SK55193A3 - Bombesin antagonists - Google Patents

Description

Vynález je zameraný na nové peptidy, ktoré ovplyvňujú rast rakovinových nádorov u človeka. Konkrétne sa týka antagonistov bombezínu. tvorených E y ^8-9 pseudolnonapeptidmi, obsahujúcimi na N- alebo/a C- konci D- alebo L-tryptofán alebo analóg tryptofánu 2,3,4.9-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indol-3-karboxylovú kyselinu (Tpi), ktorý má antagonistické vlastnosti voči bombezínu alebo peptidom typu bombezínu a ich soliam, a farmaceutických prostriedkov a spôsobov používajúcich tieto peptidy.

Doterajší stav techniky

Vynález sa týka polypeptidických zlúčenín, ktoré majú antagonistické vlastnosti voči bombezínu, alebo peptidom typu bombezínu, ako je peptid uvolňujúci gastrín /GRP/.

Neuromedin C a pod., označované ďalej iba ako antagonistické vlastnosti voči bombezínu, a sú účinné napríklad pri liečbe malígnych chorôb teplokrvných živočíchov, ako je človek. Vynález zahrňuje nové polypeptidické zlúčeniny a spôsoby ich výroby, nové farmaceutické prostriedky, obsahujúce tieto polypeptidické zlúčeniny, a spôsoby výroby liečiv s ich obsahom pre použitie na vyvolanie antagonistického účinku voči bombezínu u teplokrvných živočíchov, ako je človek.

Bombezín je tetradekapeptidamid, ktorý bol pôvodne izolovaný z kože žaby Bômbi na bômbi na /Anastasi, Erspamer a Bucci, Experientia, 1971, 27, 166/. Je známe, že bombezín je potentným mitogénom pre fibroblastové bunky myši Swiss 3T3 /Rozengurt a Sinňett-Smith, prac. Natl, Acad. Sci. USA, 1983, 80, 2936/ a že stimuluje sekréciu amylázy z morčacích pankreatických acínov /Jensen, Jones, Folkers a Gardner, Náture, 1984, 309, 61/. Je ďalej známe, že peptidy typu bombezínu sú produkované a vylučované ľudskými pľúcnymi rakovinovými bunkami /SCLC/ /Moody. Pert, Gazdar, Carney a Minna, Science, 1981, 214, 1246/, že exogénne pridané peptidy typu bombezínu môžu stimulovať rast ľudských buniek SCLC in vitro /Carney, Cuttita, Moody a Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821/ a že monoklonálna protilátka, špecifická pre C-terminálnu oblasť bombezínu a GRP, môže blokovať väzbu GRP k jeho receptorom a zabraňovať rastu ľudských buniek SCLC in vitro i in vivo /Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler a Minna, Náture, 1985, 316, 823/.

GRP, ktorý má vlastnosti, podobné bombezínu, je široko rozšírený peptidamid, obsahujúci 27 aminokyselín, izolovaný z bravčového čreva /McDonald, Jornvall, Nilsson, Vágne, Ghatei, Bloom a Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227/, ktorého C-terminálna sekvencia aminokyselín je takmer identická ako u bombezínu. Neuromedin C je dekapeptidamid, ktorého štruktúra je identická s poslednými desiatimi aminokyselinami C-terminálnej oblasti GRP, ktorý bol izolovaný zo psieho tenkého čreva /Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke a Shively, J.Biol. Chem., 1983, 258, 5582/. GRP stimuluje rôzne biologické odpovede vrátane uvolňovania gastrínu v systematickom obehu. Funguje tiež ako rastový faktor vo fibroblastoch myši 3T3 a bunkách pľúcnej rakoviny /SCLC/. Bolo teda navrhnuté, že GRP hrá priamu patofyziologickú úlohu vo vývoji SCLC autokrinným rastovým mechanizrnom.

Štruktúry bombezínu, Neuromedínu C a karboxyl-terminálneho nonapeptidu GRP sú tieto^: bombez ín:

pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Neuromedin C:

H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

C-terminálny nonapeptid GRP:

-Asn-His-Trp-Ala-Val-G1y-His-Leu-Met-Nlfe

Výskum ďalších peptidov typu bombezínu z obojživelníkov viedol k izolácii Litorínu ako nonapeptidu pGlu-Hln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 z kože žiab z Papuy, Nová Guinea, ktorý sa prejavil ako najúčinnejší bombezín /Yasukara a d., Chem. Pharm.

Γΐ /li i l\/iiyi V /i

Bull., 1979, 27,492/. štúdia bombezínových analógov ukázala, že minimálny segment aminokyse1 inových zbytkov v polohách 6-14 bombezínu má plné spektrum bombezínovej aktivity.

Teraz je známych niekoľko typov antagonistov bombezínu. Substancia P/ Ärg-Pro-Lys-Pro.G1n.Phe-Phe-Gly-leu-Met-NH2/. .ktorá vykazuje miernu homológiu aminokyselinovej sekvencie s bombezínomn, neinhibuje väzbu bombezínu a peptidov typu bombezínu, ale analógy substancie P, modifikované náhradou niekoľkých L-aminokyselín D-aminokyselinami, ako je /D-Arg¹. D-Pro², D-Trp⁷-⁹, Leu¹¹ /substancie P a /D-Arg¹, D-Phe⁵. D-Trp⁷- ⁹,Leu¹¹/ substancie P a /D-Arg¹, D-Phe⁵, D-Trp⁷-⁹, Leu¹¹/ Moody a d. Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201/, ako bolo zistené, blokujú sekréciu bombezínu v pankreatických acinárnych bunkách a antagonizujú rast podporujúci účinky bombezínu v bunkách Swiss 3T3.Napríklad 2 typy antagonistov bombezínu, odvodených od bombezínu,/D-Phe⁶, D-Phe¹²/bombezín a [ Leu¹³-psí-Leu¹⁴]bombezín /Coy a d., J.Biol.Chem.,1988, 263, 5056, a Peptides, 1989, 10, 587/ sa prejavili ako účinné inhibítory bombezínoivej odpovede in vitro a in vivo.

Ďalším typom antagonistov bombezínu, odhaleným Heimbrookom a d. /J.Biol. Chem., 1989, 264, 11258), je N-acety1-GRPC20-26) a jeho analógy, kde je z analógov GRPÍ20-27) vypustený C-terminálny metiónový zvyšok. Nedávno uviedol Coy (J. Biol. Chem., 1989, 264, 14691), že určité antagonisty bombezínu s krátkym reťazcom, založené na sekvencii Litorinu, ako je [D-Phe⁵, Leu¹³-psí-Phe¹⁴] bombezín-(6-14) a [D-Phe⁶, Leu¹³-psí-Leu¹⁴]bombezín-(6-14), vykázali omnoho viac účinnosti ako zodpovedajúci materský peptid [Leu¹³-psí-Leu¹⁴]bombezín.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje nové polypeptidy, antagonistami bombezínu, spôsoby ich výroby, farmaceutické zmesi na ich báze a ich použitie ako farmaceutický účinné prostriedky. Konkrétne sú predmetom vynálezu pseudopeptidy, polypeptidickú sekvenciu vzorca I

X-A¹-A²-A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-ps í-A⁹-Q (I) ktoré sú účinnými obsahujúce

NÁ'/PTTWTÍ S7P7I.V7» kde

Q je NHz alebo OQ¹ , kde Q¹ je vodík, Ci-ioalkyl. fenyl alebo C7-10fenylalky1.

X je vodík alebo jednoduchá väzba -aminoskupiny A¹ ku karboxylu v bočnom reťazci IJ. ak je prítomný, alebo skupina vzorca R¹CO-, kde R¹ je volené zo skupín zahrňujúcich a/ vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7_iofenylalkyl, b/ R² >NR³ kde R² je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo Cy-iofenylalky1, R³ je vodík alebo Ci-ioalkyl, a c/ R⁴-0-. kde R⁴ je Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-10 fenylalky1;

A¹ je D-, L- alebo DL-pGlu, Nal, Phe, Thi, Tyr, Tpi, Hca, Hpp, Mpp. Trp alebo Trp, substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi skupiny zahrňujúcej halogén, NO2. NH2. OH, Ci-3alkyl a Ci-3alkoxy, kde halogénom je fluór, chlór a bróm.

A² je Asn, Dpa, Gin. His. MeHis. His(Bz). His(Z) alebo skupina vzorca Asp(Y), Glul-1 a Glu(Y), kde

Y je -OR⁵ alebo -N-R⁶

R*

kde
R5	je
R6	je
R7	je
1	je

jednoduchá väzba, spojujúca bočnú karboxylovú -aminoskupinou A¹, kde X je jednoduchá väzba.

Trp, MeTrp, Trp(For) alebo Trp, kruhu jedným alebo viac členmi N02 . NH2 . OH. Ci-3alkyl a skupinu s

ij je Nal, Pal, Tpi, substituovaný na benzénovom skupiny zahrňujúcej galogén.

Ci-3alkoxy, kde halogénom je fluór, chlór a bróm, A⁴ je Äla, MeAla alebo Gin,

A⁵ je Val alebo MeVal,

A⁶ je Gly. Phe alebo D-Ala.

NÁHRADNÁ STRANA

A⁷ je His, MeHis. His(Bz). His(Z), Lys(Z) alebo Pal.

A⁸ je redukovaný izoster Leu alebo Phe.

A⁹ je Leu, Phe, Tpi. Trp alebo Trp, substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viacerými členmi skupiny zahrňujúcej halogén, NO2 . NHz. OH, Ci-3alkyl a Ci-₃alkoxy, kde halogénom je fluór, chlór a bróm, avšak s podmienkou, že A¹ alebo A⁹ je D-, L- alebo DL-Tpi, a ich soli s farmaceutický prijateľnými kyselinami.

Výhodné polypeptidy vzorca I majú ako A¹ zvyšok zvolený zo skupiny zahrňujúcej Mpp, D-Phe, L- alebo D-Tpi, D-Trp alebo Trp, substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi skupiny zahrňujúcej halogén, NO2. NH2 . OH, Ci-₃alkyl a Ci-3alkoxy. kde halogénom je fluór, chlór a bróm. A⁹ je zvyšok D-. L- alebo DL-aminokyseliny. zvolené zo skupiny zahrňujúcej Leu, Phe, Tpi, Trp alebo Trp(For).

Pre účely popisu tohto vynálezu sa používajú konvenčné skratky aminokyselín, peptidov a ich derivátov, ktoré sú používané všeobecne v chémii peptidov a sú doporučené komisiou IUPAC-IUB pre biochemickú nomenklatúru (European J. Biochem., 1984, 138, 9-37).

Skratky pre jednotlivé zvyšky aminokyselín sú založené na triviálnom názve aminokyseliny, napríklad Trp je tryptofán, Gin je glutamín, His je histidín,, Äla je alanín. Val je valín, Gly je glycín, Leu je leucín, Phe je fenylalanín. Ak má aminokyselinový zvyšok izomerné formy, označuje skratka L-formu aminokyseliny, ak nie je pred symbolom aminokyseliny uvedené D- alebo DL-. Význam neobvyklých skratiek aminokyselín, použitých v tejto prihláške:

Dpa 2,3-diaminopropiónová kyselina

Nal 3-(2-nafty1)-alanín

Thi -2--tienylalanín

Tpi 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido-[3,4-blindol-3-karboxylová kyselina

Peptidické sekvencie sú zapisované v súlade s konvenciou, pričom N-terminálna aminokyselina je naľavo a C-terminálna aminokyselina napravo.

Hca hydroškoricová kyselina

Hna 3-hydroxy-2-naftoová kyselina

Hpp 3-(4-hydroxyfeny1)propiónová kyselina

- Ú Mpp 3-(4-metoxyfeny1)propiónová kyselina

Paa fény1octová kyselina

Ďalšie použité skratky:

AC	acy 1
Ac	acety1
AcOH	octová kyselina
Boe	terc.butoxykarbonyl

(Boe)₂0 diterc.butyldikarbonát

BHA	benzyhydry1am í n
Bzl	benzy1
BSA	albumín hovädzieho séra
DIC	1,3-di izopropylkarbodi imid
DMEM	Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium
Et	ety 1
EDTA	etyléndiamíntetraoctová kyselina
FCBS	sérum teľacieho plodu
Fmoc	9-f1uórenylmetyloxykarbony1
For	formyl

HITES médium RPMI 16 4D plus 10 ⁸ M hydrokortizónu,

	5 1/ml hovädzieho inzulínu. 10 g/ml ľudského transferrinu, 10-8 M -estradiolu a 3xl0-8 M Na2 Se03
HOBt	1-hydroxybenzotriazol
HPLC	vysokoúčinná kvapalinová chromatografia
Me	mety 1
MeCN	acetón i tri 1
MeOH	metylalkohol
TEA	trietylamín
PBS	fosfátom tlmený solný roztok
pGl u	pyroglutamová kyselina
ps í	pseudopeptidická väzba štruktúry CH2-NH okrem prípadov, kedy nasledujúci zbytok má sekundrárny N-koniec, kedy znamená CH2N
TFA	trifluóroctová kyselina
Z	benzyloxykarbony1

Najvýhodnejšími polypeptidmi podľa vynálezu sú^: štruktúra

NH₂-CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 D-Trp-Gln-Trp-A1a-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Leu-NH2 D-Trp-G1 u(MeNH)-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 5F-D-Trp-G1 n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH₂ D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH₂ D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2 D-Tpi-H is(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Leu-NH2 NH₂ CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH₂ D-Trp-G1n-Trp-A1a-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Phe-NH₂ D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-G1y-His-Leu-ps í-Phe-NH2 D-Tpi-G1u(OMe)-Trp-Äla-Val“Gly-His-Leu-ps í-Phe-NH₂ Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂ D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2 Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps ί-Tpi-NH2 D-Trp-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂ D-Trp-His CBz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2 D-Trp-G1u(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂ D-Trp-Glu-(OMe)-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂ Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 Ac-Tpi-Gln-Trp-A la-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 NH₂ CO-Tpi-G1η-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 Mpp-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps1-ΤΓΡ-ΝΗ2 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2 D-Trp-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2 Mpp-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Trp(For)-NH₂ D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-TrpCFor)-NH₂ D-Trp-G1n-Trp-A1a-Va1-Gly-H is-Leu-ps í-Trpí For) -NH2 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-TrpíFor)-NH₂ Tpi-G1 η-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-OMe D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Tpi-OMe

ΝΗ₂ CO-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Tpi-OMe

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-H is-Leu-ps í-Tpi-NHMe

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Tpi-OH

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-N₂ H₂ C0NH₂

Zvlášť výhodné polypeptidy podľa vynálezu zahrňujú peptidy č. 5. 7, 12, 17, 18, 22, 26 a 38.

Syntéza polypeptidov:

Polypeptidy podľa vynálezu je možné pripraviť akoukoľvek známou metódou. Súhrn týchto metód možno nájsť v M.Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.

Metódy syntézy výlučne v pevnej fáze sú uvedené v učebnici J.M.Stewarta a J.D. Younga, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2.vyd.), a v prehľade G. Baranyho a d., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739, 1987.

Zvlášť výhodnou metódou prípravy polypeptidov a ich medziproduktov podľa vynálezu je syntéza v pevnej fáze. Ako nosič sa pri syntéze polypeptidov podľa vynálezu v pevnej fáze používa benzhydrylaminová (BHA) živica alebo chlórmetylovaná polystyrénová živica, sieťovaná 1 % divinyIbenzénu, ktoré sú obchodne dostupné. Ako chrániaca skupina pre OL-aminoskupinu sa volí terc.butoxykarbonylová (Boe-) skupina, ktorá sa odstraňuje po každom stupni syntézy. Počiatočná látka, obsahujúca chránenú aminokyselinu, sa pripraví kondenzáciou Boc-aminokyseliny so živicou BHA alebo jej naviazaním na chlórmetylovanú polystyrénovú živicu pomocou KF. Syntéza začína na C-konci polypeptidu a uskutočňuje sa pomocou manuálneho zariadenia postupne krok za krokom s odstraňovaním chrániacej skupiny -aminoskupiny a kondenzáciou s nasledujúcou aminokyselinou.

Čistenie polypeptidov:

Polypeptidy sa všeobecne čistia vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na stĺpci s reverznými fázami, uskutočňovanou na zariadení Rainin HPLC System (Rainin Inc.,

- ‘b Co.,Voburn, MA), tvorenom troma pumpami Rainin Rabbit HP HPLC, ovládanými počítačom Apple Macintosh Plus, vstrekovacím zariadením Rheodyne a UV monitorom Knauer model 87 s premennou vlnovou dĺžkou. Surové peptidy (10 až 40 mg) sa nanesú na kolónu Dynamax Macro (21.2 x 250 mm), plnenú guľovým silikagelom Cie (veľkosť pórov 300 , veľkosť častíc 12 m, Rainin Inc. Co.), a eluujú lineárnym gradientom s použitím rozpúšťadlového systému, tvoreného a/ 0,1¾ TFA a b/ 0,1¾ TFA v 70¾ vodnom acetonitrile. s prietokom 2,0 ml/min. Pri všetkých frakciách sa hodnotí čistota a retenčná doba analytickou HPLC d'alej popísaným spôsobom.

Kvalita a elučné charakteristiky surového a čisteného peptidu sa stanovia analytickou HPLC na kvapalinovom chromatografe Hewlett-Packard model 1090. vybavenom diódovou detekčnou sústavou pri 220 a 280 nm a kolónou V-porex Cie 4,6 x 250 nm s reverznými fázami (veľkosť pórov 300 , veľkosť častíc 5 m). Udržuje sa prietok 1,2 ml/min vyššie uvedeného

rozpúšťadlového systému teplote miestnosti.	a/, b/ a	separácia sa	uskutočňuje pri
Vo väčšine	prípadov sa	polypeptidy	ďalej	čistia
rechromatograf iou	na	rovnakej	kolóne s	miernou	úpravou

gradientových podmienok. Homogenita čistených peptidov v analytickej HPLC preukázala čistotu nad 97¾.

Analýza aminokyselín:

Analýza aminokyselín polypeptidov podľa vynálezu sa uskutočňuje v analyzátore aminokyselín Beckman 6300 na vzorcoch, ktoré boli 20 h pri 110°C hydrolyzované v zatavených evakuovaných skúmavkách so 4 M metánsulfonovou kyselinou, obsahujúcou 0,2 ¾

3-(2-aminoety1)-indolu. Boli zistené očakávané pomery aminokyselín. Zbytky Leu-psí-Leu a Leu-psí-Phe vykazujú absorbčné Piky s retenčnými dobami 39, 93, resp. 44, 56 min. Po 50 min digescie nebol pri analýze nájdený Tpi.

Skúšobné postupy: a/ test väzby receptorov

Naviazanie ¹²⁵I-GRP(14-27) a jeho odštiepenie antagonistami bombezínu sa uskutočňuje na 24-jamkových doštičkách pre tkanivovú kultiváciu (GIBCO) s použitím buniek Swiss 3T3. Myšie fibroblasty Swiss 3T3 sa udržujú týždenným prechodom DMEM, obsahujúcim 10 % FCBS a ant imykotiká. Kultúry sa inkubujú v 5¾ CO2 vo vzduchu pri 37°C. Jamky sa osadia 10⁵ buniek/jamku (životnosť > 95¾). pestovanými do súvislého nárastu. Väzobný postup sa uskutočňuje 7 dní po naočkovaní. Bunky sa premyjú dvakrát 0.5 ml väzobného pufra (Dulbeccove modifikované Eagleho médium obsahujúce 20 nM HEPES-NaOH (pH 7,4), 0,2 ¾ BSA a 100 g/ml bac i trac í nu). Potom sa bunky inkubujú 0,2 nM ¹²⁵I-GRP(14-27) v prítomnosti alebo neprítomnosti rôznych koncentrácií antagonistov (6xl0^-11 až 6xl0^-6 M, celkový objem 0,4 ml).

Podľa Zacharyho & Rozengurda (Preš. Natl. Acad. Sci., USA, 1985, 85, 3636-3670) a Laytona a d. (Cancer Res., 1988, 43, 4783-4789) dosiahne väzba ¹²⁵I-GRP pri 37°C maximálnu hodnotu v 30 min. a potom klesá; bunky sa teda inkubujú 30 min. pri 37°C. Potom sa dvakrát premyjú ľadovo chladným (4°C) väzobným pufrom a dvakrát ľadovo chladným fosfátom tlmeným solným roztokom (PBS, NaCl 138, KC1 2,8, Na2HPCU 8, KH2PO4 1,45, CaCl₂ 0,91, MgCl₂ 0,49 mM). Premyté kultúry sa extrahujú v 0,5 ml 0,5M NaOH a prenesú sa do skúmaviek. Rádioaktivita vzoriek sa zisťuje automatickým počítačom gamma (Micromedic System. Inc., Huntsville, Ala.).

Na stanovenie typov väzby receptorov, disociačnej konštanty (Kd), asociačnej konštanty (Ka). maximálnej väzobnej kapacity receptorov (Bmax) a polovičnej maximálnej inhibície (IC50) sa použije počítačový program aproximácie krivky Ligand-PC podľa Munsona a Rodbarda (Anál. Biochem., 1987, 107, 220-239).

Hodnoty IC50 reprezentujú koncentrácie antagonistov, vyvolávajúce polovicu maximálnej inhibície rastu stimulovaného 0,2 nM GRP(14-27). Disociačná konštanta v našich pokusoch je 1,32 nm a maximálna väzobná kapacita ¹²⁵I-GRP(14-27) 0,769 pm/mg proteínu, čo sú podobné hodnoty, aké boli zaznamenané u ¹²⁵I-GRP a ¹²⁵ I^-Tyr^-bombez í nu. Väzobné charakteristiky receptorov GRP na bunky 3T3 v týchto pokusoch dobre súhlasia s hodnotami, získanými pre väzbu bombezínu na pankreatickej acinárnej (Jensen a d., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 6139-6143) a hypofyzárnej (Vestendorf a Schonbrunn, J. Biol. Chem., 1983, 258, 7527-7535)

II bunke.

GRP(14-27) inhibuje väzbu ¹²⁵I-GRP(14-27) s IC50 2.32 nM. čo súhlasí s údajmi Laytona a d. (Cancer Res., 1988, 48, 4783-4789), ktorý uvádza 2,2 nM. Údaje o väzbe polypeptidov podľa vynálezu sú uvedené v tabuľke I.

Tabuľka I väzba na Swiss 3T3

kód	Ka (nM-1)	Kd (nM)	ICsn (nM)__
7	neodštiepuje	-	-
5	0,129	8	9,2
12	0,014	71	81,65
26	0,045	22	25,3
17	0,955	1	1,2
2	0,095	10,6	12, 19
34	0,0006	1667	1917,05
11	0,217	5	5,75
27	0,013	74,5	85,66
29	0,0019	526,3	604,9
30	0,254	4	5,15
28	0,125	8	9,16
33	0,002	556	639,4
18	0,257	4	4,6
10	1	1	1,15
22	1,012	0,9	1,14
8	0,014	71	82,14
GRP(14-27)	0,75±0,23	l,32±0,43	/ŕ 1,52+0,7
Bmax = 7,12x10“	12 , t.j. 0,35xl0-12	M/mg proteínu
IC50 je koncentrácia neznačeného 1 igandu.	ktorý odštiepuje
polovičné množstvo špecifickej väzby rádioligandu. Počíta sa
podľa rovnice	Chenga a Prusoffa	(Biochem-Pharmacol. 1973, 22.
3099): ICso =	Kc < 1 + L/Kh), kde Kc	a Kh sú disociačné konštanty
neznačeného (Kc ) a značeného (Kh)	1 igandu a	Ľ je koncentrácia

použitého rádioligandu.

b/ uvoľňovanie amylázy

Izolované pankreatické acíny sa pripravujú kolagénazovou digesciou pankreatu, odobratého samcom krýs Vistar (150 až 180

g), ponechaným cez noc bez potravy). Zvieratá sa usmrtia vyvrátením krčných stavcov, odoberie sa pankreas a digeruje vysoko čistenou kolagénazou (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical,

Freehold, N.J.,	USA)	postupom podľa	Amsterdama	, Solomona a
Jamiesona (1978).
Jednotí ivé	acíny	sa suspendujú	v inkubačnom médiu.
obsahujúcom 24,5	mM HEPES, 98 mM NaCl	, 4,0 mM	KC1, 11,7 mM
KH2 POzj, 1.0 mM	MgCl2,	0,3 mM CaCl2,	5,0 mM	glukózy, 1 %

(hm./obj.) zmesi esenciálnych a neesenciálnych aminokyselín (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, SRN), 2 mM glutamínu, 0,2 % BSA a 0,01 % (hm./obj.) trypsínového inhibítoru. Inkubačný roztok sa nasýti kyslíkom a udržuje pri 37°C v trepacom kúpeli (60 oscilácií/min.). Acinárna suspenzia sa inkubuje v prítomnosti rôznych koncentrácií GRP alebo antagonistov GRP.

Po inkubácii sa skúmavky 5 min. odstred’ujú pri 1000 g a supernatant sa oddelí od pevného podielu. V suspernatante a rozpustenom pevnom podiele sa oddelene stanoví obsah amylázy podľa Bernfelda (1955). Sekrécia amylázy je daná percentom prírastku nad základnú hodnotu. Inkubácie sú zdvojené. Ako základná hodnota sa stanoví nestimulované uvoľňovanie amylázy v priebehu celej doby experimentu.

Prídavok k inkubačnému médiu v postupne vzrastajúcej koncentrácii spôsobuje koncentračné závislú inhibíciu uvoľňovania amylázy, stimulovanú submaximálnou koncentráciou GRP (10^-9M).

c/ inhibícia začlenenia ³H-tymidínu do buniek 3T3

Použijú sa bunky SCLC 2 až 4 dni po pasáži. Pripraví sa jednobunečná suspenzia premytím buniek (dvakrát PBS) a potom pipetovaním do PBS obsahujúceho 0,2 g/1 glukózy, 0,2 g/1 EDTA a 14 mM 1ignokainhydrochloridu s teplotou 37°C do vytvorenia uniformnej suspenzie (2 až 4 min.). Bunky sa potom trikrát premyjú a resuspendujú v HITES bez FCSB. V dni 0 sa vytvorí na doštičkách po l,34xl0⁵ buniek kultúry, ku ktorým sa pridajú všetky peptidy súčasne v 1 ml média RPMI-1640 plus HITES a 0,125 % albumínu. Po 48 h sa ku každej jamke pridá 1 uc tritiovaného tymidínu a v inkubácii sa pokračuje ešte 24 h. Potom sa bunky premyjú, prenesú na filtračný papier a premyjú ľadovo chladnou 5% trichlóroctovou kyselinou. Filtračný papier sa vloží do nádobiek so scintilačnou tekutinou a 1 min. sa uskutočňuje čítanie.

Tabuľka II testovanie antagonistických analógov gastrín uvoľňujúceho peptidu (GRP) na bunkách 3T3 inhibícia začlenenia ³H-tymidínu peptidický analóg

GRP ng/ml 3 ng/ml +

500 +

100 +

500

100

500

100

500

100

500

100

DPM-S-E-_

207000*4200

348000*15300

233000*8800

205000*12500

222000*3900

277000*9800

207000*3800

223000*1200

283000*5400

280000*21900

199000*7100

261000*19500

242000*8300

255000*26200

269000*14000

280000*14000

198000*18800 % inhibície . proti a GRP § >100 (-l⁵*) 89

100 >100 C-4~) >100 C-4~) ~~ P < 0,01 í-*“) inhibícia pod základnou nestimulovanou hodnotou

§) 348000 - 207000 = 141000 vzaté ako stimulovaná hodnota d/ inhibícia rastu rôznych pľúcnych (SCLC) karcinómov Zásobná kultúra buniek SCLC H-69 a H-345, získaná z National

Cancer Inštitúte (NCI), sa udržuje v suspenznej kultúre. Inhibícia GRP vyvolanej syntézy antagonistami bombezínu sa zisťuje meraním včlenenia ³H-tymidínu. Inhibícia GRP vyvolanej syntézy antagonistami bombezínu sa ukazuje ako signifikantná a závislá na koncentrácii.

e/ účinok pankreatickej sekrécie in vivo

Výskum sekrécie sa uskutočňuje pri vedomí na 6 mačkách (2 až kg), preparovaných s chronickými žalúdočnými a pankreatickými fistulami (Konturek a d., J. Physiology London, 1976, 257, 663-672). V žalúdočnej fistúl i sa použije kanyla popísaná Emasom (Gastroenterology, 1960, 39, 886-782). Kanyla sa zavedie do oblasti vratníka v blízkosti veľkého zakrivenia. Pankreatická fistula sa vytovrí pomocou kovovej kanyly tvaru T s bočným a hlavným ramenom, ktorú sme upravili pre mačky. Normálny žlčovod sa pred spojením s vývodom slinivky rozdelí a transplantuje do horného dvanástom íka na oddelenie žlče od pankreatickej šťavy. Vytvorí sa malý dvanástomikový váčok, obsahujúci vstup hlavného vývodu slinivky, a do tohto váčku sa zavedie bočné remeno pankreatickej kanyly. Hlavné rameno tejto kanyly sa umiestni do distálneho dvanástorníka asi 3 cm za duodeno-duodenostómiou.

Výskum sekrécie sa zaháji asi 3 mesiace po chirurgickom zákroku. Aspoň 18 h pred každým testom sa z klietok odoberie potrava. V priebehu celého testu (okrem kŕmenia) sa žalúdočná fistula ponechá otvorená na odtok žalúdočných štiav.

Sekrécia z pankreatickej fistule sa nepretržite zbiera a delí sa do vzoriek po 15 min. Zaznamená sa objem a stanoví sa koncentrácia a výstup proteínu a bikarbonátu (Konturek a d-, 1876).

Na každom zvierati sa uskutoční rad testov na porovnanie sekrečnej potencie. Pri jednodennom teste sa intravenózne podáva GRP v odstupňovaných dávkach (1250 pmol/kgh GRP) s prídavkom alebo bez prídavku peptidu 5. Pri testoch s kŕmením sa žalúdočná fistula udržuje uzatvorená a každej mačke sa podá asi 50 g vareného homogenizovaného mletého hovädzieho mäsa, ktoré je obvykle celkom skonzumované. Po kŕmení sa udržuje intravenózna infúzia solného roztoku (asi 10 ml/h) a keď pankreatická sekréčna odpoveď dosiahne dobre ustálené zdržanie, podá sa peptid 5 a ďalšie 2 h sa skúma sekrécia. Vo zvláštnych testoch na hladujúcich mačkách (bez infúzie peptidu alebo kŕmenia mäsom) sa 2 h meria základná pankreatická sekrécia (s otvorenou žalúdočnou fistulou) a potom sa k infúzii pridá peptid 5 (10 nmol/kgh) v dávke, ktorá celkom zruší pankreatickú sekréciu, vyvolanú GRP. Výsledky sú uvedené ďalej.

Analógy bombezínu peptidy 5, 10 a 2 sa testujú in vivo na inhibícii sérového gastrínu po stimulácii GRP. 8 min po stimulácii GRP (3 g/100 g BW) sa hladina sérového gastrínu zvýši z 16,7 pg/ml (kontrola) na 105 pg/ml. Krysa po injekcii bolusu antagónnych peptidov 5, 10, 2 (30 g/100 g BW) 10 min pred stimuláciou GRP vykazuje pokles hladiny sekrécie gastrínu (po 8 min 36,8 pg/ml pre peptid 2, 24,2 pg/ml pre peptid 10 a 39,2 pg/ml pre peptid 5).

Antagonisty bombezínu/GRP podľa vynálezu sú vhodné na liečbu hypergastrinemických stavov, napríklad perniciálnej anémie, chronickej gastritídy, Zol1inger-El1isonovho syndrómu a vitiligo, spojených s difúznou hyperpláziou žalúdočných enterochromaffinických buniek a so zvýšeným rizikom vývinu multifokálnych gastrických kareinoidných tumorov. Hyperplázia enterochromaffinických buniek sa naviac ľahko dostavuje pri hypergastrinemických zvieratách.

Uvedená liečba -je oproti doterajším liečivám výhodná, nakoľko H2-antagonisty, ako je cimetidín, ktoré spôsobujú hypergastrinémiu, môžu viest u človeka ku karcinoidným tumorom. Naviac vynechanie terapie s H2-antagonistami spôsobuje v dôsledku existujúcej hypergastrinémie okamžité obnovenie vredov.

Pretože zlúčeniny podľa vynálezu sú antagonistami receptorov bombezínu/GRP, môžu byt používané pri liečbe rakoviny pľúc, rakoviny hrubého čreva a rakoviny žalúdka.

Na základe uvedených výsledkov a údajov získaných u potkanov

NTWR’nnNÁ RTR71N71

-16vo forme farmaceutický adiačné soli, ako ich hydrochlorid. tanát, maleát, pamoát, malát.

môžu byť peptidy podľa vynálezu podávané prijateľných netoxických solí. ako sú príklady je možné pre ilustráciu hydrobromid, sulfát, fosfát, fumarát, acetát, citrát, benzoát. sukeinát. askorbát, tartrát a pod.

Výhodným prostriedkom stáleho mikrokapsle alebo mikrocastice týchto peptidov, formulované z poly(DL-laktid-koglykolidu). Je rovnako možné používať intravenóznu, intramuskulárnu alebo subkutánnu aplikáciu v izotonickom soInom roztoku a pod. Pre aplikáciu v pľúcach je možné používať aj aerosóly.

Tieto farmaceutické zmesi obsahujú peptid v spojení s bežným farmaceutický prijateľným nosičom. Dávkovanie sa pohybuje od asi 1 do 1000 g peptidu na kg telesnej hmotnosti pacienta pri parenterálnom podaní. Liečba subjektov týmito peptidmi môže byť uskutočňovaná rovnakým spôsobom ako klinická liečba s použitím iných agonistov a antagonistov LHRH. analógov somatostatinu alebo iných peptidov.

Tieto peptidy nachádzajú použitie v intravenóznej, subkutánnej, intramuskulárnej. intranasálnej forme alebo vo forme pulraonárnych aerosolí k vyvolaniu gastrického inhibičného alebo antitumorového účinku. Účinné dávky sa menia s formou aplikácie a konkrétnym druhom liečeného cicavca. Príkladom typickej dávkovej formy je fyziologický solný roztok, obsahujúci peptid, podávaný tak, aby zabezpečoval dávku v rozmedzí asi 0,01 až 0,20 mg/kg telesnej hmotnosti. Formulácie s trvalým uvolňovaním môžu byť podávané iba jedenkrát mesačne a doba liečby môže činiť niekoľko mesiacov.

uviesť glukonát, alginát, uvoľňovania mozu byť

Príklady uskutočnenia vynálezu

Akokoľvek je vynález popísaný s ohľadom na svoje výhodné uskutočnenia, je pochopiteľné, že bez prekročenia rozsahu vynálezu, uvedeného v patentových nárokoch, je možné v nich uskutočňovať zmeny a modifikácie, zrejmé odborníkovi. Pri vynáleze je rovnako možné uskutočňovať známe substitúcie, pokiaľ významne neznižujú jeho účinnosť.

Všeobecné operácie syntézy peptidov vychádzajúce z jednotky Boc-aminokyselina-živica

Operácia I^; (1) premytie CH2CI2 (3 x 1 min) (2) odštiepenie chrániacej skupiny - 5 min a potom 25 min s

50¾ TFA v CH2CI2^: u živíc s naviazaným peptidom obsahujúcim Dalebo L-Trp alebo Tpi 50¾ TFA v CH2CI2 s obsahom 5 ¾ merkaptoetanolu a 5 ¾ anizolu (3) premytie CH2CI2 (6x1 min) (4) neutralizácia 10¾ trietylamínom v CH2CI2 (2x3 min) (5) premytie CH2CI2 (6x1 min) (6) kondenzácia: i/ prídavok Boc-aminokyseliny (3 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) v DMF <3 min) i i/ prídavok 20 ¾ diizopropylkarbodiimidu v CH2CI2 a trepanie na čas 60 až 90 min (7) premytie CH2CI2 (2x1 min), etanolom (2 x 1 min) a CH2CI2 (5x1 min)

Operácia 11=

Na zavedenie redukovanej peptidickej väzby -CH2NH- je stupeň (6) operácie I modifikovaný takto:

(1) premytie DMF (2 x 1 min) (2) prídavok Boc-leucinaldehydu (3 ekv.) v DMF, obsahujúcom 1¾ AcOH (3) prídavok NaBlteCN (3,5 ekv.) v DMF a trepanie na čas 60 min (4) premytie 50 ¾ MeOH (3x1 min)

100 ¾ MeOH (3x1 min)

CH2CI2 (3x1 min)

Operácia III

Ku kondenzácii Boc-Asn, Boc-Gln a Boc-Gly je stupeň (6) operácie I modifikovaný takto:

20¾ diizopropylkarbodiimidu (3,0 ekv.) v CH2CI2 sa pridá k zmesi DMF roztoku Boc-aminokyseliny (3,0 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.), ponechá sa 15 min pri 0°C a 15 min pri teplote miestnosti, odfiltruje sa nerozpustný podiel, filtrát sa pridá k živici s naviazaným peptidom a trepe sa 2 až 4 h s Boc-Gln alebo Boc-Asn alebo 1 h s Boc-Gly.

Operácia IV'Na zavedenie Fmoc-aminokyseliny sa uskutoční tento postup^: (1) po odštiepení chrániacej skupiny a neutralizácii premytia CH2CI2 (3x1 min) a DMF (3x1 min)

	(2)	kondenzácia i)	prídavok	Fmoc-aminokyseliny (3 ekv.) a
HOBt	(3.	3 ekv.) v DMF (3	min)
		ii)	prídavok	20¾ diizopropylkarbodiimidu v
CH2CI2 a	trepanie na čas	60 min
	(3)	premytie etanolom (3x1	min)
		DMF (3	x 1 min)
	(4)	odštiepenie skupiny Fmoc	50¾ piperidinom v DMF na čas 30
min
	(5)	premytie DMF (6	x 1 min)
	(6 )	ďalšia kondenzácia ako v	stupni (2)

Potom. čo sa pripravia požadované intermediárne peptidy vzorca I, pôsobí sa na živicu s naviazaným peptidom kvapalným HF v prítomnosti anizolu za vzniku polypeptidu vo vodnej forme, kde X vo vzorci I je vodík a Y vo vzorci I je -NH2 alebo OH. alebo v chránenej forme, kde A² vo vzorci I je Glu(OMe) alebo His(Bz)

Premena funkčnej skupiny na N- alebo C-konci alebo v bočnom reťazci polypeptidu z volnej alebo chránenej formy na inú formu sa uskutoční reakcia s vhodným činidlom v roztoku.

Napríklad chránený polypeptid, majúci v polohe A² Glu, sa nechá reagovať s metylamínom v prítomnosti DIC za vzniku polypeptidu. majúceho v polohe A² Glu(MeNH). Polypeptid s voiným N-koncom sa nechá reagovať s KOCN za vzniku polypeptidu. majúceho v polohe X skupinu NH2CO-.

V príkladoch sa na označovanie medziproduktu používa takéto kódovanie: a/b/Res je pôvodná živica. použitá v príklade a, stupeň b, a/b/c je prekurzor peptidu c, vyrobený v stupni b príkladu a;, a, b a c sú celé čísla.

i‘J

Príklad 1

1. a) L- a D-Tpi

2.04 g (10 mM) L-Trp sa rozpustí v 25 ml vriacej vody, obsahujúcej 2,1 g citrónovej kyseliny. Pridá sa 0,5 ml 40% formaldehydu a okamžite sa začína tvoriť pevná látka. Zmes sa vychladí na ľadovom kúpeli, pevný podiel sa odoberie, premyje studenou vodou a suší na vzduchu pri teplote miestnosti; získa sa tak 2,14 g, t.j. 99% pevnej látky s teplotou topenia (za rozkladu) cca 310°C. D-izomer, získaný rovnakým spôsobom, má tiež teplotu topenia (za rozkladu) cca 310°C.

b/ L- a D-Boc-Tpi

K miešanej suspenzii 10,8 g (50 mM) D-Tpi v 250 ml 0,2N NaOH a 7,5 ml trietylamínu sa pridá 10 g diterc.butyldikarbonátu, zmes sa mieša 4 h, potom sa pridá ďalších 10 g dikarbonátu a ďalších 10 g po 3 h miešania. Potom sa zmes mieša cez noc a extrahuje (2 x 100 ml) éterom, ktorý sa kanalizuje. K vodnej vrstve sa pridá citrónová kyselina do kyslej reakcie (pH 3-5). Pevný podiel sa zhromaždí, premyje vodou a cez noc suší na vzduchu.

Pevná látka sa resuspenduje v 100 ml tetrahydrofuránu. Rozpustí sa takmer všetok pevný podiel. Nerozpustný podiel sa odfiltruje a tetrahydrofurán sa odparí vo vákuu. Zbytok sa trituruje s éterom a získa sa 9,20 g, resp. 58 %. Táto látka má rovnakú teplotu topenia ako pôvodná látka, ale líši sa rozpustnosťou a pri TLC na silici s použitím 85^:15^:0,5 CHCI3^: Me0H:H0Ac.

Rovnakým spôsobom sa z 2,55 g L-Tpi získa 2,22 g, t.j. 59 % Boc-Tpi.

2. Boc-Leu-CHO

Metylester Boc-leucínu (35 g, 134 mmol) v suchom touléne (250 ml) pod dusíkom sa vychladí suchým ľadom a acetónom a v priebehu 30 min sa pridá 150 ml 25% diizobutylalumíniumhydridu v toluéne. Po prídavku diizobutylalumíniumhydridu sa zmes mieša 20 min na kúpeli suchý ľad/acetón, potom sa opatrne pridá metanol (15 ml). Zmes sa vleje do 1000 ml ľadovo chladnej vody, pretrepe a prefiltruje. Oddelí sa toulén a vodná fáza sa reextrahuje éterom (3 x 300 ml). Toulén sa spojí s éterickými extraktami a suší (Na2S04>- Získaný olej sa nechá rýchlo prejsť stĺpcom silikagélu (3 x 50 cm) v 1500 ml 15¾ EtOflc/benzín.

Boc-Leu-aldehyd sa získa vo forme oleja (27,6 g).

Príklad 2 peptid č.

NH₂CO-Trp-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH₂

D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

D-Tpi-G1η-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Leu-NH2

D-Tpi-G1u(OMe)-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2

D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

Polypeptidy v tomto príklade, obsahujúce rovnaký fragment Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2, ale dva rôzne zbytky na N-konci, sa pripravia postupnou syntézou na benzhydrylamínovej (BHA) živici štandardnou metódou syntézy v pevnej fáze.

Na 0,50 g živice BHA (0,9 mmol NH2/g) sa pôsobí dvakrát za čas 3 min 10¾ TEÄ v CH2CI2 (neutralizácia) a šesťkrát sa premyje CH2CI2- Živica sa 3 min mieša s 1,35 mmol Boc-Leu a 1,50 mmol 1-hydroxy1benzotriazolu (HOBt) v DMF. Pridá sa 20¾

1,3-diizopropylkarbodiimidu (DIC) s 1,3 mmol v CH2CI2 - Zmes sa 60 min trepe pri teplote miestnosti. Získaná živica Boc-Leu-BHA sa premyje CH2CI2, dvakrát metanolom a trikrát CH2CI2 a potom sa podrobí Kaizerovmu testu (Anál. Biochem. 34, 595 (1970)). Pokiaľ dôjde k neúplnej kondenzácii, kondenzačný postup sa opakuje.

Odštiepenie skupiny Boe z Boc-Leu-BHA sa uskutočňuje za čas 5 min v roztoku 50¾ TFA v DCM, potom sa uskutoční filtrácia a pôsobenie sa opakuje, načo sa uskutoční šesťnásobné premytie v DCM.

Neutralizácia sa uskutoční vyššie uvedeným postupom pre živicu BHA.

Kondenzácia s Boc-Leu-CHO zodpovedá operácii II:

(1) premytie DMF 2 x v:. -.-^Λ... ‘ J :!ί\- . %.v vktí.··. .«.4\ t /-«- -V

- 21 (2) prídavok 1.5 mmol Boc-Leu-CHO v DMF s obsahom 1 % ÄcOH (3) prídavok 2,0 mmol NaBHjCN v DMF a trepanie za čas 60 min (4) premytie 50% metanolom v H2O 2 x, 100% MeOH 2 x a CH2CI2 x

Po odštiepení skupiny Boe z Boc-Leu-psí-Leu-BHA a neutralizácii sa uskutoční kondenzácia s Boc-His(Z) podľa operácie I. Kondenzácia s Boc-Gly sa uskutoční podľa operácie

III.

20% 1,3-diizopropylkarbodiimid (1,5 mmol) v CH2CI2 sa pridá k DMF roztoku 1,5 mmol Bod-Gly a 1,65 mmol HOBt s teplotou 0°C, za chladenia sa mieša 15 min a potom 15 min pri teplote miestnosti, zrazenina sa odfiltruje a pridá k živici a trepe sa 60 min.

Potom sa spôsobom, uvedeným v operácii I, postupne naviažu nasledujúce aminokyselinové zvyšky Boc-Val, Boc-Äla a Boc-Trp pri vzniku 0,90 g chráneného polypeptidu, naviazaného na živici, štruktúry Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/1/Res).

Po zavedení Boc-Trp sa skupina Boe odštiepi 50% TFA v DCM s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu za vzniku TFA-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/2/Res) .

0,91 g TFA.Trp-Äla-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/2/Res) sa rozdelí na 8 dielov (po asi 100 mg), ktoré sa použijú k syntéze označených chránených polypeptidov, naviazaných na živicu, podľa postupov, uvedených v operácii I pre kondenzáciu s Boc-D-Trp, Boc-5F-D-Trp, Boc-D-Tpi a Boc-His(Z) a v operácii III pre Boc-Gln.

Postupným naviazaním Boc-Gln a Boc-Trp k uvedenému heptapeptidu na živici (2/2/Res) sa získa:

2/2/01 Boe-Trp-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA

Postupným naviazaním Boc-Gln a Boc-D-Trp k heptapeptidu (2/2/Res) sa získa:

2/2/02 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA

Naviazanie Boc-Gln a Boc-5F-D-Trp k heptapeptidu (2/2/Res) vedie k:

2/2/04 Boc-5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val -Gly-His<(Z) - Leu-psí-Leu-BHA 2/2/05 Boc-D-Tpi-Gin-Trp-A la-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA sa získa postupným naviazaním Boc-Gln a Boc-D-Tpl.

2/2/06 Boc-D-Tpi -G1 u (. OMe) -Trp-A la-Va 1 -Gly-Hi s CZ) -Leu-ps í-Leu-BHA sa získa postupným naviazaním Boc-Glu(OMe) a Boc-D-Tpi.

2./2./07 Boc-D-Tpi-Gis(Z)-Trp-Ala-Va 1 -Gly-Hi s CZ) - Leu-ps í-Leu-BHA sa získa postupným naviazaním Boc-HisCZ) a Boc-D-Tpi.

2/2/08 Boc-D-Tpi-His CBz)-Trp-Ala-Va1-Gly-His CZ)-Leu-ps í-Leu-BHÄ sa získa postupným naviazaním Boc-His(Bz) a Boc-D-Tpi.

Po odštiepení skupiny Boe 50 % TFA v DCM s obsahom 5 % merkaptoetanolu 5 % anizolu sa polypeptid naviazaný na živici premyje vždy trikrát DCM, metanolom a DCM a na 1 h sa podrobí pôsobeniu čerstvo predestilovanej HF (5 ml) a anizolu (0,25 ml) pri teplote 0°C. Vo vákuu sa odparí rozpúšťadlo, zvyšok sa premyje éterom alebo etylacetátom a potom sa extrahuje 70-80 % octovou kyselinou a lyofilizuje na surový

2/3/01 Trp-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 peptid č2 D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Leu~NH2

D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-A1a-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

D-Tpi-His-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2

D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2

Zmes 40 mg Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 (2/3/1) a 20 1 TEA v 0,5 ml DMF a 20 mg K0CN v 100 1 H₂0 sa mieša pri 0°C, potom sa do zmesi prikvapká 100 1 AcOH a 1 h sa mieša pri 0°C. Reakčná zmes sa podrobí čisteniu a získa sa^: preptid č.

NH2CO-Trp-Glη-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH₂

Peptid (3) sa pripraví postupným naviazaním Fmoc-Glu(OBut) a Fmoc-D-Trp metódou, uvedenou v operácii IV, na Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/2/Res) za vzniku Fmoc-D-Trp-G1uCOBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Leu-BHÄ (2/4/3). Na živicu s naviazaným peptidom sa 30 min pôsobí 10 % TFA v DCM s obsahom 5 % 2-merkaptoetanolu k odštiepeniu skupiny But z karboxylovej skupiny Glu. Po šesťnásobnom premytí DCM sa cez ložisko Fmoc-D-Trp-G1 u-Trp-Ala-Va1-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/5/Res) v 5 ml DMF za čas 5 min pri 0°C prebubláva MeNH2, pridá sa 0,325 ml 20% DIC v DCM a zmes sa nechá reagovať 2 h pri 0°C.

potom premyje DCM a skupina Fmoc sa odštiepi Peptid (3) D-Trp-G1 u(MeNH)-Trp-Ala-Va1-G1y-His-LeuZivica sa P i per i d i nom

-psí-Leu-NH2 (RC-3490) sa získa pôsobením HF.

Čistenie sa uskutočňuje pomocou HPLC s rozpúštadlovým systémom, tvoreným (a) 0,1 % TFA v 70 % acetónitrile. Čistené peptidy ukazujú pri analytickej HPLC čistotu cez 97 %. Retenčné doby polypeptidov v tomto príklade:

analytická HPLC grád ient retenčná doba peptid č. % B/min ... .... na kolóne

2	25-65	% B/40	11,84
4	25-65	%/40	14,85
5	25-65	%/40	14,32
6	25-65	%/40	19,21
7	30-70	%/40	9,11

Výsledky aminokyselinovej analýzy polypeptidov v tomto príklade sú podľa očakávania. Napríklad pomery aminokyselín v peptide (2) štruktúry

D-Trp-Gln-Trp-A 1a-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Leu-NH2 sú

1,11:2,09.0,90:1,03:0,95:0,92 (G1n - Trp:A1a-Va1Gly:His). Zvyšok

Leu-psí-Leu vykazuje absorbčnú piku s retenčnou dobou 39,95 min. Tpi v peptidoch (5), (6), (7) a (8) nebol detekovaný.

Príklad 3 peptid č.

NH₂CO-Trp-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Phe-NH2

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Phe-NH2

D-Trp-G1 u(MeNH)-Trp-Ala-Va1-Gly-H is-Leu-ps í-Phe-NH2

D-Tpi-G1u-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Phe-NH2

D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Phe-NH2

Polypeptidy v tomto príklade obsahujú rovnaký fragment

Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2- Živica Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psί-Phe-BHA (3/1/Res) sa vybuduje postupne na 0,5 g živice BHA (0,9 mmol NH2/g) v súlade so syntézou v pevnej fáze, popísanou v príslušnej časti príkladu 2, avšak prvá kondenzácia sa miesto s Boc-Leu uskutočňuje s Boc-Phe.

Živica s Čiastočným peptidom (3/1/Res) sa vždy v množstve asi 150 mg Boc-Trp-Äla-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA kondenzuje so zostávajúcimi dvoma zvyškami metódami, popísanými v operácii I pre kondenzáciu s Boc-Trp, Boc-D-Trp, Boc-D-Tpi a Boc-Glu(OMe) a v operácii III pre Boc-Gln, na konečný polypeptid, naviazaný na živici.

Postupným naviazaním Boc-Gln a Boc-Trp na uvedený heptapeptid na živici (3/1/Res) sa získa:

3/2/09 Boe-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA

Postupným naviazaním Boc-Gln a Boc-D-Trp na heptapeptid (3/1/Res) sä získa:

3/2/10 Boe-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(T)-Leu-psí-Phe-BHA

Naviazaním Boc-Gln a Boc-D-Tpi na heptapeptid (3/1/Res) sa získa:

3/2/12 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Phe-BHA

3/2/13 Boc-D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHÄ sa vybuduje kondenzáciou heptapeptidu (3/1/Res) s Boc-Glu(OMe) a Boc-D-Tpi.

Po odštiepení skupiny Boe pomocou 50 % TFA v DCM s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu sa polypeptid na živici premyje vždy trikrát DCM, metanolom a DCM a 1 h sa podrobuje pôsobeniu čerstvo predestilovanej HF (5 ml) a anizolu (0,25 ml) pri 0°C. Rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu a zvyšok sa premyje etylacetátom, extrahuje 70-80¾ octovou kyselinou a lyofilizuje. Získajú sa tak tieto peptidy:

3/3/09 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu~psí-Phe-NH2 peptid č.

D-Trp-Gln-Trp-Äla-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Phe-NH2

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Phe-NH2

D-Tp i-G1u(MeO)-Trp-Ala-Va1-Gly-H is-Leu-ps í-Phe-NH2

Peptid majúci na N-konci skupinu NH2CO sa pripraví týmto postupom:

Zmes 40 mg surového polypeptidu ¢3/3/9)

Trp-Gln-Trp-Äla-Va1-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2 a 20 1 TEA v 0,5 ml

DME a 20 mg KOCN v 100 1 H2O sa mieša pri 0°C, potom sa do zmesi prikvapká 100 1 AcOH a reakčná zmes sa 1 h mieša pri 0°C. Reakčná zmes obsahujúca požadovaný peptid (9) NffeCO-Trp-Gln-Trp-Äla-Vaľ -Gly-His-Leu-psí-Phe-Nífe sa podrobí čisteniu pomocou HPLC.

Peptid (11) sa pripraví postupnou kondenzáciou s dvoma Emoc-aminokyselinami metódou uvedenou pre syntézu v pevnej fáze v operácii IV.

150 mg (3/1/Res) sa kondenzuje

TFA.TRP-Ala-VaľGly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHÄ živice neutralizuje 10¾ TEA, premyje CH2CI2 a DME a s Fmoc-Glu(OBut) za vzniku

Fmoc-Glu(0But)-Trp-A la-Va 1-Gly-H is (Z )-Leu-psí-Phe-BHÄ (3/5/11).

Fmoc-D-Trp-Glu(0But)-Trp-A la-Va 1-Gly-H is (Z)-Leu-psí-Phe-BHÄ sa získa po odštiepení chrániacej skupiny 50 ¾ piperidinom a kondenzáciou s Fmoc-D-Trp. Skupina But sa od Fmoc-chráneného peptidu odštiepi pôsobením 10 ¾ TFA v DCM s obsahom 2 ¾ merkaptoetanolu za čas 30 min. Ložiskom 200 mg Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-VaľGly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA (3/6/11) v 5 ml DMF sa pri 0°C za čas 5 min prebubláva MeNH2 , pridá sa 0,2 ml 20 ¾ DIC v DCM a zmes sa mieša 2 h pri 0°C. Potom sa živica premyje DCM a skupina Fmoc sa odštiepi piperidinom. Po pôsobení HF a anizolu sa peptid (11) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-VaľGly-His-Leu-psí-Phe-NH2 sa podrobí čisteniu HPLC.

Retenčné doby peptidov v tomto príklade:

analytická HPLC

peptid č.	gradient ¾ B /m i n	retenčná doba . na kolóne D
9	25-65	16,38
10	25-65	14,62
12	25-65	14,72
13	25-65	19,20

Pomery aminokyselín sa pri aminokyselinovej analýze prejavili podľa očakávania. Napríklad pomery v peptide (10) D-Trp-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH₂ sú 1,15:0,96=0,95:1,01: :0,94=1,97 (G1u=Gly=Ala=Val=His.Trp) a tento peptid má piku s retenčnou dobou 44,56 min. Pomery v peptide (13) sú 1,04=0,98= :1,02:1,00=1,03:0,94 (Glu=Giy=Ala=Val=His=Trp) a tento peptid má absorbčnú piku Leu-psí-Phe s retenčnou dobou 44,56, Tpi v peptide (13) nebol detekovaný.

Príklad 4 peptid č.

Hca-Gln-Trp-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

D-pGlu-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-BH2

-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH₂

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hls-Leu-psí-Tpi-NH₂

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂

D-Trp-His(Bz)-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂

D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

Tpi-G1η-Trp-A la-Bal-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH?

Äc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi~NH₂

NH2CO-TPÍ-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH?

Hna-Tpi-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

Živica Leu-psí-Tpi-BHA sa pripraví reakciou živice Boc-Leu-psí-Trp-BHA s formaldehydom týmto postupom:

Boc-Leu-psí-Trp-BHA sa získa z 1,0 g živice BHA (0,9 mmol NH₂/g) postupnou kondenzáciou s Boc-Trp a Boc-Leu-CHO spôsobom, uvedeným v operácii I a operácii II. K získanej živici s naviazaným peptidom sa pridá 10 ml DMF s obsahom 1 % octovej kyseliny, potom sa uskutoční reakcia za čas 60 min s 1 ml 10 % formaldehydu pri teplote miestnosti a premytí DMF, MeOH a DCM.

Všetky polypeptidy v tomto príklade obsahujú spoločný fragment Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH₂- Živica Boc-Trp-Ala-Va1-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/1/Res) sa vybuduje na živici Leu-psí-Tpi-BHA postupnou kondenzáciou s Boc-His(Z) (operácia I), Boc-Gly (operácia III). Boc-Val. Boc-Ala a Boc-Trp (operácia I).

150 mg časť uvedeného medziproduktu sa podrobí dvom ďalším kondenzáciám postupom podľa operácie I k naviazaniu Hca, D-pGlu, Boc-Glu(OMe), Boc-Glu(OBz). Boc-D-Phe,

Boe-Tpi, Boc-D-Tpi, Ac-Tpi a Hna-Tpi naviazaniu Boc-Gln za vzniku konečných živici.

Postupnou kondenzáciou uvedeného (4/1/Res) s Boc-Gln a Hca sa získa

4/2/14 Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA

Boc-D-Trp. Boc-His(Bz). a podľa operácie III k peptidov naviazaných na heptapeptidu na živici

Postupným prídavkom Boc-Gln a D-pGlu k heptapeptidu (4/1/Res) sa získa

4/2/15 D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA

Postupnou kondenzáciou uvedeného medziproduktu (4/1/Res) s Boc-Glu(OBz) a Boc-Phe sa získa

4/2/16 Boc-Phe-Glu(OBz)-Trp-Ala-Va1-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA

Kondenzáciou Boc-Gln a Boc-D-Phe s heptapeptidom na živici (4/1/Res) sa získa

4/2/17 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA

4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Äla-Va1-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou Boc-Gln a Boc-D-Trp s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

4/2/19 Boe-D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Va1-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou Boc-His(Bz) a Boc-D-Trp s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

4/2/21 Boe-D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou Boc-Glu(MeO) a Boc-Tpi s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

i

4/2/22 Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou BOc-Gln a Boc-Tpi s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

4/2/23 Ac-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou Boc-Gln a Ac-Tpi s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

4/2/25 Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou Boc-Gln a Hna-Tpi s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

4/2/26 Boc-D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA sa vybuduje kondenzáciou Boc-Gln a Boc-D-Tpi s heptapeptidom na živici (4/1/Res).

Po odštiepení skupiny Boe a pôsobení HF a anizolu ako v príkladoch 2 a 3 sa získajú tieto peptidy:

peptid č.

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

D-pGlu-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

D-Phe-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

D-Trp-Gln-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

D-Trp-Glu(0Me)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s-Leu-psí-Tpi-NH2

Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NH2

Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 mg Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 (4/3/16), 5 mg difenylfosforylazidu a 10 mg KHCO3 v 0,5 ml DMF sa 24 h mieša pri 0°C. Reakčná zmes sa podrobí čisteniu pomocou HPLC s použitím rozpúštadlového systému 40-70 % B/60 min a získa sa peptid (16)

I-1

-Phe-G1 u-Trp-Ala-Val-Gly-H i s-Leu-ps í-Tpi-NH2, atnAeta-idau ujíasX^oupiie azXjeup λ es gg e V7, ' ZT ’2 qaopiqdad λ rdj - (daj,: sig : aq<J = ΐθΛ: θΐ V · ^19 ; ηγο) 9O‘T ^:660^:^60^:00T =96‘0:66‘0:ťO‘T XJamod em (χχ) ^zHN-T^dI-J^sd-naq-STH-^ÄT9-í^eA-^eIV-^d'¹l-^uI9-^3ll<d-Q P^BI³U-^Id,eN aTuazoyz aueftejjeaó aCnqXqsod apetqjad oq.moq λ Aoprqdad ezXjeue baoui {asXqouimv

9Z‘9T	otyoz-οε	9Z
ζε'τζ	0ť-/S9-SZ	ZZ
^ε“6τ	0fr/G9-SZ	8T
ετ ‘ζτ	0ť/S9-SZ	ζτ
q auoio^ eu .....	uitii/g % - -	2 ptqdad
eqop euauaqaj	9ΐΐθτρειβ

33dH eqoTqXieue zapeyqjcid 0911109 λ Aopxqdad eqop euouagaj) ^HN-T^dL-Jsd-na9-siH-Xl9-ieA-eTV-dai-(HNSW)ni9-dj:i-a (0Z) pT9dad es eqsjz e ζ i m

S2‘0) nio[oziue e (tni g) jg jqosod 3_o0 ud q χ τοτλιζ eu pxgdad eu es mourpijadid ooiujj Auidmis juadaigspo oj -(sag/g/^) VH9 -Tdj,-rsd-na9-(Z)^sTH-4T9-T^cA-^eTtf-^dj:L-(HN^aW)ⁿI9-dJl-Q-ooiiij es eqsjz e “(ΤΤ/9/ε) naiAiz aid £ apeyqjjd λ mXuapaňn ‘inodngsod 31Q e ^zHN^aW ^s 9<2Aoj&eaj: eqoau eoiAiz es utih οε sea ez nyoueqaoqdejjjaiii-z % Z moqesqo s 143α λ vjí % oi mxuaqosod qng Xutdn>is juadayqspo °d ‘ ΛΙ apeiado ejpod tuoqosods (say/χ/χ-) VHa-T^dX-jsd-naq-CZ)STH-Zi9-Te/\-eiv-dj:i ποοϊλτζ s dai-a-oomj e (qngo)nig-oomj noioezuapuoq noudnqsod jAeidijd es (say/z/^g

VHa-T^dI-Jsd-naq-(Z)STH-4l9-I^GA-^GTV-^dJI-CinaO)UT9-^d-iI-a-oouj '31dH noaouod ruuaqsig jqoapod es

ZHN-T^dJL-Jsd-naq-STH-XT9-T^GA-^GIV-^d'iI-ui9-T^dl-03^zHN (VZ) ptqdad p tqdad(οβ τ t o) Xuertopezod eoncnqesqo sarnz euoqeag -3,-,0 TJd q χ esajui es sarnz e H0°tí I 00Ϊ e^dBAJiTJd isatiiz op es uiin qoxjj jojjaTu oj ‘3_o0 T*¹*¹ esaTuí es qZh ΐ 00X λ N30X OZ ^G JWtl P« S‘0 ^Λ U31 ΐ OZ ‘^ZHN-T^dl~jsd-naq-syq-^ÄT9-ieA-^GTtf-^dJI-UT9-Tdi 2Z npiqdadXrod oqaóojns βω ok sarnz •utu ac eqop euouaqag - (% g& <> Xqsio ac ujni 0W% G9-SZ laomaqsXs mXAOipeqsndzoj: s 39dH CajpiqXieue ejpog -βω Q‘v tse

- 6Z asi 4,5 mg. Podľa analytickej HPLC s rozpústadlovým systémom 25-65 %/40 min je čistý O 95 Retenčná doba je min.

Zmes 40 mg surového polypeptidu 22 Tpi-Glri-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 , 20 1 TEA v 0,5 ml DMF a 20 mg KOCN v 100

H2O sa mieša pri 0°C. Po niekoľkých min sa do zmesi prikvapká

100 1 AcOH a zmes sa mieša 1 h pri 0°C. Reakčná zmes obsahujúca požadovaný (o1 i go)pept i d peptid (24) NH2C0-Tpi-G1η-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 sa podrobí čisteniu pomocou HPLC.

Emoc-D-Trp-Gln(0But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Tpi-BHÄ (4/2/Res) sa pripraví postupnou kondenzáciou

Fmoc-Glu(OBut) a Fmoc-D-Trp s živicou Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/1/Res) spôsobom podľa operácie IV. Po odštiepení skupiny But pôsobením 10 % TEA v DCM s obsahom 2 %

2-merkaptoetanolu za čas 30 min sa živica nechá reagovať s MeNH2 a DIC postupom, uvedeným v príklade 3 pre živicu (3/6/11), a získa sa Fmoc-D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/3/Res). Po odštiepení skupiny Fmoc piperidinom sa na peptid na živici 1 h pri 0°C pôsobí HF (5 ml) a anizolom (0,25 ml) a získa sa peptid (20) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2

Retenčná doba peptidov v tomto príklade:

analytická HPLC gradient retenčná doba peptid č-- % B/min na kolóne D

17	25-65/40	17,13
18	25-65/40	19,34
22	25-65/40	21,32
26	30-70/40	16,76

Aminokyselinová analýza peptidov v tomto príklade poskytuje očakávané zloženie. Napríklad D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 (17) má pomery 1,04:0,99:0,96:1,00:0,94:0,99:1,06 (G1 u : Gly : A la:Val:Phe:His:Trp). Tpi v peptidoch č. 17, 24 a 26 sa v analýze aminokyselín neprejavuje.

Príklad 5 peptid č.

Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2

D-Tpi-G1n-Trp-Äla-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2

Mpp-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-TrpíFor)-NH2

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH₂

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp<For)-NH₂

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-ps í-TrpCFor)-NH2

Peptidy v tomto príklade obsahujú spoločný fragment Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2 alebo Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z) -Leu-psí-Trp(For)-NH2- Živica Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí -Trp(For)-BHA (5/1/Res) sa vybuduje na 0,1 g živice BHA (0,9 mmol NH2/g> postupnou kondenzáciou operáciami syntézy v pevnej fáze, popísanými v príklade 2, avšak pri prvej kondenzácii sa použije Boc-Trp(For) miesto Boc-Leu. Podiely uvedeného peptidu po 250 mg sa použijú k uskutočneniu syntézy týchto štyroch chránených peptidov, kde sa posledná kondenzácia uskutočňuje postupom podľa operácie I s Mpp, resp. Boc-D-Phe, resp. Boc-D-Trp, resp. Boc-D-Tpi^:

5/2/27 Mpp-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-H is(Z)-Leu-ps í-Trp(For)-BHA

5/2/28 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Trp(For)-BHA

5/2/29 Boe-D-Trp-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Trp(For)-BHA

5/2/30 Boc-D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Trp(For)BHA

Po odštiepení skupiny Boe 50 % TFÄ v DCM s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % anizolu sa polovica množstva každého z uvedených peptidov na živici podrobí na 1 h pri 0°C pôsobeniu HF (5 ml) a anizolu (0,25 ml) za vzniku týchto peptidov^: peptid č.

Mpp-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2

D-Phe-Gln-Trp-A la-Val -Gly-H is-Leu-ps í -Trp( For) -NH2

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2

D-Tpi-G1n-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-TrpCFor)-NH₂ Zostávajúca polovica množstva každého peptidu na živici sa na 1 h pri 0°C podrobí pôsobeniu HF s obsahom 5 % anizolu a 5 % dimerkaptoetanolu za vzniku týchto peptidov:

Μρρ-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-G1y-His-Leu-psí-Trp-NH2

D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Trp-NH2

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2

Tieto peptidy majú pri čistení HPLC tieto retenčné doby^: analytická HPLC grádient retenčná doba peptid č. R/min. na kolóne D

27	25-65	27,89
28	25-65	18,70
29	25-65	19,70
30	25-65	20,26
31	25-65	28,00
32	25-65	19, 10
33	25-65	19,01
34	25-65	17,70

Výsledky analýzy aminokyselín u týchto peptidov sú podľa očakávania. Napríklad peptid (28) má pomery aminokyselín 0,98:0.92:1,03:0,97:0,98:1,09 (Gly:A la:Va1:PheHis - Trp). Tpi v (30) a (34) sa neprejavuje.

Príklad 6 peptid č.

Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Tpi-OMe

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-OMe

ΝΗ₂ CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OMe

D-Tpi-Trp-Äla-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-NHMe

D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OH

D-Tpi-Trp-Ala-Va1-Va1-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-N₂H₂C0NH₂

Ako počiatočný materiál sa použije Boc-Trp-0CH₂-živica získaná týmto spôsobom: Zmes CICH₂-živica (1,0 g, 0,7 mmol Cl/g), Boc-Trp (2,0 mmol Trp) a KF (4 mmol) v 20 ml DMF sa 4 h mieša pri 70 až 80°C. Boc-Trp-0CH₂-živica sa potom premyje dvakrát MeOH, H₂0, MeOH, DMF a DCM. Boc-Leu-psí-Trp-0CH₂-živica sa získa kondenzáciou Boc-Leu-CHO s Trp-0CH₂-živicou podľa operácie II. Boc-Leu-psí-Tpi-0CH₂-živica sa získa reakciou

Boc-Leu-psí-Trp-0CH₂-živice s formaldehydom postupom, popísaným v príklade 4. Postupnou kondenzáciou s Boc-His(Z), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp a Boc-Gln vyššie popísanými operáciami syntézy v pevnej fáze sa získa 1,60 g Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-H is (Z)-Leu-psí-Tpi-0CH₂-živica (6/1/Res). Cast uvedeného medziproduktu sa použije k získaniu

Boc-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va 1 -Gly-His(Z)-Leu-ps í-Tpi-0CH₂-živica (6/2/35) kondenzáciou s Boc-Tpi. Ďalší podiel medziproduktu sa použije k získaniu Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-0CH₂-živice (6/2/36) kondenzáciou s Boc-D-Tpi.

Po odštiepení skupiny Boe pomocou 50% TEA v DEM s obsahom 5 % merkaptoetanolu a 5 % aniyolu sa uskutoční transesterifikácia týmto postupom: 0,5 g

Tpi-G1 n-Trp-Äla-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps í-Tpi-0CH₂-živica (6/3/35), metanol (15 ml), DMF (15 ml) a diizopropyletylamín (3 ml) sa zmiesia a zmes sa mieša 3 dni pri teplote miestnosti. Živica sa premyje DMF (3krát) a metanolom (3krát). Filtráty sa spoja a odparením vo vákuovej rotačnej odparke sa odstránia rozpúšťadlá. Po reakcii s HF a anizolom sa získa 123 mg surového peptidu

Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-H is-Leu-ps í-Tpi-OCH?

Peptid

D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-H is(Z)-Leu-ps í-Tpi-OCH3 sa získa rovnakým postupom s počiatočnou látkou (6/2/36).

Zmes Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3 (35) (45 mg), 20 1 TEA v 0,5 ml DMF a 50 mg KOCN v 100 1 H₂0 sa mieša íLdi.ifX’i -i %**»*.. Víi'v’X· pri 0°C, po niekoľkých min sa k zmesi pridá 50 1 AcOH a nechá sa reagovať 1 h pri 0°C. Zmes sa potom podrobí čisteniu a získa sa peptid.

NH2C0-Tpi-G1n-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3

Zmes D-Tpi-G1n-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3 (36) a roztoku metylamínu v metanole 1 = 2 hmotnostné (2 ml) sa 16 h mieša pri teplote miestnosti. Po odparení vo vákuovej rotačnej odparke sa zvyšok lyofilizuje a podrobí sa pôsobeniu HF a anizolu. Produktom je peptid , 38 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-His-Leu-psí-Tpí-NHClte ktorý sa podrobí čisteniu pomocou HPLC.

. Na ďalší podiel D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-OCH2-živica (6/2/35) sa pôsobí HF a anizolom za vzniku peptidu

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OH

Zmes peptidu 39 (40 mg), (Boc)₂0 (20 mg) a TEA (20 1) v 0,5 ml DMF sa 4 h mieša pri 0°C a lyofilizuje- Po premytí éterom sa zvyšok, HOBt (10 mg) a N2H3CONH2 (20 mg) nechá reagovať cez noc . pri 0°C s DCI (100 1 20¾ DCI v DCM, DMF sa odparí, zvyšok sa pemyje éterom a skupina Boe sa odštiepi 50¾ TFA s 5 ¾ í merkaptoetanolu a anizolu za vzniku surového peptidu

D-Tpi-Gin-Trp-Äla-Val-Gly-His-Leu-ps í-Tpi-N₂ H₂ CONH2

NÁHRADNÁ STRANA

Claims (17)

1. Polypeptid vzorca I

X-fti-R² A³ Ä⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸ -psí-A⁹ -Q (I) kde

Q je NH2 alebo OQ¹ , kde Q¹ je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo Cy-iofenylalky1,

X je vodík alebo jednoduchá väzba <*·-aminoskupiny A¹ k bočnej karboxylovej skupine A², ak je prítomná, alebo skupina vzorca RiCO-, kde R¹ je volené zo skupín zahrňujúcich a/ vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-iofenylalky1, b/ R² >NR³ kde R² je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-10fenylalky1,

R³ je vodík alebo Ci-ioalkyl, a c/ R⁴-0~, kde R⁴ je Ci-ioalkyl, fenyl alebo

C7-10 fénylalky1,

A¹ je zvyšok, zvolený zo skupiny zahrňujúcej Mpp, D-Phe, L- alebo D-Tpi, D-Trp alebo Trp, substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi skupiny zahrňujúcej halogén, NO2, NH2, OH, Ci-3alkyl a Ci-3alkoxy, kde halogénom je fluór, chlór a bróm,

A² je Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, HisCBz), His(Z) alebo skupina vzorca Asp(Y), Glul-] a GluCY), kde

Y je -OR⁵ alebo R⁶

-N<

R⁷

kde R⁵ je vodík R6 je vodík R⁷ je vodík

Ci-3alkyl alebo alebo Ci-3alkyl,

Ci-3alkyl alebo fenyl.

-NHCONH2, a [-1 je jednoduchá väzba, spojujúca postrannú karboxylovú

- 35 NÁHRADNÁ STRANA skupinu A², ak jednoduchá väzba.

A³ je Nal, substituovaný na skupiny je prítomná. s -aminoskupinou A¹. kde X je

Ci-₃alkoxy, A⁴ je A⁵ je A⁶ je A⁷ je A⁸ je A⁹ je a jeho soli

Pal, Tpi. Trp. MeTrp, TrpCFor) alebo Trp, benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi zahrňujúcej halogén, NO2 , NH2, OH, Ci-₃alkyl a kde halogénom je fluór, chlór a bróm, la, MeAla alebo Gin. al alebo MeVal. ly, Phe alebo D-Äla, is, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) alebo Pal,

A⁸ je redukovaný izoster Leu alebo Phe,

L- alebo DL-Tpi, a jeho soli s farmaceutický prijateľnými kyselinami.

2- Polypeptid vzorca I

X-A¹-A²-A³-A⁴-A⁵ A⁶-A⁷-A⁸-psí-A⁹-Q (!) kde

Q je NH2 alebo OQ¹ . kde Q¹ je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-10 fény la lky 1,

X je vodík alebo jednoduchá väzba ¢(. -aminoskupiny A¹ k bočnej karboxylovej skupine IJ, ak je prítomná, alebo skupina vzorca R¹CO-, kde R¹ je volené zo skupín zahrňujúcich a/ vodík, Ci-ioalkyl. fenyl alebo C7-iofenylalky1, b/ R² >NR³ kde R² je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-iofenylalky1,

R³ je vodík alebo Ci-ioalkyl, a c/ R⁴-0-, kde R⁴ je Ci-ioalkyl. fenyl alebo C7-10 fénylalkyl,

A¹ je L-. D- alebo DL-Tpi,

A² je Asn. Dpa. Gin. His. MeHis, His(Bz), His(Z) alebo skupina vzorca Asp(Y). Glui-1 a Glu(Y), kde Y je -OR⁵ alebo R⁶

1RADNÁ STRANA

-N<

R⁷ kde

R⁵ je vodík, Ci-3alkyl alebo fenyl.

R⁶ je vodík alebo Ci-3alkyl,

R⁷ je vodík. Ci-3alkyl alebo -NHCONH2.

a [-] je jednoduchá väzba, spojujúca bočnú karboxylovú ipinu ň², ak je prítomná. s »\-aminoskupinou A¹, kde X je Inoduchá väzba,

A³ je Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) alebo Trp, jstituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi ipiny zahrňujúcej halogén, NO2. NH2. OH, Ci-3alkyl a -3aflkoxy. kde halogénom je fluór, chlór a bróm,

A⁴ je Ala, MeAla alebo Gin,

A⁵ je Val alebo MeVal,

A⁶ je Gly, Phe alebo D-Ala,

A⁷ je His, MeHis, HisCBz), His(Z), Lys(Z) alebo Pal,

A⁸ je redukovaný izoster Leu alebo Phe,

A⁹ je zvyšok aminokyseliny, zvolenej zo skupiny zahrňujúcej ‘Phe, Trp alebo Trp(For), eho soli s farmaceutický prijateľnými kyselinami.

3. Polypeptid podľa nároku 2 vzorca D-Tpi-G1η-Trp-Ala-Va 1 y-His-Leu-psí-Leu-NH24. Polypeptid podľa nároku 2 vzorca D-Tpi-G1n-Trp.Ala-Va1 y-His-Leu-psí-Phe-NH25. Polypeptid podľa nároku 2 vzorca D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Va1 y-His-Leu-psí-Trp-NH26. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Valy-His-Leu-psί-Tpi-NH27. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val z-His-Leu-psí-Tpi-NH2NÁHRADNÁ STRANA

8. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-Trp-Gln-Trp-Ala-Vaľ -Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2.

9. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca Tpi-Gln-Trp-Ala-Vaľ -Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH210. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca zvoleného zo skupiny zahrňujúcej NH2C0-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 a ACY-Tpi-Gln-Trp-Ala-VaľGly-His-Leu-psí-Tpi-NH2. kde ACY je acetyl, oktanoyl alebo 3-hydroxy-2-naftoy1.

•

11. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val« -Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2·

12. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-Trp-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NIfe

13. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-Trp-Glu(MeNH)~Trp-Ala-VaľGly-His-Leu-psí-Tpi-Nlfe b

14. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala* -Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH215. Polypeptid podľa nároku 1 vzorca Phe-Glu-Trp-Ala-Vaľ -Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH216- Farmacceuticky prijateľná adičná sol polypeptidy podľa nároku 1.

17. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polypeptid podľa nároku 1 alebo jeho farmaceutický prijateľnú adičnú sol alebo jeho komplex a farmaceutický prijateľný kvapalný alebo pevný nosič.

18. Použitie polypeptidu podľa nároku terapeuticky prijateľné sól i k liečbe rakoviny.

1 alebo jeho

NÁHRADNÁ STRANA

19. Polypeptid podľa nároku 2 kde A⁸ je redukovaný isoster Leu a

A⁹ je zvyšok D-. L- alebo DL-aminokyseliny Trp, TrpCFor) alebo Trp. substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi skupiny zahrňujúcej halogén. NO2 . NH2 . OH. Ci-3alkoxy. kde halogénom je fluór, chlór a bróm.

Ci-3alkyl a

20. Polypeptid podľa nároku 1. kde A¹ a Ä⁹ je D-, L- alebo DL-Tpi.

21. Spôsob výroby polypeptidov vzorca I

X-A¹-A²-A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-Ä⁸-ps í-A⁹-Q

Cl) kde

Q je NH2 alebo 0Q¹. kde Q¹ je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-10 fenylalky1.

X je vodík alebo jednoduchá väzba -aminoskupiny A¹ k bočnej karboxylovej skupine IJ, ak je prítomná. alebo skupiny vzorca R¹CO-. kde R¹ je volené zo skupín zahrňujúcich a/ vodík. Ci-ioalkyl. fenyl alebo C7-10fenyla 1ky 1 , b/ R² >NR³ kde R² je vodík. Ci-ioalkyl. fenyl alebo

C7-iofenylalky1. R³ je vodík alebo C1-10 alkyl. a c/ R⁴-0-. kde R⁴ je Ci-ioalkyl. fenyl alebo

C7-10 fénylalky1.

A¹ je zvyšok, zvolený zo skupiny zahrňujúcej Mpp, D-Phe, Lalebo D-Tpi. D-Trp alebo Trp. substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi skupiny zahrňujúcej halogén, NO2. NH2 . OH. Ci-3alkyl a Ci-3alkoxy, kde halogénom je fluór, chlór a bróm.

A² je Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), HisCZ) alebo skupina vzorca Asp(Y). Glu[-1 a GluCY).

kde

Y je -OR⁵ alebo

NÁHRADNÁ STRANA

R⁶

-N< R⁷ kde R⁵ je vodík R⁶ je vodík R⁷ je vodík

a [-] je jednoduchá väzba, spojujúca bočnú karboxylovú skupinu A², ak je prítomná, s K-aminoskupinou A¹ X je jednoduchá väzba.

kde

A³ je Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) alebo Trp, substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi skupiny zahrňujúcej halogén, NO2. NH2, OH, Ci-3alkyl a Ci-3alkoxy, kde halogénom je fluór, chlór a bróm,

A⁴ je Äla, MeAla alebo Gin,

A⁵ je Val alebo MeVal,

Ä⁶ je Gly, Phe alebo D-Ala,

A⁷ je His, MeHis. His(Bz), His(Z), Lys(Z) alebo Pal.

A⁸ je redukovaný izoster Leu alebo Phe,

A⁹ je D-, L- alebo DL-Tpi. a ich soli s farmaceutický prijateľnými kyselinami, vyznačujúce sa tým, že sa uskutočňuje fragmentovou kondenzáciou zodpovedajúcich peptidických fragmentov, zvyčajnou v chémii peptidov, alebo postupnou syntézou, zvyčajnou v chémii peptidov, načo sa prípadne uskutoční acylácia získaných peptidov alebo ich premena na farmaceutický prijateľné soli.

22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že pri postupnej syntéze sa chráni aminoskupina v polohe «. a koncová karboxyskupina sa kovalentne naviaže k syntetickému nosiču, načo sa X -chrániaca skupina odštiepi, karboxyskupina nasledujúcej aminokyseliny sa redukuje na skupinu HC=O, ktorá sa potom naviaže na uvedenú nechránenú ¢(-aminoskupinu. načo sa odštiepi <X-amino-chrániaca skupina tejto druhej aminokyseliny a k jej nechránenej aminoskupine sa naviaže karboxyskupina nasledujúcej aminokyseliny, načo sa postupne naväzujú v príslušnej sekvencii

NÁHRADNÁ STRANA ostatné aminokyseliny syntetizovaného peptidu, pričom po naviazaní všetkých aminokyselín úplného peptidu podľa nároku 21 sa tento peptid odštiepi od nosiča a poprípade sa odštiepi, pokiaľ sú prítomné, ďalšie chrániace skupiny bočných funkčných skupín.

23. Spôsob výroby polypeptidov vzorca I

X-A¹-A²-A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-ps í-A⁹-Q < I ) kde

Q je NH2 alebo 0Q¹, kde Q¹ je vodík, Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7-1o f eny1a1ky1,

X je vodík alebo jednoduchá väzba <\-aminoskupiny A¹ k bočnej karboxylovej skupine A², ak je prítomná. alebo skupina vzorca R¹C0-, kde R¹ je volené zo skupín zahrňujúcich a/ vodík, Ci-ioalky1, fenyl alebo C7-iofenylalky1, b/ R² >NR³ kde R2 je vodík, Ci-ioalkyl. fenyl alebo C7-iofenylalkyl, R³ je vodík alebo C1-10 alkyl, a c/ R⁴-0-, kde R⁴ je Ci-ioalkyl, fenyl alebo C7 -1 o f eny 1 a 1 ky 1 ,

A¹ je L-, D- alebo DL-Tpi,

A² je Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) alebo skupina vzorca Äsp(Y), Glu[-1 a Glu(Y), kde

Y je -OR⁵ alebo R⁶

-N<

R⁷ kde

R⁵ je vodík, Ci-3alkyl alebo fenyl,

R⁶ je vodík alebo Ci-3alkyl.

NÁHRADNÁ STRANA - 41 R⁷ je vodík. Ci-3alkyl alebo -NHCONH2. a [-1 je jednoduchá väzba. spojujúca bočnú karboxylovú

skupinu A². ak je jednoduchá väzba. prítomná. s ¢4. - aminoskupinou A¹, kde X je A³ je Mal. Pal. Tpi. Trp. MeTrp. Trp(For) alebo Trp, substituovaný na benzénovom kruhu jedným alebo viac členmi

skupiny zahrňujúcej halogén, NO2. NH2. OH. Ci-3alkyl a Ci-3alkoxy. kde halogénom je fluór, chlór a bróm.

A⁴ je Äla, MeAla alebo Gin.

A⁵ je Val alebo MeVal.

_Ľ A⁶ je Gly, Phe alebo D-Ala, » A⁷ je His. MeHis. His(Bz). HisCZ). LysCZ) alebo Pal.

A⁸ je redukovaný izoster Leu alebo Phe.

A⁹ je zvyšok D-, L- alebo DL-aminokyse1iny, zvolenej zo skupiny zahrňujúcej Leu. Phe. Trp alebo Trp(For), a ich soli s farmaceutický prijateľnými kyselinami, vyznačujúci sa tým. že sa uskutočňuje fragmentovou kondenzáciou zodpovedajúcich peptidických fragmentov. zvyčajnou v chémii • peptidov. alebo postupnou syntézou. zvyčajnou v chémii peptidov, načo sa poprípade uskutoční acylácia získaných peptidov alebo ich

P premena na farmaceutický prijateľné soli.

24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým. že pri postupnej syntéze sa chráni aminoskupina v polohe a koncová karboxyskupina sa kovalentne naviaže k syntetickému nosiču, načo sa tŕ. -chrániaca skupina odštiepi. karboxyskupina nasledujúcej aminokyseliny sa redukuje na skupinu HC=O, ktorá sa potom naviaže na uvedenú nechránenú K-aminoskupinu. načo sa odštiepi K-amino-chrániaca skupina tejto druhej aminokyseliny a k jej nechránenej aminoskupine sa naviaže karboxyskupina nasledujúcej aminokyseliny, načo sa postupne naväzujú v príslušnej sekvencii ostatné aminokyseliny syntetizovaného peptidu. pričom po naviazaní všetkých aminokyselín úplného peptidu podľa nároku 23 sa tento peptid odštiepi od nosiča a poprípade sa odštiepia, pokiaľ sú prítomné, ďalšie chrániace skupiny bočných funkčných skupín.