TH14893Y - ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) - Google Patents

Abstract

------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเชีย (Malassezia) ประกอบด้วย ไพรเมอร์ (primer) จำนวน 1 คู่ ที่ใช้ตรวจสอบหาสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อราในกลุ่ม มาลาสซีเชีย (Malassezia) ด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีชีอาร์ (Polymerase chain 5 reaction หรอ PCR) ที่มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cga caa egg ate tot tgg ttc tcc -3’ -รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- ggc act caa aca ggc atg etc - 3’ และสามารถประกอบเพิ่มเติมด้วยชุดน้ำยาลำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจเชื้อราสกุลมาลาส ซีเซีย (Malassezia) ------------

Claims (10)

1. ------26/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า ข้อถือสิทธิ 1.ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาลซีเชีย (Malassezia) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชี้อรากลุ่ม มาลาลซีเซีย (Malassezia) ที่มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cga caa egg ate tot tgg ttc tec -3’ รีเวอร์ส'ไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- ggc act caa aca ggc atg etc - 3' 2.กรรมวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) โดยใช้ไพร เมอร์สำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที 1 ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอ เรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) ซึ่งมี เงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิทิแคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และขันตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครองเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------ ------28/12/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ 1.ไพรเมอร์สำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปรมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรา กลุ่มมาลาสชีเชีย (Malassezia) ที่มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cga caa egg atc tct tgg ttc tcc -3’ รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5'- ggc act caa aca ggc atg ctc - 3’
2. 2. ชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ที่ซึ่งใช้ประกอบร่วมกับไพรเมอร์ ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งชุดน้ำยาลำหรับตรวจเชื้อรามาลาสซีเซีย (Malassezia) ประกอบด้วย น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCI2) น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีชีทีพี(dCTP), ดีจีทีพี(dGTP) และดีทีทีพี(dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิระดับพีซีอาร์ (PCR grad)
3. 3. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาลำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 - 2 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia} มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่ เหมาะสมที่สุด คือ ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) 1 คู่ ประกอบ ด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และริเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไม โครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 1.5 ไมโครลิตร พีซีอาร์ร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น50มิลลิโมลาร์ปรมาตร0.9 ไมโครลิตรและเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต (unit) ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
4. 4. ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1- ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซี อาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรม อุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ที่ความเหมาะสมที่สุดตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ลั่นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ลั่นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และลั่นตอนเอิกเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ------------ แก้ไข 9/06/2559 1.ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรา กลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ที่มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cga caa cgg atc tct tgg ttc tcc -3’ รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- ggc act caa aca ggc atg ctc -3’ 2.ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ ซึ่ง ประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจวินิจฉัยเชื้อราในกลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ซึ่งประกอบด้วย น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millimolar Potassium chloride; mM KCI), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCI pH 8.3) และ 1-1.5 มิลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; mM MgCI2) น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็มทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี(dCTP), ดีจีทีพี(dGTP) และ ดีทีทีพี(dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCI2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad) 3.ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 – 2 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่ เหมาะสมที่สุด คือ ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA)ในระดับสกุล (Genus) 1 คู่ ประกอบ ด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไม โครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 1.5 ไมโครลิตร พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP , dCTP , dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.9 โครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็คดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 unit ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร 4.ไพรเมอร์และชุดน้ำยาสำหรับตรวจเชื้อราสกุลมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิบัติลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซี อาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรม อุณหภูมิเพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ที่มีความเหมาะสมที่สุดตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุฯหภูมิ 65 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ---------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

   1. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรา กลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ที่มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cga caa cgg atc tct tgg ttc tcc -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- ggc act caa aca ggc atg ctc -3’

   2. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสามารถประกอบ เพิ่มเติมด้วย ชนิดของคู่ไพรเมอร์ (Primer) ที่ใช้สำหรับเพิ่มปริมาณพันธุกรรม (DNA) ที่จำเพราะต่อสปี ชีส์ (species) ของเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตั้งแต่ 1 ชนิดขึ้นไป ซึ่งชนิดของคู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ที่จำเพาะต่อสปีชีส์ (species) ของเชื้อรากลุ่ม มาลาสซีเซีย (Malassezia) เลือกได้จาก คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย โกลโบซา (Malassezia globosa) มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cgt aca ata agt gtg tct ctg gcg -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gtt tcg ctg cgt tct tca tcg -3’ คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์(forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata cgg acg caa aca cg-3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- tcg ctg cgt tct tca tcg -3’ คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cgt gga act tgg ttg gac cat -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cgt ttc gct gcg ttc ttc atc -3’ คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย สล็อฟฟิอี้ (Malassezia slooffiae) มีลำดับเบสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cac gct aac aca acg tgc-3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcg gaa tac cac aga gcg -3’ คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) มีลำดับเบสดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- cgc tact cg cgt aca acg tct ctg -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gtt tcg ctg cgt tct tca tcg -3’ - คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย) แพคคีเดอร์ มาติส (Malassezia pachydermatis) มีลำดับเลสดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) มีลำดับเบสเป็น 5’- gcc ata cgg atg cgc aag -3’ - รีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) มีลำดับเบสเป็น 5’ tcg ctg cgt tct tca tcg a -3’

   3. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง สามารถ ประกอบเพิ่มเติมด้วย ชุดน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาเพื่อการตรวจวินิจฉัยเชื้อราในกลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ซึ่งประกอบด้วย - น้ำยาสิบเอ็กพีซีอาร์ บัฟเฟอร์ (10XPCR buffer) ประกอบด้วย 50 มิลลิโมลาร์ โพแทสเซียมคลอ ไรด์ (millomolar Potassium chloride; mM KCL), 10 มิลลิโมลาร์ ทริสไฮโดรคลอไรด์ (millimolar Tris- Hydrochloride; mM Tris-HCL pH 8.3) และ 1-1.5 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมคลอไรด์ (millimolar Magnesium chloride; nM MgCl2) - น้ำยาดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) ประกอบด้วย ดีเอ็นทีพี มิกซ์ (dNTPs mix) 4 ชนิด คือ ดีเอทีพี (dATP), ดีซีทีพี(dCTP), ดีจีทีพี(dGTP) และ ดีทีทีพี(dTTP) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ - น้ำยาแม็กนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ - น้ำยาแท็ก ดีเอ็นเอ โพลีเมอร์เรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร - น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad)

   4. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง สำหรับการทดสอบใน 1 ปฏิกิริยา ต่อการใช้คู่ไพรเมอร์ 1 ชนิด สำหรับตรวจสอบหาสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) และสปีชีส์ (species) ของเชื้อราในกลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) โดยมี ส่วนประกอบดังนี้ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่าง ละ 0.6-1.5 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6-0.9 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดีเอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 ยูนิต ต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม - น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซีอาร์ (PCR grad) ใช้สำหรับปรับปริมาตรให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
5. 5. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-4 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (Primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรากลุ่มมาลาสซี เซีย (Malassezia) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด คือ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forword primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 1.5 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCI2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.9 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 unit ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม - ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
6. 6. ชุด ตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-5 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย โกลโบซา (Malassezia globosa) หรือ คู่ไพรเมอร์ (Primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) หรือ คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของ เชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด คือ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรา มาลาสซีเซีย โกลโบซา (Malassezia globosa) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.6 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10 X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 Unit ต่อ ไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม - ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอีออน (deionized distilled water) ที่มีความบริเสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
7. 7. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-6 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อมาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด คือ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรา มาลาสซีเซีย ซิมโพเดีย ลิส (Malassezia sympodialis) 1 คู่ประกอบดด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forword primer) และรีเวอร์สไพร เมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.75 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10 X ปริมาตร ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP,dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 Unit ต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร (Malassezia sympodialis) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Master mix) ที่เหมาะสมที่สุด คือ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรา มาลาสซีเซีย ซิมโพเดีย ลิส (Malassezia symprdialis) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เอวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพร เมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.75 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP,dGTP, และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6, ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 Unit ต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรม (DNA) ที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม - ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสทุธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
8. 8. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-7 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย สล็อฟฟิอี้ (Malassezia slooffiae) หรือ คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคี เดอร์มาติส (Malassezia pachydermatis) มีปริมาณส่วนประกอบของน้ำยาทดสอบ (Maste mix) ที่ เหมาะสมที่สุด คือ - ไพรเมอร์ (primer) สำหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรา มาลาสซีเซีย สล็อฟฟิอี้ (Malassezia slooffiae) 1 คู่ ประกอบด้วยฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) และรีเวอร์สไพรเมอร์ (reverse primer) ที่มีความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 0.6 ไมโครลิตร - พีซีอาร์แอกชั่น มิกซ์ (PCR reaction mix) ประกอบด้วยพีซีอาร์บัฟเฟอร์ (PCR buffer) ความ เข้มข้น 10X ปริมาตร 3 ไมโครลิตร, ดีเอ็นทีพี (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP ที่ มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.6 ไมโครลิตร, สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (Magnesium chloride; MgCl2) ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 0.9 ไมโครลิตร และเอนไซม์ (enzyme) แท็กดี เอ็นเอโพลิเมอเรส (Taq DNA polymerase) ความเข้มข้น 5 Umit ต่อไมโครลิตร ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร - สารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 1-50 นาโนกรัม - ปรับด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธิ์ระดับพีซี อาร์ (PCR grad) ให้ได้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 30 ไมโครลิตร
9. 9. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-8 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้ เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหภูมิเพื่อเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ตามขั้นตอนดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) หรือ โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ด้วยวิธีทัชดาวน์พีซีอาร์ (Touchdown PCR) อย่างใดอย่างหนึ่ง ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealling) ที่อุณหภูมิ 57-65 องศาเซลเซียส นาน 20-45 วินาที ขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 25-45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 10-30 รอบ (cycle) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที สำหรับเฉพาะการโปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ด้วยวิธีทัชดาวน์พีซีอาร์ (Tochdown PCR) จะทำการตั้งโปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) นี้อีกรอบซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที ขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 20 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition) rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา)
10. 10. ชุดตรวจวินิจฉัยเชื้อรากลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-9 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ ซึ่ง การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเลส หรือ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) โดยใช้เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler หรือ PCR machine) มีเงื่อนไขของโปรแกรมอุณหถูมิเพื่อ เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ที่ความเหมาะสมที่สุดสำหรับแต่ละคู่ไพรเมอร์ ดังนี้ ก. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ในระดับสกุล (Genus) ของเชื้อรา กลุ่มมาลาสซีเซีย (Malassezia) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นเชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ข. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย โกลโบซา (Malassezia globosa) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำกทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ค.คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย ซิมโพเดียลิส (Malassezia sympodialis) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภุมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycle) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิ่ง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ง. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เรสทริกต้า (Malassezia restricta) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) สำหรับไพรเมอร์คู่นี้ในขั้นตอนแอมพลิฟิเคชั่นจะ ใช้วิธีทัชดาวน์ พีซีอาร์ (Touchdown PCR) ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนีบลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 67 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 25 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 10 รอบ (cycles) และทำการตั้งโปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) นี้อีกรอบ ซึ่งประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอเรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็ก เท็นชั่น (Extension) ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 20 รอบ (cycles) โดย อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 7 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิ่ง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) จ. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย สล็อฟฟิอี้ (Malassezia slooffiae) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycle) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิ่ง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ฉ. คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน 30 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cucler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิ่ง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา) ช.คู่ไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA) ของเชื้อรามาลาสซีเซีย แพคคีเดอรร์ มาติส (Malassezia pachydermatis) ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรี-ดีเนเจอร์ (Pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (Amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (Denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (Annealing) ที่ อุณหภูมิ 57 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (Extention) ที่อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 45 วินาที ทำซ้ำทั้งหมด 30 รอบ (cycles) โดยอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) ของเครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ (Thermal cycler) เป็น 5 องศาเซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมไฟนอล เอ็กเท็นชั่น (Final extention) ใช้อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส นาน 4 นาที ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิ่ง (Cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 4 องศาเซลเซียส (ไม่จำกัดเวลา)