CZ9904449A3 - Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid - Google Patents
Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- CZ9904449A3 CZ9904449A3 CZ19994449A CZ444999A CZ9904449A3 CZ 9904449 A3 CZ9904449 A3 CZ 9904449A3 CZ 19994449 A CZ19994449 A CZ 19994449A CZ 444999 A CZ444999 A CZ 444999A CZ 9904449 A3 CZ9904449 A3 CZ 9904449A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- helicobacter pylori
- asn
- gly
- ser
- ala
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y02A50/472—
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Vynález se týká polypeptidů a vakcínových kompozic pro
indukování obranné imunitní odpovědi na infekci
Helicobacterem pylori. Použití polypeptidů Helicobactera
pylori pro výrobu prostředků pro léčbu nebo profylaxi infekce
Helicobacterem pylori.
Description
Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter polypeptid
Oblast techniky
Tento vynález se týká polypeptidů a vakcínových kompozic pro indukci obranné imunitní odpovědi na infekci bakterií Helicobacter pylori. Přítomný vynález se dále týká použití polypeptidů Helicobactera pylori pro výrobu prostředků pro léčbu nebo profylaxi infekce zapříčiněné Helicobacterem pylori.
Dosavadní stav techniky
Helicobacter pylori
Gram negativní bakterie Helicobacter pylori (H. pylori) je důležitým lidským patogenem, který se vyskytuje u několika gastrointestinálních chorob. Kolonizace žaludečního epitelu touto bakterií vede k aktivnímu zánětu a progresivní chronické gastritidě se značným zvýšením rizika progrese peptické vředové choroby. Po celý život trvající zánět žaludeční sliznice je ve velmi těsné korelaci se signifikantním zvýšením rizika vzniku karcinomu žaludku.
Ke kolonizaci žaludeční sliznice používá H. pylori různých faktorů virulence. Tyto faktory virulence zahrnují několik adhesinů, prostřednictvím kterých se bakterie přichycuje na hlen a/nebo se váže na epiteliální buňky; ureázu, která pomáhá neutralizovat kyselé prostředí; a proteolytické enzymy, které činí hlen tekutější. H. pylori je velmi pohyblivý, pohybuje se v hlenu a směrem do krypt. Ukázalo se, že motilita je zásadním faktorem virulence,
Γ» · ···· ·· ···· ·· ·» ··· · · · · · · · ···· · ···· * · * · • « · · · ······ • · · » ··*·· ······ ·· ··· ·* · · jako že nepohyblivý H. pylori není schopen infikovat sliznici v experimentálních modelech popsaných v publikaci Eaton a kol., Infection & Immunity, 64 (7), 2445 až 2448 (1996). Pro to existuje mnoho možných důvodů, nejzřetelnější je neschopnost pohybovat se a přichytit se na slizniční buňky, a neschopnost bránit se škodlivým látkám v žaludku.
Navzdory zjevné silné imunitní odpovědi hostitele na infekci H. pylori s produkcí jak lokálních (slizničních), tak i systémových protilátek, perzistuje patogen v žaludeční sliznici, běžně po celý život hostitele. Příčinou této skutečnosti pravděpodobně je, že spontánně indukované imunitní odpovědi nejsou dostatečné, nebo jsou cíleny na nesprávné epitopy antigenů. Alternativně se může jednat o nesprávný typ imunitní reakce, protože imunitní systém se může chovat vůči H.pylori jako ke komenzálovi, neboli baktérii žijící v symbióze, což je naznačeno celoživotním vztahem mezi hostitelem a bakterií.
Za účelem porozumění patogenezi a imunologii infekcí H. pylori je důležité definovat antigenní strukturu této bakterie. Obzvláště je nutné charakterizovat proteiny exprimované na povrchu, proteiny spojené s povrchem, stejně jako proteiny secernované, které byly u mnoha bakteriálních patogenů prokázány jako představitelé hlavních faktorů virulence, a které mohou být užitečné pro diagnózu H. pylori a pro výrobu vakcínových kompozicí. Pokud jsou tyto proteiny, současně s tím, že jsou povrchové, také nezbytné pro přežití a/nebo kolonizaci, zvyšuje se tím jejich vhodnost jako cíl pro vakcínou navozenou imunoterapii.
Kdykoliv se buňka H. pylori vyskytne ve stresu nebo ohrožení, transformuje se z bacilární do kokoidní formy.
• · • · · ·
V kokoidní formě je buňka H. pylori značně méně citlivá na antibiotika a jiné antibakteriální přípravky. Nepřímo je naznačeno, že H. pylori může být přenášen mezi jednotlivci v této formě, pravděpodobně vodou nebo přímým kontaktem (orálně-orální; fekálně-orální cestou). Účinná vakcínová kompozice by měla proto navodit imunitní odpověď jak na kokoidní tak na bacilární formu H. pylori. Protože systémová imunita zastává pravděpodobně pouze omezenou roli v ochraně proti slizničním infekcím, je také důležité, že vakcínová kompozice bude zesilovat obranné imunitní mechanismy lokálně v žaludku.
Bičíkový háčkový protein
Ukázalo se, že se bičíkové háčky H. pylori skládají z FlgE podjednotek o molekulové hmotnosti 78 kDa (0'Toole a kol., Molecular Microbiology, 14 (4), 691 až 703 (1994)). Funkce bičíkového háčku je spojení bičíku se submembránovým bičíkovým motorem. Část háčku, která prominuje zevně membrány je krátká, měří přibližně 60 nm (v porovnání s přibližně 10 pm délky vlastního bičíku). Stejně jako bičík H. pylori, háček je pravděpodobně pokryt obalem (Geis a kol., J. Med. Microbiol., 38 (5), 371 až 377 (1993)).
Sekvence aminokyselin v FlgE polypeptidu se nápadně podobá sekvenci jiných známých háčkových proteinů, včetně určité homologie s jinými příslušníky rodu Helicobacter jako jsou Mustelae (0'Toole a kol., viz výše). Polyklonální protilátky secernované proti FlgE polypeptidu vykazují zkříženou reaktivitu proti bičíkovým proteinům A a B, což možná naznačuje existenci sdílených epitopu. Produkce protilátek proti FlgE paralyzuje H. pylori, což vede ke vzniku bezbičíkatých nepohyblivých bakterií, ve kterých se FlgE polypeptid stále tvoří, ale může být zpracován pouze • « v cytoplasmě.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1
Účinek terapeutické imunizace myši infikované H. pylori (skupina o n = 9 až 10 členů) FlgE polypeptidem. Výsledky jsou uvedeny jako střední hodnota + směrodatná odchylka počtu H. pylori v antru (A), těle (Β), nebo celkový počet bakterii (A + B) = (C).
Zkratky: CFU (colony forming units) počet bakterii;
nevyšrafováné sloupce = DOC + CT, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok s 0,5 % deoxycholatu podaný společně s cholerovým toxinem 10 pg na myš;
vyšrafované sloupce = FlgE + CT, myš dostane 100 pg FlgE a 10 pg cholerovtho toxinu.
Pokles CFU je signifikantní v antru a jak bylo vypočítáno, v celém žaludku.
** p <0,01;
* p <0,05 (řadící test podle Wilcoxon-Mann-Whitney znaku).
Obrázek 2:
Sérový myší IgG měřený ELISA metodou; odpověď na infekci a na imunizaci FlgE. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměrné titry ± směrodatná odchylka, n = 9 až 10 ve skupině. ELISA, povlečení H. pylori, kmen 244. Jako znak infekce H. pylori mohou být v séru zvířat léčených DOC +
CT nalezeny specifické protilátky (= A, kontrola/244). Po imunizaci FlgE + cholerovým toxinem (= B, FlgE/244) vzrostla tato reaktivita čtyřikrát (** p <0,01; řadící test podle Wilcoxon-Mann-Whitney znaku). C = FlgE specifický.
• · · » • · • «··· ······ • ··· ·«··· ······ ·· ··· · · · ·
Specifický FlgE IgG vzrostl u zvířat, kterým bylo podáno
FlgE + CT, ale byl nedetekovatelný u kontrolních zvířat.
Podrobný popis vynálezu
Účelem přítomného vynálezu je poskytnutí antigenního polypeptidů H. pylori, který může být užitečný pro spuštění obranné imunitní odpovědi proti H. pylori, a pro diagnózu infekce H. pylori. Tento záměr se dosáhne rekombinantním klonováním genu H. pylori, který kóduje kvalitní esenciální polypeptid. Sekvence nukleové kyseliny tohoto genu je podobná sekvenci genu pro FlgE, jak publikoval 0'Toole a kol., Molecular Biology, 14(4), 691 až 703 (1994). Protože se jedná o esenciální protein motility, je gen pro FlgE exprimován všemi kmeny H. pylori.
S překvapením bylo nalezeno, že FlgE polypeptid H. pylori, navzdory faktům, že se pouze malá část háčkového proteinu vyskytuje mimo bakterii, a že je pravděpodobně pokryta krytem, může fungovat jako terapeutický antigen na modelu myši infikované H. pylori, v případě, že je podán společně s přídatným cholerovým toxinem. Experimentální údaje níže proto naznačují, že pokud je FlgE polypeptid H. pylori použit jako perorální imunogen, funguje jako stimulátor imunitní odpovědi, která vede k signifikantní redukci kolonizace H. pylori u myší, které byly infikovány H. pylori jeden měsíc před imunizací.
Tyto výsledky silně podporují použití FlgE polypeptidů H. pylori jako perorální vakcínové formulace pro použití u lidí, za účelem léčby a prevence infekcí H. pylori. FlgE polypeptid bude jako takový použitelný jak pro detekci infekcí H. pylori, tak pro výrobu vakcínových kompozic, které, pokud budou podány v podobě vhodné • · • ···· ·♦ ···· ·· • · · · · · ··· ···· · ···· · · · • «··· ····· • · · · ···· ······ · · ··· · · ·· farmaceutické formulace, spustí obrannou nebo terapeutickou imunitní odpověď na tyto infekce.
Následně, v jednom aspektu poskytuje přítomný vynález FlgE polypeptid H. pylori pro použití k indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori. Zamýšlí se, že název „FlgE polypeptid Helicobactera pylori znamená polypeptid, který je popsán v publikaci 0'Tool a kol., Molecular Microbiology, 14(4), 691 až 703 (1994), a který je kódován genem, jehož nukleotidová sekvence je určena jako SEQ ID NO:1, nebo jí lze získat od Národního centra pro biotechnologické informace (National Center for Biotechnology Information) (přírůstkové číslo U09549), nebo v podstatě podobná modifikovaná forma zmíněného polypeptidu, která si uchovává funkčně ekvivalentní antigenicitu.
Název „obranná imunitní odpověď má být chápán jako imunitní odpověď, která činí prostředek vhodný pro terapeutické a/nebo profylaktické účely.
Název „funkčně ekvivalent! antigenicita má být chápán jako schopnost indukovat systémovou a slizniční imunitní odpověď a současně snižovat počet buněk H. pylori vyskytujících se na sliznici žaludku. Odborník v oboru bude schopen identifikovat modifikované formy FlgE polypeptidu, které si uchovávají funkčně ekvivalentní antigenicitu, použitím známých způsobů, jako je mapování epitopů protilátkami indukovanými in vivo.
Ve výhodném provedení přítomného vynálezu má FlgE polypeptid Helicobactera pylori pro použití za účelem indukce obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori v podstatě sekvenci aminokyselin uváděnou v seznamu • * • · • « · • · · • · · · sekvencí jako SEQ ID NO: 2, nebo je to jeho modifikovaná forma, která si uchovává funkčně ekvivalentní antigenicitu.
Proto má být rozuměno, že by definice FlgE polypeptidu Helicobactera pylori neměla být přísně omezena na polypeptid se sekvencí aminokyselin identickou s SEQ ID NO: 2 v seznamu sekvencí. Přítomný vynález se spíše týká polypeptidu nesoucích modifikace jako jsou substituce, malé delece, inzerce nebo inverze, a tyto polypeptidy nicméně mají v podstatě biologickou účinnost FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, a mají zachovanou funkčně ekvivalentní antige-nicitu. V definici FlgE polypeptidu Helicobactera pylori jsou následně zahrnuty polypeptidy, jejichž sekvence aminokyselin jsou z alespoň 90 % homologní, s výhodou z alespoň 95 % homologní, se sekvencí aminokyselin uvedenou jako SEQ ID NO: 2 v seznamu sekvencí.
Z dalšího aspektu poskytuje vynález vakcínovou kompozici pro indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori, která obsahuje imunogenně účinné množství FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, popřípadě s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
V přítomném kontextu se výrazem „imunologicky účinné množství rozumí takové množství, které spustí signifikantní obrannou odpověď na Helicobactera pylori, která povede k eradikaci infekce H. pylori u infikovaného savce, nebo zabrání infekci vnímavého savce. Obvykle bude imunologicky účinné množství zahrnovat přibližně 1 pg aD 1000 mg, s výhodou přibližně 10 pg až 100 mg, antigenu H. pylori pro perorální podání, nebo přibližně méně než 100 pg pro parenterální podání.
« · • · · · · ·· ···· • · t · · · · ···· · · ··· · • ···· · · · • · · · · · ······ · · · · ·
Vakcínová kompozice obsahuje popřípadě mimo farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo, jeden nebo více imunologicky aktivních antigenů pro profylaktické nebo terapeutické použití. Fyziologicky přijatelné nosiče a ředidla jsou odborníkům v oboru dobře známá a zahrnují např. fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (phosphate buffered šalině, PBS), nebo, v případě perorálních vakcín, formulace založené na HCO3, nebo entericky povlečené formulace.
Vakcínové kompozice mohou popřípadě zahrnovat, nebo mohou být podány společně s inhibitory sekrece kyseliny, s výhodou s inhibitory protonové pumpy (PPI), jako například s omeprazolem. Vakcína může být formulována v známých systémech dodávání, jako jsou lipozomy, ISCOM molekuly, kochleaty atd. (viz například Rabinovich a kol., Science, 265, 1401 až 1404 (1994)), nebo může být navázána nebo inkorporována do polymerových mikrosfér degradovatelné nebo nedegradovatelné povahy. Antigeny mohou být spojeny s živými nebo atenuovanými bakteriemi, viry nebo fágy, nebo s mrtvými vektory stejného druhu. Antigeny mohou být chemicky nebo geneticky kuplovány s proteiny nosiče inertních nebo přídatných typů (například cholerová subjednotka B). Následně v dalším aspektu přítomný vynález poskytuje vakcínovou kompozici, jak je popsáno výše, který navíc obsahuje přídatný prostředek, jako je cholerový toxin. Takovéto farmaceuticky přijatelné formy cholerového toxinu jsou v oboru známé, např. jak je popsáno v Rappuoli a kol., Int. Arch. Allergy & Immunol., 108 (4), 327 až 333 (1995); a Dickinson a kol., Infection and Immunity, 63(5), 1617 až 1623 (1995).
Vakcínová kompozice podle přítomného vynálezu může být použita jak pro terapeutické, tak pro profylaktické • · • · účely. Následně přítomný vynález zahrnuje vakcínovou kompozici podle popisu výše, pro použití jako terapeutická nebo profylaktická vakcína pro savce, včetně člověka, který je infikován Helicobacterem pylori. V tomto kontextu znamená výraz „profylaktický účel indukci imunitní odpovědi, která povede k ochraně proti budoucí infekci Helicobacterem pylori, zatímco výraz „terapeutický účel znamená indukci imunitní odpovědi, která může eradikovat existující infekce Helicobacterem pylori.
Vakcínová kompozice podle přítomného vynálezu je s výhodou podávána na jakoukoliv savčí sliznici, například na bukální, nosní, tonsilární, žaludeční, střevní (tenké a tlusté střevo), rektální a vaginální sliznici. Slizniční vakcíny mohou být podány společně s přídatnými přípravky, které jsou pro tento účel vhodný. Vakcína může být také podána perorálně nebo parenterálně subkutánní, intrakutánní nebo intramuskulární cestou, popřípadě společně s vhodným přídatným přípravkem. Vakcínová kompozice může být popřípadě podána společně s antimikrobními terapeutickými přípravky.
V dalším aspektu poskytuje přítomný vynález použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, pro výrobu (i) prostředku pro léčbu, profylaxi nebo diagnostiku infekce Helicobacterem pylori;
(ii) vakcíny pro použití pro navození obranné imunitní odpovědi proti infekci Helicobacterem pylori; a (iii) diagnostického kitu pro diagnózu infekce Helicobacterem pylori.
Dále v dalším aspektu poskytuje přítomný vynález in vitro způsob diagnózy infekce Helicobacterem pylori • · • · ··· · · · · · · · · * • · · · ··· · · · • ·· · · · · · ··· ·· ··· · · · · zahrnující alespoň jeden krok, ve kterém je použit FlgE polypeptid Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, popřípadě označený nebo koplovaný na pevnou podporu. Zmíněný způsob může například zahrnovat kroky (a) kontaktování zmíněného FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, popřípadě navázaného na pevnou podporu, s tělesnou tekutinou odebranou savci; a (b) detekci protilátek ve zmíněné tělesné tekutině, které se navážou na zmíněný FlgE polypeptid. Výhodné způsoby detekce protilátek jsou ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assay) metody, které jsou v oboru dobře známé.
V dalším aspektu poskytuje přítomný vynález diagnostický kit pro detekci infekce Helicobacterem pylori u savce, včetně člověka, který obsahuje složky, které umožní provedení způsobu diagnózy in vitro, jak je popsáno výše. Zmíněný diagnostický kit může například obsahovat:
(a) FlgE polypeptid Helicobactera pylori; a (b) činidla pro detekci protilátek, které se vážou na zmíněný FlgE polypeptid.
Zmíněná činidla pro detekci protilátek mohou být například enzymem značené antiimunoglobuliny a chromogenní substrát zmíněného enzymu.
Dále, z dalšího aspektu, poskytuje přítomný vynález způsob spuštění obranné imunitní odpovědi proti infekci Helicobacterem pylori u savce, včetně člověka, a zmíněný způsob zahrnuje krok podání zmíněnému savci imunologicky účinné množství FlgE polypeptidu Helicobactera pylori, jak je popsáno výše, nebo alternativně podání zmíněnému savci imunologicky účinné množství vakcínové kompozice, jak je popsáno výše.
• · · · · · · · ··· · ···· · ·· * ··· · ··· ·« · • · · · ···· ··· · · · · · · · ··
Experimentální postupy
V tomto popisu mají být výrazy „standardní protokoly a „standardní postupy, pokud jsou použity v kontextu s metodami molekulárního klonování, pochopeny jako protokoly a postupy uvedené v běžné laboratorní příručce, jako je: Current Protocols in Molecular Biology, vyd. F Ausubel a kol., John Wiley and Sons Inc. (1994), J. Fritsch, E. F. a T. Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor Laboratorary Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Příprava rekombinantního FlgE polypeptidu Helicobactera pylori
Informace o DNA sekvenci
Sekvenční informace pro gen kódující FlgE polypeptid se získá od Národního centra pro biotechnologické informace (přírůstkové číslo U09549; SEQ ID NO: 1) .
PCR amplifikace a klonování DNA sekvencí obsahujících ORFy pro membránové a secernované proteiny z J99 kmene Helicobactera pylori
Sekvence se klonují z J99 kmene Helicobactera pylori způsobem amplifikačního klonování, za použití polymerázové řetězové reakce (PCR). Navrhnou a zakoupí se syntetické oligonukleotidové primery (viz níže) specifické pro 5'- a 3'-konce otevřených čtecích rámců genů (GibcoBRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Navrhnou se přímé primery (specifické pro 5'-konec sekvence) pro FlgE tak, aby obsahovaly Ncol klonovací místo na úplném 5'-zakončení, zatímco reverzní primery zahrnují EcoRI místo na úplném 5'• · • · ··· · • · • · · · konci, aby mohlo proběhnout klonování každé sekvence H. pylori do čtecího rámce pET28b vektoru. Inserty klonované do NcoI-EcoRI míst pET-28b vektoru fúzují s vektorem DNA sekvence, která kóduje přídatnou 20 karboxyteminální aminoskupinu obsahující šest histidinových zbytků (na úplném C-konci).
Přímý primer (SEQ ID NO:3):
5'-TAT ACC ATG GTG CTT AGG TCT TTA T-3'
Reversní primer (SEQ ID NO:4):
5'-GCG AAT TCA ATT GCT TAA GAT TCA A-3'
Genomová DNA připravená z J99 kmene Helicobactera pylori se použije jako zdroj templátové DNA pro PCR amplifikační reakce (Current Protocols in Molecular Biology, vyd. F. Ausubel a kol., John Wiley and Sons, lne. (1994)). Pro amplifikaci DNA sekvence, která obsahuje ORF H. pylori, se vloží 50 ng genomové DNA do reakční nádoby obsahující 2 mM MgCl2, 1 μΜ syntetickúch oligonukleotidových primerů (přímé a reverzní primery) komplementárních s a doprovázejících definovaný ORF Helicobactera pylori,
0,2 mM každého deoxynukleotidového trifosfátu, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, a 2,5 jednotek termostabilní DNA polymerázy (Amplitaq, Roche Molecular Systems, lne., Branchburg, NJ, USA) v celkovém objemu 100 μΐ. Použijí se následující podmínky termálního cyklování pro získání amplifikovaných DNA produktů rpo každý ORF, za použití termálního cyklovače Perkin Elmer Cetus/ GeneAmp PCR systém 9600:
Denaturace při teplotě +94 °C po dobu 2 minut;
cykly při teplotě +94 °C po dobu 15 sekund, při teplotě +30 °C po dobu 15 sekund a při teplotě +72 °C po dobu 1,5 minuty;
cyklů při teplotě +94 °C po dobu 15 sekund, při teplotě
0*0 0 • 00 «0 0 00 0 ·· ’ · « · · · » · * • ···» · « » * ·« « 0*0 ♦ » • 0 · · * · · « e ··· *· ·· +58 °C po dobu 15 sekund a při teplotě +72 °C po dobu 1,5 minuty;
reakce se dokončí při teplotě +72 °C po dobu 6 minut.
Při dokončení termálních cyklovacích reakcí se každý vzorek amplifikované DNA promyje a čistí se za použití Qiaquick Spin PCR purifikačního kitu (Qiagen, Gaithersburg,
MD, USA). Amplifikované vzorky DNA se podrobí štěpení restrikčními endonukleázami NdeI a EcoRI standardními způsoby. Vzorky DNA se poté podrobí elektroforéze na 1,0% NuSieve (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) agarózových gelech. DNA se vizualizuje vystavením ethidium-bromidu a ozáření UV paprsky s velkou vlnovou délkou. DNA obsažená v řezech oddělených z agarózového gelu se čistí za použití protokolu Bio 101 GeneClean Kit (Bio 101 Vista, CA, USA) .
Klonování DNA sekvencí H. pylori do pET-28b prokaryotického expresního vektoru pET-28b vektor se ke klonování připraví štěpením prostřednictvím Ncol a EcoRI známými postupy. Po štěpení se DNA inzerty klonují známými způsoby do předem naštěpeného pET-28b expresního vektoru. Produkty ligační reakce se potom použijí k transformaci BL21 kmene E. coli způsobem popsaným níže.
Transformace kompetentní bakterie rekombinantními plasmidy
Kompetentní bakterie, E. coli kmene BL21 nebo E. coli kmene BL21(DE3), se běžnými způsoby transformují rekombinantními pET expresními plasmidy nesoucími nakloňované sekvence H. pylori. Stručně, 1 μΐ ligační reakční směsi se smíchá s 50 μΐ elektrokompetentních buněk a vystaví se pulzu o vysokém napětí, po kterém se vzorky t ··«· ·· ···« • · · ♦·· · · ♦ · inkubují v 0,45 ml SOC media (0,5 % kvasnicového extraktu, 2,0 % tryptonu, 10 mM NaCl, 2,5 mM KOI, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 a 20 mM glukózy) při teplotě +37 °C při třepání po dobu 1 hodiny. Vzorky se potom rozetřou na plotny z LB agaru obsahující 25 pg/ml kanamycinsulfatu, a nechají růst přes noc. Transformované kolonie BL21 se odeberou a analyzují se za účelem stanovení nakloňovaných inzertů, způsobem popsaným níže.
Identifikace rekombinantních pET expresních plazmidů, které nesou sekvence H. pylori
Jednotlivé BL21 klony transformované rekombinantními pET-28b H. pylori geny se analyzují PCR amplifikací klonovaných inzertů, za použití stejných přímých a reverzních primerů, které jsou specifické pro každou ze sekvencí H. pylori, a které se používají v původních PCR amplifikačních klonovacích reakcích. Úspěšná amplifikace se potvrdí integrací sekvencí H. pylori do expresního vektoru podle standardních postupů.
Izolace a příprava DNA plazmidu z BL21 transformantů
Vezmou se jednotlivé klony rekombinantních pET-28b vektorů nesoucí správně nakloňované ORFy H. pylori a inkubují se přes noc v 5 ml LB bujónu s 25 pg/ml kanamycinsulfatu. Následující den se izoluje DNA plazmid a čistí se za použití Qiagen plasmid purifikačního protokolu (Qiagen lne., Chatsworth, CA, USA).
Exprese rekombinantních sekvencí H. pylori u E. coli pET vektor může být vložen do jakéhokoliv K-12 kmene
E. coli, například HMS174, HB101, JM109, DH5oí atd., za • * • · · • · « · • · • · · i · účelem klonování nebo přípravy plasmidu. Hostitelé exprese zahrnují kmeny E. coli, které obsahují chromozomální kopii genu pro T7 RNA polymerázu. Tito hostitelé jsou lyzogeny bakteriofágu DE3, lambda derivátu, který nese láci gen, lacUV5 promotor a gen pro T7 RNA polymerázu. T7 RNA polymeráza se aktivuje přidáním izopropyl-p-D-thiogalaktosidu (IPTG) a T7 RNA polymeráza transkribuje jakýkoliv cílový plasmid, například pET-28b, který nese sledovaný gen. Kmeny používané v naší laboratoři zahrnují: BL21(DE3) (F. W. Studier, A. H. Rosenberg, J. J. Dunn a J. W. Dubendorff, Methods Enzymol., 185, 60 až 89 (1990)).
Pro expresi rekombinantních sekvencí H. pylori se použije 50 ng DNA plasmidu izolovaného tak, jak je popsáno výše, pro transformaci kompetentních BL21(DE3) bakterií, jak je popsáno výše (poskytnuty firmou Novagen jako součást pET expresního systémového kitu). Transformované buňky se kultivují na SOC mediu po dobu 1 hodiny a kultura se potom naočkuje na LB plotny obsahující 25 pg/ml kanamycinsulfatu. Následující den se kolonie bakterií spojí a pěstují se na LB mediu obsahujícím 25 pg/ml kanamycinsulfatu, až do dosažení optické hustoty (O.D.) 600 nm od 0,5 do 1,0 O.D. jednotek, kdy se po dobu 3 hodin ke kultuře přidává 1 mM IPTG, za účelem indukce genové exprese rekombinantních DNA konstruktů H. pylori.
Po indukci genové exprese prostřednictvím IPTG se bakterie peletují odstředěním v centrifuze Sorvall RC-3B při 3500 x g po dobu 15 minut při teplotě +4 °C. Pelety se resuspendují v 50 ml studeného lOmM Tris-HCl, pH 8,0, 0,lM NaCl a 0,1 mM EDTA (STE pufr). Buňky se potom odstřeďují při 2000 x g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Stanoví se hmotnost vlhkých pelet a ty se zmrazí se na teplotu -80 °C, aD jsou připraveny na proteinové čištění.
• · · · • · ♦ · • « • ·
Analytické metody
Koncentrace čištěných proteinových přípravků se kvantifikuje spektrofotometricky za použití koeficientů absorbance, které se vypočítají z obsahu aminokyselin (S.
J. Perkins, Eur. J. Biochem., 157, 169 až 180 (1986)) . Koncentrace proteinů se také určí metodou popsanou v Μ. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 až 254 (1976) a O. H. Lowry, N. Rosenbrough, A. L. Farr a R. J. Randall (1951), která jako standard používá bovinní sérový albumin.
Natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidové gely (SDSPAGE) (12% nebo 4% až 25% gradient akrylamidu) se zakoupí od firmy BioRad (Hercules, CA, USA) a obarví se Coomassie briliantovou modří. Markéry molekulární hmoty zahrnují králičí myosin příčně pruhovaného svalu (200 kDa), βgalaktosidázu E. coli (116 kDa), fosforylázu B králičího svalu (97,4 kDa), albumin bovinního séra (66,2 kDa), ovalbumin (45 kDa), bovinní karboanhydrázu (31 kDa), sójový inhibitor trypsinu (21,5 kDa), lysozym vaječného bílku (14,4 kDa) a bovinní aprotinin (6,5 kDa).
Čištění FlgE z inkluzních tělísek
Následující kroky se provedou při teplotě +4°C. Buněčné pelety se resuspendují v lytickém pufru obsahujícím 10 % glycerolu, 200 pg/ml lysozymu, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu. Po pasáži skrze buněčný dezintegrátor se s 0,2% DOC připraví výsledný homogenát, míchá se po dobu 10 minut, poté se odstředí (10 000 g, x 30 minut). Pelety se nejprve promyjí lytickým pufrem obsahujícím 10 % glycerolu, 10 mM EDTA, 1 % Tritonu X-100, mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu, potom lytickým pufrem • · · · obsahujícím 1 M močoviny, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu. Výsledná bílá peleta se skládá primárně z inkluzních tělísek, která neobsahují nerozrušené buňky a membránový materiál.
Následující kroky se provedou při teplotě místnosti. Inkluzní tělíska se rozpustí ve 20 ml 8 M močoviny v lytickém pufru obsahujícím 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu, a inkubují se při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Materiál, který se nerozpustil, se odstraní odstředěním (100 000 x g po dobu 30 minut). Čirý supernatant se přefiltruje a naplní do Ni2+-NTA agarózového sloupce ekvilibrovaného v 8 M močoviny v lytickém pufru. Sloupec se promyje 250 ml (50 objemů vrstvy) lytického pufru obsahujícího 8 M močoviny, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoethanolu, a potom se vyvolá po sobě jdoucími kroky lytického pufru obsahujícího 8 M močoviny, 1 mM PMSF, 0,1 % β-merkaptoethanolu a 20, 100, 200 a 500 mM imidazolu.
Frakce se monitorují podle absorbance při OD280 nm a frakce píku se analyzují prostřednictvím SDS-PAGE. Coomassie briliantovou modří se vizualizují dva proužky, hlavní proužek o Mr = 78 kDa a vedlejší proužek o Mr = 60 kDa. Stanoví se, že čistota rekombinantního FlgE (78 kDa) je vyšší než 90 %. Protože se jedná o čištění rozpustných proteinů, eluují se frakce obsahující rekombinantní protein při koncentraci imidazolu 100 mM.
Močovina se pomalu oddělí od FlgE polypeptidů dialýzou proti TBS, který obsahuje 0,5% DOC při postupném snižováním koncentrace močoviny následujícím způsobem: 6 M, 4 M, 3 M, 2 Μ, 1 M, 0,5 M a potom 0 M. Každý dialyzační krok se provádí minimálně po dobu 4 hodin při teplotě místnosti.
• · • « «· · · » · · • · « · : :
• · · · · ·
Po dialýze se vzorky zkoncentrují tlakovou filtrací za použití Amicon míchaných buněk. Koncentrace proteinů se potom měří metodami podle Perkinse, Bradforda a Lowryho.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Terapeutická imunizace
1. Materiály a metody
1.1 Zvířata
Samice myši kmene SPF BALB/c se získají od Bomholt Breeding centre (Dánsko). Chovají se v běžných makrolonových klecích s volnou dodávkou vody a potravy. Zvířata jsou při dodání 4 až 6 týdnů stará.
1.2. Infekce
Po nejméně 1 týdnu aklimatizace se zvířata infikují typem 2 kmene H. pylori (kmen 244, původně izolovaný od pacienta s vředovou chorobou). Již dříve se prokázalo, že tento kmen je dobrým kolonizátorem myšího žaludku. Bakterie ze zásobníku udržovaného při teplotě -70 °C se nechají přes noc růst v brucelovém bujónu obohaceném 10% fetálním telecím sérem při teplotě +37 °C v mikroaerofilní atmosféře (10 % CO2, 5 % O2). Zvířatům se podá perorální dávka 400 pmol/kg omeprazolu a po 3 až 5 hodinách se perorálně očkuje H. pylori (přibližně 107 až 108 CFU/zvíře). Infekce se zkontroluje na kontrolních zvířatech za 2 až 3 týdny po očkování.
• · · ·
1.3 Imunizace
Jeden měsíc po infekci se dvě skupiny myší (10 myší ve skupině) čtyřikrát imunizují v průběhu časového úseku 34 dnů (ve dni 1, 15, 25 a 35). Podá se čištěný rekombinantní FIgE rozpuštěný v PBS s 0,5% deoxycholatem (DOC) v dávce 100 pg/myš.
Jako přídatný přípravek se zvířatům jak v kontrolní skupině, tak ve skupině, které se aplikuje FIgE, podá s každou imunizací také 10 pg/myš cholerového toxinu (CT). Všem zvířatům se 3 až 5 hodin před imunizací perorálně podá omeprazol v dávce 400 pmol/kg, jako způsob ochrany antigenů před degradací kyselinou. Zvířata se usmrtí 1 až 2 týdny po finální imunizaci.
Skupina 1: 300 pl PBS s 0,5% DOC obsahujícím 10 pg CT; Skupina 2: 300 pl PBS s 0,5% DOC obsahujícím 100 pg FIgE a pg CT.
1.4 Analýza infekce
Myši se usmrtí CO2 a cervikální distorzí. Otevře se břišní a hrudní dutina a punkcí srdce se odebere vzorek krve. Následně se vyjme žaludek. Žaludek se rozřízne podél velké kurvatury, potom se propláchne fyziologickým roztokem a postupně se rozdělí na dva shodné kusy. Chirurgickým skalpelem se seškrábne separátně z antra a z těla vzorek sliznice o ploše 25 mm2. Seškrábnutá sliznice se suspenduje v brucelovém bujónu, zředí se a naočkuje na Blood Skirrow plotny. Plotny se inkubují za mikroaerofilních podmínek po dobu 3 až 5 dnů a spočítá se počet kolonií. Totožnost H. pylori se ověří ureázovým a katalázovým testem a přímou mikroskopií nebo barvením podle Grama.
1.5 Měření protilátek
Z krve se odeberou sérové protilátky. Před odstředěním se krev zředí stejným množstvím PBS. Sérum se až do okamžiku analýzy udržuje při teplotě -20 °C. Metodou ELISA se změří sérové protilátky, tam, kde jsou plotny povlečeny buď konkrétní frakcí H. pylori kmene 244 nebo FlgE, což je následováno přidáním různých ředění séra.
ELISA se provede anti-myšími Ig protilátkami značenými alkalickou fosfatázou. Anti-Ig protilátky jsou typu antitěžký/anti-lehký řetězec, což by mělo zaručit detekci všech typů protilátek.
2. Výsledky
2.1 Terapeutická imunizace: účinek na CFU
Zvířata v této studii se infikují H. pylori - kmen 244 jeden měsíc před provedením imunizací. Myši ve skupinách po deseti se potom imunizují buď cholerovým toxinem (CT) nebo CT společně s rekombinantním FlgE polypeptidem. Čtyři týdny po poslední imunizaci se zvířata usmrtí a stanoví se CFU (obrázek 1). Zvířata léčená samotným CT jsou vysoce infikována, jak v těle tak v antru. Zvířata aktivně imunizovaná rekombinantním FlgE polypeptidem a CT mají signifikantně snížené hodnoty CFU v antru a v žaludku celkově při porovnání se zvířaty léčenými pouze CT (p <0,01 a p <0,05; řadící test podle znaku Wilcoxon-Mann-Whittneyova).
• · · · • ·
2.2 Terapeutická imunizace: účinky na tvorbu protilátek a • * · · · · • · · « • ···· · ♦· f • · · · · · « · • * · · · · · • · · a · · * * na sekreci
Jako známka infekce H. pylori mohou být v séru nalezeny specifické protilátky (kontrola/244). U zvířat, kterým se podá FlgE + CT, vzrostl titr proti kmeni 244 (jeho membránovým proteinům) čtyřikrát (p < 0,01) . Titr specifického sérového IgG proti FlgE lze změřit pouze u zvířat, kterým byl podán FlgE a CT (obrázek 2). Specifický IgG proti FlgE vzrůstá pouze u zvířat, kterým byl podán FlgE a CT, ale je nelze ho detekovat u kontrolních zvířat.
Prezentované výsledky ukazují, že rekombinantní FlgE polypeptid H. pylori je vysoce imunigenní pokud je podán perorálně, společně s cholerovým toxinem jako přídatným přípravkem, stanoveno jako růst systémových specifických Ig protilátek proti FlgE. Imunizace FlgE také vede k signifikantnímu růstu Ig titrů proti konkrétní frakci H. pylori. Dále se po imunizaci FlgE společně s cholerovým toxinem pozoruje dramatický pokles počtu kolonizujících bakterií H. pylori ve sliznici žaludku infikovaných myší.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (1) Žadatel
Jméno: Astra AB
Ulice: Vástra Málarehamnen 9
Město: Sódertálje
Stát: Švédsko
Směrovací číslo: S-151 85
Telefon: +46 8 553 260 00
Telefax: +46 8 553 288 20 (ii) Název vynálezu: Vakcínové kompozice V (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Počítačové formy:
(A) Medium: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1,0, verze # 1,30 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:1:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) délka: 2550 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitost: dvojitá (D) topologie: lineární (EPO (ii) Typ molekuly: cDNA « « • · · · (vi) Původní zdroj:
(A) organismus: Helicobacter pylori (ix) Znak:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokus: 321..2477 (D) další informace: /produkt = „FlgE bičíkový háčkový protein (x) Informace o publikaci (A) autoři: Paul W. 0'Toole, Magdalena Kostrzynska, Trevor J. Trust (B) název: Nepohyblivé mutanty Helicobactera pylori a produkce Helicobakterů mustelae defektních v bičíkovém háčku (C) časopis: Mol. Microbiology (D) vydání: 14 (E) číslo: 4 (F) stránky: 691 až 703 (G) datum: 1994 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:
AACAAAGCGA | TAACTCCTTT GTCTTATTAG CGACACAATT TAACCCATTG ACTTTAAATC | SO |
GCGCTTCAGC | CGAAGAGATT CAAGATCATG AATGCGCGAT TTTGCACTAA AGCGAGTTAG | 120 |
ATTCTTAAAT | TTGAGCGATA ACCTTTAAAA AGCGTAATTA AGGGGTGGTG TTACAAAACC | ISO |
« · · · • ·
CCCTATCCCC TTATGAATTT GACCGATCTT TTTGATTAAC AAAACTTTAA AATCCGCAAT 240
CAATCATTCT AAAAAGCTAT TTAGGAACAA CTTTTGCTTT ATTTTGCATA GATTGAATTT 300
CTTTAAATTA AAGGATAACC ATG CTT AGG TCT TTA TGG TCT GGT GTC AAT 350
Met Leu Arg Ser Leu Trt Ser Gly Val Asn
1 | 5 | 10 | ||||||||||
GGG ATG | CAA | Lsk-s- | CAC | CAA ATC | GCT | TTG | GAT | ATT | GAG | AGT AAC | AAT ATT | 398 |
Gly Met | Gin | Ala | His | Gin Ile | Ala | Leu | Asn | Ile | Glu | Ser Asn | Asn Ile | |
15 | 20 | 25 | ||||||||||
GCG AAC | GTG | AAT | ACC | ACT GGT | TTT | AAG | TAT | TCT | AGG | GCT TCT | TTT GTG | 445 |
Ala Asn | Val | Asn | Thr | Thr Gly | Phe | Lvs | Tyr | Ser | Arg | Ala Ser | Phe Val | |
30 | 35 | 40 | * | |||||||||
GAT ATG | TCT | CAA | GTC AAA | CTC | ATC | GCT | ACC | GCA | CCC TAT | AAA AAC | 494 | |
Asp Met | Leu | Ser | Gin | Val Lys | Leu | Ile | Ala | Thr | Ala | ?xo Tyr | Lys Asn | |
45 | 50 | *55 | ||||||||||
GGG TTA | GCA | GGG | CAG | AAT GAT | TTT | TCT | GTG | GGG | qfppr | GGG GTA | GGC GTG | 542 |
Gly Leu | Ala | Gly | Gin | Asn Asn | Phe | Ser | Val | Gly | Leu | Gly Val | Gly Val | |
SO | 55 | 70 | ||||||||||
GAT GCG | ACG | ACT | AAA | TCA | CAA | GGC | AAT | ATC | CAA AAC | ACA GAT | 590 | |
Asn Ala | Thr | Thr | Lys | Ile Phe | Ser | Gin | Gly | Asn | XXe | Gin Asn | Thr Asp | |
7Š | 30 | 35 | 90 | |||||||||
GTC AAA | ACC | GAT | CTA | GCG ATT | CAA | GGC | GAT | GGC | TTT | ATT AAC | S38 | |
Val Lys | Thr | Asp | Leu | Ala Ile | Gin | Gly | Asn | Gly | Phe | Phe Ile | Ile Asn | |
95 | 100 | 105 | ||||||||||
CCT GAT | AGG | GGG | ATC | ACG CGC | AAT | ACT | AGA | GAT | GGG GAG | 586 | ||
Pro Asn | Arg | Gly | Ile | Thr Arg | Asn | Phe | Thr | Arg | Asp | Gly Glu | Phe Leu | |
110 | 115 | 120 | ||||||||||
TTT GAC | TCG | CAA | GGG | AGT TTG | GTT | ACC | ACC | GGC | Λ*»·»*“· | CTT GTG | GTG CAA | 734 |
Phe Asp | Ser | Gin | Gly | Ser Leu | Val | Thr | Thr | Gly | Gly | Leu Val | Val Gin | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||
GGG TGG | GTG | AGA | AAT | GGG AGC | GAT | ACC | GGC | AAT | AAA | GGG AGC | GAT ACA | 7S2 |
Gly Tm | Val | Arg | Asn | Gly Ser | Asp | Thr | Gly | Asn | Lys | Gly Ser | Asp Thr | |
140 | 145 | 150 | ||||||||||
GAC GCT | TTA | AAA | GTG | GAT AAC | ACC | GGT | CCT | TTA | GAA | AAC ATT | AGG ATT | 330 |
Asp Ala | Leu | Lys | Val | Asn Asn | Thr | Gly | Pro | Leu | Glu | Asn Ile | Arg Ile | |
155 | ISO | 165 | 170 | |||||||||
GAT CCT | GGA | ATG | GTG | ATG CCA | GCC | AGA | GCG | AGT | AAC | CGC ATT | TCT ATG | 373 |
Asp Pro | Gly | Met | Val | Met Pro | Ala | Arg | Ala | Ser | Asn | Arg Ile | Ser Met |
175 180 185
AGG GCG AAT TTA AAC GCT GGA AGG CAT GCC GAT CAA ACA GCG GCG ATA 925
Arg Ala Asn Leu Asn Ala Gly Arg His Ala Asp Gin Thr Ala Ala Xle
190 195 200
TTC GCT TTG GAT TCT TCA GCC AAA ACC CCT TCA GAT GGC ATT AAT CCG 974
Phe Ala Leu Asp Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Asp Gly Ile Asn Pro
205 210 215
GTG TAT GAT TCA GGC ACG AAT CTT GCT CAA GTC GCC GAA GAC ATG GGA 1022
Val Tyr Asn Ser Gly Thr Asn Leu Ala Gin Val Ala Glu Asp Met Gly
220 225 230
TCT TTA TAC AAT GAA GAT GGC GAC GCT CTT TTG TTG AAT GAA AAT CAA 1070 • ···· ·· ···· · · * * «·· ·«· * · · · • ·· · · ···· · ·· · • · · · · ·*··«· • ··« ···«« ·«·«·· ·· · · · · » *
Ser 225 | Leu | Tyr | Asn | Glu | Asn 240 | Gly | Asn | Ala | Leu | Leu 245 | Leu | Asn | Glu | Asn | Gin 250. | |
GGG | ATT | TGG | GTG | AGC | TAT | AAG | AGT | CCA | AAA | ATG | GTC | AAA | GAC | ATC | CTC | 1113 |
Gly | Ile | Trp | Val | Ser 255 | Tyr | Lys | Ser | Pro | Lvs 260 | Met | Val | Lys | Asp | Ile 265 | Leu | |
mmm | TCT | GCA | GAA | AAC | AGC | ACG | CTT | GAA | TTG | AAT | GGC | GTT | AAG | ATT | TCT | 1166 |
Pro | Ser | Ala | Glu 270 | Asn | Ser | Thr | Leu | Glu 275 | Leu | Asn | Gly | Val | Lys 280 | Ile | Ser | |
mmr· | ACA | AAC | GAT | TCA | GCG | GTG | AGC | CGG | ACT | TCA | AGC | TTA | GTG | GCG | GCT | 1214 |
Pixs | Thr | Asn 285 | Asp | Ser | Ala | Val | Ser 290 | Arg | Thr | Ser | Ser | Leu 295 | Val | Ala | Ala | |
AAA | AAT | GCG | ATC | AAT | GCA | GTC | AAA | AGC | CAA | ACA | GGC | ATT | GAA | GCT | TAT | 1262 |
Lys | Asn 300 | Ala | Ile | Asn | Ala | Val 305 | Lys | Ser | Gin | Thr | Gly 310 | Ile | Glu | Ala | Tyr | |
mm·* | GAC | GGC | AAG | CAA | TTG | CGT | TTG | GAA | AAC | ACC | AAT | GAA | TTA | GAC | GGC | 1310 |
Leu 315 | Asp | Gly | Lys | Gin | Leu 320 | Arg | Leu | Glu | Asn | Thr 325 | Asn | Glu | Leu | Asp | Glv 330 | |
GAT | GAA | AAG | QfTwn | AAA | AAC | ATT | GTA | GTT | ACT | CAA | GCC | GGA | ACC | GGA | GCG | 13 5 8 |
Asp | Glu | Lys | Leu | Lys 335 | Asn | Ile | Val | Val | Thr 340 | Gin | Ala | Gly | Thr | Giv 345 | Ala | |
mwn | GCT | AAC | TTT | TTA | GAC | GGC | GAT | AAA | GAT | GTA | ACG | GCT | TTC | AAA | TAC | 1406 |
Phe | Ala | Asn | Phe 350 | Leu | Asp | Gly | Asp | Lys 355 | Asn | Val | Thr | Ala | Phe 360 | Lys | Tyr | |
AGC | TAC | ACG | CAT | TCT | ATT | AGC | CCT | AAC | GCC | AAT | AGC | GGG | CAG | TTT | AGG | 1454 |
Ser | Tyr | Thr 365 | His | Ser | Ile | Ser | Pro 370 | Asn | Ala | Asn | Ser | Gly 375 | Gin | Phe | Arg | |
ACC | ACT | GAA | GAC | TTG | CGC | GCC | TTA | ATC | CAG | CAT | GAC | GCT | AAT | ATC | GTT | 1502 |
Thr | Thr 380 | Glu | Asp | Leu | Arg | Ala 385 | Leu | Ile | Gin | His | Asp 390 | Ala | Asn | Ile | Val | |
AAA | GAT | CCT | AGC | CTA | GCG | GAC | AAT | TAC | CAA | GAC | TCA | GCT | TCT | ATA | 1550 | |
Lvs 395 | Asp | Pro | Ser | Leu | Ala 400 | Asp | Asn | Tyr | Gin | Asn 405 | Ser | Ala | Ala | Ser | Ile 410 | |
GGA | GTT | ACA | ATC | AAC | CAA | TAC | GGC | ATG | TTT | GAA | ATC | AAC | AAT | AAA | GAC | 1598 |
Gly | Val | Thr | Ile | Asn 415 | Gin | Tyr | Gly | Met | Phe 420 | Glu | Ile | Asn | Asn | Lys 425 | Asp | |
AAT | AAA | AAT | GTC | ATT | AAA | GAA | AAT | CTT | AAT | ATC | TTT | GTG | AGC | GGG | TAT | 1646 |
Asn | Lys | Asn | Val | Ile | Lys | Glu | Asn | Leu | Asn | Ile | Phe | Val | Ser | Gly | TV-7 |
430 435 440
řpr^m | TCA | GAC | AGC GTA | ACG | AAC | AAT | gipíp | TTG | TTT | AAA | AAT | GCG | ATG | AAA | 1594 |
Ser | Ser | Asp | Ser Val | Tiur | Asn | Asn | Val | Leu | Phe | Lys | Asn | Ala | Met | Lys | |
445 | 450 | 455 | |||||||||||||
GGG | CTT | AAT | ACC GCT | ijirwm | TTA | ATT | GAA | Guu | -G | TCA | G77 | AGC | AGT | 1742 | |
Gly | Leu | Asn | Thr Ala | Se.- | Leu | Ile | Glu | C-iy | Gly | ..a | Ser | T. | Ser | Ser | |
460 | 465 | 470 | |||||||||||||
mmm | AAA | TTC | ACC CAC | GCT | ACG | CAT | GCG | ACA | AGC | ATT | GAT | GTG | ATA | GAC | 1790 |
Ser | Lys | Phe | Thr His | Ala | Thr | His | Ala | Thr | Ser | Zle | Asn | Val | Ile | Asp | |
475 | 480 | 485 | 490 | ||||||||||||
AGC | TTA | GGC | ACT AAA | CAC | GCC | ATG | CGC | ^mir» | GAG | TTT | TAT | AGG | AGT | GGG | 1838 |
Ser | Leu | Gly | Thr Lys | His | Ala | Met | Azrg | Zle | Glu | Phe | Tyr | Arg | Ser | Gly |
495 500 505 • 4*4
4* ·
4 • · • · 4 ·
GGA | GCG GAT | TGG | AGA | GTG | ATC | GTG | CCT | GAG | CCT GGG | GAA TTA | 1385 | |
Gly | Ala As? | Tm | Asn Phe | Arg | Val | Ile | Val | Pro | Glu | Pro Gly | Glu Leu | |
510 | 515 | 520 | ||||||||||
GTA | GGG GGG | TCA | GCG GCT | AGG | CCT | AAT | GTG | TTT | GAA | GGA GGC | CGT TTG | 1934 |
Val | Gly Glv | Ser | Ala Ala | Arg | Pro | Asn | Val | Phe | Glu | Glv Gly | Arg Leu | |
525 | 530 | 535 | ||||||||||
CAC | TTC AAT | AAT | GAC GGA | TCG | CTT | GCA | GGC | ATG | AAC | CCG CCT | 1982 | |
His | Phe Asn | Asn | As? Gly | Ser | Leu | Ala | Gly | Met | Asn | Pro Pro | Leu Leu | |
540 | 545 | 550 | ||||||||||
CAA | TTT GAC | CCT | AAA AAT | GGT | GCT | GAT | GCC | CCC | CAA | CGC ATC | AAT TTA | - 2030 |
Gin. | Phe As? | Pro | Lys Asn | Gly | Ala | Asp | Ala | Pro | Gin | Arg Ile | Asn Leu | |
555 | 560 | 565 | 370 | |||||||||
GCT | TTT GGT | TCC | TCA GGG | AGT | TTT | GAC | GGG | CTA | ACG | AGC GTG | GAT AAG | 2073 |
Ala | Phe Gly | Ser | Ser Gly | Ser | Phe | As? | Gly | Leu | Thr | Ser Val | Asn Lys | |
575 | 580 | 585 | ||||||||||
TCT GAA | ACT | TAT GCG | ATT | GAG | CAA | AAC | GGC | /nu m | CAA GCG | GGC GAT | 2126 | |
Ile | Ser Glu | Thr | Tyr Ala | Ile | Glu | Gin | Asn | Gly | Tyr | Gin Ala | Gly As? | |
590 | 595 | 600 | ||||||||||
TTG | ATG GAT | GTC | CGC TTT | GAT | TCA | GAT | GGG | GTG | TTA GGA | GCG TTC | 2174 | |
Leu | Met Asn | Val | Arg Phe | Asp | Ser | As? | Gly | Val | Leu | Leu Gly | Ala Phe | |
605 | 510 | 615 | ||||||||||
AGT | AAT GGC | AGG | ACT TTA | GCG | CTC | GCT | CAA | GTG | GCT | TTA GCG | AAT TTC | 2222 |
Ser | Asn Gly | Arg | Thr Leu | Ala | Leu | Ala | Gin | Val | Ala | Leu Ala | Asn Phe | |
620 | 625 | 530 | ||||||||||
GCT | AAC GAT | GCG | GGC TTG | CAG | GCT | TTA | GGC | GGG | AAT | GTC TTT | TCT CAA | 2270 |
Ala | Asn As? | Ala | Gly Leu | Gin | Ala | Leu | Gly | Gly | Asn | Val Phe | Ser Gin | |
635 | 640 | 545 | 650 | — | ||||||||
ACC | GGA AAC | TCA | GGG CAA | GCC | TTA | ATC | GGT | GCT | AAT ACG | GGG CGT | 2318 | |
Thr | Gly Asn | Ser | Gly Gin | Ala | Leu | Ile | Gly | AlaAla | Asn Thr | Gly Arg | ||
655 | 660 | 665 | ||||||||||
AGG | GGT TCA | ATT | TCA GGA | TCT | AAA | CTG | GAG | TCT | AGT | AAT GTG | GAT TTG | 2366 |
Arg | Gly Ser | Ile | Ser Gly | Ser | Lys | Leu | Glu | Ser | Ser | Asn Val | As? Leu | |
670 | 675 | 680 | ||||||||||
AGC | CGG AGT | TTA | ACG AAT | TTG | ATT | GTG | GTT | CAA | AGG | GGC TTT | CAA GCA | 2414 |
Ser | Arg Ser | Leu | Thr Asn | Leu | Ile | Val | Val | Gin | Arg | Glv Phe | Gin Ala | |
585 | 690 | 695 | ||||||||||
AAC | TCT AAA | GCG | GTA ACC | ACA | TCC | GAT | CAA | ATC | QfTWp | AAT ACC | CTA TTG | 2462 |
Asn | Ser Lys | Ala | Val Thr | Thr | Ser | As? | Gin | Ile | Leu | Asn Thr | Leu Leu | |
700 | 705 | 710 | ||||||||||
AAT | CTT AAG | CAA | TAA ACTAAAGGAT ' | TACT | CTAA' | TA CAATA | TAATA GGGGCTAATT | 2517 | ||||
Asn | Leu Lys | Gin | * |
715
TAAAGATTAA GGTTTAGTAT GCATGAATAC TCG 2550 * · • « « · )3) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) délka: 719 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
• · · · • ··· ···· ··· « ···· · ·· · • · · · ··· ·· · • ·· · · · · · • « · 4» · · · · · · *
Met 1 | Leu | Arg | Ser | Leu 5 | Trp | Ser | Gly | Val | Asn 10 | Gly | Met | Gin | Ala | His 15 | Gin |
Ile | Ala | Leu | Asn 20 | Ile | Glu | Ser | Asn | Asn 25 | Ile | Ala | Asn | Val | Asn 30 | Thr | Thr |
Gly | Phe | Lys 35 | Tyr | Ser | Arg | Ala | Ser 40 | Phe | Val | Asp | Met | Leu 45 | Ser | Gin | Val |
Lys | Leu 50 | Ile | Ala | Thr | Ala | Pro 55 | Tyr | Lys | Asn | Gly | Leu 60 | Ala | Gly | Gin | Asn |
Asn 55 | Phe | Ser | Val | Gly | Leu 70 | Gly | Val | Gly | Val | Asp 75 | Ala | Thr | Thr | Lys | Ile 80 |
Phe | Ser | Gin | Gly | Asn 85 | Ile | Gin | Asn | Thr | Asp 90 | Val | Lys | Thr | Asp | Leu 95 | Ala |
Ile | Gin | Gly | Asp 100 | Gly | Phe | Phe | Ile | Ile 105 | Asn | Pro | Asp | Arg | Gly 110 | Ile | Thr |
Arg | Asn | Phe 115 | Thr | Arg | Asp | Gly | Glu 120 | Phe | Leu | Phe | Asp | Ser 125 | Gin | Gly | Ser |
Leu | Val 13 0 | Thr | Thr | Gly | Gly | Leu 135 | Val | Val | Gin | Gly | *Ζ?2Γρ 140 | Val | Arg | Asn | Gly |
Ser 145 | Asp | Thr | Gly | Asn | Lys 150 | Gly | Ser | Asp | Thr | Asp 155 | Ala | Leu | Lys | Val | Asn 160 |
Asn | Thr | Gly | Pro | Leu 155 | Glu | Asn | Ile | Arg | Ile 170 | Asp | Pro | Gly | Met | Val 175 | Met |
Pro | Ala | Arg | Ala 180 | Ser | Asn | Arg | Ile | Ser 185 | Met | Arg | Ala | Asn | Leu 190 | Asn | Ala |
Gly | Arg | His 195 | Ala | Asp | Gin | Thr | Ala 200 | Ala | Ile | Phe | Ala | Leu 205 | Asp | Ser | Ser |
Ala | Lys 210 | Thr | Pro | Ser | Asp | Gly 215 | Ile | Asn | Pro | Val | Tyx 220 | Asp | Ser | Gly | Thr |
Asn 225 | Leu | Ala | Gin | Val | Ala 23 0 | Glu | Asp | Met | Gly | Ser 235 | Leu | Tyr | Asn | Glu | Asp 240 |
Gly | Asp | Ala | Leu | Leu 245 | Leu | Asn | Glu | Asn | Gin 250 | Gly | Ile | Trp | Val | Ser 255 | Tyr |
Lys | Ser | Pro | Lys 250 | Met | Val | Lys | Asp | Ile 255 | Leu | Pro | Ser | Ala | Glu 270 | Asn | Ser |
Thr | Leu | Glu 275 | Leu | Asn | Gly | Val | Lvs 280 | Ile | Ser | Phe | Thr | A.- 28;. | isp | £- : | Ala |
Val | Ser 290 | Arg | Thr | Ser | Ser | Leu 295 | Val | Ala | Ala | Lys | Asn 300 | Ala | Ile | Asn | Ala |
Val 305 | Lys | Ser | Gin | Gly 310 | Ile | Glu | Ala | Tyr | Leu 315 | Asp | Gly | Lys | Gin | Leu 320 |
Arg Leu Glu Asn Thr Asn Glu Leu Asp Gly Asp Glu Lys Leu Lys Asn
325 330 335
Ile Val | Val | Thr 340 | Gin | Ala | Gly | Thr | Gly 345 | Ala | Phe | Ala | Asn | Phe Leu 35Q | Asp |
Gly Asp | Lys 355 | Asp | Val | Thr | Ala | Phe 360 | Lys | Tyr | Ser | Tyr | 7»+ 3 65 | His Ser | Ile |
Ser Pro 370 | Asn | Ala | Asn | Ser | Gly 375 | Gin | Phe | Arg | Thr | Thr 380 | Glu | Asp Leu | Arg |
Ala Leu 335 | Ile | Gin | His | Asn 390 | Ala | Asn | Ile | Val | Lys 395 | Asp | Pro | Ser Leu | Ala 400 |
Asp Asn | Tyr | Gin | Aso 405 | Ser | Ala | Ala | Ser | Ile 410 | Gly | Val | ^hr | Ile Asn 415 | Gin |
Tyr Gly | Mec | Phe 420 | Glu | Ile | Asn | Asn | Lys 425 | Asp | Asn | Lys | Asn | Val Ile 430 | Lys |
Glu Asn | Leu 435 | Asn. | .Ile | Phe | Val | Ser 440 | Gly | Tyr | Ser | Ser | Asp 445 | Ser Val | Thr |
Asn Asn 450 | Val | Leu | Phe | Lys | Asn 455 | Ala | Mec | Lys | Gly | Leu 460 | Asn | Thr Ala | Ser |
Leu Ile 465 | Glu | Gly | Gly | Ala 470 | Ser | Ala | Ser | Ser | Ser 475 | Lys | Ph.s | HiS | Ala 480 |
Thr His | Ala | Thr | Ser 485 | Ile | Asp | Val | Ile | Asn 490 | Ser | Leu | Gly | Thr Lvs 495 | His |
Ala Mec | Arg | Ile 500 | Glu | Phe | Tyr | Arg | Ser 505 | Gly | Gly | Ala | Asp | Trp Asn 510 | Phe |
Arg Val | Ile 515 | Val | Pro | Glu | Pro | Gly 520 | Glu | Leu | Val | Gly | Gly 525 | Ser Ala | Ala |
Arg Pro 530 | Asn | Val | Phe | Glu | Gly 535 | Gly | Arg | Leu | His | Phe 540 | Asn | Asn Asp | Gly |
Ser Leu 545 | Ala. Gly | MeC | Asn 550 | Pro | Pro | Leu | Leu | Gin 555 | Phe | Asp | Pro Lys | Asn 560 | |
Gly Ala | Asp | Ala | Pro 565 | Gin | Arg | Ile | Asn | Leu 570 | Ala | Phe | Gly | Ser Ser 575 | Gly |
Ser Phe | Asp | Gly 580 | Leu | Thr | Ser | Val | Asp 585 | Lys | Ile | Ser | Glu | Thr Tvr 590 | Ala |
Ila Glu | Gin | Asn | Gly | Tyr | Gin | Ala | Gly | Asp | Leu | Mec | Asp | Val Arg | Phe |
595 600 605
Asp | Ser 610 | Asp | Gly | Val | Leu | Leu 615 | Gly | Ala | Phe | Ser | Asn 620 | Gly | Arg | Thr | Leu |
Ala 625 | Leu | Ala | Gin | Val | Ala 630 | Le^Ala. | Asn. | Phe | Ala 635 | Asn | Asp | Ala | Gly | Leu 640 | |
Gin | Ala | Leu | Gly | Gly 645 | Asn | Val | Phe | Ser | Gin 650 | Thr | Gly | Asn | Ser | Gly 655 | Gin |
Ala | Leu | Ile | Gly 660 | Ala | Ala | Asn | Thr | Gly 665 | Arg | Arg | Gly | Ser | Ile 670 | Ser | Gly |
Ser | Lys | Leu 675 | Glu | Ser | Ser | Asn | Val 680 | Asp | Leu | Ser | Arg | Ser 6S5 | Leu | Thr | Asn |
Leu | Ile 690 | Val | Val | Gin | Arg | Gly 695 | Phe | Gin. | Ala | Asn | Ser 700 | Lys | Ala | Val | Thr |
Thr 705 | Ser | Asp | Gin | Ile | Leu 710 | Asn | Thr | Leu | Leu | Asn 715 | Leu | Lys | Gin | * |
• ·
3-α • ···· ·· ··*· • · · · · · • ··· · ···· • · · · · · • · · · ·
(2) | Informace o sekvenci SEQ ID NO: | 3: |
(i) | Sekvenční charakteristika: | |
(A) | délka: 25 párů bází | |
(B) | typ: nukleová kyselina | |
(C) | vláknitost: jednoduchá | |
(D) | topologie: lineární | |
(ii) | typ molekuly: jiná nukleová | kyselina |
(A) | popis: /desc. = „PCR primer | |
(xi) | i Popis sekvence: SEQ ID NO: 3: | |
TAT | ACC ATGG TGC TTA GGTC TTTAT | |
(2) | Informace o sekvenci SEQ ID NO: | 4 : |
(i) | Sekvenční charakteristika: | |
(A) | délka: 25 párů bází | |
(B) | typ: nukleová kyselina | |
(C) | vláknitost: jednoduchá | |
(D) | topologie: lineární | |
(ii) | Typ molekuly: jiná nukleová | kyselina |
(A) | popis: /desc. = „PCR primer | |
(xi) | í Popis sekvence: SEQ ID NO: 4: |
GCG AAT TCAA TTG CTT AAGA TTCAA
Claims (16)
- PATETOVÉ NÁROKY1. FlgE polypeptid Helicobactera pylori nebo jeho modifikovaná forma, která má funkčně ekvivalentu antigenicitu, pro použití v indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori.
- 2. FlgE polypeptid Helicobactera pylori podle nároku 1, který má v podstatě sekvenci aminokyselin, znázorněnou v sekvenci SEQ ID NO: 2 z výčtu sekvencí, pro použití k indukci obranné imunitní odpovědi na infekciHelicobacterem pylori.
- 3. Vakcínová kompozice pro indukci obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori, vyznačující se tím, že obsahuje imunogenně účinné množství FlgE polypeptidů Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, popřípadě společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
- 4. Vakcínová kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že navíc obsahuje přídatný přípravek.
- 5. Vakcínová kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že přídatný přípravek je farmaceuticky přijatelná forma cholerového toxinu.
- 6. Vakcínová kompozice podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, pro použití jako terapeutická vakcína pro savce včetně člověka, který je infikován Helicobacterem pylori.• · · · • · · · • · · ·Ί. Vakcínová kompozice podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, pro použití jako profylaktická vakcína pro ochranu savce včetně člověka, proti infekci Helicobacterem pylori.
- 8. Použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, pro výrobu prostředku pro léčbu, profylaxi nebo diagnózu infekce Helicobacterem pylori.
- 9. Použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, pro výrobu vakcíny pro navození obranné imunitní odpovědi proti Helicobacteru pylori.
- 10. Použití FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, pro výrobu diagnostického kitu pro diagnózu infekce Helicobacterem pylori.
- 11. Způsob diagnózy infekce Helicobacterem pylori in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden krok, kde je použit FlgE polypeptid Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2, popřípadě označen nebo koplován na pevnou podporu.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje kroky (a) kontaktování zmíněného FlgE polypeptidu Helicobactera pylori popřípadě navázaného na pevnou podporu, s tělesnou tekutinou odebranou savci; a (b) detekování protilátek ve zmíněné tělesné tekutině, které se vážou na zmíněný FlgE polypeptid.
- 13. Diagnostický kit pro detekci infekce Helicobacterem pylori u savce včetně člověka, vyznačuj ící9 4 9444 ·· ♦·4 9 · · · · · • ···· · · · *9 4 9 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4 44 4 4 49 4 4 4 4 se t í m, že zahrnuje složky, které umožní provedení postupu podle nároků 11 nebo 12.
- 14. Diagnostický kit podle nároku 13, v y z n a č u jící se tím, že zahrnuje:(a) FlgE polypeptid Helicobactera pylori; a (b) činidla pro detekci protilátek, které se vážou na zmíněný FlgE polypeptid.
- 15. Způsob navození u savce obranné imunitní odpovědi na infekci Helicobacterem pylori, vyznačuj ίο i se t i m, že zmíněný způsob zahrnuje krok podání zmíněnému savci imunologicky účinného množství FlgE polypeptidu Helicobactera pylori podle nároku 1 nebo 2.
- 16. Způsob navození u savce obranné imunitní odpově di proti infekci Helicobacterem pylori, vyznačuj i c i se t i m, že zmíněný způsob zahrnuje krok podání zmíněnému savci imunologicky účinného množství vakcínové kompozice podle kteréhokoliv z nároků 3 až 7.
- 17. Způsob podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že zmíněný savec je člověk.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ19994449A CZ9904449A3 (cs) | 1998-06-08 | 1998-06-08 | Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ19994449A CZ9904449A3 (cs) | 1998-06-08 | 1998-06-08 | Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ9904449A3 true CZ9904449A3 (cs) | 2000-11-15 |
Family
ID=5468093
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19994449A CZ9904449A3 (cs) | 1998-06-08 | 1998-06-08 | Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ9904449A3 (cs) |
-
1998
- 1998-06-08 CZ CZ19994449A patent/CZ9904449A3/cs unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ghiara et al. | Therapeutic intragastric vaccination against Helicobacter pylori in mice eradicates an otherwise chronic infection and confers protection against reinfection | |
JP3380559B2 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物 | |
US7901907B2 (en) | Process for production of Helicobacter pylori bacterioferritin | |
JP5327873B2 (ja) | リコンビナントヘリコバクターピロリの経口ワクチン及びその調製方法 | |
US6468545B1 (en) | Treatment and prevention of helicobacter infection | |
KR102071743B1 (ko) | 신규의 약독화된 시겔라 생백신 | |
US5837825A (en) | Campylobacter jejuni flagellin/Escherichia coli LT-B fusion protein | |
JP2008517595A (ja) | ワクチンと核酸 | |
JP2010189411A (ja) | 病原菌株に特異的な新規生成物およびそのワクチンとしての使用および免疫療法における使用 | |
JP2000125889A (ja) | アクチノバチルス・プレウロニウモニアからのタンパク質 | |
EP1874806B1 (en) | Vaccine against burkholderia infections | |
PL185013B1 (pl) | Szczepionka do indukowania odpowiedzi immunologicznej i zestaw farmaceutyczny | |
US6762295B2 (en) | Protective helicobacter antigens | |
KR101252911B1 (ko) | pep27 유전자 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주 및 이의 용도 | |
JP2005514041A (ja) | ミコバクテリウム・パラツベルクローシス感染の診断薬及びワクチン | |
US20020028210A1 (en) | Vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide | |
SK173099A3 (en) | Vaccine compositions comprising the helicobacter pylori flge polypeptide | |
Trust et al. | Helicobacter pylori: today's treatment, and possible future treatment | |
CZ9904449A3 (cs) | Vakcínové kompozice obsahující Helicobacter pylori FIgE polypeptid | |
MXPA99011528A (en) | Vaccine compositions comprising the helicobacter pylori | |
WO1998056412A1 (en) | VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI 26kDa POLYPEPTIDE | |
WO1998056815A1 (en) | VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI Pfr POLYPEPTIDE | |
AU693679B2 (en) | Protective helicobacter antigens | |
EP1996228A2 (en) | Campylobacter vaccines and methods of use | |
JP2005515759A (ja) | GroELキメラ蛋白質およびワクチン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |