SK37697A3

SK37697A3 - Preparatoin method of alpha-substituted-4-methyl-butanoic acids

Info

Publication number: SK37697A3
Application number: SK376-97A
Authority: SK
Inventors: Olivier Favre-Bulle; Marie-Claude Bontoux; Denis Largeau; Andre Ariagno
Original assignee: Rhone Poulenc Nutrition Animal
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1997-10-08
Also published as: SK281956B6; AU3476495A; CZ84497A3; JPH10507631A; EP0782629B1; WO1996009403A1; RU2144959C1; FI971198A0; CN1077599C; ES2126313T3; PL180871B1; CA2200100A1; KR100398595B1; ATE174059T1; AU699625B2; US5814497A; NZ292559A; UA48953C2; DE69506430D1; DE69506430T2

Description

Spôsob prípravy racemických α-substituovaných 4-metyltiomaslových kyselín

Oblasť techniky

Vynález sa týka použitia nitrilázy ako hydrolýzového katalyzátora na hydrolýzu nitrilovej skupiny na karboxylovú skupinu. Vynález sa presnejšie týka použitia nitrilázy zvolenej z množiny zahrňujúcej nitrilázy mikroorganizmov rodu Alcaligenes faecalis uloženého pod číslom ATCC8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 uloženého pod číslom FERM BP-3857 a Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslom FERM BP-4535.

Doterajší stav techniky

Nitriláza z Alcaligenes faecalis je opísaná napríklad v európskom patente EP 348901 a v japonskom patente JP 03 224 496, pričom obidva tieto patenty patria spoločnosti Asahi. V týchto patentových dokumentoch a najmä v európskom patentovom dokumente je opísané použitie nitrilázy na prípravu opticky aktívnych kyselín z racemických nitrilov. Výhodnými východiskovými nitrilmi sú α-substituované nitrily, ktoré majú alkylový reťazec obsahujúci výhodne 1 až 3 uhlíkové atómy alebo aromatickú skupinu. Príklad 11 vyššie uvedeného európskeho patentu opisuje hydrolýzu racemického nitrilu kyseliny mandľovej pôsobením mikroorganizmu Alcaligenes faecalis, pričom kyselina R-(-)-mandľová sa získa v enantiomérnom prebytku 91 %. Európsky patent 486289 a jeho americký ekvivalent, patent US 5 326 702 spoločnosti Nitto

Chemical opisujú použitie mikroorganizmu Alcaligenes sp. BC35-2 (FERM č. 11265 alebo FERM-BP-3318) na hydrolýzu nitrilu kyseliny mandľovej v prítomnosti siričitanu, pričom kyselina mandľová sa v tomto prípade získa v enantiomérnom prebytku 98 %.

Patent JP 04 341 185 spoločnosti Asahi ešte opisuje prípravu a použitie nitrilázy z Alcaligenes faecalis ATCC 8750 na riešenie problémov prípravy opticky čistých zlúčením z ich racemických nitrilov. Enantioselektívna nitriláza opísaná vo vyššie uvedenom japonskom patente je schopná preferenčne hydrolyzovať ďalej uvedený 2-hydroxynitril so všeobecným vzorcom I na kyselinu 2-hydroxykarboxylovú s nasledujúcim všeobecným vzorcom II

OH

R-C-CN (D i

H

OH . I

R—C—COOH (||) H pričom v uvedených všeobecných vzorcoch I a II R znamená arylovú skupinu, ktorá je prípadne substituovaná, alebo prípadne substituovanú heterocyklickú skupinu. V uvedenom patente je uvedené, že hydrolýza nitrilu kyseliny mandľovej umožňuje získať kyselinu R-(-)-mandľovú v enantiomérnom prebytku 100 %. V príklade 5 je uvedené, že uvedená nitriláza môže sa použiť na hydrolýzu alifatických nitrilov, akými sú napríklad valeronitril, akrylonitril, 2-halogénpropionitrily a chlóracetonitril. Pokial ide o enantioselektivitu tejto hydrolýzy, týkajúcej sa alifatických nitrilov majúcich asymetrické centrum, nie je tu uvedené.nič presného.

Tento text tiež uvádza, že nitriláza z Alcaligenes faecalis má optimálnu účinnosť pri hodnote pH v rozsahu od 6,5 do 8,0, pričom teplota musí byť pri použití uvedeného enzýmu podlá tohoto odkazu vždy nižšia ako 45 °C.

Ukázalo sa úplne prekvapivo, že uvedený enzým z Alcaligenes faecalis ATCC 8750 v prípade, keď je použitý na hydrolýzu 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje uvedenú hydrolýzu bez akejkoľvek selektivity, pokial ide o optickú čistotu. Tento enzým hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemickej zmesi obidvoch kyselín a to bez akejkoľvek prevahy jedného či druhého z izomérov.

Nitriláza z Rhodococcus sp. HT 29-7 uložená pod číslom FERM BP-3857 je opísaná napríklad v európskom patente EP 610 049 a americkom patente US 5 296 373, pričom oba tieto patenty patria spoločnosti Nitto.

V týchto patentoch a najmä v americkom patente je opísané použitie nitrilázy na prípravu opticky aktívnych kyselín z racemických nitrilov nesúcich fenylovú skupinu. Všetky východiskové nitrily obsahujú aromatickú skupinu, pričom sa v podstate jedná o hydrolýzu nitrilu kyseliny mandľovej alebo jeho derivátov substituovaných na aromatickom jadre. Príklad 1 amerického patentu US 5 296 373 opisuje hydrolýzu racemického nitrilu kyseliny mandľovej pôsobením Rhodocoddus sp. HT 29-7, pri ktorej sa získa kyselina R-(-)-mandľová v enantiomérnom prebytku 100 %. Príklad 2 opisuje hydrolýzu derivátov nitrilu kyseliny mandlovej substituovaných na jadre, pričom i v tomto prípade je enantiomérny prebytok získanej kyseliny mandľovej 100 %. Taktiež je tomu i v prípade, keď sa vykonáva hydrolýza nitrilov benzaldehydu.

Európsky patent 610 049 spoločnosti Nitto Chemical opisuje použitie mikroorganizmu Rhodococcus sp. HT 29-7 /FERM BP-3857), Alcaligenes sp. BC35-2 (FERM BP-3318)alebo Brevibacterium acetylicum IAM 1790 na hydrolýzu a-hydroxynitrilov substituovaných v polohe gama aromatickým jadrom za vzniku opticky aktívnej α-hydroxykarboxylovej kyseliny substituovanej fenylovou skupinou. Kyseliny získané za použitia Rhodococcus sp. HT 29-7 majú vždy premenlivý enantiomérny prebytok, ktorý je v každom konkrétnom prípade závislý na východiskovom nitrile a na prítomnosti alebo neprítomnosti kyseliny fosforečnej (hodnota pH nastavená na asi 8,2).

Ukázalo sa úplne prekvapivo, že uvedený enzým y prípade, keď je použitý na hydrolýzu 4-metyltio-2-hydroxy-butyronitrilu, realizuje túto hydrolýzu bez akejkoľvek selektivity z hľadiska enantiomérnej čistoty. Tento enzým hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemickej zmesi obidvoch kyselín bez akejkoľvek prevahy jedného či druhého z izomérov.

Nitriláza z Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslom FERM BP-4335 je opísaná v európskom patente 0 610 048 na hydrolýzu nitrilov nesúcich v polohe gama fenylovú skupinu a v polohe alfa hydroxy-skupinu na zodpovedajúcu opticky aktívnu kyselinu. Enantiomérny prebytok sa vo všetkých príkladoch pohybuje medzi 92 a 100 %.

Ukázalo sa úplne prekvapivo, že uvedený enzým z Gordona terrae MA-41 uloženého pod číslom FERM BP-4535 v prípade, že je použitý na hydrolýzu 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje túto hydrolýzu bez akejkoľvek selektivity z hľadiska enantiomérnej čistoty. Tento enzým hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemickej zmesi obidvoch kyselín bez akejkoľvek prevahy jedného či druhého z izomérov.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je teda spôsob prípravy racemických a-substituovaných kyselín 4-metyltiomaslových hydrolýzou racemických α-substituovaných 4-metyltiobutyronitrilov pôsobením nitrilázy jedného z nasledujúcich mikroorganizmov: Alcaligenes faecalis uloženého pod číslom ATCC 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 uloženého pod číslom FERM BP-3857 a Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslom FERM BP-4535.

V rámci vynálezu sa môže mikroorganizmus použiť ako taký alebo imobilizovaný na o sebe známych nosičoch.

Inak sa môže genetická informácia, ktorá kóduje uvedený enzým transfekovať z rodičovského mikroorganizmu (akým je A.faecalis ATCC 8750...)do mikroorganizmu, akým je Bacillus subtilis.

Variantné uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že sa namiesto mikroorganizmu použije v zodpovedajúcom množstve jeho voľný alebo imobilizovaný enzým, ktorý je úplne alebo čiastočne vyčistený.

Z α-substituovaných 4-metyltiobutyronitrilov je výhodné použiť 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril, ktorý umožňuje pripraviť hydroxy-analóg racemického metionínu. Táto technológia prípravy derivátov metionínu umožňuje eliminovať tvorbu minerálnych vedľajších produktov vo veľkom množstve, ktorých likvidácia je čím ďalej tým viac obtiažnejšia vzhladom na ochranu životného prostredia.

t *

Uvedené enzýmy vykazujú v rámci vynálezu nitrilačnú

účinnosť	v oblasti	PH	v rozsahu od 4	do	11,	pričom	optimálnu
účinnosť	vykazujú	v	rozsahu pH od	5	do	9. Ich	optimálna
aplikačná	teplota	sa	pohybuje medzi	30	a	60 °C, .	pričom je

však výhodné použiť teplotu medzi 30 a 50 °C.

Výhodne sa pracuje s koncentráciou nitrilu vo východiskovom roztoku pohybujúcou sa medzi 20 a 400 molmi na liter, výhodne medzi 50 a 200 molmi na liter. Koncentrácia amónnej soli získanej kyseliny má len veľmi malý vplyv na účinnosť enzýmu v prípade, že je nižšia ako 2 moly na liter a keď výhodne leží v rozsahu medzi 0,1 a 1,5 molu na liter.

V nasledujúcej časti popisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétných príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou definície patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Mikroorganizmus Alcaligenes	faecalis ATCC 8750
kultivuje v nasledujúcom prostredí
octan amónny	10 g/1
kvasničný extrakt	5 g/1
peptón	5 g/1
K₂HPO₄	5 g/1
MgSO₄.7H₂O	0,2 g/1
FeSO₄.7H₂O	30 mg/1

NaCl 1 g/1 benzonitril 0,5 g/1 pH 7,2.

Kultivácia sa vykonáva pri teplote 30 °C v Erlenmeyerových bankách o obsahu 2 litre, obsahujúcich 600 ml uvedeného kultivačného prostredia. Všetok podiel sa mieša pri 150 otáčkach za minútu po dobu 30 minút. Izoluje sa bunkový pevný podiel , ktorý sa premyje roztokom chloridu sodného s koncentráciou 9 g/1 a potom zmrazí.

Pracovné podmienky na hydrolýzu butyronitrilu:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril	50	mM
bunky	5	mg/ml
fosfátový pufor	200	mM
teplota	30	°C
doba	4	hodiny.

Kinetická štúdia hydrolýzy 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu ukazuje, že dochádza k lineárnej produkcii 2,8 (xmolu hydroxy-analógu metionínu za hodinu a na miligram bunkovej sušiny. Enantiomérny prebytok získanej kyseliny, ktorý bol stanovený kvapalinovou chromatografiou, sa rovná 0 % pri výťažku kyseliny 80 %.

Príklad 2

Sledovaním kinetiky produkcie hydroxy-analógu metionínu po dobu 180 hodín za použitia voľných buniek sa vyhodnotí stabilita enzýmu.

Použijú sa nasledujúce pracovné podmienky:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril	100	mM
bunky	10	mg/ml
300mM fosfátový pufor	5	ml
teplota	25	°c

Nitril sa pridáva postupne v množstve 100 mmolov vždy po jeho vyčerpaní. Tvorba zodpovedajúcej kyseliny je zrejmá z nasledujúcej tabulky I:

Čas	Vytvorená kyselina (mmoly/litre)	Účinnosť (pmoly/h.mg bunkovej sušiny)
0	0	0
2 h	39	1,7
17 h	230	1,3
24 h	312	1,7
47 h	466	1,2
70 h	556	0,4
172 h	860'	0, 6
180 h	940	0, 6

Východisková účinnosť je rovná 2 pmolom/h.mg bunkovej sušiny. Tento príklad demonštruje stabilitu enzýmu i napriek vysokej koncentrácii kyseliny (0,9 molu hydroxy-analógu metionínu)

Príklad 3

V nasledujúcich podmienkach sa tiež stanovila stabilita enzýmu v závislosti na množstve substrátu a na množstve vytvorenej kyseliny.

Stabilita enzýmu v závislosti na množstve substrátu

Nitril	viď	nasledujúca	tabuľka
bunky	10	mg/ml
300mM fosfátový pufor, pH 7,0	5	ml
teplota	25	°C
doba	1	hodina.

Koncentrácia nitrilu	Účinnosť
(mM)	(pmoly/h.mg bunkovej sušiny)
50	2
100	2
150	2
200	2
500	0

Stabilita enzýmu v závislosti na množstve vytvorenej kyseliny

Pracovné podmienky:

nitril 50 mM bunky 2,5 mg/ml lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 1 ml teplota 30°C doba 2 hodiny.

Koncentrácia	Účinnosť
(mM)	(pmoly/h.mg bunkovej sušiny)
0	3,2
100	4,5
200	3, 8
300	4,1
400	4
500	4
600	3,4
700	2,8

Príklad 4

Purifikácia nitrilázy

Bunky Alcaligenes faecalis sa kultivujú 24 hodín pri teplote 30 °C v kultivačnom prostredí opísanom v príklade 1. Po odstredení kultúry sa bunková peleta vyberie pufrom s pH 7,5 (25mM Tris-HCl, 10 % (hm./obj.) glycerolu). Získaná bunková suspenzia sa spracuje ultrazvukom a potom odstredí za účelom získania surového extraktu. Tento surový extrakt sa potom spracuje síranom amónnym až so 30 % nasýtenia. Získaná zrazenina sa resuspenduje v pufri s pH 7,5 a potom dialyzuje proti 2 litrom rovnakého pufru v priebehu noci. Získaný roztok sa potom zavedie na stĺpec anexovej živice Q Sephadex Fast Flow HR 26/10, ktorá bola predtým uvedená do rovnovážneho stavu pufrom s pH 7,5. Aktívny podiel sa potom eluuje za použitia elučného gradientu od 0 do 1 M NaCl. Aktívne frakcie sa potom zavedú na anexovú živicu Mono Q HR

R/R, ktorá bola predbežne uvedená do rovnovážneho stavu pufrom s pH 7,5. Nitriláza sa eluuje pomocou elučného gradientu 0 až IM NaCl. Nakoniec sa frakcie vykazujúce účinnosť zlúčia, potom sa pridá 1 M síranu amónneho. Tento roztok sa potom zavedie na hydrofóbny interakčný stĺpec živice Phenyl sepharose HR 5/5, ktorá bola predbežne uvedená do rovnovážneho stavu pufrom s pH 7,5, ku ktorému bol pridaný 1 M síranu amónneho.

Gélovou filtráciou sa stanoví molekulová hmotnosť proteínu. Je asi 260 kDa. Na géli SDS-PAGE možno pozorovať jediný pás s 43 kDA (čistota 95 %).

Kinetika hydrolýzy 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu na hydroxy-analóg metionínu pôsobením nitrilázy mikroorganizmu A.faecalis je lineárna.

Čas	Účinnosť ((.imoly/h.mg bun.suš.)	RR (%)
0	0	1
0,5	150	3
1	171	5
21,5	150	68
24,8	150	77
29	150	87

Príklad 5

Vplyv hodnoty pH Pracovné podmienky:

nitril	50 mM
proteín	50 gg/ml
lOOmM acetátový pufor s pH 4 až 5
lOOmM fosfátový pufor s pH 6 až 7	. 1 ml
lOOmM Tris-HCl-pufor s pH 8 až 9
lOOmM boritanový pufor s pH 10 až 11
teplota	30°C
doba	+ až 2 hodiny.

PH	Účinnosť (gmoly/h. (jimoly/h.mg proteínu)
4	45
10	67
20	140
30	272
40	419
50	570
60	333

Porovnávací príklad s použitím nitrilu kyseliny mandľovej

Pracovné podmienky:

nitril kyseliny mandľovej 7 mM proteín 5 μς/ιηΐ lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 1 ml teplota

Čas (min)	Účinnosť (gmoly/h.mg proteínu)	ee
15	1000	1
60	1030	1

Purifikovaná nitriláza je teda enantioselektívna pre nitril kyseliny mandľovej, avšak nie pre 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril.

Príklad 7

Hydrolýza 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu s použitím mikroorganizmu Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857.

Mikroorganizmus Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 sa kultivuje v nasledujúcom kultivačnom prostredí:

glycerol	20 g/1
kvasničný extrakt (Difco)	3 g/1
KH₂PO₄	i g/1
Na₂HPO₄.12H₂O	4,4 g/1
Na₂SO₄	2,8 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,85 g/1
CaCl₂.2H₂O	0,05 g/1
MnSO₄.H₂O	0,033 g/1
FeSO₄.7H₂O	0,013 g/1
ZnSO₄.7H₂O	0,005 g/1
benzonitril	0,5 g/1

pH 7,5.

Kultivácia sa vykonáva pri teplote 30°C v Erlenmeyerových bankách s obsahom 2 litre, obsahujúcich 600 ml kultivačného prostredia. Všetok, podiel sa mieša pri 150 otáčkach za minútu po dobu 140 hodín. Bunková peleta sa izoluje, premyje vodným roztokom NaCl s koncentráciou 9 g/1 a potom zmrazí.

Vplyv hodnoty pH na hydrolýzu

Pracovné podmienky:

4-metyltio-2.hydroxybutyronitril optická hustota pri 660 nm lOOmM acetátový pufor s pH 4 až 5 lOOmM fosfátový pufor s pH 6,0 až 7,0 lOOmM Tris-HCl-pufor s pH 8,0 až 9,0 lOOmM boritanový pufor s pH 10,0 až 11,0 teplota doba

100 mM ml

30°C hodín.

PH	Výťažok kyseliny (%)
4	0
5	100
6	100
7	100
8	100
9	100
10	20
11	0

Príklad 8

Vplyv koncentrácie substrátu

V nasledujúcich podmienkach bola tiež stanovená stabilita enzýmu v závislosti na množstve substrátu.

Pracovné podmienky:
4-metyltio-2-hydroxybutyronitril	viď nasledujúca tabulka
optická hustota pri 660 nm	20
300mM fosfátový pufor, pH 7,0	5 ml
teplota	30°C
doba	2 hodiny.
Koncentrácia nitrilu	Výťažok kyseliny
(mM)	(¾)
50	90
100	44
200	22
300	10
400	0
500	0

Príklad 9

Stabilita enzýmu v závislosti na množstve vytvorenej kyseliny ľ

Pracovné podmienky:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril

100 mM optická hustota pri 660 nm 15 lOOmM fosfátový.pufor, pH 7,0 1 ml teplota 30°C doba 6 hodín.

Koncentrácia kyseliny	Výťažok kyseliny
(mM)	(%)
0	100
200	100
400	100
600	100
800	100
1000	100

Príklad 10

Enantiomérny prebytok

Pracovné podmienky:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril 140 mM optická hustota pri 660 nm 14 lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 teplota

20°C

Inkubačná doba	Výťažok kyseliny	Optická čistota
(h)	(%)
2	15	0
6	50	0
24	100	0

Štúdium kinetiky hydrolýzy 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu ukazuje lineárnu produkciu hydroxy-analógu metioninu za hodinu a na mg bunkovej sušiny. Enantiomérny prebytok vytvorenej kyseliny sa meral kvapalinovou chromatograf iou, pričom sa stanovilo, že je 0 % pre výťažok kyseliny meniacej sa medzi 15 a 100 %.

Príklad 11

Vplyv teploty

Pracovné podmienky:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril optická hustota pri 660 nm lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 teplota doba

100 mM ml viď tabulka hodín.

Teplota	Výťažok kyseliny
(°C)	(%)
10	70
20	100
30	100
40	100
50	31
60	15

Príklad 12

Hydrolýza 4-metyltio-2-aminobutyronitrilu

Pracovné podmienky:

•4-metyltio-2-hydroxybutyronitril 23 mM optická hustota pri 660 nm 15 lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 1 ml teplota 30°C

Čas	Výťažok kyseliny	Enantiomérny
(h)	(%)	prebytok kyseliny
0,5	40	nestanovený
1	51	0,12
1	62	nestanovený
5	78	0, 15

Príklad 13

Na. kultiváciu mikroorganizmu Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) sa použije kultivačné prostredie, ktoré má nasledujúce zloženie:

glycerol	10 g/1
kvasničný extrakt	0,4 g/1
K₂HPO₄	6,8 g/1
Na₂HPO₄.12H₂O	7,1 g/1
Na₂SO₄	2,8 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,4 g/1
CaCl₂.2H₂O	40 mg/1
MnSo₄.H₂0	4 mg/ml
FeCl₃	0,6 mg/1
ZnSO₄	0,3 mg/1
benzonitril	0,5 g/1

pH 7,2.

Účinnosť enzýmu

Kultivované bunky sa po premytí uvedú do styku s hydroxymetyltiobutyronitrilom na stanovenia ich účinnosti. Pracovné podmienky:

nitril 23 mM bunky 6,8 g/1 lOOmM fosfátový pufor teplota 35°C pH 7,0

Hydrolýza AMTP-kyánhydrínu s použitím mikroorganizmu Gordona terrae MA-1

			/	/
		ď
	/	Ť—
/	Λ
t					-ΤΤΤ-Γ

<' ......................

12 3 4 5 6

Čas (h)

Kinetika hydrolýzy hydroxymetyltiobutyronitrilu má lineárny charakter. Počiatočná rýchlosť je 12 mmolov/h.g bunkovej sušiny.

Príklad 14

Vplyv koncentrácie AMTP-kyánhydrínu na účinnosť nitriláz.

Výsledky stanovenia vplyvu východiskovej nitrilázy sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Pracovné podmienky:

bunky. 5,1 g/'l lOOmM fosfátový pufor teplota 35°C ph 7,0.

Sledovanie kinetiky bolo uskutočnené v časových úsekoch 0,5, 1, 2 a 3 hodín

Koncentrácie nitrilu	Účinnosť
(mM)	(mmoly/h.g .bunkovej sušiny)
50	14
100	13
200	15
300	0
400	0

Až do koncentrácie nitrilu 200 mM sa účinnosť v závislosti na koncentrácii substrátu mení len veľmi málo.

Príklad 15

Vplyv koncentrácie hydroxy-analógu metionínu na účinnosť nitrilázy

V rámci tohoto príkladu bol študovaný vplyv koncentrácie 4-hydroxy-2-metyltiobutanoátu amónneho na účinnosť nitrilázy.

Pracovné podmienky:

bunky 5 g/1 nitril 100 mM lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 teplota 35°C.

Koncentrácia karboxylátu amónneho sa mení medzi 0 a 1,5 M.

Koncentrácia kyseliny	Účinnosť
(mol/1)	(μπιοΐ/h.mg bunkovej sušiny)
0	9,4
0, 5	14
1	19
1,5	15

Koncentrácia 4-hydroxy-2-metyltiobutanoátu amónneho nijako neovplyvňuje východiskovú účinnosť kmeňa Gordona terrae HT 29-7.

Príklad 16

Vplyv hodnoty pH a teploty

Pracovné podmienky:

nitril 100 mM bunky 7,5 g/1 lOOmM acetátový pufor s pH 4 až 5 lOOmM fosfátový pufor s pH 6 až 7 lOOmM Tris-HCl-pufor. s pH 8,9 lOOmM boritanový pufor s pH 10 až 11 teplota 30°C.

Sledovanie kinetiky bolo uskutočnené v časových úsekoch 1, 2, 4 a 6 hodín.

PH	Účinnosť (mmol/h.g bunkovej sušiny)
4	0, 6
5	2,5
6	7,8
7	9,6
8	15, 3
9	18
10	5,7
11	11

Pri použitých pracovných podmienkach sa optimálne pH pohybuje v blízkosti pH 8 až 9.

Vplyv teploty na účinnosť nitrilázy mikroorganizmu Gordona terrae MA-1

Pracovné podmienky:

nitril 10 mM bunky 7,5 g/1 lOOmM fosfátový pufor, pH 7,0 sledovanie kinetiky v časovom úseku 1 hodiny.

Teplota	Účinnosť
(°C)	(mmol/h.g bunkovej sušiny)
10	0, 6
20	2,3
30	3, 2
40	3,4
50	3,5
60	1,9

Optimálna teplota sa pohybuje v blízkosti 40 až 50 °C.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy racemických a-substituov.aných · 4-metyltiomaslových kyselín, v y z n a č e n ý t ý m , že sa racemické α-substituované 4-metyltiobutyronitrily hydrolyzujú nitrilázou zvolenou z množiny zahrňujúcej nitrilázy mikroorganizmov Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 a Gordona terrae FERM BP-4535.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačený tým, že racemickým a-substituovanom 4-metyltiobutyronitrilom je 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačený tým, že sa pH prostredia pohybuje medzi 4 a 11, výhodne medzi 5 a 9.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačený tým, že sa teplota hydrolýzy pohybuje medzi 30 a 60 °C, výhodne medzi 30 a 50 °C.
5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačený tým, že sa koncentrácia α-substituovaného 4-metyltiobutyronitrilu vo východiskovom roztoku pohybuje medzi 10 a 400 mmolmi, výhodne medzi 50 a 200 mmolmi na liter.
6. Spôsob podľa nárokul, vyznačený tým, že sa koncentrácia α-substituovanej 4-metyltiomaslovej kyseliny v roztoku pohybuje medzi 10 a 2000 mmolmi, výhodne medzi 100 a 1500 mmolmi na liter.