TH64540B - กรรมวิธีที่ใช้ในการผลิตไวรัสของกุ้งในเซลล์เพาะเลี้ยงของแมลง - Google Patents

Abstract

DC60 (20/06/51) กรรมวิธีที่ใช้ในการผลิตไวรัสของกุ้งในเซลล์เพาะเลี้ยงของแมลง เพื่อให้สามารถเก็บรักษาแมลง ที่ติดเชื้อไวรัสของกุ้งให้สามารถอยู่ได้และสามารถรักษาสภาพการติดเชื้อได้อย่างต่อเนื่อง ทำให้เกิด ประโยชน์ในการศึกษาการติดเชื้อไวรัสในเซลล์, การแพร่ขยาย, กระบวนการป้องกันตัวเองจากไวรัส , การพัฒนาวิธีการตรวจสอบ แม้กระทั่งการเก็บรักษาไวรัสที่มีความคงตัวทางด้านพันธุกรรม โดยนำ เซลล์ของแมลง คือ เซลล์ไลน์ของยุง C6/36 และเซลล์ไลน์จากหนอนแมลง SF9 แล้วนำมาผ่านกรรมวิธี 2 ขั้นตอน คือ การเพาะเลี้ยงเซลล์ไลน์ของแมลงและการทำให้เซลล์ไลน์ติดเชื้อไวรัส ซึ่งมี 2 ตัว คือ เชื้อ ไวรัสที่ก่อโรคหัวเหลืองและไวรัสก่อโรคตัวแดงดวงขาว แล้วนำมาตรวจสอบผลการติดเชื้อด้วยเทคนิค พีซีอาร์และวิธีฮิสโตโลจิคอล อนาไลซิส พบว่าสามารถเพิ่มปริมาณในเซลล์ไลน์ของแมลงไม่ว่าจะเป็น เซลล์ C6/36 หรือ SF9 ซึ่งเซลล์ไลน์ของแมลงที่ติดเชื้อไวรัสนี้สามารถเก็บรักษาสภาพได้อย่างต่อเนื่อง แล้วสามารถเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ -80 องศาเซลเซียส เพื่อนำกลับมาใช้ใหม่ได้อีกครั้งเมื่อต้องการ กรรมวิธีที่ใช่ในการผลิตไวรัสของกุ้งในเซลล์ เพราะเลี้ยงของ เพื่อให้สามารถเก็บรักษาแมลง ที่ติดเชื้อไวรัสของกุ้งให้สามารถอยุ่ได้และสามารถรักษาสภาพการติดเชื้อได้อย่างต่อเนื่อง ทำให้เกิด ประโยชน์ใรการศึกษาการติเชื้อไวรัสในเซลล์, การแพร่ขยาย, กระบวนการป้องกันตัวเองจาก ไวรัส การพัฒนาวิธีการตรวจสอบ แม้กระทั้งการเก็บรักษาไวรัสที่มีความคงตัวทางด้านพันธุกรรรม โดยนำ เซลล์ของแมลงคือ เซลล์ไลน์ของยุง C6/36 และเซลล์ไลน์จากหนอนแมลง SF9 แล้วนำมาผ่านกรรมวิธี 2 ขั้นตอน คือ การเพราะเลี้ยงเซลลืไลน์ของแมลงและการทำให้เซลล์ไลน์ติดเชื้อไวรัส ซึ่งมี 2 ตัว คือ เชื้อ ไวรัสที่ก่อโรคหัวเหลืองและไวรัสก่อโรคตัวแดงดวงขาว แล้วนำมาตรวจสอบผลการติดเชื้อ ด้วยเทคนิค พีซีอาร์และวิธิสโตโลจิคอล อนาไลซิส พบว่าสามารถ เพิ่มปริมาณในเซลล์ไลน์ของแมลงไม่ว่าจะเป็น เซลล์ C6/36 หรือ SF9 ซึ่งเซลล์ไน์ของแมลงที่ติดเชื้อไวรัสนี้สามารถเก็บบรักษาสภาพได้อย่างต่อเนื่อง แล้วสามารถเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ -80 ํC เพื่อนำกลับมาใช้ใหม่ได้อีกครั้งเมื่อต้องการ

Claims (3)

1. กรรมวิธีที่ใช้ในการผลิตไวรัสของกุ้งในเซลล์เพราะเลี้ยงของแมลง ประกอบด้วย 2 ขั้นตอน คือ - ขั้นตอนที่ 1 การเพราะเลี้ยงเซลล์ไลน์ของแมลง นำเซลล์ของแลงมาเลี้ยงในอาหารลิวโบวิท (Leibovitz\'L15) ที่มีการเติม ฟีทอนโบไวน์ซีรั่ม (fetai bovine serum, FBS) ที่ inactive แล้วปริมาณ 10% กับ ทริปโตสฟอสเฟสบรอท (Tryptose phosphate broth, TPB) ปริมาณ 10% และยาปฎิชีวนะที่ผสมกันระหว่างเพนิซินลีน จี และ สเตรปโตรซิน (Penicillin G และ Streptomycin) ปริมาณ 1.2% - ขั้นตอนที่ 2 การทำให้เซลล์ไลน์ติดเชื้อไวรัส เตรียมเชื้อไวรัสที่ใช้ในการทดลอง ซึ่งจะเตรียมไว้ในรูปของสารละลายเข้าข้น เวลาที่ใช้จะลอความเข้าข้นในอัคตราส่วน 1:100 โดยผสมกับ L-15 ที่เติม 2%FBS , 10%TPB และ 12% ยาปฏิชีวนะ เมื่อเริ่มการทดลองจะเลี้ยงเซลล์ C6-36 ให้เพิ่มปริมาณและเผ่ยขยายเต็มพื้นที่ผิว (monlayer) ของขวดทดลอง (T-25 flask : Costar Corning) ภายใน 24-48 ซม. แล้วจึงใช้ทดสอบการ ติดเชื้อไวรัส โดยการนำอาหารเลี้ยงเซลล์ที่อยู่ในขวดทดลองออกให้หมดแล้วเติมไวร้สที่พร้อมใช้งาน จำนวน 2 มล. แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 28 ํC เป็นเวลา 2 ซม. ก่อนแล้วจึงเติมสารอาหารสูตรเดียวกับที่ลดความ เข้มข้นของไวรัส จำนวน 3 มล. แล้วนำไปเลี้ยงที่อุณหภูมิ 28 ํC เป็นเวลา 6-7 วัน หรือจนกระทั่งเห็น การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ จึ่งย้ายเซลล์ทที่ติดเชื้อไปเลี้ยงในจานเลี้ยงแบบ 6 หลุม และแล้ว sub- cult ทุก ๆ 2 วัน โดยทิ้งอาหารเลี้ยงเก่าไปแล้วเติมอาหารเลี้งใหมม่ก่อนแบ่งเซลล์ที่ติดเชื้อใน อัตราส่วน 1:2 หรือ 1:3 ไปเลี้ยงในจานเลี้ยงใหม่

2. กรรมวิธีที่ใช้ในการาผลิตไวรัสของกุ้งในเซลล์เพาะเลี้ยงของแมลง ตามข้อถือสิทธิที่ 1 เซลล์ไลน์ ของแมลง สามารถเลือกใช้ได้จากเซลล์ไลน์จากยุง C6/36 หรือเซลล์ไลน์ จากหนอนแมลง SF9

3. กรรมวิธีมราใช้ในการผลิตไวรัสของกุ้งในเซลล์เพาะเลี้ยงของแมลง ตามข้อถือสิทธิที่ 1 เชื้อไวรัสที่ นำมาใช้กับกรรมวิธีนี้ สามารถใช้ได้ ทั้งเชื้อไวรัสที่ก่อโรคหัวเหลืองและเชื้อไวรัสก่อโรคตัวแดงขาว