SK286308B6

SK286308B6 - Aromatic derivatives and iron complexes thereof for use as normalising agents of iron level

Info

Publication number: SK286308B6
Application number: SK556-2001A
Authority: SK
Inventors: Napoli Guido Di
Original assignee: Medidom Lab
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2008-07-07
Also published as: AU1157300A; EP1124814A1; US6455578B1; PL198826B1; SK5562001A3; DE69904635D1; PL347940A1; EP1124814B1; ATE229947T1; CZ299542B6; AR021037A1; ES2189537T3; IT1303688B1; IL142813A; WO2000026205A1; JP2002528539A; BR9914863A; AU756726B2; IL142813A0; CZ20011461A3

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka opisovaných aromatických derivátov vzorca (I) a ich komplexov so železom na prípravu farmaceutických kompozícií použiteľných ako činidlá na normalizáciu hladiny železa.

Doterajší stav techniky

Preťaženie organizmu železom v dôsledku väčších porúch v metabolizme železa, ako je genetická hemochromatóza a talasémia, alebo v dôsledku menej významných príčin, ako napríklad transfúzie pri hemolytickej anémii, môže viesť k nadmernej fyziologickej obrannej reakcii a v dôsledku toho mať toxický účinok.

Taký výsledok je spôsobený zväčšením „zásoby voľného železa“ vyvolávajúceho vznik aktívnej formy kyslíka zodpovednej za inaktiváciu bunkových enzýmov, za modifikácie membránových lipidov, za zmeny DNA a pod. (E. Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 1989, zv. 58, str. 79 -110).

Preto môžu následky zväčšenia „zásoby voľného železa“ siahať od genotoxicity tohto kovu vedúcej k vývoju nádorov až k rôznym chorobným stavom orgánov, ako je cirhóza, diabetes, kardiopatia, hypogonadiz.mus a artropatia.

Ku zväčšeniu „zásoby voľného železa“ môže dôjsť, aj keď hodnota všetkého železa v organizme nevzrastie, a to v súvislosti s mnohými patologickými stavmi, ako sú napríklad neurodegeneratívne poruchy (M. Gassen a ďalší, Pharmacol. Toxicol., 1997, zv. 80 (4), str. 159 - 166), ateroskleróza (A. J. Matthews a ďalší, J. Surg. Res., 1997, zv. 73 (1), str. 35 - 40), ischemická kardiopatia (T. P. Tuomainon a ďalší, Circulation, 1998, zv. 97 (15), str. 1461 - 1466, chronické črevné choroby (R. A. Floyd a ďalší, Dig. Dis. Sci., X. 1996, zv. 41(10), str. 2078 - 2086) a môže zaviniť vývoj patobiologického prípadu.

Najnovšie boli zistené priame väzby medzi zmenami metabolizmu železa a infekciami HIV (J. R. Boelaert a ďalší, Infect. Agents Dis. I. 1996, zv. 5 (1), str. 36 - 46) rovnako ako spojenie medzi kardiotoxicitou vyvolanou železom a metabolizmom antineoplastických činidiel u osôb, ktoré sa podrobili protinádorovej liečbe (G. Minotti a ďalší, J. Clin. Invest., IV. 1995, zv. 95 (4), str. 1595 - 1605).

Navyše sa dokázalo, že prítomnosť „voľného železa“ má rozhodujúcu úlohu v reakciách vedúcich k tvorbe voľných radikálov a k šíreniu škodlivých účinkov pôsobenia voľných radikálov, s ktorými sa spájajú napríklad za ochorenia, ako je artritída, pyelonefritída (R. Gupta a ďalší, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1997, zv. 20 (4), str. 299 - 307) a senescencia (M. C. Corti a ďalší, Am. J. Cardiol., 1997, zv. 79 (2), str. 120- 127).

Dnes je známe použitie činidiel tvoriacich cheláty so železom pri liečbe systémového preťaženia železom spojeného s chorobnými stavmi, ako je talasémia alebo hemochromatóza.

Zlúčeniny používané pri týchto liečbach majú niekoľko závažných nedostatkov. Napríklad desferríoxamín, jedna zo zlúčenín častejšie používaných pri tomto type liečby, viaže okrem železa mnoho iných dôležitých kovov, ako je hliník; je to veľmi drahý výrobok, ktorý nie je možné podávať orálne a má tak krátky polčas, že pri subdermálnej infúzii je nutné nepretržité podávanie (R. J. Rothman a ďalší, Mol. Pharmacol., 1992, zv. 42, str. 703 -710).

Sú známe ďalšie lieky obsahujúce komplexotvomé činidlá pre železo ako napríklad deferiprón a jeho deriváty, ktoré sa vyznačujú veľkou biologickou dosažiteľnosťou, ale tiež veľkou toxicitou spôsobenou práve ich biologickou dosažiteľnosťou, ktorá vedie k vypuknutiu chorôb, ako je napríklad agranulocytémia, epatická fibróza a pod. (N. F. Olivieri a ďalší, N. Engl. J. Med., 1998, zv. 339 (7), str. 417 - 423).

Okrem toho dosiaľ používané lieky majú dramatický účinok na bunkový metabolizmus železa, ktorý uvádzajú do hlbokej nerovnováhy; sťahujú totiž značné množstvá kovu z miest, v ktorých sú v organizme deponované, a preto ich nie je možné podávať ani v prekox fázach ani v rámci profylaxie pri hemochromatóze alebo talasémii, ani v podmienkach, v ktorých by sa malo čeliť zväčšeniu hotovosti voľného železa, aby sa zabránilo kolísaniu množstva funkčného železa alebo železa uloženého v depozitoch.

Preto sa hlboko pociťuje potreba nových zlúčenín vhodných na prípravu farmaceutických kompozícií schopných pôsobiť ako chelatotvomé činidlá pre všetko železo rovnako ako pre hotovosť voľného železa, odstraňovať ich z buniek a eliminovať výsledný komplex v moči.

Podobne so pociťuje potreba nových farmaceutických kompozícii na liečbu chorôb, spojených s nedostatkom železa v organizme.

Podstata vynálezu

Prihlasovateľ s prekvapením zistil, že aromatické deriváty vzorca (I):

kde

R₃ O

I II

Ri je -CH-C-CH2-R4, pričom význam R₃ a R4 je zvolený z H a OH, za predpokladu, že R₃ a R, nie sú súčasne H, a

R₂ je H, alebo

OHR₅

I I

R] a R₂ tvorí dohromady -C=C-, pričom význam R₅ je zvolený z CH₃ a (ΟΗ₂)₅ΟΗ, sú schopné stabilne viazať železo, zvlášť Fe(III).

Uvedené zlúčeniny vzorca (I) sú vhodné na prípravu farmaceutických kompozícií na perorálnu aplikáciu a majú vysokú absorpciu a vysokú schopnosť prenikať biologickými membránami vo forme voľných ligandov aj ako komplexy so železom.

Uvedené farmaceutické kompozície sú preto použiteľné pri liečbe všetkých patologických stavov vzniknutých preťažením železom, pri náraste celkového železa rovnako ako v prípade relatívneho vzrastu koncentrácie železa v dôsledku vzrastu hotovosti voľného železa.

Komplexy zlúčenín vzorca (I) so železom sa tiež môžu použiť pri príprave farmaceutických kompozícií použiteľných pri liečbe chorôb spojených s deficitom železa, a to v akútnej fáze rovnako ako pri chronickom ochorení.

Preto sú jedným z cieľov tohto vynálezu zlúčeniny vzorca (I) na prípravu farmaceutických kompozícií na použitie zvlášť ako chelatotvomé činidlá pre železo a ich komplexy použiteľné ako činidlá na uvoľňovanie železa pri hypoferémii.

Ďalším cieľom tohto vynálezu sú zlúčeniny vzorca (I), kde

R₃ O

I II

Rt je -CH-C-CH2-R4, pričom R₃ je OH a R4 je H, OH a R₂ je H;

OHR₅

I I alebo Ri a R₂ tvoria dohromady -C=C-, pričom Rs je (CTUjsOH.

Znaky a prednosti zlúčenín podľa vzorca (I) ako chelatotvomých činidiel pre železo a komplexov železa podľa tohto vynálezu so podrobne opíšu v nasledujúcom opise.

Tento vynález sa týka zlúčenín s uvedeným vzorcom (I) na prípravu farmaceutických zlúčenín, zvlášť farmaceutických zlúčenín použiteľných ako chelatotvomé činidlá železa. Komplexy zlúčenín podľa tohto vzorca (I) majú tiež terapeutické použitie ako činidlá na uvoľňovanie železa.

Zlúčeniny podľa vzorca (I), ktoré je možné ľahko pripraviť spôsobmi známymi v odbore, majú vysokú afinitu k železu, zvlášť pre Fe(III), a vytvárajú stabilné komplexy s týmto kovom pri rôznych pomeroch kov/ligand.

Pokiaľ ide o prípravu uvedených komplexov, typicky sa pripravujú reakciou zlúčeniny vzorca (I) s (FelII) iónmi zo železitých solí zvolených zo skupiny pozostávajúcej z anorganických soli Fe(III), najmä chloristanu, chloridu a síranu, ale zvlášť chloristanu.

Táto reakcia sa uskutočňuje v rozpúšťadle vybranom zo skupiny, ktorú tvorí acetón, chloroform, dichlórmetán a vodné roztoky obsahujúce 5 až 10 % dimetylsulfoxidu, výhodne v acetóne.

So zlúčeninami vzorca (I), kde

OHR₅

I I

Ri a R₂ tvoria dohromady -C=C-, pričom R₅ je zvolené z CH₃ a (CH₂)OH, boli vykonávané experimenty s chelatáciou železa a zistilo sa, že vytvárajú komplex s Fe(III) pri molámom pomere ligand/kov 2:1.

Príprava tohto komplexu sa výhodne vykonáva pri teplote miestnosti reakciou zlúčeniny vzorca (I) s chloristanom železitým v acetóne.

Konštanta stability komplexu trojmocného železa so zlúčeninou vzorca (I), kde

OHR,

Ri a R₂ tvoria dohromady -C=C-, kde R_s je CH₃, sa merala voltametricky s Pt elektródou ako indikačnou elektródou a s kalomelovou elektródou ako referenčnou elektródou a získala sa hodnota konštanty stability 3,0 x 10'°.

Podobné skúšky s chelatáciou a s meraním konštánt stability týchto komplexov sa vykonávali s inými zlúčeninami vzorca (I) a získali sa podobné výsledky.

Schopnosť zlúčenín podľa vzorca (I) a ich komplexov so železom prenikať biologickými membránami sa zisťovala testami medzifázového rozdelenia medzi n-oktanolom a vodným roztokom uvedených zlúčenín, ktoré preukázali ich väčšiu afinitu k organickým rozpúšťadlám.

Testy medzifázového rozdelenia sa najmä vykonávali medzi n-oktanolom a vodným roztokom 20 mM tris(hydroxymetyl)aminometánhydrochloridu, upraveným na pH 7,4 prídavkom fosforečnanu sodného, a získali sa hodnoty rozdeľovacieho koeficientu vyjadrené ako pomer medzi koncentráciou zlúčeniny v organickej fáze a koncentráciou vo vodnej fáze, ktorý mal pre tieto zlúčeniny podľa vzorca (I) rovnako ako pre ich komplexy s Fe (111) typicky hodnotu vyššiu než 20.

Zlúčeniny podľa vzorca (I) a ich komplexy so železom podľa tohto vynálezu sa môžu formulovať s farmaceutický prijateľnými excipientmi a/alebo riedidlami s cieľom pripraviť farmaceutické kompozície na liečbu chorôb charakterizovaných preťažením železom alebo naopak deficitom železa v ľudskom organizme.

Ako riedidlo sa napríklad môže použiť dimetylsulfoxid a príklady možných prísad sú metylcelulóza, β-cyklodextriny a polyetylénglykol.

Koncentrácia zlúčeniny podľa tohto vzorca (I) alebo zodpovedajúcich komplexov so železom vo farmaceutických kompozíciách je v rozmedzí 0,4 až 0,8 % hmotnostných z celkovej hmotnosti kompozície.

Uvedené kompozície obsahujúce zlúčeniny podľa vzorca (I) sú účinné ako chelatotvomé činidla pre železo pri liečbe systémového preťaženia železom, ako je tomu v prípade talasémie a hemochromatózy, rovnako ako pri liečbe rastu zásoby voľného železa.

Farmaceutické kompozície obsahujúce zlúčeniny podľa vzorca (I) podľa tohto vynálezu sú preto použiteľné pri liečbe niektorých chorôb, ktoré súvisia s preťažením organizmu železom, ako je hemochromatóza, talasémia, anémia spojená s preťažením železom a stavy spojené so sekundárnou siderózou, neurodegeneratívne ochorenie, ako je Parkinsonova alebo Alzheimerova choroba, ischemická kardiopatia, chronické zápalové ochorenia, ako je artritída, pyelonefritída a chronické zápalové črevné choroby, zmeny metabolizmu železa spojené s infekciami HIV, kardiotoxicita spôsobená doxorubicínom a antracyklínmi, ateroskleróza a starnutie.

Farmaceutické kompozície obsahujúce komplexy zlúčenín podľa vzorca (I) so železom sú použiteľné pri liečbe chorôb, spojených s deficitom železa v organizme vrátane sideropenickej anémie v akútnej fáze aj v chronickej forme.

Nasledujúce príklady sú nelimitujúcimi ilustráciami tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu (zlúčenina vzorca (I)), v ktorej Ri a R₂ tvoria

OH R s

I I dohromady -C=C-, pričom R₅ je CH₃.)

2-Hydroxyacetofenón (20 g) sa rozpustí v etylacetáte (200 ml). V priebehu 15 až 20 minút sa postupne pridáva práškový sodík (16 g) rýchlosťou umožňujúcou primeraný reflux. Zmes sa zahrieva pod spätným chladičom 1 hodinu, potom sa ochladí. Potom sa pridá drvený ľad (200 g) do vyzrážania sodnej soli acetylacetofenónu, ktorá sa potom oddelí vákuovou filtráciou. Pevný produkt sa potom kryštalizuje zo 40 % kyseliny octovej (200 ml), čím sa získa acetylacctofenón (19,6 g) ako práškové kryštály (teplota topenia 95 °C, výťažok 75 %).

K takto získanému acetylacetofenónu (15 g) sa pridá koncentrovaná kyselina sírová (30 g). Po ochladení na teplotu miestnosti sa pridáva voda do vyzrážania bieleho prášku, ktorý sa izoluje vákuovou filtráciou a premyje studenou vodou. Získa sa 2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (10 g) s teplotou topenia 71 °C pri výťažku 74 %.

V benzéne (15 ml) so vo vhodnej hydrogenačnej banke suspenduje Pd na CaCO₃ (1,6 g). K aktivácii katalyzátora dochádza absorpciou H₂ pri izbovej teplote, potom sa pridá 2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (1,6 g)

SK 286308 Β6 rozpustený v benzéne (15 ml). Katalyzátor sa ponechá, aby absorboval asi 200 ml H₂ pri tlaku a teplote miestnosti. Po filtrácii a odparení benzénu sa získa bledožltá olejovitá kvapalina, ku ktorej sa pridá malý objem zmesi petroléter/etyléter v pomere 1:1. Získaný roztok sa prečistí chromatograficky v kolóne naplnenej silikagélom (600 až 200 mesh) s uvedenou zmesou ako eluentom. Získa sa 0,9 g prečisteného a vysušeného produktu (výťažok 60 %); uvedený produkt je bezfarebný olej zlúčeniny 2,3-dihydro-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón. 2,3-Dihydro-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (1,62 g) sa rozpustí v 95 % etanole (50 ml) a roztok sa za miešania reíluxuje. V priebehu 10 až 15 minút sa po kvapkách pridá izoamylnitrit (8 ml) a koncentrovaná HC1 (40 ml). Zahrievanie a miešanie sa zastaví a výsledná zmes sa nechá 2 hodiny stáť. Potom sa pridáva voda (200 ml) do vyzrážania bielej pevnej látky. Rozpúšťadlo sa odparí a získa sa pevný produkt, ktorý sa rozpustí v malom objeme chloroformu a prečistí na silikagéli v rovnováhe s tým istým rozpúšťadlom. Prečistený produkt obsahuje nízke percento žltých nečistôt, ktoré sa úplne odstránia rekryštalizáciou z acetónu. Potom sa oddelia zvyšky rozpúšťadla a ziska sa 0,97 g 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu ako bezfarebné kryštály s teplotou topenia 179 - 180 °C; IR: 1632, 1666 e 3301 cm'¹; výťažok = 51 %.)

Príklad 2

Príprava 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-1 -benzopyran-4-ónu (Zlúčenina vzorca (I)),

OHRj v ktorej R| a R₂ tvoria dohromady -C=C-, pričom R5 je (CH₂)₅OH)

Do reaktora sa uvedie 2-hydroxyacetofenón (13,6 g) a toluén (200 ml). Postupne sa za miešania pridáva hrubo zmný sodík (4,4 g) tak, aby sa udržal mierny reflux. Po ukončení reakcie so pridá etyl-6-hydroxykapronát (28 g) a zmes sa nechá za miešania reagovať pri miernom refluxe 2 hodiny; vznik produktu sa kontroluje chromatografiou TLC so zmesou dietyléter/petroléter 9 : L Po ochladení sa vykoná vákuová filtrácia a pevný produkt sa premyje dietyléterom.

Potom sa pevný produkt opäť rozpustí v 40 % kyseline octovej (100 ml) a k takto získanému roztoku sa postupne pridáva NaHCO₃ do neutrálnej reakcie. Potom sa roztok vleje do separačnej nálevky a vykonajú sa tri extrakcie dietyléterom (každá s 100 ml rozpúšťadla). Fáza obsiahnutá v éteri zo všetkých extrakcií sa spojí a vysuší prídavkom bezvodébo Na₂SO₄; po pridaní vysúšadla sa suspenzia 5 minút mieša a potom sa filtruje. Rozpúšťadlo sa odparí a získa sa olej, ktorý sa chromatograficky prečistí na silikagéli s elučným činidlom dietyléter/petroléter v pomere 9:1. Získa sa l-(2-hydroxyfenyl)-l,3-[3-(5-hydroxypentyl)]butandión(8 g).

K získanému produktu (8 g) sa pridá 96 % H₂SO₄ (16 g) a zmes sa nechá niekoľko minút za miešania reagovať. Po ochladení na izbovú teplotu sa pridá voda, potom sa postupne pridáva NaHCO₃ s cieľom neutralizácie kyseliny sírovej. Nasledujú tri extrakcie dietyléterom (150 ml). Výsledné tri fázy obsiahnuté v éteri sa spoja a vysušia pridaním Na₂SO₄. Po filtrácii a odparení rozpúšťadla sa získa olej, ktorý je v ďalšom chromatograficky prečistený v kolóne obsahujúcej silikagél so zmesou etyléter/acetón v pomere 80 : 20 ako eluentom. Získa sa 0,74 g 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu.

Vo vhodnej hydrogenačnej banke sa suspenduje Pd na CaCO₃ v benzéne; katalyzátor sa ponechá, aby absorboval H₂ pri izbovej teplote a tlaku. Keď katalyzátor prestane absorbovať H₂, pridá sa 2-(5-hydroxypentyI)-4H-l-benzopyran-4-ón (0,74 g) rozpustený v benzéne a vykoná sa hydrogenácia; pri teplote a tlaku miestnosti sa absorbuje asi 100 ml H₂. Po asi 24 hodinách sa vykoná filtrácia a odparí sa benzén, čím sa získa olej, ku ktorému sa pridá malé množstvo dietyléteru. Prečistenie tohto produktu sa vykoná chromatograficky na silikagély s dietyléterom ako elučným činidlom. Získa sa 0,23 g 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu.

0,23 g 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu sa rozpusti v 95 % etanole (5 ml) a roztok sa zahrieva pod spätným chladičom za miešania. Potom sa po kvapkách pridajú HC1 (6,2 ml) a izoamylnitrid (1,2 ml). Potom sa miešanie a zahrievame zastaví a reakčná zmes sa nechá stáť asi 1 hodinu. Rozpúšťadlo sa odparí, pridá sa voda a produkt sa extrahuje dietyléterom. Frakcia obsiahnutá v éteri sa suší prídavkom bezvodého Na₂SO₄. Po filtrácii a odparení rozpúšťadla sa získa olej, ktorý sa chromatograficky prečisti na silikagéli so zmesou dietyléter/metanol v pomere 98 : 2 ako eluentom. Získa sa 3-hydroxy2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón (99,2 mg). Produkt v kryštalickej forme sa získa kryštalizáciou v cyklohexáne alebo dietyléteri (teplota topenia 111-112 °C).

Príklad 3

Príprava 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu (zlúčenina vzorca (I), v ktorej Ri a R₂ tvoria dohromady

0HR₅

I I

-C=C-, pričom R₅ je (CH₂)₅OH).

Etyl-6-hydroxykapronát (100 mmol) sa za miešania rozpustí v 3,4-dihydropyráne (120 mmol); potom sa pridá p-toluénsulfónová kyselina (15 mg) a zmes sa pri teplote miestnosti nechá reagovať asi 1 hodinu. Koniec reakcie sa overí chromatografiou TLC na silikagéli so zmesou petroléter/'dietyléter v pomere 1 : 1 ako eluentom s použitím jódových pár na detekciu. Po ukončení reakcie sa pridá zásaditý vodný roztok uhličitanu sodného a opatrne mieša. Produkt získaný v kvantitatívnom výťažku sa extrahuje dietyléterom.

Toluén (15 ml) vydestilovaný na sodíku sa naleje na granulovaný sodík (300 mmol) a zahrieva sa do refluxu. Po dosiahnutí refluxu sa ukončí zahrievanie a pridá sa po kvapkách v priebehu 90 až 120 minút etyl-6-hydroxykapronát (200 mmol), s hydroxylovou skupinou stále chránenou, získaný ako opísané, spoločne s 2-hydroxyacetofenónom (100 mmol) v toluéne (15 ml). Zmes sa nechá reagovať 4 až 5 hodín a koniec reakcie sa kontroluje chromatografiou TLC na silikagéli so zmesou petroléter/dietyléter v pomere 1 : 1 ako eluentom.

Po ukončení reakcie sa pridá etanol na odstránenie nadbytku sodíka, potom sa pridá 100 ml 7,5 % octovej kyseliny tak, aby pH malo hodnotu asi 10.

Kondenzačný produkt s dosiaľ chránenou hydroxylovou skupinou sa trikrát extrahuje dietyléterom a dvakrát etylacetátom, čím sa získa produkt v 60 % výťažku.

Takto získaný produkt rozpustený v octovej kyseline (2 ml) sa umiestni v reaktore ponorenom v olejovom kúpeli, načo sa jeho teplota asi 1 hodinu udržuje na 130 °C. Najskôr prebieha destilácia azeotropnej zmesi voda/octová kyselina, načo sa nasadí vákuové čerpadlo na intenzívnejšie oddestilovanie zvyšujúcej kyseliny octovej.

Cyklizácia sa overuje chromatografiou TLC na silikagéli s dietyléterom ako eluentom. Na konci cyklizácie sa pridá zmes kyselina octová/voda v pomere 4 : 1 (50 ml) a teplota sa zvýši na 50 °C. Reakčná zmes sa udržuje na teplote 50 °C za miešania až do úplného odstránenia chrániacej skupiny a získa sa 2-(5-hydroxypentyl)-benzopyran-4-ón. Vznik tohto produktu sa overí chromatografiou TLC na silikagéli s dietyléterom obsahujúcim 2 % metanolu ako elučným činidlom.

Získaný produkt sa extrahuje dietyléterom po pridaní vody, potom sa odparí rozpúšťadlo a produkt sa prečistí stĺpcovou chromatografiou s dietyléterom obsahujúcim 2 % metanolu ako eluentom, čím sa získa čistý 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón v 50 % výťažku.

% Pd na uhličitane vápenatom (1 g) sa vloží do 20 ml etanolu a hydrogenuje. Len čo katalyzátor prestane absorbovať H₂, pridá sa roztok pripravený rozpustením 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzpyran-4-ónu (4 g), získaného uvedeným spôsobom, v etanole (40 ml) a vykoná sa hydrogenácia. Zmes sa nechá reagovať 4 až 5 hodín, potom sa vykoná filtrácia; reakčný produkt sa vysuší a znovu rozpustí v minimálnom množstve dietyléteru na účely chromatografického prečistenia na silikagéli s dietyléterom ako eluentom. Takto sa získa 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón v 50 % výťažku.

Takto získaný produkt (1 mmol) sa rozpustí v 95 % etanole (5 ml) a roztok sa refluxuje za miešania. K tomuto roztoku sa po kvapkách pridajú HCl (6,5 ml) a izoamylnitrit (1,2 ml). Potom sa zastaví zahrievanie a miešanie a reakčná zmes sa nechá 1 hodinu stáť. Rozpúšťadlo sa odparí, pridá sa voda a vykoná sa extrakcia dietyléterom; fáza obsiahnutá v éteri sa vysuší pridaním bezvodého Na₂SO₄. Filtráciou a odparením rozpúšťadla sa získa 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón vo výťažku 25 %. Tento produkt sa potom chromatograficky prečistí v kolóne so silikagélom so zmesou dietyléter/metanol v pomere 98 : 2 ako eluentom a tým sa získa čistý 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón (fluoreskujúci na svetle s λ= 360 nm; 'H-NMR (CDC1³, 200 MHz) δ od 1,5 do 1,88 ppm (multiplet), 2,5 ppm (triplet), 3,6 ppm (triplet), od 7,35 do 8,25 ppm (aromatický H); MS m/e 248 M*).

Príklad 4

Príprava komplexu 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu s Fe(III)

3-Hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (7 mg; 0,04 mmol), pripravený, ako je opísané v príklade 1, sa rozpustí v acetóne (5 ml); k tomuto roztoku sa pri teplote miestnosti pridá chloristan železitý (7 mg, 0,02 mmol) a tým dôjde ku kvantitatívnej tvorbe komplexu chelatotvomé činidlo : Fe(III) v pomere 2:1. Odparením acetónu sa komplex izoluje ako tmavočervený práškovitý zvyšok, ktorý sa určí hmotnostnou spektroskopiou.

Kinetika tvorby komplexu sa ďalej študovala cyklickou voltametriou s Pd elektródou ako indikačnou elektródou a kalomelovou elektródou ako referenčnou elektródou v nasledujúcich podmienkach: chloristan železitý (7 mg) sa rozpustí v 20 ml 150 mM roztoku NaCl obsahujúceho 5 % DMSO a tento roztok sa vloží do voltametrickej komory s grafickým záznamom; zo získaného diagramu sa odvodí polvlnový potenciál železitej soli: (Ei/₂)s Fe³⁺/Fe²⁺ = 0,420 V.

3-Hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (10,5 mg) sa rozpustí v DMSO (3 ml) a takto získaný roztok sa štyrikrát pridá do voltametrickej komory a po každom prídavku sa zaznamená graf cyklickej voltametrie. Po prvom pridaní dávky 0,5 ml sa zaznamená diagram, z ktorého sa získa polvlnový potenciál komplexu: ((E_1/2)s Fe³⁺/Fe²⁺ = 0,120 V. Potom sa postupne pridá 0,5 ml (druhý prídavok), 1 ml (tretí prídavok) a 1 ml (štvrtý prídavok) roztoku chelatotvomého činidla v DMSO. Po treťom prídavku zmizne oxidačná vlna Fe³⁺/Fe²⁺, čím sa dokazuje, že po dosiahnutí molámeho pomeru chelatotvomé činidlo/kov 2 : 1 už v roztoku nie je žiadne voľné železo.

Konštanta stability komplexu sa vypočíta podľa nasledujúceho vzorca:

0,059 0,059 (E_1/2)s - (E_1/2)c =----------log β +----------p log c, n n kde (Ei_/2)s a (E_1/2)c sú polvlnový potenciál soli respektíve spomínaného komplexu, n je počet elektrónov, β je konštanta stability komplexu, c je jeho koncentrácia a p je počet molekúl chelatotvomého činidla v komplexe. Takto vypočítaná konštanta stability je 3,0 x 10¹⁰.

Príklad 5

Príprava komplexu 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu s Fe(III)

Komplex 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu s Fe(III), získaný ako v príklade 3, sa pripravuje obdobným spôsobom, ako je opísaný v príklade 4 (MS m/e 549 M*. Svedčí to o tvorbe neutrálneho komplexu s pomerom chelatotvomé činidlo/Fe(III) 2 : 1, v ktorom sú tri zo štyroch oxyhydrylových skupín chelatačného činidla v komplexe depretonované.

Príklad 6

Test medzifázového rozdelenia 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu so železom

Pre 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón a jeho komplex s Fe(III) sa stanovil spektrofotometricky a pri teplote miestnosti rozdeľovači koeficient medzi n-oktanolom a vodným roztokom 20 mM tris(hydroxymetyl)aminometánu s pH upraveným na 7,4 fosforečnanom sodným.

3-Hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón získaný, ako je uvedené v príklade 1, vo vodnom roztoku sa rozpustil v množstve potrebnom na dosiahnutie koncentrácie 10’⁴ M. 5 ml uvedeného roztoku sa odstreďovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniknuté dve fázy sa oddelili na spektrofotometrické stanovenie koncentrácie v každej z nich.

Výsledný rozdeľovači koeficient, vyjadrený ako pomer medzi koncentráciou zlúčeniny v n-oktanole a jej koncentráciou vo vodnom roztoku, bol 24. V uvedenom vodnom roztoku (v množstve potrebnom na dosiahnutie koncentrácie 2 x 10'⁴ M) sa rozpustil komplex s Fe(III) získaný v príklade 4,5 ml uvedeného roztoku sa odstred’ovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniknuté dve fázy sa oddelili na spektrofotometrické stanovenie koncentrácie v každej z nich. Rozdeľovači koeficient bol 25.

Príklad 7

Rozdeľovacie charakteristiky 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu so železom

Spôsobom opísaným v príklade 6 sa stanovili spektrofotometricky a pri teplote miestnosti rozdeľovacie údaje pre 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón pripravený ako v príklade 3 a pre jeho komplex s Fe(III) pripravený ako v príklade 5 medzi n-oktanolom a vodným roztokom 20 mM tris(hydroxymetyljaminometánhydrochloridu s pH upraveným na 7,4 fosforečnanom sodným.

Vo vodnom roztoku sa rozpustil 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón pripravený ako v príklade 3 tak, aby výsledná koncentrácia bola 100 mM. 5 ml uvedeného roztoku sa odstred’ovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniknuté dve fázy, vodná a organická, sa oddelili na spektrofotometrické stanovenie koncentrácie v každej z nich.

Ten istý pokus sa opakoval rozpustením v opísanom vodnom roztoku komplexu pripraveného v príklade 5 s Fe(III). V obidvoch prípadoch zlúčenina kvantitatívne prechádza do alkoholovej fázy.

Príklad 8

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu s Fe(III) do erytrocytov in vitro

Roztoky 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu pripravené ako uvedené v príklade 1 a jeho komplex s Fe(III) získaný v acetóne ako v príklade 4 sa použili na odoberanie vhodných vzoriek do inkubačnej banky. V prípade komplexu sa odparil acetón a ku zvyšku sa potom pridali biologické vzorky. Celá krv krysy zbavená leukocytov alebo alternatívne erytrocytov, premytá a resuspendovaná v 127 mM 50 % pufra fosforečnanu sodného (pH = 7,4) a obsahujúca 23 mM NaCl, sa pridala do inkubačných baniek a pri 37 °C sa inkubovala 15 respektíve 30 minút.

Potom sa erytrocyty oddelili odstredením a oddelene extrahovali spoločne so supematantnou frakciou 2 objemami etylacetátu. Príslušné množstvá skúšaných látok sa merali spektrofotometricky v etylacetáte a porovnali s vhodnými štandardami. Po 30 minútach inkubácie sa 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón a jeho komplex s Fe(III) našiel v erytrocytoch v množstve 51 % a vo vodnom prostredí v množstve 49 %. Po 30 minútach inkubácie sa 50 % usadených erytrocytov resuspendovalo v ich čerstvej plazme a zvyšných 50 % v čerstvom pufri.

Po ďalších 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón a jeho komplex zhodne distribuovali v erytrocytoch vopred preťažených železom a vo vodnom médiu, v ktorom boli resuspendované, čím sa dokázalo, že tieto zlúčeniny sú distribuované prakticky zhodne v intracelulámom ako v extracelulárnom prostredí, a že pokiaľ ide o erytrocyty, rovnováha sa docieľuje približne za 30 minút.

Príklad 9

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu s Fe(III) do erytrocytov in vitro

Erytrocyty krýs sa oddelili od ich plazmy zbavenej leukocytov. Časť erytrocytov sa resuspendovala v 50 % pufri fosforečnanu sodného (pH = 7,4) a druhá časť erytrocytov sa spojila s časťou ich plazmy tak, aby sa získal 50 % hematokrit. K obidvom suspenziám sa alternatívne pridalo 100 mg/1 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu pripraveného ako v príklade 3 a 50 mg/1 jeho komplexu pripraveného ako v príklade 5, načo nasledovala inkubácia pri 37 °C. Po 30 minútach sa erytrocyty oddelili odstredením a oddelene extrahovali spoločne so supematantnou frakciou etylacetátom. Množstvo skúšanej látky sa meralo spektrofotometriou v etylacetáte a porovnávalo s vhodnými štandardami.

Po 30 minútach inkubácie sa 40 % 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu rovnako ako jeho komplexu so železitým iónom našlo v erytrocytoch a zvyšných 60 % v médiu predstavovanom plazmou. Keď bol médiom fosfátový pufer, bolo nájdené v erytrocytoch 60 % skúšaných zlúčenín a zvyšných 40 % v médiu.

Po sedimentácii sa 50 % erytrocytov obsahujúcich skúšané zlúčeniny resuspendovalo v ich plazme a zvyšujúcich 50 % v čerstvom pufri. Po ďalších 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa 60 % 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu našlo v plazme a zvyšných 40 % vo vodnom médiu obsahujúcom fosfátový pufer.

Z toho plynie, že chelatotvomé činidlo rovnako ako príslušný komplex s trojmocným železom prenikajú bunkovými membránami obidvoma smermi a sú rovnomerne distribuované v intracelulámom aj extracelulámom prostredí.

Príklad 10

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu do erytrocytov krýs in vivo

Skúšky sa vykonávali s krysími samcami Sprague-Dawley hmotnosti 250 až 300 g.

Chelatotvomé činidlo 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón pripravené ako uvedené v príklade 1 s 4 dielmi |3-cyklodextrinu vo funkcii vehikula na jeden diel chelatotvomého činidla sa podáva krysám v jedinej orálnej dávke obsahujúcej 20 mg chelatotvomého činidla na kg telesnej hmotnosti. Prítomnosť chelatotvorného činidla v krysách sa spektrofotometricky a fluorimetricky vyhodnocuje v pravidelných časových odstupoch po 1/2 hodine, 1 hodine, 4 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách od okamihu podania: 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón sa v erytrocytoch v mozgu a v pečeni nachádza už za hodinu a maximum vykazuje za štyri hodiny a v moči začiatkom dvadsiatou štvrtou hodinou.

Príklad 11

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu do erytrocytov krýs in vivo

Chelatotvomé činidlo 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón pripravené ako uvedené v príklade 3 sa podáva krysám v jedinej orálnej dávke obsahujúcej 2 % metylcelulózy a 20 mg chelatotvomého činidla na kg telesnej hmotnosti. Prítomnosť 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu sa zisťovala v moči po 12 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách po podaní. Keď sa 20 mg 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu na kilogram telesnej hmotnosti podávalo v DMSO intraperitoneálne, bola jeho prítomnosť v plazme a erytrocytoch pozorovaná po 15, 30 a 60 minútach po liečbe.

V tabuľkách 1 a 2 sú uvedené výsledky kvalitatívnej detekcie 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu, resp. 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu v krysom tkanive a jeho vylučovanie.

Tabuľka 1. Kvalitatívna detekcia 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu v krysom tkanive a jeho vylučovanie ___________________________ _______________________

čas po podaní	plazma	erytrocyty	pečeň	mozog	moč	stolica
h	P(+)	P(±í	n	n	n	n
1 h	p(++)	P(++)	P(⁺)	p(+)	n	n
4h	P(++)	p(+++)	P(+++)	P(++)	P(⁺)	n
24 h	n	n	p(++)	p(++)	p(⁺⁺)	n
48 h	n	n	n	n	p(+++)	n

Tabuľka 2. Kvalitatívna detekcia 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu v krysom tkanive a jeho vylučovanie

čas po podaní	plazma	erytrocyty	pečeň	mozog	moč	stolica
Ľh	P(+)	p(⁺)	n	n	n	n
h	p(++)	p(++)	n	n	n	n
lh	p(++)	p(+++)	P(+)	n	n	n
4h	p(+++)	p(+++)	P(⁺⁺)	n	n	n
12 h	n	n	P(++)	P(+)	P(+)	n
24 h	n	n	p(+++)	P(⁺)	p(+++)	n
48 h	n	n	n	n	p(+++)	n

p prítomný n neprítomný + semikvantitatívna hodnota

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutické kompozície, vyznačujúce sa tým, že zahrnujú ako účinnú zložku aspoň jednu zlúčeninu vzorca (I) v ktorom:

R₃ O ^{1 11}

R, je -CH-C-CH2-R4, pričom R₃ a R4 je vybrané z H a OH, za predpokladu, že R₃ a R4 nie sú súčasne H a R₂ je H, alebo

OHR_S

I I

R, a R₂ tvoria dohromady -C=C-, pričom R₅ je zvolené z CH₃ a (CH₂)₅OH, alebo jej komplex so železom.
2. Farmaceutické kompozície, vyznačujúce sa tým, že zahrnujú ako účinnú zložku komplex železa a zlúčeniny vzorca (I), kde R₅ je CH₃.
3. Farmaceutické kompozície podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že ďalej zahrnujú farmaceutický prijateľné excipienty a/alebo riedidlá.
4. Použitie zlúčenín vzorca (I) v ktorom:

R₃ O

R] je -CH-C-CH₂-R4, pričom R₃ a R4 je zvolené z H a OH, za predpokladu, že R₃ a R4 nie sú súčasne H a R₂ je H, alebo

OHR₅

I I

Ri a R₂ tvoria dohromady -C=C-, pričom R₅ je zvolené z CH₃ a (CH₂)₅OH, na prípravu farmaceutických kompozícií vhodných na liečbu stavov, s ktorými je spojené preťaženie železom.
5. Použitie podľa nároku 4, kde stavy, s ktorými je spojené preťaženie železom, zahrnujú hemochromatózu, talasémiu, anémiu spojenú s preťažením železom a stavy spojené so sekundárnou siderózou, neurodegeneratívne ochorenia, zahrnujúce Parkinsonovu a Alzheimerovu chorobu, ischemickú kardiopatiu, zápalové ochorenie zahrnujúce artritídu, pyelonefritídu a chronické zápalové črevné choroby, zmeny metabolizmu železa spojené s infekciami HIV, kardiotoxicitu spôsobenú doxorubicínom a antracyklínmi, aterosklerózu a starnutie.
6. Komplexy zlúčenín vzorca (I) podľa nároku 4 so železom.
7. Komplexy so železom podľa nároku 6, kde molárny pomer zlúčeniny vzorca (I) a železa je 2 : 1.
8. Komplexy so železom podľa nárokov 6 a 7, kde železo je Fe(III).
9. Použitie komplexov so železom podľa nárokov 6 až 8 na prípravu farmaceutických kompozícií, vhodných na liečbu stavov, s ktorými je spojený nedostatok železa.
10. Použitie podľa nároku 9, kde stavy, s ktorými je spojený nedostatok železa, zahrnujú sideropenickú anémiu v akútnej fáze a chronickú sideropenickú anémiu.
11. Zlúčeniny vzorca (I)