TH14900Y - ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) - Google Patents

Abstract

------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเรีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) เป็นชุดตรวจที่ ประกอบด้วย ไพรเมอร์ (primers) จำนวน 1 คู่ ที่ใช้ตรวจสอบหาสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับลปีชีส์ (species) คือ มาลาสซีเรีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอ เรล หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (Polymerase chain reaction หรือ PCR) ลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata cgg acg caa aca cg -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- tcg ctg cgt tct tca tcg -3' และสามารถประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฎิกิริยาเพื่อการตรวจหาเชื้อรามาลาสซี เซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ------------

Claims (4)

1. ------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า ข้อถือสิทธิ 1.ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาลซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis)lประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata cgg acg caa aca cg -3’ รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- tcg ctg cgt tct tca tcg -3' 2.กรรมวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) โดยใช้ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาลซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซ เคลอร์ (Thermal cycler หริอ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิ เพื่อเพิ่มปริมาณสาร พันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพริ-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 58องศาเซลเซียส นาน 30วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30วินาที ทำชำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเชียล นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------ ------28/12/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

   1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย ชิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis)ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเรีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata egg aeg caa aca eg -3’ รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- teg ctg cgt tet tea teg -3’
2. 2. ชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเรีย ชิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ที่ซึ่งใช้ ประกอบร่วมกับไพรเมอร์ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ชุดนายาสำหรับตรวจวิเชื้อรามาลาสซีเรีย ชิมโพเดียสิส (Malassezia sympodialis) ซึ่งประกอบด้วย น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50มิลลิโมลาร์โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; ทาM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCI2) น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี(dCTP), ดีจีทีพี(dGTP) และดีทีทีพี(dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแม็กนีเรียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความปริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)
3. 3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาลำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเรีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรอ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรา มาลาสซีเรีย ซิมโพเดียสิส (Malassezia sympodialis) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเรีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ0.75ไมโครลิตร พีซีอาร์ร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น50มิลลิโมลาร์ ปริมาตร0.6 ไมโครลิตรและเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต (unit) ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
4. 4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเชีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 -3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิ เมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิทิแคลั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ลั่นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส นาน 30วินาที และลั่นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง4องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------

   1. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialls) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5' - gcc ata cgg acg caa aca cg -3' รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5' - tcg ctg cgt tct tca tcg -3'

   2. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง สามารถประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจ วินิจฉัยเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ซึ่งประกอบด้วย น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimotar Magnesium chloride; mM MgCI2) น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPS mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี(dCTP), ดีจีทีพี(dGTP) และ ดีทีทีพี(dTTP) ควมเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)

   3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรา มาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.75 ไมโครลิตร พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 unit ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร

   4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิ เมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (tempereture transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา)