TH14899U - ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) - Google Patents

Abstract

------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ประกอบด้วย ไพรเมอร์ (primer) จำนวน 1 คู่ ที่ใช้ตรวจสอบหาสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสปีชีส์ (species) คือ มาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสหรือ เทคนิคพีซีอาร์ (Polymerase chain reaction หรือ PCR) ที่มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cgc tac tcg cgt aca aeg tct ctg -3’ -รีเวอร์ลไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gtt teg ctg cgt tot tca tcg -3’ และสามารถประกอบเพิ่มเติมด้วยชุดน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ------------

Claims (4)

1. ------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า ข้อถือสิทธิ 1.ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) มีลำดับเบสดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- cgc tac tcg cgt aca acg tet ctg -3’ -รีเวอร์ลไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gtt tcg ctg cgt tct tca tcg -3’ 2.กรรมวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อรามาลาลซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) โดยใช้ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเรีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ด้วยวิธี ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครองเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอน ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาท ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------ ------28/12/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

   1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเชีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบส เป็น 5’- cgc tac teg cgt aca aeg tet ctg -3’ -รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gtt teg ctg cgt tet tea teg -3’
2. 2. ชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ที่ซึ่งใช้ประกอบ ร่วมกับไพรเมอร์ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ประกอบด้วย -น้ำยาสิบเอ็กพีชีอาร์บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย50 มิลสิโมลาร์โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCI2) -น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ -น้ำยาแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ -นำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร -น้ำกลั่นปริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความปริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)
3. 3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ตามข้อ ถือสิทธิที่ 1 หรอ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเชีย เฟอร์เฟอร์ {Malassezia furfur) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ -ไพรเมอร์(primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเชีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ0.6 ไมโครลิตร หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า - พีซีอาร์รีแอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ที่มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์(Magnesium chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดีเอ็นเอโพลิเมอเรส (7ag DNA polymerase) ความ เข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม -ปรับด้วยนำกลั่นปริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความปริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
4. 4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเชีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ตามข้อ ถือสิทธิที่ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มี เงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นขั้น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------

   1. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- cgc tac tcg cgt aca acg tct ctg -3' - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- gtt tcg ctg cgt tct tca tcg -3'

   2. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสปีชีส์ (Species) ของเชื้อ เชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสามารถประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฎิกิริยาเพื่อการตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ซึ่ง ประกอบด้วย - น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCi2) -น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ - น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ - น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร - น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)

   3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ตามข้อ ถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพร์เมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฎิกิริยา คือ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.6 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dATP), ดีจีทีพี (dGTP) และดีทีทีพี (dTTP) ที่มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดีเอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความ เข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม - ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร

   4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ตามข้อ ถือสิทธิที่ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฎิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มี เงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟีเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา)