SU1018970A1 - Способ определени содержани живых микроорганизмов - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ в исследуемом образце, предусмвтрк&ак дий приготовление суспензии микроорганизмов в водной среде, отличающийс   тем, что, с целью ускорени  и упроще НИН способа, суспензию микроорганизмов окрашивсиот красителем на мертвые клетки, ведут..подсчет окрашенный мертвых клеток, затем суспензию инактивируют путем нагрева при 70-100 с в . течение 0,5-5 мин или путем химической обработки, после чего ведут подсчет общего кэличества окрашенных мертвых клеток и по разнице двух пбщсчетов определ ют содержание живых клеток в суспензии. (Л С

Description

Изобретение относитс  к микробиор1огии , в частности к методам определени  живых микроорганизмов, и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Известен способ определени  числа живых микроорганизмов путем высева на питательные среды с подсчетом числа выросших колоний 1.

Недостатками данного способа  вл ютс  длительность, составл юща  от одного до -нескольких дней, и об зательное условие соответстви  состава реды потребност м определ емых мик роорганизмов , что трудно выполнимо при определении смешанных попул ций микроорганизмов из ферментеров и объектов окружающей среды

Извертен способ определени  живых и мертвых бактерий путем окраски образца красителем акридиновым оранжевым и подсчета числа бактерий, евет се .ихс  красньм (мертвые) и зеленым (живые) светом {2J,

Недостатком этого способа  вл етс неоднозначность результатов/ обуслов ленна , в частности, наличием в продбах инактивированных клеток, сохран ющих  дерный компонент, которые окрашиваютс  красителем в зеленый цвет.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту  вл етс  способ определени  содержани  живых микроорганизмов в исследуемом образце микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов в водной cpesae.

Способ состоим из следующих, операций мазок бактерий подсушивают на воздухе, фиксируют в фиксаторе Кариуа 20 мин, после чего снова подсушивают на воздухе не менее . Прдсутенный мазок окрашивацот азур-эозчком ври 20С в течение 24 ч, затем промыВа1ют в днетилл.ированной воде, подсушивают на воздухе,5-10 мин, докрашивают раствором крас-1тел  светлого зеленО1 о 1 мин, затем удал ют остатки краски, подсушивают и микроскопируют Живые клетки бактерий окрашиваютс  в сине-фиолетовый цвет, а мертвые KJiieTKH приобретают  рко-зеленую окраЬку 31.

Недостатками известного способ.а . вл ютс  больша  трудоемкость и длительность (более 26 ч).

° Целью изобретени   вл етс  ускорение и упрощение способа.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что соглас.но способу определени  содержани  живых Микроорганизмов в исследуемом образце, предчусматриваквдем приготовление сураензии микроорганизмов в водной среде, суспензию микроорганизмов с кра1 ЕИвают красителем на мертвые клетки, ведут подсчет окрашенных мертвых клеток, затем суспензию инактивируют. путем нагрева при

70-100С в 0,5-5 шн или путем химической обработки., после чего ведут подсчет общего количества окрашенных мертвых клеток и по разнице двух.подсчетов определ ют содержание живых клетон в суспензии.

Сущность способа заключаетс  в следующих операци х: добавление к суспензии красител , окраска в течение 3-5 мин, приготовление мазка дл  счета мертвых клеток, инактиваци  суспензии, содержащей, краситель, в течение 0,5-10 -мин, приготовление второго мазка дл  счета обш,его количества клеток, счет клеток в двух препаратах.

Одним из наиболее универсальных и удобных в работе красителей: на мертвые клетки  вл етс  флуорохром примулин , окрашивакщий клетки различных классов микроорганизмов. Нертвые клетки дрожжей хорошо окрашиваютс  также флоурохррмом тиазинов1цм красным и абсорбционным красителем метиленовым синим,

Оптимальным режимом тепловой инактивации  вл етс  нагрев суспензии при lO-lQffC 3 течение 0,5-5 мин (фиг. 1 И 2) .Применение более 1 изкой температуры ,более короткого,и в р де случаев более длительного нагрева приводит к уменьшению степени окраски клеток. При этом хорошее прокрашивание инактивированных клеток,отмечалось Дл  всех трех леречисленных красителей, причем окрашенные клетки хорошо видны , как в препаратах мазков, так и раздавленной капли .

Инактиваци  путем нагрева удобна тем. Что при небольшом времени нагрева практически не мен етс  объем клеточной суспензии, что облегчает расчет oличecтвa живых клеток.

Примером химической инактивации может служить обработка фенолом, котора  .дает . наилучшие рёзул.ьтаты при концентрации фенола 6-12% (фиг. 3) причем достаточно даже 30 секундной обработки (фиг. 4) . Обработка меньши ми и большими концентраци ми фенола приводит к ослабленной окраске клеток , кроме того, обработка большими концентраци ми фенола в случае применени  флуорохромов ведет к повышению люминесцекиии фона. Обработка фенолом путем добавлени  спиртового раствора или водной эмульсии приводит к хорошему окрашиванию клеток примулином и метиленовым синим (фиг. 3). После обработки фенолом можно готовить дл  счета как препараты сухих мазков, так и раздавленной капли .

Инактивацию можно проводить и другими дезинфектантами, например спиртом .

Инактивацию путем добавлени  жидкого химагента предпочтительнее проводить в тех случа х, когда по различным причинам нежелательна теплова  инактиваци :.в случае опредёдени  термофильных микроорганизмов, при наличии в пробе низкокип щих примесей и т.д.

Инактиваци  клеток в присутствии 5 красителей имеет CJ tf«yющиe преимуществ ва перед йнактивацие;й неокрашенн.ых клеток: она более экономична (требуетс  всего одна суспелзи ) и более удобна-дл автоматизации.10

Способ осуществим дл  различных .видов мйкроорганиэмов.: представителей энетеробактерий., грамотрицатель .ных а5 робиих хемргетеротрофов, кокков, ацилл, дрожжей. :15

; После инактивации в предложенных режимах клетки всех исследованных микроорганизм.ов сохран ли размер и форму и-поэтому легко были узнаваемы по морфологическим признакам. Количество микроорганизмов, окрашенных предлагаемым способом, можно оп:редел ть различными- методами-: све товой и люминесцентной микроскопией, автоматическим счетом на микрофотометре , или микрофлуор.иметре, а т.акже . макрометодами, в частности флуориметрией . ;. л.- ;, . .- ; . - : На фиг. 5 показана калибровочна  крива  дл  .окрашенной примулином сус-. рензи;й клезгрк Е.coll (17-часова  куль-30 vrypa, содержаща  практически одни живые клетки) до. и. посзле тепловой инак тивации с регистрацией ф-пуоресценции в кк1Вете на спектрофлуориметре. Инактиваци  -да,ет -ВОЗМОЖНОСТЬ измер ть ко- 35 личество первоначально живых клеток по приросту флуоресценции после инактивации и одределёнйю числа клето.к попрёдварительнс построенной калибров6чн зй кривой. Люминесценци  суо- дд пензии .мертвых клеток не увелйчивалась после инактивации

Использовали-культуру следующих . возрастов: Escherichia eoli - 17-часова , .Bacillus, thuringiensis - 17- « часова , Sac.charomyces carevisiai .- . 24 часова .

хШтенсивность люминесценции от отдельных клеток в мазках на предметных стеклах измер ли (вусловных единицах на лк 1инесцентном-микроскопе с помоью фотометрической насадки и выражали в процентах по отнощению .к наивысшей величине, полученной в дайной серии опытов.

Величину оптической плотности вы- 55 числ ют по Формуле , гд 1 - интенсивность падающего еве.та; I - интенсивность света, прошедшего через клетку.;1д и I измер ют на микроскопе МЛ- 2 с помощхгю фототермической на-60 садки при освещении црепарата мазка снизу красным светом, Величину оптичесно й плотности выражают в процентах по отношению к наивысшей величине , полученной в данной серии опытов

На фиг. 1 показана Зёшксиморть тепени окраски клеток к{ асител ми . т температуры при тепловой инактиваии: 1) E.coli 4: примулин; 2} Вас. hurinqiensis tj примулин 3) Sacch., erevisiae +. метиленрвый синий; ) Sacch. cerevisiae + тиазинрвый расный. ...-..Врем  тепловой инактивации - 2 мин

По оси ординат - процент устреденной интенсивности. люминес1з;ейции отельных клеток jp случае флрурйхромов, илй ус редненной в еличины рптичёскШ, плотности в случае не иленовогр.си в-. го..;. . , -...По оси абсцисс - температура ина стивации . : /

На фиг, 2 - зависимость степени окраски клеток красител ми от време ни .тепловой инактивации. 1). ,coli +: примулин; 2 Вас, thuringiensis + примулин| 3) Sacch, cereyisi. . тиленовьйй синий; 4) Sacch,: cerevi siae..+ тиазиновый красный.

Температура инактивации в случае Вас,- tharingiensis. - 8)°Сг в р гтальных случа х - , . - -.

nt оси ординат - то же, что и . н|1

фиг. 1 . .,. ;. : - .

По ОСИ абсцисс - врем  инактивацй.и

ja минутах..

.нафиг.З - зависимость бтепейи-ок раски клеток красител ми от койцентрйции фенола при инактивации: 1)Б«со11Ф . римулин; 2) Вас. thuringlensig . примулин; 3) Sacch. Qereviglae МЭ тиленовый синий. .. .

. Пр оси ррдаинат - то же,, что и на фиг, 1.. . ; : . по оси абсцисс - концентраци  фенола в процентах. . .

Возраст клеток - как на фиг. 1,

На фиг. 4 - зависимость степени окраски клеток красцтел мв рг Bpeneiни инактивации фенолоь : 1) E.coli + примулин; 2) Вас. thuriiigiensils + принулин; 3) Sacch. cereviaiae - Летиленовый синий.

Концентраци  фенола в случае дрржжёй - 10%/ в остальных случа х - 7%,

По оси ррдинат - то же, чтр и н;а фиг. 1..

По оси абсцисс -.врем  инактивации в минутах. . .

Возраст клеток - как на фиг. 1.

На фиг. 5 - зависимость флурресценции суспензии 1 -часовой культуры E.coli, окрашенной примулшк 4, от концентрации клеток, до и после инактивации: 1} суспензи  др инактивацииг 2) суспензи  после инактивации при в течение 30 с.

ПР оси ррдинат - интенсивность люминесценции .при нм (Алоэб. « 365.ИМ).

ПР рсиабсцисс 1 обща  концентраци  клетрк а пррбе «10 кл/мл,

Крвдентраци  примулина 30 мхг/ Измерени  проводились на спектрег флуориметре Aminco Bowman. Пример, К 1,8мл суспензии клеток В. coli (8-часова  культура), содержащей живые и мертвые клетки, добавл ют О,2 мл раствора примулина (1 мг/мл) на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,0 - 7,8, через 3 мин готов т Клеточный препарат по Виноградскому, считают число  рко флуоресцирующих мертвых клеток, а оставшуюс  суспензию прогре&ают 3 мин при , снова готов т клеточный препарат по Виноградскому , считают общее количество флоуресцирукщих клеток и по разнице между двум  отсчетами наход т число живых клеток. Клетки в препаратах просчитывают на люминесцентном микроскопе при возбуждении сверху синефиолетовым светом (объектив 90, окул р г 1 о). Пример2. К 1,8 мл суспензии 24-часовой культуры Sacch. cerevlsiae содержащей различные соотношени  жи- ВЕ0 и мертвых (убитых спиртом) клеток , добавл ют 0,2 мл водного раствора мети; енового синего (1 мг/мл) и провод т Операции, как указано в примере 1, за исключением того, что подсчет ведут на светопольном микроско ,пе при освещении снизу ,и считают клет ки,  рко окрашенные в синий свет. Приме г 3. К 1,8 мл суспензии клеток 17-часовой культуры Вас. thurlnglensls , содержащей ;н мертвые клетки, добавл ют 0,2 мл раствора примулина (1 мг/мл) на 1/15 М фгэофатном буфере рН 6,0-7,8, через 3 мин измер ют число мертвых  рко флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, затем добавл ют к суспензии фзнол ввиде концентрированного спиртового раствора до концентрации 7%, измер ют общее число флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, и по разнице между двум  отсчетами наход т число живых клеток. . Пример4.К1,8мл суспензии 24-часовой культуры Saccr. cereyisiae/ содержащей различные соотношени  живых и мертвых (убитых нагревом) клеток добавл ют 0,2 мл водного раствогра тиазинового красного (1 мг/мл), через 3 мин изАер ют число мертвых  рко флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, затем добавл ют к измер ют общее число флуоресцируюцих клеток, как указано в примере 1, и по разнице между двум  отсчетами наход т число живых клеток. Результаты определени  числа живых и мертвых клеток предлагаемым и контрольным способами представлены в таблице.

Окраска примулином , инакти102 ваци  теплом Окраска приму лином, инакти106 ваци  фенолом Окраска метиленовым синим, инактиваци  теплом

Окраска тиазиновым красным, инактиваци  этанолом

100 100

1:1 3:1

1:3

1:1

1:1,03 2,93:1,0

3:1

1:3,03

1:3

Таким- образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позвол ет | ускорить определение 026 ч до I IlfS 4j а также снизить трудоемкость

J

7

/

.,- I

за счет проведени  простых операций, не требующих омывок реактивов и позгвол кцих использовать один набор регистрируюдей аппаратуры.

5

ФигЛ

1

/

fS

10

Фаз.

Claims (1)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ в исследуемом образце, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов в водной среде, отличающийс я тем, что, с целью ускорения и упроще⁴*· ния способа, суспензию микроорганизмов окрашивают красителем на мертвые клетки, ведут·.подсчет окрашенных мертвых клеток, затем суспензию инактивируют путем нагрева при 70-100^сС в . течение 0,5-5 мин или путем химической обработки, после чего ведут подсчет общего количества окрашенных мертвых клеток и по разнице двух подсчетов определяют содержание живых клеток в суспензии. S