SK180798A3 - A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide - Google Patents

A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide Download PDF

Info

Publication number
SK180798A3
SK180798A3 SK1807-98A SK180798A SK180798A3 SK 180798 A3 SK180798 A3 SK 180798A3 SK 180798 A SK180798 A SK 180798A SK 180798 A3 SK180798 A3 SK 180798A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
helicobacter pylori
ala
ser
gly
polypeptide
Prior art date
Application number
SK1807-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Ingrid Bolin
Thomas Berglindh
Bjorn Mellgard
Ann-Mari Svennerholm
Original Assignee
Astra Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astra Ab filed Critical Astra Ab
Publication of SK180798A3 publication Critical patent/SK180798A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Description

Vakcínová kompozícia obsahujúca Helicobacter pylori flagelínový polypeptid
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka polypeptidov a vakcínových kompozícií na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii. Vynález sa ďalej týka použitia Helicobacter pylori polypeptidov na výrobu kompozícií na liečbu alebo profylaxiu Helicobacterpylori infekcie.
Doterajší stav techniky
Helicobacter pylori
Gram-negatívna baktéria Helicobacter pylori je dôležitý ľudský patogén, ktorý sa podieľa na niekoľkých gastroduodenálnych chorobách. Kolonizácia epitelu žalúdka baktériou vedie k aktívnemu zápalu a progresívnym chronickým gastritídam, s veľmi zvýšeným rizikom vývoja žalúdočných vredov.
Na kolonizáciu sliznice žalúdka využíva H. pylori mnoho virulentných faktorov. Takéto virulentné faktory zahŕňajú niekoľko adhezív, prostredníctvom ktorých baktéria asociuje so sliznicou žalúdka a/alebo sa pripája na epiteliálne bunky; ureázy, ktoré pomáhajú neutralizovať kyslé prostredie; a proteolytické enzýmy, ktoré robia sliznicu tekutejšou. Navyše na udržanie kolonizácie žalúdočnej sliznice je nevyhnutná pohyblivosť, čo je dokázané neschopnosťou Helicobacterových mutantov bez bičíka kolonizovať sliznicu žalúdka (Akopyants et al. Infection & Immunity 63(1):116-21,1995).
Napriek zrejmej silnej imunitnej odpovedi hostiteľa na H. pylori vytváraním tak lokálnych (slizničných) ako aj systémových protilátok, patogén zotrváva v sliznici žalúdka normálne počas života hostiteľa. Pravdepodobným dôvodom je, že spontánne indukovaná imunitná odpoveď je neadekvátna alebo nasmerovaná na nesprávne epitopy antigénov.
-2Flagelíny
Bičíky sú organely, ktoré sa podieľajú na pohybe bakteriálnych buniek a primárne sa nachádzajú na povrchu tyčinkovitých a špirálovitých baktérií. Filamenty bičíkov sú vytvorené zo špecifických proteinov, známych ako flagelíny.
V EP 0413378 je popísaná vakcína odvodená od E. coli bičíka na ochranu proti infekcii E. coli. Vakcíny, v ktorých boli flagelínové proteíny použité ako adjuvans, teda zlúčeniny, ktoré sú zmiešané s imunogénom na zvýšenie imunitnej odpovede, boli popísané vo WO 88/01873 a WO 89/10967.
V US 5 459 041 sú popísané antigénové kompozície obsahujúce bičík na použitie v diagnostických kitoch na detekciu Campylobacter (Helicobacter) pylori. Avšak nie je tam žiadna zmienka o použití Helicobacter pylori flagelínu na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii.
Helicobacter pylori flagelín (H.p. flagelín) je štrukturálny protein H. pylori bičíka. Helicobacter pylori flagelín pozostáva z dvoch podjednotiek, FlaA a FlaB. Gény Helicobactera flaA a flaB boli klonované (pozri Leying, H. et al., Molecular Microbiology 6(19):2863-74, 1992). Mutačné experimenty ukázali, že FlaA je absolútne nevyhnutný pre pohyb, zatiaľ čo pri absencii FlaB je pohyb zachovaný (Josenhans, C. et al., J. Bacteriology 177(11):3010-3020, 1995). Pri všetkých druhoch Helicobacter žijúcich v žalúdku sa zdá byť bičík úplne pokrytý bičíkovým obalom (Geis, G. et al., J. Med. Microbiol. 38(5):371-377, 1993). Účel tohto obalu nie je známy, ale mohol by byť dôležitý pre prežívanie v žalúdočnom prostredí hostiteľa.
Predchádzajúce štúdie ukázali, že Helicobacter pylori lokalizovaný hlbšie v ľudskom žalúdku môže byť pokrytý s slgA a zriedkavejšie s IgM a IgG (Wyatt, J.l. et al., J. Clin. Pathol. 39: 863-870, 1986). Dôvodom by mohlo byť, že protilátky nereagujú so žiadnymi funkčne nevyhnutnými miestami a/alebo, že v sliznici nepracuje bunková imunita. Antigény vybudzujúce ochrannú slizničnú imunitu sú zvyčajne prezentované povrchom slizníc M-bunkami. Sliznica žalúdka nemá žiadne, alebo má len veľmi málo takýchto antigén rozoznávajúcich buniek, a tak je detekcia antigénu pravdepodobne slabá. Na získanie zodpovedajúcej ochrannej
-3imunitnej odpovede musia byť správne antigény prezentované na správnom mieste.
Podstata vynálezu
Prirodzená infekcia človeka Helicobacterom pylori indukuje systémovú imunitnú odpoveď na flagelín. Napriek tomu sa nezíska žiadna ochrana alebo odstránenie infekcie. Prekvapujúco bolo teraz zistené, že je pozorovaná významná supresia a eradikácia H. pylori v infikovanej myši, keď sa podá vyčistený flagelín. Navyše bolo zistené, že keď sa pred inokuláciou baktérie do myši inkubuje H. pylori s monoklonálnou protilátkou proti H.p. flagelínu, úplne sa zabráni infekcii zvierat.
Na základe týchto zistení boli vyvodené nasledujúce závery:
- Časť H. pylori bičíka je vystavená útoku protilátok a tak nie je úplne pokrytá bičíkovým obalom.
- H. pylori bičíkový proteín účinkuje ako silný a pevný antigén, keď je vo vyčistenej forme prezentovaný povrchu sliznice.
- Vyčistený H. pylón flagelín bude stimulovať kompetentnú lokálnu imunitnú odpoveď schopnú významne znížiť alebo zničiť kolonizáciu žalúdočnej sliznice Helicobacterom pylori.
-Mechanizmus väzby protilátky na bičík je účinný, pretože predchádzajúce naviazanie monoklonálnej protilátky na H. pylori flagelín úplne inhibuje kolonizáciu Helicobacterom pylori.
Preto je predložený vynález zameraný na polypeptid obsahujúci aspoň jeden Helicobacter pylori flagelínový polypeptid alebo modifikovanú formu uvedeného polypeptidu, ktorá si zachováva funkčne ekvivalentnú antigenicitu, na použitie na indukciu ochrannej imunitnej odpovede na infekciu Helicobacterom pylori.
Termín Helicobacter pylori flagelínový polypeptid predstavuje polypeptid tvoriaci časť základnej štruktúry bičíka Helicobactera pylori. Vo výhodných
-4uskutočneniach vynálezu uvedený polypeptid obsahuje Helicobacter pylori polypeptid FlaA alebo FlaB.
Termínu funkčne ekvivalentná antigenicita treba rozumieť ako schopnosti indukovať systémovú a slizničnú imunitnú odpoveď, pri ktorej sa znižuje počet H. pylori buniek spojených so sliznicou žalúdka. Odborník v oblasti bude schopný identifikovať polypeptid zachovávajúci si funkčne ekvivalentnú antigenicitu použitím známych metód, ako napríklad epitopového mapovania s in vivo indukovanými protilátkami.
Termín ochranná imunitná odpoveď' znamená imunitnú odpoveď, ktorá robí kompozíciu vhodnou na terapeutické a/alebo profylaktické účely.
V inom dôležitom aspekte vynález poskytuje vakcínovú kompozíciu na indukciu ochrannej imunitnej odpovede na infekciu Helicobacterom pylori, ktorá obsahuje imunogénne účinné množstvo polypeptidu obsahujúceho Helicobacter pylori flagelínový polypeptid, voliteľne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom. Vo výhodných uskutočneniach vynálezu uvedený polypeptid obsahuje Helicobacterpylori polypeptid FlaA alebo FlaB.
V predloženom kontexte termín imunologický účinné množstvo znamená množstvo, ktoré vyvolá významnú ochrannú Helicobacter pylori odpoveď v infikovanom cicavcovi alebo zabráni infekcii náchylného cicavca. Typicky imunologický účinné množstvo bude zahŕňať približne 1 mg až 1000 mg, výhodne približne 10 mg až 100 mg antigénu H. pylori na orálne podanie alebo približne menej ako 100 mg na parenterálne podanie.
Vakcínová kompozícia navyše voliteľne obsahuje farmaceutický prijateľný nosič alebo rozpúšťadlo, jeden alebo viacero iných imunologický aktívnych antigénov na profylaktické alebo terapeutické použitie. Fyziologicky prijateľné nosiče a rozpúšťadlá sú dobre známe odborníkovi v oblasti a zahŕňajú napr. fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) alebo, v prípade orálnych vakcín kompozície založené na HCO3' alebo entericky obalené práškové kompozície.
-5Vakcínové kompozície môžu voliteľne zahŕňať alebo byť podávané spolu s inhibítormi sekrécie kyseliny, výhodne inhibítormi protónovej pumpy (PPIs), napr. omeprazolom. Vakcína môže byť začlenená v známych dodávacích systémoch, ako napríklad lipozómoch, ISCOMoch, kochelátoch, atď. (pozri napr. Rabinovich et al. (1994) Science 265,1401-1404) alebo môže byť pripojená alebo inkorporovaná do polymérnych mikrosférov degradovateľnej alebo nedegradovateľnej povahy. Antigény by mohli byť asociované so živými oslabenými baktériami, vírusmi alebo fágmi alebo so zabitými vektormi rovnakého druhu. Antigény môžu byť chemicky alebo geneticky spárované s nosičovými proteínmi inertného typu alebo adjuvans typu (cholera B podjednotka). Z toho vyplýva, že vynález poskytuje ďalší výhodný aspekt vakcínovej kompozície v súlade s vyššie uvedeným, navyše obsahuje adjuvans ako napríklad farmaceutický prijateľnú formu cholera toxínu. Takéto farmaceutický prijateľné formy cholera toxínu sú známe z doterajšieho stavu techniky, napr. Rappuoli et al. (1995) Int. Árch. Allergy & Immunol. 108 (4), 327333; a Dickinson et al. (1995) Infection and Immunity (63 (5), 1617-1623.
Vakcínová kompozícia podľa vynálezu môže byť použitá tak na terapeutické ako aj na profylaktické účely. V tomto kontexte termín profylaktický účel znamená indukovanie imunitnej odpovede, ktorá bude chrániť voči budúcej infekcii Helicobacterom pylorí, zatiaľ čo termín terapeutický účel znamená indukovanie imunitnej odpovede, ktorá môže suprimovať alebo eradikovať existujúce infekcie Helicobacterom pylorí.
Vakcínová kompozícia podľa vynálezu je výhodne podávaná do akejkoľvek cicavčej sliznice napríklad do bukálnej, nosnej, hlasivkovej, žalúdočnej, črevnej (do tenkého a hrubého čreva), do rektálnej a vaginálnej sliznice. Slizničné vakcíny môžu byť podávané spolu s adjuvans vhodným pre daný účel. Vakcíny môžu byť podávané parenterálne, subkutánne, intrakutánne alebo intramuskulárnou cestou, voliteľne spolu s vhodným adjuvans.
Ešte ďalším aspektom vynálezu je použitie polypeptidu obsahujúceho aspoň jeden Helicobacter pylorí flagelínový polypeptid na výrobu kompozícií na liečbu alebo profylaxiu infekcie Helicobacterom pylorí·, a hlavne na výrobu vakcín na použitie na vyvolanie ochrannej imunitnej odpovede proti Helicobacter pylorí. Vo
-6výhodných uskutočneniach vynálezu uvedený polypeptid obsahuje Helicobacter pylori flagelín alebo Helicobacter pylorí polypeptid FlaA alebo FlaB.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob vyvolania ochrannej imunitnej odpovede cicavca; vrátane človeka, proti Helicobacter pylori infekcii, pričom spôsob zahŕňa krok podávania imunologický účinného množstva vakcínovej kompozície, ktorá je definovaná vyššie, uvedenému cicavcovi.
Vo výhodných uskutočneniach vyššie uvedených aspektov vynálezu, má Helicobacter pylori FlaA podjednotka v podstate aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencii ako Sekv. č. 2, alebo je jej modifikovanou formou, ktorá si zachováva funkčne ekvivalentnú antigenicitu. Helicobacter pylorí FlaB podjednotka má v podstate aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v Zozname sekvencii ako Sekv. č. 4, alebo je jej modifikovanou formou, ktorá si zachováva funkčne ekvivalentnú antigenicitu.
Takže tomu treba rozumieť tak, že definícia Helicobacter pylorí FlaA a FlaB polypeptidov nie je striktne obmedzená na polypeptidy s aminokyselinovými sekvenciami, ktoré sú identické so Sekv. č. 2 alebo 4 v Zozname sekvencii. Lepšie povedané vynález zahŕňa polypeptidy nesúce modifikácie ako substitúcie, malé delécie, inzercie alebo inverzie, pričom tieto polypeptidy napriek tomu majú v podstate biologické aktivity Helicobacter pylori FlaA a FlaB polypeptidov a zachovávajú si funkčne ekvivalentnú antigenicitu. Z toho vyplýva, že do definície Helicobacter pylorí FlaA a FlaB polypeptidov so zahrnuté polypeptidy, ktorých aminokyselinová sekvencia je aspoň na 90 % homologická, výhodne aspoň na 95 % homologická s aminoKyselinovou sekvenciou uvedenou v Zozname sekvencii ako Sekv. č. 2 a 4.
Experimentálne postupy
a) Čistenie flagelínu z Helicobacter pylorí bičíka
H. pylorí rástol na 100 platniach s koňskou krvou 2 až 3 dni v mikroaerofilnej atmosfére. Bunky boli zozbierané zoškriabaním a baktérie boli rozsuspendované v chladenom PBS, celkovo približne v 40 ml.
Flagelín bol pripravený modifikáčiou metódy popísanej v Kostrzynska et al. (J. Bacteriol. 173, 937-946,1991) ako je stručne uvedené nižšie.
Bičíky boli odstránené homogenizáciou 2 krát po 30 sekúnd v Ultra-Thurrax mixéri (13,500 rpm). Bunky zbavené bičíka boli odstránené centrifugáciou počas 1 hodiny, pri +4°C pri 18 000 x g. Bičíky boli potom peletované ultracentrifugáciou počas 1 hodiny pri 100 000 x g. Výsledné pelety boli rozsuspendované v 4 ml 20 mM Tris-HCI tlmivého roztoku, pH 7,8, ktorý obsahuje 20 mM CaCh a bolo pridaných 160 μΙ trypsínu (25 mg/ml). Bičíky boli potom inkubované 80 minút pri +37 °C. Reakcia bola zastavená pridaním 40 μΙ trypsínového inhibítora (25 mg/ml).
V trypsínom ošetrenej vzorke bol rozpustený CsCI2 (4,9 g) a bolo pridaných
8,1 ml vody. Defrakčný index bol upravený na 1,27 g/cm3. Vzorky boli centrifugované 20 hodín pri 180 00 x g v širokooblúkovom rotore. Z gradientu bol odobratý viditeľný pás, cez noc bol dializovaný s 20 mM tlmivým roztokom, pH 7,0. Bola odmeraná optická denzita pri 280 a 310 nm a bol vypočítaný obsah proteínu. Materiál bol analyzovaný prostredníctvom SDS-PAGE. Po vyfarbení s Coomassie Brilliant modrou boli pozorované dva pásy zodpovedajúce flagelínovým podjednotkám FlaA a FlaB.
b) Výroba Helicobacterpyloríflagelínových monoklonálnych protilátok.
Od Bomholtovho množiaceho centra (Dánsko) boli kúpené samičky myši SPF BALK/c. Boli držané v bežných makrolónových klietkach s voľným dodávaním vody a potravy. Pri príchode mali zvieratá 4 až 6 týždňov.
Na imunizáciu BALB/c myší boli použité purifikované flagelíny z H. pylori kmeňa E50 na produkciu monoklonálnych protilátok ako bolo predtým popísané De St. Grothom a Scheideggerom (J. Immunol. Methods. 35, 1-21,1980). V stručnosti 5 až 10 pg vyčisteného flagelínu sa injektovalo i.p. a i.v. do Balb/c myši s a bez Freund sovho kompletného adjuvans 5 krát počas 109 dní. Boli pripravené pečeňové bunky a fúzovali sa štandartnými postupmi s myelómovými bunkami.
Výsledné testy boli analyzované ELISA testom podľa popisu (Lopez-Vidal et al. (1988) J.Clin. Microbiol. 26,1967-1972) použitím 5 pg/ml vyčistených flagelínov
-8na obalenie. Hybridómy preskrínované protilátkou s najvyššími ELISA titrami boli klonované a rozmnožené. Vrstva kultúry z vytvorených hybridómov bola zozbieraná a zmrazená pri -20 °C a korešpondujúce bunky produkujúce protilátku boli zmrazené v tekutom dusíku na dlhotrvajúce uskladnenie. Monoklonálna antiflagelínová protilátka používaná v nasledujúcich štúdiách bola označená HP50F48:13;1.
(c) Izolácia Helicobacter pylori flaA a flaB génov
FlaA a flaB gény boli klonované z Helicobacter pylori genomickej knižnice, ktorá bola skonštruovaná z Helicobacter pylori CCUG 17874 DNA v Lambda Zap Express.
Genomický kloň obsahujúci celú sekvenciu flaA bol izolovaný použitím dvoch prób, ktoré boli získané PCR amplifikáciou 5'- a 3'-oblastí génu. Boli syntetizované a použité na PCR amplifikáciu prób dva syntetické oligonukleotidy komplementárne k 5'-oblasti a dva komplementárne k 3'-oblasti predtým klonovaného Helicobacter pylori flaA génu (Leying H. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6(19), 2863-2874). Próby boli značené 32P Amershams Megaprime značiacim systémom. Bolo analyzovaných približne 30 000 individuálnych plakov. Bol izolovaný jeden plak, ktorý hybridizoval k 5'- a 3'-oblastiam génu. Bola uskutočnená in vivo excízia pBK-CMV plazmidu z Zap Express vektora a výsledný plazmid bol označený pS947. Použitím PRISM pripravenej reakcie farba/deoxy terminovanej cyklovej sekvenácie (PERKIN ELMER) bola určená kompletná sekvenica flaA génu (SEKV. Č: 1).
Genomický kloň obsahujúci celú sekvenciu flaB génu bol izolovaný použitím dvoch prób, ktoré boli získané PCR amplifikáciou 5'- a 3'-oblastí génu. Boli syntetizované a použité na PCR amplifikáciu prób dva syntetické oligonukleotidy komplementárne k 5'-oblasti a dva komplementárne k 3'-oblasti predtým klonovaného H. pylori flaB génu (Suerbaum S. et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 32783288)). Próby boli značené 32P Amershams Megaprime značiacim systémom. Bolo analyzovaných približne 30 000 individuálnych plakov. Bol izolovaný jeden plak, ktorý hybridizoval k 5'- a 3'-oblastiam génu. Bola uskutočnená in vivo excízia pBK-9CMV plazmidu z Zap Express vektora a výsledný plazmid bol označený pS948. Použitím PRISM pripravenej reakcie farba/deoxy terminovanej cyklovej sekvenácie (PERKIN ELMER) bola určená kompletná sekvenica flaA génu (SEKV. Č: 3) podľa postupu výrobcu.
(d) Konštrukcia expresného vektora pre rekombinantný Helicobacter pylori FlaA proteín
Za účelom produkcie vysokej hladiny rekombinantného FlaA proteínu (SEKV. Č: 2) bol konštruovaný expresný vektor pS997. Vektor obsahoval Helicobacter pylori flaA gén pod kontrolou T7 promótora.
Za účelom zmeny reštrikčných miest na 3'-konci flaA génu boli syntetizovné dva syntetické oligonukleotidy (SEKV. Č: 5 a SEKV. Č: 6) na PCR amplifikáciu. Ako templát na PCR amplifikáciu bol použitý plazmid pS947 (flaA-pBK-CMV). Uskutočnila sa PCR amplifikácia a namnožený fragment bol štiepený Xmal a Pstl, čím sa vytvoril 339 bp fragment. Tento fragment bol klonovaný do pUC19 a skonštruovaný plazmid bol označený pS989. Sekvencia konštruktu bola potvrdená sekvenovaním, ako bolo uvedené vyššie.
Na generovanie vhodných reštrikčných miest na 5'-konci flaA génu boli syntetizované dva syntetické oligonukleotidy (SEKV. Č: 7 a SEKV. Č: 8) na PCR amplifikáciu. Ako templát na PCR amplifikáciu bol použitý plazmid pS947 (flaApBK-CMV). Uskutočnila sa PCR amplifikácia a 462 bp namnožený fragment bol ligovaný do pCRII vektora (Mead, D.A. et al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663). Skonštruovaný plazmid bol označený ako pS991. Sekvencia konštruktu bola potvrdená ABI PRISM farbou terminovaným pripraveným reakčným kitom cyklovej sekvenácie (Perkin Elmer).
Elektroforézou na agarózovom géli bola izolovaná DNA kódujúca strednú časť flaA génu ako 774 bp EcoRI/Nhel fragment z plazmidu pS947. Tento fragment bol ligovaný spolu s 327 bp Nhel/Bglll Ndel/ fragmentom z pS989 a 438 bp EcoRI fragmentom z pS991 do Ndel/BamHI štiepeným pET3a (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89). Vytvorený plazmid bol označený pS997.
(e) Konštrukcia expresného vektora pre rekombinantný Helicobacter pylori FlaB proteín
Za účelom produkcie vysokej hladiny rekombinantného FlaB proteínu (SEKV. Č: 3) bol konštruovaný expresný vektor pS1000. Vektor obsahoval Helicobacter pylori flaB gén pod kontrolou T7 promótora.
Na generovanie vhodných reštrikčných miest na 5'-konci flaB génu boli syntetizované dva syntetické oligonukleotidy (SEKV. Č: 9 a SEKV. Č: 10) na PCR amplifikáciu. Ako templát na PCR amplifikáciu bol použitý plazmid pS948 (flaBpBK-CMV). Uskutočnila sa PCR amplifikácia a 478 bp namnožený fragment bol ligovaný do TA-vektora (Mead, D.A. et al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663). Sekvencia konštruktu bola potvrdená PRISM pripravenou reakciou farba/deoxy terminovanou cyklovou sekvenáciou (Perkin Elmer). Skonštruovaný plazmid bol označený ako pS998.
Za účelom zmeny reštrikčných miest na 3'-konci flaB génu boli syntetizovné dva syntetické oligonukleotidy (SEKV. Č: 11 a SEKV. Č: 12) na PCR amplifikáciu. Ako templát na PCR amplifikáciu bol použitý plazmid pS948 (flaB-pBK-CMV). Uskutočnila sa PCR amplifikácia a 1349 bp namnožený fragment bol ligovaný do TA-vektora (Méad, D.A. et al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663). Skonštruovaný plazmid bol označený pA. Sekvencia konštruktu bola potvrdená PRISM pripravenou reakciou farba/deoxy terminovanou cyklovou sekvenáciou (Perkin Elmer). Namnožený fragment bol štiepený Hindlll a Ncol, čím sa vytvoril 1158 bp fragment. Tento fragment bol klonovaný do pRSETB a skonštruovaný plazmid bol označený pS999. Sekvencia konštruktu bola potvrdená PRISM pripravenou reakciou farba/deoxy terminovanou cyklovou sekvenáciou (Perkin Elmer).
Elektroforézou na agarózovom géli bola izolovaná DNA kódujúca 5'-časť flaB génu ako 392 bp Ndel-Hindlll fragment z plazmidu pS998 (templát pS948 flaBpBK-CMV). Tento fragment bol ligovaný spolu s 1230 bp HindlII-BamHI fragmentom z pS999 a 4,6 kB Ndel-BamHI fragmentom T7 vektora pS637 (pET-3a) (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89). Vytvorený plazmid bol označený pSIOOO.
(f) Hostiteľské kmene a bakteriálne kultúry
Expresný vektor pS997 (flaA) alebo pS1000 (flaB) bol transformovaný do nasledujúcich kmeňov E.coli'. BL21(DE3); BL21(DE3)pLysS; a BL21(DE3)pLysE. Expresné experimenty boli v podstate uskutočňované tak ako popisuje Studier et al. (vyššie). Baktérie rástli v LB (4) médiu obsahujúcom 50 pg/ml karbenicilínu. Navyše, ak boli použité BL21 (DE3)pLysS a BL21 (DE3)pLysE, bolo médium doplnené chloramfenikolom. Na indukcu T7 expresného systému rástli kultúry do hustoty približne OD6oo = 0,5, a potom bolo na indukciu pridané 0,4 mM IPTG. Bunky boli zbierané približne 180 minút po indukcii. Pre plazmid pS997 vykazoval najvyššie hladiny expresie hostiteľský kmeň BL21(DE3)pLysE a pre plazmid pS1000 hostiteľský kmeň BL21(DE3)pLysS.
(g) Purifikácia inklúznych teliesok rekombinantných FlaA a FlaB vyprodukovaných v E. coli
Príprava rozpustných E.coli proteínov:
Jeden liter čerstvej bakteriálnej kultúry sa centrifugoval pri 11 300 x g počas 15 minút pri +4 °C. Výsledný bunkový pelet bol rozsuspendovaný v 10 ml tlmivého roztoku (40 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, pH 8,2, 2 mM pefablock SC (Boehringer Mannheim, Germany)). Suspenzia bola prenesená do JA-20 skúmaviek (Beckman) a zmrazená pri -20 °C. Pelet bol roztopený pri laboratórnej teplote a potom sonifikovaný 10x10 sek. x 10 cyklov (Soniprep 150, MS E Scientific Instruments) v ľadovom vodnom kúpeli. Jeden krát sa zopakoval postup zmrazenia, roztopenia a sonifikácie. Suspenzia bola centrifugovaná pri 23700 x g 15 minút pri +4°C. Odobratý bol supernatant obsahujúci rozpustné proteíny. Pelet bol resuspendovaný v tlmivom roztoku, ktorý bol popísaný vyššie, a jeden krát sa zopakoval celý postup zmrazenia, roztopenia a sonifikácie. Skombinovali sa dva supernatanty a prefiltrovali sa cez 0,45 pm filter. Pelet bol rozsuspendovaný v 10 ml 40 mM Tries-HCI, 0,1 mM EDTA, pH 8,2 a zmrazený pri -20 °C.
Premývanie inklúznych teliesok:
-12Peletová suspenzia obsahujúca buď nerozpustný FlaA alebo FlaB bola centrifugovaná pri 23 300 x g 15 minút pri 4 °C a resuspendovaná v 10 ml premývacieho tlmivého roztoku (100 mM Tris pH 7,0, 5 mM EDTA, 2 M močovina, 2% Triton X-100). Suspenzia bola centrifugovaná pri 23 300 x g 30 minút pri +4 °C. Pelet bol resuspendovaný v premývacom tlmivom roztoku a premývanie sa dva krát zopakovalo. Výsledný pelet sa rozsuspendoval v 100 mM Tris, 5 mM EDTA pH 7,0 a centrifugoval sa tak, ako bolo uvedené vyššie. Výsledný pelet sa uskladnil pri -20 °C.
Denaturačné/znovuformovacie experimenty
Premyté pelety obsahujúce buď nerozpustný FlaA alebo FlaB boli rozpustené v denaturačnom tlmivom roztoku (50 mM glycín, 8 M GuHCI, pH 9,6) a centrifugované pri 64 000 x g počas 30 minút pri +4 °C. Supernatant bol prefiltrovaný cez 0,2 pm filter a koncentrácia proteínu sa stanovila BCA-testom (Pierce, Holandsko) Supernatant obsahujúci denaturované proteíny mohol byť uskladnený pri +4 °C. Supernatant bol rozriedený na 1 až 3 mg/ml s 50 mM glycínom, 1 mM EDTA, 10% sacharózou, 4 M močovinou, pH 9,6 a dializovaný cez noc pri +4 °C oproti rovnakému tlmivému roztoku. Dializačný tlmivý roztok bol zamenený 60 mM etanolamínom, 10% sacharózou, 1 mM EDTA pH 9,6 a dialýza pokračovala cez noc pri +4 °C. Znovusformovaná vzorka bola centrifugovaná pri 10 000 x g počas 5 až 10 minút pri +4 °C. Supernatant obsahoval znovusformovaný proteín. Zvyčajne bolo 75 % proteínového obsahu v rozpustnej frakcii. FlaA a FlaB proteín bol pri uskladnení pri +4 °C v roztoku ale pri uskladnení pri -20 °C bol precipitovaný.
(h) Štúdia antigenicity rekombinantných FlaA aFIaB proteínov
Aby sa vytvorilo antisérum proti rekombinantnému FlaA alebo FlaB, boli tieto proteíny vyrezané s SDS-PAGE gélov farbených Coomassie Brilliant modrou. Na celkovo štyri reimunizácie bolo použitých približne 500 gg z každého. Western imunoblotingom a ELISA detekciou sa určilo, že výsledné polyklonálne protilátky proti FlaA a FlaB boli imunoreaktívne voči zodpovedajúcim antigénom a krížovo reagovali navzájom proti sebe. Obe polyklonálne antiséra boli imunoreaktívne s
-13vyčistenými flagelárnymi prípravkami z Helicobacter pylori kmeňov E32 alebo E50, čo sa určilo Western imunoblotingom. Rekombinantný FlaA, avšak nie rekombinantný FlaB, bol imunoreaktívny s monoklonálnou protilátkou (Mab104a) vytvorenou proti vyčistenému Helicobacter pylori FlaA (Kostrzynska, M. et al. (1991) J. Bacteriol. 173(3) 937-946). Oba rekombinantné FlaA a FlaB boli imunoreaktívne s monoklonálnymi protilátkami vytvorenými proti vyčisteným flagelárnym prípravkom z Helicobacter pylori kmeňa E32.
Popis obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Terapeutická orálna imunizácia myši infikovanej H. pylori. Výsledky sú uvádzané v CFU (kolónie vytvárajúce jednotky) H. pylori na 25 mm2 žalúdočnej sliznice (hodnoty geometrického priemeru). Skratky: CT, cholera toxín; Mp, membránové proteíny.
Obr. 2: Titre sérových protilátok proti H. pylori flagelínu v infikovaných kontrolných zvieratách a v infikovaných zvieratách, ktoré boli následne imunizované H. pylori flagelínom. Hodnoty sú vyjadrené ako relatívne OD hodnoty.
Obr. 3: Účinok monoklonálnych protilátok proti flagelínu na kolonizáciu žalúdka myší H. pylori. Pred inokuláciou myší boli protilátky zmiešané s H. pylori (n = 10 vo všetkých skupinách). Znázornené sú hodnoty geometrického priemeru CFU.
Obr. 4: Kolonizácia žalúdka H. pylori vyjadrená ako geometrický priemer v sliznici antra a tela. Zvieratá, ktoré dostali rekombinantný FlaA + CT vykazovali významne zníženú kolonizáciu antra. 3/10 zvierat nemali žiadnu baktériu v antre. *p < 0,05 (Wilconxon-Mann-Whitney sign rank test).
Obr. 5: IgG sérová odpoveď na H. pylori infekciu a na imunizáciu rekombinantným FlaA + CT. Znázornené údaje sú priemer ± SEM. ELISA platne boli pokryté membránovým proteínom z kmeňa 244 (m.p. 244) alebo s rFlaA. Všetky zvieratá vykazovali imunitnú odpoveď na H. pylori infekciu. Len zvieratá, ktorým bol podaný rFlaA + CT mali IgG protilátky proti FlaA.
Obr. 6: Slizničné IgA protilátky proti FlaA v sliznici žalúdka a dvanástnika. Údaje sú znázornené ako priemer ± SEM.
-14Príkladv uskutočnenia vynálezu
Príklad 1:
Helicobacter pylorí flagel ín
1.1. Infekcia a imunizácia
Po najmenej jednotýždňovej aklimatizácii boli BALB/c myši infikované typom 2 kmeňa Helicobacter pylorí (kmeň 244, pôvodne izolovaný z pacienta so žalúdočnými vredmi). Tento kmeň bol už skôr overený ako dobrý kolonizátor myšacieho žalúdka. Baktérie zo zásoby držanej pri -70 °C rástli cez noc v Brucella médiu doplnenom o 10% fetálne hovädzie sérum pri +37 °C v mikroaerofilnej atmosfére (10% CO2, 5% O2). Zvieratám bola podaná orálna dávka omeprazolu (400 gmol/kg), aby sa znížila sekrécia kyseliny, a aby sa zlepšilo následné prežívanie Helicobacter pylorí. 3 a 6 hodín po omeprazole poli zvieratá inokulované približne 108 čerstvých Helicobacter pylorí kmeňa 244. Infekcia bola kontrolovaná (pozri nižšie) na kontrolných zvieratách 2 až 3 týždne po inokulácii, pred začiatkom experimentu.
Mesiac po infekcii boli štyri skupiny myší (10 zvierat v skupine) imunizované perorálne 4 krát počas 34 dňovej periódy (dni 1,15, 25 a 35) nasledovne:
Skupina 1: Kontrola, vehikulum (PBS)
Skupina 2: Cholera toxín (CT), 10 gg/zviera Skupina 3: H.p. flagelín, 100 gg/zviera + 10 gg CT Skupina 4: Membránové proteíny, 500 gg/zviera + 10 gg CT
Ako pozitívna kontrola boli myši v skupine 4 imunizované surovými membránovými proteínmi z Helicobacter pylorí kmeňa 244. Ako adjuvans bolo zvieratám v skupine 3 a 4 tiež podávaných 10 mg cholera toxínu s každou imunizáciou. Pri každej imunizácii bolo podávané celkové množstvo 0,3 ml. Omeprazol (400 gmol/kg) bol zvieratám podávaný orálne 2 až 3 hodiny pred imunizáciou, aby sa antigén ochránil pred kyslou degradáciou. Zvieratá boli usmrtené 4 týždne po konečnej imunizácii.
1.2. Analýza infekcie
Myši boli usmrtené pomocou CO2 a cervikálnou dislokáciou. Otvoril sa abdomen a bol vybraný žalúdok. Po prerezaní žalúdka pozdĺž väčšieho zakrivenia bol tento vymytý fyziologickým roztokom. Oblasti 25 mm2 sliznice antra a tela žalúdka boli oddelene zoškrabané chirurgickým skalpelom. Zoškrabaná sliznica bola rozsuspendovaná v Brucella médiu a rozmiestnená na Blood Skirrow platne. Platne boli inkubované v mikroaerofilných podmienkach 3 až 7 dní a počítaním množstva kolónií bola určená hodnota CFU (colony-forming units - jednotky vytvárajúce kolónie). Identita Helicobacter pylori bola overená močovinovým a katalázovým testom a priamou mikroskopiou a Gram farbením.
Všetky kontrolné zvieratá, ako aj tie, ktoré dostali CT, boli infikované tak v antre ako aj v tele žalúdka (obr. 1). Zvieratá aktívne imunizované H.p. flagelínom mali významne (p < 0,01) znížený obsah baktérií (CFU hodnoty) v porovnaní s kontrolami. Vo flagelínovej skupine u piatich myší nebola detegovaná žiadna baktéria v tele žalúdka a jedna myš bola negatívna aj v antre. Nižšie ale významné (p < 0,01) zníženie CFU bolo tiež pozorované v antre po vakcinácii s Helicobacter pylorí membránovými proteínmi.
1.3. Analýza imunitnej odpovede
Sérové protilátky boli zozbierané z krvi odobratej punkciou srdca pri ukončení štúdie. Pred centrifugáciou bola krv zriedená rovnakým množstvom PBS. Sérum bolo do analýzy držané pri -20 °C. Sérové protilátky boli merané použitím ELISA pričom bol platovaný vyčistený H.p. flagelín a potom bolo pridané sérum v riedenej sérii. Ako konjugát bola použitá kozia anti-myšia Ig protilátka značená fosfatázou. Výsledky (obr. 2) boli čítané ako titre z OD grafických hodnôt a porovnané so štandardnou krivkou. Neinfikované kontroly mali hodnoty nižšie ako
80. V kontrolných myšiach infikovaných Helicobacter pylori sa titre protilátok zvýšili do 189. V infikovaných zvieratách po flagelínovej imunizácii sa tieto kontroly zvýšili do 424.
1.4. Pasívna ochrana
-16Cieľom tejto štúdie bolo zistiť či väzba monoklonálnych protilátok na Helicobacter pylori namierená na Helicobacter pylori flagelín by mohla znížiť alebo zabrániť kolonizácii myší baktériou.
Boli použité tri skupiny myší (10 zvierat v skupine). Jedna skupina bola vybudená zmesou čerstvo narasteného Helicobacter pylori kmeňa 244 a mohoklonálnou protilátkou HP50F-48:13;1. Pred inokuláciou bola zmes inkubovaná 10 minút pri laboratórnej teplote. Na porovnanie bola jedna skupina inokulovaná len Helicobacter pylori kmeňom 244, a jednej skupine bola podaná zmes Helicobacter pylori kmeňa 244 a kontrolnej monoklonálnej protilátky namierene proti E.coli termostabilnému proteínu (ST). Všetky inokulácie boli uskutočňované perorálne a v objeme 0,3 ml.
Dva týždne po vybudení boli myši usmrtené a analyzované na prítomnosť žalúdočného Helicobacter pylori ako je popísané vyššie (obr. 3). Všetky kontrolné zvieratá, tak tie, ktoré dostali len baktérie ako aj tie, ktoré dostali baktérie a E. coli ST Mab, boli dobre infikované. Naproti tomu žiadne zo zvierat inokulovaných zmesou baktérií a flagelínu Mab nebolo infikované, štatistický významný rozdiel (p <0,001).
Príklad 2:
Rekombinantný FlaA (rFlaA)
Experiment sa uskutočňoval ako v príklade 1, s výnimkou toho, že zvieratá boli usmrtené a zhodnotené 10 dní po poslednej imunizácii (deň 45). Tri skupiny zvierat (10 na skupinu) boli ošetrované podľa schémy uvedenej nižšie:
Skupina 1: Kontrola, vehikulum (PBS)
Skupina 2: Cholera toxín (CT), 10 gg/zviera Skupina 3: rFlaA, 100 gg/zviera + 10 gg CT
Odpoveď na orálnu imunizáciu bola hodnotená pomocou H.p. CFU v sliznici antra a tela žalúdka. V žalúdku a dvanástniku boli determinované sérové IgG protilátky ako aj slizničné Ig a IgA protilátky.
-17Slizničné protilátky boli zbierané nasledujúcou technikou. Jedna polovica vymytého žalúdka bola umiestnená slizničnou stranou smerom hore na kus papiera. Podobným spôsobom bol rozrezaný a otvorený dvanástnik a bol uložený slizničnou stranou smerom hore. Jeden štandardizovaný okrúhly filtračný papier (30,4 mm2) bol umiestnený na antrum a jeden na telo žalúdka. Po 10 minútach boli oba papiere premiestnené do skúmavky s 200 μΙ špeciálneho tlmivého roztoku obsahujúceho inhibítory proteáz. Rovnakým spôsobom boli do sliznice dvanástnika umiestnené pásiky papiera 4,8 x 19 mm (91,2 mm2) a následne boli umiestnené do oddelenej skúmavky s tlmivým roztokom. Po minimálne jednej hodine extrakcie filtračných papierov boli spolu zliate tlmivé roztoky z 10 myší v rámci každej skupiny. Zliate roztoky boli buď priamo použité na ELISA merania koncentrácie protilátky alebo boli držané zmrazené pri -20 °C.
Sérové protilátky boli zozbierané z krvi odobratej punkciou srdca pri ukončení štúdie. Pred centrifugáciou bola krv zriedená rovnakým množstvom PBS. Sérum bolo do analýzy držané pri -20 °C.
Slizničné protilátky boli merané použitím ELISA, pričom platne boli pokryté rFlaA a potom bol pridaný extrakt sliznice. ELISA sa vizualizovala anti-myšími Ig alebo anti-myšími IgA protilátkami značenými fosfatázou. Anti-lg protilátky boli typu anti-ťažký/anti-ľahký reťazec, ktoré normálne detegujú všetky typy protilátok. Štandardné krivky boli vytvorené pokrytím známych množstiev myších IgA a Ig.
Sérové Ig protilátky boli merané použitím ELISA, pričom platne boli pokryté buď čiastočnou frakciou (membránový proteín; m.p.) Helicobacter pylori kmeňa 244 alebo s rFlaA a potom boli pridané rôzne riedenia séra. ELISA bola vizualizovaná anti-myšími-lg-protilátkami značenými fosaftázou ako je popísané vyššie.
Výsledky
Všetky kontrolné zvieratá a CT ošetrené zvieratá boli dobre infikované tak v antre ako aj v tele žalúdka. V zvieratách, ktoré dostali rFlaA + CT bol stupeň kolonizácie významne nižší v sliznici tela žalúdka (*p < 0,05) (obr. 4). V rFlaA+CT skupine jedno zviera nemalo žiadny Helicobacter pylori m antre a 3 zvieratá nemali žiadny Helicobacter pylori v tele žalúdka.
-18Systémová imunitná odpoveď, meraná ako IgG v sáre, vykazovala imunitnú reaktivitu k infekčnému kmeňu 244 (kontrolná a CT skupina). Len v zvieratách, ktoré dostali rFlaA + CT mohla byť zaznamenaná imunitná odpoveď k FlaA (obr.
5).
Lokálna (slizničná) imunitná odpoveď, meraná ako IgA, vykazovala špecifickú imunitnú reaktivitu proti FlaA po imunizácii s FlaA + CT. Žiadnu takúto odpoveď nebolo vidieť v kontrolných zvieratách, pozri obr. 6.
Možno zhrnúť, že rekombinantný FlaA môže indukovať eradikatívnu imunitnú odpoveď, ktorá je schopná znížiť alebo zničiť Helicobacter pylori infekciu.
Príklad 3
Rekombinantný FlaB (rFlaB)
Experiment sa uskutočňoval a analyzoval ako je popísané v príklade 2. Tri skupiny zvierat (10 na skupinu) boli ošetrované podľa schémy uvedenej nižšie: Skupina 1: Kontrola, vehikulum (PBS)
Skupina 2: Cholera toxín (CT), 10 gg/zviera Skupina 3: rFlaB, 100 gg/zviera + 10 gg CT
Výsledky
Všetky kontrolné zvieratá a CT ošetrené zvieratá boli dobre infikované tak v antre ako aj v tele žalúdka. V zvieratách, ktoré dostali rFlaB + CT bol stupeň kolonizácie (cfu) významne nižší v sliznici antra žalúdka, geometrický priemer 1005 vs 83(*p < 0,05, Wilcoxon-Mann-Whittney Sign Rank Test). V rFlaB + CT skupine 3/10 zvierat nemalo žiadny Helicobacter pylori v antre. Len v zvieratách, ktoré dostali rFlaB, mohla byť meraná sérová IgG odpoveď na FlaB, to znamená 85,7 ± 46,0 gg/ml (priemer ± SEM, n=10).
Lokálna (slizničná) odpoveď na orálnu imunizáciu bola meraná ako špecifické IgA protilátky k rFlaB v sliznici žalúdka a dvanástnika. , vykazovala špecifickú imunitnú reaktivitu proti FlaA po imunizácii s FlaA + CT. Hodnoty boli 3,3
-19± 2,0 ng/ml v sliznici žalúdka a 12,1 ±6,6 ng/ml v sliznici dvanástnika (priemer ± SEM, n=10)
Možno zhrnúť, že rekombinantný FlaB môže indukovať eradikatívnu imunitnú odpoveď, ktorá je schopná znížiť alebo zničiť Helicobacter pylori infekciu.
-20ZOZNAM SEKVENCII (1) Všeobecné informácie:
(I) Prihlasovateľ:
(A) Meno: Astra Aktiebolag (B) Ulica: Västra Mälarehamnen 9 (C) Mesto: Sodertälje (D) Krajina: Švédsko (E) Poštové smerovacie číslo: S-151 85 (G) Telefón: +46 8 553 260 00 (H) Fax: +46 8 553 288 20 (ii) Názov vynálezu: Bakteriálne antigény a vakcínové kompozície (iii) Počet sekvencii: 12 (iv) Počítačom čitateľná forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software:
(2) Informácie o sekv. č. 1:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 1800 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znaky:
(A) meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 139... 1671 (D) Iné informácie: /produkt = FlaA proteín
-21(xi) Popis sekvencie: sekv. č. 1:
TTTATTATAG CCCATTTTCA TGCTCTTľTA AATTTTGCTT TTAÄAGTAAA GCCCTTTAAA
ATTTCAAACT TTAÄCCGA7A A7AGTTCCAA CĽAAAGCAA GGATGCC7TT GGGT77TTTA
120
TAACAAGGAG TTACAACA ATG GCT TTT CAG GTC AAT ACA AAT ATC AAT GCG171
Met Ala Phe Gin Val Asn Thr Asn Íle Asn Ala
S10
ATG AAT GCG CAT GTG CAA TCC GCA CTC ACT CAA AAT GCG CTT AAA ACT 219
Mex Asn Ala His Val Gin Sex Ala Leu Thr Gin Asn Ala Leu Lys Thx
15 20 25
TCA TTG GAG AGA TTG AGT TCA GGT TTA AGG ATT AAT AAA GCG GCT GAT 267
Sex Leu Glu Arg Leu Sex Sex Gly Leu Arg Xle Asn Lys Ala Ala Asp
30 35 40
GAC GCA TCA GGC ATG ACG GTG GCG GAT TCT TTG CGT TCA CAA uua 315
Asp Ala Sex Gly Met Thr Val Ala ASP Sex Leu Arg Sex Gin Ala Sex
45 50 55
AGT TTG GGT CAA GCG « Man Λ* 1 GCC AAC ACG AAT GAC GGC ATG GGG ATT ATC 363
Ser Leu Gly Gin Ala Xle Ala Asn Thx Asn Asp Gly Met Gly íle Zle
50 65 70 5
CAG GTT GCG GAT AAG GCT ATG GAT GAG CAG TTG AAA ATC TTA GAC ACC 411
Gin val Ala Asp Lys Ala Met Asp Glu Gin Leu Lys Xle Leu Asp Thr
BO B5 90
GTT AAG GTT AXA GCG ACT CAA GCG GCT CAA GAC taju CAA ACT ACA GAA 459
Val Lvs val Lys Ala Thr Glr. Ala Ala Gin Asp Gly Gin Thr Glu
100 105
TCT CGT AAA GCG ATT CAA TCT GAC ATC GTT CGT TTG ATT CAA GST TTA 507
Ser Arg Lys Ala Xle Gin Sex Asp Xle Val Arg Leu íle Gin Gly Leu
110 115 120
GAC « «Φ ΑΛΑ ATC GGT AAC ACG ACT ACT TAT AAC GGG CAA GCG TTA TTG TCT 555
Asp Asn Xle Gly Asn Thr Thx Thr Tyr Asn Gly Gin Ala Leu Leu Ser
125 130 135
GGT CAA TTC ACT AAC AAA GAA TTC CAA GTA GGG GCT TAT TCT AAC CAA 603
Gly Gin Phe Thr Asn Lys Glu Phe Gin Val Gly Ala Tyr Ser Asn Gin
140 145 150 155
AGT ATT AAG GCT TCT ATC GGC TCT ACC ACT TCC GAT AAA ATC GGT CAG 651
Sex íle Lys Ala Sex Zle Gly Sex Thr Thr Ser Asp Lys íle Gly Gin
160 165 170
GTT CGT ATC GCT ACA GGC GCG TTA ATC ACG GCT TCT GGG GAT ATT AGC 699
Val Arg Zle Ala Thr Gly Ala Leu íle Thr Ala Ser Gly Asp Zle Sex
175 180 185
TTG ACT TTT AAA CAA GTG GAT GGC GTG AAT GAT GTA ACT TTA GAG AGC 747.
Leu Thr Phe Lys Gin Val Asp Gly Val Asn Asp Val Thr Leu G1U Sex
190 195 200
GTG AAA GTC TCT AGT TCA GCA GGC ACA GGG ATT GGC GTG TTA GCG GAA
Val Lys Val Sex Sex Sex Ala Gly Thr Gly Xle Gly Val Leu Ala Glu 205 210215
795
AGC GAT GTG SC3 GTC CAG TCA GGA AGT • iw AGT AAT 691
Ser Asp Val Ala Val Gin Ser Gly Ser Leu Ser Asn
240 245 250
GGG ATC CAT TTG G3T AAT A7C CCA GAT ATT AAG AAA 939
Gly íle HÍ5 Leu Gly Asn íle Ala Asp íle Lys Lys
AAA AGC ATC AAT GTC GTT TCG GCT TCT GAC TCA CAG
Lys Ser íle Asn Val Val Ser Ala Ser Asp Ser Gin
350 355
ACA e·*»/· UUJ ATT GGT TTT GGG GAA TCT CAA GTG GCA GAA
Thr Ala íle Gly Phe Gly G1U Ser Gin Val Ala Glu
365 370 375
TTG CGC GAT GTT ACT GGG AAT TTT AAC GCT AAT GTC
Leu Ars Asp Val Thr Gly Asn Phe Asn Ala Asn Val
380 385 390
GGT GCG AAC TAT AAC GCC GTC ATT GCT AGC GGT AAT
Gly Ala Asn Tyr Asn Ala Val íle Ala Ser Gly Asn
míG CAA AAT CAA ATG Ά7Τ AGC ACC GTG AAT AAC ATC AGC ATC ACT CAA
Val Gin Asa Gla Met íle Ser Thr Val Asn Asn íle Ser íle Thr Gin
445 450 455
GTG AAT GTT AAA GCG GCT GAA TCT CAA ATC AGG GAT GTG GAT TTC GCT
Val Asa Val Lys Ala Ala Glu Ser Gla íle Arg Asp Val Asp Phe Ala
460 465 470 47S
GAA GAG AGT Gvu AAT ttc AAT AAA AAC AAC ATT TTG GCG CAA TCA GGC
Glu Glu Ser Ala Asn Phe Asn Lys Asa Asn íle Leu Ala Gla Ser Gly
480 485 490
AGC TAT GC3 • «Λ AGT CAA GCC m * «F λλΓ ACC GTC CAA CAA AAT ATC T7A AGG
Ser Tyr Ala Met Ser Gin Ala Asa ΤΪ13Γ Val Gla Gin Asn íle Leu Arg
455 500 505
CTT 7TA ACT TAG 7TTTAAGAAA GGTG7T7GTA TGGGGCTAAC GCTT7AAGCG
Leu Leu Thr ·
510
7TGGTTTTTC C-CTT7AA77T 7TACTTC7TT TTTÄATAÄAA TACTCTTT7T GAT7CCT~T
TATCATAGGC GGT7A7TGTG T7GGGTAGT
1515
1553
1611
1559
1711
1771
1800 • (2) Informácie o sekv. č. 2:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 511 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 2:
Met Ala Phe Gin Val Asn Thr Asn íle Asn Ala Met Asn Ala MísVal
S 1015
Gin Ser Ala Leu Thr Gin Asn Ala Leu Lys Thr Ser Leu Glu ArgLeu
2530
Ser Ser Gly Leu Arg íle Asn Lys Ala Ala Asp Asp Ala Ser Gly Met
4045
-24Thr Val Ala Asp Ser Leu Arg Ser Gin Ala Ser Ser Leu Gly Gin Ala 50 5550
Zle Ala Asn Thr Asa Asp Gly Met Gly Zle Zle Gin Val Ala AspLys
Č5 70 75BO
Ala Ket Asp Glu Gin Leu Lys íle Leu Asp Thr Val Lys Val LysAla
9055
Thr Gin Ala Ala Gin Asp Gly Gin Thr Thr Glu Ser Arg Lys Ala Zle 100 105110
Gla Ser Asp Zle Val Arg Leu Zle Gla Gly Leu Asp Asn Zle Gly Asn
115 120 125
Thr Thr Tyr Asn Gly Gin Ala Leu Leu Ser Gly Gla Phe Thr Asn
130 135 140
Lys Glu Phe Gla Val Gly Ala Tyr Ser Asn Gin Ser Zle Lys Ala Ser
145 150 155 150
Zle Gly Ser' Thr Ser Asp Lys Zle Gly Gin Val Arg Zle Ala Thr
165 170 175
Gly Ala Leu íle Thr Ala Ser Gly Asp Zle Ser Leu Thr Phe Lys Gin
180 185 190
Val Asp Gly Val Asa Asp val Thr Leu Glu Ser val Lys Val Ser Ser
195 200 205
Ser Ala Gly Thr Gly Zle Gly Val Leu Ala Glu Val Zle Asn Lys Asn
210 215 220
Ser Asn 225 Arg Thr Gly Val Lys Ala Tyr Ala Ser Val Zle Thr Thr Ser 240
230 235
Asp Val Ala Val Gla Ser Gly Ser Leu Ser Asn Leu Thr Leu Asn Gly
245 250 255
Zle Sís Leu Gly Asa Zle Ala Asp Zle Lys Lys Asn Asp Ser Asp Gly
260 265 270
Arg Leu Val Ala Ala Zle Asn Ala Val Thr Ser Glu Thr Gly Val Glu
275 280 285
Ala Tyr Thr Asp Gin Lys Gly Arg Leu Asn Leu Arg Ser Zle Asp Gly
290 295 300
Arg Gly Zle Glu Zle Lys Thr Asp Ser Val Ser Asn Gly Pro Ser Ala
305 310 315 320
Leu Thr Met Val Asn Gly Gly Gin Asp Leu Thr Lys Gly Ser Thr Asn
325 330 335
Tyr Gly Arg Leu Ser Leu Thr Arg Leu Asp Ala Lys Ser Zle Asn Val 340 345350
Val Ser Ala Ser Asp Ser Gin His Leu Gly Phe Thr Ala Zle Gly Phe
355 360 365
Gly Glu Ser Gla Val Ala Glu Thr Thr Val Asn Leu Arp Asp Val Thr
370 375 3B0
Gly Asn Phe Asn Ala Asa Val Lys Ser Ala Ser Gly Ala Asa Tyr Asn
385 390 395 400
Ala Val Zle Ala Ser Gly Asn Gin Ser Leu Gly Ser Gly Val Thr
405 410 415
Leu Arg Gly Ala Met Val Val Zle Asp Zle Ala Glu Ser Ala Met Lys
420 425 430
Met Leu Asp Lys Val Arg Ser Asp Leu Gly Ser Val Gin Asa Gin Met
435 440 445
Zle Ser Thr Val Asn Asn Zle Ser Zle Thr Gin Val Asn Val Lys Ala
450 455 460
Ala Glu Ser Gla Zle Arg Asp Val Asp Phe Ala Glu Glu Ser Ala Asn
465 470 475 480
Phe Asa Lys Asn Asa Zle Leu Ala Gin Ser Gly Ser Tyr Ala Met Ser
485 490 495
Glr. Ala Asa Thr Val Gin Gin Asn Zle Leu Arg Leu Leu Thr *
500 505 510
(2) Informácie o sekv. č. 3:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 1800 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znaky:
(A) meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 138... 1682 (C) (D) Iné informácie: /produkt = FlaB proteín (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 3:
TA77AÄ7GÄA TGATTGTAGC ATAGAATTTT GACTAääCGA TTCAT7AAAC CATÄÄAÄACC60
ATÄÄCAGCGT TAAAAATCAA AGAGTTGGAA CACCCTTTGC TTGACTAACA GCAAATATCT120
ATGCAAASGA TGCÄAÄC ATG AGT TTT AGG ΑΤΑ AAT ACC AÄT ATC GCC GCT170
Met Ser Phe Arg íle Asn Thr Asn íle Ale Ale
515520
TTA Λ*. A TCT CAT GCG GTA GGG GTT CAA ÄAC AAC AGA GAC CTT TCA AGT 218
Leu u* Ser His Ala Val Glý Val Gin Asn Asn Arg Asp Leu Ser Ser
525 530 535
•RR Cl'· GAA AAG TTA AGC TCA RRR υϋν CTT AGG ATC AAT AAA GCC GCT GAC 266
Ser Lsu Glu Lys Leu Ser Ser Gly Leu Arg íle Asn Lys Ala Ala Asp
540 545 550
GAT . u A AGT GGG ATG GCG ATC GCT GAT AGC TľA AGG AGT CAA AGC GCG
Asp Ser Ser Gly Met Ala íle Ala Asp Ser Leu Arg Ser Gin Ser Ala
ΞΞ5 560 565 570
AAT TľA GGC CAG GCG ATT CGC AAT GCT AAT GAC GCT ATT GGT ATG GTT
Asn Leu Gly Gin Ala íle Arg Asn Ala Asn Asp Ala íle Gly Met Val
575 580 585
314
362
CAA ACC GCA GAT AAA GCG ATG GAT GAG CAA ATC AAA ATC TFA GAC ACC 410
Gin Thr Ala Asp Lys Ala Met Asp Glu Gin Zle Lys íle Leu Asp Thr
590 595 600
ATT AAA ACC AAA GCC GTT CAA GCC GCT CAA GAT GGG CAA ACT TTA GAA 458
íle Lys Lys Ala Val Gin Ala Ala Gin Asp Gly Gin Thr Leu Glu
605 610 615
AGC CSÄ AGA GCG CTC CAA AGC GAT ATT CAA AGG TTG TTA GAA GAA CCA 506
Ser Arg ÄTH A*a Leu Gin Ser Asp íle Gin Arg Leu Leu Glu Glu Leu
620 625 630
3ÄC AAT ATC GCT AAC ACC ACA AGC TTT AAC GGC CAA CAA ATG CTT TCA 554
Asp Asn íle Ala Asn Thr Thr Ser Phe Asn Gly Gin Gin Met Leu Ser
635 640 645 650
GGA AGT TTT TCT AAC AAA GAA TTT CAA ATT GGC GCG 7ÄT.TCT AAC ACC 602
Gly Ser Phe Ser Asn Lys Glu Phe Gin íle Gly Ala Tyr Ser Asn Thr
655 660 665
ACG GTT AAA *** www TCT ATT GGC TCA ACA AGC TCA GAT · r· ATT bínj CAT 650
Thr Val Lys Ala Ser íle Gly Ser Thr Ser Ser Asp Lys íle Gly :-:ís
670 675 680
GTA CGC ATG GAA ACT TCT TCT TTT AGC GGT GCA GGC A7G CTC GCT AGC 698
Val Arg Met Glu Thr Ser Ser Phe Ser Gly Ala Gly Met Leu Ala Ser
685 690 695
GCG GCG GCG CAA AAC TTG ACT GAA GTG GGA TTG AAT TTC AAA CAA GTC 746
Ala Ala Ala Gin Asn Leu Thr Glu Val Gly Leu Asn Lys Gin val
700 705 710
ΑΛΤ GGC GTG AAT GAT TAT AAG ATT GAA ACC GTG CGT ATT TCT ACA AGC 794
Asn Gly Val Asn Asp Tyr Lys Zle Glu Thr Val Azg íle Ser 7*m Ser
715 720 725 730
GCT GGC ACT GGG ATT GGG UUtf TTA AGC GAG ATT ATC AAT CGC TTT TCT B42
Ala Gly Tbc Gly íle Gly Ala Leu Ser Glu íle íle Asa Arg The Ser
735 740 745
AAC ACC TTA GGC GTT AGG GCG TCT TAT AAT GTC ATG GCT ACC GGC GGC 890
Asn T*'“ Leu Gly Val Ala Ser Tyr Asa Val Met Ala Thr Gly Gly
750 755 750
ACT CCC GTG CAA TCA . GGA ACT 3TG AGA GAA CTC ACC ATT AAT GGC GTA 938
*hr Pro Val Gla Ser Gly Thr Val Arg Glu Leu Thr íle Asa Gly val
755 770 775
GAA ATT GGG ACC GTG AAT GAT GTG CAT AAA AAC GAC GCT GAT GGG AGA 985
Glu íle Gly Thr Val Asa Asp Val His Lys Asa Asp Ala Asp Gly Arg
780 785 790
TTG ACT AAC GCG ATC AAC TCC GTC AAA GAC AGG ACC GGC GTA GAA GCG 1034
Leu Thr Asa Ala íle Asa Ser Val Lvs Asp Arg Gly Val Glu Ala
79S 600 BO5 810
AGC TTG GAT ATT CAA GGG CGC ATT AAT TTG CAC TCC ATT GAC GGG CGT 10S2
Ser Leu Asp íle Gla Gly Arg íle Asn Leu His Ser íle Asp Gly Arg
BIS 620 825
GCG ATT TCT GTG CAT GCA GCG AGC GCG AGC GGT CAG GTT TTT GGG GGA 1130
Ala Zle Ser val nis Ala Ala Ser Ala Ser Gly Gla Val Phe Gly Gly
630 635 840
GGG AAT TTT GCA uuu ATT TCT uue ACA CAG CAT GCG GTG ATT GGG CGC 1173
Gly Asa The Ala Gly íle Ser Gly Thr Gin EÍS Ala Val íle Gly . Arg
845 850 655
x xA ACC TTA ACT AGA . ACC GAC GCT AGA GAC ATC ! ATT GTA . AGC GGT ' GTG 1226
Leu Thr Leu Thr Arg 1 Thr Asp Ala Arg Asp Zle i íle Val Ser Gly Val
850 865 670
AAT TTT AGC CAT GTG GGC TTT CAT TCC GCT CAA . GGG GTG GCA GAA TAC 1274
Asn Phe Ser Eis Val Gly Phe Xís Ser Ala Gla Gly Val Ala Glu Tyr
B75 6B0 8B5 890
ACC GTG AAT TTG AGA GCG GTT AGG GGC ATT TTT GAT GCG AAT GTG GCT 1322
Thr Val Asn Leu Arg Ala Val Arg Gly íle Phe Asp Ala Asa Val Ala
895 900 905
TCA GCA GCC GGA GCG AAC GCT AAT GGC GCA CAA GCG GAG ACC AAT TCT 1370
Ser Ala Ala Gly Ala Asa Ala Asa Gly Ala Gla Ala Glu Thr Asa Ser
910 915 920
CAA GGT ATA GGG GCT GGG GTA ACA AGC CTT AAG GGG GCG ATG ATT GTG 1418
Gin Gly íle Gly Ala Gly Val Thr Ser Leu Lys Gly Ala Met íle Val
925 930 935
ATG GAT ATG GCA GAT TCT GCA CGC ACG CAA TTA GAC AAG ATC CGC TCG 1456
Met Asp Met Ala Asp Ala Arg Thr Gla Leu Asp Lys íle Arg Sfl*
»40 945 950
GAT ATG Asp MSt
955
GGT TCG GTG CAA ATG
Gly Ser Val Gin Mec
960
GAA TTG GTT ACA ACC ATT Glu Leu Val Thr Tki íle
965
AAT AAT MT
Asn Asn íle
970
1514
TCT GTA ACC CAA GTG AAT GTT AAA GCG GCT GAA TCT CAA ATC
Še- Val hr Gin Val Asn val Lvs Ala Ala Glu Ser Gin íle 975”0
AGA GAC Arg Asp 985
ACT CCC GTG CAA TCA GGA ACT GTG AGA GAA CTC ACC ATT AAT GGC GTA938
Thr Pro Val Gin Ser Gly Thr Val Arg Glu Leu Thr zle Asn GlyVal
75S 770775
GAA ATT GGG ACC GTG AAT GAT GTG CAT AAA AAC GAC GCT GAT GGG AGA986
Glu íle Gly Thr Val Asn Asp Val His Lys Asn Asp Ala Asp GlyArg
780 7B5790
TTG ACT AAC GCG ATC AAC TCC GTC AAA GAC AGG ACC GGC GTA GAA GCG 1034
Leu Thr Asn Ala Íle Asn Ser Val Lys Asp Thr Gly Val Glu Ala
795 800 805 810
AGC U GAT ATT CAA GGG CGC ATT AAT TTG CAC TCC ATT GAC GGG CGT 1082
Ser Leu Asp Íle Gin Gly Arg íle Asn Leu His Ser íle Asp Gly Arg
815 820 B25
GCG ATT TC“ GTG CAT GCA GCG AGC GCG AGC GGT CAG GTT GGG GGA 1130
Ala Zle Ser Val Eis Ala Ala Ser Ala Ser Gly Gin Val Phe Gly Gly
630 835 840
\9\3O • · * AA1 TTT G ZA, GGG ATT TCT GGG ACA CAG CAT GCG GTG ATT GGG CGC 1178
Gly Asn ?hs Ala Gly íle Ser Gly Thr Gin EiS Ala Val Zle Gly Arg
645 B50 BES
TTÄ ACC TTA ACT AGA ACC GAC GCT AGA GAC ATC ATT GTA AGC GGT GTG 1226
Leu Thr Leu Thr Arg Thr Asp Ala Arg ' Asp Zle Zle Val Ser Gly Val
860 865 870
AAT TTT AGC CAT GTG GGC TTT CAT TCC GCT CAA GGG GTG GCA . GAA . AC 1274
Asn Phe Ser Eis Val Gly Phe His Ser Ala Gin Gly Val Ala Glu Tyr
B7S 8B0 885 B90
ACC GTG AAT TTG AGA GCG GTT AGG GGC ATT TTT GAT GCG AAT GTG GCT 1322
Val Asn Leu Arg Ala Val Arg Gly íle Phe Asp Ala Asn Val Ala
895 900 905
TCA GCA GCC GGA GCG AAC GCT AAT GGC GCA CAA GCG GAG ACC AAT TCT 1370
Ser Ala Ala Gly Ala Asn Ala Asn Gly Ala Gin Ala Glu Thr Asn Ser
910 915 920
CAA GGT ATA GGG GCT GGG GTA ACA AGC CTT AAG GGG GCG ATG ATT GTG 1418
G1 n Gly Zle Gly Ala Gly Val Thr Ser Leu Lys Gly Ala Mec Zle Val
925 930 935
ATG GAT ATG GCA GAT TCT GCA CGC ACG CAA TTA GAC AAG ATC CGC CG 1466
Mec Asp Mec Ala Asp Ser Ala Arg Tmm Gla Leu Asp Lys Zle Arg Ser
940 945 950
GAT ATG GGT TTG GTG CAA ATG GAA TTG GTT ACA ACC ATT AAT AAT ATT 1514
Asp Mec Gly Ser Val Gin Met Glu Leu Val Thr Thr Zle Asn Asn Zle
955 960 965 970
-29TCT G7A ACC CAA GTG AAT GTT ÄÄA GCG GCT GAA TCT CAA ATC AGA GÄC
Ser Val Thr Gin Val Asn Val Lys Ala Ala Glu Ser Gla Zle Arg Asp
975 980 noc
GTG GAT TTT GCT GAA GAG AGC scs AAC TTT TCT AAA TAC AAT ATT TTG
Val Asp Phe Ala Glu Glu Ser Ala Asn Phe Ser Lys Tyr Asn Zle Leu
990 995 1000
GCG CAA AGC GGG AGT TTT GCT ATG GCG CAA GCG AAT GCG GTG CAA CAG
Ala Gin Ser Gly Ser Phe Ala Met Ala Gin Ala Asn Ala Val Gin Gin
1005 1010 1015
AAT GTC ΤΤΆ AGG CTT TTA CAA TAA CAGCCCTTTT ÄATTCAAAAG GGCGTTAGCC Asn Val Leu Arg Leu Leu Gin *
1020 1025
CTTTTTATCA GTTÄTTTTTA TAAGTTAGAA TGATGGÄTAT TTÄTCAAAAA ÄACTTACAÄG
CTCTTTTCAA AAAAGACCCT CT77TG7T
1562
1610
1SSB
1712
1772
1800 (2) Informácie o sekv. č. 4:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 515 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 4:
Mec Ser Phe Arg Zle Asn , Thr Asn Zle Ala Ala Leu , Thr Ser Eis Ala
1 5 10 15
Val Gly Val Gin Asn Asn Arg Asp Leu Ser Ser Ser Leu Glu Lys Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Lea Arg Zle Asn Lys Ala Ala Asp Asp Ser Ser Gly Met
35 40 45
Ala Zle Ala ÄS? Ser Leu Arg Ser Gin Ser Ala Asn Leu Gly Gin Ala
50 55 60
Zle Arg Asn Ala Asn Asp Ala Zle Gly Met Val Gin Thr Ala Asp Lys
65 70 75 80
Ala Met Asp Glu Gin Zle Lys Zle Leu Asp Thr Zle Lys Thr Lys Ala
85 90 95
Val Gin Ala Ala Gin Asp Gly Gin Thr Leu Glu Ser Arg Arg Ala Leu
100 105 110
Gin Ser Asp Zle Gin Arg Leu Leu Glu Glu Leu Asp Asn Zle Ala . Asn
115 120 125
Th; Thr Ser Phe Asn Gly Gin Gin Met Leu Ser Gly S c r Phe Ser Asn 130 ” 135 140
Lys Glu Phe Gin íle Gly Ala Tyr Ser Asn Thr Thr Val Lys Ala Ser
145 X50 155 160
Zle Gly Ser Thr Ser Ser Asp Lys íle Gly His Val Arg Met Glu Thr
155 170 175
Ser Ser Phe Ser Gly Ala Gly Met Leu Ala Ser Ala Ala Ala Gin Asn
180 185 190
Leu Thr Glu Val Gly Leu Asn Phe Lys Gin Val Asn Gly Val Asn ÄSD
195 200 205
Tyr Lys íle Glu Thr Val Arp íle Ser Thr Ser Ala Gly Thr Gly íle
210 215 220
Gly Ala Leu Ser Glu íle íle Asn Argr Phe Ser Asn Thr Leu Gly Val
225 230 235 240
Arg Ala Ser Tyr Asn Val Met Ala Tm2T Gly Gly Thr Pro Val Gin Ser
245 250 255
Gly Thr Val Arg Glu Leu Thr íle Asn Gly Val Glu íle Gly Thr Val
260 265 270
Asn Asp Val His Lys Asn Asp Ala Asp Gly Arg Leu Thr Asn Ala íle
27S 280 285
Asn Ser Val Lys Asp Arg Thr Gly Val Glu Ala Ser Leu Asp íle Gin
290 295 300
Gly Arg Zle Asn Leu His Ser íle Asp Gly Arg Ala íle Ser Val His
305 310 315 320
Ala Ala Ser Ala Ser Gly Gin Val Phe Gly Gly Gly Asn Phe Ala Gly
32S 330 335
íle Ser Gly Thr Gin His Ala val íle Gly Arg Leu Thr Leu Thr Arg
340 345 350
Thr Asp Ala Arg Asp íle íle Val Ser Gly Val Asn Phe Ser His Val
355 360 365
Gly Phe His Ser Ala Gin Gly Val Ala Glu Tyr Thr Val Asn Leu Arg
370 375 3B0
Ala Val Arg Gly íle Phe Asp Ala Asn Val Ala Ser Ala Ala Gly Ala
385 390 395 400
Asn Ala Asn Gly Ala Gin Ala Glu Thr Asn Ser Gin Gly íle Gly Ala
405 410 415
Gly Val Thr Ser Leu Lys Gly Ala Met íle Val Met Asp Met Ala Asp
420 425 430
Ser Ala Arg 7hr Gin Leu Asp Lys íle Arg Ser Asp Met Gly Ser Val
435 440 445
Gin Met Glu Leu Val Thr Thr íle Asn Asn íle Ser Val Thr Gin Val
450 455 460
Asn Val Lys Ala Ala Glu Ser Gin íle Arg Asp Val Asp Phe Ala Glu
455 470 475 480
Glu Ser Ala Asn Phe Ser Lys Tyr Asn íle Leu Ala Gin Ser Gly Ser
485 490 495
Phfi * Met Ala Gin Ala Asn Ala Val Gin Gin Asn Val Leu Arg Leu
500 505 510
Leu Gla *
515 (2) Informácie o sekv. č. 5:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 30 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primer (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 5:
ACÄCCCGGGG C7AGCGGTAA TCAGAGCTTG (2) informácie o sekv. č. 6:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 45 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primer'1
-32(xi) Popis sekvencie: sekv. č. 6:
ACACAGTGCA GAGATCTTTA CTAAGTTAAA ÄGCCTTÄAGA ΤΑΤΓΤ 45 (2) Informácie o sekv. č. 7:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 36 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primeŕ (xi) Popis sekvencie: sekv. & 7:
ACAGTCGACC ATATGGCTTT TCAGGTCÄAT ACAÄAT 36 (2) Informácie o sekv. č. 8:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 33 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primer (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 8:
ACACCCGGGG AATTCTTTGT TÄGTGAATTG ACC 33 (2) Informácie o sekv. č. 9:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 35 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primér” (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 9:
CGGAATTCAT A7GASTTTTA GGATAAÄTAC CAATA 33 (2) Informácie o sekv. č. 10:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 21 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primér'' (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 10:
CGTGGTGTTA GAATACGCGC C 21 (2) Informácie o sekv. č. 11:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 22 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primér'' (xi) Popis sekvencie: sekv. č. 11:
CTATTGGTAT GG7TCAAAGC GC
-34(2) Informácie o sekv. & 12:
(i) Charakteristika sekveňcie:
(A) Dĺžka: 39 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vlákno: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Popis: PCR primer“ (xi)Popis sekveňcie: sekv. č. 12:
CACACÄCCAT SGCTATTÄ7T GTAÄÄAGCCT TAAGACÄTT

Claims (22)

1. Polypeptid obsahujúci aspoň jeden Helicobacter pylori flagelínový polypeptid alebo modifikovanú formu tohto polypeptidu, ktorá si zachováva funkčne ekvivalentnú antigenicitu na použitie na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii.
2. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý obsahuje Helicobacter pylori polypeptid FlaA alebo modifikovanú formu tohto polypeptidu, ktorá si zachováva funkčne ekvivalentnú antigenicitu, na použitie na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori itfekcii.
3. Polypeptid podľa nároku 2, v ktorom Helicobacter pylori polypeptid FlaA obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 2, na použitie na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii.
4. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý obsahuje Helicobacter pylori polypeptid FlaB alebo modifikovanú formu tohto polypeptidu, ktorá si zachováva funkčne ekvivalentnú antigenicitu, na použitie na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii.
5. Polypeptid podľa nároku 4, v ktorom Helicobacter pylori polypeptid FlaB obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 4, na použitie na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii.
6. Vakcínová kompozícia na indukciu ochrannej imunitnej odpovede voči Helicobacter pylori infekcii, vyznačujúca sa tým, že obsahuje imunogenicky účinné množstvo polypeptidu obsahujúceho aspoň jeden Helicobacter pylori flagelínový polypeptid, voliteľhe spolu s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.
7. Vakcínová kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že polypeptid zahŕňa Helicobacter pylori polypeptid FlaA
8. Vakcínová kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že Helicobacter pylori polypeptid FlaA obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 2.
9. Vakcínová kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že polypeptid zahŕňa Helicobacter pylori polypeptid FlaB.
10. Vakcínová kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že Helicobacter pylori polypeptid FlaB obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 4.
11. Vakcínová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 10, vyznačujúca sa tým, že navyše obsahuje adjuvans.
12. Vakcínová kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že adjuvans je farmaceutický prijateľná forma cholera toxínu.
13. Vakcínová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 12 na použitie ako terapeutická vakcína pre cicavca, vrátane človeka, ktorý je infikovaný Helicobacter pylori.
14. Vakcínová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 12 na použitie ako profylaktická vakcína na ochranu cicavca, vrátane človeka, proti infekcii Helicobacter pylori.
15. Použitie polypeptidu obsahujúceho aspoň jeden Helicobacter pylori flagelínový polypeptid na výrobu kompozície na liečbu alebo profylaxiu Helicobacter pylori infekcie.
16. Použitie podľa nároku 15, pričom polypeptid zahŕňa Helicobacter pylori polypeptid FlaA.
17. Použitie podľa nároku 16, pričom Helicobacter pylori polypeptid FlaA obsahuje sekvenciu aminokyselín uvedenú ako sekv. č. 2.
18. Použitie podľa nároku 15, pričom polypeptid zahŕňa Helicobacter pylori polypeptid FlaB.
19. Použitie podľa nároku 18, pričom Helicobacter pylori polypeptid FlaB obsahuje sekvenciu aminokyselín uvedenú ako sekv. č. 4.
20. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 19, pričom kompozícia obsahuje vakcínu účinnú pre vyvolanie ochrannej imunitnej odpovede proti Helicobacter pylori.
21. Spôsob vyvolania ochrannej imunitnej odpovede proti Helicobacter pylori infekcii cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok, v ktorom je podávané cicavcovi imunologický účinné množstvo vakcinovej kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 12.
22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
SK1807-98A 1996-11-25 1997-11-18 A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide SK180798A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9604322A SE9604322D0 (sv) 1996-11-25 1996-11-25 Bacterial antigens and vaccine compositions II
PCT/SE1997/001928 WO1998023288A1 (en) 1996-11-25 1997-11-18 A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK180798A3 true SK180798A3 (en) 1999-07-12

Family

ID=20404740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1807-98A SK180798A3 (en) 1996-11-25 1997-11-18 A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20020028210A1 (sk)
EP (1) EP0910404A1 (sk)
AR (1) AR010568A1 (sk)
AU (1) AU5077798A (sk)
CA (1) CA2253244A1 (sk)
SE (1) SE9604322D0 (sk)
SK (1) SK180798A3 (sk)
WO (1) WO1998023288A1 (sk)
ZA (1) ZA9710205B (sk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9518606D0 (en) * 1995-09-12 1995-11-15 Inst Of Psychiatry Neural transplantation
EP1991264B1 (en) 2006-03-07 2015-01-07 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
KR100962378B1 (ko) * 2008-01-23 2010-06-10 경상대학교산학협력단 헬리코박터 파이로리의 편모ａ 단백질의 사람 항혈청에반응하는 항원결정기재조합 단백질 및 그의 제조방법
ES2594102T3 (es) 2008-04-18 2016-12-15 Vaxinnate Corporation Mutantes por deleción de la flagelina y métodos para su uso
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-05-22 Gt Biolog Ltd Polypeptide and immune modulation
CN116496406B (zh) * 2022-07-13 2023-11-03 河北省肿瘤研究所 激活tlr-5的幽门螺旋杆菌融合抗原及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4368944B2 (ja) * 1995-04-21 2009-11-18 シーエスエル、リミテッド 防御用ヘリコバクター抗原

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998023288A1 (en) 1998-06-04
SE9604322D0 (sv) 1996-11-25
EP0910404A1 (en) 1999-04-28
AR010568A1 (es) 2000-06-28
US20020028210A1 (en) 2002-03-07
ZA9710205B (en) 1998-05-25
AU5077798A (en) 1998-06-22
CA2253244A1 (en) 1998-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2199938T3 (es) Fragmentos de adn codificante de las subunidades del receptor de la meningitis neisseria.
JP3380559B2 (ja) ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物
Bahrani et al. Proteus mirabilis flagella and MR/P fimbriae: isolation, purification, N-terminal analysis, and serum antibody response following experimental urinary tract infection
JP2008086316A (ja) ヘリコバクター感染に対する免疫原性組成物、該組成物に用いられるポリぺプチドおよび該ポリぺプチドをコードする核酸配列
US20080187541A1 (en) Helicobacter pylori adhesin binding group antigen
SK168497A3 (en) Streptococcal heat shock proteins members of the hsp70 family
JP2577280B2 (ja) 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌ｍタンパク質ワクチン
EP0469045B1 (en) SYNTHETIC $i(PSEUDOMONAS) $i(AERUGINOSA) PILIN PEPTIDE AND RELATED VACCINES AND DIAGNOSTICS
US5801018A (en) Vaccines for Actinobacillus pleuropneumoniae
JPH11504633A (ja) 多量体の組換えウレアーゼワクチン
SK180798A3 (en) A vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide
WO1994008013A9 (en) Pilin variants and uses thereof
WO1994008013A1 (en) Pilin variants and uses thereof
ES2310776T3 (es) Composiciones de vacuna que comprenden proteinas omp de neisseria gonorrhoeae y de neisseria meningitidis.
EP1009764A1 (en) VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE $i(HELICOBACTER PYLORI) FlgE POLYPEPTIDE
WO1998056815A1 (en) VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI Pfr POLYPEPTIDE
WO1998056412A1 (en) VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI 26kDa POLYPEPTIDE
WO1992016223A1 (en) Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
PT703981E (pt) Composições imunogénicas contra infecção por helicobacter, polipéptidos para utilização nas composições e sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos
MXPA99011528A (en) Vaccine compositions comprising the helicobacter pylori
MXPA97009194A (en) Antigens of helicobacter pylori and compositions of vac
CZ9904449A3 (cs) Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid