SK5372001A3

SK5372001A3 - Serine protease inhibitor

Info

Publication number: SK5372001A3
Application number: SK537-2001A
Authority: SK
Inventors: Cornelis Marius Timmers; Johannes Bernardus Ma Rewinkel
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-19
Publication date: 2001-11-06
Also published as: PE20001283A1; CZ20011440A3; NO20011966D0; IL142398A0; TR200101120T2; US6903107B1; ZA200102970B; CN1348444A; NZ511067A; NO20011966L; AR020922A1; AU763667B2; HUP0103806A3; PL347948A1; EP1123280A1; TW575567B; ID29885A; WO2000024718A1; AU6341399A; CA2346990A1

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka inhibítorov serínovej proteázy, ktoré obsahujú éterom naviazanú arginínovú náhradu, farmaceutických zlúčenín, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny, ako aj použitia spomínaných proteázových inhibítorov na výrobu liekov.

Doterajší stav techniky

Serínové proteázy sú enzýmy, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri zrážaní krvi.

Odhliadnuc od trombínu a faktora Xa, inými príkladmi tejto skupiny proteáz sú faktory Vila, IXa, Xla, XIla, a proteín C.

Trombín je konečný enzým serínovej proteázy v kaskádovom zrážaní krvi.

Primárna funkcia trombínu je štiepenie fibrinogénu za účelom vytvárania fibrínových monomérov, ktoré sú zosietené a vytvárajú nerozpustný gél. Okrem toho, trombín reguluje svoju vlastnú produkciu aktiváciou faktorov V a VIII na začiatku kaskády.

Má tiež dôležitú úlohu na bunkovej úrovni, kde pôsobí na špecifické receptory za účelom spôsobenia agregácie krvných doštičiek, aktivácie endoteliálnych buniek a proliferácie fibroplastov. Teda trombín má centrálnu regulačnú úlohu pri homeostáze a tvorbe trombusu. Kým inhibítory trombínu môžu mať široký rozsah terapeutických aplikácií, stále existuje nepretržité úsilie nájsť nové inhibítory serínovej proteázy. Ťažkosťou v tejto snahe je nájsť zlúčeninu, v ktorej sú kombinované vlastnosti terapeutickej bezpečnosti, selektivity, účinku a syntetickej prístupnosti. Obzvlášť biodostupnosť orálnym spôsobom podávania môže byť problematická pre selektívne trombínové inhibítory.

Vo WO 97/16444 sú trombínové inhibítory opísané s modifikáciou tripeptidovej sekvencie fenylalanyl-prolyl-arginín, v ktorých je prítomná karboxylová skupina na aminokonci a arginín je nahradený bázickou (aminoiminometyl)fenylovou alebo bázickou (aminoiminometyl)pyridinylovou skupinou viazanou na prolylový analóg éterovou väzbou.

·· ····

-2• ·· · · · • · • · • · ······· • · · ·· ·

Cieľom vynálezu je poskytnúť nové chemicky prístupné inhibítory serínovej proteázy s priaznivým farmakologickým a toxikologickým profilom s dostatočným účinkom na terapeutické použitie.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú inhibítory serínovej proteázy, najmä inhibítor trombínu všeobecného vzorca I

v ktorom

J znamená H, R¹, R¹-O-C(O)-, R¹-C(O)-, R¹-SO2-, R³OOC-(CHR²)P-, (R^2a,R^2b)-NCO-(CHR²)P- alebo Het-CO-(CHR²)p-;

D znamená aminokyselinu vzorca -NH-CHR¹-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)qC(O)OR¹]C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)qC(O)N(R^2a,R^2b)]-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH₂)_qC(0)Het]-C(O)-, D-1Tiq, D-3-Tiq, D-Atc, Aic, D-1-Piq alebo D-3-Piq;

E znamená -NR²-CH₂- alebo fragment (CH₂), / \

-N -CHvoliteľne substituovaný (Ci-6)alkylom, (Ci-6)alkoxylom alebo benzyloxyskupinou;

R¹ je vybrané z (Ci-i₂)alkylu, (C₂.i₂)alkenylu, (C₂.i₂)alkinylu, (C₃-i₂)cykloalkylu a (C₃-i₂)cykloalkyl(Ci-6)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C₃.i₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, oxoskupinou, OH, CF₃ alebo halogénom a z (C₆-i4)arylu, (C7-i5)aralkylu, (Ce-i6)aralkenylu a (Ci4_₂o)(bisaryl)alkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C₃.i₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, OH, CF₃ alebo halogénom;

·· ····

-3R², R^2a a R^2b sú každý nezávisle vybraný z H, (Cvejalkylu, (C₂-₈)alkenylu, (C₂.₈)alkinylu, (C₃.₈)cykloalkylu a (C3-6)cykloalkyl(Ci-4)alkylénu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C3.6)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom a z (C6-i4)arylu a (C7-i5)aralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-₆)alkylom, (C₃.6)cykloalkylom, (Ci.₆)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom;

R³ je určený ako R² alebo znamená Het-ÍCveJalkyl;

R⁴ znamená H alebo (Ci-₃)alkyl;

X a Y znamenajú CH alebo N, s podmienkou, že neznamenajú súčasne N;

Het znamená 4-, 5- alebo 6-členný heterocyklus obsahujúci jeden alebo viac heteroatómov vybraných z O, N a S;

m je 1 alebo 2;

p je 1,2 alebo 3;

q je 1, 2 alebo 3;

t je 2, 3 alebo 4;

a ich prekurzory;

a ich farmaceutický prijateľné adičné soli a/alebo ich solváty.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu konkrétne zlepšiť biodostupnosť po orálnom podaní.

Do výhodného uskutočnenia vynálezu patria zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde

J znamená H, R¹, R¹-SO2-, R³OOC-(CHR²)P-, (R^2a,R^2b)-N-CO-(CHR²)p- alebo HetCO-(CHR²)P-, výhodne znamená (C₃.i2)cykloalkyl voliteľne substituovaný (Ci-6)alkoxylom; alebo

D znamená aminokyselinu vzorca -NH-CHR¹-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)qC(O)OR¹]C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)_qC(O)N(R^2a,R^2b)]-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH₂)_qC(O)Het]-C(O)-, výhodne znamená aminokyselinu vzorca -NH-CHR¹-C(O)- alebo L-aminokyselinu všeobecného vzorca -NR⁴-CH[(CH₂)₂C(O)N(R^2a,R^2b)]-C(O)-; alebo

E znamená -N(C₃-6)cykloalkyl-CH₂- alebo fragment (CH₂), / \

-N - CH• ·· ······ · • · · · · • · · · · • · · · · ··· ···· ·· · ·· ···· • · ·· ·

-4voliteľne substituovaný (Ci-6)alkylom, (Ci-6)alkoxylom alebo benzyloxyskupinou, výhodne je nesubstituovaný; alebo

R¹ je vybrané z (Ci-i₂)alkylu, (C₃.i₂)cykloalkylu a (C3.i₂)cykloalkyl(Ci-₆)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C3.₁₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom alebo oxoskupinou a z (C₆.i4)arylu, (C₇-i5)aralkylu a (Ci4-2o)(bisaryl)alkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C₃-i₂)cykloalkylom, (Ci-₆)alkoxylom, OH, CF₃ alebo halogénom, výhodne je vybraný z (C3-i2)cykloalkylu a (C₃-i2)cykloalkyl(Ci-6)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C₃.i₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, a z (C6-i4)arylu, (C7-i5)aralkylu a (Ci₄-2o)(bisaryl)alkylu, kde arylové-skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C₃-i2)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom alebo halogénom; alebo

R²znamená H; alebo

R^2a a R^2b sú každý nezávisle vybraný z H, (Ci.e)alkylu, (C3-8)cykloalkylu a (C₃-6)cykloalkyl(Ci-₄)alkylénu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C₃.₆)cykloalkylom alebo (Ci-6)alkoxylom, a z (Ce-i4)arylu a (CM5)aralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C₃-6)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom; alebo

R³ je vybraný z H, (Cvejalkylu, (C3-e)cykloalkylu a (C₃.₆)cykloalkyl(Ci-4)alkylénu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C₃.6)cykloalkylom alebo (Ci-6)alkoxylom, a z (Cz-isjaralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (C1-6)alkylom, (C₃.6)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom a z Het-(Ci-6)alkylu, výhodne je vybraná z (Ci-e)alkylu a (C₃.8)cykloalkylu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C₃-6)cykloalkylom alebo (Ci-6)alkoxylom, a z (C7-i5)aralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C₃.6)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom a z Het-(Ci-6)alkylu;

R⁴ znamená H alebo (Ci.₃)alkyl; alebo

X a Y znamenajú CH; alebo

Het znamená 4-, 5- alebo 6-členný heterocyklus obsahujúci jeden alebo viac heteroatómov vybraných z O, N a S; alebo m je 2; alebo p je 1; alebo q je 2; alebo ·· ·· ··· ··

• · ·· · t je 3 alebo 4, výhodne 4.

V ďalšom výhodnom uskutočnení je

D aminokyselina vzorca -NH-CHR¹-C(O)- alebo glutamyl [alebo ich (Ci-6)alkylester]; R¹ je vybrané z (C3-i₂)cykloalkylu a (C3-i2)cykloalkyl(Ci-6)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C₃-i2)cykloalkylom alebo (C₁-₆)alkoxylom, a z (C6-i4)arylu, (C₇.i₅)aralkylu a (Ci4-2o)(bisaryl)alkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C3-i2)cykloalkylom, (Ci.₆)alkoxylom alebo halogénom; a

R³ je vybrané z (Ci-e)alkylu a (C₃.₈)cykloalkylu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C3-6)cykloalkylom alebo (Ci-6)alkoxylom, a z (Cz-isjaralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci.₆)alkylom, (C3.₆)cykloalkylom, (Ci.₆)alkoxylom, CF3 alebo halogénom a z Het-(Ci.₆)alkylu.

Výhodné sú najmä zlúčeniny, kde J je -CH2COO(Ci-6)alkyl, (C3-e)cykloalkyl, -SO₂-10-kamfor, -CH₂CONH-fenyl alebo -CH₂CONH(C₃-8)cykloalkyl.

Ďalšie veľmi výhodné zlúčeniny sú tie, kde D je D-cyklohexylalaninyl, Dfenylalaninyl, D-difenylalaninyl alebo glutamyl [alebo ich (Ci-6)alkylesteryj.

Výhodné sú tiež zlúčeniny, kde E je fragment (CH₂)_t/ \

-N - CH kde t je 3 alebo 4.

V prihláške uvádzané termíny majú nasledujúce významy:

(Ci-i₂)älkyl, (Ci-e)alkyl, (Ci^)alkyl, (Ci-3>alkyl znamenajú rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu s 1 až 12, 1 až 8, 1 až 6 a 1 až 3 atómami uhlíka, napríklad metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sek-butyl, ferc-butyl, hexyl, oktyl a podobne.

(C₂.i₂)alkenyl a (C₂.e)alkenyl znamenajú rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkenylovú skupinu s 2 až 12 a 2 až 8 atómami uhlíka, napríklad etenyl, 2-butenyl a podobne.

• ·· ·· ···· ·· ···· ·· · · · · • · · · · · · • · · · · · · ······· ·· · ·· ·

-6(C₂.₁₂)alkinyl a (C₂.₈)alkinyl znamenajú rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkenylovú skupinu s 2 až 12 a 2 až 8 atómami uhlíka, napríklad etinyl, propinyl a podobne.

(Ci-6)alkoxy znamená alkoxyskupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkylový zvyšok má význam uvedený vyššie.

(C₃-i₂)cykloalkyl, (C₃.₈)cykloalkyl, (C₃-6)cykloalkyl znamená mono- alebo bicykloalkylovú skupinu s 3 až 12, 3 až 8 a 3 až 6 atómami uhlíka, napríklad cyklopropyl, cyklobutyl, cykiopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl, cyklooktyl a podobne.

(Ci-6)alkylén, (Ci.₄)alkylén znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylénovú skupinu s 1 až 6 a 1 až 4 atómami uhlíka, ako je napríklad -(CH₂)_a- (kde a znamená počet uhlíkových atómov), -CH(CH₃)- a -CH(CH₃)-CH₂-, a podobne.

(C^wjalkenylén znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkenylénovú skupinu s 2 až 10 atómami uhlíka a jednou alebo viacerými dvojitými väzbami, ako je napríklad -CH=CH-CH₂-, -(CH₂)₂-CH=CH-CH(CH₃)-, -CH=CH-CH=CH-CH₂- a podobne.

(C6-i₄)aryl, (C6-i2)aryl znamená aromatickú uhľovodíkovú skupinu so 6 až 14 alebo 6 až 12 atómami uhlíka, ako je napríklad fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, indenyl a podobne.

(C7-i5)aralkyl znamená aralkylovú skupinu so 7 až 15 atómami uhlíka, kde „alkyl znamená (Ci.₈)alkylénovú skupinu a arylovú skupina je (C₆-i₄)aryl, obidva definované vyššie.

(C₈--i₆)aralkenyl znamená aralkylovú skupinu s 8 až 16 atómami uhlíka, kde „alkenyl“ znamená (C2-io)alkenylénovú skupinu a arylová skupina znamená (C₈-i₄)aryl, obidva definované vyššie.

(Ci₄.₂o)(bisaryl)alkyl znamená (Ci.₃)alkylovú skupinu substituovanú na tom istom atóme uhlíka alebo na odlišných atómoch uhlíka dvoma nezávisle vybranými arylovými skupinami podľa definície termínu (C₈-i2)aryl· ako je napríklad bisfenylmetylová skupina.

Halogén znamená F, Cl, Br alebo I.

Tiq znamená kyselinu 1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-karboxylovú.

Atc znamená kyselinu 2-aminotetralín-2-karboxylovú.

Aic znamená kyselinu 2-aminoindán-2-karboxylovú.

-7·· ···· • · ·· · · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ···· ·· • · • · · · • · · • · · · • · ·

Piq znamená kyselinu perhydroizochinolylkarboxylovú.

Termín prekurzor znamená zlúčeninu, ktorá po podaní je metabolizovaná na jednu alebo viac aktívnych zlúčenín všeobecného vzorca I. Výhodnými prekurzormi sú napríklad /V-alkoxykarbonyl (výhodne /V-etoxykarbonyl) chránené deriváty zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Keďže má aminoskupina v aminoizochinolíne, aminochinazolíne alebo aminoftalazíne menšiu zásaditosť ako aminoskupiny v lyzíne a arginíne, je neočakávané, že novo nájdené zlúčeniny majú dostatočnú účinnosť pre serínové proteázové inhibítory.

Ako bolo spomenuté, medzi zlúčeniny podľa vynálezu patria inhibítory serínovej proteázy, ktoré sa týkajú kaskádového zrážania krvi, a obzvlášť inhibítory trombínu a/alebo faktoru Xa. Tieto zlúčeniny môžu byť použité v lekárskej a veterinárnej terapii, t.j. pri liečbe a prevencii ochorení spôsobených trombínom a spojených s trombínom. Tieto zahrnujú mnoho trombotických a protrombotických stavov, kde je aktivované kaskádové zrážanie. Takéto ochorenia a stavy sú alebo sa objavujú, napríklad s hlbokou žilovou trombózou, pľúcnym embolizmom, tromboflebitídou, arteriálnym uzavretím z tromózy alebo embolizmu, arteriálnym znovuuzavretím počas alebo po angioplastike alebo trombolýze, s restenózou, ktorá nasleduje po arteriálnom poranení alebo inváznej kardiologickej procedúre, pooperatívnou žilovou trombózou alebo embolizmom, akútnou alebo chronickou aterosklerózou, porážkou, infarktom myokardu, určitými typmi rakoviny a metastáz, určitými typmi neurodegeneratínych ochorení. Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť tiež použité ako in vitro antikoagulanty alebo ako antikoagulanty v mimotelovom krvnom obehu, ako sú tie, ktoré sú nevyhnutné pri dialýze a chirurgii.

Podľa predchádzajúceho hľadiska, tento vynález poskytuje použitie zlúčeniny podľa vynálezu na liečenie a/alebo prevenciu ochorení spôsobených trombínom alebo spojených s trombínom zvierat alebo človeka.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť podávané enterálne (napríklad orálne, rektálne, nazálne alebo topikálne) alebo parenterálne (napríklad prostredníctvom intramuskulárnych, subkutánnych, intravenóznych alebo intraperitoneálnych injekcií).

·· ····

-8·· • · · · • · · • · · · • · · ·· • · · · • · · • · · · • · ·

Presná dávka a režim podávania týchto zlúčenín a ich farmaceutických prostriedkov bude nutne závisieť od potrieb jednotlivca, ktorému sa zlúčenina podľa vynálezu podáva vo forme lieku a od stupňa ochorenia alebo potreby podľa posúdenia lekára. Vo všeobecnosti, parenterálne podávanie vyžaduje nižšie dávky ako iné spôsoby podávania, ktoré sú viac závislé na absorpcii. Denné dávky sú pre človeka výhodne 0,001 až 100 mg na kilogram telesnej hmotnosti, výhodnejšie 0,01 až 10 mg na kilogram telesnej hmotnosti.

Denná dávka môže byť podávaná v jednej alebo viacerých jednotkových dávkach vhodných napríklad na orálne, rektálne, sublinguálne alebo nazálne podanie alebo cez kožu (napríklad transdermálne náplasti, alebo vo forme krému).

Iný spôsob podania zlúčeniny podľa vynálezu je jej zavedenie do (dialýzneho) obehu inými prostriedkami, napríklad prostredníctvom vpichnutia postupne alebo naraz do systému proti prúdu dialýznej membrány simultánne so zavedením krvi do obehu. Okrem toho, kanáliky a/alebo ďalšie vybavenie mimotelového obehu môžu byť opatrené zlúčeninou podľa vynálezu, výhodne spôsobom potiahnutia, ale nie sú ním limitované. Alternatívne, zlúčenina podľa vynálezu môže byť adsorbovaná do materiálov častí vybavenia, napríklad do membrán použitých pre dialýzu.

Vynález zahrnuje aj farmaceutický prostriedok na inhibíciu straty agregátov krvných doštičiek, inhibíciu tvorby fibrínu, inhibíciu tvorby trombusu a inhibíciu tvorby embolu u cicavcov, ktorý obsahuje zlúčeninu podľa vynálezu s vhodnými pomocnými látkami. Tieto farmaceutické prostriedky môžu voliteľne zahrnovať antikoagulanty, antiplateletné činidlá a trombolytické činidlá. Farmaceutické prostriedky môžu byť pridané do krvi, krvných produktov alebo orgánov cicavcov za účelom spôsobenia žiadaných inhibícii. Vynález tiež zahrnuje farmaceutický prostriedok na prevenciu alebo liečenie nestabilnej angíny, neustupujúcej angíny, infarktu myokardu, prechodných ischemických záchvatov, atriálnej fibrilácie, trombotickej porážky, embolickej porážky, hlbokej žilovej trombózy, roztrúsenej intravaskulárnej koagulácie, a reoklúzie alebo restenózy rekanalizovaných ciev, u cicavca, ktorý obsahuje zlúčeninu podľa vynálezu vo farmaceutickom prostriedku. Tieto farmaceutické prostriedky môžu voliteľne zahrnovať antikoagulanty, antiplateletačné činidlá a trombolytické činidlá. Vynález tiež zahrnuje spôsob redukcie ·· ·· ···· • ·

-9trombogenecity povrchu u cicavca prostredníctvom naviazania na povrch, buď kovalentne alebo nekovalentne, zlúčeniny podľa vynálezu.

Vynález ďalej zahrnuje farmaceutický prostriedok, opísaný vyššie, v kombinácii s baliacimi materiálmi vhodnými pre uvedenú zlúčeninu, uvedený baliaci materiál zahrnuje návod na použitie zlúčeniny opísanej vyššie.

Na tvorbu prostriedkov na podanie, ako sú pilulky, tablety, čapíky, (mikro)kapsuly, púdre, emulzie, krémy, masti, implantáty, speje, injekčné prípravky vo forme roztoku alebo suspenzie môžu byť použité vhodné pomocné látky ako sú nosiče, plnivá, väzobné činidlá, lubrikanty, dispergovadlá, emulzifikátory, stabilizátory, povrchovo aktívne látky, antioxidanty, farbivá, ochranné látky a podobne, napríklad ako je opísané v štandardnom odkaze, Gennaro a ďalší, Remington's Pharmaceutical Sciences, (18-ta edícia, Mack Publishing Company, 1990, pozri najmä časť 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture). Vo všeobecnosti akákoľvek prijateľná pomocná látka, ktorá nezasahuje do funkcie aktívnych zlúčenín je vhodná a môže byť použitá.

Vhodné nosiče a plnivá, s ktorými môže byť účinná látka podľa vynálezu podávaná zahrnujú napríklad agar, alkohol, deriváty celulózy, tuky, polysacharidy, polyvinylpyrolidón, oxid kremičitý, sterilnú solänku a podobne.

Väzobné činidlá sú činidlá použité za účelom poskytnutia kohéznych vlastností farmaceutickému prostriedku, čo vyúsťuje do minimálnej straty farmaceutického prostriedku počas tvorby a zaobchádzania s ním. Väzobné činidlá sú napríklad celulóza, škroby, polyvinylpyrolidón a podobne.

Vhodný lubrikant, s ktorým môže byť aktívna látka podľa vynálezu podávaná je, napríklad stearan horečnatý.

Povrchovo aktívne látky sú činidlá uľahčujúce kontakt a migráciu zlúčenín v rôznych fyzických prostrediach ako je hydrofilné a hydrofóbne prostredie. Mnohé povrchovo aktívne látky sú známe v danej oblasti výroby farmaceutických prostriedkov ako je napríklad opísané v kapitole 19 Remington's Pharmaceutical Sciences (18. edícia Editor A.R. Genarro, Mack Publishing Comp; Easton, Pennsylvania). Povrchovo aktívne látky, ktoré môžu byť použité počas spôsobu prípravy farmaceutických prostriedkov sú, napríklad, polyetylénglykol (PEG) a podobne.

·· ····

- 10·· • · ·· • · · • · • · • · ·· ·

Zlúčeniny môžu byť tiež použité s implantácie schopnými farmaceutickými zariadeniami, ako sú tie, ktoré sú opísané v US patente 4,767,628, obsah ktorého je tu zahrnutý týmto odkazom. Potom zariadenie bude obsahovať dostatočné množstvá zlúčeniny, na pomalé uvoľnenie zlúčeniny (napríklad viac ako mesiac).

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu pripraviť zo zlúčenín všeobecného vzorca II alebo ich derivátov, kde aminoskupina na aromatickej skupine (arylaminoskupina) je chránená ako uretán, napríklad skupinou Alloc alebo ako amid, napríklad benzoylom, kde D, E, X, Y a m majú význam určený vyššie a Pg je Nchrániaca skupina (výhodne uretán, napríklad Boe).

Termín /V-chrániaca skupina, ako je použitý v tomto dokumente znamená skupinu bežne používanú v chémii peptidov na chránenie α-aminoskupín, ako je napríklad alyloxykarbonylová (Alloc) skupina, terc-butyloxykarbonylová (Boe) skupina, benzyloxykarbonylová (Z) skupina, 9-fluorenylmetyloxykarbonylová (Fmoc) skupina alebo ftaloylová (Phth) skupina. Odstránenie chrániacich skupín sa môže uskutočniť rôznymi spôsobmi, čo závisí na povahe týchto chrániacich skupín. Prehľad chrániacich skupín na aminoskupine a spôsoby ich odstránenia sú uvedené v publikácii The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, zv. 3 a v T. W. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydanie, 1991, John Wiley & Sons, Inc..

Odstránenie /V-chrániacej skupiny Pg a prípadná modifikácia (modifikácie) odstránenia ochranných skupín na aminoskupine za použitia spôsobov známych v danej oblasti techniky, napríklad ako je peptidová kopulácia, alkylácia alebo redukčná aminácia, poskytuje zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Zlúčeniny všeobecného vzorca II sa môžu pripraviť zo zlúčenín všeobecného vzorca III alebo z ich derivátov, kde arylaminoskupina je chránená ako uretán, napríklad skupinou Alloc alebo ako amid, napríklad benzoylom, kde E, X, Y, m a Pg ·· ···· ·· • · · • · · • · · · • · · ·· · • · • · · • · • · · • · ·· ·

-11 majú vyššie určený význam. Odstránenie /V-chrániacej skupiny Pg v zlúčeninách vzorca III a peptidová kopulácia so zlúčeninami vzorca Pg-D-OH, v ktorej D a Pg majú význam určený vyššie, poskytuje zlúčeniny všeobecného vzorca II.

nh₂ (III)

Alternatívne, môže byť zlúčenina všeobecného vzorca I pripravená priamo zo zlúčenín všeobecného vzorca III. Odstránenie /V-chrániacej skupiny Pg v zlúčenine všeobecného vzorca III a petidová kopulácia so zlúčeninami vzorca J-D-OH, v ktorých J a D majú význam uvedený vyššie a môžu voliteľne obsahovať ďalšie chrániace skupiny, poskytujú zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Zlúčeniny vzorcov I, II a III sú získateľné zo zlúčenín všeobecného vzorca IV, kde X a Y majú vyššie uvedený význam, alebo z ich derivátov, kde arylaminoskupina je chránená ako uretán, napríklad skupinou Alloc alebo ako amid, napríklad benzoylom, reakciou s alkoholmi vzorca J-D-E-(CH₂)_m-OH, Pg-D-E-(CH₂)m-OH alebo Pg-E-(CH₂)_m-OH, v ktorých D, E, J, m a Pg majú význam uvedený vyššie a voliteľne obsahujúcich chrániacu skupinu, za štandardných podmienok podľa Mitsunobu (tributyIfosfín, dialkylazodikarboxylát) (R. L. Elliot, H. Kopecka, D. E. Gunn, H. N. Lin a D. S. Garvey, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 2283 (1996); K. Wisniewski, A. S. Koldziejczyk a B. Falkiewicz, J. Pept. Sc., 4,1 (1998)).

(IV)

Alkoholy typu vzorca Pg-E-(CH₂)_m-OH, v ktorých E = -R³NCH₂- a m = 2 sa dajú získať konjugovanou adíciou zo zodpovedajúceho amínu R³NH₂ na etylakrylát, redukciou esterovej funkcie s hydridom hlinitolítnym a následným zavedením Nchrániacej skupiny Pg.

·· · ·· ···· ·· • · · · • · · • · · · • · · ···· ··

- 12Demetylácia metylarylesterov vzorca V na zodpovedajúce fenolické zlúčeniny vzorca IV môže byť uskutočnená reakciou s BBr3 [J. F. W. McOmie a D. E. West, Org. Synth., Collect. zv. V, 412 (1973)] alebo EtSNa [A. S. Kende a J. P. Rizzi, Tetrahedron Lett., 22,1779 (1981)].

Meo

nh₂ (V)

Výhodný východiskový materiál na výrobu zlúčenín všeobecného vzorca V sú zlúčeniny vzorca Vl, kde X a Y majú význam určený vyššie. Chlórová skupina zlúčenín všeobecného vzorca VI sa môže priamo transformovať na aminoskupinu predošlým zahriatím s amoniakom za zníženého tlaku. Alternatívne, chlórová skupina v zlúčeninách všeobecného vzorca VI sa môže konvertovať na fenoxyskupinu reakciou s fenolom za alkalických podmienok a následným pôsobením octanom amónnym za poskytnutia aminoskupiny v zlúčenine všeobecného vzorca V. Zlúčeniny všeobecného vzorca V sa môžu získať aj pôsobením na zlúčeniny všeobecného vzorca VI azidom sodným a následnou redukciou arylazidu s PPh3.

Zlúčeniny všeobecného vzorca VI, kde X a Y majú význam určený vyššie sa môžu získať zo zlúčenín všeobecného vzorca VII pôsobením fosforylchloridu. Zlúčeniny všeobecného vzorca VII sú opísané v literatúre; 7-metoxy-3/-/-chinazolín4-ón: Chapman a ďalší, J. Chem. Soc. 890 (1947), 6-metoxy-2H-ftalazín-1-ón: Consonni P. a A. Omodei-Sale, Farmaco, Ed. Sci. 76, 691 (1976) (Chem. Abstr. 85177191). Zlúčeniny všeobecného vzorca VI, kde X = CH a Y = CH (1-chlór-6metoxy-izochinolín) sa môžu pripraviť konverziou 6-metoxy-izochinolínu (Hendrickson, J. B.; Rodriguez, C.; J. Org. Chem. 1983, 48, 3344 až 3346) na Noxidovú soľ, napríklad s perkyselinou, ako je kyselina m-chlórperbenzoová, ·· ····

- 13následným pôsobením HCl a ďalej reakciou tejto N-oxidovej soli schloračným činidlom, napríklad fosforylchloridom (J. Robinson, J. Am. Chem. Soc., 69, 1941 (1939)).

Peptidová kopulácia, tak ako je uvedené v kroku spôsobu opísanom vyššie na prípravu zlúčenín podľa vynálezu, sa môže uskutočniť spôsobmi bežne známymi v danej-oblasti techniky pre kopuláciu alebo kondenzáciu peptidových fragmentov, ako je azidový spôsob, zmiešaný anhydridový spôsob, aktivovaný esterový spôsob alebo výhodne karboimidový spôsob, najmä pridaním katalytických a racemizáciu potláčajúcich zlúčenín ako je A/-hydroxysukcínimid a /V-hydroxy-benzotriazol. Výhodné spôsoby sú opísané v: The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, zv. 3, E. Gross a J. Meienhofer, eds. (Academic Press, New York, 1981), R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bannwarth a D. Gillessen, Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989) a L. A. Carpino, J. Am. Chem. Soc., 115, 4397 (1993).

Zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré môžu byť vo forme voľnej bázy, sa môžu izolovať z reakčnej zmesi vo forme farmaceutický prijateľných solí. Farmaceutický prijateľné soli sa môžu získať pôsobením na voľnú bázu všeobecného vzorca I organickou alebo anorganickou kyselinou, ako je napríklad kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová, fosforečná, octová, propiónová, glykolová, maleínová, malónová, metánsulfónová, fumarová, jantárová, vinná, citrónová, benzoová a askorbová.

Zlúčeniny podľa vynálezu majú jeden alebo viac chirálnych atómov uhlíka a preto môžu byť získané ako čisté enantioméry alebo ako zmes enantiomérov alebo ako zmesi obsahujúce diastereoméry. Spôsoby na získanie čistých enantiomérov sú známe v danej oblasti techniky, napríklad kryštalizácia solí, ktoré sú získané z opticky aktívnych kyselín a racemických zmesí alebo chromatografiou za použitia chirálneho stĺpca. Pre diastereoméry sa môžu použiť stĺpce priamej alebo reverznej fázy.

Vynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi.

• ·· ······ ·· ···· ·· · · · · • · · · · · ·

-14• · · · · · ······· ·· · ·· ·

Príklady uskutočnenia vynálezu

Použité sú nasledujúce skratky:

Alloc: alyloxykarbonyl Boe: ŕerc-butoxykarbonyl eluent: x-y% rozpúšťadlo A v rozpúšťadle B znamená, že bol použitý gradient elúcie x% (objem. %) rozpúšťadla A v rozpúšťadle B na y% (objem. %) rozpúšťadla A v rozpúšťadle B.

Príklad 1 (2S)-1-(/V-(-)-Kamforsulfonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Krok 1a

Hydrochlorid 6-metoxy-izochinolín-A/-oxidu

K miešanému roztoku 6-metoxy-izochinolínu [Hendrickson, J. B.; Rodriguez,

C.; J. Org. Chem. 1983, 48, 3344 až 3346; 79,8 g, 500 mmol] v 1,2 I dichlórmetánu sa po častiach pri teplote miestnosti pridalo 133 g m-chlórperbenzoovej kyseliny (čistota 75%). Miešanie pokračovalo 3 hodiny a následne sa pridal metanol (1 I). Objem zmesi sa zredukoval na 700 ml a potom sa pridalo 800 ml nasýteného roztoku chlorovodíka v dietyléteri. Z roztoku sa pridaním 1,5 I dietyléteru vyzrážali žlté kryštály, ktoré sa oddelili filtráciou, premyli studeným dietyléterom a vysušili vo vákuu: 85 g (80 %)' biela tuhá látka; t.t. 189 až 191 °C; (+)-FAB-MS: 176 (MH⁺-HCI).

Krok 1b

-Chlór-6-metoxy-izochinolín

Hydrochlorid 6-metoxy-izochinolín-/V-oxidu (1a, 85 g, 400 mmol) sa opatrne pridal po častiach k chloridu fosforečnému (550 ml) pri teplote 90 °C, potom sa zmes miešala 6 hodín pri 90 °C. Prebytok chloridu fosforečného sa odstránil vo vákuu. Zvyšná biela tuhá látka sa premyla vodou, prefiltrovala a vysušila vo vákuu. Výťažok: 68 g (88 %); biela tuhá látka; t.t. 72 až 74 °C; EI-MS: 193 (M⁺).

• ·· ·· ···· ·· ······ · · · · • · · · · · · • β I · · · · ··· ···· ·· · ·· ·

- 15Krok 1c

6-Metoxy-1 -fenoxy-izochinolín

K zmesi 1-chlór-6-metoxy-izochinolínu (1b, 16,8 g, 87 mmol) a fenolu (67 g) sa pridal práškový hydroxid draselný (8,4 g). Zmes sa zahrievala pod atmosférou dusíka na 140 °C počas 3 hodín, potom sa ochladila na teplotu miestnosti a následne sa zriedila 280 ml 3N roztoku hydroxidu sodného a 500 ml dichlórmetánu. Organická vrstva sa premyla 2N hydroxidom sodným, vodou a soľankou, sušila sa nad síranom horečnatým a koncentrovala sa za zníženého tlaku za vzniku 21,3 g (98 %) bielej tuhej látky. ESI-MS: 251,8 (M+H)⁺. Rf (silikagél; toluén/etanol, 8/2, objemový pomer): 0,75.

Krok 1d

-Amino-6-metoxy-izochinolín

Zmes 6-metoxy-1-fenoxy-izochinolínu (1c, 21,3 g, 85 mmol) a octanu amónneho (55 g) sa zahriala pod atmosférou dusíka na 150 °C a miešala sa cez noc. Zmes sa potom nechala ochladiť na teplotu miestnosti a potom sa za miešania pridal 3N roztok hydroxidu sodného (280 ml). Takto získaný roztok sa extrahoval s etylacetátom (2 x 300 ml) a spojené organické vrstvy sa extrahovali s 2N kyselinou chlorovodíkovou (100 ml), obsahujúcou soľanku. Následne sa pH vodnej vrstvy upravilo na 12 s 2N roztokom hydroxidu sodného. Extrakcia s etylacetátom (300 ml) potom poskytla organickú vrstvu, ktorá sa premyla soľankou (100 ml), sušila sa síranom horečnatým a koncentrovala za zníženého tlaku, za vzniku 11 g bielej tuhej látky (75 %). ESI-MS: 175,2 (M+H)⁺, 349,2 (M+2H)²⁺. Rf (silikagél; toluén/etanol, 8/2, objemový pomer): 0,17.

Krok 1e

1-Amino-6-hydroxy-izochinolín

Roztok bromidu boritého (18,2 ml, 370 mmol) v 20 ml dichlórmetánu sa po kvapkách pridal k miešanému roztoku 1-amino-6-metoxy-izochinolínu (1d, 11,0 g, mmol) v 150 ml dichlórmetánu pri 10 °C. Po miešaní 4 dni pri okolitej teplote sa reakčná zmes vyliala do ľadu a pH sa upravilo na 9 pridaním koncentrovaného vodného amoniaku. Zrazenina sa zozbierala filtráciou a sušila sa vo vákuu za

-16vzniku 8,9 g (88 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej tuhej látky s teplotou topenia 258 až 260 °C; EI-MS: 160 (M⁺). ¹H NMR (DMSO-de): δ 8,11 (d, 1H), 7,65 (d, 1 H), 6,99 (dd, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,80 - 6,63 (m, 4H), 5,2 (bs, 1H).

• ·· • · · • ·	·· ···· • e · • · ·	• t	•
• •	• •
• ·	• · e	•	•
·· ····	·· ·		··	•

Krok 1f (2S)-1-ŕerc-Butoxykarbonyl-2-(2-(1-amÍno-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín (2S)-1-ŕerc-Butoxykarbonyl-2-(2-hydroxyetyl)piperidín [Ikeda, M.; Kugo, Y.;

Sato, T.; J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1996, 15, 1819 až 1824; 860 mg, 3,75 mmol], pripravený z rozpusteného (2S)-2-(2-hydroxyetyl)piperidínu [Beyerman, H. C.; Recl. Tráv. Chim. Pays-Bas 1971, 90, 755 až 765], 1-amino-6-hydroxy-izochinolín (1e, 480 mg, 3,0 mmol) a tributylfosfín (1,5 ml, 6,0 mmol) sa rozpustili v tetrahydrofurán/A/./V-dimetylformamide (4:1, objemový pomer, 15 ml). Potom sa po kvapkách pridal roztok dietylazodikarboxylátu (0,95 ml, 6,0 mmol) v tetrahydrofuráne (5 ml). Po miešaní cez noc sa zmes zriedila dichlórmetánom (100 ml), premyla sa 2N hydroxidom sodným (2 x 50 ml), sušila síranom horečnatým) a koncentrovala za zníženého tlaku. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo chromatografiou na silikagéli (eluent: 2 až 10% metanol v dichlórmetáne) za vzniku 827 mg (60 %) bielej peny. ESI-MS: 372,2 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9/1, objemový pomer): 0,41. Tá istá reakcia sa uskutočnila s nerozpusteným 1-ŕercbutoxykarbonyl-2-(2-hydroxyetyl)piperidínom (v množstve 10 mmol, 63% výťažok).

Krok 1g (2S)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

K miešanému roztoku (2S)-1-ŕerc-butoxykarbonyl-2-(2-(1-amino-izochinolín6-oxy)etyl)piperidínu (1f, 371 mg, 1,0 mmol) v pyridín/dichlórmetáne (1:2, objemový pomer, 5 ml) sa pridal alylchlórformiát (117 μΙ, 1,1 mmol). Po 2 hodinách miešania, sa reakcia ukončila pridaním vody, zmes sa koncentrovala vo vákuu, znovu rozpustila v dichlórmetáne (50 ml) a premyla nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 25 ml). Sušenie nad síranom horečnatým a koncentrovanie za zníženého tlaku poskytlo 460 mg (100 %) bezfarebného oleja, ktorý sa rozpustil v kyseline trifluóroctovej/dichlórmetáne (1:1, objemový pomer, 10 ml) a miešal sa 2 hodiny. Potom sa reakčná zmes koncentrovala vo vákuu a podrobila sa chromato·· ·· ···· ··

- 17grafii na silikagéli (eluent: 2 až 12% metanol v dichlórmetáne), ktorá poskytla 285 mg (80 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej peny. ESI-MS: 356,4 (M+H)⁺,

281,4 (M+H-Alloc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9/1, objemový pomer): 0,62.

Krok 1h /V-(-)-Kamforsulfonyl-D-cyklohexylalanín (-)-Kamforsulfonylchlorid (3,0 g, 12 mmol) sa po kvapkách pridal k miešanej zmesi hydrochloridovej soli (HCl soli) D-cyklohexylalanínu (2,08 g, 10 mmol), 1,4dioxánu (20 ml) a nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Táto heterogénna zmes sa miešala cez noc a následne sa opatrne okyslila (pH = 3) s použitím 1N kyseliny chlorovodíkovej. Extrakcia tejto zmesi s dichlórmetánom (2 x 100 ml), následné sušenie nad síranom horečnatým a koncentrácia za zníženého tlaku poskytli 3,22 g (84 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej tuhej látky. ESIMS: 386,5 (M+H)⁺, 384,5 (M-H)‘. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9/1, objemový pomer): 0,32.

Krok 1i (2S)-1-(/V-(-)-Kamforsulfonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylaminoizochinolín-6-oxy)-etyl)piperidín

K miešanému roztoku (2S)-1-ŕerc-butoxykarbonyl-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidínu (1g, 285 mg, 0,80 mmol), /V-(-)-kamforsulfonyl-D-cyklohexylalanínu (1h, 308 mg, 0,80 mmol) a Λ/,/V-diizopropyl-etylaminu (348 μΙ, 2,0 mmol) v dichlórmetáne (5 ml) sa pridal 2-(1 /-/-benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3tetrametyluróniumtetrafluórborát (TBTU, 321 mg, 1,0 mmol). Po miešaní cez noc, sa reakčná zmes zriedila dichlórmetánom (50 ml), premyla sa nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou (25 ml), sušila sa nad síranom horečnatým a koncentrovala za zníženého tlaku. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo chromatografiou na silikagéli (eluent: 0 až 5% metanol v dichlórmetáne), za vzniku 480 mg (83 %) bielej tuhej látky. ESI-MS: 723,6 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 19/1, objemový pomer): 0,34.

• · • ····

-18·· ·· ···· • · • · • · · • ·

Β· ·

Krok 1j (2S)-1-(/V-(-)-Kamforsulfonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Pod nepretržitým prúdom suchého dusíka sa k roztoku (2S)-1-(/V-(-)-kamforsulfonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)-etyl)piperidínu (1i, 480 mg, 0,66 mmol) a morfolínu (0,26 ml, 3,0 mmol) v tetrahydrofuráne (5 ml) pridal tetrakís-(trifenylfosfín)paládium(0) (30 mg, 0,03 mmol). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny a následne sa koncentrovala vo vákuu. Zvyšný morfolín sa odstránil odparením s 1,4-dioxánom a zmes sa podrobila preparatívnej RP-HPLC (Delta Pak Ci₈, 100 Á, 15 pm): mobilná fáza: A = 0,5M NaH₂PO₄ + H₃PO₄ pH 2,1; B = H₂O; C = CH₃CN/H₂O (3:2, objemový pomer).

Gradient:

Čas (min)	% A	%B	%C
0	20	60	20
30	20	20	60
32	20	0	80
37	20	0	80
50	20	60	20

Po zozbieraní zodpovedajúcich frakcií, sa zmes odsotila za použitia 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následne sa lyofilizovala za vzniku 227 mg (54 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESI-MS: 639,6 (M+H)⁺, 637,6 (M-H)’, 673,4 (M+CI)’. Anál. HPLC (Supelcosil LC-18-DB 5 pm, 250*2,1 mm): mobilná fáza: A = 0,5M NaH₂PO₄ + H₃PO₄, pH 2,1; B = H₂O; C =

CH₃CN/H₂O (3:2, objemový pomer).
Gradient: Čas (min)	%A	%B	%C
0	20	60	20
30	20	0	80
40	0	0	100
50	0	0	100

Retenčný čas: 39,27 minút (96,0% čistota).

·· ····

-19Príklad 2 /V-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)-cyklohexylamín

Krok 2a

Etyl-A/-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklohexylamino-propanoát

K miešanému roztoku cyklohexylamínu (1,14 ml, 10 mmol) v etanol/tetrahydrofuráne (1:1, objemový pomer, 30 ml) sa pridal etylakrylát (1,09 ml, 10 mmol). Po miešaní cez noc sa postupne pridal pyridín a di-ŕerc-butyldikarbonát a zmes sa miešala ďalších 5 hodín. Koncentrácia reakčnej zmesi a následná purifikácia zvyšku pomocou chromatografie na silikagéli (eluent: etylacetát/heptín, 1:4, objemový pomer) poskytli 2,18 g (73 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej peny. ESIMS: 300,2 (M+H)⁺, 244,2 (M+H-C₄H₈)⁺, 200,2 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; etylacetáVheptán, 1:4, objemový pomer): 0,51.

Krok 2b /V-ŕerc-Butoxykarbonyl-3-cyklohexylamino-propanol

K miešanému roztoku etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklohexylamino-propanoátu (2a, 2,18 g, 7,3 mmol) v tetrahydrofuráne (20 ml) sa pridal hydrid hlinitolítny (1M roztok v tetrahydrofuráne, 10 ml). Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu a potom sa pomaly pridal etylacetát (5 ml). Potom sa pridala vodná kyselina citrónová (0,5M, 50 ml) a heterogénna zmes sa extrahovala s EÍ2O (2 x 100 ml). Organická vrstva sa premyla vodným hydrogenuhličitanom sodným (1N, 25 ml). Sušenie nad síranom horečnatým, koncentrácia za zníženého tlaku a purifikácia chromatografiou na silikagéli (eluenet: etylacetát/heptán, 3:7, objemový pomer) poskytli 1,50 g (80 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej peny. ESI-MS: 258,2 (M+H)⁺, 280,3 (Ma Na)⁺, 202,2 (M+H-C₄He)⁺, 158,2 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél, etylacetát/heptá, 1:4, objemový pomer): 0,31.

Krok 2c /V-ŕerc-Butoxykarbonyl-/V-(3-(1-aminoizochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamín

-20Táto zlúčenina sa pripravila z /V-terc-butoxykarbonyl-3-cyklohexylaminopropanolu (2b, 257 mg, 1,0 mmol) a 1-amino-6-hydroxy-izochinolínu (1e, 160 mg,

1,0 mmol) spôsobom podľa Mitsunobu opísaným v príklade 1f. Výťažok: 260 mg (65

%). ESI-MS: 400,1 (M+H)⁺, 344,1 (M+H-C₄H₈)⁺, 300,1 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél;

dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,28.

·· ····

Krok 2d /V-(3-(1-Alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamín

Táto zlúčenina sa pripravila pomocou Alloc-chránenia a následného odstránenia skupiny Boe z A/-ŕerc-butoxykarbonyl-/\/-(3-(1-aminoizochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamínu (2c, 260 mg, 0,65 mmol) spôsobom opísaným v príklade 1g. Výťažok: 177 mg (71 %). ESI-MS: 384,2 (M+H)⁺, 300,2 (M+H-Alloc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 17:3, objemový pomer): 0,47.

Krok 2e

Hydrochloríd benzylesteru D-cyklohexylalanínu

K miešanému roztoku /V-terc-butoxykarbonyl-D-cyklohexylalanínu (2,71 g, 10 mmol) v metanole (50 ml), obsahujúcom 1 ml vody, sa pridal uhličitan cézny (1,63 g, 5,0 mmol). Po miešaní 2 hodiny sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a znovu sa rozpustila v Λ/,/V-dimetylformamide (50 ml). Potom sa pridal benzylbromid (2,38 ml, 20 mmol) a reakčná zmes sa miešala cez noc. Zmes sa potom zriedila etylacetátom (200 ml), premyla sa vodným hydrogenuhličitanom sodným (1M, 2 x 50 ml), sušila sa nad síranom horečnatým a koncentrovala za zníženého tlaku. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo použitím chromatografie na silikagéli (eluent: 0 až 30% etylacetát v heptáne). Spojené frakcie sa koncentrovali vo vákuu a následne sa na ne pôsobilo 3M chlorovodíkom v 1,4-dioxáne (50 ml). Po miešaní cez noc sa reakčná zmes koncentrovala za zníženého tlaku, za vzniku 2,94 g (74 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej peny. ESI-MS: 262,4 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 19/1, objemový pomer): 0,41.

Krok 2f

Benzylester /V-terc-butoxykarbonyl-/V-propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanínu ·· ···· • · · ···· ·· • ····· · · · • · · · · · · ··· ···· ·· · ·*

-21 K miešanému roztoku hydrochlorid benzylesteru D-cyklohexylalanínu (2,94 g,

7,4 mmol) a Λ/,/V-diizopropyletylamínu (3,5 ml, 20 mmol) v acetonitrile (20 ml) sa pridal n-propylbrómacetát (1,05 ml, 8,1 mmol). Reakčná zmes sa nechala miešať 6 dní a potom sa skoncentrovala za zníženého tlaku. Zvyšok sa rozpustil v dichlórmetáne (100 ml) a premyl vodným hydrogenuhličitanom sodným (1M, 50 ml), sušil nad síranom horečnatým a koncentroval vo vákuu. Surový materiál sa rozpustil v dichlórmetáne (20 ml) a potom sa na roztok pôsobilo A/,A/-diizopropyletylamínom (3,5 ml, 20 mmol) a di-ŕerc-dikarbonátom (1,74 g, 8,0 mmol). Po miešaní 4 dni, sa reakčná zmes koncentrovala za zníženého tlaku a čistila sa chromatografiou na silikagéli (eluent: 0 až 50% etylacetát v heptáne), za vzniku 2,39 g (70 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bezfarebného oleja. ESI-MS: 461,5 (M+H)⁺, 407,5 (M+HC₄H₈)⁺, 361,5 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/heptán, 1/3, objemový pomer):

0,27.

Krok 2g /V-ŕerc-Butoxykarbonyl-W-propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanín

Na roztok benzylesteru /V-tere-butoxykarbonyl-/V-propoxykarbonylmetyl-Dcyklohexylalanínu (2f, 2,39 g, 5,2 mmol) v /V,/V-dimetylformamide (25 ml) sa pôsobilo paládiom na aktívnom uhlí (10% Pd, 250 mg). Týmto roztokom sa za zníženého tlaku nechal prebublávať plynný vodík počas 2 hodín. Potom sa reakčná zmes prefiltrovala cez Celit a filtrát sa odparil za zníženého tlaku za vzniku 1,90 g (98 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej tuhej láky. ESI-MS: 371,2 (M+H)⁺, 369,2 (M-H)', 315,2 (M+H-C₄H₈)⁺, 271,5 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9/1, objemový pomer): 0,42.

Krok 2h /V-(W-ŕerc-Butoxykarbonyl-/V-propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamín

Táto zlúčenina sa pripravila z A/-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6oxy)propyl)cyklohexylamínu (2d, 192 mg, 0,50 mmol) a /V-ŕerc-butoxykarbonyl-A/propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanínu (2g, 185 mg, 0,50 mmol) pomocou peptidovej kopulácie opísanej v príklade 1i. Výťažok: 221 mg (60 %). ESI-MS: 737,6 ·· ·· ···· • · • ·

-22(Μ+Η)⁺, 681,5 (M+H-C₄H8)⁺, 637,6 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol,

9:1, objemový pomer): 0,68.

Krok 2i /V-(A/^,-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z N-(/V-ŕerc-butoxykarbonyl-/\fpropoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/\/-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamínu (2h, 221 mg, 0,30 mmol) spôsobom opísaným v príklade 1i na odstránenie alyloxykarbonylovej skupiny. Potom sa surový produkt ošetril zmesou dichlórmetán/kyselina trifluóroctová (1:1, objemový pomer, 10 ml) a zmes sa miešala 2 hodiny, potom sa reakčná zmes koncentrovala vo vákuu. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo preparatívnou HPLC opísanou v príklade 1j. Odsolenie použitím 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná lyofilizácia poskytla 67 mg (41%) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESIMS: 553,6 (M+Hf, 587,9 (M+CI). Anál. HPLC retenčný čas (gradient podľa príkladu 1 j): 27,91 min (95,8% čistota).

Príklad 3 /V-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamín

Krok 3a

Etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklopentylamino-propanoát

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z etylakrylátu (1,09 ml, 10 mmol) a cyklopentylamínu (0,99 ml, 10 mmol) spôsobom podľa príkladu 2a. Výťažok: 2,28 g (80 %). ESI-MS: 286,2 (M+H)⁺, 230,2 (M+H-C₄H₈)⁺, 186,2 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/heptá, 1:4, objemový pomer): 0,45.

Krok 3b /V-terc-Butoxykarbonyl-3-cyklopentylamino-propanol ·· ·· ···· • · • ····

-23Táto zlúčenina sa pripravila z etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklopentylamino-propanoátu (3a, 2,28 g, 8,0 mmol) sa použitia spôsobu opísaného v príklade

2b. Výťažok: 1,34 g (69 %). ESI-MS: 244,2 (M+H)⁺, 266,3 (M+Na)⁺, 188,2 (M+HC₄H₈)⁺, 144,2 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/heptán, 1:4, objemový pomer):

0,30.

Krok 3c /V-íerc-Butoxykarbonyl-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-terc-butoxykarbonyl-3-cyklopentylaminopropanolu (3b, 243 mg, 1,0 mmol) a 1-amino-6-hydroxy-izochinolínu (1e, 160 mg, 1,0 mmol) spôsobom podľa Mitsunobu opísaným v príklade 1f. Výťažok: 262 mg (68 %). ESI-MS: 386,1 (M+H)⁺, 330,1 (M+H-C₄H₈)⁺. 286,1 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,25.

Krok 3d /V-(3-(1-Alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila Alloc-chránením a následným odstránením Boe skupiny z /V-ŕerc-butoxykarbonyl-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamínu (3c, 262 mg, 0,68 mmol) spôsobom podľa príkladu 1g. Výťažok: 171 mg (68 %). ESI-MS: 370,2 (M+H)⁺, 286,2 (M+H-Alloc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 17:3, objemový pomer): 0,44.

Krok 3e

A/-(/V-ŕerc-Butoxykarbonyl-/\/'-propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/\/-(3-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6oxy)propyl)cyklopentylamínu (3d, 185 mg, 0,50 mmol) a /V-íerc-butoxykarbonyl-A/propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanínu (2g, 185 mg, 0,50 mmol) pomocou peptidovej kopulácie opísanej v príklade 1i. Výťažok: 256 mg (71 %). ESI-MS: 723,6 (M+H)⁺, 667,5 (M+H-C₄H₈)⁺, 623,6 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,64.

-24• ·· ·· · · • · • · · • · ··· ···· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · ·· ·

Krok 3f /V-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-A/-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z Λ/-(Λ/^,-ŕerc-butoxykarbonyl-Λ/^,propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopentylamínu (3e, 256 mg, 0,35 mmol) spôsobom podľa príkladu 2i na odstránenie Alloc a Boe ochranných skupín. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo preparatívnou HPLC opísanou v príklade 1j. Odsolenie s použitím 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná lyofilizácia poskytli 113 mg (59 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESI-MS: 539,5 (M+H)⁺, 573,9 (M+Cl). Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1 j): 25,84 min (90,1% čistota).

Príklad 4 /V-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamín

Krok 4a

Etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklobutylamino-propanoát

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z etylakrylátu (1,09 ml, 10 mml) a cyklobutylamínu (0,85 ml, 10 mmol) spôsobom podľa príkladu 2a. Výťažok: 1,71 g (63 %). ESI-MS: 272,2 (M+H)⁺, 216,2 (M+H-C₄H₈)*, 172,2 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/heptán, 1:4, objemový pomer): 0,44

Krok 4b /V-ŕerc-Butoxykarbonyl-3-cyklobutylamino-propanol

Táto zlúčenina sa pripravila z etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklobutylaminopropanoátu (4a, 1,71 g, 6,3 mmol) za použitia spôsobu opísaného v príklade 2b. Výťažok: 0,94 g (65 %). ESI-MS: 230,2 (M+H)⁺, 252,3 (M+Na)⁺, 174,2 (M+H-C₄H₈)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/heptán, 1:4, objemový pomer): 0,37.

Krok 4c /V-ŕerc-Butoxykarbonyl-A/-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamín ·· ···· • ·· ·· · · • · • · • · ··· ····

-25Táto zlúčenina sa pripravila z /V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklobutylaminipropanolu (4b, 229 mg, 1,0 mmol) a 1-amino-6-hydroxy-izochinolínu (1e, 160 mg, 1,0 mmol) spôsobom podľa Mitsunobu opísaným v príklade 1f. Výťažok: 230 mg (62 %). ESI-MS: 372,1 (M+H)⁺, 316,1 (M+H-C₄H₈)⁺, 272,1 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,26.

Krok 4d /V-(3-(1-Alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila pomocou Alloc-chránenia a následne odstránením skupiny Boe v zlúčenine /V-ŕerc-butoxykarbonyl-/V-(3-(1amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamínu (4c, 230 mg, 0,62 mmol) podľa spôsobu opísaného v príklade 1g. Výťažok: 166 mg (75 %). ESI-MS: 356,2 (M+H)⁺, 286,2 (M+H-Alloc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 17:3, objemový pomer): 0,44.

Krok 4e /V-(A/'-ŕerc-Butoxykarbonyl-/\/'-propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6oxy)propyl)cyklobutylamínu (4d, 142 mg, 0,40 mmol) a A/-ŕerc-butoxykarbonyl-/\/propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanínu (2g, 148 mg, 0,40 mmol) pomocou peptidovej kopulácie opísanej v príklade 1i. Výťažok: 207 mg (73 %). ESI-MS: 709,5 (M+H)⁺, 653,5 (M+H-C₄He)⁺, 609,6 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,61.

Krok 4f

A/-(/\/^,-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-A/-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z /V-f/V-ŕerc-butoxykarbonyl-A/'propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklobutylamínu (4e, 207 mg, 0,29 mmol) spôsobom z príkladu 2i na odstránenie Alloc a Boe ochranných skupín, čistenie zvyšku sa uskutočnilo • · ····

-26·· • · • · • · · • · ·· «· ···· • · • · • · ·· · preparatívnou HPLC opísanou v príklade 1j. Odsolenie použitím 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná Iyofilizácia poskytli 36 mg (24 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESI-MS: 525,5 (M+H)⁺, 559,9 (M+CI). Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1j): 25,10 min (97,5% čistota).

Príklad 5 /V-(A/'-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-A/-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylamín

Krok 5a

Etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklopropylamino-propanoát

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z etylakrylátu (1,09 ml, 10 mmol) a cyklopropylamínu (0,69 ml, 10 mmol) podľa príkladu 2a. Výťažok: 2,06 g (80 %). ESI-MS: 258,2 (M+H)⁺, 202,2 (M+H-C₄H₈)⁺, 158,2 (M+H-Bocf. Rf (silikagél; etylacetát/heptán, 1:4, objemový pomer): 0,38.

Krok 5b /V-terc-Butoxykarbonyl-3-cyklopropylamino-propanol

Táto zlúčenina sa pripravila z etyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklopropylaminopropanoátu (5a, 2,06 g, 8,0 mmol) za použitia spôsobu opísaného v príklade 2b. Výťažok: 1,22 g (71 %). ESI-MS: 216,2 (M+H)⁺, 160,2 (M+H-C₄H₈)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/heptán, 1:4, objemový pomer): 0,21.

Krok 5c /V-ferc-Butoxykarbonyl-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylannín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-ŕerc-butoxykarbonyl-3-cyklopropylaminopropanolu (5b, 215 mg, 1,0 mmol) a 1-amino-6-hydroxy-izochinolínu (1e, 160 mg, 1,0 mmol) spôsobom podľa Mitsunobu opísanom v príklade 1f. Výťažok: 226 mg (63 %). ESI-MS: 358,1 (M+H)⁺, 302,1 (M+H-C₄H₈)⁺, 258,1 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,19.

• ·

-27·· ··· • ·· ·· · · · · • · · · • · · · · • · · · ······· ··

Krok 5d

A/-(3-(1-Alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila pomocou Alloc-chránenia a následného odstránenia Boe skupiny z N-terc-butoxykarbonyl-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylamínu (5c, 226 mg, 0,63 mmol) spôsobom podľa príkladu 1g. Výťažok: 148 mg (69 %). ESI-MS: 342,2 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 17:3, objemový pomer): 0,36.

Krok 5e

A/-(A/^,-ŕez'c-Butoxykarbonyl-/V-propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/\/-(3-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylamín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-(3-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6oxy)propyl)cyklopropylamínu (5d, 136 mg, 0,40 mmol) a /V-íerc-butoxykarbonyl-/Vpropoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanínu (2g, 148 mg, 0,40 mmol) pomocou peptidovej kopulácie spôsobom opísaným v príklade 1 i. Výťažok: 221 mg (78 %). ESI-MS: 695,3 (M+H)⁺, 639,5 (M+H-C₄H₈)⁺, 595,3 (M+H-Boc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,49.

Krok 5f /V-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/\/-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z /V-(/\/'-íerc-butoxykarbonyl-/Vpropoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-/V-(3-(1-alyloxykarbonylaminoizochinolín-6-oxy)propyl)cyklopropylamínu (5e, 221 mg, 0,31 mmol) spôsobom opísaným v príklade 2i na odstránenie Alloc a Boe ochranných skupín. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo preparatívnou HPLC opísanou v príklade 1j. Odsolenie za použitia 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná lyofilizácia poskytli 87 mg (55 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESI-MS: 511,3 (M+H)⁺, 545,9 (M+CI). Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1j): 24,02 min (96,0% čistota).

·· ·· ··· • · • ····

-28Príklad 6 (2S)-1-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6oxy)etyl)pyrolidín

Krok 6a (2S)-1-ŕerc-Butoxykarbonylmetyl-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)pyrolidín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-ŕerc-butoxykarbonyl-L-p-homoprolinolu [Leyendecker, F.; Jesser, F.; Laucher, D.; Tetraherdon Lett. 1983, 24, 3513 až 3516; 590 mg, 2,75 mmol] a 1-amino-6-hydroxy-izochinolínu (1e, 320 mg, 2,0 mmol) spôsobom podľa Mitsunobu opísaným v príklade 1f. Výťažok: 650 mg (91 %). ESI-MS: 358,0 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol), 9:1, objemový pomer): 0,37.

Krok 6b (2S)-2-(2-(1-Alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)pyrolidín

Táto zlúčenina sa pripravila z (2S)-1-ŕerc-butoxykarbonylmetyl-2-(2-(1-aminoizochinolín-6-oxy)etyl)pyrolidínu (6a, 650 mg, 1,8 mmol) využitím Alloc-chránenia a odstránenia Boe skupiny spôsobom opísaným v príklade 1g. Výťažok: 558 mg (90 %). ESI-MS: 342,2 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,22.

Krok 6c (2S)-1-(/V-Propoxykarbonylmetyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)pyrolidín

Nechal sa reagovať /\/-propoxykarbonylmetyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-D-cyklohexylalanín (2g, 925 mg, 2,5 mmol) a (2S)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín6-oxy)etyl)pyrolidín (6b, 558 mg, 1,63 mmol) za použitia peptidovej kopulácie opísanej v príklade 1i. Výťažok: 590 mg (52 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bezfarebného oleja. ESI-MS: 695,6 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,41.

-29·· ·· ·· • · • · • · φ · ·· φ· ···· ·· • · · • · • · ·

Β · ·· ·

Krok 6d (2S)-1-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6oxy)etyl)pyrolidín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila z (2S)-1-(/V-propoxykarbonylmetyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylaminoizochinolín-6-oxy)etyl)pyrolidínu (6c, 590 mg, 0,85 mmol) spôsobom opísaným v príklade 2i na odstránenie Alloc a Boe ochranných skupín. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo pomocou preparatívnej HPLC opísanej v príklade 1j. Odsolenie za použitia 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná lyofilizácia poskytla 107 mg (25 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESI-MS: 511,6 (M+H)⁺. Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1j): 42,96 min (96,4% čistota).

Príklad 7

1-(/V-Propoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Krok 7a

1-(/V-Propoxykarbonylmetyl-/V-ŕerc-butoxykarbonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

2-(2-(1-Alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín (1g, 330 mg, 0,75 mmol) a /V-propoxykarbonylmetyl-/\/-ŕerc-butoxykarbonyl-D-cyklohexylalanín (2g, 273 mg, 0,75 mmol) sa podrobili kondenzácii sa použitia petidovej kopulácie opísanej v príklade 1i, za vzniku 239 mg (45 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bezfarebného oleja. ESI-MS: 709,7 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,56.

Krok 7b

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila pomocou odstránenia Alloc skupiny a následného odstránenia Boe skupiny z 1-(/V-propoxykarbonylmetyl-/V-ŕercbutoxykarbonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6·· ····

-30·· • · • ···· ·· • · · • · • · ·· · oxy)etyl)piperidínu (7a, 239 mg, 0,34 mmol) podľa spôsobu opísaného v príklade 1 j. Čistenie zvyšku a uskutočnilo pomocou preparatívnej HPLC spôsobom opísaným v príklade 1j. Odsolenia použitím 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná lyofilizácia poskytli 87 mg (49 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny (2 diastereoméry) ako bielej nadýchanej tuhej látky. ESI-MS: 525,4 (M+H)⁺. Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1j): 25,88 min (32,4 %) a 27,52 min (66,6 %).

Príklad 8

1-(A/-Cyklooktyl-y-ŕerc-butyl-L-glutamyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)-etyl)piperidín

Krok 8a

Kyselina /V-cyklooktyl-y-ŕerc-butyl-L-glutámová

K miešanej suspenzii kyseliny y-ŕerc-butyl-L-glutámovej (4,06 g, 20,0 mmol) a cyklooktanónu (3,15 g, 25 mmol) v zmesi Λ/,/V-dimetylformamid/kyselina octová (99:1, objemový pomer, 50 ml) sa pridal nátriumtriacetoxybórhydrid (6,36 g, 30,0 mmol) po malých množstvách a zmes sa miešala cez noc. Po odparení rozpúšťadla, sa zvyšok rozpustil vo vode (50 ml). pH sa upravilo na 9 2N roztokom hydroxidu sodného, a zmes sa extrahovala dietyléterom (50 ml). Potom sa pH vodnej vrstvy opatrne nastavilo na 2,5 použitím 1N kyseliny chlorovodíkovej. Extrakcia s dichlórmetánom poskytla organickú vrstvu, ktorá sa sušila nad síranom horečnatým a koncentrovala za zníženého tlaku za vzniku 4,82 g (77 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej tuhej látky. ESI-MS: 314,2 (M+H)⁺, 336,2 (M+Na)⁺. Rf (silikagél: etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda 63:20:6:11, objemový pomer): 0,80.

Krok 8b

1-(/V-Cyklooktyl-y-ŕerc-butyl-L-glutamyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6oxy)-etyl)-piperidín

Kyselina /V-cyklooktyl-y-ŕerc-butyl-L-glutámová (8a, 344 mg, 1,1 mmol) a 2-(2(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín (1g, 391 mg, 1,1 mmol) sa reagovali použitím metodológie opísanej v príklade 1i, za vzniku 380 mg (58 %) ·· ····

-31 v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bezfarebného oleja. ESI-MS: 651,3 (M+H)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,23.

Krok 8c

1-(/V-Cyklooktyl-Y-ŕerc-butyl-L-glutamyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)-etyl)piperidín

Táto zlúčenina sa pripravila z 1-(/V-cyklooktyl-y-ŕerc-butyl-L-glutamyl)-2-(2-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)-etyl)-piperidínu (8b, 380 mg, 0,58 mmol) odstránením skupiny Alloc a čistením podľa príkladu 1j. Výťažok: 81 mg (25 %, 2 diastereoméry na C-2 piperidínu). ESI-MS: 567,4 (M+H)⁺. Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1j): 26,20 min (47,2% čistota) a 27,07 min (52,0% čistota).

Príklad 9

1-(/V-Cyklopentylaminokarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-aminoizochinolín-6-oxy)-etyl)-piperidín

Krok 9a /V-Alyloxykarbonyl-/V-ŕerc-butoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanín

K miešanému roztoku /V-terc-butoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalanínu [Hamada, Y., Shibata, M., Suguira, T., Kato, S., Shioiri, T., J. Org. Chem. 1987, 52, 1252 až 1255; 2,85 g, 10 mml] sa následne pridal nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného (25 ml) a alylchlórformiátu (1,17 ml, 11 mmol). Po miešaní 3 dni, sa reakčná zmes opatrne okyslila (pH = 3) za použitia 1N kyseliny chlorovodíkovej a následne sa extrahovala dichlórmetánom. Zmes sa sušila nad síranom horečnatým a koncentrovala sa za zníženého tlaku za vzniku požadovanej zlúčeniny ako tuhej bielej látky (2,41 g, 65 %). ESI-MS: 370,4 (M+H)⁺, 314,4 (M+HC4He)⁺, 230,3 (M+H-C₄Hb-AIIoc)⁺. Rf (silikagél, etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda, 63/20/10/7, objemový pomer): 0,69.

Krok 9b

1-(A/-Alyloxykarbonyl-/V-ŕerc-butoxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín ·· ·· ···· ·· ···· ·· · ··· • · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ·

-32K miešanému roztoku 2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidínu (1g, 676 mg, 1,9 mmol) a A/-alyloxykarbonyl-/\/-terc-butoxykarbonylmetylD-cyklohexylalanínu (9a, 709 mg, 1,9 mmol) v A/./V-dimetylformamide (15 ml) pri °C sa pridal 2-(1/-/-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborát (TBTU, 616 mg, 1,9 mmol). pH zmes sa upravilo na 8 A/,/\/-diizopropyletylamínom.

Po miešaní cez noc pri teplote miestnosti, sa reakčná zmes koncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa zriedil s etylacetátom (100 ml), premyl sa 5% (objem.) vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 50 ml) a soľankou (50 ml), sušil nad síranom horečnatým a koncentroval za zníženého tlaku. Čistenie zvyšku sa uskutočnilo chromatografiou na silikagéli (eluent: 33 až 50% etylacetát v heptáne), poskytlo 825 mg (57 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej peny. ESI-MS:

707,4 (M+H)⁺. Rf (silikagél; etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda, 232/31/18/7, objemový pomer): 0,91.

Krok 9c

1-(A/-Alyloxykarbonyl-/V-karboxymetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Roztok 1-(/V-alyloxykarbonyl-/V-ŕerc-butoxykarbonylmetyl-D-cyklohexyl-alaninyl)-2-(2-(1-alyl-oxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidínu (9b, 825 mg, 1,3 mmol) v zmesi kyseliny trifluóroctovej/dichlórmetánu (2/3, objemový pomer) sa miešal 5 hodín pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa koncentrovala vo vákuu za vzniku 0,76 g (100 %) hnedastej tuhej látky. ESI-MS: 651,4 (M+H)⁺, 649,4 (M-H)⁺, Rf (silikagél; etylacetát/pyridín/kyselina octová/voda, 232/31/18/7, objemový pomer): 0,31.

Krok 9d

1-(/V-Alyloxykarbonyl-/\/-cyklopentylaminokarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

1-(/V-Alyloxykarbonyl-/V-karboxymetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonyl-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín (9c, 189 mg, 0,29 mmol) a cyklopentylamín (40,3 μΙ, 0,41 mmol) reagovali použitím spôsobu opísaného v príklade ·· ····

-339b, za vzniku 187 mg (90 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny. ESI-MS: 718,4 (M+H)⁺,

716,4 (M-H)'. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 95/5, objemový pomer): 0,72.

Krok 9e

1-(/V-Cyklopentylaminokarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinoI í η-6-oxy )ety I)pi perid í n

Ochranná skupina Alloc v 1-(/V-alyloxykarbonyl-/V-cyklopentylanriinokarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)-piperidíne (9d, 187 mg, 0,26 mmol) sa odstránila použitím spôsobu opísaného v príklade 1j (10 mol % Pd, 10 ekv. morfolínu). Purifikácia zvyšku sa uskutočnila pomocou preparatívnej HPLC opísanej v príklade 1j. Odsolením za použitia 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následnou lyofilizáciou vzniklo 102 mg (66 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny (2 diastereoméry) ako žltá nadýchaná tuhá látka. ESI-MS: 550,4 (M+H)⁺, 272 (C₁₆H22N₃O)⁺, 251 (Cis^y^O)*, 548,4 (M-H)', 584 (N+CI)'. Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1j): 31,19 min (44,4 %) a 33,31 min (55,6 %)·

Príklad 10

1-(/V-Anilinokarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-aminoizochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Krok 10a

1-(/V-Alyloxykarbonyl-/V-anilinokarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Použitím spôsobu z príkladu 9b sa kuploval 1-(A/-alyloxykarbonyl-/V-hydroxykarbonylmetyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylaminoizochinolín-6-oxy)etyl)piperidín (9c, 189 mg, 0,29 mmol) a anilín (38 μΙ, 0,41 mmol). Výťažok: 206 mg (98 %). ESI-MS: 726,4 (M+H)⁺, Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 95/5, objemový pomer): 0,73.

·· ·· ····

-34Krok 10b

1-(/V-Anilinokarbonyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Ochranná skupina Alloc v 1-(/V-alyloxykarbonyl-/V-anilinokarbonylmetyl-Dcyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)-piperidíne (10a, 206 mg, 0,28 mmol) sa odstránila použitím spôsobu opísaného v príklade 1j (10 mol % Pd, 10 ekv. morfolínu). Purifikácia zvyšku sa uskutočnila pomocou preparatívnej HPLC opísanej v príklade 1j. Odsolením za použitia 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následnou lyofilizáciou vzniklo 80 mg (51 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny (2 diastereoméry) ako žltá nadýchaná tuhá látka. ESI-MS: 558,0 (M+H)⁺,

580,1 (M+Na)⁺, 272,2 (Ci6H22N3O)⁺, 259,3 (Ci6H₂3N₂O)⁺, 556,0 (M-H)', 592,3 (N+CI)'. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 95/5, objemový pomer): 0,32. Anál. HPLC retenčný čas (gradient z príkladu 1 j): 32,76 min (43,5 %) a 34,52 min (56,5 %)

Príklad 11

1-(/V-Cyklohexyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín

Krok 11a /V-Cyklohexyl-D-cyklohexylalanin

K miešanej suspenzii HCI soli D-cyklohexylalanínu (2,08 g, 10 mmol) v N,Ndimetylformamide (10 ml) obsahujúcom 0,1 ml kyseliny octovej sa pridal cyklohexanón (1,55 ml, 15 mmol). Potom sa pridal triacetoxybórhydrid sodný (3,18 g, 15 mmol) a reakčná zmes sa miešala cez noc. Po 17 hodinách sa číry roztok koncentroval za zníženého tlaku a zvyšok sa suspendoval vode (15 ml). Po okyslení (1N kyselinou chlorovodíkovou) heterogénnej zmesi na pH = 3, sa pridal dichlórmetán (150 ml) a zmes sa miešala mechanicky 30 minút. Organická vrstva sa sušila nad síranom horečnatým a koncentrovala za zníženého tlaku za vzniku 1,57 g (63 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako bielej tuhej látky. ESI-MS: 254,2 (M+H)⁺,

252,1 (M-H)'. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 8/2, objemový pomer): 0,29.

·· ····

-35Krok 11 b

1-(/V-Cyklohexyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-alyloxykarbonylamino-izochinolín-6oxy)etyl)-piperidín

Táto zlúčenina sa pripravila z /V-cyklohexyl-D-cyklohexylalanínu (11a, 127 mg, 0,50 mmol) a 2-(2-(1 -alyloxykarbonylamino)-izochinolín-6-oxy)-etyl)piperidínu (1g, 178 mg, 0,50 mmol) pomocou peptidovej kopulácie opísanej v príklade 1i. Výťažok: 224 mg (76 %). ESI-MS: 591,4 (M+H)⁺, 589,4 (M-H)', 507,3 (M+H-Alloc)⁺. Rf (silikagél; dichlórmetán/metanol, 9:1, objemový pomer): 0,69/0,72 (2 diastereoméry na C-2 piperidínu).

Krok 11c

1-(/V-Cyklohexyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1-amino-izochinolín-6-oxy)etyl)piperidín Táto zlúčenina sa pripravila z 1-(/V-cyklohexyl-D-cyklohexylalaninyl)-2-(2-(1alyloxykarbonylamino-izochinolín-6-oxy)etyl)-piperidínu (11b, 224 mg, 0,38 mmol) podľa spôsobu opísaného v príklade 1j na odstránenie Alloc ochrannej skupiny.

Purifikácia zvyšku sa uskutočnila preparatívnou HPLC opísanou v príklade 1j. Odsolenie za použitia 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej a následná lyofilizácia poskytli 102 mg (53 %) v nadpise uvedenej zlúčeniny ako žltej nadýchanej tuhej látky (2 diasteroméry na C-2 piperidínu). ESI-MS: 507,3 (M+H)⁺, 623,4 (M+CI). Výťažok: 224 mg (76 %). ESI-MS: 507,3 (M+H)⁺. Anál. HPLC retenčný čas (gradient podľa príkladu 1j): 30,94 min (41,2 %); 32,20 min (53,4 %).

Príklad 12 /V-(/V-lzopropoxykarbonylmetyl-D-difenylalaninyl)-/V-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)propyl)cyklohexylamín /V-(/V-lzopropoxykarbonylmetyl-D-difenylalaninyl)-/\/-(3-(1-amino-izochinolín6-oxy)propyl)cyklohexylamín sa pripravil spôsobmi opísanými v predchádzajúcich príkladoch. Táto zlúčenina (1,11 g) bola s 1 ml dichlórmetánu a 9 ml kyseliny trifluóroctovej. Po miešaní 16 hodín pri teplote miestnosti sa reakčná zmes skoncentrovala, zmiešala s toluénom a znova koncentrovala. Na zvyšok sa pôsobilo zmesou ŕerc-butanolu a vody, zmes sa premyla éterom a koncenrovala. Pridanie ···· ···· ·· ···· • · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ·

-36etanolu k zvyšku, filtrácia a odstránenie etanolu zfiltrátu poskytlo 0,72 g N-(Whydroxykarbonylmetyl-D-difenylalaninyl)-/\/-(3-(1-amino-izochinolín-6-oxy)-propyl)cyklohexylamínu. K 0,34 g tejto zlúčeniny sa pridalo 10 ml 2-propanolu a 0,16 ml tionylchloridu. Po miešaní 18 hodín pri 60 °C sa reakčná zmes skoncentrovala. Zvyšok sa podrobil dvakrát stĺpcovej chromatografii (silikagél, prvý stĺpec: dichlórmetán/metanol, 9/1, objemový pomer; druhý stĺpec: toluén/etanol, 98/2 až 95/5, objemový pomer). Surový zvyšok sa trituroval s éterom za vzniku 45 mg v nadpise uvedenej zlúčeniny. ESI-MS: 595 (M+H)⁺, 629 (M-CI)'. Anál. HPLC (Supelcosil LC-18-DB 5 pm, 250 x 2,1 mm): mobilná fáza: A = 0,5M NaH₂PO₄ + H₃PO₄ pH 2,1; B = H₂O; C = CH₃CN/H₂O (3:2, objemový pomer).

Gradient: Čas (min)	%A	%B	%C
0	20	60	20
40	20	0	80

Retenčný čas: 34,9 min a 37,4 min.

Príklad 13

A/-(/V-Cyklopentylaminokarbonylmetyl-D-difenylalaninyl)-/V-(3-(1-amino-izochinolín6-oxy)propyl)cyklohexylamín

V nadpise uvedená zlúčenina sa pripravila spôsobmi opísanými v predchádzajúcich príkladoch z /V-(/\/'-hydroxykarbonylmetyl-D-difenylalaninyl)-/V-(3-(1aminoizochinolín-6-oxy)-propyl)cyklohexylamínu (380 mg). ESI-MS: 620 (M+H)⁺, 654 (M+CI)'. Anál. HPLC (gradient z príkladu 12) retenčný čas: 37,2 min.

Príklad 14a až 14f

Nasledujúce zlúčeniny sa pripravili spôsobmi opísanými v predchádzajúcich príkladoch:

o o

NHj

• ·· ·· ···· ······ · • · · · ·

-37• · · · · ··· ···· ·· · ·· ·

ο

Príklad-15

Biologické aktivity zlúčenín podľa vynálezu sa určili pomocou nasledujúcej testovacej metódy.

Anti-trombínový test

Trombín (Faktor lla) je faktor v kaskádovom zrážaní.

Anti-trombínová aktivita zlúčenín podľa vynálezu sa určila pomocou spektrofotomerického merania rýchlosti hydrolýzy chromogenického substrátu s-2238 použitím trombínu. Tento test na anti-trombínovú aktivitu v pufrovom systéme sa použil na určenie IC₅o hodnôt testovanej zlúčeniny.

Testované médium: Trometamín-NaCI-polyetylénglykol 6000 (TNP) pufor Referenčná zlúčenina: 12581 (Kabi)

Vehikulum: TNP pufor

Solubilizácia môže byť podporená dimetylsulfoxidom, metanolom, etanolom, acetonitrilom alebo terc-butylalkoholom, ktoré sú bez nepriaznivých účinkov v koncentrácii do 2,5 % v konečnej reakčnej zmesi.

Postup: Činidlá*

1. Trometamín-NaCI (TN) pufor

Zloženie pufru:

Trometamín (Tris) 6,057 g (50 mmol)

NaCl 5,844 g (100 mmol)

-38• ·· ·· ···· ·· ······ ···· • · · · · · • · · · · · ··· • · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ·

Voda do 1 I pH roztoku sa upravilo na 7,4 pri 37 °C s HCl (10 mmol.ľ¹).

2. TNP pufor

Polyetylénglykol 6000 sa rozpustil v TN pufri za účelom poskytnutia koncentrácie 3 g.ľ¹.

3. S-2238 roztok

Jedna ampulka S-2238 (25 mg; Kabi Diagnostica, Sweden) sa rozpustila v 20 ml TN pufri za účelom poskytnutia koncentrácie 1,25 mg.ml'¹(2 mmol.ľ¹).

4. Trombínový roztok

Ľudský trombín (16000 nKat.nádoba'¹; Centraal Laboratórium voor Bloedtransfusie, Amsterdam, The Netherlands) sa rozpustil v TNP pufri za účelom poskytnutia zásobného roztoku 835 nKat.mľ¹.

Bezprostredne pred použitím sa tento roztok zriedil s TNP pufrom za účelom poskytnutia koncentrácie 3,34 nKat.mľ¹.

* - Všetky použité zložky sú analytickej kvality - Pre vodné roztoky sa použila ultračistá voda (Milli-Q kvalita)

Príprava roztokov testovaných a referenčných zlúčenín

Testované a referenčné zlúčeniny sa rozpustili v Milli-Q vode za účelom poskytnutia zásobných koncentrácií 10'² mol.l¹. Každá koncentrácia sa postupne zriedila vehikulom za poskytnutia koncentrácií 10'³, 10'⁴ a 10'⁵ mol.l'¹. Riedenia, zahrnujúce zásobný roztok, sa použili v teste (konečné koncentrácie v reakčnej zmesi: 3.10'³; 10³; 3.10'⁴; 10'⁴; 3.10'⁵; 10'⁵; 3.10'⁶ a 10'⁶ mol.l'¹, jednotlivo).

Postup

Pri teplote miestnosti sa pipetou vložilo do jamiek mikrotitračnej platne 0,075 ml a 0,025 ml roztokov testovanej zlúčeniny, referenčnej zlúčeniny alebo vehikulá a tieto roztoky sa zriedili s 0,115 ml a 0,0165 ml TNP pufra, jednotlivo. Alikvót 0,030 ml S-2238 roztoku sa pridal do každej jamky a platňa sa predohriala a predinkubovala trasením v inkubátore (Amersham) počas 10 minút pri teplote 37 °C.

• ·· ·· · ·	·· • ·	···· •	·· • ·	•
• ·	• ·	•	• ·
·······	··	•	• ·	•

Hydrolýza S-2238 sa začala pridaním 0,030 ml trombínového roztoku do každej jamky. Platňa sa inkubovala (trasením počas 30 sekúnd) pri teplote 37 °C. 1 minútu po začiatku inkubácie, sa merala absorbancia každej vzorky pri 405 nm každé 2 minúty počas periódy 90 minút použitím kinetického čítača mikrotitračnej platne (Twinreader plus, Flow Laboratories).

Všetky údaje sa zozbierali na IBM osobnom počítači použitím LOTUSMEASURE. Pre každú koncentráciu zlúčeniny (vyjadrenú v mol.ľ¹ reakčnej zmesi) a pre vehikulum sa vyniesla absorbancia v závislosti od reakčného času v minútach.

Vyhodnotenie odpovedí

Pre každú konečnú koncentráciu sa vypočítala maximálna absorbancia z grafu testu. IC50 hodnota (konečná koncentrácia, vyjadrená v pmol.ľ¹, ktorá zapríčiňuje 50% inhibiciu maximálnej absorbancie vehikula) sa vypočítala použitím logitovej transformačnej analýzy podľa Hafnera a ďalších (Atzneim.-Forsch./Drug Res. 1977; 27 (II): 1871-3).

Antitrombínová aktivita:

Príklad	IC₅₀ (pmol.l*¹)
1	0,41
8	0,61
9	0,32
10	1,35
11	0,5

Ρν εΐϊ-200, ·· ···· ·· · • · · · ····· • · · · · · · • · · · · · · ···· ·· t ·· ···

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Inhibitory serínovej proteázy všeobecného vzorca I v ktorom

J znamená H, R¹, R¹-O-C(O)-, R¹-C(O)-, R¹-SO2-, R³OOC-(CHR²)P-, (R^2a,R^2b)-NCO-(CHR²)P- alebo Het-CO-(CHR²)p-;

D znamená aminokyselinu vzorca -NH-CHR¹-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)qC(O)OR¹]C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)_qC(O)N(R^2a,R^2b)]-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH₂)_qC(O)Het]-C(O)-, D-1Tiq, D-3-Tiq, D-Atc, Aic, D-1-Piq alebo D-3-Piq;

E znamená -NR²-CH₂- alebo fragment (CH₂), / \

-N -CHvoliteľne substituovaný (Ci-6)alkylom, (Ci-6)alkoxylom alebo benzyloxyskupinou;

R¹ je vybrané z (Ci-i₂)alkylu, (C₂.i₂)alkenylu, (C₂.i₂)alkinylu, (C3-i₂)cykloalkylu a (C3-i₂)cykloalkyl(Ci_6)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C₃.i₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, oxoskupinou, OH, CF₃ alebo halogénom a z (C₈-i4)arylu, (C₇-i5)aralkylu, (C₈-i6)aralkenylu a (Ci₄-₂o)(bisaryl)alkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-₆)alkylom, (C₃-i₂)cykloalkylom, (Ci.₆)alkoxylom, OH, CF₃ alebo halogénom;

R², R^2a a R^2b sú každý nezávisle vybraný z H, (Ci.₈)alkylu, (C₂.₈)alkenylu, (C₂.₈)alkinylu, (C₃.₈)cykloalkylu a (C₃_6)cykloalkyl(Ci-4)alkylénu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C₃-6)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom a z (C6-i4)arylu a (C₇.i₅)aralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-₆)alkylom, (C₃-₆)cykloalkylom, (Ci.₆)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom;

·· ···· ···· ·· · · ·· • · · · · · · • ····· ··· • · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ·

-41 R³ je určený ako R² alebo znamená Het-(Ci-e)alkyl;

R⁴ znamená H alebo (Ci-₃)alkyl;

XaY znamenajú CH alebo N, s podmienkou, že neznamenajú súčasne N;

Het znamená 4-, 5- alebo 6-členný heterocyklus obsahujúci jeden alebo viac heteroatómov vybraných z O, N a S; m je 1 alebo 2;

p je 1,2 alebo 3;

q je 1,2 alebo 3;

t je 2, 3 alebo 4;

alebo prekurzory;

a/alebo ich farmaceutický prijateľné adičné soli a/alebo ich solváty.
2. Inhibítory serínovej proteázy podľa nároku 1, kde m je 2, X je CH a Y je CH.
3. Inhibítory serínovej proteázy podľa nároku 2, kde

J znamená H, R¹, R¹-SO2-, R³OOC-(CHR²)P-, (R^2a,R^2b)-N-CO-(CHR²)p- alebo HetCO-(CHR²)P-;

D znamená aminokyselinu vzorca -NH-CHR¹-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)qC(O)OR¹]C(O)-, -NR⁴-CH[(CH2)_qC(O)N(R^2a,R^2b)]-C(O)-, -NR⁴-CH[(CH₂)_qC(O)Het]-C(O)-;

E znamená -N(C₃-6)cykloalkyl-CH₂- alebo fragment (CH₂)_t/ \

-N - CH voliteľne substituovaný (Ci-6)alkylom, (Ci-6)alkoxylom;

R¹ je vybrané z (Ci_i₂)alkylu, (C₃-i₂)cykloalkylu a (C₃-i₂)cykloalkyl(Ci.₆)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C₃-i₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom alebo oxoskupinou a z (C6-i4)arylu, (C7.is)aralkylu a (Ci4-2o)(bisaryl)alkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (C-i-6)alkylom, (C₃.i₂)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, OH, CF₃ alebo halogénom;

R² znamená H; alebo ·· ·· ···· ·· • · · · ···· • · · · · · • · · · · · ···· ·· · ·· ·

-42R^2a a R^2b sú každý nezávisle vybraný z H, (Ci_₈)alkylu, (C₃.₈)cykloalkylu a (C₃.₆)cykloalkyl(Ci.4)alkylénu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C₃.₆)cykloalkylom alebo (Ci-e)alkoxylom, a z (C₆-i4)arylu a (Cz-isjaralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-6)alkylom, (C₃.₆)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom; alebo

R³ je vybraný z H, (Ci-₈)alkylu, (C₃.₈)cykloalkylu a (C₃-₆)cykloalkyl(Ci₄)alkylénu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C₃.₆)cykloalkylom alebo (Ci.6)alkoxylom, a z (C7.i5)aralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci-e)alkylom, (C₃.6)cykloalkylom, (Ci-6)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom a z Het-(Ci.₆)alkylu; p je 1;

q je 2;

t je 3 alebo 4.
4. Inhibitory serínovej proteázy podľa nároku 3, kde

D aminokyselina vzorca -NH-CHR¹-C(O)- alebo glutamyl [alebo ich (Ci_6)alkylester]; R¹ je vybrané z (C₃.i2)cykloalkylu a (C₃-i₂)cykloalkyl(Ci.6)alkylénu, ktoré môžu byť voliteľne substituované (C₃-i2)cykloalkylom alebo (Ci.₆)alkoxylom, a z (C6-i₄)arylu, (C₇-i₅)aralkylu a (Ci₄-2o)(bisaryl)alkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Ci.₆)alkylom, (C₃.i2)cykloalkylom, (Ci-e)alkoxylom alebo halogénom; a

R³ je vybrané z (Ci.₈)alkylu a (C₃.₈)cykloalkylu, kde každý môže byť voliteľne substituovaný (C3-6)cykloalkylom alebo (Ci-6)alkoxylom, a z (Cz-isjaralkylu, kde arylové skupiny môžu byť voliteľne substituované (Cvejalkylom, (C₃-6)cykloalkylom, (Ci.₆)alkoxylom, CF₃ alebo halogénom a z Het-(Ci-₆)alkylu.
5. Inhibitory serínovej proteázy podľa nároku 4, kde

J je -CH2COO(Ci-6)alkyl, (C₃.₈)cykloalkyl, -SO₂-10-kamfor, -CFhCONH-fenyl alebo

-CH₂CONH(C₃.₈)cykloalkyl;

D je D-cyklohexylalaninyl, D-fenylalaninyl, D-difenylalaninyl alebo glutamyl [alebo ich (Ci-6)alkylestery]; a

E je fragment

-43·· • · • · • ···· ·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· · ·· • · · • · • · · * · ·· · (CH₂)_t/ \

-N - CH kde t je 3 alebo 4.
6. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje inhibítory serínovej proteázy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 a farmaceutický prijateľné pomocné látky.
7. Inibítory serínovej proteázy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na použitie na liečebne účely.
8. Použitie inhibítorov serínovej proteázy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na výrobu lieku na liečenie alebo prevenciu chorôb sprostredkovaných trombínom a spojených s trombínom.