TH14898U - ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาทิส (Malassezia pachydermatis) - Google Patents

Abstract

------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเชีย แพคคีเดอร์มาทิล (Malassezia pachydermatis) ประกอบด้วย ไพรเมอร์ (primer) จำนวน 1 คู่ ที่'ใช้ตรวจลอบหาสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับลปีชีส์ (species) คือ มาลาลซีเซีย แพคคีเดอร์มาทิส (Malassezia pachydermatis) ด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (Polymerase chain reaction หรอ PCR) ที่มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata egg atg ege aag -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- teg ctg cgt tet tea teg a -3’ และสามารถประกอบเพิ่มเติมด้วยชุดน้ำยาลำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาทิส (Malassezia pachydermatis) ------------

Claims (4)

------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า ข้อถึอสิทธิ 1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจเรือรามาลาลซีเชีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปรมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเรือรามาลาลซีเซีย แพคคีเดอร์ มาติล (Malassezia pachydermatis) มีลำดับเบลดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata egg atg ege aag -3’ -ธีเวอร์ลไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- teg ctg cgt tet tea teg a -3’ 2. กรรมวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเรือรามาลาสซีเชีย แพคคีเดอร์มาทิส (Malassezia pachydermatis) โดยใช้ไพรเมอร์สำหรับตรวจเรือรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาทิล (Malassezia pachydermatis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ด้วยวิธีปฏิกิรยาลูกโซ่พอลิเมอเรล หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้ เครืองเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) ซึ่งมีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเชียล นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลทิแคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ94 องศาเซลเชียสนาน45 วินาทีขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ57 องศาเซลเชียสนาน45 วินาทีและขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ72 องศา เซลเซียส นาน45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเชียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเชียล นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------ ------28/12/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ 1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาลซีเซีย แพคคีเดอร์ มาติส (Malassezia pachydermatis) มีลำดับเบสดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata egg atg ege aag -3' -รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- teg ctg cgt tet tea teg a -3’ 2.ชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) ที่ซึ่ง ใช้ประกอบร่วมกับไพรเมอร์ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาลซีเซีย แพคดีเดอร์มา ติส (Malassezia pachydermatis) ประกอบด้วย - น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCI2) - น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ -น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ -น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร -น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad) 3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาลซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) มีปริมาณส่วนประกอบ ของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์ มาติส (Malassezia pachydermatis) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์ สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ0.6ไมโครลิตร - พีซีอาร์รีแอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ที่มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.9 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดีเอ็นเอโพลิเมอเรล (fag DNA polymerase) ความ เข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม -ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร 4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธี ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอน ดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 57 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียล นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------

1. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezis pachydermatis) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์ มาติส (Malazssezia pachydermatis) มีลำดับเบสดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- gcc ata cgg atg cgc aag -3' -รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- tcg ctg cgt tct tca tcg a-3'

2. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสปีชีส์ (Species) ของเชื้อ เชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydrematis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสามารถ ประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydrematis) ซึ่งประกอบด้วย -น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium Chloride; mM KCl), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCl2) -น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ -น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ -น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร -น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled watrt) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)

3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส ((Malassezia pachydrematis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydrematis) มีปริมาณส่วนประกอบ ของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ -ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ชองเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์ มาติส (Malassezia pachydrematis) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์ สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.6 ไมโครลิตร -พีซีอาร์แอกชั่น มิกช์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ที่มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.9 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดีเอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความ เข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร -สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม -ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionzed distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์(PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร

4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตวรจเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอร์มาติส (Malassezia pachydrematis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธี ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยที่ใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Themal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอน ดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 57 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา)