SU1254004A1 - Способ получени @ - блочной кислоты - Google Patents

Description

f

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к способу получени  L- б- лочной кислоты из фумаровой путем ферментативной гидратации последней под воздействием фермента фумаразы дрожжей.

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого продукта.

Способ осуществл ют следующим образом.

J Превращение фумаровой кислоты в  блочную провод т с помощью обладающих фумаразной активностью свободны или иммобилизованных дрожжей Saccha romyces cerevisiae, Sacchaiorayces vi ni НЛИ Caiididy lipolytica.

Дрожжи подвергают предварительному активированию.

Дл  активировани  С. lipolytica и Sacch.. vlni используют влажные биомассы, полученные после выращивани  на среде с н -алканами (С. lipolytica) или мелассой (Sacch. vini), сепарировани  и последующей промывки водой.

Дл  активировани  Sacch. cerevisiae приготавливают смесь, содержащую , %: дрожжи 44,15-44,4i вода 44 15-44,4 i калий фосфорнокислый двухзамещенный 1,55-1,99; магний сернокислый 0,,26; фумарова  кислота 0,88-0,89 и гидроокись кали 0,88-0,90, рН смеси 7,2-7,4. Дрожжи в этом растворе инкуби- pysoT при 28-30 С и встр хивании в течение 18-22 ч. Затем добавл ют 7,68-7,73% толуола и продолжают инкубировать при 35-39°С и встр хивании в течение 60-80 мин.

Активирование осуществл ют путем выдерживани  полученных биомасс дрожжей в замороженном состо нии, этого достаточно вьщерзсивать их йри температуре от -5 до -9 С.

определени  активировани  дрожжей став т опыты с добавлением разшлх количеств субстрата реакции (фумаровой кислоты) в расчете на 1 сухой биомассы дрожжей. Об эффекте активировани  суд т по времени в течение которого не менее 80% фумаровой кислоты преврапщетс  в  блочную , а также по максимальному количеству образовавшейс   блочной кислоты в расчете на t г сухой биомассы дрожжей.

Результаты экспериментов пред- етавлены в табл. 1-3.

54004J

Как видно из таблиц, использование активированной путем замораживани  биомассы дрожжей во всех слу- ча х приводит к ускорению фермента5 тивного превращени  фумаровой кислоты в  блочную по сравнению с использованием неактивированных таким способом дрожжей при прочих одинаковых услови х,

10 Наиболее оптимальньй режим работы в диапазоне 34,8-1112 г фумаровой кислоты (субстрата) на 1 г сухой биомассы дрожжей. Ниже 34,8 г фумаровой кислоты в инкубационной сре15 де проводить процесс нецелесообразно из-за низкого абсолютного выхода  блочной кислоты. Верхний предел оп- тимального содержани  фумаровой кислоты в инкубационной смеси 20 1112 г на Г г сухой биомассы дрожжей Saccharomyces vini.

При увеличении количества субстрата выше этого значени  эффективность превращени  фумаровой кисло25 ты в  блочную при использовании активированных дрожжей понижаетс  «, (табл,2, вариант 7),

Дл  более эффективного превращени  фумаровой кислоты в  блочную

30 активированные дрожжи иммобилизуют.

5 1ммобилизацию дрожжей осуществл ют путем помещени  их в камеру, выпол- неннзпо из полупроницаемой мембраны, например в герметичный целлофановый

35 мешок или трубку. Превращение фумаровой кислоты в  блочную происходит эффективнее, если дрожжи в целлофановом мешочке или трубке погружать в верхние слои раствора фума40 ровой кислоты (табл,4).

Как видно из таблицы, при нахождении иммобилизованных дрожжей в верхних сло х раствора фумаровой кислоты скорость реакции намного

45 выше. Это объ сн етс  тем, что образующа с   блочна  кислота пареме- щаетс  в нижние слои инкубационной смеси из-за большей удельной массы по сравнению с фумаровой кислотой.

При иммобилизации дрожжей Sacch. cerevisiae pfin их стабилизировани  в камеру из полупройацаеМой мембра- ,ны ввод т гемоглобин в количестве 3-20 мае,% или суспензию эритроци- тов в количестве 7-450 об.% от объема содержимого камеры (табл.5 и 6). Суспензию эритроцитов получают центрифугированием крови быка с после-

.,

дующим промьшанием 0,9%-ным раствором хлористого натри .

Из табл.5 видно, что при увеличении количества гемоглобина в целлофановом мешочке с хлебопекарными дрожжами, катализирующими превращение фумаровой кислоты в  блочную в последовательных циклах, увеличиваетс  число циклов, осуществл ющих 80%-ное превращение, уменьшаетс  врем  их завершени , а также возрастает число последовательных циклов с сохранением каталитической активности дрожжей, наблюдавшейс  в первом и втором циклах. Минимальное число циклов, в которых имеет место 80%-ное превращение фумаровой кислоты в  блочную, наблюдаетс  в отсутствие гемоглобина. Все это свидетельствует о стабилизирующем действии гемоглобина на фумаразную активность иммобилизованных хлебопекарных дрожжей.

Из табл.6 видно, что аналогичное стабилизирующее действие на фумаразную активность иммобилизованных хлебопекарных дрожжей- при их функционировании в. последовательней циклах оказывают добавки суспензии эритроцитов быка. Целесообразно вводить 7- 450 об.% суспензии эритроцитов от объема содержимого камеры. Более низкие концентрации оказывают понижен- ньм стабилизирующий эффект. Вводить количества суспензии эритроцитов больше 450 об.% нецелесообразно, так как уже это количество занимает почти весь целлофановый мешочек.

Пример 1.1г влажной биомассы Candida lipolytica, выращенной на среде с и-алканами, отсепариро- ванной и промытой водой, замораживают до (-5)-(-9)С и вьщсрживают в замороженном состо нии в течение 7 сут. Затем дрожжи смешивают с 800 мл 1,5 М раствора фумарата аммони , содержащего 180 г соли (рН 7,9) до образовани  гомогенной суспензии. Полученную суспензию, содержащую 558 г фумаровой кислоты в расчете на 1 г сухой биомассы С. lipolytica, выдержирзют при комнатной температуре (18-25-С). Превращение фумаровой кислоты в  блочную контролируют методом тонкослойной хроматографии . на пластинках Силуфол в системе этанол : концентрированный раствор аммиака (8,5:1,5 по объему). Про в5

540044

ление пластин после высзтаивани  при. осуществл ют после обработки 0,1%-ным водно-спиртовьм раствором бромфенола синего.

5 О количестве образующейс   блочной кислоты и уменьшении количества фумаровой кислоты суд т путем сравнени  интенсивности п тен с контрольными (наносимыми на пла:стинку разtO ными количествами  блочной и фумаровой кислот). На стартовую линию хро- матограммы наноситс  также некоторое количество  нтарной кислоты, что позвол ет судить о ее наличии в инкуба 5 ционной смеси.

В табл.7 приведены результаты превращени  фумаровой кислоты в  б- 1лочную в процессе инкубировани  дрожжей С. lipolytica.

20 Из таблицы следует,что за 16 сут в растворе получено 515 г  блочной кислоты в расчете на 1 г сухой биомассы .

После окончани  процесса в инкубационную смесь добавл ют концентрированную сол ную кислоты до рН 1-2. Полученную смесь выдерживают при (+5)-(-ИО) с в течение 16-20 ч, затем отфильтровывают от осадка фума0 ровой кислоты, которую высушивают и оставл ют дл  регенерации. В полученном фильтрате, нагретом до 48- 55°С, при размешивании раствор ют 35,6 г растертой гидроокиси каль5 ци . Полученньй раствор охлаждают при размешивании, при этом, начина  примерно с , выпадает белый осадок. Полученную суспензию вадерживают при периодическом перемешивании при

0 ()-(+10)°С в течение 16-20 ч, затем выпавший в осадок кислый  блочно-кислый кальций отфильтровывают и раствор ют в 1990 мл воды при и помешивании. {1еобходимое количество

5 гидроокиси кальци  дл  получени 

кислого малата кальци  и необходимое количество воды дл  получени  8%-но- го раствора последнего рассчитывают на основании достигнутой степени

0 превращени  фумаровой кислоты в  блочную во вз том объеме 1,5 М раствора фумарата аммони ).

Раствор кислого малата кальци  5 пропускают через термостатируемую при 55 С колонку с катионитом КРС-10 в водородной форме. Получаемый кислый раствор  блочной кислоты упари ют в вакууме досуха, не допуска  нагревани  выше .

Выход  блочной кислоты -88,75 г. Пример 2.К суспензии то- верных хлебопекарных дрожжей производственного объединени  Друва приготовленной как описано вьше и хранившейс  в течение 87 сут при (-5)-(-20)С, добавл ют пенопласт в кусочках (примерно 2 2 2 мм) до покрыти  всей поверхност-и, все осторожно перемешивают. Освобожденную с помощью пенопласта от толуола суспензию сливают с кусочков пенопласта и центрифугируют. К 0,62 мл полученного после центрифугировани  прозрачного экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей (что соответствует 0,31 г влажных дрожжей, удельный вес которых приблизительно 1 г/мл) добавл ют 0,5 г сухого фумар 1та аммони  и 1,3 мл хранившейс  при (5)- (-9) € суспензии эритроцитов быка, перенос т все в целлофановый мешо- чек, и удал ют из него воздух.

Зав занный целлофановьй мешочек с раствором экстракта суспензи  хлебопекарных дрожжей с общей рабочей поверхностью 31 см вьщерживают при комнаткой температуре (18-25°С) в верхних сло х следующих друг за другом порций объемом 58 мл t,5 М фу- марата аммони , содержащих 13 г со- ли°(рН 7,9) до достижени  80-83% превращени  фумарата в  блочную кислоту . Прореагировавшие смеси сливают вместе н хран т до выделени  Ь- блочной кислоты при температуре от О до . Контроль за процессом осуществл ют по примеру 1. Примеси  нтарной кислоты не обнарзшено,

Первый цикл завершен за 10 сут, последующие 6 циклов завершены за 9-10 сут каждый, т.е. в течение 66 сут на прот жении 7 циклов препарат работает с полным сохранением начальной фумаразной активности. Последующие 5 циклов завершены за 15- 17 сут ка вдый. Таким образом, до завершени  12-го цикла включительно, т.е. около 5 мес., препарат работает с активностью, превьшак дей 50% начальной . Дальнейшие даклы завершаютс  за 25-28 сут каждый, ПоЬле завершени  23 циклов (14 мес. работы) получено 1304 мл прореагировавшей ш- кубационной смеси, из которой вьще- лен 131 г  блочной кислоты способом рписанньм в примере 1.

Таким образом, в расчете на 1 г сухой биомассы дрожжей образовано 2700 г . блочной кислоты.

Пример 3. Из дрожжей Saccha- romyces vini (расса Феодоси ), выращенных на среде с мелассой, отсе- парированных, промытых водой и хран щихс  при температуре от -5 до -9 с в течение 42 сут, готов т однороднуто суспензию путем смешивани  0,1 г прессо/занной биомассы с 1 мл 1,5 М фумарата аммони , содержащим 0,225 г соли (рН 7,9). К 0,2 мл полученной суспензии, содержащей 0,02 г

влажных дрожжей, добавл ют 346 мл 1,5 М фумарата аммони  (0,78 г) перенос т в целлофановый мешочек, из которого удал ют воздух. Зав занный мешочек с суспензией дрожжей общей

рабочей поверхностью около 31 см вьщерживают при комнатной температуре (18-25 С) в верхних сло х следующих друг за другом порций объемом 60 мл 1,5 М фумарата аммони , содержащим 13,5 г соли (рН 7,9), до дос- тижени  80-95% превращени  фумаратаа в  блочную кислоту. Прореагировавшие реакционные смеси собирают и хран т при температуре от О до +5°С до выделени   блочной кислоты, которое осуществл ют по примеру 1.

Первый цикл завершен за 20 сут, последую цие 5 циклов завершены за 20-22 сут каждый, седьмой цикл завершен за 19 суток. Таким образом, в течение 143 сут на прот жении 7 последовательных циклов препарат иммобилизованных дрожжей работает с полньм сохранением исходной фумаразной активности. На этой стадии полу- чено 416 мл прореагировавшей реакционной смеси, из которой выделено 56,4 г  блочной кислоты способом, описанным в примере 1. Таким образом, в расчете на 1 г сухой биомассы дрож

зкей получают 1 3400 г   ал очной кислоты.

Пример 4. 50 г хлебопекарных дрожжей производственного объединени  Друва смешивают с 50 мл раствора, содержащего 1,75 г кали  фосфорнокислого двухзамещенного, 0,2 г сульфата магни  и 1 г фумаро- Бой кислоты (рН 7,2-7,4). При необходимости рН довод т до требуемого значени  с помощью КОН.

Полученр. ую суспензию выдерживают при 28-30 С и встр хивают в течение 18-22 ч. Затем к ней добавл ют 10 мл

толуола и продолжают встр хивать при в течение l-t,2 ч. Обработанную толуолом суспензию вьщержи- вают 30 сут при температуре от -5 до -20°С. Затем к ней добавл ют кусочки пенопласта ( мм) до покрыти  всей поверхности и осторожно перемешивают . Освобожденную таким способом от толуола суспензио дрожжей сливают с кусочков пенопласта и центрифуги- руют,

К 2 мл полученного после центрифугировани  прозрачного экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей,что соответствует 1 г влажных дрожжей, добавл ют 50 мл 1,5 М раствора фума- рата аммони , содержащее И,25 г соли (рН 7,9). При таком соотношении на I г сухой биомассы дрожжей приходитс  34,8 г фумаровой кислоты.

Ckecb инкубируют при 40°С, Через сутки 85% фумаровой кислоты превращаетс  в  блочную, что соответствует образованию 34,2 г  блочной кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей.

При использовании хлебопекарных дрожжей, не подвергнутых активированию , при прочих одинаковых услови х 85%-ное превращение фумаровой кислоты в  блочную наблюдаетс  только через 3 сут.

Контроль за процессом и вьщеление  блочной кислоты осуществл ют по примеру 1.

Пример 5. Из дрожжей Saccha romyces vini (расса Феодоси ), выращенных на среде с мелассой, отсе- парированных, промытых водой и выдержанных при -(5)-(-9)С в течение 17 сут, готов т однородную суспен- зию путем смешивани  1 г прессованной биомассы с 1600 мл t,5 М раствора фумарат,а аммони , содержащего 360 г соли (рН 7,9), что соответствует 1112 г фумаровой кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей.

Инкубирование осуществл ют при комнатной температуре, через 11 сут 80% фумаровой кислоты превращаетс  в  блочную. Выход  блочной кислоты составл ет t028 г на 1 г сухой биомассы дрожжей.

При применении дрожжей, хранившихс  при температуре от О до +5°С в течение 8 сут, т.е. е подвергну- тых активированию путем зш оражива- ни , при прочих одинаковых услови х за этот же период време только 30%

Фз маровой кислоты превращено в  блочную .

Контроль за процессом и вьщеление  блочной кислоты осуществл ют по примеру 1 .

Пример 6. 0,1 г влажной биомассы хлебопекарных дрожжей, хранившихс  при температуре от -5 до -9 °С в течение 145 сут, помещают в целлофановый мешочек, в который добавл ют 0,84 мл 1,5 М раствора фумарата аммони , содержащего О,19 г соли (рН 8,2), 0,01 г фумарата аммони  и Oj063 мл суспензии эритроцитов быка , что составл ет приблизительно

7об.% от объема содержимого камеры. Целлофановый мешочек с рабочей поверхностью 9,9 см, из которого предварительно удален воздух, зав зывают и помещают в 1,5 М раствор фумарата аммони  (рН 8,2) объемом

14 мл, что соответствует содержанию 3,15 г соли.

За протеканием процесса след т по примеру 1. После превращени  8U- 90% фумаровой кислоты в  блочную целлофановый мешочек перенос т в новую порцию фумаровой кислоты.

Результаты представлены в табл.6.

Как видно из таблицы, добавление суспензии эритроцитов быка оказывает заметное стабилизирующее действие.

8циклах 1-4 не менее 80% превращени  фумаровой кислоты в  блочную происходит в течение 7-11 суток, а

в последующих циклах - в течение 21- 22 сут.

Без добавлени  суспензии эритроцитов уже во втором цикле в течение 10-21 суток достигнуто только 40% превращени  фумаровой кислоты в  блочную.

Пример 7. 0,1 г влажной биомассы хлебопекарных дрожжей, хранившихс  при температуре от -5 до в течение 145 сут, помещают в целлофановый мешочек, в который добавл ют 0,2 г сухого фумарата аммони  и 0,9 мл суспензии эритроцитов быка, что составл ет 450 об.% от объема содержимого камеры. Целлофановый мешочек , из которого предварительно удал ют воздух, зав зывают и помещают в 1,5 М раствор фумарата аммони  (рН 8,2) объемом 14 мл, что соответствует содержанию 3,15 г соли .

За процессом след т по примеру 1.

После превращени  80 90Z фумаро- йой кислоты в  блочную целлофановый мешочек перенос т в новую порцию раствора фумарата аммони . Результаты представлены в табл.6.

Как видно из таблицы, длитель- иость превращен   основного количества фумаровой кислоты s  блочную в первых двух 1щклах составл ет 7 сут, в следующих трех циклах- сут.,

Вли ние активировани  дрожжей на превращение фумаровой

кислоты в  блочную

17,4 69,6

Таблиц а 2

Вли ние активировани  дрожжей Saccharomyces vini на гфевращение фумаровой кислоты в  блочную

Биомасса не заморожена

17,4

То же

557,0

Реализаци  предлагаемого изобретени  позвол ет значительно увеличить скорость по. .учени  L- блочной кислоты и выход продукта в расчете

на 1 г биомассы дрожжей, упростить процесс при использовании дрожжей , иммобилизованньк предложен- :шм способом, а также снизить затраты на получение целевого

продукта.

Таблица 1

7 8

17,45 68,3

За t9 сут в  блочную кислоту превращено около 5% фумаррвой

16,8

14

514,6

2224,0

-ТаблицаЗ

Вли ние активировайи  дро скей Saccharomyces cerevisiae на превращение фумаровой кислоты в  блочную

Вномасса Кб заморожена

Биомасса заморожена

То же

(Другой образец)

За 24 сут в  блочную кислоту превращаетс  не более 70% фума- ровой кислоты

1

2 2

34,2

34,2 16,1 32,2

13

Влви ние положени  полупроницаемой камеры с дрожл ами в инкубационной среде на превращение фумаровой кислоты в  блочкую

1

2

6 6

54

37

414

515

Таблица 5

Вли ние гемоглобина на превращение фумаровой кислоты в  блочную иммобилизованнымн дрож- Saccharomyces cerevisiae

Врем  (сут), 33 течение которого в каждом цикле не менее 80% фумаровой кислоты превращаетс  в  блочную, зз зависимости or количества

Фжл

гемоглобина в полупроницаемой камере с дрожжами.

0

10

Цикл

14 Продолжение табл.5

Врем  (сут) в течение ко- i торого в каждом цикле не менее 80% фумаровой кислоты превращаетс  в  блочную, в зависимости от количества гемоглобина в полупроницаемой камера с дрожжами, мае.%.

Е1П1Г

10

20

7 8

10

11римечание, В цикле 3 через 22-31 сут достигнуто лишь 60% превращени  фумаровой кислоты в  б- лочную; в цикле 4 через 1О-17 сут достигнуто лишь 70% превращени  фумаровой кислоты в . блочную; в цикле 6 через 21-28 сут достигнуто лишь 20% превращени  фумаровой кислоты в  блочную; в цикле 7 через 10- 16 сут достигнуто лишь 40% превращени  фзт аровой кислоты в  блочную; в цикле 10 через 6-9 сут достигнуто лишь 40% превращени  фумаровой кислоты в  блочн5то.

Таблица 6,

Вли ние суспензии эритроцитов на превращение фумаровой кислоты в  блочную иммобилизованными дрожжами Saccharomyces cerevisiae

10 10 12

Продолжение табл. 6

сут) в течение ко- торого в кеакдом цикле не менее sot фумаровой кислоты превращаетс  в  блочную, в зависимости от количества суспензии эритрощггов в полупроницаемой камере с дрожжами, об.Х

ГнТззТюо

Примечание. В цикле 2 через 10-21 сут достигнуто лишь 40% превращени , фумаровой кислоты в  блочную , в цикле 7 через 21 сут достигнуто лишь 70% превращени  фумаровой кислоты в  блочную, в цикле 6 через 14-15 сут достигнуто лишь 70% превращени  фумаровой кислоты в  блочную , в цикле 7 через 14-15 сут достигнуто лишь 70% превращени  фумаровой кислоты в  блочную, в цикле 8 через 13-15 сут достигнуто лишь 65% превращени  фумаровой кислоты в  блочную.

Редактор Л. Повхан

Составитель Л. Минаева

Техред М.Ходанич Корректор А. Обручар

4687/29

Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного ксмитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

14 оизводственно-полиграфнческое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна ,4

Превращение фумаровой кислоты в  блочную свободными дрожжами Candida lipolytica

to

450

3

14 16 20

10 30 70 80 80

Нет Нет

30

Claims (4)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЯБЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ, предусматривающий введение свободных или иммобилизованных дрожжей рода Candida или Saccharomyces в раствор соли фумаровой кислоты с последующим инкубированием и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, перед введением осуществляют активирование дрожжей, а фумаровую кислоту используют в виде водного раствора ее соли из расчета 34,8-1112,0 г фумаровой кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей .

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активирование дрожжей проводят путем выдерживания в замороженном состоянии.

3. Способ поп.1, отличающийся тем, что иммобилизацию осуществляют путем введения дрожжей в камеру, образованную полупроницаемой мембраной, а инкубирование их осуществляют путем помещения в верхний слой раствора соли фумаровой кислоты.

4. Способ поп.З, отличающийся тем, что при иммобилизации дрожжей рода Saccharomyces в камеру дополнительно вводят от 7 до 450% суспензии эритроцитов от объема содержимого камеры.

>

1 1254004 2