SK56394A3 - Anti-vaccine of streptococcus suis infection and method of its production - Google Patents
Anti-vaccine of streptococcus suis infection and method of its production Download PDFInfo
- Publication number
- SK56394A3 SK56394A3 SK563-94A SK56394A SK56394A3 SK 56394 A3 SK56394 A3 SK 56394A3 SK 56394 A SK56394 A SK 56394A SK 56394 A3 SK56394 A3 SK 56394A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- vaccine
- polypeptide
- streptococcus suis
- hemolysin
- vac
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 72
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 55
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 claims abstract description 43
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims description 42
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 32
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 29
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 claims 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 claims 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims 1
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 52
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 14
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 4
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- 101710173835 Penton protein Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001023795 Brochis Species 0.000 description 1
- 101710082751 Carboxypeptidase S1 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710179002 Hemolytic toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010036141 Polyserositis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430696 Protis Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007078 todd-hewitt medium Substances 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Vodíuna, protĽ inf.<^cÍÓ StreptccocAus sats cl zposob j<zj Vyroby
Oblasť techniky
Vynález sa týka polypeptidu Streptococcus suis, vakcíny na ochranu proti infekcii Streptococcus suis u ošípaných, protilátok, ktoré reagujú s polypeptidom Streptococcus suis a spôsobu výroby týchto protilátok.
Doterajší stav techniky
Streptococcus suis bol identifikovaný ako hlavná príčina infekčného ochorenia ošípaných, ktoré je charakterizované artritídou, septikémiou, meningitídou, perikarditídou, endokarditídou, polyserozitídou a/alebo pneumóliou (Clifton-Handley, F. A, Br. Vet. Journ. 139:1 až 5 1983),Vecht a ďalší, Vet. Quarterly 7: 315 až 321 (1985), Vindsor R. S.: Vet. Rec. 101 : 378 až 379 (1977), Higgins a ďalší: Can. J. Vet. Res. 54 : 170 až 173 (1990), Devriese a ďalší: Vet. Rec. 127 : 68 (1990) .
Chorobnosť je zvlášť vysoká u prasiatok medzi 3 až 12 týždňami veku (Vindsor R. S. a Elliot S. D., J. Hyg. Camb. 75 : 69 až 78 (1975), Guise a ďalší: Vet. Rec. 117 : 43 až 44 (1985), Hoffman L. J. a Henderson L. M. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28 Ann. Proc. 201 až 210 (1985). Hoci sa ochorením môžu nakaziť ošípané akéhokoľvek veku, mortalita ošípaných starších než 14 týždňov je nízka (Guise a ďalší: Vet. Rec. 117 : 43 až 44 (1985), Hoffman L. J. a Henderson L. M.: L. M. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28 Ann. Proc.: 201 až 210 (1985).
Z času na čas sa vyskytujú také prípady, pri ktorých uvedený mikroorganizmus vyvolá ochorenie aj u iných živočíšnych druhov alebo u človeka (Devriese a ďalší: Vet. Rec. 127 : 68 (1990), Hommez a ďalší: Vet. Rec. 123 : 626 až 627 (1988), Arends a ďalší: Rev. Infect. Dis. 10: 131 až 137 (1988), Gottschalk a ďalší: J. Clinic. Microbiol. 27: 2633 až 2636 (1989), Arends J. P. a Zanen H. C.: Rev. Infect.
Dis. 10: 131 až 137 (1988)). K infekcii v týchto prípadoch obvykle dochádza poranením kože.
Ochorenie Streptococcus suis bolo prvýkrát opísané v Holandsku (DeMoor C. E.: Antónie van Leeuwenhoek 29 : 272 až 280 (1963)). Od tej doby podal rad výskumných pracovníkov správu s výskyte tejto choroby v ďalších európskych krajinách a tiež v Kanade, v USA a v Austrálii (Sanford E. a Tilker M. E.: J. Am. Vet. Med Assoc. 23: 5 až 97 (1982), Perch a ďalší: J. Clin. Microbiol. 17: 993 až 996 (1983), Larson
D. J. a Kott B.: Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28 Ann. Proc.: 121 až 130 (1985), Guise a ďalší: Vet. Rec. 117 : 43 až 44 (1985), Clifton-Handley F. A.: Br. Vet. Journ. 139: 1 až 5 (1983)) .
Kmene Streptococcus suis boli rozdelené na veľké množstvo odlišných sérotypov.
Stanovenie sérotypov je založené na kapsulárnom polysacharidovom antigéne (Koehne a ďalší, Am. J. Vet. Res. 40: 1640 až 1641 (1979), Perch a ďalší, J. Clin. Microbiol. 17 : 993 až 996 (1983)).
Až dosiaľ bolo na celom svete preukázaných 29 rôznych sérotypov.
Určité sérotypy však v niektorých krajinách prevažujú. V škandinávskych krajinách prevažuje sérotyp 7, zatiaľ čo v Rakúsku sa najčastejšie vyskytuje sérotyp 9. Najrozšírenejším sérotypom po celom svete je sérotyp 2 (Gogolewski a ďalší, Aust. Vet. J. 67: 202 až 204 (1987), Boetner a ďalší, Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B 95: 233 až 239 (1987) .
Málo je dosiaľ známe o patogenézii, faktoroch virulencie alebo protektívnych antigénoch Streptococcus suis.
Neexistuje preto žiadne pravidlo, aké faktory sú potrebné na účinnú vakcináciu proti patogénu.
Jednou z bežných ciest na výrobu vakcíny proti bakreriálnemu ochoreniu je produkcia a skúšky s vakcínou, pripravených z celých buniek.
Tento postup bol použitý v prípade Streptococcus suis a ukázalo sa, že vakcína z celých buniek môže zaistiť účinnú ochranu ošípaných proti napadnutiu homológnym organizmom (Holt a ďalší, Res. Vet. Sci. 48: 23 až 27 (1990)).
Zdá sa však pravdepodobné (Kebede a ďalší. Vet. Microbiol 22: 249 až 257 (1990)), že ochrana, získaná pri použití prípravkov z celých buniek je špecifická pre použitý serotyp. Ďalšími všeobecnými a dobre známymi nevýhodami vakcín z celých buniek sú a) nežiadúce reakcie v mieste a v blízkosti miesta injekcie a b) veľké množstvo nešpecifickej bielkoviny, ktorá je podaná, v porovnaní s množstvom materiálu, ktorý skutočne vyvoláva ochranu.
Vzhľadom na skutočnosť, že v súčasnej dobe je na báze polysacharidového obalu známych už 29 odlišných sérotypov Streptococcus suis je zrejmé, že by vakcíny za použitia celých buniek mali obsahovať rad sérotypov na dosiahnutie spektra ochrany.
Takáto vakcína bola pripravená na ochranu ľudí proti pneumólii, vyvolanej streptokokmi (Boulnois G. J.: Journ. Gen. Microbiol. 138: 249 až 259 (1992).
Táto vakcína obsahuje 23 polysacharidov z najčastejšie sa vyskytujúcich sérotypov. Vakcína však má okrem svojej zložitosti ešte ďalšie podstatné nevýhody vzhľadom k nízkemu stupňu imunogenity kapsulárnych polysacharidov.
Z tohto dôvodu boli vyvíjané snahy stanoviť určujúce faktory, ktoré pravdepodobne hrajú úlohu v patogenézii ochorenia Streptococcus suis.
Boli opísané hemaglutiníny a fibrie ako potenciálne virulencie, avšak ich presná úloha alebo funkcia, pokiaľ ide o patogenézu nie sú známe a zodpovedajúce molekuly alebo bielkoviny neboli identifikované. (Jacques a ďalší, J. Bacteriol. 172: 2833 až 2838 (1990), Gottschalk a ďalší, J. Clin. Microbiol. 28: 2156 až 2158 (1990)).
Až dosiaľ boli považované za potenciálne faktory virulencie štyri bielkoviny:
a) bielkovina s molekulovou hmotnosťou 44 000 (Gottschalk a ďalší, Vet. Microb. 30: 59 až 71 (1992)).
b) bielkovina s molekulovou hmotnosťou 94 000 (Holt a ďal4 ší, J. Comp. Path. 1003: 85 až 94 (1990)),
c) bielkovina s molekulovou hmotnosťou 110 000 (extracelulárny faktor), (Vecht a ďalší, Infect. Immun. 59: 3156 až 3162 (1991), Vecht a ďalší, Infect. Immun. 60: 550 až 556 (1992), Smith a Vecht, PCT-patentová prihláška VO
92/16630)),
d) bielkovina s molekulovou hmotnosťou 136 000 (Muraminidase Released Proteín), Vecht a ďalší, Infect. Immun. 59: 3156 až 3162 (1991), Vecht a ďalší, Infect. Immun. 60: 550 až 556 (1992), Smith a Vecht: PCT-patentová prihláška VO 92/16630).
Bielkovina s molekulovou hmotnosťou 44 000 bola nájdená v patogénnom kmeni Streptococcus suis, sérotyp 2 a bolo preukázané, že nie je prítomná v nepatogénnej mutante tohto kmeňa. Antiséra, produkované proti mutante, neobsahujúce túto bielkovinu s molekulovou hmotnosťou 44 000 neboli dostatočné na dosiahnutie úplnej ochrany proti pôvodnému kmeňu. Bielkovina sa teda zúčastňuje vzniku virulencie.
Antisérum, produkované králikom proti bielkovine s molekulovou hmotnosťou 94 000 zo Streptococcus suis, sérotyp 2 zaisťuje u myší ochranu proti infekcii homológnym kmeňom.
Bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 110 000 a 136 000 sú prítomné vo vysoko patogénnych kmeňoch a nie je možné ich preukázať v nepatogénnych kmeňoch, pričom bielkovina s molekulovou hmotnosťou 110 000 nie je prítomná u kmeňov s nízkou patogenitou.
To by mohlo ukazovať na skutočnosť, že bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 110 000 a 136 000 sa zúčastňujú patogenézy. Na druhej strane neboli zatiaľ uverejnené žiadne správy o výsledkoch pokusov na izolátoch týchto bielkovín v uvedenom zmysle.
Je teda možné uzavrieť, že zatiaľ pokiaľ ide o potenciálne faktory virulencie, len bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 44 000 a 94 000 preukázateľne hrajú úlohu v ochrane proti sérotypu 2. Túto ochranu bolo možné preukázať len u myší a pri infekcii homológnym kmeňom.
Okrem toho bola zatiaľ prítomnosť štyroch vyššie uvedených bielkovín preukázaná len u kmeňov Streptococcus suis, sérotyp 2.
Ako už bolo vyššie uvedené, je vzhľadom na veľký počet rôznych sérotypov zrejmé, že by antigén, nezávislý na sérotype a poskytujúci sérologicky skríženú ochranu bol najvýhodnejším základom pre vakcínu. Takýto antigén však dosiaľ nebol pre Streptococcus suis opísaný.
Podstata vynálezu
Teraz bolo neočakávane zistené, že niektoré kmene Streptococcus suis vylučujú polypeptid s molekulovou hmotnosťou približne 54 000, ktorý môže byť aktivovaný tiolom a inhibovaný cholesterolom a má hemolytickú účinnosť.
Všetkým hemolytickým toxínom je spoločný fenomén poškodzovania buniek cicavcov rozrušením integrity membrány a/alebo jej funkcie. Toto rozrušenie je zrejme dôsledkom tvorby pórovitej štruktúry oligomérnymi formami toxínu, hneď ako prenikne do bunkovej membrány.
Bolo preukázané, že hemolytický polypeptid podľa vynálezu je toxín, aktivovaný tiolom. Toxíny, aktivované tioly sú účinné len v redukovanom stave a oxidáciou prechodne strácajú účinnosť (Smyth C. J. a Duncan J. L.: Bacterial Toxins and Celí Membranes Jeljaszewicz J. and Vadstrom T. (eds.) Londýn, Academic Press: 129 až 183 (1978)).
Napriek tomu, že úloha tiolovej skupiny zatiaľ nie je zrejmá, predpokladá sa, že ide o dôležitú časť motívu sekvencie, ktorá je podstatná pre vznik poškodenia membrán.
Mechanizmus cytolytického účinku niektorých skupín hemolyzínu predpokladá väzbu hemolytického polypeptidu na cholesterol v membráne cicavčej bunky. Hneď ako je bielkovina naviazaná na bunku, vstupuje do dvojitej vrstvy lipidov. Potom sa vytvoria oligomérne hemolyzínové komplexy, o ktorých sa predpokladá, že sú príčinou vzniku transmembránových pórov .
Bolo preukázané, že hemolytická účinnosť polypeptidu podľa vynálezu patrí do skupiny hemolyzínov, ktorú je možné inhibovať pôsobením cholesterolu. Cholesterol zrejme hrá kľúčovú úlohu pri väzbe hemolyzínu na cieľové bunky. Bol navrhnutý rad modelov, v ktorých je cholesterol primárnym miestom väzby toxínu v bunke. Voľný cholesterol je účinným inhibítorom cytolytickej účinnosti, čo môže byť vysvetlené tak, že v prípade, že je miesto väzby sterolu na toxín obsadené (voľným) cholesterolom, nemôže sa už ďalej viazať na cholesterol, viazaný na membránu (Boulnois a ďalší, Mol. Microbiol. 5: 2611 až 2616 (1991).
Pre hemolytický peptid podľa vynálezu bola stanovená molekulová hmotnosť 54 000. Táto molekulová hmotnosť bola stanovená bežnými postupmi za použitia elektroforézy na polyakrylamidovom géli, ako je opísané v príklade II. Dráha C na obr. 1 znázorňuje čistený polypeptid, ohraničený značiacimi molekulami (dráhy A a D).
Hemolytický polypeptid z jedného kmeňa Streptococcus suis, kmeň Pl/7, bol ďalej charakterizovaný stanovením svojho N-terminálneho reťazca aminokyselín. Reťazec č. 1 je uvedeným N-terminálnym reťazcom tohto polypeptidu. Hemolytické polypeptidy je možné izolovať z niektorých, avšak nie zo všetkých kmeňov Streptococcus suis. Môžu sa taktiež vyskytovať pre určité modifikácie v nukleových kyselinách génov pre hemolytické polypeptidy z rôznych kmeňov Streptococcus suis. Tieto modifikácie nemusia mať žiadny vplyv na reťazec aminokyselín zodpovedajúceho polypeptidu v prípade, že modifikácia je taká, že vzniká nový triplet, ktorý je kódom pre tú istú aminokyselinu. K tomu dochádza napríklad v prípade, že je G v tríplete CTG pre leucín nahradené C, takže vzniká iný triplet, ktorý je taktiež kódom pre leucín. Avšak v prípade, ak by došlo k náhrade T za použitia C, bol by nový triplet kódom pre prolín namiesto pre leucín. To by už viedlo k variácii v reťazci aminokyselín hemolytického polypeptidu.
Variácie v reťazci aminokyselín môžu byť dôsledkom náhrady jednej alebo väčšieho počtu aminokyselín ich funkčnými ekvivalentmi alebo vzácnejšie zavedením STOP-kodónu alebo v prípade vypustenia/zaradenia do nukleového reťazca môže dôjsť k vypusteniu alebo zaradeniu niektorej aminokyseliny naviac do reťazca aminokyselín. Často je možné pozorovať náhradu určitej aminokyseliny jej funkčným ekvivalentom. Príklady boli opísané v Neurath a ďalší, The Proteins, Academic Press, New York (1979), str. 14, obr. 6, ide okrem iného o náhradu alanínu serínom, Ala/Ser alebo VAl/lle, Asp/Glu a podobne. Okrem týchto variácii, pri ktorých dochádza k zaradeniu funkčného ekvivalentu pôvodnej aminokyseliny môže dochádzať aj k variáciám, v ktorých je aminokyselina nahradená inou aminokyselinou, ktorá však nie je jej funkčným ekvivalentom. Táto modifikácia sa však od predchádzajúcej líši len tým, že môže vzniknúť bielkovina s miernou modifikáciou vo svojom priestorovom rozložení.
Je samozrejmé, že variácie reťazca nukleových kyselín v kódovom reťazci pre hemolytický polypeptid, pri ktorých dochádza k takým variáciám v reťazci aminokyselín, pri ktorých je imunogénna účinnosť polypeptidu zachovaná, patria taktiež do rozsahu podstaty vynálezu.
Podstatu vynálezu tvorí aj vakcína, schopná zaistiť ochranu ošípaných proti infekcii Streptococcus suis, ktorá obsahuje vyššie uvedený hemolytický polypeptid alebo jeho časť, schopnú vyvolať imunologickú odpoveď na podanie hemolytického polypeptidu Streptococcus suis. Takúto vakcínu je možné získať napríklad za použitia syntetického polypeptidu, napodobujúceho polypeptid podlá vynálezu alebo jeho časť, schopnú vyvolať imunologickú odpoveď proti hemolytickému polypeptidu Streptococcus suis.
Ďalším možným spôsobom získania takejto vakcíny je biochemické čistenie hemolytického polypeptidu z bakteriálnej kultúry. Toto je možné dosiahnuť napríklad odstredením baktérií a použitím filtrácie na stĺpci gélu na oddelenie hemolytického polypeptidu od zvyšných zložiek. Ďalšie čistenie možno uskutočniť napríklad selektívnym zrážaním za použitia síranu amónneho s následným odstredením a rozpustením usadeniny vo vhodnom pufri.
Vakcínu uvedeného typu je možné získať aj molekulárnym klonovaním. Za použitia tohto postupu je možné klonovať re8 ťazec nukleovej kyseliny, ktorá je kódom pre polypeptid podlá vynálezu alebo časť tohto reťazca, schopnú vyvolať imunologickú odpoveď proti hemolytickému polypeptidu Streptococcus suis vo vektore pre expresiu a potom dosiahnuť expresiu vo vhodnom systéme pre expresiu. Produkt expresie je potom možné použiť ako vakcínu. Možnými systémami pre expresiu sú baktérie, kvasinky, huby a ďalšie systémy na báze buniek hmyzu a cicavcov.
Ďalším spôsobom získania polypeptidu je klonovanie genetickej informácie pre polypeptid vo vhodnom vírusovom vektore a využitie hostiteľskej bunky vírusu pre expresiu bielkoviny. Takýmto systémom môže byť napríklad vírus ovčích kiahní v kombinácii s bunkou cicavca, citlivou na polypeptid alebo baculovírus a bunky Spodoptera frugiperda. Čistené alebo surové lyzáty buniek obsahujúce polypeptid, produkovaný expresiou je potom možné použiť ako východiskový materiál pre vakcínu.
Ďalšia možnosť spočíva vo využití vírusov, ktorých hostiteľom je ošípaná, napríklad vírusu Live Recombinant Carrier. LRC je vírus, v ktorom bola klonovaná doplnková genetická informácia. Živočíchy infikované týmto rekombinantným vírusom budú produkovať imunogénnu odpoveď nielen proti imunogénom vo vektorovom víruse, ale aj proti imunogénnej časti alebo častiam polypeptidu alebo polypeptidov, pre ktoré bol klonovaný v rekombinantnom víruse genetický kód.
Vírus, ktorý je zvlášť vhodným materiálom je vírus LRC, z organizmov odlišných od ošípaných, je Pseudorabies. Tento vírus bol už s úspechom použitý ako LRC napríklad pre kombinovanú vakcináciu proti pseudorabies a proti cholere ošípaných .
Vo výhodnom uskutočnení obsahuje vakcína podľa vynálezu ešte ďalšie imunogény Streptococcus suis.
Bolo zistené, že antiséra proti Streptococcus suis, serotyp 2 - hemolytickému polypeptidu sú reaktívne s hemolyzínmi všetkých kmeňov Streptococcus suis, ktoré hemolyzíny vytvárajú, bez ohľadu na ich sérotypy.
Túto reaktivitu nebolo možné preukázať pre vyššie uve9 dené polypeptidy Streptococcus suis s molekulovými hmotnosťami 44 000, 94 000, 110 000 a 136 000.
Bez ohľadu na túto skutočnosť má vakcína podľa vynálezu, ktorá naviac obsahuje ešte jeden z týchto polypeptidov alebo akýkoľvek iný imunogén Streptococcus suis ešte lepšiu účinnosť. Táto vyššia účinnosť môže byť napríklad dôsledkom synergného účinku. Mohla by teda byť dosiahnutá ešte účinnejšia vakcína za použitia nižšieho množstva antigénu.
V ešte výhodnejšom uskutočnení vakcína obsahuje podľa vynálezu aj nosič, viazaný na polypeptid podľa vynálezu. Ako nosiče je možné použiť rôzne molekuly, napríklad haemokyaníny (Keyhole Limpet Haemocyanin), sérový albumín hovädzieho dobytka alebo tiež zložitejšie molekuly cukrov.
V ešte výhodnejšom uskutočnení obsahuje vakcína podľa vynálezu kapsulárny polysacharid, viazaný na polypeptid podľa vynálezu.
Postupy pre kovalentnú väzbu polypeptidu na uhľohydráty boli opísané napríklad v Diek V. E. a Beurt M. Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 48 až 114 (1989).
Je zrejmé, že použitie typov nosičov alebo ďalších spôsobov väzby polypeptidu na uhľohydrát taktiež patrí do rozsahu vynálezu.
Podľa ďalšieho možného uskutočnenia môže vakcína podľa vynálezu obsahovať antigény ďalších, pre ošípané antigénnych organizmov a vírusov. Takýmito organizmami a vírusmi sú napríklad Actinobacillus pleuropneumoniae, vírus pseudorabies, vírus chrípky ošípaných, vírus prenosnej gastroenteritídy, rotavírus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida a Bordetella brochiseptica.
Vakcína podľa vynálezu môže vo výhodnom uskutočnení taktiež obsahovať pomocný prostriedok. Pomocné prostriedky sú všeobecne látky, ktoré zvyšujú imunologickú odpoveď hostiteľa nešpecifickým spôsobom. V danej oblasti techniky je známy celý rad rôznych prostriedkov tohto typu. Príkladom môže byť Freundov kompletný a nekompletný pomocný prostriedok, vitamín E, neiónové blokové polyméry, muramyldipeptidy,
R R R Quill A , minerálne oleje, ako Bayol alebo Markol , ras 10
R tlinné oleje a niektoré z homopolymérov, ako Carbopol alebo Diluvac^ Forte.
Vakcína môže tiež obsahovať takzvaný nosič. Ide o látku, ku ktorej polypeptid ľne, bez toho aby bol na ňu kovalentne viazaný. Často používanými nosičmi sú napríklad hydroxid hlinitý, fosfát alebo oxid hlinitý, oxid kremičitý, kaolín a bentonit.
Špecifickým nosičom, v ktorom je antigén čiastočne zapuzdrený, je prostriedok ISCOM podľa EP 109 942, EP 180 564 a EP 242 380.
Okrem toho vakcína môže obsahovať ešte jedno alebo väčší počet zmáčadiel alebo emulgátorov, ako sú napríklad Spal alebo Tween.
Vakcína sa ešte často mieša so stabilizátormi, napríklad na ochranu citlivých polypeptidov, ktoré by mohli podľahnúť degradácii, na predĺženie skladovateľnosti vakcíny alebo na ľahšiu lyofilizáciu. Vhodnými stabilizátormi sú napríklad SPCA (Bovarnik a ďalší, J. Bacteríology 59: 509 (1950)), uhľohydráty, ako sorbitol, mannitol, trehalóza, škrob, sacharóza, dextrán alebo glukóza, ďalej bielkoviny, ako albumín alebo kazeín alebo degradačné produkty týchto látok a tiež aj pufre, napríklad fosforečnany alkalických kovov. Okrem toho môže byť vakcína uvedená do suspenzie vo fyziologicky prijateľnom riedidle.
Je samozrejmé, že je možné pridávať ešte iné pomocné látky, nosné prostredie, riedidlá, emulgátory alebo stabilizátory pre polypeptidy bez odchýlenia sa od zmyslu vynálezu.
Podľa ďalšieho možného uskutočnenia sa používajú protilátky, monošpecificky reaktívne s polypeptidom podľa vynálezu alebo jeho antigénnej časti na dosiahnutie pasívnej imunity .
Monošpecifické protilátky sú protilátky, ktoré sú špecificky schopné reagovať s polypeptidom podľa vynálezu s molekulovou hmotnosťou 54 000 alebo s jeho antigénnou časťou, bez toho aby pritom reagovali s ostatnými antigénmi Streptococcus suis.
Protilátky proti patogénom je možné s úspechom použiť na dosiahnutie pasívnej imunizácie. Výhoda tohto spôsobu liečenia spočíva v tom, že protilátky sú k dispozícii v okamžiku vzniku infekcie. To znamená, že nedochádza k strate času čakaním na aktiváciu imunologického systému hostiteľa tak, aby došlo k tvorbe dostatočného množstva protilátky na obranu organizmu. Zvlášť v prípade, kedy k infekcii už došlo a ochorenie postupuje, dochádza podaním protilátok okamžite k vyliečeniu živočícha a k odstráneniu toxínov a patogénnych organizmov. Vakcína, schopná chrániť ošípané proti ochoreniu po infekcii Streptococcus suis a obsahujúca protilátky proti hemolytickému polypeptidu teda taktiež tvorí súčasť podstaty vynálezu.
Podľa vynálezu je taktiež možné vyrobiť vakcínu, schopnú chrániť cicavcov proti infekcii Streptococcus suis. Postup spočíva v tom, že sa polypeptid podľa vynálezu spracuje spolu s farmaceutickým nosičom, pomocnými látkami alebo riedidlom .
Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad I
Bakteriálne kmene
Streptococcus suis, typ 2, kmene Pl/7 a 688/9 boli dodané Dr. T. Alexandrom, University of Cambridge, UK. Typ 2, kmene 4005, D282, 3921, 3977, 3889 a T15 boli získané od Dr. U. Vechta, CDI-DLO, Lelystad, Holandsko. Typ 7, kmene 10 681, 10 727 a 14 391 boli získané od Dr. B. Nielsen, Intervet Scandinavia, Kodaň, Dánsko. Referenčné kmene 1 až 22 boli získané od Dr. J. Henrichsena, Statens Sérum Inštitúte, Kodaň, Dánsko.
Kmeň B10, sérotyp 1, je izolát zo súčasnej doby, získaný od Cezondheidsdient voor dieren, Oost-Nederland, Deven- 12 ter, Holandsko.
Kmene NV92109, sérotyp 8, 22089, sérotyp 9 a 220891, sérotyp 14 sú izoláty zo súčasnej doby a boli získané od chorých ošípaných.
Bakteriálne kultúry
Bakteriálne kmene boli naočkované na agar s ovčou krvou a pestované 24 hodín pri teplote 37 °C. Na stanovenie produkcie hemolyzínu bolo niekoľko kolónií naočkovaných do 100 ml bujónu Todd Hewitt (Difco) a pestovaných pri teplote 37 °C až do skončenia exponenciálnej fázy rastu (zvyčajne 5 až 6 hodín). Potom boli bunky oddelené odstredením pri 10 000 g po dobu 10 minút a supernatant bol uložený až do použitia pri teplote -20 ’C.
Skúška na inhibíciu hemolyzínu
Na titráciu séra na schopnosť spôsobiť inhibíciu hemolyzínu bolo pripravené sériové riedenie séra (vždy dvojnásobné riedenie, 75 mikrolitrov) vo vyhĺbeniach titračných platní za použitia fyziologického roztoku chloridu sodného s 10 mM tris pufra s pH 7,4 ako riedidla. Potom bolo do každého vyhĺbenia pridaných 75 μΐ roztoku hemolyzínu, ktorý obsahoval vždy 2$ hemolyzínových jednotiek. Po inkubácii vzoriek pri teplote 20 °C po dobu 10 minút bolo do každého vyhĺbenia pridaných ešte 150 μΐ 2% suspenzie konských erytrocytov a skúška bola skončená tak, ako bolo vyššie uvedené pre titráciu hemolytickej účinnosti. Titer bol definovaný ako najväčšie zriedenie, pri ktorého použití je ešte možné dosiahnuť 50% inhibíciu hemolýzy. Schopnosť špecifického séra ošípaných P399 proti čistenému hemolyzínu (odvodenému od Streptococcus suis, typ 2) spôsobiť inhibíciu hemolytického účinku u kmeňov rôznych sérotypov bola skúšaná vždy v jedinom vyhĺbení za použitia 75 mikrolitrov séra P399, vopred zriedeného 1 : 128 a 75 mikrolitrov nezriedeného supernatantu kultúr rôznych kmeňov. Skúška potom bola skončená vyššie uvedeným spôsobom. Preimúnne sérum taktiež vopred zriedené 1 : 128 bolo použité ako kontrola (maximálna hemolýza). Skríženú neutralizáciu bolo možné pozorovať v prípadoch, kedy sérum P399 spôsobilo inhibíciu hemolýzy na viac než 50 % v porovnaní s preimúnnym sérom. Vzorky s titrom pre hemolyzín nižším než je hodnota 2 4 neposkytovali pri tejto skúške žiadne výsledky vzhľadom na to, že maximálna hemolýza (preimúnne sérum) nedosahovala dvojnásobok hodnoty pozadia (sérum P399).
Príklad II
Čistenie hemolyzínu
250 ml kultúry kmeňa Pl/7, pestovanej cez noc bolo ďalej pestovaných za anaeróbnych podmienok 6 hodín v 12 litroch Todd Hewittovho roztoku pri teplote 37 °C a potom boli bunky tohto kmeňa oddelené kontinuálnym odstredením. Supernatant kultúry bol ochladený na teplotu 4 °C a potom sa nechal prejsť filtrom 0,8 pm a bol zahustený na 150 ml na filtroch PTGG 10 000 NMVL. Po prechode filtrom s priemerom otvorov 0,2 μπι boli podiely roztoku po 1,0 ml nanesené na gél Superose-12 vo filtračnom stĺpci (FPLC, Pharmacia) a stĺpec bol vymývaný roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom s pH 7,2 s obsahom 0,5 M NaCl. Boli odobrané frakcie po 0,5 ml a analyzované na SDS-PAGE a bol vykonaný imunoblot a test na hemolyzín. Najvyššiu hemolytickú účinnosť bolo možné preukázať vo frakciách 35 až 45, ako je zrejmé z obr.
2. Analýzou rôznych frakcií zo stĺpca SDS-PAGE a imunoblotovou reakciou bolo možné preukázať, že hemolytická účinnosť putuje spoločne s antigénom s molekulovou hmotnosťou približne 54 000, ako je zrejmé z obr. 3. Hemolytické frakcie 35 až 45 boli spojené a malé množstvo prítomných nečistôt bolo odstránených selektívnym zrážaním za použitia 50% síranu amónneho v priebehu troch hodín pri teplote 4 ’C. Po odstredení bola usadenina znova uvedená do suspenzie v 20 rnl chloridu sodného so 40 mM fosfátového pufra s pH 7,2. Ako výsledná látka bol získaný polypeptid, ktorý mal po prechode stĺpcom SDS-PAGE molekulovú hmotnosť približne 54 000 pri farbení modrou Coomassie brilliant, ako je zrejmé z obr. 1, špecifická účinnosť bola po redukcii beta-merkaptoetanolom v hemolytických jednotkách približne 0,7 x 10^/mg.
Stanovenie bielkoviny
Koncentrácia bielkoviny bola meraná spôsobom podľa publikácie Lowry a ďalší, J. Biol. Chem. 193: 265 až 275 (1951) za použitia sérového albumínu hovädzieho dobytka ako štandardu.
SDS-PAGE a Vestern blot
SDS-PAGE na 9% géloch a príprava vzorky boli uskutočnené v podstate podľa publikácie Laemmli U. K., Náture 227: 689 až 685 (1970). Po elektroforéze boli peptidy sfarbené modrou Coomassie brilliant R250 alebo bol vykonaný elektroblot za použitia membrány Immobilon PVDF. V prípade blotu boli ako sondy použité polyklonálne králičie sérum R2089 alebo polyklonálne myšie sérum M189 (opísané v odstavci Antiséra). Po premytí boli viazané protilátky vizualizované za použitia konjugátu peroxidázy a kozieho antiséra proti králičím tkanivám alebo konjugátu s kozími protilátkami proti myším tkaniván, ako substrát bol použitý v oboch prípadoch diaminobenzidín.
Hemolytická účinnosť po rôznom spracovaní
Pre každé spracovanie bolo použitých 0,5 ml čisteného hemolyzínu v roztoku chloridu sodného so 40 mM fosfátovým pufrom s pH 7,2 pri titri 2 .
- Vplyv teploty bol meraný po indukcii hemolyzínu pri rôznych teplotách v rozmedzí -20, 4, 20, 37 a 100 ’C.
- Vplyv proteinázy K bol meraný tak, že bolo 5 mikrolitrov koncentrovaného roztoku enzýmu (2 mg/ml) pridaných k 0,5 ml roztoku hemolyzínu a zmes bola inkubovaná 10 minút pri teplote 20 °C. Potom bola meraná zvyšná hemolytická účinnosť.
- Vplyv redukcie beta-merkaptoetanolom bol meraný tak, že bolo pridaných 5 mikrolitrov roztoku beta-merkaptoetanolu s koncentráciou 10 % objemových k 0,5 ml roztoku hemolyzínu a zmes bola inkubovaná 10 minút pri teplote 20 ’C, potom bola meraná hemolytická účinnosť.
- Vplyv oxidácie peroxidom vodíka bol meraný tak, že bolo pridaných 5 mikrolitrov 10% roztoku peroxidu k 0,5 ml roztoku hemolyzínu a potom bola zmes inkubovaná 10 minút pri teplote 20 ’C, potom bola meraná akákoľvek zvyšná hemolytická účinnosť.
- Vplyv alkylácie akejkoľvek tiolovej skupiny pôsobením TLCK (N-Á-p-tosyl-L-lyzínchlórmetylketón, Sigma) bol stanovený pridaním 5 mikrolitrov 10% roztoku TLCK k 0,5 ml roztoku hemolyzínu s následnou inkubáciou 10 minút pri teplote 20 °C. Potom bola meraná akákoľvek zvyšná účinnosť skúškou na hemolyzín.
- Vplyv cholesterolu bol skúmaný pridaním 10 mikrolitrov 5% cholesterolu (v 10% etanole) k 0,5 ml roztoku hemolyzínu, potom bola reakčná zmes inkubovaná celkom 10 minút pri teplote 20 ’C, potom bola meraná akákoľvek zvyšná hemolytická účinnosť.
- Reverzibilná redukcia po určitom spracovaní bola meraná tak, že k časti reakčnej zmesi bol pridaný prebytok betamerkaptoetanolu v konečnej koncentrácii 2 %, potom bola zmes inkubovaná 10 minút pri teplote 20 °C a potom bola meraná zvyšná hemolytická účinnosť.
Účinok rôzneho spracovania na hemolytickú účinnosť je zhrnutý v tabuľke 1. Výsledky ukazujú, že hemolyzín je tepelne labilný, štiepi sa proteinázou K, oxiduje sa peroxidom vodíka a je možné ho alkylovať pôsobením TLCK. Okrem toho dochádza k inhibícii jeho hemolytickej účinnosti pôsobením cholesterolu. Po inkubácii s beta-merkaptoetanolom bolo možné preukázať zvýšenie účinnosti a po pridaní beta-merkaptoetanolu k prípravku, oxidovanému peroxidom vodíka došlo k obnoveniu hemolytickej účinnosti. Po pridaní prebytku beta-merkaptoetanolu k prípravku po pôsobení TLCK došlo k čiastočnému obnoveniu účinnosti. Toto čiastočné obnovenie účinnosti by zrejme bolo možné vysvetliť prítomnosťou oxidovaných tiolových skupín, ktoré nereagovali s TLCK. Účinok teploty a cholesterolu nebolo možné pridaním beta-merkaptoetanolu zrušiť.
V podvojných vzorcoch, v ktorých bolo vynechané reakčné činidlo alebo hemolyzín nebolo možné pri skúškach vzoriek preukázať žiadny vplyv na hemolytickú účinnosť alebo žiadny vplyv reakčných činidiel bez hemolyzínu na erytrocyty.
Vnímavosť erytrocytov rôznych druhov na hemolyzín
Bola skúmaná vnímavosť erytrocytov z rôznych živočíšnych druhov, ako je človek, hovädzí dobytok, moriak, holub, myš, kurča, morča, králik, mačka a ošípaná, použitý bol redukovaný (0,1% beta-merkaptoetanol) prípravok čisteného heO molyzínu s titrom 2·. Skúšky boli vykonávané tak, ako bolo opísané u titrácie hemolytickej účinnosti. Podľa výsledkov týchto skúšok boli všetky druhy erytrocytov rovnako citlivé na pôsobenie hemolyzínu. Titer sa menil v rozmedzí 2' (myš, mačka, moriak) až 2^θ (človek).
N-terminálny reťazec aminokyselín
Prvých 16 zvyškov aminokyselín čisteného hemolyzínu, získaného z kmeňa Pl/7 bolo stanovených pomocou automatizovanej Edmanovej degradácie, výsledky sú ďalej uvedené ako reťazec aminokyselín 1.
Prevaha molekúl hemolyzínu u rôznych kmeňov Streptococcus suis
Všetky dostupné kmene včítane kmeňov so sérotypmi 1 až 22 boli pestované v živnom prostredí Todd Hewitt až do skončenia exponenciálnej rastovej fázy (5 až 6 hodín). Potom boli bunky oddelené odstredením. Prítomnosť molekúl hemolyzínu v supernatante kultúry bola preukázaná skúškou na hemolyzín a pomocou imunoblotovej reakcie. Vela, avšak nie všetky kmene produkovali rôzne množstvo hemolyzínu v supernatante svojich kultúr, ako je zrejmé z tabuľky 2.
Všetky hemolytické vzorky včítane vzoriek s nízkou účinnosťou boli inhibované pôsobením cholesterolu a peroxidu vodíka. Okrem toho pridanie prebytku beta-merkaproetanolu k vzorkám, oxidovaným peroxidom vodíka k úplnému návratu hemolytickej účinnosti.
Je teda možné uzavrieť, že väčšina kmeňov produkovala hemolyzín v supernatante kultúry, nebolo možné preukázať žiadne známky produkcie odlišných hemolyzínov.
Príklad III
Vakcíny
Z kmeňa Pl/7 boli pripravené štyri vakcíny na báze čisteného hemolyzínu koncentrovaného supernatantu kultúry alebo na báze spojených frakcií 19 až 31 zo stĺpca Superose-12, okrem toho bola vyrobená vakcína ako placebo.
Na porovnanie bola pripravená vakcína na báze čisteného EF a ďalšia vakcína bola pripravená z kmeňa B10 z koncentrovaného supernatantu kultúry.
Vakcína bola pripravená nasledujúcim spôsobom:
Čistený hemolyzín s obsahom 40 mikrogramov bielkoviny bol v pomere 1:1 zmiešaný s pomocným prostriedkom Diluvac Forte za vzniku homogénnej emulzie. Táto vakcína bola označená VAC-SLY.
V prípade vakcíny, obsahujúcej koncentrovaný supernatant bola časť koncentrátu PTCG s obsahom 1,9 mg bielkoví18 ny/ml zmiešaná v pomere 1:1 s pomocným prostriedkom Diluvac Forte až do vzniku homogénnej suspenzie. Táto vakcína bola označená VAC-CCS.
Tretia vakcína bola pripravená zmiešaním spojených a koncentrovaných frakcií 19 až 31 zo stĺpca Superose-12, obsahujúcich 2 mg bielkoviny/ml v pomere 1:1 s pomocným prostriedkom Diluvac Forte za vzniku homogénnej suspenzie. Frakcie 19 až 31 z uvedeného stĺpca obsahovali väčšinu extracelulárne produkovaných bielkovín kmeňa Pl/7 Streptococcus suis, boli však v podstate zbavené hemolyzínu. Táto vakcína bola označená VAC-SCF.
Štvrtá vakcína bola pripravená filtráciou supernatantu kultúry cez filter s priemerom otvorov 0,2 mikrometre s následným zrážaním síranom amónnym, nasýteným na 60 % po dobu 16 hodín pri teplote 0 “C. Po odstredení bola vytvorená usadenina znova uvedená do suspenzie v PBS za vzniku vzorky, ktorá bola približne 100-krát koncentrovanejšia v porovnaní so supernatantom kultúry.
Vakcína, použitá ako placebo bola pripravená rovnakým spôsobom ako bolo uvedené vyššie s tým rozdielom, že roztok antigénu bol nahradený fyziologickým roztokom chloridu sodného so 40 mM fosfátovým pufrom s pH 7,2.
Kmeň B10 bol použitý na prípravu vakcíny vyzrážaním síranom amónnym, nasýteným na 60 % po dobu 16 hodín pri teplote 0 °C, ako bolo opísané vyššie.
Vakcína EF bola získaná po chromatografii s hydrofóbnou interakciou (Phenyl Sepharose, vysoký stupeň substitúcie) za použitia supernatantu kultúry kmeňa Pl/7 a klesajúceho grad.ientu síranu amónneho. Vzorka EF po skončení čistenia (dialýza a riedenie) obsahovala približne 150 mikrogramov EF/ml. Podlá SDS-PAGE a farbenia Coomassieovou modrou mala vzorka čistotu vyššiu než 95 %.
Antisérum
Špecifické polyklonálne sérum ošípaných (P399) proti čistenému hemolyzínu bolo získané nasledujúcim spôsobom:
Ošípaná vo veku 4 týždne bola imunizovaná vnútrosvalovo (krk) za použitia 2 ml vakcíny VAC-SLY. Po dvoch týždňoch bolo vykonané preočkovanie rovnakým množstvom vakcíny, podanej rovnakým spôsobom. Po ďalších dvoch týždňoch bola odobratá krv, ktorá potom bola skladovaná až do použitia pri teplote -20 °C.
Skúška na očkovanie myší
Myšie kmene Balb-c vo veku 4 týždňov boli rozdelené do 4 skupín a očkované podkožným podaním vakcíny a to 0,5 ml vakcíny VAC-CCS, VAC-SCF, VAC-SLY alebo placebom. Po dvoch týždňoch boli zvieratá preočkované rovnakým spôsobom. Po ďalších dvoch týždňoch bolo intraperitoneálne podaných 0,5 ml 6 hodín starých kultúr kmeňa Pl/7 v Todd-Hewittovom živnom prostredí, obsahujúcom 4 x 10^ CFU/ml. Potom bola zaznamenaná po dobu 7 dní mortalita myší.
Výsledky
Myši, ktorým bolo podané placebo, uhynuli do troch dní, zatiaľ čo myši, očkované vakcínami VAC-CCS a VAC-SLY boli celkom chránené, ako je zrejmé z tabuľky 3. Vakcína VAC-SCF poskytovala len čiastočnú ochranu. Táto vakcína obsahovala väčšinu extracelulárne produkovaných antigénov kmeňa Pl/7, avšak bola v podstate zbavená hemolyzínu.
Záver
Z toho, čo bolo uvedené, je možné uzavrieť, že vakcína, obsahujúca čistený hemolyzín podľa vynálezu chráni myši pred infekciou. Z toho vyplýva, že hemolyzín je faktorom, určujúcim virulenciu a že neutralizácia tohto jediného faktora virulencie stačí na ochranu myší proti zhubným účinkom infekcie Streptococcus suis, typ 2.
Pokus s heterológnou ochranou myší
K pokusu boli použité myši kmeňa Balb/c vo veku štyroch týždňov (Iffa Credo).
Usporiadanie pokusu
Skupiny 30 myší (2 x 15) boli očkované raz podkožnou dávkou 0,4 ml vakcíny alebo neboli vôbec očkované (jedna skupina 30 myší), ako je zrejmé z tabuľky 6. Štyri týždne po očkovaní bolo polovici myší v skupine intraperitoneálne podaných 0,5 ml 6 hodín starej kultúry kmeňa B10 (typ 1), druhej polovici myší bolo podané rovnaké množstvo kultúry kmeňa Pl/7 (typ 2).
Mortalita myší bola zaznamenaná v priebehu 7 dní. Kmeň B10 je pre myši menej patogénny (mortalita približne 20 %) než kmeň Pl/7 (mortalita 100 %) . Z tohto dôvodu bol u skupiny, ktorej bola podaná kultúra kmeňa B10, zaznamenaný aj počet myší, u ktorých došlo k prejavom ochorenia. Tesne pred podaním kultúr boli odobraté vzorky krvi a zmes sér bola podrobená imunoblotovej skúške.
Výsledky
Pri skúške na hemolyzín mal supernatant kultúry kmeňa B10 (sérotyp 1) hemolytickú účinnosť 2^’^, zatiaľ čo supernatant z kultúry kmeňa Pl/7 (sérotyp 2) mal túto účinnosť veľkosti 2 . To znamená, že kmeň B10 produkoval približne 5x vyššie množstvo hemolytickej účinnosti než kmeň Pl/7.
Na základe SDS-PAGE a farbenia Coomassieovou modrou je zrejmé, že oba koncentrované supernatanty kultúr kmeňov B10 a Pl/7 obsahovali bielkovinu s molekulovou hmotnosťou 54 000 (SLY) a že koncentrovaný supernatant kultúry kmeňa B10 obsahoval väčšie množstvo tejto bielkoviny, čo je v súlade s jeho vyššou účinnosťou. Čistený EF neobsahoval žiadnu bielkovinu s molekulovou hmotnosťou 54 000.
Po podaní kultúry patogénnych kmeňov sa. ukázalo, že obe vakcíny, obsahujúce supernatant kultúry vyvolávali homológnu ochranu myší, ako je zrejmé z tabuľky 6. V prípade, že boli vzorky sér zo skupín po ich zliatí skúšané imunoblotovou technikou za použitia supernatantu kultúry kmeňa Pl/7 alebo B10 ako antigénu, bolo možné preukázať, že obe vakcíny na báze supernatantu kultúr vyvolávali tvorbu protilátok proti SLY, ako je zrejmé z tabuľky 6. V prípade protilátok proti supernatantu kultúry B10 bolo možné preukázať silnejšiu reakciu než v prípade kmeňa Pl/7. Pri heterológnych skúškach imunoblotovou technikou (supernatant proti B10 a supernatant Pl/7 alebo supernatant proti Pl/7 a supernatant B10) bolo zrejmé, že antigén s molekulovou hmotnosťou 54 000 je hlavným alebo jediným reaktívnym antigénom.
Myši, očkované čisteným EF neboli ani po podaní vysokých dávok chránené proti heterológnej alebo homológnej infekcii, napriek tomu, že došlo k tvorbe protilátok, ako je zrejmé z tabulky 6.
Záver
Obe vakcíny na báze supernatantu kultúr poskytovali homológnu a heterológnu ochranu očkovaným myšiam. Skutočnosť, že antigén s molekulovou hmotnosťou 54 000 je jediným alebo aspoň hlavným reaktívnym antigénom pri heterológnej imunoblotovej skúške jasne preukazuje, že SLY je faktorom, ktorým je možné u myší dosiahnuť skríženú ochranu.
Očkovanie ošípaných
Vakcíny VAC-SLY, VAC-SCF a placebo boli pripravené vyššie uvedeným spôsobom.
Vakcína VAC-SLY obsahovala 20 mikrogramov/ml čisteného hemolyzínu v pomocnom prostriedku Diluvac Forte. Vakcína VAC-SCF obsahovala 2 mg bielkoviny/ml, išlo o väčšinu extracelulárne produkovanej bielkoviny Streptococcus suis v pomocnom prostriedku Diluvac Forte, vakcína však bola v podstate zbavená hemolyzínu.
Deväť ošípaných vo veku 4 týždňov bolo rozdelených do troch skupín po tri ošípané a skupiny potom boli očkované vnútrosvalovo do krku vždy 2 ml vakcíny VAC-SLY, VAC-SCF alebo placebom. Dva týždne po prvom očkovaní boli zvieratá preočkované rovnakým spôsobom za použitia toho istého množstva vakcín. Dva týždne po preočkovaní bolo zvieratám vnútrožilovo podaných 0,5 ml 6 hodín starej kultúry kmeňa Pl/7 v Todd Hewittovom roztoku, materiál obsahoval 4 x 10^ CFU/ml (4). Tesne pred prvým očkovaním a pred vnútrožilovým podaním kultúry, boli odobraté vzorky krvi, sérum bolo uložené pri teplote -20 °C až do použitia.
Opätovná izolácia baktérií
Z uhynutých zvierat bolo odobraté tkanivo mozgu, pľúc a tarzu, pokiaľ možno z najpostihnutejších častí. Bakteriálny rast bol hodnotený stupnicou 0, 1, 2, 3 a 4 podľa intenzity rastu.
Výsledky
Po podaní kultúry patogénneho mikroorganizmu sa u ošípaných, očkovaných placebom objavili závažné klinické príznaky a to zápal kĺbov, vysoká teplota a chorobný vzhľad. U dvoch z troch ošípaných, očkovaných placebom došlo k rozvoju neurologických príznakov, ktoré boli tak závažné, že zvieratá bolo nutné usmrtiť. U zvierat, očkovaných vakcínou VAC-SCF sa vyvinuli rovnaké klinické príznaky ako u kontrol, avšak v menšom rozsahu. U jednej ošípanej z tejto skupiny došlo k rozvoju neurologických príznakov a zviera muselo byť usmrtené. Zvieratá, očkované vakcínou VAC-SLY boli postihnuté najmenej. Prejavili sa len mierne príznaky ochorenia, ktoré zmizli rýchlejšie než prejavy ochorenia u ostatných skupín. Výsledky klinických pozorovaní sú zhrnuté v tabuľke
4. Ako je zrejmé z tabuľky 5, bolo možné pri nekropsii ošípaných, očkovaných placebom, pozorovať ťažkú polyartritídu, zasiahnutá bola väčšina kĺbov. U ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SCF došlo taktiež k polyartritíde, avšak v menšom rozsahu, zatiaľ čo väčšina kĺbov u ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SLY mala normálny vzhľad, ako je zrejmé z tabuľky 5 .
Streptococcus suis bol opätovne izolovaný u dvoch z troch ošípaných, očkovaných placebom a to z rôznych tkanív a tiež u všetkých ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SCF, avšak mikroorganizmus nebol izolovaný u žiadnej ošípanej, očkovaných vakcínou VAC-SLY. Údaje, uvádzajúce relatívne množstvo baktérií, reizolovaných z celkového množstva zvierat v každej skupine sú zhrnuté v tabulke 5.
Histologické skúmanie vzoriek mozgu (tabuľka 5) preukázalo meningitis u dvoch ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SCF a u dvoch ošípaných, očkovaných placebom.
Záver
Aj napriek tomu, že sa u ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SLY objavili v priebehu niekoľkých dní klinické príznaky, boli tieto príznaky menej závažné a mali kratšie trvanie v porovnaní s prejavmi, ktoré sa vyvinuli u ošípaných po vakcinácii vakcínou VAC-SCF alebo placebom. Pri nekropsii bol zápal kĺbov menej častý a menej závažný u ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SLY v porovnaní so zvieratami, očkovanými vakcínou VAC-SCF alebo placebom. Okrem toho sa u dvoch ošípaných po vakcinácii pomocou vakcíny VAC-SCF a u dvoch ošípaných, očkovaných placebom vyvinula meningitis, zatiaľ čo u žiadnej z ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SLY k prejavom meningitídy nedošlo. Okrem toho boli pľúca, kĺby a mozgové tkanivo ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SLY zrejme sterilné, zatiaľ čo z väčšiny týchto orgánov u oboch ostatných skupín bol reizolovaný Streptococcus suis, typ 2. Pri imunoblotovej skúške reagovali séra ošípaných, očkovaných vakcínou VAC-SLY (odobraté v deň podania kultúry patogénu) s pásom pre jediný antigén s molekulovou hmotnosťou 54 000 v celom supernatante kultúry, čo potvrdzuje, že hemolyzín je imunogénny a že použitý hemolyzín bol vysoko čistý.
Výsledky preukazujú, že hemolyzín Streptococcus suis je dôležitý faktor a že neutralizácia tohto faktora je dostatočná na ochranu ošípaných pred nepriaznivými vplyvmi infekcie Streptococcus suis a na zabránenie prieniku baktérií do rôznych orgánov a tkanív.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je v dráhe A pri elektroforéze na SDS-PAGE znázornené značenie zlúčeninou s nízkou molekulovou hmotnosťou, v dráhe B je nanesený koncentrovaný supernatant kultúry, v dráhe C čistený hemolyzín Streptococcus suis s v dráhe D sú uložené značiace látky s vysokou molekulovou hmotnosťou. Gél bol farbený brilliantovou modrou Coomassie. Číslovanie na pravej a ľavej strane označuje molekulovú hmotnosť značiacich bielkovín.
Na obr. 2 je znázornené chovanie emulzie koncentrovaného supernatantu kultúry Streptococcus suis, typ 2, kmeň Pl/7 po chromatografii na Superose-12. Plná čiara: absorpcia pri 280 nm, prerušovaná čiara: liter hemolyzínu.
Na obr. 3 je znázornený Western blot značiacich bielkovín (dráha A), koncentrovaný supernatant kultúry kmeňa Pl/7 (dráha B) a frakcia zo stĺpca Superose-12 (dráhy C-N). Dráha C: frakcia 15, dráha D: frakcia 18, dráha E: frakcia 20, dráha F: frakcia 23, dráha G: frakcia 26, dráha H: frakcia 28, dráha I: frakcia 30, dráha J: frakcia 32, dráha K: frakcia 34, dráha L: frakcia 36, dráha M: frakcia 38, dráha N: frakcia 40.
Značiace bielkoviny (dráha A) boli farbené za použitia brilliantovej modrej Coomassie. Pre antigény Streptococcus suis (dráhy B-N) bolo ako sonda použité králičie sérum a potom bolo vykonané farbenie za použitia konjugátu kozieho séra proti králičím tkanivám a diaminobenzidínu ako substrátu. Molekulová hmotnosť značiacich bielkovín je uvedená na ľavej strane.
Zoznam reťazcov
1) všeobecná informácia
i) prihlasovateľ
A) meno: AKZO N.V.,
B) ulica: Velperweg 76
C) mesto: Arnhem
E) štát: Holandsko
F) poštový kód (ZIP): 6824 BM
G) telefón: 04120-66381
H) telefax: 04120-50592
I) telex: 37503 akpha nl ii) názov vynálezu: Vakcína proti infekcii Streptococcus suis iii) počet reťazcov: 1 iv) forma, odpočítaná počítačom:
A) typ prostredia: Floppy disk
B) počítač: IBM PC-kompatibilný
C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS
D) Software: Patentln Release 1,0, verzia 1,25 (EPO)
2) informácie pre reťazec č. 1
i) vlastnosti reťazca
A) dĺžka: 16 aminokyselín
B) typ: aminokyseliny
D) topológia: lineárna ii) typ molekuly: bielkovina iii) hypotetický reťazec: 0
v) typ fragmentu: N-terminálny vi) pôvodný zdroj:
A) organizmus: Streptococcus suis
B) kmeň: Pl/7
C) hednotlivý izolát vii) použitý zdroj:
B) kloň:
xi) opis reťazca č. 1:
Asp Ser Lys Gin Asp Íle Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Leu Thr Tyr Glu
Tabuľka 1
Účinnosť čisteného hemolyzinu po rôznom spracovaní spracovanie doba 2 log titra 2 log titr spracovania hemolyzinu hemolyzinu po pridaní 2% merkaptoetanolu
| -20 “C | 7 | dní | 7 | ND | ||
| 4 °C | 7 | dní | 6 | ND | ||
| 20 °C | 7 | dní | 3 | ND | ||
| 37 °C | 7 | dní | 0 | 0 | ||
| 100 ’C | 5 | min. | 0 | 0 | ||
| 20 ’C | 10 | min. | 7 | ND | ||
| proteináza K | ||||||
| 20 μg/ml | 10 | min. | 20 | ’C | 0 | ND |
| beta-merkapto- | ||||||
| etanol 0,1% | 10 | min. | 20 | °c | 12 | ND |
| H202 0,1% | 10 | min. | 20 | ’C | 0 | 12 |
| TLCK 0,1% | 10 | min. | 20 | ’C | 2 | 6 |
| cholesterol 0,1% | 10 | min. | 20 | ’C | 0 | 0 |
NDa = nebolo stanovené
Tabuľka
X • I > ·
C -d · m
| E | •H rH | O | X |
| 0 | P 0 | O | 0 |
| P | U E | o | c |
| P | d | ||
| P | dd | E | |
| CP | E i—( | m | •H |
• >>
| X | rP | X |
| •H | 0 | d c* d |
| x | E | C X P |
| C! | o | ή m o) |
| •H | X | N CP ΙΛ |
| 0 | X |
| O P | N · X |
| c | P P 0 |
| d | υ x p |
| P | > d \ |
| d | u d x |
| d | P -P 0 |
| P 1) CP d w | í£X tP 1 - P |
| Ifl -P | • !/! |
| d | X rP d) |
| > (Λ | •P 0 d rP |
| d W | X E d 0 d o 'P x |
| d d | •p x n υ |
| Ή 0 N U >, 0 | x p i d |
| rP o | DO D O P |
| 0 0 | 0 P E N |
| E P | P *P 1) .P |
| U CP | M P X rP |
| X! D P E P | 1 Od |
| 0 CZ) | d cp |
| X d > | 0) >> SP p |
| •P 0 >υ >d 'd u E !/) X | P o >d MP U |
| rP X | U E Dá P X4 ' |
| x o X >Ί i) d rP N | 1 0 P CP |
O <0 1) >,
E P (Λ P d
X P d Ό > p >d u h o p d E
CP xí x4
O Q Q Q Q +++++++**++Ζ+^*ΖΖΖ + + + + + + + + + + +Z ι/Ί C ifi Μ Ό «i P p M X 'C C p p P O O C i + + + + I I I I ωωωωωωωωω + + + + + + + l I
CPD-.CPD-.CPD,D-.CpDPáDáOáPáQáQáDáPáQá sssssszss
Dá Dá Dá
Pá Pá Qá Dá Dá (N
H \ N P (N N (N (N (N N (N (<: t i/rc r-' r-- >
H
| CZ) | σ\ | 00 | tP | P- | |||||||||||
| 00 | X | x | p- \x | CP | Ή | c- | Ch | υΊ | rH | O | m | tf | tf | oo | CP |
| (N | p) | m | \00C | 00 | (N | r- | 00 | H | VO | O | X | N | r^ | x | P- |
| tf | CZ) | p~ | P CO o | M | o\ | Ch | 00 | 1 | Ch | tf | rP | o | o | o | |
| ω | Dá | Dá | pop | Q | m | m | H | 'tf | VO | rP | N | 00 | rP | rP |
Tabuľka 2 - pokračovanie
| c | 'd · | 1—1 |
| E | •H i—1 | o x |
| 0 | M 0 | O 0 |
| P | □ E | o d |
| Ή | P | d |
| H | d d | ’t E |
| Λ | E r—i | in -h |
| 1 >h | ||
| H 2 | o | |
| •H | o d | CTs d |
| x | E C | Ch p |
| c | U Ή | m Ό |
| •H | X N X | cp w |
| N | • -o | |
| M | P U | |
| Θ | X P | |
| > | d \ | |
| (U | tí x | |
| M | •H O | |
| ϊ£Χ | ||
| P | ||
| I | P | |
| >X | W | |
| X | r—1 | U |
| •H | o d | ip |
| X! | E C | 0 |
| C | d 'rl | X |
| Ή | X N | 0 |
| D | ||
| P i | d | |
| bO | U o | Ή |
| 0 | P E | N |
| 1—1 | H (D | >, |
| <N | P X | i—J |
| ód | ||
| c | Q. | |
| □ | ||
| p | P | |
| u | ||
| 0 | >d | |
| ΜΗ | U Z~s | |
| U | e ca | |
| M | X ' | |
| 1 0 | ||
| M | Q. | |
| (D | ||
| </) | P |
d
U
E i i i i i + i i i+ + +i i++i i i
Q Q Q Q Q Q
Ζ+^Ζ^^^Ζ^+Ι+Ζ + Τ+ ΖΖ*
Q Q Q Q Q Q
Z++Z+++Z++++Z+++ZZ+ + Q + + + +Q+ + Z Z ' J ITi m Π Λ (M (M n N 'Λ Λ Γ! Tt ň
| (X | ca | Pi | Pi | Pi | Pi | Pi | ci | ca | Pi | ca | Pi | ca | Pi | ca | ||||
| o | H | (N | m | 'ď | ·+ | m | Ό | r- | co | o | o | í—l | M | |||||
| Γ- | 00 | 00 | σ\ | O\ | rH | rH | rH | i—( | rH | P | rH | P | t-H | P | rH | (N | (N | (N |
| z | > | |||||||||||||||||
| σ\ | x | O | P | |||||||||||||||
| o | P | P | (N | io | ||||||||||||||
| Η | vo | P | Pl | Ch | T—I | O | Ch | O\ | oo | |||||||||
| Ov | cn | <N | 00 | 00 | Γ- | rH | O | 00 | CC | 00 | ov | r- | P | P | ||||
| m | vo | o | o | rH | 00 | ΓΠ | un | r- | o | m | <N | < | Γ- | < | V) | < | \ | |
| > | C4 | <N | Tt | N | 00 | o | m | (N | O) | Γ- | CC | Η | N | IO | 00 | |||
| rH | rH | Z | n | <N | i—< | 00 | i—( | rH | (N | H | η | σ\ | Z | 00 | i-í | 00 |
- 29 Vysvetlivky k tabuľke 2:
a Pre kmene typu 2 sú fenotypy opísané v publikácii Vecht a ďalší (26, 27).
b Titrácia hemolytickej účinnosti, jej inhibícia 0,1% cholesterolom, reverzibilná inaktivácia tejto účinnosti inkubáciou s peroxidom vodíka a beta-merkaptoetanolom a jej inhibícia špecifickým sérom ošípaných P399 a tiež imunoblotová skúška za použitia špecifického myšieho séra M189 boli vykonávané podlá odstavca Materiály a metódy.
c# = test bol vykonávaný, avšak výsledok nebol získaný vzhľadom na príliš nízku hemolytickú účinnosť.
^ND = nebolo stanovené.
Tabuľka 3
Účinok imunizácie rôznymi vakcínami na dobu prežitia myší po intraperitoneálnom podaní Streptococcus suis, kmeň Pl/7 vakcína doba prežitia
VAC-CCS3 9/9
VAC-SCFb 6/10
VAC-SLYc 10/10
Placebo 0/10 a Vakcína s b Vakcína s c Vakcína s obsahom koncentrovaného supernatantu kultúry, obsahom frakcií 19 až 31 zo stĺpca Superosy. obsahom čisteného suilyzínu.
Tabuľka 4
Klinické hodnotenie v deň podania antigénu a 1 až 7 dní po ňom klinické hodnotenie v dňoch po antigéne
| vakcína | 0 | la | 2a | 3a | 4a | 5 | 6 | 7 | celkom | |
| VAC-SLY | 0 | 3,7 | 3 | 1,7 | 0,8 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 10,2 | |
| VAC-SCF | 0 | 4,7 | 4,2 | 5,5 | 5,5 | 5 | 4,7 | 4,7 | 34,3 | |
| ŕ | Placebo | 0 | 5,7 | 5,8 | 6 | 7,8 | 7,7 | 7,3 | 7,7 | 48 |
a Hodnotenie v dňoch 1 až 4 je priemerom z dvoch hodnotení, dopoludnia a odpoludnia.
Tabuľka 5
Klinické príznaky v deň disekcie, makroskopické pozorovania pri disekcii, reizolácia a počet prípadov meningitídy
| Vakcína | disekcia počet dní po antigéne | celkové hodnotenie artritídy | celkové hodnotenie reizolácie | počet príznakov meningitídy |
| VAC-SLY | 7 | 3,5 | 0 | 0 |
| VAC-SCF | 7 | 8 | 7 | 2 |
| Placebo | 4 | 12 | 9 | 2 |
Výsledky pokusu, pri ktorom boli skupiny 15 myší očkované jedným podkožným podaním 0,4 ml rôznych vakcín v pomocnom prostriedku GNE. 4 týždne po očkovaní bolo intraperitoneálne podaných 0,5 ml 6 hodín starej kultúry kmeňa Pl/7 alebo B10 s obsahom 3 x 10^ baktérií/ml. Pred podaním bola odobratá krv a sérum bolo skúšané imunoblotom na protilátky proti SLY alebo EF za použitia supernatantu kultúr Pl/7 alebo B10 ako antigénu, sú uvedené v tabuľke 6.
| 1 | 1 0 P | Pi | 0 u. ca | o P CQ |
| E | X | 0 | ||
| 0 | P | •rl | ||
| P | •p | 'rt | P | P |
| Ή | 71 | rp | 0 | |
| P | 0 | •P | P | P |
| X | c | P | (X | x |
| 1 E | ||||
| 0 | ||||
| P | P | |||
| Ή | 71 | |X2 | ||
| P | 0 | u. | ||
| X | C | ca | ||
| 0 | o | |||
| 1 | > | P | ||
| 0 | J | ca | ||
| 1 | P | Pi | ω | |
| E | X | o | ||
| 0 | P | P | ||
| P | P | 'rf | P | P- |
| Ή | 71 | rp | 0 | \ |
| P | 0 | p | P | P |
| x | c | P | x | x |
Tabuľka i
E
| P | •p | 43 | |
| Ή | 71 | ||
| P | 0 | X | |
| x | c | ω | |
| ol | 1 | ||
| o | x | •p | 0 |
| P | b | C | X 'P |
| ca | Ό | Τ3 | c |
| C | 0 ol | ||
| 0 | •rl | m | X T3 |
| x | ol | ||
| CP | P | ||
| PC | rl | ||
| τι | P | ||
| b | ol | ||
| i—1 | P | ||
| 71 | P | ||
| 'CP | 0 | ||
| > | E | ||
| Cti | |||
| P | |||
| P | r- | ||
| I—i | |||
| ol | P | ||
| P | X | ||
| P | |||
| 0 | 0 | ||
| E | x | ||
| ol | 1 | ||
| C | Ol | ||
| P | 71 | ||
| 0 | 43 | ||
| p; | 0 | E | |
| ol | 0 | ||
| > | 71 | X |
tn O r-l r-l (N r-l O r-l m
Os 't 73
| x | CP | ||
| X | 3 | x | P |
| 3 | 71 | ca | o |
| 71 | P- | P· | P P |
| o | \ | c | |
| P | P | P | o |
| ffl | x | x | Pi |
I I
| 0 O U | •P P 3 | |||
| ,—S | 3 | |||
| P | 3 | |||
| > | 3 | |||
| x | P | -P | ||
| 43 | P | |||
| 'P | P | P | ||
| >1/1 | 3 | >N | ||
| CP | P | 3 | ||
| E | 0 | |||
| 3 | X | |||
| 4a | ||||
| ϋ | ca | 3 | ||
| 'Cp | o | N | ||
| P | < | |||
| 0 | x | E | ||
| 43 | 1 | 0 | ||
| o | CZ) | P | ||
| Q | 0 | |||
| P | CZ1 | rP | ||
| 0 | 43 | |||
| >ϋ | 3 | O | ||
| 0 | P | c | ||
| x | P | 3 | ||
| •P | E | |||
| >N | •r-l | |||
| + | 3 | Cp | ||
| 0 | P | |||
| X | b | '3 | ||
| m | P | P | ||
| 3 | 'b | r-l | ||
| x | N | 7) | 3 | |
| Pi | ||||
| Ή | b | M | ||
| >71 | C | 5 | 3 | |
| Cp | 'P | r | P | |
| E | υ | b | C | |
| P! | •rp | 3 | ||
| 43 | 3 | 0 | P | |
| ϋ | > | X | 3 | |
| 'Cp | 75 | C | ||
| P | 0 | P | ||
| 3 | > | > | b | |
| c | X | |||
| Cp | 'P | 'P | 3 | |
| 43 | cn | 71 | 71 | |
| 3 | 0 | 0 | ||
| c | C | 0 | ||
| P | E | b | E | N |
| U | 0 | •P | 0 | |
| >□ | P | 71 | P | 3 |
| 0 | 'P | 7) | Ή | C |
| x | P | 3 | P | 'b |
| x | E | X | M | |
| 3 | 43 | Q |
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Polypeptid Streptococcus suis, vyznačuj úci sa t ý m, že má molekulovú hmotnosť približne 54 000, je aktivovaný tiolom a je možné ho inhibovať cholesterolom a v natívnej forme má hemolytickú účinnosť alebo časť tohto polypeptidu je schopná vyvolať imunologickú odpoveď proti tomuto polypeptidu.
- 2. Polypeptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho N-terminálny reťazec aminokyselín je Asp-Ser-Lys-Gln-Asp-Íle-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu-Thr-TyrGlu alebo časť tohto polypeptidu.
- 3. Vakcína na ochranu ošípaných proti infekcii Streptococcus suis, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polypeptid podľa nárokov 1 alebo 2.tým, suis.Vakcína podľa nároku 3, že naviac obsahuje ešte vyznačujúca sa iný imunogén Streptococcus
- 5. Vakcína podľa nárokov 3 a4, vyznačuj úca sa tým, že polypeptid je viazaný na nosič.
- 6. Vakcína podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že ako nosič obsahuje kapsulárny polysacharid.
- 7. Vakcína podľa nárokov 3 až 6, vyznačuj úca sa t ý m, že obsahuje ešte pomocný prostriedok.
- 8. Vakcína podľa nárokov 3 až 7, vyznačujúca sa t ý m, že obsahuje ďalší imunogén, odvodený od vírusu alebo mikroorganizmu, patogénneho pre ošípané.
- 9. Vakcína podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že ako ďalší imunogén obsahuje imunogénnu látku zo skupiny Actinobacillus pleuropnemoniae, vírus pseudorabies, vírus chrípky ošípaných, parvovírus ošípaných, vírus gastroenteritídy, rotavírus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusioparhiae, Pasteurella multocida alebo Bordetella bronchiseptica.
- 10. Protilátky, monošpecificky reaktívne s polypeptidom podľa nárokov 1 a 2.
- 11. Spôsob výroby vakcíny schopnej chrániť cicavcov proti infekcii Streptococcus suis, vyznačuj úci sa tým, že sa zmieša polypeptid podľa nárokov la 2 s farmaceutický prijateľným nosičom, pomocnou látkou alebo riedidlom.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93201401 | 1993-05-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK56394A3 true SK56394A3 (en) | 1995-07-11 |
| SK281324B6 SK281324B6 (sk) | 2001-02-12 |
Family
ID=8213828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK563-94A SK281324B6 (sk) | 1993-05-17 | 1994-05-13 | Polypeptid zo streptococcus suis, vakcína, spôsob výroby vakcíny a protilátky |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5612042A (sk) |
| EP (1) | EP0626452B1 (sk) |
| JP (1) | JP3578799B2 (sk) |
| AT (1) | ATE183241T1 (sk) |
| CZ (1) | CZ289302B6 (sk) |
| DE (1) | DE69419966T2 (sk) |
| DK (1) | DK0626452T3 (sk) |
| ES (1) | ES2137310T3 (sk) |
| GR (1) | GR3031698T3 (sk) |
| HU (1) | HU218154B (sk) |
| PL (1) | PL177219B1 (sk) |
| SK (1) | SK281324B6 (sk) |
| TW (1) | TW494103B (sk) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI93733C (fi) * | 1993-01-29 | 1995-05-26 | Kaarina Tikkanen | Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi |
| US5919466A (en) * | 1993-10-01 | 1999-07-06 | Gerbu Biotechnik Gmbh | Method for improving the yield of immunoantibodies in the vaccination of animals and humans |
| WO1996041879A1 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
| US6936259B2 (en) | 1995-06-08 | 2005-08-30 | University Of Saskatchewan | CAMP factor of Streptococcus uberis |
| US5863543A (en) * | 1996-06-05 | 1999-01-26 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
| ZA97452B (en) * | 1996-01-25 | 1997-08-15 | Trinity College Dublin | Streptococcus equi vaccine. |
| AU769539B2 (en) | 1999-01-29 | 2004-01-29 | Zoetis Services Llc | Adjuvants for use in vaccines |
| FR2791895B1 (fr) * | 1999-03-23 | 2001-06-15 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Utilisation de trehalose pour stabiliser un vaccin liquide |
| MXPA03003690A (es) * | 2000-10-27 | 2004-05-05 | Chiron Spa | Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos. |
| NO318426B1 (no) | 2001-10-02 | 2005-04-18 | Neurozym Biotech As | Et materiale for a senke konsentrasjonen av patogene tarmpeptider |
| DE10239629A1 (de) * | 2002-08-23 | 2004-04-08 | Idt Impfstoffwerk Dessau-Tornau Gmbh | Nicht-rekombinate Subunit-Vakzine gegen Streptococcus suis-Infektionen des Schweines |
| PL2004220T3 (pl) * | 2006-03-30 | 2015-11-30 | Zoetis Services Llc | Sposoby i kompozycje do szczepienia drobiu |
| US7572457B2 (en) * | 2006-03-31 | 2009-08-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Use of Streptococcus suis 38 kDa polypeptide as an immunogen |
| JP5339243B2 (ja) * | 2008-04-24 | 2013-11-13 | 株式会社微生物化学研究所 | ストレプトコッカス・スイス感染症予防用ワクチン |
| TW201043242A (en) * | 2009-03-26 | 2010-12-16 | Intervet Int Bv | Vaccine for protection against Streptococcus suis bacteria of various serotypes |
| WO2017005913A1 (en) * | 2015-07-09 | 2017-01-12 | Intervacc Ab | Vaccine against s.suis infection |
| US20180271969A1 (en) * | 2015-10-07 | 2018-09-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Streptococcus suis polysaccharide-protein conjugate composition |
| GB201703529D0 (en) * | 2017-03-06 | 2017-04-19 | Cambridge Entpr Ltd | Vaccine composition |
| CN113957057B (zh) * | 2021-11-16 | 2023-10-20 | 西南大学 | 一种杂交瘤细胞、能中和猪溶素的单克隆抗体及检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5059419A (en) * | 1988-06-09 | 1991-10-22 | Grand Laboratories, Inc. | Streptococcus suis antiserum and its use in treating Streptococcus suis infections |
-
1994
- 1994-05-09 EP EP94201295A patent/EP0626452B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 DK DK94201295T patent/DK0626452T3/da active
- 1994-05-09 AT AT94201295T patent/ATE183241T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 ES ES94201295T patent/ES2137310T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 DE DE69419966T patent/DE69419966T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-13 SK SK563-94A patent/SK281324B6/sk unknown
- 1994-05-13 CZ CZ19941175A patent/CZ289302B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-13 TW TW083104343A patent/TW494103B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-05-13 US US08/242,406 patent/US5612042A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-16 PL PL94303482A patent/PL177219B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-05-16 HU HU9401511A patent/HU218154B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-05-17 JP JP10308094A patent/JP3578799B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-03 GR GR990402789T patent/GR3031698T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2137310T3 (es) | 1999-12-16 |
| HUT69796A (en) | 1995-09-28 |
| SK281324B6 (sk) | 2001-02-12 |
| EP0626452A1 (en) | 1994-11-30 |
| PL177219B1 (pl) | 1999-10-29 |
| DE69419966T2 (de) | 2000-01-20 |
| JP3578799B2 (ja) | 2004-10-20 |
| GR3031698T3 (en) | 2000-02-29 |
| EP0626452B1 (en) | 1999-08-11 |
| CZ289302B6 (cs) | 2001-12-12 |
| CZ117594A3 (en) | 1995-02-15 |
| HU9401511D0 (en) | 1994-08-29 |
| HU218154B (hu) | 2000-06-28 |
| DE69419966D1 (de) | 1999-09-16 |
| JPH0710774A (ja) | 1995-01-13 |
| TW494103B (en) | 2002-07-11 |
| PL303482A1 (en) | 1994-12-12 |
| US5612042A (en) | 1997-03-18 |
| DK0626452T3 (da) | 2000-02-14 |
| ATE183241T1 (de) | 1999-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100361562B1 (ko) | 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 | |
| SK56394A3 (en) | Anti-vaccine of streptococcus suis infection and method of its production | |
| Luo et al. | Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) of Pasteurella multocida X-73 | |
| Von Specht et al. | Protection of immunocompromised mice against lethal infection with Pseudomonas aeruginosa by active or passive immunization with recombinant P. aeruginosa outer membrane protein F and outer membrane protein I fusion proteins | |
| USRE46285E1 (en) | Streptococcus suis polypeptides and polybnucleotides encoding same and their use in vaccinal and diagnostic applications | |
| CZ284616B6 (cs) | Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu | |
| AU2005280147B2 (en) | Fusobacterium polypeptides and methods of use | |
| EP0656014B1 (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group b streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| US10261092B2 (en) | Cross-reactive determinants and methods for their identification | |
| US5369019A (en) | Pasteurella vaccine | |
| HAGA et al. | Protective efficacy of an affinity-purified hemolysin vaccine against experimental swine pleuropneumonia | |
| US5885589A (en) | Pasteurella vaccine | |
| US6015889A (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| AU758555B2 (en) | Peptides | |
| AU681130C (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity tomany strains of the group B streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| DK169749B1 (da) | DNA-fragment, der koder for et Pasteurella multocida-toxin eller for en immunogen subsekvens eller analog deraf, ekspressionsvektor, der omfatter DNA-fragmentet, fremgangsmåde til fremstilling af et Pasteurella multocida-toxin og anvendelse af Pasteurella multocida-toxinsekvens eller -analog til fremstilling af en vaccine |