受體；重症肌無力乙醯膽鹼受體、核酸分子、蛋白質或胜肽、以及非蛋白質或非多肽化合物。本發明之自體抗原也包含由已知與自身免疫相關之MHC分子洗提之胜肽混合物，該等MHC分子例如為可對數種常見自身免疫病例如第1型糖尿病、類風濕性關節炎及多發性硬化提供敏感性之HLA-DQ及HLA-DR分子；或已知可對反應性關節炎及僵直性脊椎炎提供敏感性之HLA-B27分子。本發明之自體抗原也可為預測可結合至與自身免疫病相關之MHC 分子之敏化胜肽。本發明進一步提供供選擇性去除至少實質部分之可表現特定V /5、Va、νγ、或νδ基因之T細胞群用之敏化組合物。例如特定V沒、V a、V γ、或V δ基因之特異性抗體可用於根 86387 -42- 200403340 據本發明方法特別敏化τ細胞。另外，可表現感興趣之特定 V>5、Va、νΥ、或νδ基因之Τ細胞可經陰性選擇，因此由細胞群中至少去除實質部分之該等細胞。於本發明之又一具體實施例中，一或多種敏化組合物同時使用且使用經歷足夠謗生預定之敏化作用之時間。如削文對前驅細胞凋亡組合物之說明，本發明提供下列万法，其中可讓細胞對進一步刺激/活化敏化或對前驅細胞调1Γ組合物之效應敏化之組合物經活體内或經活體外投藥之方法，或二者之組合。如同任一種醫藥物質或生物物質，對於任一種可讓細胞對活體内投予進一步刺激/活化敏化 <作用劑’例如多種前驅細胞凋亡組合物、例行用來免疫接種之抗體、胜肽及蛋白質必須於一定劑量範圍例行進行測試來測定：1)此等物質之藥力學表現；2)其免疫原性；以及3)任何非期望效應之安全性及識別。如此組成第〗期臨床試驗。於本發明方法採用來讓細胞對進一步刺激/活化敏化之特定作用劑（例如多發性硬化之目標抗原識別為ΜΒρ 84-102或ΜΒΡ 143-168 ;於葡萄膜炎為s抗原；或於類風濕性關節炎為第Π型膠原）皆需要個別進行例行的最佳化試驗。本發明之敏化組合物可經局部、腸道外或藉吸入投藥。「腸道外」-詞包括皮下注射、靜脈肌肉、腦池内注射或輸注技術。i匕等組合物典型含有有效量之敏化組合物，可單獨使用 <組合有效量之任何其他活性物質&用。組合物所含之此種劑量及所需藥物濃度可依據多項因素改變，該等因素包括預期用it、哺乳類體重及年齡以及投藥途徑。 86387 -43- 200403340 初步劑量係根據動物試驗決定用於人體投藥之劑量可根據業界可接受之規範進行調整。於疫苗發展中有大量證據提示合成胜肽或重組DNA衍生蛋白質可有效用於人體提引出免疫反應。此等研究也對可有效免疫接種劑量範圍提供指示[Zajoc，B.A.，D.J. West， W.J· McAleer及E.M· Scolnick，藉重組DNA製造B型肝炎疫苗之臨床研究综論感染期刊13 :(補遺A)39-45(1986)。 Yamamoto, S·，T· Kuroki，K_ Kurai 及 S. lino，使用重組以及血漿衍生自B型肝炎疫苗進行第I期研究結果比較，以及比較肌肉注射及皮下注射重組B型肝炎疫苗之對照研究，感染期刊 ’ 13 :(補遺 a)53-60(1 986)。Francis，D.P·等人，以疫苗預防B型肝炎，國際醫學年報97 : 362-366(1982)。Putney等人’ HI V套膜及亞單元疫苗發展特色，愛滋病疫苗研究與臨床試驗，S· Putney 及 B. Bolognesi 編辑（紐約：Dekker)3-62 頁（1990年）。Steven，V.C·及W.R. Jones，預防懷孕疫苗，新世代疫苗，G.C· Woodrow及M.M. Levine編輯（紐約： Dekker)879-900(1990年）。Herrington 等人，合成胜肽癔疾疫苗於人體對抗惡性瘧孢子蟲之安全性及免疫原性，自然， 328 : 257-259(1987)]。本發明之一具體實施例中，使用可讓細胞對進一步刺激/ 活化或暴露於前驅細胞凋亡組合物敏化作用劑免疫接種 (亦即活體内敏化），接著為一段等候期，於該段期間作用劑活化載有反應性受體之細胞子集例如載有反應性TCR之T 細胞或可表現特異性抗體受體之B細胞子集，造成其表現細 86387 -44- 200403340 胞激素受體如IL-2受體。例如此種方法唯有於已經經過抗原刺激之T細胞才謗生IL-2受體。基於人及鼠T細胞之試管試驗研究，抗原暴露後需時約12小時至24小時來表現顯著量之IL-2受體，於大部分T細胞表現最佳數目IL-2受體需要長達約72小時。如此等候期可能短至約12小時，或長達約 72小時；於各種疾病之情況下由於延遲免疫反應，此段時間可能長達120小時，朝向此範圍之上限逐漸變成最佳化。本發明之一具體實施例中，IL-2或其他適當細胞激素（例如IL-4)投予病人而於前述活化細胞謗生細胞凋亡。IL-2投予人體已經於癌症病人做過徹底研究，已經評估多種劑量 [Loize，M.T·，L.W. Frana，S.O· Sharrow，R.J· Robb及 S.A· Rosenberg，活體内投予經純化之人類介白質2，I·朱卡特細胞系衍生之介白質2之半生期及免疫效應，免疫學期刊，134: 157-166(1985)。Lotze，J.T·，Y.L. Malory，S.E. Ettinghausen， Α·Α·，Rayner，S.O· Sharrow，C.A.Y· Seipp，M.C. Custer&S.A·

Rosenberg，活體内投予經純化之人介白質2，II.活體内帶有重組IL-2之周邊類淋巴細胞之半生期、免疫功效及擴大’ 免疫學期刊 135: 2865-2875(1985)。Donahue，J.H·及 S.A· Rosenberg，介白質2於活體内投予後之命運，免疫學期刊， 130 ： 2203-2208(1983)。Belldegrun，Α·，Μ.M. Muul及 S.A Rosenberg，人腎癌細胞中之經介白質2擴大之腫瘤浸潤淋巴細胞··分離、特徵化及抗腫瘤活性，癌症研究48 : 206-214(1988)oRosenberg，S.A.，M.T.Lotze，L.M.Muul,S·

Leitman, A.E. Chang, S.E. Ettinghausen, Y.L. Malory, J.M. 86387 -45- 200403340

Skibber, E. Shiloni, J.T. Vetto, C.A. Seipp5 C. Simpson^C.M. Rewhert，患有轉移癌病人系統性投予自體淋巴激素活化殺手細胞及重組介白質2之觀察，新英格蘭醫藥期刊313: 1485-1492(1985)]。資料指出IL-2可經常以大劑量靜脈注射或連績靜脈輸注投藥。先前已經確立劑量係於約3〇〇至約 3000單位/千克/小時連續輸注或1〇4至1〇6單位/千克大劑量靜脈注射之範圍。於本發明之一方面，細胞群於試管内暴露於一或多種敏化、’且户物。為謂技蟄人士已知本發明方法使用之任一種敏化組合物需例行於一定劑量範圍進行測試來決定：1}此等物貝之樂力學表現；以及2)安全性及非期望副作用之識別，3)於欲去除之細胞有效誘生細胞凋亡之最佳劑量。如此此處所述方法使用之特殊敏化組合物需要個別例行最佳化。本發明之一具體實施例中，由先前於活體内使用可讓細胞對進一步刺激/活化敏化之作用劑處理個體收集細胞。然後細胞經進一步刺激/活化而謗生細胞凋亡，隨後如後文所述於試管内擴大。刺激經敏化之細胞而由混合細胞群中誘生欲去除之細胞之細胞凋亡毛本發明之一方面，前述包含敏化細胞之免疫細胞群進步&刺激而誘生細胞凋亡，如後文述於名稱「細胞群之刺激Λ舌化」乙節，如此由混合細胞群中去除敏化細胞，例如自體反應性或異體反應性Τ細胞或Β細胞。同時留下之預 86387 -46- 200403340 定細胞’例如未經敏化而進行細胞凋亡之該等細胞經活化及刺激而擴大，結果獲得活化細胞群，由該活化細胞群中至少已經去除相當大部分之非期望之T細胞（或B細胞）亞群。如前文說明，此處所述刺激/活化係於混合細胞群直接暴露於莉驅細胞凋亡組合物後，對剩餘的細胞進行刺激/活化。此外’本發明提供之隨後刺激及活化如型譜分析指示，可對τ細胞群相對於表現之TCR基因恢復多株性。於本發明之一具體實施例，於有或無額外敏化組合物存在下，經敏化之細胞如後文說明刺激/活化多次，其次數為去除至少實質部分之非期望細胞所需。例如於自身免疫病集合，本發明提供於初次刺激/活化回合後，於抗原（亦即敏化組合物）存在下，刺激細胞第二次或第二次以上之方法。同理，於造血幹細胞移植集合，本發明提供於得自造血幹細胞移植接受者之經輻射照射細胞存在下，刺激得自造血幹細胞捐贈者細胞第二次或第二次以上之方法，或刺激次數多達至少去除相當大部分非期望之細胞所需次數。於器官移植方面，本發明提供若有所需，於得自器官捐贈者之經輻射照射細胞存在下，刺激得自器官接受者細胞第二次或第二次以上，或多達去除至少部分非期望細胞所需次數《万法。-具ff實施例巾，本發明方法係對得自移植後病人之細胞（例如宿主細胞）進行俾去除非期望的細胞。若干具體實施例中，可能需要去除全部非期望的細胞例如於某些癌症之造血幹細胞移植案例，可能希望有移植片相對於白血病細胞效應。 86387 -47- 200403340 於本發明之若干方面，較佳係於暴露於一或多種作用劑，而該作用劑可敏化細胞對進一步刺激/活化以及隨後之刺激前，如後文於「細胞族群之刺激/活化」以及「細胞族群之擴大」等節所述，較佳刺激/活化（於某些情況下）擴大混合細胞群。於本發明之其他方面，細胞經敏化，然後暴露於前驅細胞洞亡組合物’藉此去除至少實質部分之已經變成對前驅細胞凋亡組合物之影響敏化之細胞。族群中之剩餘細胞隨後進一步經刺激/活化及擴大，說明如後。純CD3+CD28+ T細胞群之產生本發明提供由免疫細胞群產生實質純質之CD3+CD28+ 丁細胞群。供本發明之目的之用，實質純質CD3+CD28+T細胞群含有少於10% CD3+CD28· T細胞。若干具體實施例中，實質純質CD3+CD28+ T細胞群含有低於9%、8%、7%、6%、5%、 4%、3%、2%、1%、0.5%、或〇1% CD3+CD28_ T細胞。純CD3+CD28+ T細胞群之產生方式係藉磁力濃縮、選擇以及使用一種組合物，該組合物可刺激T細胞表面之CD3及 CD28分子二者之組合物刺激混合τ細胞群而產生。細胞表面之CD3及CD28分子二者之選擇及刺激，結果導致此種細胞子集的活化及增生。相反地，於此處所述條件下， CD3 + CD28· T細胞暴露於可選擇以及刺激CD3及CD28兩種表面分子之組合物，將不足以謗生此種T細胞群之活化及擴大。此外，縮短與此處所述CD3/CD28珠粒之培養時間，有利於選擇CD3+CD28+細胞，而犧牲CD3+CD28·細胞（例如於 86387 -48- 200403340 室溫以1 r.p.m.選擇15分鐘，接著為磁力濃縮，將留下多個或大部分CD3+CD28·細胞）。藉特異性抗原或藉可1激表面分子之分子（例如抗CD3抗體），觸發TCR，除非補充辅刺激信號亦即特異性刺激CD28分子，否則不足以誘生擴大及淋巴激素分泌。實際上於無輔刺激存在下’ τ細胞獲得無反應或失能狀態。 μ 如此本發明方法，例如使用可觸發CD3以及刺激〇1)28之組合物剌激及選擇混合T細胞群，將導致生成實質純質之 CD3+CD28+ T細胞群。本發明之一具體實施例中，此種實質純質之CD3+CD28+ τ 細胞群可用來治療急性或慢性GVHD。其他具體實施例中，實質純質CD3+CD28+ T細胞群可用來治療自身免疫病例如類風濕性關節炎、多發性硬化、胰島素依賴型糖尿病、艾迪森氏病、腹腔疾病、慢性倦息症候群、結腸炎、克隆氏病、纖維肌痛、狼瘡、乾癖、修格連氏症候群、甲狀腺機能尤進/葛雷夫氏病、甲狀腺機能過低/橋本氏病、胰島素依賴型糖尿病（第1型）、重症肌無力、子宮内膜炎、硬皮病、惡性貧血、古德巴斯特氏症候群、韋吉納氏病及風濕熱。又一具體實施例中，本發明細胞可用於治療大型粒狀淋巴細胞白血病（LGL)相關之自身免疫。混合免疫細胞群可由捐贈者去除，此等細胞使用可刺激CD3及CD28分子之組合物刺激。雖然不欲受特定理論所限，推定此項刺激將導致 Cm + CD2g+ T細胞之特異性活化及擴大，以及導致缺乏表現輔刺激分子（CD28)之T細胞失能。一旦已經生成純質 86387 -49- 200403340 CD3+CD28+ T細胞群，貝此等細胞可輸注人體供治療自身免疫病、LGL或GVHD。細胞群之刺激/活化

本發明之經刺激以及經活化之T細胞係藉可誘生活化及細胞表面部分接合而產生。若干具體實施例中，經刺激且經活化之T細胞係單純透過TCR而活化T細胞群，例如使用抗CD3抗體或天然TCR配位子來活化T細胞群。若干具體實施例中，經由活化T細胞群，以及使用可結合附屬分子之配位子刺激T細胞表面之附屬分子，而生成經刺激且經活化之 T細胞，例如述於美國專利申請案08/253，694、08/435,816、 08/592,711、09/183,055、09/350,202、及 09/252，150，以及美國專利案6,352,694、5,858,358及5,883,223。前述敏化細胞之說明中，活化經過敏化之T細胞群、以及使用可結合複數分子之配位子刺激敏化後T細胞表面之複數分子，謗生細胞之細胞凋亡，以及隨後誘生細胞之去除。

通常細胞之T細胞活化可藉細胞表面部分接合達成，例如刺激T細胞受體（TCR)/CD3複合物或CD2表面蛋白質。多種抗人CD3單株抗體為市面上可得，例如純株BC3(XR-CD3 ; 福哈金森（Fred Hutchinson)癌症研究中心，華盛頓州西雅圖）、OKT3(由得自美國種型培養收集會之雜交瘤細胞製備而得）及單株抗體G19-4。同理，抗CD2抗體之刺激形式為已知且可取得。使用抗CD2抗體透過CD2刺激典型係使用至少兩種不同抗CD2抗體之組合達成。前述抗CD2抗體之刺激性組合包括下列：Τ11.3抗體組合Τ11.1或Τ11·2抗體（Meuer等 86387 -50- 200403340

人，細胞36 ·· 897-906，1984)及9.6抗體（辨識ΤΙ 1.1之相同抗原決定部位）組合9-1抗體（Yang等人，免疫學期刊137 : 1097-1100，1986)。也可使用其他可結合至前述任一種抗體之抗原決定部位之抗體。其他抗體或抗體組合可藉標準技術製造及識別。經由下列方式也可達成刺激，經由接觸超抗原[例如葡萄球菌腸毒素A(SEA)、葡萄球菌腸毒素 B(SEB)、毒性休克症候群毒素l(TSST-l)]、内毒素或經由多種突變原也可達成刺激，突變原包括（但非限制性）植物血液凝集素（PHA)、佛波肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)以及艾歐諾黴素、脂多醣（LPS)、T細胞突變原及IL-2。

為了進一步活化τ細胞群’ T細胞表面之輔刺激分子或附屬分子（如CD28)使用可結合複數分子之配位子刺激。如此熟諳技藝人士了解任一種作用劑包括抗CD28抗體或可交聯CD28分子之其片段或CD28天然配位子皆可用來刺激T細胞。本發明之上下文有用之抗CD28抗體或其片段例如包括單株抗體9.3(IgG2a)(必治妥梅爾施貴寶（Bristol-Myers Squibb)，紐澤西州普靈斯頓）、單株抗體K〇LT-2(IgGl)、15E8 (IgGl)、248.23.2(IgM)、純株 B-T3(XR-CD28 ;戴爾康 (Diaclone)，法國貝桑松）及 EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。天然配位子例如包括B7蛋白質家族例如B7-1 (CD80)及B7-2(CD86)(Freeman等人，免疫學期刊 137:3260-3267，1987 ; Freeman等人，免疫學期刊 143 : 2714-2722， 1989 ; Freeman等人，實驗醫學期刊 174 ·· 625-631，1991 ; Freeman等人，科學 262 : 909-911，1993 ; Azuma等人，自 86387 -51 - 200403340 然366 : 76-79，1993 ; Freeman等人，實驗醫學期刊178 : 2185-2192 ， 1993)。其他T細胞表面可使用本發明可結合附屬細胞之配位子刺激之範例附屬分子包括（但非限制性）CD54、及 CD40 〇此外，天然配位子之結合同系物無論為天然同系物或藉化學技術或重組技術合成，也可根據本發明使用。其他作用劑包括天然及合成配位子。作用劑包括（但非限制性）其他抗體或其片段、生長因子、細胞激素、化學激素、可溶性受體、類固醇、激素、突變原例如ΡΗΑ或其他超抗原。如前文說明，隨後刺激及活化尚未進行細胞凋亡或尚未對細胞洞亡敏化之其餘細胞，如型譜分析指示，就表現之 TCR基因而言，可恢復其餘τ細胞群之多株性。細胞群之擴大概略s 本發明提供擴大下述處理後剩餘之細胞群，細胞群暴露於前驅細胞凋亡組合物或敏化組合物，以及任何隨後於非期望之細胞亞群較佳為自體反應性了細胞，或非期望（異體反應性Τ細胞亞群誘生細胞凋亡後擴大剩餘細胞群。本發明之一具體實施例中，剩餘τ細胞可藉單一作用劑刺激。本發明之另一具體實施例中，其餘τ細胞係使用兩種或多種作用劑刺激，纟中_種作用劑誘生—次信號，而其他作用齋⑽生一或多固輔刺激信號。彳用於#激單一信號之配位子或刺激一次信號以及附屬分子刺激二次信號之配位子可以可溶形式、附著於細胞表面或如此處所述制動 86387 -52- 200403340 於表面形式使用。附著於表面之配位子或作用劑係用作為「代用品」抗原呈現細胞（APC)。較佳具體實施例中，一次作用劑及二次作用劑共同制動於一表面上。一具體實施例中，提供一次活化信號之分子（例如CD3配位子）及輔刺激分子（如CD28配位子）係偶合至同一表面例如偶合至粒子。此外如前文說明，一、二或多個刺激分子可用於相同或不同表面。

細胞群可如此處所述經刺激，例如制動於表面之抗CD3 抗體或抗CD2抗體而刺激，或經由接觸輛合鈣離子基團之蛋白質激酶C活化劑（例如比歐史塔丨丁（bryostatin))而被刺激。供輔刺激T細胞表面之附屬分子，使用可結合附屬分子之配位子。例如於適合刺激T細胞增生之條件下，CD4+細胞群可接觸抗CD3抗體及抗CD28抗體。另外，細胞群可接觸 PMA及艾歐諾黴素。同理，為了刺激CD8+ T細胞的增生，抗CD3抗體及抗CD28抗體B-T3、XR-CD28(戴爾康，法國貝桑松）可如同業界俗知之其他方法使用（Berg等人，移植議事錄 30(8) : 3975-3977，1998 ; Haanen等人，實驗醫學期刊 190(9) : 1319-1328，1999 ; Garland等人，免疫方法期刊 227(1-2) : 53-63，1999) ° T細胞之一次刺激信號及辅刺激信號可由不同方案提供。例如提供各信號之作用劑可呈溶液或偶合至表面。當作用劑係偶合至表面時，作用劑可偶合至同一表面（亦即呈「順」式）或偶合至分開表面（亦即呈「反」式）。另外，一種作用劑可偶合至一表面，而另一種作用劑係呈溶液。一 86387 -53 - 200403340 具體實施財’提供輔刺激信號之作面’而提供-次活化信號之作用劑係呈溶液或偶合至= 面。若干具體實施例中，二作用劑皆可呈溶液。另—且触實施例中，作用劑係呈可溶形式，然後交聯至表面，例Z 可表現Fc或Sc受體之細胞、或抗體、或其他結合至該作用劑之結合劑。較佳具體實施例中，兩種作用劑係制動於球體或半球體表面上，原型範例為珠粒或細胞，結合於同— 珠粒意即「順式」或結合於分開珠粒意即「反式」。舉例士之，提供一次活化信號之作用劑為抗CD3抗體，提供辅= 激信號之作用劑為抗CD28抗體；兩種作用劑係以等分子量共同制動於同一珠粒上。一具體實施例中，使用結合至珠粒供T細胞擴大及T細胞生長之個別抗體為丨：丨比例。於本發明之某些方面，結合至珠粒之抗CD3:抗CD28(CD3: CD28) 抗體之比係用來觀察比較使用1 :丨比例時觀察得之擴大，以及使用前述比例時T細胞擴大之增加。一特定具體實施例中，比較使用1: 1比例時觀察得之擴大情況，觀察得擴大增加約0 · 5倍至約3倍。一具體實施例中，結合至珠粒之抗 CD3 :抗 CD28(CD3 : CD28)抗體比係於約 1〇〇 : 1 至 1 : 1〇〇之範圍以及介於其間之全部整數值。若干具體實施例中， CD3 ·· CD28 比例至少為約 95 : 1，90 : 1，85 : i，8〇 : i， 75 : 1，70 : 1，65 : 1，60 : 1，55 ·· 1，50 : 1，45 : 1，40 ·· 1 ’ 35 : 1 ， 30 : 1 ’ 25 : 1 ’ 20 : 1 ， 15 : 1 ， 1〇 : 1 ， 9 : 1 ， 8 : 1,7: 1，6: 1’5: 1’4: 1，3: 1，2: 1 或 1: 1。於本發明之一方面，結合至粒子之抗CD28抗體比抗CD3抗體更 86387 -54- 200403340

多，亦即CD3 : CD28比值小於1。本發明之若干具體實施例中，結合至珠粒之抗CD28抗體對抗CD3抗體之比大於2: 1。一特定具體實施例中，使用1 : 200 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。一特定具體實施例中，使用1 : 1500 CD3: CD28 結合至珠粒之抗體比例。一特定具體實施例中，使用1 : 100 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 75 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。又一具體實施例中，使用1 : 50CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 45 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 40 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 35 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 30 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 25 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 20 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 15 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。較佳具體實施例中，使用1 : 10 CD3 : CD28 結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 5 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 4 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 3 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。又另一具體實施例中，使用3 : 1 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。粒子對細胞比為1 ·· 500至500 ·· 1以及介於其間之任何整 86387 -55- 200403340 數值可用來刺激τ細胞或其他目標細胞。如熟諳技藝人士已知’粒子對細胞比係依據粒子相對於目標細胞之相對大小決定。例如小尺寸粒子只能結合少數細胞，而較大珠粒將可結合多數細胞。若干具體實施例中，細胞對粒子比係於 1 : 100至100 : 1之範圍以及介於其間之任何整數值；又一具體實施例中，該比例為1 ·· 50至50 : 1以及介於其間之任何整數值。另一具體貫施例中，細胞對粒子比係於1 : 9至9 : 1之範圍以及介於其間之任何整數值，也可用來刺激丁細胞。可導致τ細胞刺激之抗CD3偶合粒子及抗CD28偶合粒子對T細胞之比可如前述改變，但若干較佳值包括至少丄： 150 > 1 ： 125 ^ 1 : 1〇〇 ' 1 ： 75 > 1 : 50 ^ 1 : 40 ^ 1 ： 30 > 1 : 20、1 : 10、1 : 9、1 : 8、1 : 7、1 : 6、i : 5、！： 4、i : 3、 1 ·· 2·5、1 : 2、1 1、8 : 1、9 : 1、1G : 1及15 : 1，較佳比例為至少1 : 1粒子相對於每個T細胞。一特定具體實施例中，較佳粒子對細胞比為1()。-具體實施例中，使雌子對細胞比為 1 ·· 1或以下。又-具體實施例中，粒子對細胞比例可依據不同之刺激日而改變。例如-具體實施例中日粒子對細胞比為 1: 1至10 μ，隨後每日或每隔一日添加額外粒子至細胞長達日’最終比例為1:1至1:10(以添加當曰之細胞數目為基準）。·另—具體實施例中，粒予對細胞比例土 /、.勺 1 2.5 万；弟 5 日以約 i : 1〇、i : 25、丄：5〇或 1 : _ 之比例添加額外粒子至細胞，於第7日為丨：1〇、1 :乃、1 . 86387 -56- 200403340 5〇iU:H)0 以及第 9 日為 1:10、1:25、1:5〇或1:1〇〇。一特定具體實施例中，刺激之第丨日，粒子對細胞比為ι:ι，以及於刺激之第3曰及第5日調整至i : 5。另一具體實施例中’粒子係以每日或每隔一日為基準添加至最終比例，第丄日為^ i，刺激之第3曰及第5日為1: 5。另—具體實施例中，刺激第1日之粒子對細胞比為2:丨，刺激之第3日及第5 日調整至1: U)。另一具體實施例中，粒子係以每日或每隔 -日為基準添加至最終比例’約日為i :卜刺激之第3日及第5日為1 : 10。熟諳技藝人士了解多種其他比例適合用於本發明。特別比赌依據粒子大小及細胞大小之類型改變。本發明d面係基^出乎意外地發現使用不同珠粒：細胞比，就抗原特異性T細胞之擴大而言可獲得不同結果。特別，珠粒：細胞比可經改變而選擇性擴大或刪除抗原特異性（記憶）τ細胞。-具體實施财，使用之特定珠粒：細胞比可選擇性刪除抗原特異性Τ細胞。特別高珠粒：細胞比例如約 5 …1〇 …15小2〇:1、25:1、3〇:135: 刪除。不欲受任何特定理論所限，相㈣原特異,口細胞係對進-步刺激敏化。使用高珠粒：細胞比刺激可提供高濃度刺激性抗體’結果導致抗原特異性了細胞之過度刺激，造成抗原特異性T細胞經由細胞洞亡或其他機轉而死亡。如此就此方面而言’此處所述珠粒組合物係作為前驅細胞调亡組合物。此外就此方面而言，如熟諳技藝人士已知，若干

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具fa貝犯例中，用作為前驅細胞凋亡組合物之相同組合物 (例如附著有作用劑可刺激細胞表面部分之表面，例如此處所述珠粒組合物）用來擴大其餘細胞群供用於此處所述之多種免疫治療计畫。使用較低珠粒：細胞比，對抗原特異性T細胞提供之刺激信號未過度刺激，反而謗生抗原特異性 T細胞快速增生。又一具體實施例中，使用特定珠粒：細胞比選擇性擴大抗原特異性τ細胞。熟諳技藝人士了解只要可出現所需擴大或刪除，則可使用任一種比例。因此此處所述組合物之方法可用來擴大特定τ細胞群，或刪除特定τ細胞群，用於此處所述之多種免疫治療計畫。

使用若干方法’經由於約7日至約14日後由刺激分離τ細胞，可優異地於Τ細胞群之初次刺激及活化後長時間維持τ 細胞群之刺激。經由檢查Τ細胞大小或測量Τ細胞容積（例如使用庫特氏（Coulter)計數器）定期（每日）監控τ細胞增生速率。就此方面而言，休眠T細胞之平均直徑約6.8微米，於刺激作用配位子存在下，經初步活化及刺激後，至第4日時，T細胞平均直徑增加至超過12微米，而於約第6日時τ 細胞平均直徑開始縮小。當平均Τ細胞直徑縮小至約8微米時，Τ細胞可重新活化及重新刺激來誘生τ細胞的進一步增生。另外，Τ細胞增生速率及Τ細胞再度刺激時間可經由檢驗細胞表面分子（例如00154、0054、€025、00137、〇〇134, 其謗生於活化Τ細胞之分子）之存在加以監視。為了誘生CD4+及/或CD8+T細胞群之長期刺激，需要使用刺激劑，例如抗CD3抗體或抗CD28抗體[例如Β-Τ3、 86387 -58 - 200403340 XR-CD28(戴爾康，法國貝桑松）]再度活化及再度刺激丁細胞數次，來獲得CD4+或CD8 +細胞數目之增加為原先丁細胞群數目之约10倍至約1，000倍。例如本發明之一具體實施例中，T細胞係如所述刺激2-3次。又一具體實施例中，τ細胞如所述刺激4或5次。使用本方法，比較於刺激前，可達成τ 細胞數目之多株性增加約1〇〇倍至約1〇〇,〇〇〇倍。此外，藉本發明方法擴大之Τ細胞可分泌相當濃度之細胞激素（例如 IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF及 TNF-α)至培養上清液。例如與使用IL-2刺激作比較，經由使用抗CD3及抗CD28共同刺激而擴大之CD4+T細胞，可分泌高濃至培養基。此等細胞激素可由培養上清液純化獲得，或培養上清液可直接用於維持細胞於培養。同理，藉本發明方法擴大之T細胞連同培養上清液及細胞激素可於活體内投予而支援細胞生長。一具體實施例中，使用抗CD3及抗CD28抗體共同制動於珠粒（3x28珠粒），進行τ細胞刺激經歷一段足夠讓細胞返回靜止態（低度增生或無增生）之時間（於初次刺激後約為8_ i4 日）。然後由細胞去除刺激信號，細胞經洗條及輸注回病人體。刺激期接受時，藉本發明方法讓細胞變成「可超謗發」，如實施例證實，超誘發係由細胞回應於抗原之能力、以及細胞驗證仿記憶表現型之能力獲得證實。如此當藉外生性再度刺激、或於輸注後於活體内藉抗原再度刺激時，活化的T細胞顯示強勁反應，該強勁反應係以獨特表現型性質為特徵’例如持續性CD 154表現、細胞激素產量增高等。 86387 -59- 200403340 於本發明之又一具體實施例，細胞如τ細胞組合經作用劑塗覆或經作用劑軛合之珠粒，隨後將珠粒與細胞分離，然後細胞經培養。又一具體實施例中，於培養前，經作用劑塗覆或輛合之珠粒於細胞並未分離，反而係共同培養。又一具體實施例中，珠粒及細胞首先藉施力濃縮，結果獲得細胞表面邵分接合，因此誘生細胞刺激及/或活化信號的極化。

舉例e之’當τ細胞為目標細胞群時，細胞表面部分係經由允許順磁性珠粒[該珠粒附著抗CD3及抗CD28抗體（3x28 珠粒）]接觸製備之T細胞而接合細胞表面部分。一具體實施例中，細胞（例如1〇4至1〇9 T細胞）與珠粒（例如DYNABEADS⑧ M-450 CD3/CD28順磁性珠粒，1 : 1比例）係於緩衝液且較佳為PBS(不含二價陽離子如鈣及鎂）組合。再度熟諳技藝人士了解可使用任一種細胞濃度。例如目標細胞於樣本中極罕見，僅占0.01%樣本，或整個樣本（亦即100%)構成感興趣之目標細胞。如此任一種細胞數目皆屬於本發明之範圍。若干具體實施例中，需要顯著減少粒子及細胞混合之溶劑（換 T之，提高細胞濃度）來確保細胞與粒子做最大接觸。例如一具體實施例中，使用約20億細胞/毫升之濃度。另一具體實施例中，使用大於1億細胞/毫升之濃度。其他具體實施例中，使用 1〇、15 ' 20、25、30、35、40、45或 50百萬細胞/毫升濃度。又另一具體實施例中，使用乃、80、85、90、 95或100百萬細胞/毫升之細胞濃度。又一具體實施例可使用 125或150百萬細胞/毫升濃度。使用高濃度結果導致細胞產 86387 -60- 200403340 量、細胞活化及細胞之擴大升高。此外，使用高細胞濃度允許捕捉微弱表現感興趣之目標抗原之細胞（例如CD28陰性T細胞）。此種細胞群有治療價值故希望獲得此種細胞群。例如使用高濃度細胞，允許更有效選擇CD8+ T細胞，否則通常CD8+T細胞之CD28表現微弱。相關具體貫施例中’希望使用較低濃度細胞。經由顯著稀釋T細胞與粒子混合，將粒子與細胞間之交互作用最小化。如此可選擇表現高量預定欲結合至粒子之抗原的該等細胞。例如CD4+ T細胞可表現較高濃度CD28，比稀釋濃度之CD8 T細胞可被更有效捕捉及刺激。一具體實施例中，使用之細胞濃度約為5 X 1〇6/毫升。其他具體實施例中，使用濃度為約1 X 1〇5/毫升至約1 X 1〇6/毫升，以及介於其間之任何整數值。細胞懸浮於其中之緩衝液可為任一種適合特定細胞類型之緩衝液。當利用某種細胞類型時，緩衝液可含有於處理過程維持細胞完好所需之其他成分，例如1 -5%血清。另一具體實施例中，細胞與珠粒可於細胞培養基組合。細胞與珠粒例如可藉旋轉、攪動或任何混合手段混合一段由1分鐘土數小時 < 時間。然後珠粒及細胞濃度藉一種力濃縮，例如置於磁場内渡縮。培養基以及未結合之細胞被去除，附耆於珠粒及其他表面之細胞例如藉脈動幫浦之泵送經洗然後再懸浮於適合供細胞培養之培養基。本毛明之一具體實施例中，混合物可培養30分鐘至數小時（、力3小時）至約14日，或介於其間之任何小時或分鐘整數 86387 -61 - 200403340

值。另一具體實施例中，混合物可培養21日。本發明之一具體實施例中，珠粒與T細胞共同培養約8日。另一具體實施例中，珠粒與T細胞共同培養2-3日。如前述，也需要數個刺激週期，故T細胞之培養時間為60日或60日以上。適合 T細胞培養條件包括適當培養基[例如最低必需培養基或 RPMI培養基 1640或 X-vivo 15(百歐惠克（Bio Whittaker))]培養基含有增生及存活需要之因子，包括血清（例如胎牛血清或人血清）或介白質-2(IL-2)、胰島素或任何其他熟諳技藝人士已知之細胞生長添加劑。培養基可包括RPMI 1640、 AIM-V、DMEM、MEM、α-ΜΕΜ、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo

20，含有添加胺基酸及維生素，可為不含血清或補充適量血清（或血漿），或經過界定之激素集合，及/或足夠供T細胞生長及擴大之定量細胞激素。抗生素如青黴素及鏈黴素僅涵括於實驗性培養，而未涵括於將輸注入個體體内之細胞培養。目標細胞係維持於支援生長所需條件，例如適當溫度（如37°C )及氣溫（例如空氣加5%二氧化碳）。本發明之一具體實施例中，珠粒：細胞比可經調整而獲得預定之T細胞表現型。一特定具體實施例中，可改變珠粒：細胞比來選擇性擴大或刪除抗原特異性（記憶體）T細胞。一具體實施例中，使用特定珠粒：細胞比來選擇性刪除抗原特異性T細胞。又一具體實施例中，使用特定珠粒：細胞比來選擇性擴大抗原特異性T細胞。熟諳技藝人士了解只要可進行抗原特異性T細胞之預定擴大或刪除，則任一種比例皆可使用。因此此處所述組合物及方法可用來擴大特 86387 -62- 200403340 定τ細胞群，或刪除特定τ細胞群供用於此處所述之任一種免疫治療計畫。另一具體實施例中，暴露於刺激劑例如抗CD3/抗CD28(亦即3x28)塗覆之珠粒之暴露時間可經修改或調整而獲得預定T細胞表現型。另外，預定τ細胞群可於刺激前使用任何數目之選擇技術來選擇。與CD8+胞毒性T細胞或調節性T細胞相反’因TH細胞之擴大將改良或恢復整體免疫反應性，故可能需要較大比例之助手Τ細胞（ΤΗ)—般而言為CD4+。雖然多項特定免疫反應係藉CD8 +抗原特異性Τ細胞媒介， CD8+抗原特異性Τ細胞可直接溶解或殺死目標細胞，但大部分免疫反應需要CD4+ Τ細胞的輔助，CD4+ Τ細胞可表現重要的免疫調節分子例如GM_CSF、CD40L及IL-2等。於CD4 媒介之輔助為較佳之處，如此處所述可保有或提升CD4 : CD8比例之方法有顯著效果。CD4+ T細胞數目增加，將增加被導入病人體内之細胞表現的CD40L之表現量，因而可改善目標細胞之存活（改進APC功能）。經由增加可表現 GM-CSF或IL-2之輸注細胞數目也可觀察得類似效果， GM-CSF或IL-2全部皆主要由CD4+ T細胞表現。另外於CD4 輔助需要減少，而需要較大量CD8+ T細胞之情況下，也可使用此處所述XCELLERATE™辦法，例如於刺激及/或培養前預先選擇CD8+細胞。此種情況可能存在於以較高濃度 IFN-γ或以目標細胞之細胞溶解增加為較佳之處。也可修改暴露於刺激劑之時間及類型來擴大具有預定TCR機能（例如表現預定V石族基因）之T細胞。 86387 -63- 200403340 為了執行不同T細胞族群之分離，可改變暴露於粒子之時間。例如較佳具體實施例中，可經由於3χ DYNABEADS⑧ Μ_450捭養一俨 . 培餐叙足夠陽性選擇預定ΊΓ細胞之土而刀離Τ細胞。一具體貫施例中，該段時間約為％分 4里。又-具體實施例中，該段時間至少為卜23、4、$或 6小時。又另—較佳具體實施例中，該段時間為⑺至24小時或J時以上。-較佳具體實施例中，培養時間為^小時。為了由癌症病人分離Τ細胞，使用較長培養時間例如24小時培養時間，可提高細胞產量。右干具體實施例中，刺激及/或擴大時間可為週或以下、8週或以下、4週或以下、2週或以下、1〇日或以下、或 8曰或以下[4週或4週以下包括由4週至lg(24小時）之任何時間、或介於此等數目間之任何數值]。若干具體實施例中’可能需要使用例如限騎釋或細胞分類來轉殖丁細胞，其中需要較長刺激時間。若干具體實施例中，刺激及擴大可進行6日或以下、4日或以下、2日或以下，其他例中，可進行短至24小時或以下且較佳4·6小時或以下（此等範圍包括介於其間之任何整數值）。當丁細胞之刺激進行較短時間時’ Τ細胞群數目不會劇增，反而丁細胞群需要更強勁更健康的活化Τ細月包來於活體内持續增生，且更密切類似天然效應物Τ細胞匯集物。因τ細胞援助之是否可取得經常是對蛋白貝杬原之抗體反應為限制因子，故可於活體内選擇性擴大或選擇性輸注富含CD4+之Τ細胞群至活體極為有益。此種豐冨族群之額外效果顯然易知，可辨識Β淋巴細胞呈現之抗 86387 -64 - 200403340 原的I活化之助手τ細胞可傳遞兩型刺激，亦即實體接觸刺激以及製造細胞激素刺激，結果導致Β細胞的增生與分化。各具體貫施例中，熟諳技藝人士了解由細胞去除刺激信號係與使用的細胞類型有關。例如若使用順磁性珠粒，則磁性分離為可行之㈣。分離技術之細節係由順磁性珠粒製造商之指示說明（例如待諾公司，挪威奥斯陸）。此外，若表面為珠粒，该珠粒夠大而可與細胞分離，則也可使用浸 /門此外可利用多種輸血過濾器，包括2〇微米及8〇微米輸血，濾器（巴司特）。如此只要珠粒之篩目尺寸係大於過滤器 <篩目尺寸，則浸潤高度有效。相關具體實施例中，珠粒 :通過過it器’但細胞可能留下’如此允許細胞與珠粒的为離一特疋具體實施例中，使用之生物相容表面於暴露期間於培養中分解（亦即可生物分解）。雖然此處所述方法使用之抗體易由公開來源例如美國種型培養收集會（ATCC)獲得，但T細胞附屬分子抗體及CD3複合物也可藉標準技術獲得。本發明方法用來產生抗體供本發月方法使用之方法為業界眾所周知，容後詳述。配位子制動於表面如則述’本發明方法較佳係使用配位子結合至—表面。孩表面可為任何有配位子結合或整合之表面，且為生物相谷表面，換言之，對欲刺激之目標細胞實質上無毒。生物相容表面可為可生物分解表面或非可生物分解表面。天然表面或合成表面，合诸矣口成表面可為聚合物。表面膠原、經純化之|口、③、4化之胜肽、多醣、糖胺基聚 86387 -65- 200403340 糖、胞外基質組合物、微脂粒或細胞表面。多醣包括例如纖維素、瓊脂糖、葡萄聚糖 '幾丁聚糖、玻尿酸或藻蛋白酸鹽。其他聚合物包括聚酯類、聚醚類、聚酐類、聚燒基氰基丙烯酸酯類、聚丙晞醯胺類、聚原酸酯類、聚磷腈類、聚乙酸乙婦酯類、嵌段共聚物、聚丙晞、聚四氟乙稀（PTFE) 或聚胺基甲酸酯類。聚合物可為乳酸或共聚物。共聚物包含乳酸及乙醇酸（PLGA)。非可生物分解表面包括聚合物例如聚（一甲基珍氧i坑）及聚（乙缔-乙酸乙晞酉旨）。生物相容表面包括例如玻璃（如生物玻璃）、膠原、幾丁質、金屬、輕基磷灰石、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、玻尿酸聚合物、藻蛋白敌鹽、丙知叙酿聚合物、乳酸聚合物、乙醇酸聚合物、乳酸/乙醇酸聚合物、純化蛋白質、純化胜肽或胞外基質組合物。其他組成表面之聚合物包括玻璃、矽氧、矽、羥基磷灰石、水凝膠類、膠原、丙烯醛、聚丙烯醯胺、聚丙烯、聚苯乙晞、尼龍或任何數目之塑膠或合成有機聚合物等。表面包含生物結構如微脂粒及細胞表面。表面可呈脂質、板、袭、丸粒、纖維、篩網或粒子形式。粒子包括膠體粒子、微球、奈米粒子、珠粒等。各具體實施例中，商業上可取得 < 表面例如珠粒或其他粒子可使用（例如米天易粒子，米天易生技公司，德國；希法羅斯（Sephar0se)珠粒，瑞典法瑪西亞精細化學品公司；DYNABEADSTM，待諾公司紐約；PURABEADS™，波美提克生科公司）。當使用珠粒時，珠粒可為任何可執行目標細胞刺激之尺寸。-具體實施例中，珠粒大小較佳為約5奈米至約5〇〇微 86387 -66- 200403340 如此珠粒尺寸之選擇係依據珠粒之特定用途決定。例 ^若珠粒用於耗用單核細胞時，選用小尺寸來辅助單核細胞的攝入（例如10微米及4.5微米直徑或任何可被吞嗟的尺、〗4 'τ、米大小）’但當需要藉過濾分離珠粒時，典型使用不小於5G微米之珠粒大小。此外，當使用順磁性珠粒時，、土尺寸為約2.8微米至約50〇微米及更佳約2·8微米至約5〇微米。冑後可選擇使用小至約1〇·5奈米之超順磁奈米粒子。如此由前文討論顯然易知實質上可利用任一種粒子大小。、作用劑可藉業界已知且可利用之多種方法附著、結合於:偶合於或整合於一表面。4乍用劑可為天然配位子、蛋白貝配位子或合成配位子。附著可為共價或非共價、靜電或4水\且可藉多種附著手段達成包括例如化學、機械、子靜％手#又或其他手段，因而配位子可刺激細胞。作用d之附著可為直接或間接（例如繫繩）。例如對一種配位子之抗體首先附著於表面（直接附著）；或抗生物素或鍵絲菌抗生物素或可結合至第一抗體及第二抗體可附著至該表面供結合至生物素化配位子（間接附著）。至於細胞表面，附著可使用業界已知之任—種技冑’透過作用劑之基因表現達成，例如包含感興趣作用劑之編碼區之表現載體進行轉移感染或轉導等技術。對該配位子之抗體可透過抗特異基因型抗而附著於表面。另一實施例包括使用蛋白質A或蛋白質G或其他非特異性抗體結合分子附著於表面來結合抗體。另外，配位子可藉化學手段例如使用市售交聯劑（皮爾 86387 -67- 200403340 斯（Pierce)，伊利諾州洛克福）交聯至表面或其他手段而附著於表面。若干具體實施例中，配位子係共價鍵結至表面。此外，一具體實施例中，市售甲苯磺酸基活化DYNABEADStm 或具有環氧基-表面反應基之DYNABEADStm係根據製造商之指示而與感興趣之多肽配位子共同培養。簡言之，此種培養條件典型涉及於4°C至37°C於pH 4至pH 9.5之磷酸鹽缓衝液培養。

一方面，作用劑例如某些配位子可為單一來源或多重來源，且可為抗體或抗體片段；另一方面當利用T細胞時，辅刺激配位子為B7分子（例如B7-1、B7-2)。此等配位子係藉前文討論之任一種不同附著手段而偶合至表面。欲偶合至表面之B7分子可由可表現輔刺激分子之細胞分離，或使用標準重組DNA技術及表現系統獲得，該重組DNA技術及表現系統允許製造及分離此處所述之輔刺激分子。也可使用當偶合至細胞表面時，保有觸發T細胞之辅刺激信號能力之 B7分子片段、突變株或變異株。此外，熟諳技藝人士了解任一種可用於活化及誘生T細胞子集增生之配位子也可制動於珠粒或培養容器表面或任何表面。此外，雖然配位子共價結合至表面為較佳方法，但也可使用藉二次單株抗體吸附或捕捉等方法。附著於表面之特定配位子量於表面為珠粒表面時方便藉流量細胞計量分析測定；或當表面為組織培養皿、篩網、纖維、袋（舉例）時，附著於表面之特定配位子量方便藉酶連結免疫吸附檢定分析（ELISA)測定。特定具體實施例中，B7分子之刺激形式或抗CD28抗體或 86387 -68- 200403340 其片段附著於可刺激TCR/CD3複合物之作用劑（例如抗CD3 抗體之相同固相表面上。除了抗CD3抗體外，也可使用可結合至模擬抗原信號之受體之其他抗體。例如珠粒或其他表面可塗覆以抗CD2抗體與B7分子的組合，特別塗覆於抗 CD3抗體及抗CD28抗體。

當作用劑偶合至表面時，作用劑可偶合至同一表面（亦即「順式」形式）或偶合至分開表面（亦即「反式」形式）。另外，一種作用劑可偶合至一表面，而其他作用劑係於溶液。一具體實施例中，提供輔刺激信號之作用劑結合至細胞表面，而提供一次活化信號之作用劑係呈溶液或偶合至一表面。較佳具體實施例中，二作用劑係制動於珠粒上，可制動於同一珠粒亦即「順式」或制動於分開珠粒亦即「反式」。

例如提供一次活化信號之作用劑為抗CD3抗體，而提供辅刺激信號之作用劑為抗CD28抗體；二作用劑係以等分子量共同制動於同一珠粒上。一具體實施例中，使用1 : 1比例之各抗體結合至珠粒供CD4+ T細胞擴大及T細胞生長。於本發明之某些方面，使用抗CD3 : CD28抗體結合至珠粒比係可觀察得比較使用1 : 1比例時觀察得之T細胞擴大，前者比例之T細胞擴大更為增加。一特定具體實施例中，比較使用 1 : 1比例觀察得之擴大，前者觀察得增加約0.5倍至約3倍。一具體實施例中，結合至珠粒之CD3 : CD28抗體比為100 : 1至1 : 100，以及介於其間之任何值。本發明之一方面，結合至粒子之抗CD28抗體比抗CD3抗體更多，亦即CD3 : CD28 比值小於1。若干本發明之具體實施例中，結合至珠粒之抗 86387 -69- 200403340

CD28抗體對抗CD3抗體之比係大於2: 1。一特定具體實施例中，使用1 : 200 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。一特定具體實施例中，使用1 : 150 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。一特定具體實施例中，使用1 : 100 CD3 : CD28 結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 75 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。又一具體實施例中，使用1 : 50 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 45 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 40 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 35 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 30 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 25 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 20 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 15 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。一較佳具體實施例中，使用1 : 10 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 5 CD3 ·· CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 4 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。另一具體實施例中，使用1 : 3 CD3 : CD28結合至珠粒之抗體比例。又另一具體實施例中，使用3 ·· 1 CD3 ·· CD28結合至珠粒之抗體比例。表面結合劑本發明預期涵蓋之作用劑包括蛋白質配位子、天然配位子及合成配位子。可結合至細胞表面部分以及於某些條件 86387 -70- 200403340

下引發接合及聚集而結果導致發訊之作用劑包括（但非限制性）植物凝集素（例如植物血液凝集素（PHA)、扁豆植物凝集素、刀豆球蛋白A)、抗體、抗體片段、胜肽、多肽、糖肽、受體、B細胞受體配位子及T細胞受體配位子、MHC-胜肽二元體或四元體、胞外基質成分、類固醇、激素（例如生長激素、糖皮質固醇、前列腺素、四破甲狀腺素）、細菌性部分（例如脂多醣類）、有絲分裂原、超抗原及其衍生物、生長因子、細胞激素、黏著分子（如L-選擇素、LFA-3、CD54、 LFA-1 )、化學激素及小分子。作用劑可由天然來源如細胞、血液製品之組織分離，由於活體内繁殖的細胞分離，藉重組製備，藉化學合成製備，或藉熟諳技藝人士已知之其他方法製備。

於本發明之一方面，當希望刺激T細胞時，有用作用劑包括可結合CD3/TCR複合物、CD2及/或CD28且分別引發活化或增生之配位子。如此，配位子一詞包括細胞表面蛋白如 C D 2 8之B 7分子之「天然」配位子，以及人工配位子例如針對細胞表面蛋白之抗體。此種抗體及其片段可根據習知技術製造，例如融合瘤方法及重組DNA之蛋白質表現技術。有用抗體及其片段可衍生自任何種屬包括人類，或可形成為嵌合體蛋白質，採用得自多於一種屬之序列而形成後合體蛋白質。業界人士已知方法可用來生成抗體、多株抗血清、或對一種配位子有特異性之單株抗體。抗體也可製造成具有預定性質之經過基因工程處理之免疫球蛋白（Ig)或Ig片段。例 86387 -71 - 200403340

如舉例言之但非限制性，抗體包括重組IgG，其為一種嵌合體融合蛋白質，具有得自第一種哺乳類之可變（V)區領域、以及得自第二種不同哺乳類之至少一恆定區領域。最常見，嵌合體抗體具有鼠可變區序列及人恆定區序列。此種鼠/人嵌合體免疫球蛋白可被「人化」，人化方式係將衍生自鼠抗體之互補決定區CDRs(提供抗原之結合特異性）接枝至人衍生V區骨架區以及人衍生恆定區。含有具有不同特異性之CDRs之抗體也可組合而生成多重特異性（二特異性或三特異性等）抗體。此等分子片段可經由蛋白質分解消耗產生，或選擇性地經由蛋白質分解消化接著為溫和還原雙硫鍵及烷化而產生，或經由重組基因工程技術而產生。

抗體若以親和常數Ka大於或等於約104 NT1，較佳大於或等於105 M·1，更佳大於或等於約106 NT1，以及又更佳大於或等於約ΙΟ7 ΝΓ1之親和常數特異性結合至抗原，則該抗體定義為「免疫特異性」。結合對偶或抗體之親和力易使用習知技術測定，如Scatchard等人（美國紐約學術科學年報51 : 660，1949)或表面質粒基因體共振（百歐可（BIAcore)，生物感測器公司，紐澤西州匹茲卡威）（參考Wolff等人，癌症研究，53 ·· 2560-2565，1993)所述技術方便測定。抗生素通常係藉熟諳技藝人士已知之任一種技術製備 (例如參考Harlow等人，抗生素：實驗室手冊，1988年，冷泉港實驗室）。於其中一項技術，動物使用配位子作為抗原免疫接種而產生多株抗血清。適當動物包括兔、羊、山羊、豬、牛，也包括小型哺乳類如小鼠、大鼠及倉鼠。本發明 86387 -72- 200403340 抗體也可如美國專利案所述生成：6，150,584，6，130,364， 6，114,598，5,833,985，6,071，517，5,756,096，5,736，137及 5,837,243 °

免疫原係由可表現配位子、經純化或經部分純化之配位子多肽或其變異株或片段或配位子胜肽之細胞組成。配位子胜肽可藉蛋白質分解裂解或藉化學合成生成。免疫接種胜肽可根據熟諳技藝人士已知方法分析配位子之一次、二次或三次結構選定，俾決定於宿主動物體較為可能產生抗原性反應之胺基酸序列（例如參考Novotny，分子免疫28 : 201-207，1991 ; Berzoksky，科學 229-932-40，1985)。

免疫原之製備包括配位子多肽或其變異株或片段之共價偶合或胜肽偶合至另一種免疫原性蛋白質例如鎖孔蜞血藍質或牛血清白蛋白。此外，胜肽、多肽或細胞可於佐劑乳化（參考Harlow等人，抗體：實驗室手冊，1988年冷泉港實驗室）。通常於初次注射後，可根據對該種動物之較佳計畫時程而接受一或多劑追加接種。免疫反應可經由動物定期採血，分離血清，於免疫檢定分析（例如烏特洛尼 (Ouchterlony)檢定分析）分析血清評估特異性抗體力價而監視免疫反應。一旦確定抗體力價，則動物可定期採血收集多株抗血清。然後可特異性結合至配位子多肽或胜肽之多株抗體例如可經由使用蛋白質A、或經由使用配位子多肽或胜肽偶合至適當固體撐體進行親和層析術而由此種抗血清純化多株抗體。可特異性結合配位子多肽或其片段或變異株之單株抗體 86387 -73- 200403340 例如可使用 Kohler 及 Milstein(自然，256 : 495-497，1975 ；

歐洲免疫期刊6: 511-519, 1976)之技術及其改良技術製備。融合瘤，為永生真核細胞系，可製造對配位子多肽或其變異株或片段具有預定特異性之抗體。動物（例如大鼠、倉鼠或較佳小鼠）使用如前述製備之配位子免疫原免疫接種。類淋巴細胞最常見為脾細胞係得自經免疫接種的動物，類淋巴細胞可經由融合經過藥物敏化之骨髓瘤細胞融合對偶與經過免疫接種動物同基因之細胞融合對偶而變成永生。脾細胞與骨髓瘤細胞可與膜融合促進劑（如聚乙二醇或非離子性清潔劑）組合數分鐘，隨後以低密度接種於可支援融合瘤細胞生長而非支援骨髓瘤細胞生長之選擇性培養基。較佳選擇性培養基或HAT(次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺甞）。經過一段足夠時間通常約1至2週後，觀察得細胞群落。分離單一群落，細胞產生之抗體可測試其對配位子多肽或其變異株或片段之結合活性。以可產生對配位子抗原具有高度親和力及特異性之抗體之融合瘤為佳。可產生單株抗體，該單株抗體可特異性結合至配位子多肽或其變異株或片段，可產生該種單株抗體之融合瘤也涵蓋於本發明之範圍。單株抗體可分離自融合瘤培養。鼠單株抗體之另一種製造方法係將融合瘤細胞注入同基因小鼠腹腔。小鼠製造含單株抗體之腹水。污染物可藉習知技術例如層析術、凝膠過濾、、沈澱、萃取等技術而由抗體分離。人單株抗體可藉多項技術產生。該等方法包括（但非限制性）伊普斯坦巴爾病毒（Epstein Barr Virus)(EBV)轉形人類周 86387 -74- 200403340

邊血球（例如參考美國專利第4,464,456號），試管内免疫接種人類B細胞（例如參考Boerner等人，免疫學期刊147 : 86-95， 1991)，得自攜帶人類免疫球蛋白基因之經過免疫接種的轉移基因小鼠之脾細胞融合，以及得自攜帶免疫球蛋白基因之經過免疫接種之轉移基因小鼠脾細胞由酵母人工染色體 (YAC)融合（例如參考美國專利第5,877,397號；Bruggemann 等人，流行生技觀點8 : 455_58，1997 ; Jakobovits等人，美國紐約學術科學會年報764 : 525-35，1995)，或由人類免疫球蛋白V區噬菌體存庫分離。

可製造可供本發明使用之嵌合體抗體及人化抗體。嵌合體抗體具有至少一個衍生自第一種哺乳類之恆定區領域、以及至少一個衍生自第二種不同哺乳類之可變區領域（例如參考Morrison等人，美國國家科學院議事錄，81 : 6851-55，1984)。最常見嵌合體抗體係經由下述方式組成，經由將編碼至少一個衍生自非人單株抗體之可變區領域 (例如衍生自鼠、大鼠或倉鼠單株抗體之可變區）之多核甞酸序列轉殖入載體組成，該載體含有編碼至少一個人恆定區序列（例如參考Shin等人，酶學方法，178 : 459-76，1989 ; Walls等人，核酸研究21 ·· 2921-29，1993)。選用之人恆定區係依據對特定抗體預定之效應物功能決定。業界已知產生嵌合體抗體之另一方法為同源重組（美國專利第 5，482,856號）。較佳載體將轉移感染真核細胞供穩定表現嵌合體抗體。非人/人嵌合體抗體可進一步藉基因工程處理而生成「人 86387 -75- 200403340 化」抗體。此種抗體具有複數個衍生自非人哺乳類之免疫球蛋白之多種CDRs，至少一種人可變骨架區，至少一種人免疫球蛋白恆定區。比較非人單株抗體或嵌合體抗體，人化獲得有較低結合親和力之抗體。因此熟諳技藝人士使用一或多項方案來設計人化抗體。

於若干具體實施例中，使用抗體之抗原結合片段為較佳。此等片段包括Fab片段或F(ab’)2片段，其分別可經由使用木瓜酶或胃蛋白酶進行蛋白質分解消化製備。抗原結合片段可藉親和層析術而由F c片段分離，該親和層析術例如使用經過制動之蛋白質A或經制動之配體多肽或其變異株或片段。另一種產生Fab片段之方法包括於烷化後溫和還原 F(aV)2片段（例如參考Weir，實驗免疫學手冊，1986年，布萊克威（Blackwell)科學公司，波士頓）。

前述任一種Ig分子之非人、人或人化重键及輕鏈可變區可組成為單鏈Fv(sFv)片段（單鏈抗體）。例如參考Bird等人，科學242 : 423-426，1988 ; Huston等人，美國國家科學院議事錄85 : 5 879-5 883，1988。多官能融合蛋白質可經由連結編碼sFv合規架構多核苷酸序列與編碼多種效應物蛋白質之多核苷酸序列而產生。此等方法為業界已知且揭示於例如EP-B1-0318554，美國專利第5，132,405號，美國專利第 5,091，513號，及美國專利第5,476,786號。選擇可特異性結合至配位子多肽或其變異株或片段之抗體之另一種方法係藉噬菌體顯示（例如參考Winter等人，免疫综論年報12: 433-55, 1994; Burton等人，進階免疫學57 : 86387 -76- 200403340

191-280，1994)。人或鼠免疫球蛋白可變區基因組合存庫可於噬菌體載體形成，該存庫可經篩檢而選擇Ig片段（Fab、 Fv、sFv、或其多元體片段），其特異性結合至配體多肽或其變異株或片段（例如參考美國專利第5,223,409號；Huse等人，科學246 : 1275-81，1989 ; Kang等人，美國國家科學院議事錄88 : 4363-66，1991 ; Hoogenboom等人，分子生物學期刊 227 : 381-388，1992 ; Schlebusch等人，融合瘤 16 : 47-52，1997以及其中引述之參考文獻）。使用方法

通常，此處所述組合物之方法可用來由免疫細胞群去除至少部分非期望之純株細胞群，典型為T細胞、B細胞、NKT 或NK細胞。本發明進一步提供一種組合物包含不再含有非期望細胞之細胞群，或具有顯著較少非期望細胞之細胞群及其用途。本發明之組合物及方法也可用於選擇性擴大已經刪除非期望之純株群之細胞群供用於治療與造血幹細胞移植相關之免疫機能障礙（包括得自包括血液、脊索血液及骨髓之同種異基因移植以及自體移植）、器官移植相關之免疫機能障礙（例如急性或慢性GVHD)以及自身免疫病，包括由癌症如大粒狀淋巴細胞（LGL)白血病、慢性淋巴球性白血病（CLL)引起的自身免疫病，或經由常見可變免疫機能障礙引起的自身免疫病。結果以T細胞為例，可產生一細胞群，該細胞群表現TCRs就抗原反應性而言為多株，但就CD4+或 CD8+而言為均質，該細胞群已經不含任何非期望之細胞亞群，例如自體反應性細胞或同種異基因反應性細胞。就B 86387 -77- 200403340 細胞而言，可產纽細胞群，其不含任何可產生自體反應性抗體之非期望B細胞亞群。此外，該方法允許所得τ細胞或 Β細胞群之數目擴大至足夠重新構成個別總CD4+ τ細胞群或CD8+ T細胞群細胞群（個體之淋巴細胞群約為5 X 1011細胞）。所得細胞群也可使用多種熟諳技藝人士已知技術進行基因轉導，且用於免疫治療。一具體實施例中，本發明之τ細胞或B細胞組合物可用於 2血幹細胞移植。造血幹細胞移植之重大問題為移植片對宿王病（GVHD)，GVHD係因存在於輸注的造血幹細胞製劑的同種異基因T細胞所引起。如此本發明可用來去除同種異基因反應性T細胞，且擴大其餘τ細胞群供輸注病人體内。本發明^組合物可單獨使用或結合其他治療使用。八把見知例中，本發明之τ細胞或Β細胞組合物可用於自身免疫病。自身免疫病例如包括（但非限制性）系統 I工斑性狼瘡（SLE)、多發性硬化（⑽）、類風濕性關節炎、進行性系統性硬化、修格連氏症候群、多發性硬化、多發性肌火、皮肌炎、葡萄膜炎、關節炎、第I型胰島素依賴型糖尿届冑本氏甲狀腺炎、葛雷夫氏甲狀腺炎、重症肌無 2自身免疫性錢炎、血管炎、惡性貧血、自身免疫性 f貧血、♦發|不全症候群、伊凡氏症候群、漸滚人_群1位性皮膚炎、乾癖、貝契特氏（Beheh叫症候群、克隆氏病、膽汁型硬化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、古德巴斯特氏症候群、韋吉納氏肉芽腫病、陣發型夜間血 θ瞍發同不全症候群、過敏病症如乾草熱、外因性氣 86387 -78- 200403340 喘、或昆蟲叮咬或刺螫過敏及食物及藥物過敏。

本發明之T細胞及B細胞組合物之進一步用途包括治療及 /或預防··發炎性及高度增生性皮膚病以及免疫媒介病之皮膚表徵，例如脂漏性皮膚炎、血管水腫、紅斑痤瘡及局部禿髮；多種眼病（自身免疫或其他）；過敏反應例如花粉過敏、可逆性阻塞性呼吸道疾病包括氣喘（例如支氣管氣喘、過敏性氣喘、内因性氣喘、外因性氣喘及粉塵性氣喘），特別慢性或痼疾性氣喘（例如末期氣喘及呼吸道高度反應性）、支氣管炎、過敏性鼻炎等病症；黏膜及血管發炎。如前述，本發明之T細胞及B細胞組合物可用於治療器官移植關聯之免疫機能障礙，例如宿主對移植片病。任何器官移植相關之免疫機能障礙治療預期皆涵蓋於此處。例如本發明方法及細胞可用於治療腎、心肺及肝移植關聯之免疫機能障礙。

若干本發明之具體實施例中，本發明細胞係於使用藥劑處理後投予病人，該等藥劑例如化學治療、放射線治療、免疫抑制劑如環孢靈、亞哲席平、美索崔赛、黴酚酸鹽及 FK506 ;抗生素；或其他免疫去除劑如CAMPATH、抗CD3 抗體、塞克伏伐麥、福達拉賓、環孢靈、FK506、拉帕黴素 (rapamycin)、黴盼酸、類固醇、FR901228、及光照。此等藥物可抑制約依賴型磷酸酶卡西紐林（calcineurin)(環孢靈及FK506)或抑制p70S6激酶，該激酶對生長因子謗導發訊相當重要（拉帕黴素）（Liu等人，細胞66 : 807-815，1991 ; Henderson等人，免疫 73 : 316-321，1991 ; Bierer等人，流 86387 -79- 200403340 行免疫觀點5 : 763-773，1993 ; Isoniemi(參見上文））。又一具體實施例中，本發明細胞組合物係於使用化學治療劑或抗體進行T細胞去除治療後，投予患有自身免疫病病人，該化學治療劑例如為福達拉賓、外部射束韓射治療（XRT)、塞克伏伐麥；或抗體例如OKT3或C AMPATH。另一具體實施例中，本發明細胞組合物係於B細胞去除治療例如CD20反應劑如里凸桑（Rituxan)後，投予患有自身免疫病病人。前述治療劑量係依據接受治療之疾病本質以及治療接受者而改變。供人體投藥之劑量調整可根據業界可接受之規範進行。例如CAMPATH劑量用於成年病人通常為1至約100毫克，通常係每日投藥經歷1至30日。較佳劑量為每日1至10 毫克，但若干例中可使用高達每日40毫克之較大劑量（述於美國專利第6，12〇,766號）。於本發明之又一方面，使用本發明方法於試管内由病人體去除至少實質部分之自體反應性細胞，然後進一步刺激及擴大且投予病人。相關具體實施例中，使用本發明方法於試管内去除至少實質部分之得自病人的自體反應性細胞，然後投予病人且於活體内擴大。本發明組合物可結合業界可利用之其他治療供治療自身免疫病，也構成本發明之一方面。一具體實施例中，T細胞可如此處所述刺激及擴大而於造血幹細胞移植相關治療結果之免疫受損個體謗生或提升反應性。本發明提供於接受造血幹細胞移植病人降低GVHD 不良影響風險或嚴重程度之方法，包含對病人投予本發明 86387 -80- 200403340 細胞群。一特足具體實施例中，存在於捐贈者造血幹細胞〈至少實質部分之同種異基因反應性細胞可藉本發明方法去除。又-具體實施例中，本發明之仏胞組合物係於使用化學治療劑治療後投予接受造血幹細胞移植病人。又一血幹細胞移植也構成本發明之予 G-CSF、IL-2、IL-11、IL-7、具體實施例中，得自捐贈者骨髓之至少實質部分之同種異基因反應性細胞於試管内使用本發明方法去除，然後進一步刺激及擴大，以及然後投予病人。又—具體實施例中，得自捐贈者骨髓之至少實質部分之同種異基因反應性細胞於試管内使用本發明方法去除，然後投予病人^於活體内擴大。本發明組合物可組合業界可利用之其他治療用於造一方面，其他治療例如為投 IL-12及抗病毒治療。 -具體實施例中，Τ細胞可如此處所述刺激及擴大而於因器官移植（包括但非限制性，腎、心、肺及肝移植）關聯治療結果導致免疫受損個體誘生或提升反應性。一特定具體實施例中’存在於接受者體内之至少實質部分之同種異基：反應性細胞可藉本發明方法去除H本發明提供降低器官排斥風險或嚴重度之方法。又—具㈣施财，本發明之Τ細胞組合物投予使用化學治療劑治療後接受器官移植病人。又-具體實施例中，至少實質部分得自移植接受者之同種異基因細胞使用本發明方法於試管内去除，進— 步經刺激及擴大然後投予病人。本發明組合物可組合業界可利用之其他，口療用於奋官移植係涵括於本發明之範園。本發明 < 另一具體實施例提供一種由CD4+ Τ細胞群選擇 86387 -81 - 200403340 性擴大TH1細胞群之方法。此種方法中，CD4+ T細胞使用抗 CD28抗體（如單株抗體9.3)共同刺激，誘生TH1特異性細胞激素（包括IFN-γ)的分泌，結果TH1細胞比TH2細胞含量更豐富。

本發明進一步提供一種選擇性擴大得自CD4+ T細胞之 Th2細胞群之方法。此種方法中，CD4+ T細胞使用抗CD28 抗體（如單株抗體B-T3、XR-CD28)共同刺激，謗生TH2特異性細胞激素的分泌，結果導致TH2細胞比TH1細胞更豐富（例如參考Fowler等人，血液1994年11月15曰；84(10) : 3540-9 ; Cohen等人，汽巴基金會研討會1994 ; 187 : 179-93)。本發明進一步提供使用本細胞組合物組合調節T細胞之方法。調節T細胞可使用業界已知技術產生，例如述於Woo 等人，免疫學期刊2002年5月1日；168(9) : 4272-6 ; Shevach， Ε·Μ·，免疫综論年報2000，18 : 423 ; Stephens等人，歐洲免疫學期刊 2001，31 : 1247; Salomon等人，免疫2000, 12 : 431 ;以及Sakaguchi等人，免疫综論2001，182 : 18。

本發明進一步提供一種選擇性擴大可表現特定V /5、 Va、Vy、或νδ基因之T細胞群之方法。例如此種方法中，可表現特定、Va、νγ、或νδ基因之Τ細胞經過陽性或陰性選擇，然後進一步根據本發明方法擴大/刺激。另外，可表現特定感興趣之V沒、Va、νγ、或νδ基因之經過刺激且經擴大之Τ細胞可經陽性或陰性選擇，以及進一步接受刺激及擴大。另一例中，直接由病人抽血入孤立拋棄式裝置，裝置含有敏化組合物及/或兩種或兩種以上制動抗體（例如抗CD3 86387 -82- 200403340 及杬CD28)或其他成分來刺激τ細胞活化所需的受體，隨後將細胞投予該病人個體（例如制動於塑膠表面上，或制動於可分離之微粒上）。一具體實施例中，拋棄式裝置包含容器 (如塑膠袋或燒瓶）具有適當管路連結，且適合供組合/對接注射器及無菌對接裝置。此種裝置含有可供制動以胞活化成分（例如抗CD3及抗CD28抗體）用之固體表面；可為容器本身或插入件表面，典型為平坦表面、經蝕刻之平坦表面、不規則表面、多孔㈣、纖維臨床上可接受#全之含鐵流體、珠粒等。此外，當使用孤立裝置時，病人可能維持連結於裝置，或將裝置與病人體分開。此外，裝置可於室溫使用’或使用攜帶型孵育器而於生理溫度孵育。因收集及處理血液及血液製品之裝置及方法為眾所周知，熟諳技藝人士由此處教示容易了解方便設計或修改現有裝置來獲得可滿足前述需求之多種裝置。如此一裝置及方法非受此處陳述之特定具體實施例所限，反而包括任一種裝置或方法其可維持無菌，可維持血液呈流體，其中互補活化減少，以及其中T細胞活化需要的成分（例如抗CD3 杬體及抗CD28抗體或其配位子）可被制動、或由血液或血液製品中分開隨後才投予個體。此外因熟諳技藝人士了解多種血液製品可組合此處所述裝置及方法使用。例如方法及裝置可用來由低溫保存之全血、周邊血液單核細胞、其他低溫保存血液衍生細胞或低溫保存τ細胞系於解凍時且於投予個體前，提供Τ細胞之快速活化。另一實施例中，該方法及裝置可用來於投予個體前追加增高先前於活體外擴大 86387 • 83- 200403340 之τ細胞產物或τ細胞系活性，如此提供高度活化之τ細胞產物。最後如一般了解，該等方法及裝置可於個體及給予者同時用於自體或同種異基因細胞治療。本發明方法也可用於疫苗來提升抗原反應性，及提高活體内的功效。一具體實施例中，本發明組合物組合可於活睹内挺升Τ細胞之組合物（例如il-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12 及IL-15)投予病人。此外設藉本發明擴大之τ細胞於體内具有長半生期，則經由攜帶預定感興趣之核酸序列，且可能導向癌症、疾病或感染部位，此等經擴大的τ細胞可作為基因治療的完美媒劑。如此藉本發明擴大之細胞可組合疫苗、一或多種細胞激素、一或多種治療抗體等而輸送至病人體。實質上可由較為強勁之τ細胞群受惠的任一種治療皆屬於此處所述使用方法之範圍。存在有多種試管試驗模式及動物研究模式來試驗及確認本發明細胞組合物及其應用於特定免疫系統相關疾病或適應症之用途。如此熟諳技藝人士容易由目前業界現行模式中選出適當模式。此等模式包括使用NOD小鼠，此處可產生胰島素之胰臟万細胞自發T細胞依賴型自身免疫摧毁隨著年齡而強化，結果導致IDDM(Bottazzo等人，英格蘭醫藥期刊113 : 353，1985 ; Miyazaki等人，臨床實驗免疫學，60 : 622 ’ 1985)。於NOD小鼠，一種人類iddm模式，鎖定T細胞之治療策略成功地用來預防IDDM(Makino等人，實驗動物’ 29 : 1，1980)。此等鎖定Τ細胞目標之治療方案包括初生切除胸腺、投予環抱靈、及輸Santi_pan T細胞、抗CD4 86387 -84- 200403340 或抗CD25(IL-2R)單株抗體（mAbs)(Tarui等人，NOD小鼠之胰島炎及第I型糖尿病教訓，學術出版社，東京1986年，143 頁）。其他研究模式包括例如典型用於自身免疫病及發炎病之研究模式，例如多發性硬化（EAE模式）、類風濕性關節炎、移植片對宿主病（使用皮膚移植片、心臟移植、蘭氏小島移植、大腸及小腸移植等研究移植片排斥的移植模式）、氣喘模式、系統性紅斑性狼瘡（系統性自身免疫NZBx NZWFi模式）等（例如參考Takakura等人，實驗血液學27(12) ·· 1815-821，1999 ; Hu等人，免疫學98(3) : 379-385，1999 ; Blyth等人，美國呼吸細胞分子生物學期刊14(5) : 425-438 ’ 1996 ; Theofilopoulos及Dixon，進階免疫學，37 ·· 269-389 ’ 1985 ; Eisenberg等人，免疫學期刊 125 : 1032-1036，1980 ; Bonneville等人，自然 344 : 163-165，1990 ; Dent等人，自然 343 : 714-719, 1990; Todd等人，自然 351 : 542-547, 1991 ; Watanabe等人，生化遺傳學 29 : 325-335，1991 ; Morris等人，臨床免疫免疫病理學57 : 263-273，1990 ; Takahashi等人，細胞76 : 969-976，1994 ;目前免疫學協定，Richard Coico(編輯）約翰威利父子公司，第15章，1998年）。膠原誘生之關節炎（CIA)為類風濕性關節炎（RA)之T細胞依賴型動物模式（D.E. Trentham等人，「第II型膠原之自身免疫性：實驗關節炎模式」，實驗醫藥期刊146 : 857-868(1977))。於IFA使用第II型膠原（CII)免疫接種後的兩週内，易感性大氣出現多發性關節炎，具有血管易生成及骨/軟骨糜爛之組織學變化。此外，於CIA以及於RA出現對 CII之體液反應及細胞反應旧^以^，「類風濕性關節炎之動物研究模式：病因及治療線索」，臨床骨科學及相關研究（B. Hahn編輯），費城哲里平可（JB Lippinc〇u)公司，MW年]。結果CIA為RA有用的動物研究模式，如本發明所述可作為研％潛在新穎治療法之活體試驗模式。醫藥組合物、本發明<丁細胞群可單獨投予，或組合稀釋劑及/或其他成分例如IL-2或其他細胞激素或細胞群而成醫藥組合物投予。簡言之，本發明之醫藥組合物包含此處所述目標細胞群，組合一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此種組合物包含缓衝劑如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡萄聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑如EDTA或麩胱甘肽；辅劑（如氫氧化鋁）；及保藏劑。本發明組合較佳調配供靜脈投藥。本發明進一步提供包含此處所述敏化組合物之醫藥組合物。本發明醫藥組合物可以適合欲治療（或預防）之疾病之方法投予。投藥量及投藥頻率將藉病人情況、病人疾病類別及嚴重程度決定，但適當劑量係由臨床試驗測定。當指示「免疫有效量」或「治療量」時，本發明組合物之精確投藥量係由醫師經由考慮病人年齡、體重、病情嚴重程度及情況等個別差異以及任何其他病人治療之相關因素決定。通常包含T細胞或B細胞之醫藥組合物可以1〇4至1〇7 Apc/千克體重且較佳105至1〇6 APC/千克體重之劑量投藥，包括於 86387 •86- 200403340 此範圍之全邵整數值。細胞組合物也可於此劑量投藥多次。細胞可使用免疫治療上常用的輸注技術投藥（例如參考 Rosenberg等人’新英格蘭醫藥期刊319 : 1676，ι988)。特足病人之最佳劑量及治療計畫係由醫藥業界熟諳技藝人士經由監控病人之疾病徵相及據此調整治療決定。若干免疫治療研究中，T細胞係以約1 X 1〇9至2 X 1〇"細胞投予病人（例如參考美國專利第5,〇57,423號若干本發明之具體實施例中，特別於使用同種細胞或異種細胞時，可投予較少數細胞，約1〇6/千克（每一病人1〇、1〇u)之範圍。若干具體實施例中，T或B細胞係以1 X 1〇5、1 X 1〇6、1 X 1〇7、 1 X 108、5 X 1〇8、i X 109、5 X 1〇9、i χ 1〇10、5 χ 1〇10、i X ίο11、5 X 1011、或i X 1012細胞投予個體。丁或6細胞組合物可以此種範圍之劑量投藥多次。T或B細胞可與接受治療之病人為同源或非同源（同種或異種）。若有所需治療也包括投予如此處所述之有絲分裂原（例如PIIA)或淋巴激素、細胞激素、及/或化學激素（例如GM_CSF、IL_4、IL_13、Flt3L、 RANTES、MIPloc等）俾增進免疫反應的恢復。本發明也提供於動物預防、抑制或降低自身免疫病嚴重程度之方法，包括對動物投予有效量之經活化之多株丁細胞’該Τ細胞已經去除非期望之自體反應性τ細胞亞群。本發明之Τ細胞組合物可組合τ細胞去除療法及/或其他治療自身免疫病之療法投予病人。本發明也提供於需要造血幹細胞移植動物體預防、抑制或降低移植片對宿主病嚴重程度之方法，該方法包含對動 86387 -87- 200403340 物投予有效量之捐贈者骨髓，該骨髓已經去除非期望之同種異基因反應性τ細胞亞群。本發明組合物可組合其他治療投予，用於治療造血幹細胞移植相關免疫缺陷。

本發明也提供於需要器官移植動物體預防、抑制或降低宿主對移植片病或移植片排斥嚴重程度之方法，該方法包含對動物投予有效量之捐贈者骨髓，該骨髓已經去除非期望之同種異基因反應性τ細胞亞群。本發明組合物可組合其他治療投予，用於治療器官移植相關免疫缺陷。本醫藥組合物之投予可以任一種方便之方式進行，包括喷霧劑吸入、注射、攝食、輸血、植入或移植進行。本發明組合物可經皮下、皮内、肌肉、靜脈（i.v.)注射、腫瘤内或腹内注射投予病人。較佳本發明T細胞組合物係藉靜脈注射投藥。活化T細胞組合物可直接注射於腫瘤或淋巴節。

又另一具體實施例中，醫藥組合物可以控制釋放系統輸送。一具體實施例中，可使用幫浦（例如參考Langer，1990，科學249 : 1527-1533 ; Sefton 1987，CRC臨界參考生醫工程 14 : 201 ; Buchwald等人，1980 ;手術 88 : 507 ; Saudek等人， 1989，新英格蘭醫藥期刊321 : 574)。另一具體實施例中，可使用聚合物料（參考控制釋放之醫藥應用，1974，Langer 及Wise(編輯），CRC出版社，佛羅里達州波卡雷頓；經控制之藥物生物利用性，藥品設計及效果，1984，Smolen及Ball (編輯），威利公司，紐約；Ranger及Peppas，1983 ;巨分子科學期刊巨分子化學综論23 : 61 ;也參考Levy等人，1985，科學228 : 190 ; During等人，1989，神經科學年報25 : 35 1 ; 86387 -88- 200403340

Howard等人，1989，神經手術年報71 : 105)。又另一具體實施例中，控制釋放系統可置於治療目標附近，如此只需要系統性劑量之一部分（例如參考控制釋放醫藥應用， 1984，Langer及Wise(編輯），CRC出版社，佛羅里達州波卡雷頓，第2期，115-138頁）。本發明之T細胞組合物及/或敏化組合物也可使用任一種基質投藥。基質應用於組織工程已行之有年[例如參考組織工程原理（Lanza、Langer及Chick(編輯）），1997]。本發明利用此種基質作為人工淋巴器官來支援、維持或調節免疫系統，典型係經由調節T細胞而調節免疫系統。如此本發明利用已經證實可用於組織工程之基體組合物及調配物。如此本發明組合物、裝置及方法有用之基質類型實質並無限制’包括生物基質及合成基質。一特定例中，使用美國專利 5,980,889 ; 5,913,998 ; 5,902,745 ; 5,843,069 ; 5,787,900 ; 或5,626,561所述組合物及裝置。基質包含投予哺乳動物宿主時常見為生物相容性之特色。基質可由天然材料及合成材料製成。當需要於動物體内留下持久性結構或活動結構例如植體時，基質可為非可生物分解；或基質為可生物分解。基質可呈海绵、植體、管、特發（telfa)襯墊、纖維、中 $纖維、/東乾成分、凝膠、粉末、多孔組合物、微脂粒、細胞或奈米粒子形式。此外，基質可設計成允許持續釋放種子細胞或所製造的細胞激素或其他活性劑。某些情況下，本發明之基質為撓性且為彈性，且被描述為半固體台架，其允許透過無機鹽類、水性流體及溶解之氣態作用劑 86387 -89- 200403340 包括氧氣等物質。基質用於此處為生物相容物質範例。但本發明非僅囿限於基質，如此當出現基質一詞時，須將基質解讀為包括允許細胞留存獲細胞通過、允許巨分子通過，巨分子可能為直接通過基質，故基質本身為半透明膜、或基質組合特定半透性物質使用之裝置以及其他物質。此處引用之全部參考文獻皆全文併入此處以供參考。此外，此處利用之全部數值範圍皆明白包括於該範圍内之整數值，可依據特定用途而選定該範圍内之特定數值。此外下列實例僅供舉例說明之用而非限制性。實施例1 於再度使用CD3/CD28 XCELLERATEtm珠粒刺激後抗原特異性T細胞之偵測本例說明經由使用抗CD3/CD28 XCELLERATE™珠粒 (3X28珠粒）再度刺激而由混合細胞群去除抗原特異性T細胞。使用此處所述方法生成XCELLERATED T細胞TM大致係如美國專利申請案第10/133,236號所述。使用載有CMVpp65胜肽之HLA-A2四元體（HLA-A2-CMVpp65)藉流動細胞計量術，篩檢人類PBMC之HLA-A2 CMVpp65陽性程度。於選用之捐贈者約3% CD3+CD8+ T細胞可表現HLA-A2-CMVpp65之特異性TCR(圖1)。得自捐贈者（捐贈者2)及對照捐贈者（捐贈者1)之PBMC係使用塗覆於順磁性珠粒之CMV抗原活化，至培養之第10 曰，藉流動細胞劑量分析顯示多個細胞為CD25 (IL-2R)陽 86387 -90- 200403340 性，以及全部HLA-A2 CMVpp65+ T細胞皆表現高度CD25，指示活化（圖2右圖）。

於一次刺激後之第14日，培養保持未經刺激（圖3，Α1-Α4 圖），或使用XCELLERATEtm方法以3X28珠粒再度刺激16小時（圖3，B1-B4圖）。如圖3所示，CD25係於再度經刺激之細胞向上調節（B2圖），但四面體陽性（亦即CMVpp65-Ag-特異性）之預先經過刺激的細胞係藉3X28珠粒提供的二次強力刺激而刪除（B3及B4圖），而其他細胞不受影響。當細胞附著於珠粒或相關細胞附著於珠粒時，經磁力選擇且置回培養，隨後再度使用3X28珠粒刺激，可觀察得類似結果。另一項研究中細胞又再度刺激4日。於3X28經再度刺激之培養又經4日後，仍然觀察得四面體陽性細胞的刪除。此等結果證實經活化之CMVpp65抗原特異性T細胞經使用3X28珠粒再度刺激後，可由細胞群去除，相當類似透過細胞凋亡程序去除般。

實施例2 細胞凋亡之決定本實施例說明測量細胞调亡之範例檢定分析。 DNA分段檢定分析：細胞於50微升溶解銹衝浚Π0 mM EDTA，50 mM Tris pH 8，0.5%硫酸十二燒酯鈉，0.5毫克 / 毫升蛋白酶K)分解。加入RNAse Α(0·5毫克/毫升），分解產物於3 7 °C培養1小時。進行兩次紛萃取（相等容積），接著為一次氯仿萃取。使用兩倍容積冰冷乙醇沈澱DNA，及於-80 86387 -91- 200403340 °C培養1小時。DNA經由於4°C於14,000 rpm離心10分鐘造粒。丸粒風乾30分鐘，再懸浮於50微升Tris-EDTA pH 8。DNA 根據Preston等人，癌症研究，1994，54，4214-4223之方法，於1.8%瓊脂糖凝膠於1 X TBE流動緩衝液（0.05 M Tris鹼， 0·05 Μ硼酸，1 mM EDTA二鈉）電泳。實施例3 經由與經XCELLERATED處理之T細胞頂共同培養而誘生 B細胞之細胞凋亡。本實施例說明經由與經過XCELLERATED處理之T細胞TM 共同培養而删除B-CLL病人樣本之白血病B細胞。大致如美國專利申請案第10/133,236號所述產生之經過 XCELLERATED處理之T細胞TM與得自B-CLL病人之未經操縱處理之自身白血病細胞共同培養。CD54、CD80、CD95 (FAS)及CD86之細胞表面標記及亞尼辛/PI(細胞凋亡）係於 24小時及48小時藉流動細胞計量術測量。經過XCELLERATED 處理之T細胞TM顯示可驅動CD95(FAS)於白血病B細胞之表現（圖4)。經由共同培養12日XCELLERATED T細胞谓經48小時後，自身白血病B細胞顯示CD95表現程度較高，藉流動細胞計量術測定對抗FAS之敏感度增高（第5圖）。如第5圖所示，添加抗FAS抗體至共同培養之T ·· B細胞，結果導致白血病B細胞之細胞凋亡增加。另一項研究顯示於 XCELLERATEtm處理過程，T細胞生長，而白血病B細胞被刪除（圖6)。摘要言之，經過XCELLERATED處理之T細胞⑽可將白血 86387 -92· 200403340 病B細胞之重要效應物分子向上調節，於白血病B細胞謗生功能FAS，可將白血球B細胞驅策入細胞凋亡路徑。於 XCELLERATEtm處理結束時白血病B細胞實質上已經無法偵測。因此經過XCELLERATED處理之T細胞TM可用作為供由混合細胞群中去除白血病B細胞用之敏化組合物或前驅細胞调亡組合物。實施例4 變更珠粒：細胞比可選擇性擴大或刪除記憶體CD8 T細胞本實施例顯示珠粒：細胞比對不同T細胞群之擴大有重大影響。特別，高珠粒：細胞比（3 : 1-10 : 1)可誘生抗原特異性T細胞之細胞死亡，而較低珠粒：細胞比（1 : 1-1 : 10)則導致抗原特異性T細胞的擴大。此外後述資料顯示珠粒：細胞比將低，結果也導致多株細胞群之細胞擴大的改善。如此本實施例顯示珠粒：細胞比較低可改善整體細胞的擴大。此外，本實施例證實於高珠粒：細胞比，此處所述珠粒可用作為前驅細胞凋亡組合物。細胞經製備且使用XCELLERATE ITM方法刺激，該方法大致係如美國專利申請案第10/187,467號，申請日2002年6月 28日所述。簡言之，此種方法中，XCELLERATED T細胞TM 係由周邊血液單核細胞（PBMC)血泳產物製造。於臨床由病人採集PBMC後，PBMC血泳經過洗滌及低溫保存。然後細胞經解凍且於37°C/5%二氧化碳之培養中培養1小時，俾允許單株抗體以及其他黏著細胞結合至培養板。非黏著細胞移轉至新培養板供刺激如後。於此單核細胞耗盡步驟之 86387 -93- 200403340

後，取一份共含5 x 108 CD3+ T細胞，裝配上1.5 x 109 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 Τ 細胞來引發 XCELLERATEtm過程（約3 : 1珠粒比丁細胞）。然後細胞與 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T細胞之混合細胞群於37 °C，5%二氧化碳培養約8日，產生XCELLERATED T細胞TM 供初次輸注。其餘已經清除單核細胞之PBMC經冷凍保存至第二次或另一次細胞製品擴大為止（約21日後），於該時，冷凍保藏物經解凍、洗滌然後取1份共含5 X 108 CD3+ T細胞，且裝配 1·5 X 109 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T細胞而引發XCELLERATEtm過程供第二次輸注。於37°C，5%二氧化碳約8日之培育期間，CD3+ T細胞經活化及擴大。使用之抗CD3抗體為BC3(XR-CD3 ;福哈金森癌症研究中心，華盛頓州西雅圖），以及抗CD28抗體（B-T3，XR-CD28)係得自戴爾康，法國貝桑松。

用於後述實驗，培養含有細胞，由該細胞已經去除黏著的細胞，然後以表1所示珠粒：T細胞比添加珠粒。本實施例使用之珠粒包含DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T以1 : 1 CD3 : CD28抗體比結合於珠粒。

表1 :變更珠粒：細胞比可選擇性擴大或刪除記憶體CD8 T 細胞珠粒：細胞比倍數增加多株T細胞 CMV抗原特異性T細胞 10 : 1 149 0 5:1 294 0 一 86387 -94- 200403340 3:1 346 1.4 1:1 562 20.6 1:5 113 53 1 ： 10 79 45.8 表1摘述結果’且以線圖顯示於圖7，證實經由使用高珠粒：細胞比可選擇性刪除抗原特異性τ細胞，而經由使用低珠粒··細胞比可擴大抗原特異性Τ細胞。使用ebv特異性CD8 Τ細胞及流行性感冒特異性CD8 τ細胞（圖中未顯示）也觀察得類似結果。不欲受特定理論所限相信抗原特異性T細胞對進一步刺激敏化。使用高珠粒：細胞比之刺激，提供高濃度刺激抗體’結果導致抗原特異性T細胞的過度刺激，藉細胞》周亡或其他機轉而造成抗原特異性T細胞的死亡。如此就此方面而言，珠粒係作為前驅細胞凋亡組合物。使用較低珠粒··細胞比，提供刺激信號給抗原特異性T細胞，該刺激信號不會過度刺激，反而誘使細胞快速增生。使用較低珠粒：細胞比於多株T細胞群也觀察得增生增加。特別結果指出珠粒：細胞比1 : 1對多株τ細胞擴大為最佳。因此本實施例中，提供證據證實不同珠粒：細胞比的使用係依據期望結果決定。為了擴大抗原特異性T細胞，以較低珠粒：細胞比為佳。若期望獲得刪除抗原特異性T細胞之結果，則以較高珠粒：細胞比為佳。實施例5 使用CD3/CD28 XCELLERATEtm細胞再度刺激後删除同種異基因反應性T細胞 86387 -95- 200403340 本例說明使用CD3/CD28 XCELLERATEtm細胞再度刺激後刪除同種異基因反應性T細胞。 PBMC係使用同種PBMC或JY B類淋巴母細胞同種細胞系刺激3日。於第3日，經同種基因PBMC刺激或經JY刺激之 PBMC使用XCELLERATEtm方法與CD3/CD28珠粒共同培養，大致上如美國專利申請案第10/350,305號所述，經過以及未經使用CD3/CD28珠粒進行30分鐘陽性選擇。於 XCELLERATEtm處理後，細胞再度使用同種PBMC或JY同種抗原刺激，測定CD25的向上調節。理後，以同種細胞再度刺激並未導致CD25表現（使用流動細胞計量學分析測定）的向上調節，指示同種異基因反應性細胞已經被刪除。特別於XCELLERATETM處理過程中經過JY刺激之CD8+ T細胞的陽性選擇顯著降低同種異基因反應性。但τ 細胞仍然維持合格，可回應於XCELLERATEDtm培養中之非相關抗原，如第3方同種PBMC及JY反應可證（例如使用同種 PBMC再度刺激經過JY刺激的培養，或使用JY再度刺激經過同種PBMC刺激的培養）。如此此等結果顯示經活化之同種異基因反應性T細胞可經由使用CD3/CD28珠粒再度刺激而被刪除，其餘多株T細胞可以指數方式擴大來用於多種免疫治療用途。【圖式簡單說明】圖1為點作圖，顯示於HLA-A2陽性捐贈者存在有CD3 + CD8+HLA-A2CMVpp65抗原特異性T細胞。圖2為點作圖，顯示於經CMV活化之HLA-A2CMVpp65抗 86387 -96- 200403340 原特異性T細胞之CD25表現的增高。圖3為點作圖，顯示於未經刺激細胞之CD25的向上調節，以及由3x28珠粒提供二次強力刺激而刪除預先經過刺激之四元體陽性細胞（亦即CMVpp65-抗原特異性）。於初次刺激14日後，培養保持未接受刺激（A1-A4組）或再度使用 XCELLERATEtm方法以3x28珠粒刺激16小時（B1-B4組）。 CD25於再度經刺激之細胞（B2組）向上調節，但四元體陽性 (亦即CMVpp65抗原特異性）預先刺激細胞係經由3x28珠粒提供的二次強烈刺激而刪除（B3組）。圖4為組織圖，顯示於以XCELLERATED T細胞™共同感染之白血病B細胞之關键效應物分子（包括CD95)表現的增加0 圖5為點作圖，顯示於與XCELLERATED T細胞TM共同培養之白血病B細胞謗生細胞凋亡。圖6為線圖顯示於XCELLERATE™處理過程中，白血病B 細胞的消失以及伴隨T細胞的擴大。圖7為線圖使用各種珠粒：細胞比，比較多株T細胞增加倍數與CMV pp65 A2-四元體+(抗原特異性）T細胞增加倍數。實心桿表示多株T細胞。條紋桿表示CMV特異性T細胞。 86387 -97-

Claims

200403340 拾、申請專利範圍：一種活體外自一個體之混合τ細胞群去除一種純株τ細胞亞群之至少實質部分之方法，該方法包括，一細胞群其中至少部分包含τ細胞，將該細胞群暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物或生長抑制組合物，其中该暴露謗使存在於該混合了細胞群之至少一種純株Τ 細胞群的至少貫質邵分細胞凋亡或抑制細胞生長；因此由該混合τ細胞群去除該純株了細胞群之至少實質部分。如申Μ專利圍第1項之方法，進一步包括擴大其餘混合 τ細胞群。如申叫專利範圍第2項之方法，其中其餘混合細胞群係經由餘w合細胞群暴露於—表面而擴大，其中該表面附著或多種作用劑，該作用劑可接合其餘T細胞之至少邵分細胞表面部分’以及刺激其餘T細胞而擴大。 .如申請專利範圍第3项之方法，其中該表面已經附著第一乍用^ ^作用劑可接合T細胞之第- T細胞表面部分，二：二表面或第二表面已經附著第二作用劑，該第二作物接合丁細胞之第二部分，其中該第 5二作用劑接合誘生τ細胞的增生。獻弟之^田產胞生鮮’其係根據如申請專利範圍第1-3项中任一項 6.如申請專利範園第1項物或生長抑制二？人法’其中該前驅細胞调亡組合 13物包含—種自體抗原。 86387 200403340 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該自體抗原係選自骨髓磷脂鹼性蛋白質（ΜΒΡ)、ΜΒΡ 84-102、ΜΒΡ 143-168、騰小島細胞抗原、膠原、甲狀腺抗原、Scl_7〇、核酸、乙酸膽驗受體、S抗原及II型膠原組成的組群。 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該前驅細胞凋亡組合物包含同種細胞或異種細胞。 9·如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少部分包含τ細胞之孩細胞群係於活體内暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物。 1〇·如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少部分包含T細胞炙孩細胞群係於活體外暴露於一或多種前驅細胞凋亡組合物。 U·如申請專利範圍第3項之方法，其中該細胞暴露於表面經歷一段足夠提高多株性之時間。 U·如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中該增加包含藉至少一種 V/3、Va、νγ、或 νδ族基因之¥/5、να、νγ、或 νδ 型譜側繪圖測量得由Τ細胞之單株性遷移至寡株性或遷移成多株性。 13· -種Τ細胞群，其係根據如申請專利範圍第6項或第^項之方法製造。 ~ -種治療病人之自身免疫病之醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第13項之τ細胞群。 15.如中請專利範圍第14項之醫藥組合物，其中該病人係使用免疫去除劑處理。 86387 200403340 16. 如申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其中該免疫去除劑係選自康佩斯（campath)、抗CD3抗體、塞克伏伐麥 (cyclophosphamide)、福達拉賓（fludarabine)、環孢靈 (cyclosporine)、FK506、黴盼酸、類固醇、FR901228及库昌射照射組成的組群。 17. 如申請專利範圍第14項之醫藥組合物，其中該病人係使用T細胞去除治療。

18. 如申請專利範園第1項之方法，其中該前驅細胞凋亡組合物或生長抑制組合物包含一或多種選自下列組成的組群之組合物：抗CD3抗體、抗CD2抗體、抗CD20抗體、目標

抗原、MHC-胜肽四元體或二元體、Fas配位子、抗Fas抗體、IL_2、IL-4、TRAIL、洛里潘（rolipram)、朵索比辛 (doxorubicin)、克洛布席（chlorambucil)、福達拉賓、塞克伏伐麥、亞哲席平（azathioprine)、美索崔赛（methotrexate) 、環孢靈、黴酚酸鹽（mycophenolate)、FK506、bcl-2抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、介白質-1β轉換酶（ICE)結合劑，志賀氏桿菌（Shigella)IpaB蛋白質、史洛孢靈 (staurosporine)、紫外光照射、γ射線照射、腫瘤壞死因子、目標抗原核酸分子、蛋白質或胜肽以及非蛋白質或非多核替酸化合物。 19·如申請專利範圍第3項之方法，其中至少一作用劑為抗體或抗體片段。 20·如申請專利範圍第3項之方法，其中該第一劑為抗體或其片段，以及第二劑為抗體或其片段。 86387 403340 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該第一劑及第二劑為不同抗體。如申請專利範圍第3項之方法，其中該第一劑為抗€〇3抗體、抗CD2抗體、或抗CD3抗體或抗cD2抗體之抗體片段。如申請專利範圍第3項之方法，其中該第二劑為抗 CD28 抗體或其抗體片段。如申請專利範圍第3項之方法，其中該第一劑為抗cD3抗體以及該第二劑為抗CD28抗體。一種活體外自一個體之一混合丁細胞群去除一純株τ細胞亞群之至少貫質部分之方法，該方法包括， Ο)暴露一細胞群於一或多種組合物，該細胞群中至少實質部分包含T細胞，該聚合物可讓至少部分τ細胞對進一步活化或刺激敏化， (b)細胞群暴露於一表面，其中該表面附著一或多種作用劑，該作用劑係接合至少部分敏化後T細胞之細胞表面邵分’以及刺激該敏化後之細胞，其中敏化後之T細胞暴露於該表面係經歷一段足夠謗生敏化後T細胞之細胞凋亡之時間；因而由該細胞群中去除敏化後之T細胞。如申請專利範圍第25項之方法，其中步驟（b)進一步包含该細胞群暴露於該表面經歷一段足夠刺激至少部分其餘 T細胞之時間，以及其中該至少部分其餘細胞增生。如申請專利範圍第25項之方法，其中該表面已經附著第一作用劑，該作用劑可接合T細胞之第一 τ細胞表面部 86387 -4- 200403340 刀以及同表面或第一表面已經附著第二作用劑，該第二作用劑可接合τ細胞之第二部分，其中該第一作用劑及第二作用劑接合誘生T細胞的增生。 28.如申請專利範圍第26項之方法，其中該細胞暴露於表面經歷一段足夠提高多株性之時間。 29·如申請專利範圍第28項之方法，其中該增加包含藉至少一種 V/3、Voc、νγ' 或 VS族基因之¥/3、να、γγ、或 νδ 型譜側繪圖測量得由Τ細胞之單株性遷移至寡株性或遷移成多株性。 3〇· —種Τ細胞群，其係根據如申請專利範圍第25項或第“項之方法製造。 31.如申請專利範圍第25項之方法，其中該個體需要造血幹細胞移植。 32·如申請專利範圍第3 1項之方法，其中該敏化組合物包含接受者PBMCs，該PBMCs已經經過處理故無法繼續分裂；以及該細胞群包含捐贈者T細胞。 33· 一種T細胞群，其係根據如申請專利範圍第32項之方法製造。 34· —種於接受造血幹細胞移植病人降低不良GVHD效應之風險或嚴重度之醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第 3 〇項或3 3項之T細胞群。 35·如申請專利範圍第25項之方法，其中該個體需要器官移植。 36·如申請專利範圍第35項之方法，其中該敏化組合物包含 86387 200403340 捐赠者細胞，該捐贈者細胞已經經過處理故無法分裂；以及該細胞群包含接受者τ細胞。 37·如申請專利範圍第36項之方法，其中該細胞暴露於表面經歷一段足夠提高多株性之時間。 38·如申請專利範圍第37項之方法，其中該增加包含藉至少一種 V/3 ' να、νγ、或 νδ族基因之 Vy5、Voc、νγ、或 νδ 型譜側繪圖測量得由Τ細胞之單株性遷移至寡株性或遷移成多株性。 39· 一種Τ細胞群，其係根據如申請專利範圍第36項或第37項之方法製造。 40· —種於接受器官移植病人降低器官排斥風險之醫藥組合物’其包含如申請專利範圍第39項之τ細胞群。 41·如申請專利範圍第4〇項之醫藥組合物，其中該病人係使用Τ細胞去除治療處理。 42·如申請專利範圍第25項之方法，其中該敏化組合物包含一種自體抗原。 43·如申請專利範圍第42項之方法，其中該自體抗原係選自骨髓磷脂鹼性蛋白質（ΜΒΡ)、ΜΒΡ 84-102、ΜΒΡ 143-168、 Scl_7〇、胰小島細胞抗原、S抗原及π型膠原組成的組群。 44·如申請專利範圍第43項之方法，其中該細胞暴露於表面、經歷一段足夠提高多株性之時間。 45·如申請專利範圍第44項之方法，其中該增加包含藉至少一種V冷、Va、νγ、或νδ族基因之v/3、να、νγ、或νδ 型譜側繪圖測量得由Τ細胞之單株性遷移至寡株性或遷 86387 移成多株性。 46. —種T細胞群，其係根據如申請專利範圍第“項或第料項之方法製造。 ^ 47· 一種治療病人之自身免疫病之醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第46項之T細胞群。 48·如申請專利範圍第47項之醫藥組合物，其中該病人係使用T細胞去除治療處理。 49·如申請專利範圍第26項之方法，其中至少一作用劑為抗體或抗體片段。 %如申請專利範圍第26項之方法，其中該第一劑為抗體或其片段，以及第二劑為抗體或其片段。 51.如申請專利範圍第5〇項之方法，其中該第一冑及第二劑為不同抗體。 52·如申請專利範圍第26項之方法，其中該第一劑為抗CD3 抗體、抗CD2抗體、或抗CD3抗體或抗CD2抗體之抗體片段。 •如申明專利範圍第26項之方法，其中該第二劑為抗cd28 抗體或其抗體片段。 54_如申請專利範圍第26項之醫藥組合物，其中該第一劑為 ^uCD3抗體以及該第二劑為抗CD28抗體。 5·種活體外自一個體之一 T細胞群生成CD3+/CD28+ T細胞之至少實質純細胞群之方法，其包括：於活體外暴露一細胞群（其中至少部分包含T細胞）於 —種組合物’該組合物可刺激及/或選擇表面CD3及CD28 86387 200403340 分子ί 因而製造一 CD3+/CD28+ Τ細胞之實質純細胞群。 56. —種活體外自一個體之一 Τ細胞群生成CD4+/CD3+/CD28+ Τ細胞之至少實質純細胞群之方法，其包括：於活體外暴露一細胞群（其中至少部分包含Τ細胞）於一種組合物，該組合物可刺激及/或選擇表面CD3及CD28 分子；

因而製造一 CD4+/CD3+/CD28+ Τ細胞之實質純細胞群。 57. —種活體外自一個體之一 Τ細胞群生成CD8+/CD3+/CD28 + Τ細胞之至少實質純細胞群之方法，其包括：於活體外暴露一細胞群（其中至少部分包含Τ細胞）於一種組合物，該組合物可刺激及/或選擇表面CD3及CD28 分子；因而製造一 CD8+/CD3+/CD28+ Τ細胞之實質純細胞群。

58. 如申請專利範圍第55-57項中任一項之方法，進一步包含擴大該CD3 + CD28+ Τ細胞經歷一段時間足夠讓污染 CD3+/CD28· Τ細胞百分比低於約5%。 59. 如申請專利範圍第55-57項中任一項之方法，進一步包含擴大該CD3+CD28+ Τ細胞經歷一段時間足夠讓污染 CD3+/CD28- Τ細胞百分比低於約1%。 60·如申請專利範圍第55-57項中任一項之方法，進一步包含擴大該CD3+CD28+ Τ細胞經歷一段時間足夠讓污染 CD3+/CD28. Τ細胞百分比低於約0.1%。 61·如申請專利範圍第55-57項中任一項之方法，其中該CD3 86387 200403340 分子係使用抗CD3抗體刺激，以及該CD28分子係使用抗 CD28抗體刺激。 62. —種活體外經由細胞表面部分接合而活化且擴大一丁細胞群之方法，其包括：

一T細胞群（其中至少部分包含τ細胞）接觸一表面，其中該表面附著一或多作用劑，該作用劑可接合至少部分 T細胞之細胞表面部分，以及刺激該τ細胞，其中該表面存在之比例為該表面對該細胞比讓至少一抗原特異性τ 細胞群之至少實質部分經約8日培養後被刪除。 63·如申請專利範圍第62項之方法，其中該比例為約1 〇 : 1至約 5 : 1。 64. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該比例為約5 : 1。 65. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該比例為約1 〇 : 1。 66. 如申請專利範圍第1項之方法，進一步包含擴大混合τ細胞群，該方法包括，

將其餘混合T細胞群暴露於前驅細胞凋亡組合物，其中該暴露謗生混合T細胞群之增生。 67. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該前驅細胞凋亡組合物包含抗CD3抗體及抗CD28抗體共同制動於一珠粒上0 86387