CZ299542B6

CZ299542B6 - Aromatické deriváty a jejich komplexy se železem jako cinidla pro normalizaci hladiny železa

Info

Publication number: CZ299542B6
Application number: CZ20011461A
Authority: CZ
Inventors: Napoli@Guido Di
Original assignee: Laboratoire Medidom S. A.
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2008-08-27
Also published as: AU756726B2; US6455578B1; DE69904635T2; IL142813A0; ITMI982350A1; JP2002528539A; AR021037A1; CZ20011461A3; ATE229947T1; DK1124814T3; DE69904635D1; SK286308B6; CA2348380C; IT1303688B1; PL347940A1; IL142813A; PL198826B1; ES2189537T3; WO2000026205A1; BR9914863A

Abstract

Rešení se zameruje na aromatické deriváty vzorce I, kde: R.sub.1.n. je (a), pricemž R.sub.3.n. a R.sub.4.n. se zvolí mezi H a OH, za predpokladu, že R.sub.3.n. a R.sub.4.n. nejsou soucasne H, a R.sub.2.n. je H; nebo R.sub.1.n. a R.sub.2.n. tvorí dohromady (b), pricemž R.sub.5.n. se vybere z CH.sub.3.n. a (CH.sub.2.n.).sub.5.n.OH; dále se zameruje na jejich komplexy se železem a na jejich použití pro prípravu farmaceutických kompozic pro normalizaci koncentrace železa v organismu.

Description

Aromatické deriváty a jejich komplexy se železem jako činidla pro normalizaci hladiny železa

Oblast techniky

Tento vynález se týká aromatických derivátů vzorce I popisovaných v dalším a jejich komplexů se železem pro přípravu farmaceutických kompozic použitelných jako činidla pro normalizaci hladiny železa.

Dosavadní stav techniky

Přetížení organismu železem v důsledku větších poruch v metabolismu železa jako genetická hemochromatóza a talasémie, nebo v důsledku méně významných příčin jako například transfúzí při hemolytické anémii může vést k nadměrné fyziologické obranné reakci a v důsledku toho mít toxický účinek.

Takový výsledek je způsoben zvětšením volného železa vyvolávajícího vznik enzymů, za modifikace membránových lipidů, za změny DNA apod. (E. Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 1989, sv. 58, str. 79-110).

Proto mohou následky zvětšení hotovosti volného železa sahat od genotoxicity tohoto kovu vedoucí k vývoji nádorů až k různým chorobným stavům orgánů jako je cirhóza, diabetes, kardiopatie, hypogonadismus a artropatie.

Ke zvětšení hotovosti volného železa může dojít i když hodnota veškerého železa v organismu nevzroste, a to v souvislosti s mnoha patologickými stavy jako jsou například neurodegeneratívní poruchy (M. Gassen a další, Pharmacol. Toxicol., 1997, sv. 80 (4), str. 159-166), atheroskleróza (A.J.Matthews a další, J.Surg.Res., 1997, sv. 73 (1), str. 35^40,) ischemická kardiopatie (T.P.Tuomainen a další, Circulation, 1998, sv. 97 (15), str. 1461-1466, chronické střevní choroby (R.A.Floyd a další, Dig. Dis. Sci., X. 1996, sv. 41 (10), str. 2078-2086) a může zavinit vývoj patobiologického případu.

Nejnověji byly zjištěny přímé vazby mezi změnami metabolismu železa a infekcemi HIV (J.R.Boelaert a další, Infect. Agents Dis. I. 1996, sv. 5 (1), str. 36^16) stejně jako spojení mezi kardiotoxicitou vyvolanou železem a metabolismem antineoplastických činidel u osob, jež se podrobily protinádorové léčbě (G.Minottiny a další, J.Clin.Invest., IV. 1995, sv. 95 (4), str. 1595— 1605).

Navíc se prokázalo, že přítomnost „volného železa“ má rozhodující roli v reakcích vedoucího k tvorbě volných radikálů, s nimiž se spojují například zánětlivá onemocněními jako je artritida a pyelonefritida (R.Gupta a další, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1997, sv. 20 (4), str. 299-307) a senescence (M.C.Corti a další, Am.J.Cardiol., 1997, sv. 79 (2), str. 120-127).

Dnes je známo použití činidel tvořících cheláty se železem při léčbě systémového přetížení železem spojeného s chorobnými stavy jako je talasémie nebo hemochromatóza.

Sloučeniny používané při těchto léčbách vykazují několik závažných nedostatků. Například desferrioxamin, jedna ze sloučenin častěji používaných při tomto typu léčby, váže kromě železa mnoho jiných důležitých kovů jako je hliník; je to velmi drahý výrobek, který nelze podávat orálně a má tak krátký poločas , že při subdermální infúzi je nutné nepřetržité podávání (R.J.Rotkman a další, Mol.Pharmacol., 1992, sv. 42, str. 703-710).

Jsou známy další léky obsahující komplexotvomá činidla pro železo jako například deferiprone a jeho deriváty, které se vyznačují velkou biologickou dosažitelností, ale také velkou toxicitou

-1 CZ 299542 způsobenou právě jejich biologickou dosažitelností, jež vede k vypuknutí chorob jako je například agranulocytémie, epatická fibróza apod. (N.F.Oliviery a další, N.Engl.J.Med., 1998, sv. 339 (7), str. 417-423).

Kromě toho dosud používané léky mají dramatický účinek na buněčný metabolismus železa, který uvádějí do hluboké nerovnováhy; stahují totiž značná množství kovu z míst, v nichž jsou v organismu deponována, a proto je nelze podávat ani v prekox fázích ani v rámci profylaxe při hemochromatóze nebo talasémii, ani v podmínkách, v nichž by se zabránilo kolísání množství funkčního železa uloženého v depozitech.

Proto se hluboce pociťuje potřeba nových sloučenin vhodných pro přípravu farmaceutických kompozic schopných působit jako chelatotvomá činidla pro veškeré železo stejně jako pro hotovost volného železa, odstraňovat je z buněk a eliminovat výsledný komplex v moči.

Podobně se hluboce pociťuje potřeba nových farmaceutických kompozic pro léčbu chorob, spojených s nedostatkem železa v organismu.

Podstata vynálezu

Přihlašovatel s překvapením zjistil, že aromatické deriváty vzorce (I):

kde

R₃ O I

Ri 3 ® CH C CH₂ R4, přičemž význam R3 a R4 je zvolen z H a OH, za předpokladu, že R₃ a R4 nejsou současně H, a R₂ je H, nebo

OH R₅

Ri a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž význam R₅ je zvolen z CH₃ a (CH₂)₅OH, jsou schopny stabilně vázat železo, zvláště Fe(III).

Benzoyl- nebo benzopyranonové deriváty vzorce (I) jsou vhodné pro přípravu farmaceutických kompozic pro perorální aplikaci a vykazují vysokou absorpci a vysokou schopnost pronikat biologickými membránami ve formě volných ligandů i jako komplexy se železem.

Uvedené farmaceutické kompozice jsou proto použitelné při léčbě všech patologických stavů vzniklých přetížením železem, při vzrůstu veškerého železa stejně jako v případě relativního vzrůstu koncentrace železa v důsledku vzrůstu hotovosti volného železa.

Komplexy sloučenin vzorce (I) se železem se též mohou použít při přípravě farmaceutických kompozic použitelných při léčbě chorob spojených s deficitem železa, a to v akutní fázi stejně jako při chronickém onemocnění.

-2CZ 299542

Proto jsou jedním z cílů tohoto vynálezu sloučeniny vzorce (I) pro přípravu farmaceutických kompozic pro použití zvláště jako chelatotvomá činidla pro železo a jejich komplexy použitelné jako činidla pro uvolnění železa při hypoferrémii.

Dalším cílem tohoto vynálezu jsou benzoyl-nebo benzopyranonové deriváty vzorce (I), kde R₃ 0

Ri je CH C CH2 R4, přičemž R₃ je OH a R₄ je H, OH a R₂ je H;

OH R₅ nebo Rj a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž R₅ je (CH₂)₅OH.

Znaky a přednosti sloučenin podle vzorce I jako chelatotvomých činidel pro železo a komplexů železa podle tohoto vynálezu se podrobně popíší v následujícím popisu.

Tento vynález se týká sloučenin s vzorcem I uvedeným výše pro přípravu farmaceutických sloučenin, zvláště farmaceutických sloučenin použitelných jako chelatotvomá činidla železa. Komplexy sloučenin podle tohoto vzorce I mají rovněž terapeutické použití jako činidla pro uvolňování železa.

Sloučeniny podle vzorce I, jež lze snadno připravit způsoby známými v oboru, vykazují vysokou afinitu k železu, zvláště pro Fe(III), a vytvářejí stabilní komplexy s tímto kovem při různých poměrech kov/ligand.

Pokud jde o přípravu uvedených komplexů, typicky se připravují reakcí sloučeniny vzorce I s (FelII) ionty zželezitých solí zvolených ze skupiny sestávající z anorganických solí Fe(III), zejména chloristanu, chloridu a síranu, ale zvláště chloristanu.

Tato reakce se provádí v rozpouštědle vybraném ze skupiny, kterou tvoří aceton, chloroform, dichlormethan a vodné roztoky obsahující 5 až 10 % dimethylsulfoxidu, výhodně v acetonu.

Se sloučeninami vzorce I, kde

OH R₅

Ri a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž R₅ je zvoleno z CH₃ a (CH₂)₅OH, byly prováděny experimenty s chelatací železa a zjistilo se, že vytvářejí komplex s Fe(IlI) při molámím poměru ligand/kov 2:1.

Příprava tohoto komplexu se výhodně provádí při teplotě místnosti reakcí sloučeniny vzorce I s chloristanem železitým v acetonu.

Konstanta stability komplexu trojmocného železa se sloučeninou vzorce I kde OH R₅

Ri a R₂ tvoří dohromady — C = C — ,kde R₅ je CH₃, se měřila voltmetricky s Pt elektrodou jako indikační elektrodou a s kalomelovou elektrodou jako referenční elektrodou a získala se hodnota konstanty stability 3,0 χ ÍO¹⁰.

Obdobné zkoušky s chelatací a s měřením konstant stability těchto komplexů se prováděly s jinými sloučeninami vzorce I a získaly se obdobné výsledky.

-3CZ 299542

Schopnost sloučenin podle vzorce I ajejich komplexů s železem pronikat biologickými membránami se zjišťovala testy mezifázového rozdělení mezi n-oktanolem a vodným roztokem uvedených sloučenin, jež prokázaly jejich větší afinitu k organickým rozpouštědlům.

Testy mezifázového rozdělení se zejména prováděli mezi n-oktanolem a vodným roztokem 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridu, upraveným na pH 7,4 přídavkem fosforečnanu sodného, a získaly se hodnoty rozdělovacího koeficientu vyjádřené jako poměr mezi koncentrací sloučeniny v organické fázi a koncentrací ve vodné fázi, který měl pro tyto sloučeniny podle vzorce I stejně jako pro jejich komplexy s Fe(III) typickou hodnotu vyšší než 20.

Sloučeniny podle vzorce I a jejich komplexy se železem podle tohoto vynálezu se mohou formulovat s farmaceuticky přijatelnými excipienty a/nebo ředidly s cílem připravit farmaceutické kompozice pro léčbu chorob charakterizovaných přetížením železem nebo naopak deficitem železa v lidském organismu.

Jako ředidlo se například může použít dimetyhsulfoxid a příklady možných přísad jsou methylcelulóza, β-cyklodextriny a polyethylenglykol.

Koncentrace sloučeniny podle tohoto vzorce I nebo odpovídajících komplexů se železem ve farmaceutických kompozicích je v rozmezí 0,4 až 0,8 % hmotnostních z celkové hmotnosti kompozice.

Uvedené kompozice obsahující sloučeniny podle vzorce I jsou účinné jako chelatotvomá činidla pro železo při léčbě systémového přetížení železem, jako je tomu v případě talasémie a hemochromatózy, stejně jako při léčbě růstu hotovosti volného železa.

Farmaceutické kompozice obsahují sloučeniny podle vzorce I podle tohoto vynálezu jsou proto použitelné při léčbě některých chorob které souvisejí s přetížením organismu železem jako je hemochromatóza, talasémie, anémie spojená s přetížením železem a stavy spojené se sekundární siderózou, neurodegenerativní onemocnění jako je Parkínsonova nebo Alzheimerova nemoc, ischemická kardiopatie, chronická zánětlivá onemocnění jako je artritida, pyelonefritida a chronické zánětlivé střevní choroby, změny metabolismu železa spojené s infekcemi HIV, kardiotoxicita způsobená doxorubicinem a antracykliny, ateroskleróza a stárnutí.

Farmaceutické kompozice obsahují komplexy sloučenin podle vzorce I se železem jsou použitelné při léčbě chorob, spojených s deficitem železa v organismu včetně sideropenické anémie v akutní fázi i v chronické formě.

Následující příklady jsou nelimitující ilustracemi tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava 3-hydro xy-2methy 1-4 Η— 1-benzopyran-4onu

OH R₅ (Sloučenina vzorce (I) v níž R, a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž R₅ je CH₃.)

2-hydroxyacetofenon (20 g) se rozpustí v ethylacetátu (200 ml). V průběhu 15 až 20 minut se postupně přidává práškový sodík (16 g) rychlostí umožňující přiměřený reflux. Směs se zahřívá pod zpětným chladičem 1 hodinu, potom se ochladí. Pak se přidá drcený led (200 g) do vysrážení sodné soli acetylacetofenonu, která se pak oddělí vakuovou filtrací. Pevný produkt se pak

-4CZ 299542 krystalizuje z 40% kyseliny octové (200 ml), čímž se získá acetylacetofenon (19,6 g) jako práškové krystaly (teplota tání 95 °C, výtěžek 75 %).

K takto získanému acetylacetofenonu (15 g) se přidá koncentrovaná kyselina sírová (30 g).Po ochlazení na teplotu místnosti se přidá voda do vysražení bílého prášku, který se izoluje vakuovou filtrací a promyje studenou vodou. Získá se 2-methyl-4H-l-benzopyran-4-on (10 g) s teplotou tání 71 °C při výtěžku 74 %.

V benzenu (15 ml) se ve vhodné hydrogenační baňce suspenduje Pd na CaCo₃ (1,6 g). K aktivaci ío katalyzátoru dochází absorpcí H₂ při pokojové teplotě, potom se přidá 2-methyMH-l-benzopyran-4-on (1,6 g) rozpuštěný v benzenu (15 ml). Katalyzátor se ponechá, aby absorboval asi

200 ml H₂ při tlaku a teplotě místnosti. Po filtraci a odpaření benzenu se získá bleděžlutá olejovitá kapalina, kníž se přidá malý objem směsi petroléter/ethyléter v poměru 1:1. Získaný roztok se přečistí chromatograficky v koloně naplněné silikagelem (600 až 200 mesh) s výše uvedenou směsí jako eluentem. Získá se 0,9 g přečištěného a vysušeného produktu (výtěžek 60 %); uvedený produkt je bezbarvý olej sloučeniny 2,3-dihydro-2methyl-4H-l-benzopyran4-on. 2,3-dyhydro-2-methyl-4H-l-benzopyran^l-on (1,62 g) se rozpustí v 95% ethanolu (50 ml) a roztok se za míchání refluxuje. V průběhu 10 až 15 minut se po kapkách přidá isoamylnitrit (8 ml) a koncentrovaná HCI (40 ml). Zahřívání a míchání se zastaví a výsledná směs se nechá 2 hodiny stát. Pak se přidá voda (200 ml) do vysražení bílé pevné látky. Rozpouštědlo se odpaří a získá se pevný produkt, který se rozpustí v malém objemu chloroformu a přečistí na silikagelu v rovnováze s tímtéž rozpouštědlem. Přečištěný produkt obsahuje nízké procento žlutých nečistot, jež se zcela odstraní překrystalováním z acetonu. Pal se oddělí zbytky rozpouštědla a získá se 0,97 g 3-hydroxy-2-methyl-4H-l-benzopyran-4-onu jako bezbarvé krystaly s teplotou 179 až 180 °C; IR: 1635, 1666 e 3301 cm'¹; výtěžek = 51 %.)

Příklad 2

Příprava 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benopyran—4-onu

OH R₅ (Sloučenina vzorce (I), v níž R] a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž R₅ je (CH₂)₅OH)

Do reaktoru se uvede 2-hydroxyacetofenon (13,6 g) a toluen (200 ml). Postupně se za míchání přidává hrubě zrněný sodík (4,4 g) tak aby se udržel mírný reflux. Po ukončení reakce se přidá ethyl-6-hydroxykapronát (28 g) a směs se nechá za míchání reagovat při mírném refluxu 2 hodiny; vznik produktu se kontroluje chromatografií TLC se směsí diethyléter/petroléter 9:1. Po ochlazení se provede vakuová filtrace a pevný produkt se promyje diethyleterem.

Potom se pevný produkt opět rozpustí v 40% kyselině octové (100 ml) a k takto získanému roztoku se postupně přidává NaHCO₃ do neutrální reakce. Potom se roztok vlije do separační nálevky a provedou se tři extrakce diethyleterem (každá se 100 ml rozpouštědla). Fáze obsažené v éteru ze všech extrakcí se spojí a vysuší přídavkem bezvodého Na₂SO₄; po přidání vysoušedla se suspenze 5 minut míchá a pak se sfiltruje. Rozpouštědlo se odpaří a získá se olej, který se chromatograficky přečistí na silikagenu a elučním činidlem diethyléter/petroléter v poměru 9:1.

Získá se l-(2-hydroxyfenyl)-l,3-[3-(5-hydroxypentil) ] butadion (8 g).

K získanému produktu (8 g) se přidá 96% H₂SO₄ (16 g) a směs se nechá několik minut z míchání reagovat. Po ochlazení na pokojovou teplotu se přidá voda, potom se postupně přidává NaHCO₃za účelem neutralizace kyseliny sírové. Následují tři extrakce diethyléterem (150 ml). Výsledné tři fáze obsažené v éteru se spojí a vysuší přidáním Na₂SO₄ Po filtraci a odpaření rozpouštědla se získá olej, který je v dalším chromatolograficky přečištěn v koloně obsahující silikagen se směsí

-5CZ 299542 ethyléter/aceton v poměru 80:20 jako eluentem. Získá se 0,74 g 2-(5-hydroxypentyl)-4H-lbenzopyran-4-onu.

Ve vhodné hydrogenační baňce se suspenduje Pd na CaCO₃ v benzenu; katalyzátor se ponechá, 5 aby absorboval H₂ při pokojové teplotě a tlaku. Když katalyzátor přestane absorbovat H₂, přidá se

2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-on (0,74 g) rozpuštěný v benzenu a provede se hydrogenace; při teplotě a tlaku místnosti se absorbuje asi 100 ml H₂. Po asi 24 hodinách se provede filtrace a odpaří se benzen, čímž se získá olej, k němuž se přidá malé množství diethyléteru. Přečištění tohoto produktu se provede chromatograficky na silikagelu s diethylio éterem jako elučním činidlem. Získá se 0,23 g 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-onu.

0,23 g 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)XH-l-benzopyran-4-onu se rozpustí v 95% ethanolu (5 ml) a roztok se zahřívá pod zpětným chladičem za míchání. Potom se po kapkách přidají HCI 15 (6,2 ml) a isoamylnitrit (1,2 ml). Potom se míchání a zahřívání zastaví a reakční směs se nechá stát asi 1 hodinu. Rozpouštědlo se odpaří, přidá se voda a produkt se extrahuje diethyléterem.

Frakce obsažená v éteru se suší přídavkem bezvodého Na₂SO₄. Po filtraci a odpaření rozpouštědla se získá olej, který se chromatograficky přečistí na silikagelu se směsí diethyléter/methanol v poměru 98:2 jako eluentem. Získá se 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l20 benzopyran-4-on (99,2 mg). Produkt v krystalické formě se získá krystalizaci v cyklohexanu nebo diethyléteru (teplota tání 111 až 112 °C).

Příklad 3

Příprava 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)“4H-l-benzopyran-4-onu

OH R_s (Sloučenina vzorce (I), v níž R| a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž R₅ je (CH₂)₅OH)

Ethyl-6-hydroxykarponát (100 mmol) se za míchání rozpustí v 3,4-dihydropyranu (120 mmol); 30 potom se přidá p-toluensulfonová kyselina (15 mg) a směs se při teplotě místnosti nechá reagovat asi 1 hodinu. Konec reakce se ověří chromatografií TLC na silikagenu se směsí petroléter/diethyléter v poměru 1:1 jako eluentem za použití jodových par pro detekci. Po ukončení reakce se přidá zásaditý vodný roztok uhličitanu sodného a opatrně míchá. Produkt získaný v kvantitativním výtěžku se extrahuje diethyléterem.

Toluen (15 ml) vydestilovaný na sodíku se nalije na granulovaný sodík (300 mmol) a zahřívá se do refluxu. Po dosažení refluxu se ukončí zahřívání a přidá se po kapkách v průběhu 90 až 120 minut ethyl-6-hydroxykapronát (200 mmol), s hydroxylovou skupinou stále chráněnou, získaný jak výše popsáno, společně s 2-hydroxyacetofenonem (100 mmol) v toluenu (15 ml).

Směs se nechá reagovat 4 až 5 hodin a konec reakce se kontroluje chromatografií TLC na silikagelu se směsí petroléter/diethyléter v poměru 1:1 jako eluentem.

Po ukončení reakce se přidá ethanol pro odstranění nadbytku sodíku, potom se přidá 100 ml 7,5% octové kyseliny tak aby pH mělo hodnotu asi 10.

Kondenzační produkt s dosud chráněnou hydroxylovou skupinou se třikrát extrahuje diethyléterem a dvakrát ethylacetátem, čímž se získá produkt v 60% výtěžku.

Takto získaný produkt rozpuštěný v octové kyselině (2 ml) se umístí v reaktoru ponořeném 50 v olejové lázni, načež se jeho teplota asi 1 hodinun udržuje na 130 °C. Nejdříve probíhá destilace azeotropní směsi voda/octová kyselina, načež se nasadí vakuové čerpadlo pro intenzivnější oddestilování zbývající kyseliny octové.

-6CZ 299542

Cyklizace se ověřuje chromatografií TLC na silikagelu s diethyléterem jako eluentem. Na konci cyklizace se přidá směs kyselina octová/voda v poměru 4:1 (50 ml) a teplota se zvýší na 50 °C za míchání až do úplného odstranění chránící skupiny a získá se 2-(5-hydroxypentyl)-benzopyran5 4-on. Vznik tohoto produktu se ověří chromatografií TLC na silikagenu s diethyléterem obsahující 2 % methanolu jako elučním činidlem.

Získaný produkt se extrahuje diethyléterem po přidání vody, potom se odpaří rozpouštědlo a produkt se přečistí sloupcovou chromatografií s diethyléterem obsahující 2% methanolu jako ío eluentem, čímž se získá čistý 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-on v 50% výtěžku.

5% Pd na uhličitanu vápenatém (1 g) se vloží do 20 ml ethanolu a hydrogenuje. Jakmile katalyzátor přestane absorbovat H₂, přidá se roztok připravený rozpouštěním 2-(5-hydroxypentil)-4H-lbenzopyran-4-onu (4 g), získaného výše uvedeným způsobem, v ethanolu (40 ml) a provede se hydrogenace. Směs se nechá reagovat 4 až 5 hodin, pak se provede filtrace; reakční produkt se vysuší a znovu rozpustí v minimálním množství diethyéteru za účelem chromatografického přečištění na silikagelu s diethyléterem jako eluentem. Takto se získá 2,3-dihydro-2-(5hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-on v 50% výtěžku

Takto získaný produkt (1 mmol) se rozpustí v 95% ethanolu (5 ml) a roztok se reflexuje za míchání. K tomuto roztoku se po kapkách přidají HCI (6,5 ml) a isoamylnitrit (1,2 ml). Potom se zataví zahřívání a míchání a reakční směs se nechá 1 hodinu stát. Rozpouštědlo se odpaří, přidá se voda a provede se extrakce diethyléterem; fáze obsažená v éteru se vysuší přidáním bezvodého Na₂SO₄. Filtrací a odpařením rozpouštědla se získá 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l25 benzopyran-4-on ve výtěžku 25 %. Tento produkt se potom chromatograficky přečistí v koloně se silikagelem se směsí diethyéter/methanol v poměru 98:2 jako eluentem a tím se získá čistý

3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyI)-4H-l-benzopyran-4-on (fluoreskující na světle s λ = 360 nm; ¹ H-NMR (CDCfi, 200 MHz) δ od 1,5 do 1,88 ppm (multiplet), 2,5 ppm (triplet), 3,6 ppm (triplet), od 7,35 do 8, 25 ppm (aromatický H); MS m/e 248 M*).

Příklad 4

Příprava komplexu 3-hydroxy -2-methyl-4H-l-benzopyran^l-onu s Fe(III)

3-hydroxy-2-methyl^tH-l-benzopyran-4-on (7 mg; 0,04 mmol), připravený jak popsáno v příkladu 1, se rozpustí v acetonu (5 ml); k tomuto roztoku se při teplotě místnosti přidá chloristan železitý (7 mg, 0,02 mmol) a tím dojde ke kvantitativní tvorbě komplexu chelatotvomé činidlo : Fe(III) v poměru 2:1. Odpařením acetonu se komplex izoluje jako tmavě červený práškovitý zbytek, který se určí hmotovou spektroskopií.

Kinetika tvorby komplexu se dále studovala cyklickou voltametrií s PD elektrodou jako referenční elektrodou v následujících podmínkách: chloristan železitý (7 mg) se rozpustí ve 20 ml 150 mM roztoku NaCl obsahující 5 % DMSO a tento roztok se vloží do voltametrické komory s grafickým záznamem; ze získaného diagramu se odvodí půlvlnový potenciál železité soli: (E]/₂) s Fe³⁺/Fe²⁺ = 0,420 V.

3-hydroxy-2-methyl-4H-l-benzopyran-4-on (10,5 mg) se rozpustí v DMSO (3 ml) a takto získaný roztok se čtyřikrát přidá do voltametrické komory a po každém přídavku se zaznamená graf cyklické voltametrie. Po prvním přidání dávky 0,5 ml se zaznamená diagram, z něhož se získá půlvlnový potenciál komplexu: ((E_1/2) s Fe³⁺/Fe²⁺ = 0,120 V). Potom se postupně přidá 0,5 ml (druhý přídavek), 1 ml (třetí přídavek) a 1 ml (čtvrtý přídavek) roztoku chelatotvomého činidla v DMSO. Po třetím přídavku zmizí oxidační vlna Fe³⁺/Fe²⁺ , čímž se prokazuje, že po dosažení molámího poměru chelatotvomé činidlo/kov 2:1 už v roztoku není žádné volné železo.

-7CZ 299542

Konstanta stability komplexu se vypočítá podle následujícího vzorce:

0,059 0,059 (Ei_/2)s - (Ei_/2)c = - log β + - p log c η n kde (Ej/₂)s a (Ei_/2)c jsou půlvlnový potenciál soli respektive výše zmíněného komplexu, n je počet elektronů, β je konstanta stability komplexu, c je jeho koncentrace a p je počet molekul chelatotvomého činidla v komplexu. Takto vypočítaná konstanta stability je 3,0 χ 10¹⁰.

Příklad 5

Příklad komplexu 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzonpyran-4-onu s Fe(III)

Komplex 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzonpyran-4-onu s Fe(III), získaný jako v příkladu 3, se připravuje obdobným způsobem jak je popsáno v příkladu 4 (MS m/e 549 M*).

Svědčí to o tvorbě neurálního komplexu s poměrem chelatotvomé činidlo/Fe(III) 2:1, ve kterém jsou tři ze čtyř oxhydrylových skupin chelatačního činidla v komplexu deprotonovány.

Příklad 6

Test mezifázového rozdělení 3-hydroxy-2-methyMH-l-benzopyran-4-onu a jeho komplexu se železem

Pro 3-hydroxy-2-methyl-4H-l-benzopyran-4-on a jeho komplex s Fe(III) se stanovil spektrofotometricky a při teplotě místnosti rozdělovači koeficienty mezi n-oktanolem a vodným rozto25 kem 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethanu s pH upraveným na 7,4 fosforečnanem sodným.

3-hydroxy-2-methyl-4H-l-benzopyran^4-on získaný jak uvedeno v příkladu 1 ve vodném roztoku se rozpustil v množství potřebném pdo dosažení koncentrace 10⁴M. 5 ml uvedeného roztoku se odstřeďovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniklé dvě fáze se oddělili pro spektrofotometrické stanovení koncentrace v každém z nich.

Výsledný rozdělovači koeficient, vyjádřený jako poměr mezi koncentrací sloučeniny n-oktanolu a její koncentrací ve vodném roztoku, byl 24. Ve výše uvedeném vodném roztoku (v množství potřebném pro dosažení koncentrace 2x10'⁴ M.) se rozpustil komplex s Fe(III) získaný v příkladu

4. 5 ml uvedeného roztoku se odstřeďovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniklé dvě fáze se oddělily pro spektrofotometrické stanovení koncentrace v každém z nich. Rozdělovači koeficient byl 25.

Příklad 7

Rozdělovači charakteristiky 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-benzopyran-4-onu a jeho komplexi s železem

Způsobem popsaným v příkladu 6 se stanovily spektrofotometricky a při teplotě místnosti rozdělovači údaje pro 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-benzopyran-4-on připravený jako v pří45 kladu 3 a pro jeho komplex s Fe(IIl) připravený jako v příkladu 5 mezi n-oktanolem a vodným roztokem 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridu s pH upraveným na 7,4 fosforečnanem sodným.

Ve vodném roztoku se rozpustil 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentil)-4H-benzopyran-4-on připra50 vený jako v příkladu 3 tak, aby výsledná koncentrace byla 100 mM. 5 ml uvedeného roztoku se

-8CZ 299542 odstraňovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniklé dvě fáze, vodná a organická, se oddělily pro spektrofotometrické stanovení koncentrace v každé z nich.

Tentýž pokus se opakoval rozpuštěním ve výše popsaném vodném roztoku komplexu připrave5 ného v příkladu 5 s Fe(III). V obou případech sloučenina kvantitativně přechází do alkoholové fáze.

Příklad 8 ío Zkoušky pronikání 3-hydroxy-2-methyl-4H-1-benzopyran-4-onu ajeho komplexu s Fe(III) do erytrocytů in vitro

Roztoky 3-hydroxy-2-methyMH-l-benzopyran^4-onu připravené jak uvedeno v příkladu 1 a jeho komplex s Fe(III) získaný v acetonu jako v příkladu 4 se použily pro odebírání vhodných vzorků do inkubační baňky. V případě komplexu se odpařil aceton a ke zbytku se pak přidaly biologické vzorky. Celá krev krysy zbavená leukocytů nebo alternativně erytrocytů, promytá a resuspendovaná ve 127 mM 50% pufru fosforečnanu sodného (pH = 7,4) a obsahující 23 mM NaCl, se přidala do inkubačních baňek a při 37 °C se inkubovala 15 respektive 30 minut.

Potom se erytrocyty oddělily odstředěním a odděleně extrahovaly společně se supematantní frakcí 2 objemy ethylacetátu. Příslušná množství zkoušených látek se měřila spektrofotometricky v ethylacetátu a srovnala s vhodnými standarty. Po 30 minutách inkubace se 3-hydroxy-2methyl-4H-l-benzopyran^F-on ajeho komplex s Fe(III) nalezl v erytrocytech v množství 51 % a ve vodném prostředí v množství 49 %. Po 30 minutách inkubace se 50 % usazených erytrocytů resuspendovalo v jejich čerstvém plazmatu a zbývajících 50 % v čerstvém pufru.

Po dalších 30 minutách inkubace při 37 °C se 3-hydroxy-2-methyl-4H-benzopyran^l-on ajeho komplex shodně distribuovaly v erytrocytech předem přetížených železem a ve vodném médiu v němž byly resuspendovány, čímž se prokázalo, že tyto sloučeniny jsou distribuovány prakticky shodně v intracelulámím jako v extracelulámím prostředí, a že pokud jde o erytrocyty, rovnováhy se dociluje přibližně za 30 minut.

Příklad 9

Zkoušky pronikání 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-onu ajeho komplexu s Fe(III) do erytrocytů in vitro

Erytrocyty krysy se oddělily od jejich plazmatu zbavených leukocytů. Část erytrocytů se resuspendovalo v 50% pufru fosforečnanu sodného (pH = 7,4) a druhá část erytrocytů se spojilo s částí jejich plazmatu tak, aby se získal 50% hematokrit. K oběma suspenzím se alternativně přidalo 100mg/l 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-onu připravovaného jako v příkladu 3 a 50 mg/1 jeho komplexu připravovaného jako v příkladu 5, načež následovala inkubace při 37 °C. Po 30 minutách se erytrocyty oddělily odstředěním a odděleně extrahovaly společně se supematantní frakcí ethylacetátem. Množství zkušené látky se měřila spektrofoto45 metrií v ethylacetátu a srovnala s vhodnými standardy.

Po 30 minutách inkubace se 40 % 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-onu stejně jako jeho komplexu s železitým iontem nalezlo v erytrocytech a zbylých 60 % v médiu představovaném plazmatem. Když byl médiem fosfátový pufr, bylo nalezeno v erytrocytech

60 % zkoušených sloučenin a zbylých 40 % v médiu.

Po sedimentaci se 50 % erytrocytů obsahujících zkoušené sloučeniny resuspendovalo vjejich plazmatu a zbývajících 50 % v čerstvém pufru. Po dalších 30 minutách inkubace při 37 °C se

-9CZ 299542 % 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran^4-onu a jeho komplexu nalezlo v plazmatu a zbylých 40 % ve vodném médiu obsahujícím fosfátový pufr.

Z toho plyne, že chelatotvomé činidlo stejně jako příslušný komplex s trojmocným železem pronikají buněčnými membránami oběma směry a jsou rovnoměrně distribuovány v intracelulámím i extracelulámím prostředí.

Příklad 10 ío Zkoušky pronikání 3-hydroxy-2-methyl-4H-l-benzopyran-4-onu do erytrocytů krys in vivo Zkoušky se prováděly s krysími samci Sprague-Dawley hmotnosti 250 až 300 g.

Chelatotvomé činidlo 3-hydroxy-2-methyl^lH-l-benzopyran-4-on připravené jak uvedeno v příkladu 1 s 4 díly β-cyklodextrinu ve funkci vehikula najeden díl chelatotvomého činidla se podává krysám v jediné orální dávce obsahující 20 mg chelatotvomého činidla na kg tělesné hmotnosti. Přítomnost chelatotvomého činidla v krysách se spektrofotometricky a fluorimetricky vyhodnocuje v pravidelných časových odstupech po 1/2 hodině, 1 hodině, 4 hodinách, 24 hodinách, 48 hodinách od okamžiku podání: 3-hydroxy-2-methyl^lH-l-benzopyranM-on se v ery20 trocytech v mozku a v játrech nalézá již za hodinu a maximum vykazuje za čtyři hodiny a v moči počínaje dvacátoučtvrtou hodinou.

Příklad 11

Zkoušky pronikání 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran^l-onu do erytrocytů krys in vivo.

Zkoušky se prováděly s krysími samci Sprague-Dawley hmotnosti 250 až 300 g.

Chelatotvomé činidlo 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran^l-on připravené jak uvedeno v příkladu 3 se podává krysám v jediné orální dávce obsahující 2% methylcelulózy a 20 mg chelatotvroného činidla na kg tělesné hmotnosti. Přítomnost 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-onu se zajišťovala v moči po 12 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách po podání. Když se 20 mg 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-onu na kilogram tělesné hmotnosti podáván v DMS intraperitoneálně, byla jeho přítomnost v plazmatu a erytrocytech pozorována po 15, 30 a 60 minutách po léčbě.

V tabulkách 1 a 2 jsou uvedeny výsledky kvalitativní detekce 3-hydroxy-2-methyl-4H-l-benzopyran^í—onu, resp. 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4—onu v krysí tkáni a jeho vylučování.

Tabulka 1. Kvalitativní detekce 3-hydroxy-2-methyl^fH-l-benzopyran-4—onu v krysí tkáni a jeho vylučování

doba po podání	plasma	erythrocyty	játra	mozek	moč	stolice
h h	P(+)	p( + )	n	n	n	n
1 h	p(++)	p (++)	P( + )	P ( + )	n	n
4 h	P (++)	P{+++)	P(+++)	p{++)	p( + )	n
24 h	n	n	P <++)	p{++)	P(++)	n
48 h	n	n	n	n	p (+++)	n

-10CZ 299542

Tabulka 2. Kvalitativní detekce 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran^4-onu v krysí tkáni a jeho vylučování

doba po podání	plasma	erythrocyty	játra	mozek	moč	stolíce
*4 h	p (+>	p(+)	n	n	n	n
H h	p(++)	p (++)	n	n	n	n
1 h	p{++)	PÍ+++)	p < + >	n	n	n
4 h	p(+++)	p(+++)	p(++)	n	n	n
12 h	n	n	p(++)	p(+5	p(+)	n
24 h	n	n	p{+++}	p(+)	p{+++)	n
48 h	n	n	n	n	p(+++)	n

p přítomen n nepřítomen + semikvantitativní hodnota

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

15 1. Farmaceutické kompozice, vyznačující se tím, že zahrnují jako účinnou složku alespoň jeden benzoyl- nebo benzopyranonový derivát vzorce I v němž:

R₃ 0

20 Ri j θ CH C CH2 R4, přičemž R₃ a R4 je zvoleno z H a OH, za předpokladu, že R₃ a R4 nejsou současně H, a R₂ je H, nebo

OH R₅

Ri a R₂ tvoří dohromady— C = C — , přičemž R₅ je zvoleno z CH₃ a (CH₂)₅OH, nebo jeho komplex se železem.
2. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnují jako účinnou složku komplex železa a sloučeniny vzorce I podle nároku 1, kde R₅ je CH₃.

-11 CZ 299542
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále zahrnují farmaceuticky přijatelné excipienty a/nebo ředidla.
4. Použití sloučenin vzorce I v němž:

R₃ O I

Ri 2^e CR C CH₂ R4, přičemž R₃ a R4 je zvoleno zH a OH, za předpokladu, že R₃ a R4 nejsou současně H, a R₂ je H, nebo

OH R_s

10 Rj a R₂ tvoří dohromady — C = C — , přičemž R₅je zvoleno z CH₃ a (CH₂)₅OH, pro přípravu farmaceutických kompozic vhodných pro léčbu stavů, s nimiž je spojeno přetížení železem.
5. Použití podle nároku 4, kde stavy, s nimiž je spojeno přetížení železem, zahrnují hemochro15 matózu, talasémii, anémii spojenou s přetížením železem a stavy spojené se sekundární siderózou, neurodegenerativní onemocnění, zahrnující Parkinsonovu a Alzheimerovu nemoc, ischemickou kardiopatii, zánětlivá onemocnění zahrnující artritidu, pyelonefritidu a chronické zánětlivé střevní choroby, uměny metabolismu železa spojené s infekcemi HIV, kardiotoxicitu způsobenou doxorubicinem a antracykliny, aterosklerózu a stárnutí.
6. Komplexy sloučenin vzorce I podle nároku 4 se železem.
7. Komplexy se železem podle nároku 6, kde molární poměr sloučeniny vzorce I a železa je 2:1.
8. Komplexy se železem podle nároků 6 a7, kde železo je Fe(IlI).
9. Použití komplexů se železem podle nároků 6 až 8 pro přípravu farmaceutických kompozic, vhodných pro léčbu stavů, s nimiž je spojen nedostatek železa.
10. Použití podle nároku 9, kde stavy, s nimiž je spojen nedostatek železa, zahrnují sideropenickou anémii v akutní fázi a chronickou sideropenickou anémii.
11. Benzoyl- nebo benzopyranonové deriváty vzorce I kde

- 12CZ 299542

R₃ O

Ri j® — CH — C CH₂ R4, přičemž R₃ je OH a R4 je H, OH; a R₂ je H, nebo

OH R₅

I I

Ri a R₂ tvoří dohromady— C = C — , přičemž R₅ je (CH₂)₅OH.