4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาลซีเชีย เรสทริกต้า (Malassezia restricts) ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 -3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอ เรส หรอ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรอ PCR machine) มี เงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิพิเคชั่น (Amplification) สำหรับไพรเมอร์คู่นี้ในขั้นตอนแอมพลิธิเคชั่นจะ ใช้วิธีทัชดาวน์ พีซีอาร์ (Touchdown PCR) ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 67 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นขั้น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 25วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 10 รอบ (cycles) และทำการตังโปรแกรมแอมพลิฟิเคชัน (Amplification) นี้อีกรอบ ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็ก เท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 20วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 20 รอบ (cycles) โดย อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 7 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------ ------28/12/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ
1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricts) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricts) มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cgt gga act tgg ttg gac cgt -3’ รีเวอร์ลไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- cgt ttc get gcg ttc ttc ate -3’
2. ชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเชีย เรลทริกต้า (Malassezia restricts) ที่ซึ่งใช้ประกอบ ร่วมกับไพรเมอร์ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricts) ประกอบด้วย น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (1OXPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCI2) น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีชีทีพี(dCTP), ดีจีทีพี(dGTP) และ ดีทีทีพี(dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแม็กนีเชียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีชีอาร์ (PCR grad)
3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาลำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricts) ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซี เซีย เรสทริกต้า (Matassezia restricts) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่ เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ ไพรเมอร์ (primer) ลำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อมาลาสซีเซีย เรลทริกต้า (Malassezia restricts) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์ลไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.6 ไมโครลิตร พีชีอาร์รีแอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีชีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปรัมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต(unit) ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม ปรับด้วยนากลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาลซีเชีย เรสทริกต้า (Malassezia restricts) ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 -3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอ เรส หรอ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรอ PCR machine) มี เงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิพิเคชั่น (Amplification) สำหรับไพรเมอร์คู่นี้ในขั้นตอนแอมพลิธิเคชั่นจะ ใช้วิธีทัชดาวน์ พีซีอาร์ (Touchdown PCR) ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 67 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นขั้น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 25วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 10 รอบ (cycles) และทำการตังโปรแกรมแอมพลิฟิเคชัน (Amplification) นี้อีกรอบ ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็ก เท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 20วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 20 รอบ (cycles) โดย อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 7 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------
1. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) มีลำดับเบสดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5' - cgt gga act tgg ttg gac cgt -3' -รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5' - cgt ttc gct gcg ttc ttc atc -3'
2. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง สามารถประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจวินิจฉัยเชื้อ รามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) ซึ่งประกอบด้วย น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCl), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCl pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCl2) น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPS mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี (dCTP), ดีจีทีพี (dGTP) และ ดีทีทีพี(dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA poiymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่ความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)
3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซี เซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่ เหมาะสมที่สุด สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา คือ ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อมาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.6 ไมโครลิตร พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTp, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 Unit ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 - 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอ เรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มี เงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) สำหรับไพรเมอร์คู่นี้ในขั้นตอนแอมพลิฟิเคชั่นจะ ใช้วิธีทัชดาวน์ พีซีอาร์ (Touchdown PCR) ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 67 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 25 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 10 รอบ (cycles) และทำการตั้งโปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) นี้อีกรอบ ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Deneturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็ก เท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 20 รอบ (cycles) โดย อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 7 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา)