CZ275396A3

CZ275396A3 - Způsob oddělování aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin z vodných roztoků

Info

Publication number: CZ275396A3
Application number: CZ962753A
Authority: CZ
Inventors: Stefan Ing. Stockhammer; Wiltrud Prof. Dr. Schäfer-Treffenfeldt; Günter Dr. Knaup; Karlheinz Prof. Dr. Drauz; Elfriede Dr. Sextl
Original assignee: Degussa Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 1998-05-13
Also published as: ES2133867T3; US5731459A; DE59601986D1; DK0765864T3; CA2186187A1; JPH09124565A; DE19535751A1; EP0765864A1; EP0765864B1; SK121496A3; ATE180467T1; SK281295B6

Description

Způsob oddělování aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin z vodných roztoků Oblast techniky

Vynález se týká způsobu oddělování aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin s výhodou z vodných roztoků, které je obsahují jako nečistoty, adsopcí aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin na zeolitech.

Dosavadní stav techniky

Roztoky, u kterých se může použít způsob podle vynálezu, rezultuýí například z technické syntézy oligopeptidů, u které zbývá v roztoku část ne nepodstatných zbytkových koncentrací aminokyselin, které jsou výchozími látkami, spolu s nežádoucím konečným produktem , Rozhodujícím krokem při výrobě čistých peptidů je oddělení výchozích produktů. Zejména obtížné je oddělení aminokyselin od dopeptidů, když se používají pro výrobu způsoby, při nichž se přímo po kolulaci odštěpuje chránící skupina nezbytná pro ochranu aminoskupiny / například u kopulace peptidů s anhydridy K-karboxylových kyselin / a pro kopulaci se používá druhá nechráněná aminokyselina. Volné aminokyseliny přítomné v těchto případech v roztoku a volné peptidy mají často PKI hodnoty a proto se v roztoku chovají velmi podobně, Čištění krystalizaci neníčasto proto možné nebo je možné jen s velkými ztrátami. Pro toto čištění se podle dnešního stavu techniky používají

-ív^· 't—Γ»··

-2různé chromatografické způsoby , které jsou sou hrnně popsány v Ullmann Enzyklopádie, Vol. A 19 , pp 168 / 1991/ a J.l. Greenstein , M. Winitiz , Chemistry of the Amino Acids , J. Wiley , New York , 1961, Vol. 2 , pp. 1366- 1511.

U rozdělovači chromatografiě se využívají rozdílné rozdělovači rovnováhy aminokyselin a peptidů mezi dvěma rozdílnými systémy rozpouštědel / vodným a organickým / .Jestliže nejsou tyto rozdělovači rovnováhy dostatečně od sebe vzdáleny» 3^e toto čištění uvedenou methodou obtížné až nemožné. Afinitní chromatografie, při níž se využívají rozdíly ve vazebných sílách ke speciálním reakčním partnerům, se hodí jen pro velmi malá množství, chromatografické způsoby, které spočívají na hydrofóbních interakčních působeních mezi nosičem a látkami, které se mají čistit / které jsou popsány i pro peptidy a pro teiny v TCT / SE 93/00582/, jsou závislé na těchto interakčních účincích a tím na vazbě k materiálu nosiče využívající koncentraci solí v elučním médiu. U těchto způsobů je také často nezbytný přídavek nepolárních, organických látek pro postačující výkon dělení.

Ve srovnání s dosud uvedenými způsoby dosáhla při technických procesech větší význam iontoměničová chromatografiě. Dělení aminokyselin a peptidů spočívá zde na rozdílech isoelektrickýoh bodů látek. Aminokyseliny a peptidy se w»r.

-3vážou při kyselé hodnotě pH ve formě svých kationtů výměnou iontů na kationtoměniči. Dělení se provádí eluci elučním činidlem se zvyšujícími se gradienty pH. Při hodnotě pH, která odpovídá svému vlastnímu isoelektrickému hodu,se jednotlivé aminokyseliny a peptidy uvolní a eluují se.

Všechny uvedené chromatografické způsoby mají tu nevýhodu, že pro látky s podobnými nebo srovnatelnými funkčními skupinami je zapotřebí pro dosažení dostatečné čistoty více stupňů.

Z toho rezultuje potřeba více čistících cyklů, při nichž se nedá zabránit větším ztrátám účinných látek. Kromě toho se eluoí za přídavku solí nebo posunem pH značně zvýší množství solí v roztocích. Tyto sole a popřípadě i jiné nezbytné přísady se musí potom odstraňovat za vynaložení značného nákladu.

Další způsob, při kterém se provádí dělení a čištění na základě rozdílů v molekulární hmotnosti a rozměrů molekul, které se mají dělit, je gelová filtrace.Při tom se používá porézní matrice , nej častěji na organické bázi. Větší molekuly nemohou difundovat do pórů a rychle se eluují, naproti tomu co menší molekuly se zadrží. Nevýhodou při tom ale je , že se pro dostatečné prosazení musí vynaložit vysoký tlak.

Podstata vynálezu

-4Úkolem vynálezu je dát k dispozici způsob , který umožňuje efektivní oddělení nezreagovaných aminokyselin, zbývajících v roztoku například po výrobě dipeptidů nebo ligopeptidů.

Předmětem vynálezu je způsob dělení aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin, zbývajících v roztoku , a tyto obsahujících nebo z nich vyrobených produktů, zejména dipeptidů a/ nebo oligopeptidů , jehož podstata spočívá v tom, že se roztoky uvádí pří vhodné hodnotě pH popřípadě ve více krocích , do-styku se zeolitem, s výhodou typu ΤΑ,ΡΑΤΤ,ΜΟΕ nebo MSI, a produkty, zbývající v roztoku se oddělují od aminokyselin a/ nebo aminosulfonových kyselin adsorbovaných na zeolitu.

Adsorpční teplota může být při tom mezi teplotou tání a teplotou varu použitého rozpouštědla, s výhodou mezi 15 až 35 °C. TJ aminokyselin, které se mají dělit se může jednat o všechny organické sloučeniny,.které obsahují nejméně jednu aminoskupinu stejně tak jako jednu skupinu karboxylové kyseliny nebo jednu skupinu sulfonové kyseliny. Výhodné jsou aminokyseliny a/nebo aminosulfonové kyseliny, u nichž je aminoskupina a skupina kyseliny spojena přes alkylenový zbytek.

Jestliže aminokyseliny nebo aminosulfonové kyseliny obsahují chirální centrum, dá se způsob použít pro oba enanciomery. TJ aminoskupin se může jednat o primární, sekundární nebo ter

-5ciární aminoskupiny.

Aminokyseliny a aminosulfonové kyseliny,oddělitelné podle vynálezu, mohou nést ještě další ,funkční skupiny, jako například karboxyl,sulf enyl,hydroxyl, aminoskupinu, thionyl, cuaniáin,heteroaryl,Tyto skupiny mohou popřípadě nést chránící skupinyjpouěívané obvykle v chemii peptidů, jako například benzyloxykarboxyl, t-butoxykarboxyl,trifluoracety1, tosyl pro aminoskupiny popřípadě guanidinové skupiny nebo alkylesterové skupiny pro karboxylové skupiny.

Způsob se dá z©jména výhodně použít pro oddělování produktů od aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin, které tyto obsahují nebo z nich byly vyrobeny, když produkty obsahují i volné amino skupiny a skupiny karboxylových kyselin nebo sulfokarboxylových kyselin. S výhodou se způsob používá pro oddělování nezreagovaných aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin od produktů, které se vyrábí spojením dvou nebo více aminokyselin. Zejména výhodné jsou sloučeniny u nichž dochází ke spojení přes amidové vazby.

S výhodou se způsob podle vynálezu používá pro oddělování dipeptidů a/nebo tripeptidů z převážně vodných roztoků, ve kterých jsou obsaženy zcela nebo zčásti aminokyselinytvořící peptidy,popřipádě aminosulfonové kyseliny.

Jako příklad se mají uvést s výhodou provedená dělení od dipeptidů a v nich obsažených aminokyselin:

Ala	+	Pro	od	Ala-^ro
Val	+	Pro	od	Val-Pro
Gly	+	Gin	od	Gly-Gln
Tyr	+	Arg	od	Tyr-Arg
Gly	+	Glu	od	Gly-Glu

Jako příklad oddělení od 1-aminokyselin je uveden :

β -Ala + His od β-Ala-His

Totéž platí pro oddělení od cC-1-aminokyselin z roztoků obsahujících tripeptidy :

Gly + Tyr od Gly-Gly-Tyr

Jako příklad pro oddělení diaminokarboxylové kyseliny , u níž je aminoskupina chráněna tri fluoracetylovou skupinou, lze uvést :

£ -TPA - lys + Pro od £-TPA-lys-lro

Zkouška způsobu podle vynálezu, blížící se praxi, ukazuje univerzálnost použití, ačkoliv aminokyseliny mohou mít velký počet rozdílných chemických vlastností.

Příslušně mají peptidy pocházející z proteinogenních aminohyselin a/ ” hydrofobní postranní řetězce : Gly,Ala. Pro, Ital a/nebo b/ ” polární postranní řetězce : Tyr,Gin a/nebo c/ ” kyselé ^w postranní řetězce : Glu a/nebo d/ ” zásadité ^M postranní řetězce : Arg,lys, jak je to příkladně doloženo na uvedených aminokyselinách.

-7Podle vynálezu se podaří také oddělení od aminokyselin se sekundárními aminoskupinámi, jako například :

Sar + Ala od Sar-Ala / Sar = sarkosin /.

Totéž platí pro oddělení od aminosulfonových kyselin, jako například Ala + Tau od Ala -Tau / T&u = taurin /

Vzhledem k tomu, že adsorpce aminokyselin v eeleím rozsahu pH je možná mezi 1 až nynějším JP, není v roztocích s odpovídající hodnotou pH nutná žádná korekce pH.

Adsorpce se s výhodou provádí při pH -é JP / izoelektrický bod/ , zatím co desorpce se provádí s výhodou při pH >JP. Jestliže jsou izoelektrické body dvou aminokyselin popřípadě amino sulfonových kyselin ,které se mají z roztoku odstranit , značně rozdílné, opakuje se krok adsorpce popřípadě při různých hodnotách pH.

Jako zeolity se používají s výhodou zeolity typů PAU,MSI nebo mordenit,které mají modul 15 až 200.

Zeolity jako takové jsou známy ze stavu techniky.

Roztok, který se má čistiti, se přivádí do styku se zeolitem přímým přidáním prášku zeolitu- nebo tvarových tělísek zeolitu k roztoku v mísící ¹nádrži. Oddělení vyčištěného roztoku cenné látky od prášku zeolitu nebo tvarových tělísek zeolitu se provádí připojenou filtrací*

-8Další možnost technické ho provedení spočívá v tom, že se čištěný roztok nechá procházet kontinuálně kolohou naplněnou práškem zeolitu nebo jeho tvarovými tělísky,přičemž přednost se dává na základě malé ztráty tlaku tvarovým tělískům. Volné aminokyseliny se při tom v koloně adsorbují na zeolity, zatím co dipeptidy jsou téměř úplně obsaženy v odtoku. Zeolit s naadsorbovanými aminokyselinami se může, pokud se oddělené aminokyseliny nemají získat spět, regenerovat zahřívá ním při teplotách mezi 400·až 900 °C, například v rotační trubkové peci. Adsorbované aminokyseliny se mohou ale také desorbovat i ve vodných roztocích při pH hodnotách mezi 10 až 12 a tím se mohou opět získat. Zeolit může být potom opět použit k čištění peptidů.

Na základě příznivé polohy adsorpční rovnováhy se podaří, odstranit z roztoku téměř dokonale aminokyseliny popřípadě aminosulfonové kyseliny, při přídavku odpovídajícího množství zeolitu, jediným krokem. I když v řadě případů při tom zůstane malé množství cenné látkyadsorbováno, lze ještě stále pozorovat velký dělicí výkon mezi volnými aminokyselinami a cennou látkou.

Ve srovnání se stavem techniky je toto znakem - mimo jiné - způsobu podle vynálezu. K tomu při stupuje ještě vysoká eficience,nebot při oddělování malých množství vedlejších produktů popřípadě výchozích látek z reakčních roztoků,které jsou s výhodou použity, od cenných látek, které se mají čistit není , ve srovnání s iontoměničovou chro9

y* 'Íf,' 'ffJ’!,'?· FT*ΤύV*T*

-9matografií nevyžaduje cenná látka / zde peptidy / žádnou kapacitu adsorpčního činidla.

Nezbytné, množství adsorbentu se zde řídí pouze množstvím látek, které se mají odstranit.

V protikladu ke gelové filtraci se oddělování provádí bez· použití vysokých tlaků,které jsou zde nutné s ohledem na malé adsorpční hustoty/adsorpční kspaoity.

. Ukazuje se, že je také výhodné, že se podle vynálezu nemusí přidávat sole· a že se roztok cenných látek nemusí ředit.

Koncentrace požadovaných produktů se vztahuje v závislosti na jejich rozpustnosti a na hodnách koncentrací dosažitelných podle nyní zvoleného způsobu obecně na rozmezí 1 % hmot. až 60 $ hmot., vztaženo na roztok, který je obsahuje, zejména 4 až 30 $ hmot.

Koncentrace aminokyselin, které se mají oddělit, sloužících například jako výchozí sloučeniny, vztahuje se obecně na zbytkovou koncentraci,existující po reakci, 0,01 g/1 až na hodnotu,která je předem určena mezemi rozpustnosti nyní použité výchozí slouěniny.

Jestliže se poměr jednotlivéjsloučeniny,která se má oddělit, jako například aminokyseliny nebo aminokyselin k čištěnému produktu v g/1, nalezne se rozmezí od 1 : 1000 až 1 : 1,5, zejména pak 1 : 300 až 1 : 1,5 , při kterém se způsob podle vynálezu dá s úspěchem použít.

Charakterizace použitých zeolithů odpovídá

-ιοzařezení podle V/,M. Meiera, D.E. Olsona : Atlas of Zeolite Structure Types,2nd Ad, Butterv/orth-Heinemann , London 1987.

To platí zejména pro

Zeolit A		zeolit	TA
zeolit BAY	Λ	zeolit	ΡΑΠ
mordenit		MOR
ZSM 5	/N	MSI

Číslo spojené pomlčkou pro označení ZSM 5 typu v příkladech odpovídá poměru SiOp/AlpO^.

Příklady provedení

Uvedené příklady dokládají proveditelnost způsobu podle vynálezu.

Při laboratorním pokusu bylo doplněno 30 ml roztoku,který obsahoval různé koncentrace peptidů a volných aminokyselin, 3 g prášku zeolitu a třepalo se dokud nedošlo k bezpečnému nastavení adsorpční rovnováhy.

Po adsorpci se prášek zeolitu odfiltroval přes membránu a zbytek se analyzoval.

Zkoumané látky jsou spolu s výsledky analýz a dosaženými procentuálními abohaceními uvydeny pomocí popsaného kroku adsorpce v tabulce 1.

-11Oddělení volných aminokyselin od dipeptidů nebo příbuzných, látek

látka zeolit	koncentrace ve výchozím roztoku /g/l/	koncentrace v roztoku po styku se zeolitem /g/l/	procentuální obohacení
Ala-Pro	285,9	286,5	0
Ala	4,0	0,6	85,0
Pro	2,4	0,0	100
ZSM5/28
Va-Pro	324,9	326,1	0
Val	14,1	2,1	85,1
Pro	4,5	0,8	82,2
ZSM5/28
Gly-Gin	89,1	82,0	7,9
Gly	5,2	0,2	96,2
Gin	2,0	0,2	90,0
ZSM5/28. .,
TPA-lys-Pro	39,1	39,9	0
TPA-lys	3,0	1,0	66,6
Pro	2,8	0,1	96,4
ZSM5/45
Tyr-Arg	38,4	17,2	55,2
Tyr	0,5	0,3	40,0
Arg	4,3	1,2	72,1
DAY lb .........
Gly-Gly-Tyr	5,8	5,45	6,0
Gly-Tyr	3,25	3,1	4,6
Gly	5,75	1,5	73,9
Tyr	0,3	0,1	66,6
ZSM5/28

Gly-Glu	8,25	7,8	5,4
Gly	9,6	6,1	36,4
Glu	5,0	2,4	52,0

ZSM5/28

Claims

Způsob oddělování aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin z roztoků produktů, které je obsahují nebo byly z nich vyrobeny, vyznač uj í cí se tím, že se roztoky uvádr při vhodné hodnotě pH popřípadě ve více krocích do styku se zeolitem, a produkty zbylé v roztoku se oddělují od aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin adsorbovaných na se olitu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se u produktů jedná o látky, které stejně tak jako aminokyseliny a/nebo aminosulfonové kyseliny ,použité jako edukty, obsahují jak amino skupiny,, tak i kyselinotvorné skupiny.
3. Způsob podle nároků 1 a 2 , vyznačující se tím, že se u produktů jedná o sloučeniny, ve kterých jsou minimálně dvě aminokyseliny a/nebo aminosulfonové kyseliny spojeny amidovou vazbou.
4. Způsob podle nároků 1 až 3 » vyznačující se t-í m , že se používá zeolit typů ΤΑ,ΓΑϋ,ΜΟΒ. nebo MSI.
5. Způsob podle nároků 1 až 4,vyznač ující se tím,že se adsorpce aminokyseliny nebo aminokyselin a/nebo aminosulfonové kyseliny nebo amino sulf onovýoh kyselin provádí při hodnotě pH C jp / isoelektrickém bodu /.

-146. Způsob podle nároků 1 až 4 , v y ζηαό u j í o í se t í m , že se u aminokyselin a/nebo aminosulfonových kyselin s rozdílnými hodnotami JP, které jsou ,v roztoku , který se má dělit vedle sebe, provádí popřípadě dva adsorpční kroky s hodnotou pH^přizpůsobenou hodnotě JP.
7. Způsob podle nároků 1 až 6 , v y z n ač u j í o í se tím, že se aminokyselina nebo aminokyseliny a/nebo aminosulfonová kyselina nebo aminosulfonové kyseliny,, adsorbované na zeolity, desorbují nastavením hodnoty pH >JP.
8. Způsob podle nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že aminoskupiny a kyselinotvorné skupiny aminokyseliny a/nebo aminosulfonové kyseliny jsou spojeny C^-C^-alkylenovou skupinou.
9. Způsob podle nároků 1 až 8 , vyznačující se tím, že dipeptidy nebo oligopeptidy obsahují nejméně jednu aminokyselinu,která má další funkční skupinu.
10. Způsob podle nároků 1 až 7 , v y znáčů j í c í se tím, že dipeptidy nebo oligopeptidy obsahují nejméně jednu aminokyselinu s hydrofóbním postranním řetězcem.
11. Způsob podle nároků 1 až 7 , v y z n ačující se tím, že dipeptidy nebo oligopeptidy mají nejméně jednu aminokyselinu ,

-15u které je aminoskupina přítomna jako primární , sekundární nebo terciární amin.
12. Způsob podle nároků 1 až 7 , v y z n ačující se tím, že dipeptidy nebo oli gopeptidy obsahují aminokyseliny, jejichž aminoskupiny jsou v poloze a/nebo jba/nebo jť.
13. Způsob podle nároků 1 až 11 , v y z n ačující se tím, že se provádí diskonti nuálně,polokontinuálně nebo kontinuálně.