SK281295B6

SK281295B6 - Spôsob separácie aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorpciou na zeolitoch

Info

Publication number: SK281295B6
Application number: SK1214-96A
Authority: SK
Inventors: Stefan Stockhammer; Wiltrud Sch�Fer-Treffenfeldt; G�Nter Knaup; Karlheinz Drauz; Elfriede Sextl
Original assignee: Degussa Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1996-09-25
Publication date: 2001-02-12
Also published as: DK0765864T3; CZ275396A3; DE59601986D1; DE19535751A1; CA2186187A1; US5731459A; JPH09124565A; EP0765864B1; SK121496A3; EP0765864A1; ATE180467T1; ES2133867T3

Abstract

Opisuje sa spôsob separácie aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorpciou na zeolitoch z roztokov, ktoré obsahujú dipeptidy alebo oligopeptidy, alebo sú z nich vyrobené, spočívajúci v tom, že sa roztoky uvádzajú pri vhodnej hodnote pH, prípadne v niekoľkých krokoch, do styku so zeolitom a dipeptidy alebo oligopeptidy, ktoré zostávajú v roztoku, sa oddeľujú od aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorbovaných na zeolite.ŕ

Description

Vynález sa týka spôsobu oddeľovania aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín výhodne z vodných roztokov, ktoré obsahujú ako nečistoty, adsorpciou aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín na zeolitoch.

Doterajší stav techniky

Roztoky, pre ktoré sa môže použiť spôsob podľa vynálezu, rezultujú napríklad z technickej syntézy oligopeptidov, v ktorej zostáva v roztoku časť nie nepodstatných zvyškových koncentrácií aminokyselín, ktoré sú východiskové látky, spolu s nežiaducim konečným produktom. Rozhodujúcim krokom pri výrobe čistých peptidov je oddelenie východiskových produktov. Predovšetkým náročné je oddelenie aminokyselín od dipeptidov, ak sa používajú na výrobu spôsobu, pri ktorých sa priamo po kopulácii odštiepuje chrániaca skupina nevyhnutná na ochranu aminoskupiny (napríklad pri kopulácii peptidov s anhydridmi N-karboxylových kyselín) a na kopuláciu sa používa druhá nechránená aminokyselina. Voľné aminokyseliny prítomné v týchto prípadoch v roztoku a voľné peptidy majú často PKJ hodnoty, a preto sa v roztoku chovajú veľmi podobne. Čistenie kryštalizáciou nie je často preto možné, alebo je možné len s veľkými stratami. Na toto čistenie sa podľa dnešného stavu techniky používajú rôzne chromatografické spôsoby, ktoré sú súhrnne opísané v Ullmann Enzyklopädie, Zv., A 19, str. 168 (1991) a J. P. Greenstein, M Winitiz, „Chemistry of the Amino Acids“, J. Wiley, New York, 1961, Zv. 2, str. 1366 - 1511.

Pri rozdeľovacej chromatografii sa využívajú rozdielne rozdeľovacie rovnováhy aminokyselín a peptidov medzi dvoma rozdielnymi systémami rozpúšťadiel (vodným a organickým). Ak nie sú tieto rozdeľovacie rovnováhy dostatočne od seba vzdialené, je toto čistenie pomocou uvedenej metódy problematické až nemožné. Afinitná chromatografia, pri ktorej sa využívajú rozdiely vo väzbových silách voči špeciálnym reakčným partnerom, je vhodná len pre veľmi malé množstvo, chromatografické spôsoby, ktoré sú založené na hydrofóbnych interakčných pôsobeniach medzi nosičom a látkami, ktoré sa majú čistiť (ktoré sú opísané aj pre peptidy a proteíny v PCT SE 93/00582), sú závislé od týchto interakčných účinkov, a tým od väzby k materiálu nosiča využívajúcej koncentráciu solí v elučnom médiu. Pri týchto spôsoboch je tiež často nevyhnutný prídavok nepolámych organických látok, aby bol výkon delenia dostačujúci.

V porovnaní s doteraz uvedenými spôsobmi dosiahla pri technických procesoch väčší význam ionitová chromatografia. Delenie aminokyselín a peptidov spočíva tu v rozdieloch izoelektrických bodov látok. Aminokyseliny a peptidy sa viažu pri kyslej hodnote pH vo forme svojich katiónov výmennou iónov na kationite. Delenie sa uskutočňuje elúciou elučným činidlom so zvyšujúcimi sa gradientmi pH. Pri hodnote pH, ktorá zodpovedá svojmu vlastnému izoelektrickému bodu, sa jednotlivé aminokyseliny a peptidy uvoľnia a elúujú sa.

Všetky uvedené chromatografické spôsoby majú tú nevýhodu, že pre tieto látky s podobnými alebo porovnateľnými funkčnými skupinami je potrebných viac stupňov, aby sa dosiahla dostatočná čistota. Z toho vyplýva potreba viac čistiacich cyklov, pri ktorých sa nedá zabrániť väčším stratám účinných látok. Okrem tohto sa elúciou pri prídavku solí alebo posunom pH značne zvýši množstvom solí v roztokoch. Tieto soli a prípadne aj iné nevyhnutné prísady sa musia potom odstraňovať pri vynaložení značných nákladov.

Ďalší spôsob, pri ktorom sa uskutočňuje delenie a čistenie na základe rozdielov v molekulárnej hmotnosti a rozmeroch molekúl, ktoré sa majú deliť, je gélová filtrácia. Pri tomto spôsobe sa používa pórovitá matrica, najčastejšie na organickej báze. Väčšie molekuly nemôžu difundovať do pórov a rýchlo sa elúujú, oproti tomu sa menšie molekuly zadržia. Nevýhodou ale je, že aby sa táto metóda mohla dostatočne uplatniť, musí sa vynaložiť vysoký tlak.

Z EP 0571 742 A2 je známy spôsob separácie aminokysleín z fermentačných brečiek adsorpciou týchto zlúčenín na zeolitoch. Tieto obsahujú peptidy, ktoré ale vzhľadom na aminokyseliny, ktoré sa majú oddeľovať, majú nešpecifické zloženie.

EP 0 654 371 sa týka spôsobu delenia L-leucínu a L-izoleucínu z vodných roztokov týchto aminokyselín a ich vzájomného oddelenia, pri ktorom sa používajú zeolity. Z ÚP-PS 4, 910 336 je známy spôsob, pri ktorom sa fenylalanín adsorbuje na zeolite Y z fermentačných roztokov.

Podstata vynálezu

Úlohou vynálezu je dať k dispozícii spôsob, ktorý umožňuje efektívne oddelenie nezreagovaných aminokyselín, ktoré zostávajú v roztoku napríklad po výrobe dipeptidov alebo oligopeptidov.

Predmetom vynálezu je spôsob separácie aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorpciou na zeolitoch z roztokov dipeptidov alebo oligopeptidov, ktoré ich obsahujú alebo sú z nich vyrobené, ktorého podstata spočíva v tom, že sa roztoky uvádzajú pri vhodnej hodnote pH, prípadne v niekoľkých krokoch, do styku so zeolitom a dipeptidy alebo oligopeptidy, ktoré zostávajú v roztoku sa oddeľujú od aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorbovaných na zeolite.

Adsorpčná teplota môže ležať pritom medzi teplotou topenia a teplotou varu použitého rozpúšťadla, výhodne medzi 15 až 35 °C. Pokiaľ ide o aminokyseliny, ktoré sa majú deliť, môže ísť o všetky organické zlúčeniny, ktoré obsahujú najmenej jednu aminoskupinu, rovnako tak ako jednu skupinu karboxylovej kyseliny alebo jednu skupinu sulfónovej kyseliny. Výhodné sú aminokyseliny a/alebo aminosulfónové kyseliny, v ktorých je aminoskupina a skupina kyseliny spojená cez C_rC4-alkylénový zvyšok.

Ak aminokyseliny alebo aminosulfónové kyseliny obsahujú chirálne centrum, dá sa spôsob použiť pre obidva enentioméry. Pokiaľ ide o aminokyseliny, môže ísť o primáme, sekundárne alebo terciárne aminoskupiny.

Aminokyseliny a minosulfónové kyseliny, oddeliteľné podľa vynálezu, môžu niesť ešte ďalšie funkčné skupiny, ako napríklad karboxyl, sulfenyl, hydroxyl, aminoskupinu, tionyl, fuanidín, heteroaryl. Tieto skupiny môžu prípadne niesť chrániace skupiny, používané obvykle v chémii peptidov ako napríklad benzyloxykarboxyl, t-butoxykarboxyl, trifluóracetyl, tozyl pre aminoskupiny, prípadne guanidínové skupiny alebo alkylesterové skupiny pre karboxylové skupiny.

Spôsob sa dá predovšetkým výhodne použiť na oddeľovanie produktov od aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín, ktoré tieto obsahujú alebo z nich boli vyrobené, ak produkty obsahujú aj voľné aminoskupiny a skupiny karboxylových kyselín alebo sulfokarboxylových kyselín. Výhodne sa spôsob používa na oddeľovanie nezreagovaných aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín od produktov, ktoré sa vyrábajú spojením dvoch alebo viace2

SK 281295 Β6 rých aminokyselín. Predovšetkým výhodné sú zlúčeniny, pri ktorých dochádza k spojeniu cez amidové väzby.

Výhodne sa spôsob podľa vynálezu používa na oddeľovanie dipeptidov a/alebo tripeptidov z prevažne vodných roztokov, v ktorých sú obsiahnuté úplne alebo čiastočne aminokyseliny tvoriace peptidy, prípadne aminosulfónové kyseliny.

Ako príklad sa dajú uviesť výhodne uskutočnené delenia od dipeptidov a v nich obsiahnutých a-L-aminokyselin.

Ala + Pro od Ala-Pro

Val + Pro od Val-Pro

Gly + Gin od Gly-Gln

Tyr + Arg odTyr-Arg

Gly + Glu od Gly-Glu

Ako príklad oddelenia od β-L-aminokyselín je uvedený:

β-Ala + His od β-Ala-His

To isté platí na oddelenie od α-L-aminokyselín z roztokov obsahujúcich tripeptidy:

Gly + Tyr od Gly-Gly-Tyr

Ako príklad na oddelenie diaminokarboxylovej kyseliny, v ktorej je aminokyselina chránená trifluóracetylovou skupinou, sa dá uviesť:

ε-TFA-Lys + Pro od ε-TFA-Lys-Pro

Skúška spôsobu podľa vynálezu, blížiaca sa praxi, ukazuje univerzálnosť použitia, aj keď aminokyseliny môžu mať veľký počet rozdielnych chemických vlastností.

Príslušne majú peptidy pochádzajúce z proteínogénnych aminokyselín

a) „hydrofóbne“ bočné reťazce: Gly, Ala, Pro, Val a/alebo

b) „poláme“ bočné reťazce: Tyr, Gin a/alebo

c) „kyslé“ bočné reťazce: Glu a/alebo

d) „zásadité“ bočné reťazce: Arg, Lys, ako to je príklade doložené na uvedených aminokyselinách.

Podľa vynálezu sa podarí tiež oddelenie od aminokyselín so sekundárnymi aminoskupinami, ako napríklad:

Sar + Ala do Sar-Ala (Sar = sarkozín).

To isté platí na oddelenie od aminosulfónových kyselín ako napríklad

Ala + Tau od Ala-Tau (Tau = taurín).

Vzhľadom na to, že adsorpcia aminokyselín v celom rozsahu pH je možná medzi 1 až terajším JP, nie je v roztokoch so zodpovedajúcou hodnotou pH nutná žiadna korekcia pH.

Adsorpcia sa výhodne uskutočňuje pri pH < JP (izoelektrický bod), zatiaľ čo desorpcia sa uskutočňuje výhodne pri pH > JP. Ak sú izoelektrické body dvoch aminokyselín prípadne aminosulfónových kyselín, ktoré sa majú z roztoku odstrániť, značne rozdielne, opakuje sa krok adsorpcie prípadne pri rôznych hodnotách pH.

Ako zeolity sa používajú výhodne zeolity typov FAU, MSI alebo mordenit, ktoré majú modul 15 až 200.

Zeolity ako také sú známe zo stavu techniky.

Roztok, ktorý sa má čistiť, sa privádza do styku so zeolitom priamym pridaním prášku zeolitu alebo tvarových teliesok zeolitu do roztoku v miešacej nádrži. Oddelenie vyčisteného roztoku cennej látky od prášku zeolitu alebo tvarových teliesok zeolitu sa uskutočňuje pripojenou filtráciou.

Ďalšia možnosť technickej realizácie spočíva v tom, že sa čistený roztok nechá prechádzať kontinuálne kolónou naplnenou prášok zeolitu alebo jeho tvarovými telieskami, pričom prednosť sa dáva na základe malej straty tlaku tvarových telieskam. Voľné aminokyseliny sa pritom v kolóne adsorbujú na zeolity, zatiaľ čo dipeptidy sú takmer úplne obsiahnuté v odtoku. Zeolit s naadsorbovanými aminokyselinami sa môže, ak sa oddelené aminokyseliny nemajú získať späť, regenerovať zahrievaním pri teplotách medzi 400 až 900 °C, napríklad v rotačnej rúrkovej peci. Adsorbované aminokyseliny sa môžu ale tiež desorbovať aj vo vodných roztokoch pri pH hodnotách medzi 10 až 12, a tým sa opäť získať. Zeolit môže potom byť opäť použitý na čistenie peptidov.

Na základe priaznivej polohy adsorpčnej rovnováhy sa podarí odstrániť z roztoku takmer dokonale aminokyseliny prípadne aminosulfónové kyseliny, pri prídavku zodpovedajúceho množstva zeolitu, pomocou jediného kroku. Aj keď v množstve prípadov pritom zostane malé množstvo cennej látky adsorbované, dá sa ešte stále pozorovať veľký deliaci výkon medzi voľnými aminokyselinami a cennou látkou.

V porovnaní so stavom techniky je toto znakom - okrem iného - spôsobu podľa vynálezu. K tomu pristupuje ešte vysoká eficiencia, keďže pri oddeľovaní malých množstiev vedľajších produktov prípadne východiskových látok z reakčných roztokov, ktoré sú výhodne použité, od cenných látok, ktoré sa majú čistiť v porovnaní s ionitovou chromatografiou nevyžaduje cenná látku (tu peptidy) žiadnu kapacitu adsorpčného činidla.

Nevyhnutné množstvo adsorbentu sa tu riadi len množstvom látok, ktoré sa majú odstrániť.

V protiklade ku gélovej filtrácii sa oddeľovanie uskutočňuje bez použitia vysokých tlakov, ktoré sú tu nutné s ohľadom na malé adsorpčné hustoty/adsorpčné kapacity.

Ukazuje sa ako výhoda tiež, že sa podľa vynálezu nemusia pridávať soli a že sa roztok cenných látok nemusí riediť.

Koncentrácia požadovaných produktov sa vzťahuje, y závislosti od ich rozpustnosti a od hodnôt koncentrácií dosiahnuteľných podľa teraz zvoleného spôsobu, všeobecne na rozmedzie 1 % hmotn. až 60 % hmotn., vztiahnuté na roztok, ktorý ich obsahuje, predovšetkým 4 až 30 % hmotn.

Koncentrácia aminokyselín, ktoré sa majú oddeliť, slúžiacich napríklad ako východiskové zlúčeniny, sa vzťahuje vo všeobecnosti na zvyškovú koncentráciu, existujúcu po reakcii, 0,01 g/1, až na hodnotu, ktorá je dopredu určená medzami rozpustnosti teraz použitej východiskovej zlúčeniny.

Ak je pomer jednotlivej zlúčeniny, ktorá sa má oddeliť, ako napríklad aminokysclny alebo aminokyselín k čistenému produktu v g/1, určí sa rozmedzie od 1 :1000 až 1: 1,5, predovšetkým potom 1 : 300 až 1 : 1,5, pri ktorom sa spôsob podľa vynálezu dá s úspechom použiť.

Charakterizácia použitých zeolitov zodpovedá zaradeniu podľa W. M. Meira, D. H. Olsona: Atlas of Zeolite Structure Types, II vydanie, Butterworth-Heinemann, London 1987.

To platí predovšetkým pre

zeolit A	Λ	zeolit TA
zeolit DAY	A	zeolit FAU
modenit	A	MOR
ZSM 5	A	MSI

Čislo spojené pomlčkou na označenie ZSM 5 typu v príkladoch zodpovedá pomeru SiO₂/Al₂O₃.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Uvedené príklady dokladajú realizovateľnosť spôsobu podľa vynálezu.

Pri laboratórnom pokuse bolo doplnených 30 ml roztoku, ktorý obsahoval rôzne koncentrácie peptidov a voľných aminokyselín, 3 g prášku zeolitu a trepalo sa až do bezpečného nastavenia adsorpčnej rovnováhy.

SK 281295 Β6

Po adsorpcii sa prášok zeolitu odfiltroval cez membránu a zvyšok sa analyzoval.

Skúmané látky sú spolu s výsledkami analýz a dosiahnutými percentnými obohateniami uvedené pomocou opísaného kroku adsorpcie v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Oddelenie voľných aminokyselín od dipeptidov alebo príbuzných látok

látka	koncentrácia vo	koncentrácia v	peruHtitná
	uýcl llsk ovaň	roztoku po styku	obohatenie
	roztoku (g/1)	so zeolitom (g/1)
Ala-Pro	285,9	286.5	0
Ala	4. 0	0. 5	85,0
Pro	2.4	0.0	100
ZSH5/2B
Va -Pro	324.9	325.1	n
Val	14,1	2.1	05,1
Pro	4, 5	0.8	02,2
ľSrtB/PB
Gly-Gly	89.1	R7, □	7.9
Cly	5. 2	0.2	96.2
Gin	2, 0	0,2	90,0
ZSW5/28
TFA-Lys-Pro	39,1	39,9	0
TFA-Lye	3, 0	i. a	66. 6
Pro	2. B	0.1	96.4
ZSW5/45
Tyr-Arg	38. 4	17.2	55,2
Tyr	0, 5	0. 3	40,0
Arg	4. 3	1. 2	72.1
DAY 15
Gly-Gly-Tyr	5, B	5. 45	6.0
Gly-Tyr	3. 25	3. 1	4.6
Gly	5. 75	1. G	73,9
Tyr	0. 3	0,1	56, 6
ZSA5/2B
131 y-GJ u	B. 25	7.8	5, 4
Gly	9.6	6.1	36, 4
Glu	5, 0	2, 4	52, 0

ZS115/28 lebo aminosulfónová kyselina, alebo aminosulfónové kyseliny desorbujú nastavením hodnoty pH > JP (izoelektrický bod).

Claims

8. Spôsob podľa nároku 1 až 7, vyznačujúci sa t ý m , že aminoskupiny a kyselinotvomé skupiny aminokyseliny alebo aminosulfónovej kyseliny sú spojené Ci-C₄-alkylénovou skupinou.

9. Spôsob podľa nároku laž 8, vyznačujúci sa t ý m , že dipeptidy alebo oligopeptidy obsahujú najmenej jednu aminokyselinu, ktorá má ďalšiu funkčnú skupinu.

10. Spôsob podľa nároku laž 7, vyznačujúci sa t ý m , že dipeptidy alebo oligopeptidy obsahujú najmenej jendu aminokyselinu s hydrofóbnym bočným reťazcom.

11. Spôsob podľa nároku laž 7, vyznačujúci sa t ý m , že dipeptidy alebo oligopeptidy majú najmenej jednu aminokyselinu, kde aminoskupina je prítomná ako primárny, sekundárny alebo terciámy amín.

12. Spôsob podľa nároku laž 7, vyznačujúci sa t ý m , že dipeptidy alebo oligopeptidy obsahujú aminokyseliny, ktorých aminoskupiny sú v polohe α, β alebo γ.

13. Spôsob podľa nároku lažll,vyznačujúci sa t ý m , že sa uskutočňuje diskontinuálne, polokontinuálne alebo kontinuálne.

Koniec dokumentu

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob separácie aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorpciou na zeolitoch z roztokov, ktoré obsahujú dipeptidy alebo oligopeptidy, alebo sú z nich vyrobené, vyznačujúci sa tým, že sa roztoky uvádzajú pri vhodnej hodnote pH, prípadne v niekoľkých krokoch, do styku so zeolitom a dipeptidy alebo oligopeptidy, ktoré zostávajú v roztoku, sa oddeľujú od aminokyselín a/alebo aminosulfónových kyselín adsorbovaných na zeolite.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že pokiaľ ide o dipeptidy alebo oligopeptidy, sú to látky, ktoré rovnako tak ako aminokyseliny a/alebo aminosulfónové kyseliny, použité ako adikty, obsahujú ako aminokyseliny, tak aj kyselinotvomé skupiny.
3. Spôsob podľa nároku 1 a 2, vyznačujúci sa t ý m , že pokiaľ ide o dipeptidy alebo oligopeptidy, sú to zlúčeniny, v ktorých sú minimálne dve aminokyseliny a/alebo aminosulfónové kyseliny spojené amidovou väzbou.
4. Spôsob podľa nároku 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m , že sa používa zeolit typu ZSMS alebo DAY.
5. Spôsob podľa nároku 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že sa adsorpcia aminokyseliny alebo aminosulfónovej kyseliny uskutočňuje pri hodnote pH < JP (izoelektrický bod).
6. Spôsob podľa nároku 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že sa pokiaľ ide o aminokyseliny alebo aminosulfónové kyseliny s rozdielnymi hodnotami JP, ktoré sú v roztoku, ktorý sa má deliť, za sebou uskutočňujú prípadne dva adsorpčné kroky s hodnotu pH prispôsobenou hodnote JP.
7. Spôsob podľa nároku 1 až 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa aminokyselina alebo aminokyseliny, a-