CZ9904449A3

CZ9904449A3 - Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid

Info

Publication number: CZ9904449A3
Application number: CZ19994449A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Berglindh; Björn Mellgard
Original assignee: Astra Aktiebolag
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1998-06-08
Publication date: 2000-11-15

Abstract

Vynález se týká polypeptidů a vakcínových kompozic pro indukování obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori. Použití polypeptidů Helicobactera pylori pro výrobu prostředků pro léčbu nebo profylaxi infekce Helicobacterem pylori.

Description

Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter polypeptid

Oblast techniky

Tento vynález se týká polypeptidů a vakcínových kompozic pro indukci obranné imunitní odpovědi na infekci bakterií Helicobacter pylori. Přítomný vynález se dále týká použití polypeptidů Helicobactera pylori pro výrobu prostředků pro léčbu nebo profylaxi infekce zapříčiněné Helicobacterem pylori.

Dosavadní stav techniky

Helicobacter pylori

Gram negativní bakterie Helicobacter pylori (H. pylori) je důležitým lidským patogenem, který se vyskytuje u několika gastrointestinálních chorob. Kolonizace žaludečního epitelu touto bakterií vede k aktivnímu zánětu a progresivní chronické gastritidě se značným zvýšením rizika progrese peptické vředové choroby. Po celý život trvající zánět žaludeční sliznice je ve velmi těsné korelaci se signifikantním zvýšením rizika vzniku karcinomu žaludku.

Ke kolonizaci žaludeční sliznice používá H. pylori různých faktorů virulence. Tyto faktory virulence zahrnují několik adhesinů, prostřednictvím kterých se bakterie přichycuje na hlen a/nebo se váže na epiteliální buňky; ureázu, která pomáhá neutralizovat kyselé prostředí; a proteolytické enzymy, které činí hlen tekutější. H. pylori je velmi pohyblivý, pohybuje se v hlenu a směrem do krypt. Ukázalo se, že motilita je zásadním faktorem virulence,

Γ» · ···· ·· ···· ·· ·» ··· · · · · · · · ···· · ···· * · * · • « · · · ······ • · · » ··*·· ······ ·· ··· ·* · · jako že nepohyblivý H. pylori není schopen infikovat sliznici v experimentálních modelech popsaných v publikaci Eaton a kol., Infection & Immunity, 64 (7), 2445 až 2448 (1996). Pro to existuje mnoho možných důvodů, nejzřetelnější je neschopnost pohybovat se a přichytit se na slizniční buňky, a neschopnost bránit se škodlivým látkám v žaludku.

Navzdory zjevné silné imunitní odpovědi hostitele na infekci H. pylori s produkcí jak lokálních (slizničních), tak i systémových protilátek, perzistuje patogen v žaludeční sliznici, běžně po celý život hostitele. Příčinou této skutečnosti pravděpodobně je, že spontánně indukované imunitní odpovědi nejsou dostatečné, nebo jsou cíleny na nesprávné epitopy antigenů. Alternativně se může jednat o nesprávný typ imunitní reakce, protože imunitní systém se může chovat vůči H.pylori jako ke komenzálovi, neboli baktérii žijící v symbióze, což je naznačeno celoživotním vztahem mezi hostitelem a bakterií.

Za účelem porozumění patogenezi a imunologii infekcí H. pylori je důležité definovat antigenní strukturu této bakterie. Obzvláště je nutné charakterizovat proteiny exprimované na povrchu, proteiny spojené s povrchem, stejně jako proteiny secernované, které byly u mnoha bakteriálních patogenů prokázány jako představitelé hlavních faktorů virulence, a které mohou být užitečné pro diagnózu H. pylori a pro výrobu vakcínových kompozicí. Pokud jsou tyto proteiny, současně s tím, že jsou povrchové, také nezbytné pro přežití a/nebo kolonizaci, zvyšuje se tím jejich vhodnost jako cíl pro vakcínou navozenou imunoterapii.

Kdykoliv se buňka H. pylori vyskytne ve stresu nebo ohrožení, transformuje se z bacilární do kokoidní formy.

• · • · · ·

V kokoidní formě je buňka H. pylori značně méně citlivá na antibiotika a jiné antibakteriální přípravky. Nepřímo je naznačeno, že H. pylori může být přenášen mezi jednotlivci v této formě, pravděpodobně vodou nebo přímým kontaktem (orálně-orální; fekálně-orální cestou). Účinná vakcínová kompozice by měla proto navodit imunitní odpověď jak na kokoidní tak na bacilární formu H. pylori. Protože systémová imunita zastává pravděpodobně pouze omezenou roli v ochraně proti slizničním infekcím, je také důležité, že vakcínová kompozice bude zesilovat obranné imunitní mechanismy lokálně v žaludku.

Bičíkový háčkový protein

Ukázalo se, že se bičíkové háčky H. pylori skládají z FlgE podjednotek o molekulové hmotnosti 78 kDa (0'Toole a kol., Molecular Microbiology, 14 (4), 691 až 703 (1994)). Funkce bičíkového háčku je spojení bičíku se submembránovým bičíkovým motorem. Část háčku, která prominuje zevně membrány je krátká, měří přibližně 60 nm (v porovnání s přibližně 10 pm délky vlastního bičíku). Stejně jako bičík H. pylori, háček je pravděpodobně pokryt obalem (Geis a kol., J. Med. Microbiol., 38 (5), 371 až 377 (1993)).

Sekvence aminokyselin v FlgE polypeptidu se nápadně podobá sekvenci jiných známých háčkových proteinů, včetně určité homologie s jinými příslušníky rodu Helicobacter jako jsou Mustelae (0'Toole a kol., viz výše). Polyklonální protilátky secernované proti FlgE polypeptidu vykazují zkříženou reaktivitu proti bičíkovým proteinům A a B, což možná naznačuje existenci sdílených epitopu. Produkce protilátek proti FlgE paralyzuje H. pylori, což vede ke vzniku bezbičíkatých nepohyblivých bakterií, ve kterých se FlgE polypeptid stále tvoří, ale může být zpracován pouze • « v cytoplasmě.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1

Účinek terapeutické imunizace myši infikované H. pylori (skupina o n = 9 až 10 členů) FlgE polypeptidem. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnota + směrodatná odchylka počtu H. pylori v antru (A), těle (Β), nebo celkový počet bakterii (A + B) = (C).

Zkratky: CFU (colony forming units) počet bakterii;

nevyšrafováné sloupce = DOC + CT, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok s 0,5 % deoxycholatu podaný společně s cholerovým toxinem 10 pg na myš;

vyšrafované sloupce = FlgE + CT, myš dostane 100 pg FlgE a 10 pg cholerovtho toxinu.

Pokles CFU je signifikantní v antru a jak bylo vypočítáno, v celém žaludku.

** p <0,01;

* p <0,05 (řadící test podle Wilcoxon-Mann-Whitney znaku).

Obrázek 2:

Sérový myší IgG měřený ELISA metodou; odpověď na infekci a na imunizaci FlgE. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměrné titry ± směrodatná odchylka, n = 9 až 10 ve skupině. ELISA, povlečení H. pylori, kmen 244. Jako znak infekce H. pylori mohou být v séru zvířat léčených DOC +

CT nalezeny specifické protilátky (= A, kontrola/244). Po imunizaci FlgE + cholerovým toxinem (= B, FlgE/244) vzrostla tato reaktivita čtyřikrát (** p <0,01; řadící test podle Wilcoxon-Mann-Whitney znaku). C = FlgE specifický.

• · · » • · • «··· ······ • ··· ·«··· ······ ·· ··· · · · ·

Specifický FlgE IgG vzrostl u zvířat, kterým bylo podáno

FlgE + CT, ale byl nedetekovatelný u kontrolních zvířat.

Podrobný popis vynálezu

Účelem přítomného vynálezu je poskytnutí antigenního polypeptidů H. pylori, který může být užitečný pro spuštění obranné imunitní odpovědi proti H. pylori, a pro diagnózu infekce H. pylori. Tento záměr se dosáhne rekombinantním klonováním genu H. pylori, který kóduje kvalitní esenciální polypeptid. Sekvence nukleové kyseliny tohoto genu je podobná sekvenci genu pro FlgE, jak publikoval 0'Toole a kol., Molecular Biology, 14(4), 691 až 703 (1994). Protože se jedná o esenciální protein motility, je gen pro FlgE exprimován všemi kmeny H. pylori.

S překvapením bylo nalezeno, že FlgE polypeptid H. pylori, navzdory faktům, že se pouze malá část háčkového proteinu vyskytuje mimo bakterii, a že je pravděpodobně pokryta krytem, může fungovat jako terapeutický antigen na modelu myši infikované H. pylori, v případě, že je podán společně s přídatným cholerovým toxinem. Experimentální údaje níže proto naznačují, že pokud je FlgE polypeptid H. pylori použit jako perorální imunogen, funguje jako stimulátor imunitní odpovědi, která vede k signifikantní redukci kolonizace H. pylori u myší, které byly infikovány H. pylori jeden měsíc před imunizací.

Tyto výsledky silně podporují použití FlgE polypeptidů H. pylori jako perorální vakcínové formulace pro použití u lidí, za účelem léčby a prevence infekcí H. pylori. FlgE polypeptid bude jako takový použitelný jak pro detekci infekcí H. pylori, tak pro výrobu vakcínových kompozic, které, pokud budou podány v podobě vhodné • · • ···· ·♦ ···· ·· • · · · · · ··· ···· · ···· · · · • «··· ····· • · · · ···· ······ · · ··· · · ·· farmaceutické formulace, spustí obrannou nebo terapeutickou imunitní odpověď na tyto infekce.

Následně, v jednom aspektu poskytuje přítomný vynález FlgE polypeptid H. pylori pro použití k indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori. Zamýšlí se, že název „FlgE polypeptid Helicobactera pylori znamená polypeptid, který je popsán v publikaci 0'Tool a kol., Molecular Microbiology, 14(4), 691 až 703 (1994), a který je kódován genem, jehož nukleotidová sekvence je určena jako SEQ ID NO:1, nebo jí lze získat od Národního centra pro biotechnologické informace (National Center for Biotechnology Information) (přírůstkové číslo U09549), nebo v podstatě podobná modifikovaná forma zmíněného polypeptidu, která si uchovává funkčně ekvivalentní antigenicitu.

Název „obranná imunitní odpověď má být chápán jako imunitní odpověď, která činí prostředek vhodný pro terapeutické a/nebo profylaktické účely.

Název „funkčně ekvivalent! antigenicita má být chápán jako schopnost indukovat systémovou a slizniční imunitní odpověď a současně snižovat počet buněk H. pylori vyskytujících se na sliznici žaludku. Odborník v oboru bude schopen identifikovat modifikované formy FlgE polypeptidu, které si uchovávají funkčně ekvivalentní antigenicitu, použitím známých způsobů, jako je mapování epitopů protilátkami indukovanými in vivo.

Ve výhodném provedení přítomného vynálezu má FlgE polypeptid Helicobactera pylori pro použití za účelem indukce obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori v podstatě sekvenci aminokyselin uváděnou v seznamu • * • · • « · • · · • · · · sekvencí jako SEQ ID NO: 2, nebo je to jeho modifikovaná forma, která si uchovává funkčně ekvivalentní antigenicitu.

Proto má být rozuměno, že by definice FlgE polypeptidu Helicobactera pylori neměla být přísně omezena na polypeptid se sekvencí aminokyselin identickou s SEQ ID NO: 2 v seznamu sekvencí. Přítomný vynález se spíše týká polypeptidu nesoucích modifikace jako jsou substituce, malé delece, inzerce nebo inverze, a tyto polypeptidy nicméně mají v podstatě biologickou účinnost FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, a mají zachovanou funkčně ekvivalentní antige-nicitu. V definici FlgE polypeptidu Helicobactera pylori jsou následně zahrnuty polypeptidy, jejichž sekvence aminokyselin jsou z alespoň 90 % homologní, s výhodou z alespoň 95 % homologní, se sekvencí aminokyselin uvedenou jako SEQ ID NO: 2 v seznamu sekvencí.

Z dalšího aspektu poskytuje vynález vakcínovou kompozici pro indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori, která obsahuje imunogenně účinné množství FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, popřípadě s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

V přítomném kontextu se výrazem „imunologicky účinné množství rozumí takové množství, které spustí signifikantní obrannou odpověď na Helicobactera pylori, která povede k eradikaci infekce H. pylori u infikovaného savce, nebo zabrání infekci vnímavého savce. Obvykle bude imunologicky účinné množství zahrnovat přibližně 1 pg aD 1000 mg, s výhodou přibližně 10 pg až 100 mg, antigenu H. pylori pro perorální podání, nebo přibližně méně než 100 pg pro parenterální podání.

« · • · · · · ·· ···· • · t · · · · ···· · · ··· · • ···· · · · • · · · · · ······ · · · · ·

Vakcínová kompozice obsahuje popřípadě mimo farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo, jeden nebo více imunologicky aktivních antigenů pro profylaktické nebo terapeutické použití. Fyziologicky přijatelné nosiče a ředidla jsou odborníkům v oboru dobře známá a zahrnují např. fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (phosphate buffered šalině, PBS), nebo, v případě perorálních vakcín, formulace založené na HCO3, nebo entericky povlečené formulace.

Vakcínové kompozice mohou popřípadě zahrnovat, nebo mohou být podány společně s inhibitory sekrece kyseliny, s výhodou s inhibitory protonové pumpy (PPI), jako například s omeprazolem. Vakcína může být formulována v známých systémech dodávání, jako jsou lipozomy, ISCOM molekuly, kochleaty atd. (viz například Rabinovich a kol., Science, 265, 1401 až 1404 (1994)), nebo může být navázána nebo inkorporována do polymerových mikrosfér degradovatelné nebo nedegradovatelné povahy. Antigeny mohou být spojeny s živými nebo atenuovanými bakteriemi, viry nebo fágy, nebo s mrtvými vektory stejného druhu. Antigeny mohou být chemicky nebo geneticky kuplovány s proteiny nosiče inertních nebo přídatných typů (například cholerová subjednotka B). Následně v dalším aspektu přítomný vynález poskytuje vakcínovou kompozici, jak je popsáno výše, který navíc obsahuje přídatný prostředek, jako je cholerový toxin. Takovéto farmaceuticky přijatelné formy cholerového toxinu jsou v oboru známé, např. jak je popsáno v Rappuoli a kol., Int. Arch. Allergy & Immunol., 108 (4), 327 až 333 (1995); a Dickinson a kol., Infection and Immunity, 63(5), 1617 až 1623 (1995).

Vakcínová kompozice podle přítomného vynálezu může být použita jak pro terapeutické, tak pro profylaktické • · • · účely. Následně přítomný vynález zahrnuje vakcínovou kompozici podle popisu výše, pro použití jako terapeutická nebo profylaktická vakcína pro savce, včetně člověka, který je infikován Helicobacterem pylori. V tomto kontextu znamená výraz „profylaktický účel indukci imunitní odpovědi, která povede k ochraně proti budoucí infekci Helicobacterem pylori, zatímco výraz „terapeutický účel znamená indukci imunitní odpovědi, která může eradikovat existující infekce Helicobacterem pylori.

Vakcínová kompozice podle přítomného vynálezu je s výhodou podávána na jakoukoliv savčí sliznici, například na bukální, nosní, tonsilární, žaludeční, střevní (tenké a tlusté střevo), rektální a vaginální sliznici. Slizniční vakcíny mohou být podány společně s přídatnými přípravky, které jsou pro tento účel vhodný. Vakcína může být také podána perorálně nebo parenterálně subkutánní, intrakutánní nebo intramuskulární cestou, popřípadě společně s vhodným přídatným přípravkem. Vakcínová kompozice může být popřípadě podána společně s antimikrobními terapeutickými přípravky.

V dalším aspektu poskytuje přítomný vynález použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, pro výrobu (i) prostředku pro léčbu, profylaxi nebo diagnostiku infekce Helicobacterem pylori;

(ii) vakcíny pro použití pro navození obranné imunitní odpovědi proti infekci Helicobacterem pylori; a (iii) diagnostického kitu pro diagnózu infekce Helicobacterem pylori.

Dále v dalším aspektu poskytuje přítomný vynález in vitro způsob diagnózy infekce Helicobacterem pylori • · • · ··· · · · · · · · · * • · · · ··· · · · • ·· · · · · · ··· ·· ··· · · · · zahrnující alespoň jeden krok, ve kterém je použit FlgE polypeptid Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, popřípadě označený nebo koplovaný na pevnou podporu. Zmíněný způsob může například zahrnovat kroky (a) kontaktování zmíněného FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, popřípadě navázaného na pevnou podporu, s tělesnou tekutinou odebranou savci; a (b) detekci protilátek ve zmíněné tělesné tekutině, které se navážou na zmíněný FlgE polypeptid. Výhodné způsoby detekce protilátek jsou ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assay) metody, které jsou v oboru dobře známé.

V dalším aspektu poskytuje přítomný vynález diagnostický kit pro detekci infekce Helicobacterem pylori u savce, včetně člověka, který obsahuje složky, které umožní provedení způsobu diagnózy in vitro, jak je popsáno výše. Zmíněný diagnostický kit může například obsahovat:

(a) FlgE polypeptid Helicobactera pylori; a (b) činidla pro detekci protilátek, které se vážou na zmíněný FlgE polypeptid.

Zmíněná činidla pro detekci protilátek mohou být například enzymem značené antiimunoglobuliny a chromogenní substrát zmíněného enzymu.

Dále, z dalšího aspektu, poskytuje přítomný vynález způsob spuštění obranné imunitní odpovědi proti infekci Helicobacterem pylori u savce, včetně člověka, a zmíněný způsob zahrnuje krok podání zmíněnému savci imunologicky účinné množství FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, nebo alternativně podání zmíněnému savci imunologicky účinné množství vakcínové kompozice, jak je popsáno výše.

• · · · · · · · ··· · ···· · ·· * ··· · ··· ·« · • · · · ···· ··· · · · · · · · ··

Experimentální postupy

V tomto popisu mají být výrazy „standardní protokoly a „standardní postupy, pokud jsou použity v kontextu s metodami molekulárního klonování, pochopeny jako protokoly a postupy uvedené v běžné laboratorní příručce, jako je: Current Protocols in Molecular Biology, vyd. F Ausubel a kol., John Wiley and Sons Inc. (1994), J. Fritsch, E. F. a T. Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor Laboratorary Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Příprava rekombinantního FlgE polypeptidu Helicobactera pylori

Informace o DNA sekvenci

Sekvenční informace pro gen kódující FlgE polypeptid se získá od Národního centra pro biotechnologické informace (přírůstkové číslo U09549; SEQ ID NO: 1) .

PCR amplifikace a klonování DNA sekvencí obsahujících ORFy pro membránové a secernované proteiny z J99 kmene Helicobactera pylori

Sekvence se klonují z J99 kmene Helicobactera pylori způsobem amplifikačního klonování, za použití polymerázové řetězové reakce (PCR). Navrhnou a zakoupí se syntetické oligonukleotidové primery (viz níže) specifické pro 5'- a 3'-konce otevřených čtecích rámců genů (GibcoBRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Navrhnou se přímé primery (specifické pro 5'-konec sekvence) pro FlgE tak, aby obsahovaly Ncol klonovací místo na úplném 5'-zakončení, zatímco reverzní primery zahrnují EcoRI místo na úplném 5'• · • · ··· · • · • · · · konci, aby mohlo proběhnout klonování každé sekvence H. pylori do čtecího rámce pET28b vektoru. Inserty klonované do NcoI-EcoRI míst pET-28b vektoru fúzují s vektorem DNA sekvence, která kóduje přídatnou 20 karboxyteminální aminoskupinu obsahující šest histidinových zbytků (na úplném C-konci).

Přímý primer (SEQ ID NO:3):

5'-TAT ACC ATG GTG CTT AGG TCT TTA T-3'

Reversní primer (SEQ ID NO:4):

5'-GCG AAT TCA ATT GCT TAA GAT TCA A-3'

Genomová DNA připravená z J99 kmene Helicobactera pylori se použije jako zdroj templátové DNA pro PCR amplifikační reakce (Current Protocols in Molecular Biology, vyd. F. Ausubel a kol., John Wiley and Sons, lne. (1994)). Pro amplifikaci DNA sekvence, která obsahuje ORF H. pylori, se vloží 50 ng genomové DNA do reakční nádoby obsahující 2 mM MgCl₂, 1 μΜ syntetickúch oligonukleotidových primerů (přímé a reverzní primery) komplementárních s a doprovázejících definovaný ORF Helicobactera pylori,

0,2 mM každého deoxynukleotidového trifosfátu, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, a 2,5 jednotek termostabilní DNA polymerázy (Amplitaq, Roche Molecular Systems, lne., Branchburg, NJ, USA) v celkovém objemu 100 μΐ. Použijí se následující podmínky termálního cyklování pro získání amplifikovaných DNA produktů rpo každý ORF, za použití termálního cyklovače Perkin Elmer Cetus/ GeneAmp PCR systém 9600:

Denaturace při teplotě +94 °C po dobu 2 minut;

cykly při teplotě +94 °C po dobu 15 sekund, při teplotě +30 °C po dobu 15 sekund a při teplotě +72 °C po dobu 1,5 minuty;

cyklů při teplotě +94 °C po dobu 15 sekund, při teplotě

0*0 0 • 00 «0 0 00 0 ·· ’ · « · · · » · * • ···» · « » * ·« « 0*0 ♦ » • 0 · · * · · « e ··· *· ·· +58 °C po dobu 15 sekund a při teplotě +72 °C po dobu 1,5 minuty;

reakce se dokončí při teplotě +72 °C po dobu 6 minut.

Při dokončení termálních cyklovacích reakcí se každý vzorek amplifikované DNA promyje a čistí se za použití Qiaquick Spin PCR purifikačního kitu (Qiagen, Gaithersburg,

MD, USA). Amplifikované vzorky DNA se podrobí štěpení restrikčními endonukleázami NdeI a EcoRI standardními způsoby. Vzorky DNA se poté podrobí elektroforéze na 1,0% NuSieve (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) agarózových gelech. DNA se vizualizuje vystavením ethidium-bromidu a ozáření UV paprsky s velkou vlnovou délkou. DNA obsažená v řezech oddělených z agarózového gelu se čistí za použití protokolu Bio 101 GeneClean Kit (Bio 101 Vista, CA, USA) .

Klonování DNA sekvencí H. pylori do pET-28b prokaryotického expresního vektoru pET-28b vektor se ke klonování připraví štěpením prostřednictvím Ncol a EcoRI známými postupy. Po štěpení se DNA inzerty klonují známými způsoby do předem naštěpeného pET-28b expresního vektoru. Produkty ligační reakce se potom použijí k transformaci BL21 kmene E. coli způsobem popsaným níže.

Transformace kompetentní bakterie rekombinantními plasmidy

Kompetentní bakterie, E. coli kmene BL21 nebo E. coli kmene BL21(DE3), se běžnými způsoby transformují rekombinantními pET expresními plasmidy nesoucími nakloňované sekvence H. pylori. Stručně, 1 μΐ ligační reakční směsi se smíchá s 50 μΐ elektrokompetentních buněk a vystaví se pulzu o vysokém napětí, po kterém se vzorky t ··«· ·· ···« • · · ♦·· · · ♦ · inkubují v 0,45 ml SOC media (0,5 % kvasnicového extraktu, 2,0 % tryptonu, 10 mM NaCl, 2,5 mM KOI, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ a 20 mM glukózy) při teplotě +37 °C při třepání po dobu 1 hodiny. Vzorky se potom rozetřou na plotny z LB agaru obsahující 25 pg/ml kanamycinsulfatu, a nechají růst přes noc. Transformované kolonie BL21 se odeberou a analyzují se za účelem stanovení nakloňovaných inzertů, způsobem popsaným níže.

Identifikace rekombinantních pET expresních plazmidů, které nesou sekvence H. pylori

Jednotlivé BL21 klony transformované rekombinantními pET-28b H. pylori geny se analyzují PCR amplifikací klonovaných inzertů, za použití stejných přímých a reverzních primerů, které jsou specifické pro každou ze sekvencí H. pylori, a které se používají v původních PCR amplifikačních klonovacích reakcích. Úspěšná amplifikace se potvrdí integrací sekvencí H. pylori do expresního vektoru podle standardních postupů.

Izolace a příprava DNA plazmidu z BL21 transformantů

Vezmou se jednotlivé klony rekombinantních pET-28b vektorů nesoucí správně nakloňované ORFy H. pylori a inkubují se přes noc v 5 ml LB bujónu s 25 pg/ml kanamycinsulfatu. Následující den se izoluje DNA plazmid a čistí se za použití Qiagen plasmid purifikačního protokolu (Qiagen lne., Chatsworth, CA, USA).

Exprese rekombinantních sekvencí H. pylori u E. coli pET vektor může být vložen do jakéhokoliv K-12 kmene

E. coli, například HMS174, HB101, JM109, DH5oí atd., za • * • · · • · « · • · • · · i · účelem klonování nebo přípravy plasmidu. Hostitelé exprese zahrnují kmeny E. coli, které obsahují chromozomální kopii genu pro T7 RNA polymerázu. Tito hostitelé jsou lyzogeny bakteriofágu DE3, lambda derivátu, který nese láci gen, lacUV5 promotor a gen pro T7 RNA polymerázu. T7 RNA polymeráza se aktivuje přidáním izopropyl-p-D-thiogalaktosidu (IPTG) a T7 RNA polymeráza transkribuje jakýkoliv cílový plasmid, například pET-28b, který nese sledovaný gen. Kmeny používané v naší laboratoři zahrnují: BL21(DE3) (F. W. Studier, A. H. Rosenberg, J. J. Dunn a J. W. Dubendorff, Methods Enzymol., 185, 60 až 89 (1990)).

Pro expresi rekombinantních sekvencí H. pylori se použije 50 ng DNA plasmidu izolovaného tak, jak je popsáno výše, pro transformaci kompetentních BL21(DE3) bakterií, jak je popsáno výše (poskytnuty firmou Novagen jako součást pET expresního systémového kitu). Transformované buňky se kultivují na SOC mediu po dobu 1 hodiny a kultura se potom naočkuje na LB plotny obsahující 25 pg/ml kanamycinsulfatu. Následující den se kolonie bakterií spojí a pěstují se na LB mediu obsahujícím 25 pg/ml kanamycinsulfatu, až do dosažení optické hustoty (O.D.) 600 nm od 0,5 do 1,0 O.D. jednotek, kdy se po dobu 3 hodin ke kultuře přidává 1 mM IPTG, za účelem indukce genové exprese rekombinantních DNA konstruktů H. pylori.

Po indukci genové exprese prostřednictvím IPTG se bakterie peletují odstředěním v centrifuze Sorvall RC-3B při 3500 x g po dobu 15 minut při teplotě +4 °C. Pelety se resuspendují v 50 ml studeného lOmM Tris-HCl, pH 8,0, 0,lM NaCl a 0,1 mM EDTA (STE pufr). Buňky se potom odstřeďují při 2000 x g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Stanoví se hmotnost vlhkých pelet a ty se zmrazí se na teplotu -80 °C, aD jsou připraveny na proteinové čištění.

• · · · • · ♦ · • « • ·

Analytické metody

Koncentrace čištěných proteinových přípravků se kvantifikuje spektrofotometricky za použití koeficientů absorbance, které se vypočítají z obsahu aminokyselin (S.

J. Perkins, Eur. J. Biochem., 157, 169 až 180 (1986)) . Koncentrace proteinů se také určí metodou popsanou v Μ. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 až 254 (1976) a O. H. Lowry, N. Rosenbrough, A. L. Farr a R. J. Randall (1951), která jako standard používá bovinní sérový albumin.

Natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidové gely (SDSPAGE) (12% nebo 4% až 25% gradient akrylamidu) se zakoupí od firmy BioRad (Hercules, CA, USA) a obarví se Coomassie briliantovou modří. Markéry molekulární hmoty zahrnují králičí myosin příčně pruhovaného svalu (200 kDa), βgalaktosidázu E. coli (116 kDa), fosforylázu B králičího svalu (97,4 kDa), albumin bovinního séra (66,2 kDa), ovalbumin (45 kDa), bovinní karboanhydrázu (31 kDa), sójový inhibitor trypsinu (21,5 kDa), lysozym vaječného bílku (14,4 kDa) a bovinní aprotinin (6,5 kDa).

Čištění FlgE z inkluzních tělísek

Následující kroky se provedou při teplotě +4°C. Buněčné pelety se resuspendují v lytickém pufru obsahujícím 10 % glycerolu, 200 pg/ml lysozymu, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu. Po pasáži skrze buněčný dezintegrátor se s 0,2% DOC připraví výsledný homogenát, míchá se po dobu 10 minut, poté se odstředí (10 000 g, x 30 minut). Pelety se nejprve promyjí lytickým pufrem obsahujícím 10 % glycerolu, 10 mM EDTA, 1 % Tritonu X-100, mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu, potom lytickým pufrem • · · · obsahujícím 1 M močoviny, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu. Výsledná bílá peleta se skládá primárně z inkluzních tělísek, která neobsahují nerozrušené buňky a membránový materiál.

Následující kroky se provedou při teplotě místnosti. Inkluzní tělíska se rozpustí ve 20 ml 8 M močoviny v lytickém pufru obsahujícím 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu, a inkubují se při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Materiál, který se nerozpustil, se odstraní odstředěním (100 000 x g po dobu 30 minut). Čirý supernatant se přefiltruje a naplní do Ni²⁺-NTA agarózového sloupce ekvilibrovaného v 8 M močoviny v lytickém pufru. Sloupec se promyje 250 ml (50 objemů vrstvy) lytického pufru obsahujícího 8 M močoviny, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu, a potom se vyvolá po sobě jdoucími kroky lytického pufru obsahujícího 8 M močoviny, 1 mM PMSF, 0,1 % β-merkaptoethanolu a 20, 100, 200 a 500 mM imidazolu.

Frakce se monitorují podle absorbance při OD280 nm a frakce píku se analyzují prostřednictvím SDS-PAGE. Coomassie briliantovou modří se vizualizují dva proužky, hlavní proužek o M_r = 78 kDa a vedlejší proužek o M_r = 60 kDa. Stanoví se, že čistota rekombinantního FlgE (78 kDa) je vyšší než 90 %. Protože se jedná o čištění rozpustných proteinů, eluují se frakce obsahující rekombinantní protein při koncentraci imidazolu 100 mM.

Močovina se pomalu oddělí od FlgE polypeptidů dialýzou proti TBS, který obsahuje 0,5% DOC při postupném snižováním koncentrace močoviny následujícím způsobem: 6 M, 4 M, 3 M, 2 Μ, 1 M, 0,5 M a potom 0 M. Každý dialyzační krok se provádí minimálně po dobu 4 hodin při teplotě místnosti.

• · • « «· · · » · · • · « · : :

• · · · · ·

Po dialýze se vzorky zkoncentrují tlakovou filtrací za použití Amicon míchaných buněk. Koncentrace proteinů se potom měří metodami podle Perkinse, Bradforda a Lowryho.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Terapeutická imunizace

1. Materiály a metody

1.1 Zvířata

Samice myši kmene SPF BALB/c se získají od Bomholt Breeding centre (Dánsko). Chovají se v běžných makrolonových klecích s volnou dodávkou vody a potravy. Zvířata jsou při dodání 4 až 6 týdnů stará.

1.2. Infekce

Po nejméně 1 týdnu aklimatizace se zvířata infikují typem 2 kmene H. pylori (kmen 244, původně izolovaný od pacienta s vředovou chorobou). Již dříve se prokázalo, že tento kmen je dobrým kolonizátorem myšího žaludku. Bakterie ze zásobníku udržovaného při teplotě -70 °C se nechají přes noc růst v brucelovém bujónu obohaceném 10% fetálním telecím sérem při teplotě +37 °C v mikroaerofilní atmosféře (10 % CO2, 5 % O2). Zvířatům se podá perorální dávka 400 pmol/kg omeprazolu a po 3 až 5 hodinách se perorálně očkuje H. pylori (přibližně 10⁷ až 10⁸ CFU/zvíře). Infekce se zkontroluje na kontrolních zvířatech za 2 až 3 týdny po očkování.

• · · ·

1.3 Imunizace

Jeden měsíc po infekci se dvě skupiny myší (10 myší ve skupině) čtyřikrát imunizují v průběhu časového úseku 34 dnů (ve dni 1, 15, 25 a 35). Podá se čištěný rekombinantní FIgE rozpuštěný v PBS s 0,5% deoxycholatem (DOC) v dávce 100 pg/myš.

Jako přídatný přípravek se zvířatům jak v kontrolní skupině, tak ve skupině, které se aplikuje FIgE, podá s každou imunizací také 10 pg/myš cholerového toxinu (CT). Všem zvířatům se 3 až 5 hodin před imunizací perorálně podá omeprazol v dávce 400 pmol/kg, jako způsob ochrany antigenů před degradací kyselinou. Zvířata se usmrtí 1 až 2 týdny po finální imunizaci.

Skupina 1: 300 pl PBS s 0,5% DOC obsahujícím 10 pg CT; Skupina 2: 300 pl PBS s 0,5% DOC obsahujícím 100 pg FIgE a pg CT.

1.4 Analýza infekce

Myši se usmrtí CO₂ a cervikální distorzí. Otevře se břišní a hrudní dutina a punkcí srdce se odebere vzorek krve. Následně se vyjme žaludek. Žaludek se rozřízne podél velké kurvatury, potom se propláchne fyziologickým roztokem a postupně se rozdělí na dva shodné kusy. Chirurgickým skalpelem se seškrábne separátně z antra a z těla vzorek sliznice o ploše 25 mm². Seškrábnutá sliznice se suspenduje v brucelovém bujónu, zředí se a naočkuje na Blood Skirrow plotny. Plotny se inkubují za mikroaerofilních podmínek po dobu 3 až 5 dnů a spočítá se počet kolonií. Totožnost H. pylori se ověří ureázovým a katalázovým testem a přímou mikroskopií nebo barvením podle Grama.

1.5 Měření protilátek

Z krve se odeberou sérové protilátky. Před odstředěním se krev zředí stejným množstvím PBS. Sérum se až do okamžiku analýzy udržuje při teplotě -20 °C. Metodou ELISA se změří sérové protilátky, tam, kde jsou plotny povlečeny buď konkrétní frakcí H. pylori kmene 244 nebo FlgE, což je následováno přidáním různých ředění séra.

ELISA se provede anti-myšími Ig protilátkami značenými alkalickou fosfatázou. Anti-Ig protilátky jsou typu antitěžký/anti-lehký řetězec, což by mělo zaručit detekci všech typů protilátek.

2. Výsledky

2.1 Terapeutická imunizace: účinek na CFU

Zvířata v této studii se infikují H. pylori - kmen 244 jeden měsíc před provedením imunizací. Myši ve skupinách po deseti se potom imunizují buď cholerovým toxinem (CT) nebo CT společně s rekombinantním FlgE polypeptidem. Čtyři týdny po poslední imunizaci se zvířata usmrtí a stanoví se CFU (obrázek 1). Zvířata léčená samotným CT jsou vysoce infikována, jak v těle tak v antru. Zvířata aktivně imunizovaná rekombinantním FlgE polypeptidem a CT mají signifikantně snížené hodnoty CFU v antru a v žaludku celkově při porovnání se zvířaty léčenými pouze CT (p <0,01 a p <0,05; řadící test podle znaku Wilcoxon-Mann-Whittneyova).

• · · · • ·

2.2 Terapeutická imunizace: účinky na tvorbu protilátek a • * · · · · • · · « • ···· · ♦· ^f • · · · · · « · • * · · · · · • · · a · · * * na sekreci

Jako známka infekce H. pylori mohou být v séru nalezeny specifické protilátky (kontrola/244). U zvířat, kterým se podá FlgE + CT, vzrostl titr proti kmeni 244 (jeho membránovým proteinům) čtyřikrát (p < 0,01) . Titr specifického sérového IgG proti FlgE lze změřit pouze u zvířat, kterým byl podán FlgE a CT (obrázek 2). Specifický IgG proti FlgE vzrůstá pouze u zvířat, kterým byl podán FlgE a CT, ale je nelze ho detekovat u kontrolních zvířat.

Prezentované výsledky ukazují, že rekombinantní FlgE polypeptid H. pylori je vysoce imunigenní pokud je podán perorálně, společně s cholerovým toxinem jako přídatným přípravkem, stanoveno jako růst systémových specifických Ig protilátek proti FlgE. Imunizace FlgE také vede k signifikantnímu růstu Ig titrů proti konkrétní frakci H. pylori. Dále se po imunizaci FlgE společně s cholerovým toxinem pozoruje dramatický pokles počtu kolonizujících bakterií H. pylori ve sliznici žaludku infikovaných myší.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (1) Žadatel

Jméno: Astra AB

Ulice: Vástra Málarehamnen 9

Město: Sódertálje

Stát: Švédsko

Směrovací číslo: S-151 85

Telefon: +46 8 553 260 00

Telefax: +46 8 553 288 20 (ii) Název vynálezu: Vakcínové kompozice V (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Počítačové formy:

(A) Medium: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1,0, verze # 1,30 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:1:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) délka: 2550 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitost: dvojitá (D) topologie: lineární (EPO (ii) Typ molekuly: cDNA « « • · · · (vi) Původní zdroj:

(A) organismus: Helicobacter pylori (ix) Znak:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokus: 321..2477 (D) další informace: /produkt = „FlgE bičíkový háčkový protein (x) Informace o publikaci (A) autoři: Paul W. 0'Toole, Magdalena Kostrzynska, Trevor J. Trust (B) název: Nepohyblivé mutanty Helicobactera pylori a produkce Helicobakterů mustelae defektních v bičíkovém háčku (C) časopis: Mol. Microbiology (D) vydání: 14 (E) číslo: 4 (F) stránky: 691 až 703 (G) datum: 1994 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:

AACAAAGCGA	TAACTCCTTT GTCTTATTAG CGACACAATT TAACCCATTG ACTTTAAATC	SO
GCGCTTCAGC	CGAAGAGATT CAAGATCATG AATGCGCGAT TTTGCACTAA AGCGAGTTAG	120
ATTCTTAAAT	TTGAGCGATA ACCTTTAAAA AGCGTAATTA AGGGGTGGTG TTACAAAACC	ISO

« · · · • ·

CCCTATCCCC TTATGAATTT GACCGATCTT TTTGATTAAC AAAACTTTAA AATCCGCAAT 240

CAATCATTCT AAAAAGCTAT TTAGGAACAA CTTTTGCTTT ATTTTGCATA GATTGAATTT 300

CTTTAAATTA AAGGATAACC ATG CTT AGG TCT TTA TGG TCT GGT GTC AAT 350

Met Leu Arg Ser Leu Trt Ser Gly Val Asn

1

5

10

GGG ATG

CAA

Lsk-s-

CAC

CAA ATC

GCT

TTG

GAT

ATT

GAG

AGT AAC

AAT ATT

398

Gly Met

Gin

Ala

His

Gin Ile

Ala

Leu

Asn

Ile

Glu

Ser Asn

Asn Ile

15

20

25

GCG AAC

GTG

AAT

ACC

ACT GGT

TTT

AAG

TAT

TCT

AGG

GCT TCT

TTT GTG

445

Ala Asn

Val

Asn

Thr

Thr Gly

Phe

Lvs

Tyr

Ser

Arg

Ala Ser

Phe Val

30

35

40

*

GAT ATG

TCT

CAA

GTC AAA

CTC

ATC

GCT

ACC

GCA

CCC TAT

AAA AAC

494

Asp Met

Leu

Ser

Gin

Val Lys

Leu

Ile

Ala

Thr

Ala

?xo Tyr

Lys Asn

45

50

*55

GGG TTA

GCA

GGG

CAG

AAT GAT

TTT

TCT

GTG

GGG

qfppr

GGG GTA

GGC GTG

542

Gly Leu

Ala

Gly

Gin

Asn Asn

Phe

Ser

Val

Gly

Leu

Gly Val

SO

55

70

GAT GCG

ACG

ACT

AAA

TCA

CAA

GGC

AAT

ATC

CAA AAC

ACA GAT

590

Asn Ala

Thr

Lys

Ile Phe

Ser

Gin

Gly

Asn

XXe

Gin Asn

Thr Asp

7Š

30

35

90

GTC AAA

ACC

GAT

CTA

GCG ATT

CAA

GGC

GAT

GGC

TTT

ATT AAC

S38

Val Lys

Thr

Asp

Leu

Ala Ile

Gin

Gly

Asn

Gly

Phe

Phe Ile

Ile Asn

95

100

105

CCT GAT

AGG

GGG

ATC

ACG CGC

AAT

ACT

AGA

GAT

GGG GAG

586

Pro Asn

Arg

Gly

Ile

Thr Arg

Asn

Phe

Thr

Arg

Asp

Gly Glu

Phe Leu

110

115

120

TTT GAC

TCG

CAA

GGG

AGT TTG

GTT

ACC

GGC

Λ*»·»*“·

CTT GTG

GTG CAA

734

Phe Asp

Ser

Gin

Gly

Ser Leu

Val

Thr

Gly

Leu Val

Val Gin

125

130

135

GGG TGG

GTG

AGA

AAT

GGG AGC

GAT

ACC

GGC

AAT

AAA

GGG AGC

GAT ACA

7S2

Gly Tm

Val

Arg

Asn

Gly Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Lys

Gly Ser

Asp Thr

140

145

150

GAC GCT

TTA

AAA

GTG

GAT AAC

ACC

GGT

CCT

TTA

GAA

AAC ATT

AGG ATT

330

Asp Ala

Leu

Lys

Val

Asn Asn

Thr

Gly

Pro

Leu

Glu

Asn Ile

Arg Ile

155

ISO

165

170

GAT CCT

GGA

ATG

GTG

ATG CCA

GCC

AGA

GCG

AGT

AAC

CGC ATT

TCT ATG

373

Asp Pro

Gly

Met

Val

Met Pro

Ala

Arg

Ala

Ser

Asn

Arg Ile

Ser Met

175 180 185

AGG GCG AAT TTA AAC GCT GGA AGG CAT GCC GAT CAA ACA GCG GCG ATA 925

Arg Ala Asn Leu Asn Ala Gly Arg His Ala Asp Gin Thr Ala Ala Xle

190 195 200

TTC GCT TTG GAT TCT TCA GCC AAA ACC CCT TCA GAT GGC ATT AAT CCG 974

Phe Ala Leu Asp Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Asp Gly Ile Asn Pro

205 210 215

GTG TAT GAT TCA GGC ACG AAT CTT GCT CAA GTC GCC GAA GAC ATG GGA 1022

Val Tyr Asn Ser Gly Thr Asn Leu Ala Gin Val Ala Glu Asp Met Gly

220 225 230

TCT TTA TAC AAT GAA GAT GGC GAC GCT CTT TTG TTG AAT GAA AAT CAA 1070 • ···· ·· ···· · · * * «·· ·«· * · · · • ·· · · ···· · ·· · • · · · · ·*··«· • ··« ···«« ·«·«·· ·· · · · · » *

Ser 225

Leu

Tyr

Asn

Glu

Asn 240

Gly

Asn

Ala

Leu

Leu 245

Leu

Asn

Glu

Asn

Gin 250.

GGG

ATT

TGG

GTG

AGC

TAT

AAG

AGT

CCA

AAA

ATG

GTC

AAA

GAC

ATC

CTC

1113

Gly

Ile

Trp

Val

Ser 255

Tyr

Lys

Ser

Pro

Lvs 260

Met

Val

Lys

Asp

Ile 265

Leu

mmm

TCT

GCA

GAA

AAC

AGC

ACG

CTT

GAA

TTG

AAT

GGC

GTT

AAG

ATT

TCT

1166

Pro

Ser

Ala

Glu 270

Asn

Ser

Thr

Leu

Glu 275

Leu

Asn

Gly

Val

Lys 280

Ile

Ser

mmr·

ACA

AAC

GAT

TCA

GCG

GTG

AGC

CGG

ACT

TCA

AGC

TTA

GTG

GCG

GCT

1214

Pixs

Thr

Asn 285

Asp

Ser

Ala

Val

Ser 290

Arg

Thr

Ser

Leu 295

Val

Ala

AAA

AAT

GCG

ATC

AAT

GCA

GTC

AAA

AGC

CAA

ACA

GGC

ATT

GAA

GCT

TAT

1262

Lys

Asn 300

Ala

Ile

Asn

Ala

Val 305

Lys

Ser

Gin

Thr

Gly 310

Ile

Glu

Ala

Tyr

mm·*

GAC

GGC

AAG

CAA

TTG

CGT

TTG

GAA

AAC

ACC

AAT

GAA

TTA

GAC

GGC

1310

Leu 315

Asp

Gly

Lys

Gin

Leu 320

Arg

Leu

Glu

Asn

Thr 325

Asn

Glu

Leu

Asp

Glv 330

GAT

GAA

AAG

QfTwn

AAA

AAC

ATT

GTA

GTT

ACT

CAA

GCC

GGA

ACC

GGA

GCG

13 5 8

Asp

Glu

Lys

Leu

Lys 335

Asn

Ile

Val

Thr 340

Gin

Ala

Gly

Thr

Giv 345

Ala

mwn

GCT

AAC

TTT

TTA

GAC

GGC

GAT

AAA

GAT

GTA

ACG

GCT

TTC

AAA

TAC

1406

Phe

Ala

Asn

Phe 350

Leu

Asp

Gly

Asp

Lys 355

Asn

Val

Thr

Ala

Phe 360

Lys

Tyr

AGC

TAC

ACG

CAT

TCT

ATT

AGC

CCT

AAC

GCC

AAT

AGC

GGG

CAG

TTT

AGG

1454

Ser

Tyr

Thr 365

His

Ser

Ile

Ser

Pro 370

Asn

Ala

Asn

Ser

Gly 375

Gin

Phe

Arg

ACC

ACT

GAA

GAC

TTG

CGC

GCC

TTA

ATC

CAG

CAT

GAC

GCT

AAT

ATC

GTT

1502

Thr

Thr 380

Glu

Asp

Leu

Arg

Ala 385

Leu

Ile

Gin

His

Asp 390

Ala

Asn

Ile

Val

AAA

GAT

CCT

AGC

CTA

GCG

GAC

AAT

TAC

CAA

GAC

TCA

GCT

TCT

ATA

1550

Lvs 395

Asp

Pro

Ser

Leu

Ala 400

Asp

Asn

Tyr

Gin

Asn 405

Ser

Ala

Ser

Ile 410

GGA

GTT

ACA

ATC

AAC

CAA

TAC

GGC

ATG

TTT

GAA

ATC

AAC

AAT

AAA

GAC

1598

Gly

Val

Thr

Ile

Asn 415

Gin

Tyr

Gly

Met

Phe 420

Glu

Ile

Asn

Lys 425

Asp

AAT

AAA

AAT

GTC

ATT

AAA

GAA

AAT

CTT

AAT

ATC

TTT

GTG

AGC

GGG

TAT

1646

Asn

Lys

Asn

Val

Ile

Lys

Glu

Asn

Leu

Asn

Ile

Phe

Val

Ser

Gly

TV-7

430 435 440

řpr^m

TCA

GAC

AGC GTA

ACG

AAC

AAT

gipíp

TTG

TTT

AAA

AAT

GCG

ATG

AAA

1594

Ser

Asp

Ser Val

Tiur

Asn

Val

Leu

Phe

Lys

Asn

Ala

Met

Lys

445

450

455

GGG

CTT

AAT

ACC GCT

ijirwm

TTA

ATT

GAA

Guu

-G

TCA

G77

AGC

AGT

1742

Gly

Leu

Asn

Thr Ala

Se.-

Leu

Ile

Glu

C-iy

Gly

..a

Ser

T.

Ser

460

465

470

mmm

AAA

TTC

ACC CAC

GCT

ACG

CAT

GCG

ACA

AGC

ATT

GAT

GTG

ATA

GAC

1790

Ser

Lys

Phe

Thr His

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Ser

Zle

Asn

Val

Ile

Asp

475

480

485

490

AGC

TTA

GGC

ACT AAA

CAC

GCC

ATG

CGC

^mir»

GAG

TTT

TAT

AGG

AGT

GGG

1838

Ser

Leu

Gly

Thr Lys

His

Ala

Met

Azrg

Zle

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser

Gly

495 500 505 • 4*4

4* ·

4 • · • · 4 ·

GGA

GCG GAT

TGG

AGA

GTG

ATC

GTG

CCT

GAG

CCT GGG

GAA TTA

1385

Gly

Ala As?

Tm

Asn Phe

Arg

Val

Ile

Val

Pro

Glu

Pro Gly

Glu Leu

510

515

520

GTA

GGG GGG

TCA

GCG GCT

AGG

CCT

AAT

GTG

TTT

GAA

GGA GGC

CGT TTG

1934

Val

Gly Glv

Ser

Ala Ala

Arg

Pro

Asn

Val

Phe

Glu

Glv Gly

Arg Leu

525

530

535

CAC

TTC AAT

AAT

GAC GGA

TCG

CTT

GCA

GGC

ATG

AAC

CCG CCT

1982

His

Phe Asn

Asn

As? Gly

Ser

Leu

Ala

Gly

Met

Asn

Pro Pro

Leu Leu

540

545

550

CAA

TTT GAC

CCT

AAA AAT

GGT

GCT

GAT

GCC

CCC

CAA

CGC ATC

AAT TTA

- 2030

Gin.

Phe As?

Pro

Lys Asn

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Gin

Arg Ile

Asn Leu

555

560

565

370

GCT

TTT GGT

TCC

TCA GGG

AGT

TTT

GAC

GGG

CTA

ACG

AGC GTG

GAT AAG

2073

Ala

Phe Gly

Ser

Ser Gly

Ser

Phe

As?

Gly

Leu

Thr

Ser Val

Asn Lys

575

580

585

TCT GAA

ACT

TAT GCG

ATT

GAG

CAA

AAC

GGC

/nu m

CAA GCG

GGC GAT

2126

Ile

Ser Glu

Thr

Tyr Ala

Ile

Glu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Gin Ala

Gly As?

590

595

600

TTG

ATG GAT

GTC

CGC TTT

GAT

TCA

GAT

GGG

GTG

TTA GGA

GCG TTC

2174

Leu

Met Asn

Val

Arg Phe

Asp

Ser

As?

Gly

Val

Leu

Leu Gly

Ala Phe

605

510

615

AGT

AAT GGC

AGG

ACT TTA

GCG

CTC

GCT

CAA

GTG

GCT

TTA GCG

AAT TTC

2222

Ser

Asn Gly

Arg

Thr Leu

Ala

Leu

Ala

Gin

Val

Ala

Leu Ala

Asn Phe

620

625

530

GCT

AAC GAT

GCG

GGC TTG

CAG

GCT

TTA

GGC

GGG

AAT

GTC TTT

TCT CAA

2270

Ala

Asn As?

Ala

Gly Leu

Gin

Ala

Leu

Gly

Asn

Val Phe

Ser Gin

635

640

545

650

—

ACC

GGA AAC

TCA

GGG CAA

GCC

TTA

ATC

GGT

GCT

AAT ACG

GGG CGT

2318

Thr

Gly Asn

Ser

Gly Gin

Ala

Leu

Ile

Gly

AlaAla

Asn Thr

Gly Arg

655

660

665

AGG

GGT TCA

ATT

TCA GGA

TCT

AAA

CTG

GAG

TCT

AGT

AAT GTG

GAT TTG

2366

Arg

Gly Ser

Ile

Ser Gly

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Asn Val

As? Leu

670

675

680

AGC

CGG AGT

TTA

ACG AAT

TTG

ATT

GTG

GTT

CAA

AGG

GGC TTT

CAA GCA

2414

Ser

Arg Ser

Leu

Thr Asn

Leu

Ile

Val

Gin

Arg

Glv Phe

Gin Ala

585

690

695

AAC

TCT AAA

GCG

GTA ACC

ACA

TCC

GAT

CAA

ATC

QfTWp

AAT ACC

CTA TTG

2462

Asn

Ser Lys

Ala

Val Thr

Thr

Ser

As?

Gin

Ile

Leu

Asn Thr

Leu Leu

700

705

710

AAT

CTT AAG

CAA

TAA ACTAAAGGAT '

TACT

CTAA'

TA CAATA

TAATA GGGGCTAATT

2517

Asn

Leu Lys

Gin

*

715

TAAAGATTAA GGTTTAGTAT GCATGAATAC TCG 2550 * · • « « · )3) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) délka: 719 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

• · · · • ··· ···· ··· « ···· · ·· · • · · · ··· ·· · • ·· · · · · · • « · 4» · · · · · · *

Met 1

Leu

Arg

Ser

Leu 5

Trp

Ser

Gly

Val

Asn 10

Gly

Met

Gin

Ala

His 15

Gin

Ile

Ala

Leu

Asn 20

Ile

Glu

Ser

Asn

Asn 25

Ile

Ala

Asn

Val

Asn 30

Thr

Gly

Phe

Lys 35

Tyr

Ser

Arg

Ala

Ser 40

Phe

Val

Asp

Met

Leu 45

Ser

Gin

Val

Lys

Leu 50

Ile

Ala

Thr

Ala

Pro 55

Tyr

Lys

Asn

Gly

Leu 60

Ala

Gly

Gin

Asn

Asn 55

Phe

Ser

Val

Gly

Leu 70

Gly

Val

Gly

Val

Asp 75

Ala

Thr

Lys

Ile 80

Phe

Ser

Gin

Gly

Asn 85

Ile

Gin

Asn

Thr

Asp 90

Val

Lys

Thr

Asp

Leu 95

Ala

Ile

Gin

Gly

Asp 100

Gly

Phe

Ile

Ile 105

Asn

Pro

Asp

Arg

Gly 110

Ile

Thr

Arg

Asn

Phe 115

Thr

Arg

Asp

Gly

Glu 120

Phe

Leu

Phe

Asp

Ser 125

Gin

Gly

Ser

Leu

Val 13 0

Thr

Gly

Leu 135

Val

Gin

Gly

*Ζ?2Γρ 140

Val

Arg

Asn

Gly

Ser 145

Asp

Thr

Gly

Asn

Lys 150

Gly

Ser

Asp

Thr

Asp 155

Ala

Leu

Lys

Val

Asn 160

Asn

Thr

Gly

Pro

Leu 155

Glu

Asn

Ile

Arg

Ile 170

Asp

Pro

Gly

Met

Val 175

Met

Pro

Ala

Arg

Ala 180

Ser

Asn

Arg

Ile

Ser 185

Met

Arg

Ala

Asn

Leu 190

Asn

Ala

Gly

Arg

His 195

Ala

Asp

Gin

Thr

Ala 200

Ala

Ile

Phe

Ala

Leu 205

Asp

Ser

Ala

Lys 210

Thr

Pro

Ser

Asp

Gly 215

Ile

Asn

Pro

Val

Tyx 220

Asp

Ser

Gly

Thr

Asn 225

Leu

Ala

Gin

Val

Ala 23 0

Glu

Asp

Met

Gly

Ser 235

Leu

Tyr

Asn

Glu

Asp 240

Gly

Asp

Ala

Leu

Leu 245

Leu

Asn

Glu

Asn

Gin 250

Gly

Ile

Trp

Val

Ser 255

Tyr

Lys

Ser

Pro

Lys 250

Met

Val

Lys

Asp

Ile 255

Leu

Pro

Ser

Ala

Glu 270

Asn

Ser

Thr

Leu

Glu 275

Leu

Asn

Gly

Val

Lvs 280

Ile

Ser

Phe

Thr

A.- 28;.

isp

£- _:

Ala

Val

Ser 290

Arg

Thr

Ser

Leu 295

Val

Ala

Lys

Asn 300

Ala

Ile

Asn

Ala

Val 305

Lys

Ser

Gin

Gly 310

Ile

Glu

Ala

Tyr

Leu 315

Asp

Gly

Lys

Gin

Leu 320

Arg Leu Glu Asn Thr Asn Glu Leu Asp Gly Asp Glu Lys Leu Lys Asn

325 330 335

Ile Val

Val

Thr 340

Gin

Ala

Gly

Thr

Gly 345

Ala

Phe

Ala

Asn

Phe Leu 35Q

Asp

Gly Asp

Lys 355

Asp

Val

Thr

Ala

Phe 360

Lys

Tyr

Ser

Tyr

7»+ 3 65

His Ser

Ile

Ser Pro 370

Asn

Ala

Asn

Ser

Gly 375

Gin

Phe

Arg

Thr

Thr 380

Glu

Asp Leu

Arg

Ala Leu 335

Ile

Gin

His

Asn 390

Ala

Asn

Ile

Val

Lys 395

Asp

Pro

Ser Leu

Ala 400

Asp Asn

Tyr

Gin

Aso 405

Ser

Ala

Ser

Ile 410

Gly

Val

^hr

Ile Asn 415

Gin

Tyr Gly

Mec

Phe 420

Glu

Ile

Asn

Lys 425

Asp

Asn

Lys

Asn

Val Ile 430

Lys

Glu Asn

Leu 435

Asn.

.Ile

Phe

Val

Ser 440

Gly

Tyr

Ser

Asp 445

Ser Val

Thr

Asn Asn 450

Val

Leu

Phe

Lys

Asn 455

Ala

Mec

Lys

Gly

Leu 460

Asn

Thr Ala

Ser

Leu Ile 465

Glu

Gly

Ala 470

Ser

Ala

Ser

Ser 475

Lys

Ph.s

HiS

Ala 480

Thr His

Ala

Thr

Ser 485

Ile

Asp

Val

Ile

Asn 490

Ser

Leu

Gly

Thr Lvs 495

His

Ala Mec

Arg

Ile 500

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser 505

Gly

Ala

Asp

Trp Asn 510

Phe

Arg Val

Ile 515

Val

Pro

Glu

Pro

Gly 520

Glu

Leu

Val

Gly

Gly 525

Ser Ala

Ala

Arg Pro 530

Asn

Val

Phe

Glu

Gly 535

Gly

Arg

Leu

His

Phe 540

Asn

Asn Asp

Gly

Ser Leu 545

Ala. Gly

MeC

Asn 550

Pro

Leu

Gin 555

Phe

Asp

Pro Lys

Asn 560

Gly Ala

Asp

Ala

Pro 565

Gin

Arg

Ile

Asn

Leu 570

Ala

Phe

Gly

Ser Ser 575

Gly

Ser Phe

Asp

Gly 580

Leu

Thr

Ser

Val

Asp 585

Lys

Ile

Ser

Glu

Thr Tvr 590

Ala

Ila Glu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Gin

Ala

Gly

Asp

Leu

Mec

Asp

Val Arg

Phe

595 600 605

Asp

Ser 610

Asp

Gly

Val

Leu

Leu 615

Gly

Ala

Phe

Ser

Asn 620

Gly

Arg

Thr

Leu

Ala 625

Leu

Ala

Gin

Val

Ala 630

Le^Ala.

Asn.

Phe

Ala 635

Asn

Asp

Ala

Gly

Leu 640

Gin

Ala

Leu

Gly

Gly 645

Asn

Val

Phe

Ser

Gin 650

Thr

Gly

Asn

Ser

Gly 655

Gin

Ala

Leu

Ile

Gly 660

Ala

Asn

Thr

Gly 665

Arg

Gly

Ser

Ile 670

Ser

Gly

Ser

Lys

Leu 675

Glu

Ser

Asn

Val 680

Asp

Leu

Ser

Arg

Ser 6S5

Leu

Thr

Asn

Leu

Ile 690

Val

Gin

Arg

Gly 695

Phe

Gin.

Ala

Asn

Ser 700

Lys

Ala

Val

Thr

Thr 705

Ser

Asp

Gin

Ile

Leu 710

Asn

Thr

Leu

Asn 715

Leu

Lys

Gin

*

• ·

3-α • ···· ·· ··*· • · · · · · • ··· · ···· • · · · · · • · · · ·

(2)	Informace o sekvenci SEQ ID NO:	3:
(i)	Sekvenční charakteristika:
(A)	délka: 25 párů bází
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	vláknitost: jednoduchá
(D)	topologie: lineární
(ii)	typ molekuly: jiná nukleová	kyselina
(A)	popis: /desc. = „PCR primer
(xi)	i Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
TAT	ACC ATGG TGC TTA GGTC TTTAT
(2)	Informace o sekvenci SEQ ID NO:	4 :
(i)	Sekvenční charakteristika:
(A)	délka: 25 párů bází
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	vláknitost: jednoduchá
(D)	topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová	kyselina
(A)	popis: /desc. = „PCR primer
(xi)	í Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

GCG AAT TCAA TTG CTT AAGA TTCAA

Claims

PATETOVÉ NÁROKY

1. FlgE polypeptid Helicobactera pylori nebo jeho modifikovaná forma, která má funkčně ekvivalentu antigenicitu, pro použití v indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori.
2. FlgE polypeptid Helicobactera pylori podle nároku 1, který má v podstatě sekvenci aminokyselin, znázorněnou v sekvenci SEQ ID NO: 2 z výčtu sekvencí, pro použití k indukci obranné imunitní odpovědi na infekci

Helicobacterem pylori.
3. Vakcínová kompozice pro indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori, vyznačující se tím, že obsahuje imunogenně účinné množství FlgE polypeptidů Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, popřípadě společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
4. Vakcínová kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že navíc obsahuje přídatný přípravek.
5. Vakcínová kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že přídatný přípravek je farmaceuticky přijatelná forma cholerového toxinu.
6. Vakcínová kompozice podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, pro použití jako terapeutická vakcína pro savce včetně člověka, který je infikován Helicobacterem pylori.

• · · · • · · · • · · ·

Ί. Vakcínová kompozice podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, pro použití jako profylaktická vakcína pro ochranu savce včetně člověka, proti infekci Helicobacterem pylori.
8. Použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, pro výrobu prostředku pro léčbu, profylaxi nebo diagnózu infekce Helicobacterem pylori.
9. Použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, pro výrobu vakcíny pro navození obranné imunitní odpovědi proti Helicobacteru pylori.
10. Použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, pro výrobu diagnostického kitu pro diagnózu infekce Helicobacterem pylori.
11. Způsob diagnózy infekce Helicobacterem pylori in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden krok, kde je použit FlgE polypeptid Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, popřípadě označen nebo koplován na pevnou podporu.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje kroky (a) kontaktování zmíněného FlgE polypeptidu Helicobactera pylori popřípadě navázaného na pevnou podporu, s tělesnou tekutinou odebranou savci; a (b) detekování protilátek ve zmíněné tělesné tekutině, které se vážou na zmíněný FlgE polypeptid.
13. Diagnostický kit pro detekci infekce Helicobacterem pylori u savce včetně člověka, vyznačuj ící

9 4 9444 ·· ♦·

4 9 · · · · · • ···· · · · *

9 4 9 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 49 4 4 4 4 se t í m, že zahrnuje složky, které umožní provedení postupu podle nároků 11 nebo 12.
14. Diagnostický kit podle nároku 13, v y z n a č u jící se tím, že zahrnuje:

(a) FlgE polypeptid Helicobactera pylori; a (b) činidla pro detekci protilátek, které se vážou na zmíněný FlgE polypeptid.
15. Způsob navození u savce obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori, vyznačuj ίο i se t i m, že zmíněný způsob zahrnuje krok podání zmíněnému savci imunologicky účinného množství FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2.
16. Způsob navození u savce obranné imunitní odpově di proti infekci Helicobacterem pylori, vyznačuj i c i se t i m, že zmíněný způsob zahrnuje krok podání zmíněnému savci imunologicky účinného množství vakcínové kompozice podle kteréhokoliv z nároků 3 až 7.
17. Způsob podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že zmíněný savec je člověk.