KR100962378B1

KR100962378B1 - 헬리코박터 파이로리의 편모ａ 단백질의 사람 항혈청에반응하는 항원결정기재조합 단백질 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100962378B1
Application number: KR1020080007094A
Authority: KR
Inventors: 조명제; 전진수; 이우곤; 윤희상; 서지현; 이광호; 다미르; 송재영; 백승철; 강형련; 오창환
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2010-06-10
Also published as: KR20090081164A

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파이로리 감염의 혈청학적 진단을 목적으로 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)가 생성하는 편모A 단백질 중 사람에게서 항원성을 보이는 항원결정기만 생성하는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질 제조방법에 관한 것이다.

이차원전기영동과 면역블롯 분석법으로 헬리코박터 파이로리 항원결정기를 맵핑(mapping)하여 편모A 단백질 중 환자의 혈청과 강하게 반응하는 항원결정기재조합 단백질을 제조하고, 헬리코박터 파이로리 혈청학적 진단에 사용할 수 있는 새로운 항원 성분을 제공하여 헬리코박터 파이로리의 혈청학적 진단법 개발의 폭을 넓힘으로써 위ㆍ십이지장 질환의 보건관리를 보다 향상시킬 수 있으며, 다양한 혈청학적 검색법에 대한 항원의 적용성을 증대시켜 항원 성분의 이용을 용이하게 하는 장점이 있다.

헬리코박터 파이로리, 항원결정기재조합 단백질, 편모단백질, 혈청학적 진단

Description

헬리코박터 파이로리의 편모Ａ 단백질의 사람 항혈청에 반응하는 항원결정기재조합 단백질 및 그의 제조방법{Production of the antigenic epitope recombinant protein of Helicobacter pylori FlaA reactive to human antisera and its method}

본 발명은 헬리코박터 파이로리 감염환자의 혈청과 반응하는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백질의 사람 항혈청에 반응하는 항원결정기재조합 단백질과 그의 제조방법에 관한 것으로서, 헬리코박터 파이로리 감염 여부를 진단을 목적으로 헬리코박터 파이로리가 생성하는 편모A 단백 중 사람에게서 항원성을 보이는 항원결정기만 생성하는 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백질의 항원결정기재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

한국인은 소아초기인 영ㆍ유아시절부터 의리코박터 파이로리에 감염되기 때문에 이 시기 때부터 헬리코박터 파이로리 감염을 진단할 수 있는 수단이 필요하다. 헬리코박터 파이로리는 위점막에 서식하기 때문에 감염을 진단하기 위해서는 위내시경을 통한 위점막 생검체가 필요하다. 그러나 소아를 비롯하여 성인이 위내시경술을 시술하기 위해서는 훈련된 의료인과 시설이 필요하기 때문에 일반 의료시 설에서는 수행할 수가 없다. 따라서 헬리코박터 파이로리 진단에 있어 보다 현실적이고 효과적인 진단법으로 혈청학적 진단법을 이용하고 있다. 혈청학적 진단법은 모든 의료기관에서 널리 사용하고 있기 때문에 특이한 항원만 개발되면 쉽게 사용할 수 있다. 현재 의료기관에서 사용되고 있는 혈청학적 진단법은 항원으로 헬리코박터 파이로리 세포추출단백질, 정제항원단백질 또는 발현항원단백질을 사용하고 있다. 그러나 이러한 항원은 복합항원이거나 다양한 항원들의 복합체로 구성되어 있어 비특이성 항원에 의한 비특이적 반응으로 진단의 특이도과 민감도를 향상시키는데 한계가 있다. 이 때문에 사람에게서 항원성이 있는 단일 단백성분으로 구성된 항원의 개발이 지속적으로 필요하다. 또한 단일 단백항원의 경우에도 전체 단백 중 항원결정기 부분은 일부이기 때문에 다른 부분의 존재로 인해 항체가 결합할 수 있는 빈도를 감소시키거나 방해를 할 수 있으며 교차반응성 때문에 진단 특이도를 감소시킬 수 있다. 따라서 단백항원 분자 중에서 항원결정기부분만 생산하여 항원을 준비할 수 있는 방안이 필요하다.

본 발명은 헬리코박터 파이로리가 보유하고 있는 구조단백 중에 사람의 면역기구에 가장 빠르게 노출되고, 그의 빈도가 많은 항원으로 판단되는 편모A 단백을 분석하여 환자혈청과 반응하는 항원결정기 부분을 결정하여, 반응성이 확인된 항원결정기 재조합단백질을 제조하고, 수용화 시키는 방법을 제공하고자 한다. 보다 상 세하게는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백을 클로닝하고 발현시켜 환자혈청과의 반응성을 분석한다. 이 때, 편모A 단백 유전자를 순차적으로 결손 시켜 항원결정기가 위치하는 곳을 매핍(mapping)함으로써 환자혈청과 반응하는 항원결정기 부분을 확인하여 항원결정기재조합 단백질을 제조하고, 수용성화 시킬 수 있는 방법을 고안하여 수용성 항원결정기재조합 단백질을 제조하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 제 1목적은 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 항원결정기를 제공하는 것이다.

본 발명의 제 2목적은 상기 항원결정기를 포함하는 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 제 3목적은 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질 및 그의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기의 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 항원결정기에 관한 것이다.

본 발명에서 확인한 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 중 사람에게서 항원결정기로 작용하는 부위의 아미노산 서열은 다음과 같다.

ISTVNNISITQVNVKAA (서열번호 40)

본 발명은 상기의 아미노산 서열을 갖는 항원결정기를 포함하는 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질에 관한 것이다. 상기 항원결정기는 편모A 단백의 3’마지막 도메인에 위치하며, 더욱 상세하게는 편모A 단백의 염기서열 1345에서 1395번까지 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 41의 아미노산 서열로 구성되는 헬리코박터 파이로리의 수용성 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질에 관한 것이다. 상기 서열번호 41의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MAKEIKFSDSARNLLFEGVRQLHDAVKVTMGPRGRNVLIQKSYGAPSITKDGVSVAKEIELSCPVANMGAQ

LVKEVASKTADAAGDGTTTATVLAYSIFKEGLRNITAGANPIEVKRGMDKAAEAIINELKKASKKVGGKEE

ITQVATISANSDHNIGKLIADAMEKVGKDGVITVEEAKGIEDELDVVEGMQFDRGYLSPYFVTNAEKMTAQ

LDNAYILLTDKKISSMKDILPLLEKTMKEGKPLLIIAEDIEGEAGIHLGNIADIKKNDSDGRLVAAINAVT

SETGVEAYTDQKGRLNLRSIDGRGIEIKTDSVSNGPSALTMVNGGQDLTISTVNNISITQVNVKAA

(서열번호 41)

상기 단백질은 헬리코박터 파이로리 감염환자 항혈청에 반응하는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은,

1) 헬리코박터 파이로리 항원 유전자와 항원결정기 부분 유전자 절편을 증폭하는 단계;

2) 상기 증폭된 유전자 절편을 서브-클로닝 하여 클론을 얻은 후, 제한효소를 처리하여 유전자 절편을 절단하는 단계;

3) 상기 절단된 유전자 절편을 분리한 후, 정제하는 단계;

4) 상기 2) 단계에서 처리한 동일한 제한효소를 벡터에 처리하는 단계;

5) 상기 3) 단계의 정제된 유전자 절편과 상기 4) 단계의 벡터를 클로닝 하여 클론을 얻는 단계;

6) 상기 5) 단계의 클론을 단백질 발현시켜 항원성을 조사하고 항원결정기 서열을 맵핑하는 단계;

7) 상기 6) 단계의 맵핑된 항원결정기 서열을 증폭하고 융합대상 벡터와 클로닝 하여 클론을 얻는 단계; 및

8) 상기 7) 단계의 클론을 발현하여 발현단백질을 얻는 단계:

를 포함하는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

상기 1) 단계에서 헬리코박터 파이로리 항원 유전자를 중합효소연쇄반응을 통해 오픈리딩프레임(open reading frame)의 시작부위와 3’-말단의 종결 서열까지 포함하도록 증폭하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 2) 단계 또는 4) 단계에서 제한효소는 발현에 필요한 시작코돈을 삽입하기 위해서 5’말단에는 NdeI을 사용하며, 3’말단은 BglII를 사용한다.

본 발명은 편모A 단백의 전체 유전자를 클로닝하고 발현시켰다. 그리고 전체 유전자 내부에 있는 제한효소 자리를 이용하여 편모A 유전자의 3' 부분을 단계별로 결손 시킨 단백질을 얻었고, 중합효소연쇄반응을 이용하여 편모A 유전자를 부분별로 결손시킴으로 3' 말단 쪽의 절반 쪽에 해당하는 유전자를 클로닝 하여 발현시켰다. 이들 발현한 단백질을 이용하여 사람의 항체와 반응하는 부분을 확인하였다.

상기의 과정을 통해 반응성이 확인된 단백질 부분을 50 ~ 230 bp의 크기로 중복되게 중합효소연쇄반응으로 증폭하여 헬리코박터 파이로리 단백질 융합발현 벡터인 pEGex 벡터에 클로닝 하여 발현하여 환자혈청으로 항원결정기 위치를 맵핑하였다.

상기와 같이, 반응성이 가장 높은 항원결정기를 확인하고 항원결정기재조합 단백질을 생산한 결과 모두 비용해성 단백질로 발현되었다. 상기 발현단백질을 수용화 시켜 수용성인 항원결정기재조합 단백질로 제조하기 위하여, 상기 7) 단계에서 발현단백질의 수용화를 위해 서열번호 14와 서열번호 15의 염기 서열로 구성되는 프라이머 세트를 추가로 삽입하여 클로닝 하여 수용성인 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질을 완성하였다.

즉, 본 발명에서는 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백을 통해 항원결정기를 맵핑(mapping)하였고, 맵핑된 항원결정기에 해당하는 염기서열을 융합대상 벡터에 클로닝 하여 반응성이 높은 편모A 항원결정기를 포함하는 재조합 융합단백질을 제조하였으며, 또한 이를 수용성 단백으로 생성되도록 수용성을 나타내는 아미노산 서열에 해당되는 염기서열을 삽입함으로써 헬리코박터 파이로리의 편모A 항원결정기재조합 단백질을 제조하여 혈청학적 진단법에 광범위하게 사용될 수 있게 되었다.

이상과 같이, 본 발명은 환자혈청에 반응하는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질 및 그의 제조방법을 제공하고, 헬리코박터 파이로리 혈청학적 진단에 사용할 수 있는 새로운 항원 성분을 제공하여 헬리코박터 파이로리의 혈청학적 진단법 개발의 폭을 넓힘으로써 위ㆍ십이지장 질환의 보건관리를 보다 향상시킬 수 있으며, 다양한 혈청학적 검색법에 대한 항원의 적용성을 증대시켜 항원 성분의 이용을 용이하게 하는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백 한 것이다.

[실시예 1] 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 유전자분석

국내에서 분리된 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 유전자 염기서열자료를 분석하여 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 전체 유전자 서열을 하기 서열번호 1에 나타내었으며, 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 전체 유전자(FlaA라 명명함)와 결손 유전자(FlaA1 ~ 4로 명명함)를 도식하여 하기 도 1에 나타내었다. 전체크기는 1,533 bp이고 710개 아미노산으로 형성되어 있다. 염기서열 분석 프로그램인 레이저진(Lasergene)으로 분석하여, 염기서열 441번째에 제한효소 EcoRI 자리가 위치하고 있고 염기서열 772번째에 BamHI, 그리고 868번째에 HindIII 자리가 위치하는 것을 확인하였다.

atggcttttcgggtcaatacaaatatcaatgcgatgaatgcgcatgtgcaatccgcactc 60

actcaaaatgcgcttaaaacttcattggagagattgagttcaggtttaaggattaataaa 120

gcggctgatgacgcatcaggtatgacggtggcggattctttgcgttcacaagcgaacagt 180

ttgggtcaagcgattgccaacacgaatgatggcatggggattatccaggttgcggataag 240

gctatggatgagcagttgaaaatcttagacaccgttaaggttaaagcgactcaagcggct 300

caagatgggcaaactacggaatctcgtaaagcgattcaatctgacatcgttcgtttgatt 360

caaggtttagataatatcggtaacacgactacttataacggacaagcgttattgtctggt 420

caattcactaacaaagaattccaagtaggggcttattctaaccaaagcattaaggcttct 480

atcggctctaccacttcggataaaatcggtcaggttcgtatcgctacaggtgcgttaatc 540

acggcttctggggatattagcttgacttttaaacaagtggatggcgtgaatgatgtaact 600

ttagagagcgtgaaagtctctagttcagcaggcacggggattggtgtgttagcagaagtg 660

atcaacaaaaactctaaccgaacaggcgttaaggcttatgcgagcgttatcaccacgagc 720

gatgtggcggtccagtcaggaagtttgagtaatttaaccttaaatgggatccatttgggt 780

aatatcgcagatattaagaaaaacgactcagacggacgattggttgcagcgatcaatgcg 840

gttacttcagaaaccggcgtggaagcttatacggatcaaaaagggcgcttgaatttgcgc 900

agtatagatggtcgtgggattgaaatcaaaaccgatagtgtcagtaacgggcctagtgct 960

ttaacgatggttaatggcggtcaggatttaacaaaaggctctacaaactacggaaggctt 1020

tctctcacacgcttagacgctaagagtatcaatgtggtttcggcttctgactcacagcat 1080

ttaggtttcacagcgattggttttggggaatctcaagtggcagaaaccacggtgaatttg 1140

cgcgatgttaccgggaattttaacgctaatgtcaaatcagccagtggcgcgaactataac 1200

gctgtcatcgctagcggtaatcaaagcttgggagctggggttacaaccttaagaggcgcg 1260

atggtggtgattgatattgccgagtctgcgatgaaaatgttggataaagtccgctctgat 1320

ttaggttctgtgcaaaatcaaatgattagcaccgtgaataacatcagcatcactcaagtg 1380

aatgttaaagcggctgaatctcaaattagggatgtggattttgctgaagagagtgcgaat 1440

ttcaataaaaacaacattttggcacaatcaggtagctatgcgatgagtcaagccaatacc 1500

gtccaacaaaatatcttaaggcttttaacttag 1533

(서열번호 1)

[제조예 1] 헬리코박터 파이로리 항원 제조 및 결손변이항원 제조

상기 실시예 1의 결과를 근거로 하여 유전자내부에 있는 제한효소 자리를 이용하여 편모A 유전자를 3' 부분을 단계별로 결손 시킨 단백질을 얻었고 또한 중합효소연쇄반응을 이용하여 편모A 유전자를 부분별로 결손시킴으로 3' 말단 쪽의 절반에 해당하는 유전자를 클로닝 하여 발현시켜서 편모A 단백의 3' 말단 쪽이 결손된 변이주 3개 그리고 5' 말단 쪽 절반이 결손된 변이주 1개를 제조하였다.

우선, 편모A 단백전체를 발현하기 위하여 본 발명에서 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다.

순방향 프라이머 : 5’-GAGTTACACATATGGCTTTTCGGGTCAATACAAATATCAA- 3’

(서열번호 2)

역방향 프라이머 : 5’-CCCGGGAGATCTAAGTTAAAAGCCTTAAGATATTTTGTTG- 3’

(서열번호 3)

헬리코박터 파이로리 항원은 유전자재조합 방법을 이용하여 대장균의 발현 벡터인 pET15b를 이용하여 생산하였다. 전체 오픈리딩프레임(open reading frame)이 함유 되도록 항원 유전자의 염기서열을 이용하여 시발체 올리고머를 만들고 PCR 방법으로 유전자 DNA를 증폭시켰다. 시발체에는 5' 말단에는 NdeI자리와 3' 말단에는 BglII자리를 삽입하였다. PCR 증폭 후에는 바로 pGEM-T 벡터에 클로닝 하여 클론을 얻었다. pGEM-T 벡터에 삽입된 유전자 DNA를 NdeI와 BglII으로 절단하여 1% 아가로즈에 전기영동 하여 분리하고 절편 DNA를 아가로스 겔로부터 분리하여 정제한 후, 상기와 동일한 제한효소를 처리한 pET15b 벡터를 상기 정제한 DNA와 클로닝 하였다.

또한, 결손변이항원 클론 생산은 앞에서 제조한 전체 염기서열이 삽입된 클론을 제한효소 EcoRI와 BglII, BamHI과 BglII, 그리고 HindIII와 BglII로 각각 동시에 절단하고 절단된 절편을 제거하고 절단된 부분을 마금 처리하고 라이게이션 함으로써 3' 말단이 결손된 클론을 제조하였다.

5' 말단 쪽으로 절반이 결손된 클론은 BamHI 자리에 NdeI 자리를 삽입하는 프라이머를 제작하여 순방향 프라이머로 사용하고 전체 염기서열을 증폭할 때 사용하는 역방향 프라이머를 이용하여 DNA 절편을 얻어 전체 염기서열을 클로닝 하는 방법과 동일한 방법으로 클론을 얻었다. 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백의 결손 변이주는 pET15b/FlaA1, pET15b/FlaA2, pET15b/FlaA3 및 pET15b/FlaA4와 같이 제조하여 하기 도 1에 결손위치 요약도를 나타내었다.

[실시예 2] 헬리코박터 파이로리 편모A 단백질과 결손변이단백질의 발현

상기 제조예 1과 같이 제조된 단백질과 결손변이단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 이를 발현 숙주에 형질전환 시키고 이소프로필티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가하여 발현을 유도한 결과 모두 효율적으로 발현하였다. 그러나 상기 변이 단백질은 수용성상태가 아니고 비수용 상태인 봉입체로 발현되었다.

헬리코박터 파이로리 편모A단백 염기서열과 및 결손변이 염기서열이 삽입된 pET15b 클론은 대장균 DH10B/r에 형질 전환시켜 클로닝된 플라스미드 클론을 얻고 이를 다시 발현 숙주인 대장균 BL21에 형질전환 시켜 이소프로필티오갈락토시드를 처리하여 삽입된 유전자를 발현시켰다. 단백질의 발현여부는 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis)를 통하여 확인하였다.

[실시예 3] 면역블롯 분석법에 의한 결손변이주 발현단백질의 항원성 분석

편모A 단백과 결손변이주 발현단백질의 SDS-PAGE 결과를 하기 도 2A에 나타내었으며, 결손변이주 발현단백질을 환자혈청을 이용하여 면역블롯 분석법으로 항원성을 분석한 결과를 하기 도 2B에 나타내었다. 그 결과, 편모A 유전자 전체가 클로닝된 pET15b/FlaA는 강하게 반응하였고 염기서열 1에서 772까지인 pET15b/FlaA1는 약하게 반응하였으며, 염기서열 778에서 1533인 pET15b/FlaA2는 강하게 반응하였고, 염기서열 1에서 441번까지 삽입된 pET15b/FlaA3는 반응성이 없었고 1에서 868까지 삽입된 pET15b/FlaA4는 약하게 반응하였다. 이러한 결과를 종합하면 헬리코박터 파이로리 편모A 단백은 염기서열 441에서 772번까지에 반응성이 약한 항원결정기가 있고 778에서 1533까지 강한 항원결정기가 존재할 것으로 판단되었다.

[제조예 2] 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백의 항원결정기를 확인하기 위한 중복된 항원결정기 융합단백질 제조

상기 실시예 3의 결과를 기초로 반응성이 확인된 지역을 92 ~ 230 bp의 크기로, 각 절편의 50%가 중복 되도록 DNA를 중합효소연쇄반응으로 제조하기 위한 프라이머를 아래와 같이 제작하였다.

염기서열 441에서 768까지는 하기 도 3과 같이 5개 절편으로 나누었고 프라이머 세트는 하기와 같으며, 하기 프라이머 세트로 제조한 융합단백질을 FlaA1-1 ~ FlaA1-5까지 명명하였다.

FlaA1-1

순방향 프라이머 : 5’-CCCCGAATTCCAAGTAGGGGCTTATTC- 3’(서열번호 4)

역방향 프라이머 : 5’-GCCGTCTCGAGCGCACCTGTAGCGATACG- 3’(서열번호 5)

FlaA1-2

순방향 프라이머 : 5’-CCCCCGAATTCTTAATCACGGCTTCTGGG- 3’(서열번호 6)

역방향 프라이머 : 5’-CCAATCTCGAGGCCTGCTGAACTAGAGAC- 3’(서열번호 7)

FlaA1-3

순방향 프라이머 : 5’-CCCCCGAATTCACGGGGATTGGTGTGTTA- 3’(서열번호 8)

역방향 프라이머 : 5’-CCCAACTCGAGCCCATTTAAGGTTAA- 3’(서열번호 9)

FlaA1-4

순방향 프라이머 : 5’-TAAGGCTGAATTCGGCTCTACCACTTCGG- 3’(서열번호 10)

역방향 프라이머 : 5’-GGGGGCTCGAGATCCACTTGTTTAAAAGT- 3’(서열번호 11)

FlaA1-5

순방향 프라이머 : 5’-CCCCCGAATTCGTGAATGATGTAACTTTA- 3’(서열번호 12)

역방향 프라이머 : 5’-GCCTTCTCGAGTGTTCGGTTAGAGTTTTT- 3’(서열번호 13)

염기서열 765에서 1533까지는 하기 도 4와 같이 6개 절편으로 나누었고 프라 이머 세트는 하기와 같으며, 하기 프라이머 세트로 제조한 융합단백질을 FlaA2-1 ~ FlaA2-6까지 명명하였다.

FlaA2-1

순방향 프라이머 : 5’-CCCCCGAATTCGGGATCCATTTGGGTAAT- 3’(서열번호 14)

역방향 프라이머 : 5’-CCCCCCTCGAGTTTGTTAAATCCTGACCG- 3’(서열번호 15)

FlaA2-2

순방향 프라이머 : 5’-GGCGCGGATCCTTGCGCAGTATAGATGGT- 3’(서열번호 16)

역방향 프라이머 : 5’-CCCAAACTCGAGCGCTGTGAAACCTAAATG- 3’(서열번호 17)

FlaA2-3

순방향 프라이머 : 5’-CCCCCGAATTCGGCTCTACAAACTACGGA- 3’(서열번호 18)

역방향 프라이머 : 5’-ACAGCGCTCGAGTTCGCGCCACTGGCTGA- 3’(서열번호 19)

FlaA2-4

순방향 프라이머 : 5’-CCCCCGAATTCATTGGTTTTGGGGAATCT- 3’(서열번호 20)

역방향 프라이머 : 5’-ATCCAACTCGAGCATCGCAGACTCGGCAAT- 3’(서열번호 21)

FlaA2-5

순방향 프라이머 : 5’-GTGGCGAATTCTATAACGCTGTCATCGC- 3’(서열번호 22)

역방향 프라이머 : 5’-CCCCCCTCGAGCTAAGTTAAAAGCCTTAA- 3’(서열번호 23)

FlaA2-6

순방향 프라이머 : 5’-CTGCGGAATTCATGTTGGATAAAGTCCGC- 3’(서열번호 24)

역방향 프라이머 : 5’-CCCCCCTCTGAGCTAAGTTAAAAGCCTTAA- 3’(서열번호 25)

이들 프라이머를 이용하여 DNA 절편을 증폭하고 이를 pGEMT/A에 벡터에 클로닝하고 EcoRI과 XhoI으로 절단하여 삽입된 DNA를 추출하고 이를 동일한 제한효소를 절단한 pEGexs에 삽입하여 클론을 얻었다. 실시예 2와 같은 방법을 이용하여 삽입된 염기서열을 융합단백질 상태로 발현시켰다.

[실시예 4] 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백의 중복된 항원결정기 융합단백질의 항원반응성 분석

제조예 2에서 제조한 11종의 융합단백질을 환자혈청을 이용하여 면역블롯 분석법으로 항원성을 분석하였다. 그 결과 하기 도 5B와 도 6B와 같이 FlaA1-1, 2, 3, 4, 5 단백은 모두 약하게 반응하였고 FlaA2-1과 2는 반응성이 없었다. FlaA2-3과 4는 약하게 반응하였고 FlaA2-5와 6은 강하게 반응하였다. 이러한 결과를 통해 편모A 단백은 염기서열 1195번 이후 3'말단에 강한 항원결정기가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.

[제조예 3] 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백의 50 bp 크기의 강한 항원결정기를 결정하기 위한 중복된 항원결정기 융합단백질 제조

헬리코박터 파이로리의 편모A 단백의 50 bp 크기의 강한 항원결정기를 결정하기 위해서 하기 도 7과 같이 편모A 단백 염기서열 1195에서 1533까지 50에서 130 bp 크기로 7개 종류의 절편을 만들어 융합단백질 벡터에 클로닝 하였다.

이를 위해 프라이머 세트를 하기와 같이 제조하였으며, 하기 프라이머 세트로 제조한 융합단백질을 FlaA2-7 ~ FlaA2-13까지 명명하였다.

FlaA2-7

순방향 프라이머 : 5’-GTGGCGAATTCTATAACGCTGTCATCGC- 3’(서열번호 26)

역방향 프라이머 : 5’-ATCCAACTCGAGCATCGCAGACTCGGCAAT- 3’(서열번호 27)

FlaA2-8

순방향 프라이머 : 5’-CTGCGGAATTCATGTTGGATAAAGTCCGC- 3’(서열번호 28)

역방향 프라이머 : 5’-TTTGAGCTCGAGCCGCTTTAACATTCAC- 3’(서열번호 29)

FLaA2-9

순방향 프라이머 : 5’-GGGCCCGAATTCGAATCTCAAATTAGG- 3’(서열번호 30)

역방향 프라이머 : 5’-CCCCCCTCGAGCTAAGTTAAAAGCCTTAA- 3’(서열번호 31)

FLaA2-10

순방향 프라이머 : 5’-GGGCCCGAATTCGGGGTTACAACCTTA- 3’(서열번호 32)

역방향 프라이머 : 5’-ATCCAACTCGAGCATCGCAGACTCGGCAAT- 3’(서열번호 33)

FLaA2-11

순방향 프라이머 : 5’-CTGCGGAATTCATGTTGGATAAAGTCCGC- 3’(서열번호 34)

역방향 프라이머 : 5’-GGGCCCCTCGAGAATCATTTGATTTTG- 3’(서열번호 35)

FLaA2-12

순방향 프라이머 : 5’-GGGCCCGAATTCATTAGCACCGTGAAT- 3’(서열번호 36)

역방향 프라이머 : 5’-TTTGAGCTCGAGCCGCTTTAACATTCAC- 3’(서열번호 37)

FLaA2-13

순방향 프라이머 : 5’-GGGCCCGAATTCGGGGTTACAACCTTA- 3’(서열번호 38)

역방향 프라이머 : 5’-GGGCCCCTCGAGAATCATTTGATTTTG- 3’(서열번호 39)

제조예 2와 같은 방법을 실시하여 클론을 얻었으며, 실시예 2와 같은 방법을 이용하여 삽입된 염기서열을 융합단백질 상태로 발현시켰다.

[실시예 5] 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백의 50 bp 크기의 강한 항원결정기 결정

제조예 3에서 제조한 7종의 융합단백질을 환자혈청을 이용하여 면역블롯 분석법으로 항원성을 분석하였다. 그 결과 하기 도 8B와 같이 FlaA2-7은 약하게 반응하였고 FlaA2-8과 FlaA2-12가 강하게 반응하였다. 이러한 결과를 종합하면 하기 도 9와 같이 편모A 단백이 갖고 있는 반응성이 강한 항원결정기는 염기서열 1345에서 1395사이에 위치함을 확인할 수 있었다.

[제조예 4] pEGexs/FlaA2-12 클론이 생성하는 융합단백질의 수용화

FlaA2-12가 헬리코박터 파이로리 편모A 단백의 강한 항원결정기를 발현한다는 것이 확인되었으나 발현된 단백질이 모두 불용성 단백질 상태로 발현되었다. 이를 수용화 단백질로 발현시키기 위해서 항원결정기 절편인 FlaA2-12 부분에 항원성이 없으면서 수용성으로 발현되는 FlaA2-1, FlaA2-2, 그리고 FlaA2-9를 삽입하였 다. 그 결과 하기 도 10과 같이 FlaA2-1을 삽입한 경우에 수용성 융합단백질로 발현되었다. 이 클론을 pEGexs/FlaA2-12S로 명명하였다.

[실시예 6] 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 항원결정기 서열과 수용성 융합단백질 서열 분석

상기 제조예 4에 의한 수용성 편모A 단백의 항원결정기 융합단백질에는 강한 항원결정기 부분인 다음과 같은 서열이 융합되어 있다.

ISTVNNISITQVNVKAA (서열번호 40)

또한, 상기 서열번호 40으로 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 헬리코박터 파이로리의 편모A단백 항원결정기와 수용성을 향상시키기 위한 FlaA2-1 절편과 헬리코박터 파이로리 GroEL 부분인 발현유도단백이 포함된 클론이 발현하는 재조합 단백질 GroELT1/FlaA2-1/FlaA2-12의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MAKEIKFSDSARNLLFEGVRQLHDAVKVTMGPRGRNVLIQKSYGAPSITKDGVSVAKEIELSCPVANMGAQ

LVKEVASKTADAAGDGTTTATVLAYSIFKEGLRNITAGANPIEVKRGMDKAAEAIINELKKASKKVGGKEE

ITQVATISANSDHNIGKLIADAMEKVGKDGVITVEEAKGIEDELDVVEGMQFDRGYLSPYFVTNAEKMTAQ

LDNAYILLTDKKISSMKDILPLLEKTMKEGKPLLIIAEDIEGEAGIHLGNIADIKKNDSDGRLVAAINAVT

SETGVEAYTDQKGRLNLRSIDGRGIEIKTDSVSNGPSALTMVNGGQDLTISTVNNISITQVNVKAA

(서열번호 41)

도 1은 헬리코박터 파이로리의 편모A 단백 전체 유전자(FlaA)와 결손 유전자(FlaA1 ~ 4)를 도식한 것이다.

도 2는 편모A 단백 전체 유전자와 결손변이주 발현단백질의 SDS-PAGE분석(A)과 환자혈청을 이용한 면역블롯 분석 결과(B)를 나타낸 것이다.

도 3은 편모A 단백 중 FlaA1 절편의 항원결정기 분석을 위한 중복 클론의 위치를 도식한 것이다.

도 4는 편모A 단백 중 FlaA2 절편의 항원결정기 분석을 위한 중복클론의 위치를 도식한 것이다.

도 5는 발현단백질을 니트로 셀루로즈 여과지에 전달 후 폰슈에스(Ponceau S) 염색(2A)과 면역블롯 분석 결과(2B)를 나타낸 것이다.

M; 표준 분자량 마커(Marker)

1; FlaA 전체 유전자 발현단백질

2; FlaA2 발현단백질

3; 벡터에 있는 융합단백질

4; 벡터에 있는 융합단백질

5; 발현단백질의 FlaA1-1 절편

6; 발현단백질의 FlaA1-2 절편

7; 발현단백질의 FlaA1-3 절편

8; 발현단백질의 FlaA1-4 절편

9; 발현단백질의 FlaA1-5 절편

도 6은 발현단백질을 니트로 셀루로즈 여과지에 전달 후 폰슈에스(Ponceau S) 염색(2A)과 면역블롯 분석 결과(2B)를 나타낸 것이다.

1; 벡터에 있는 융합단백질

2; 발현단백질 FlaA2

3; 발현단백질의 FlaA2-1 절편

4; 발현단백질의 FlaA2-2 절편

5; 발현단백질의 FlaA2-3 절편

6; 발현단백질의 FlaA2-4 절편

7; 발현단백질의 FlaA2-5 절편

8; 발현단백질의 FlaA2-6 절편

도 7은 편모A단백 유전자 염기서열 1195번 이후 절편에서 강한 항원결정기 분석을 위한 중복 클론의 위치의 도식이다.

도 8은 발현단백질을 니트로 셀루로즈 여과지에 전달 후 폰슈에스(Ponceau S) 염색(2A)과 면역블롯 분석 결과(2B)를 나타낸 것이다.

1; 발현단백질의 FlaA2-7 절편

2; 발현단백질의 FlaA2-8 절편

3; 발현단백질의 FlaA2-9 절편

4; 발현단백질의 FlaA2-10 절편

5; 발현단백질의 FlaA2-11 절편

6; 발현단백질의 FlaA2-12 절편

7; 발현단백질의 FlaA2-13 절편

도 9는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백의 항원결정기 위치를 도식한 것이다.

도 10은 수용화한 융합단백질인 pEGexs/FlaA2-12S의 발현을 확인한 것이다.

1; pEGexs/FlaA2-12S를 함유하고 있는 대장균의 세포추출물의 원침 후 상청액

2; pEGexs/FlaA2-12S를 함유하고 있는 대장균의 세포추출물의 원침 후 침전물

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Production of the antigenic epitope recombinant protein of Helicobacter pylori FlaA reactive to human antisera and its method <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1533 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 1 atggcttttc gggtcaatac aaatatcaat gcgatgaatg cgcatgtgca atccgcactc 60 actcaaaatg cgcttaaaac ttcattggag agattgagtt caggtttaag gattaataaa 120 gcggctgatg acgcatcagg tatgacggtg gcggattctt tgcgttcaca agcgaacagt 180 ttgggtcaag cgattgccaa cacgaatgat ggcatgggga ttatccaggt tgcggataag 240 gctatggatg agcagttgaa aatcttagac accgttaagg ttaaagcgac tcaagcggct 300 caagatgggc aaactacgga atctcgtaaa gcgattcaat ctgacatcgt tcgtttgatt 360 caaggtttag ataatatcgg taacacgact acttataacg gacaagcgtt attgtctggt 420 caattcacta acaaagaatt ccaagtaggg gcttattcta accaaagcat taaggcttct 480 atcggctcta ccacttcgga taaaatcggt caggttcgta tcgctacagg tgcgttaatc 540 acggcttctg gggatattag cttgactttt aaacaagtgg atggcgtgaa tgatgtaact 600 ttagagagcg tgaaagtctc tagttcagca ggcacgggga ttggtgtgtt agcagaagtg 660 atcaacaaaa actctaaccg aacaggcgtt aaggcttatg cgagcgttat caccacgagc 720 gatgtggcgg tccagtcagg aagtttgagt aatttaacct taaatgggat ccatttgggt 780 aatatcgcag atattaagaa aaacgactca gacggacgat tggttgcagc gatcaatgcg 840 gttacttcag aaaccggcgt ggaagcttat acggatcaaa aagggcgctt gaatttgcgc 900 agtatagatg gtcgtgggat tgaaatcaaa accgatagtg tcagtaacgg gcctagtgct 960 ttaacgatgg ttaatggcgg tcaggattta acaaaaggct ctacaaacta cggaaggctt 1020 tctctcacac gcttagacgc taagagtatc aatgtggttt cggcttctga ctcacagcat 1080 ttaggtttca cagcgattgg ttttggggaa tctcaagtgg cagaaaccac ggtgaatttg 1140 cgcgatgtta ccgggaattt taacgctaat gtcaaatcag ccagtggcgc gaactataac 1200 gctgtcatcg ctagcggtaa tcaaagcttg ggagctgggg ttacaacctt aagaggcgcg 1260 atggtggtga ttgatattgc cgagtctgcg atgaaaatgt tggataaagt ccgctctgat 1320 ttaggttctg tgcaaaatca aatgattagc accgtgaata acatcagcat cactcaagtg 1380 aatgttaaag cggctgaatc tcaaattagg gatgtggatt ttgctgaaga gagtgcgaat 1440 ttcaataaaa acaacatttt ggcacaatca ggtagctatg cgatgagtca agccaatacc 1500 gtccaacaaa atatcttaag gcttttaact tag 1533 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA forward primer <400> 2 gagttacaca tatggctttt cgggtcaata caaatatcaa 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA reverse primer <400> 3 cccgggagat ctaagttaaa agccttaaga tattttgttg 40 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-1 forward primer <400> 4 ccccgaattc caagtagggg cttattc 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-1 reverse primer <400> 5 gccgtctcga gcgcacctgt agcgatacg 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-2 forward primer <400> 6 cccccgaatt cttaatcacg gcttctggg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-2 reverse primer <400> 7 ccaatctcga ggcctgctga actagagac 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-3 forward primer <400> 8 cccccgaatt cacggggatt ggtgtgtta 29 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-3 reverse primer <400> 9 cccaactcga gcccatttaa ggttaa 26 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-4 forward primer <400> 10 taaggctgaa ttcggctcta ccacttcgg 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-4 reverse primer <400> 11 gggggctcga gatccacttg tttaaaagt 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-5 forward primer <400> 12 cccccgaatt cgtgaatgat gtaacttta 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA1-5 reversse primer <400> 13 gccttctcga gtgttcggtt agagttttt 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-1 forward primer <400> 14 cccccgaatt cgggatccat ttgggtaat 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-1 reverse primer <400> 15 cccccctcga gtttgttaaa tcctgaccg 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-2 forward primer <400> 16 ggcgcggatc cttgcgcagt atagatggt 29 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-2 reverse primer <400> 17 cccaaactcg agcgctgtga aacctaaatg 30 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-3 forword primer <400> 18 cccccgaatt cggctctaca aactacgga 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-3 reverse primer <400> 19 acagcgctcg agttcgcgcc actggctga 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-4 forword primer <400> 20 cccccgaatt cattggtttt ggggaatct 29 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-4 reverse primer <400> 21 atccaactcg agcatcgcag actcggcaat 30 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-5 forward primer <400> 22 gtggcgaatt ctataacgct gtcatcgc 28 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-5 reverse primer <400> 23 cccccctcga gctaagttaa aagccttaa 29 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-6 forward primer <400> 24 ctgcggaatt catgttggat aaagtccgc 29 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-6 reverse primer <400> 25 cccccctctg agctaagtta aaagccttaa 30 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-7 forward primer <400> 26 gtggcgaatt ctataacgct gtcatcgc 28 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-7 reverse primer <400> 27 atccaactcg agcatcgcag actcggcaat 30 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-8 forward primer <400> 28 ctgcggaatt catgttggat aaagtccgc 29 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaA2-8 reverse primer <400> 29 tttgagctcg agccgcttta acattcac 28 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-9 forward primer <400> 30 gggcccgaat tcgaatctca aattagg 27 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-9 reverse primer <400> 31 cccccctcga gctaagttaa aagccttaa 29 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-10 forward primer <400> 32 gggcccgaat tcggggttac aacctta 27 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-10 reverse primer <400> 33 atccaactcg agcatcgcag actcggcaat 30 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-11 forward primer <400> 34 ctgcggaatt catgttggat aaagtccgc 29 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-11 reverse primer <400> 35 gggcccctcg agaatcattt gattttg 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-12 forward primer <400> 36 gggcccgaat tcattagcac cgtgaat 27 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-12 reverse primer <400> 37 tttgagctcg agccgcttta acattcac 28 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-13 forward primer <400> 38 gggcccgaat tcggggttac aacctta 27 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLaA2-13 reverse primer <400> 39 gggcccctcg agaatcattt gattttg 27 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 40 Ile Ser Thr Val Asn Asn Ile Ser Ile Thr Gln Val Asn Val Lys Ala 1 5 10 15 Ala <210> 41 <211> 350 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 41 Met Ala Lys Glu Ile Lys Phe Ser Asp Ser Ala Arg Asn Leu Leu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Val Arg Gln Leu His Asp Ala Val Lys Val Thr Met Gly Pro 20 25 30 Arg Gly Arg Asn Val Leu Ile Gln Lys Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Ile 35 40 45 Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Ser Cys Pro 50 55 60 Val Ala Asn Met Gly Ala Gln Leu Val Lys Glu Val Ala Ser Lys Thr 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Tyr 85 90 95 Ser Ile Phe Lys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Thr Ala Gly Ala Asn Pro 100 105 110 Ile Glu Val Lys Arg Gly Met Asp Lys Ala Ala Glu Ala Ile Ile Asn 115 120 125 Glu Leu Lys Lys Ala Ser Lys Lys Val Gly Gly Lys Glu Glu Ile Thr 130 135 140 Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asp His Asn Ile Gly Lys Leu 145 150 155 160 Ile Ala Asp Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asp Gly Val Ile Thr Val 165 170 175 Glu Glu Ala Lys Gly Ile Glu Asp Glu Leu Asp Val Val Glu Gly Met 180 185 190 Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Val Thr Asn Ala Glu 195 200 205 Lys Met Thr Ala Gln Leu Asp Asn Ala Tyr Ile Leu Leu Thr Asp Lys 210 215 220 Lys Ile Ser Ser Met Lys Asp Ile Leu Pro Leu Leu Glu Lys Thr Met 225 230 235 240 Lys Glu Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Ile Glu Gly Glu 245 250 255 Ala Gly Ile His Leu Gly Asn Ile Ala Asp Ile Lys Lys Asn Asp Ser 260 265 270 Asp Gly Arg Leu Val Ala Ala Ile Asn Ala Val Thr Ser Glu Thr Gly 275 280 285 Val Glu Ala Tyr Thr Asp Gln Lys Gly Arg Leu Asn Leu Arg Ser Ile 290 295 300 Asp Gly Arg Gly Ile Glu Ile Lys Thr Asp Ser Val Ser Asn Gly Pro 305 310 315 320 Ser Ala Leu Thr Met Val Asn Gly Gly Gln Asp Leu Thr Ile Ser Thr 325 330 335 Val Asn Asn Ile Ser Ile Thr Gln Val Asn Val Lys Ala Ala 340 345 350

Claims

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1) 헬리코박터 파이로리 항원 유전자와 항원결정기 부분 유전자 절편을 증폭하는 단계;

2) 상기 증폭된 유전자 절편을 서브-클로닝 하여 클론을 얻은 후, 제한효소를 처리하여 절단하는 단계;

3) 상기 절단된 유전자 절편을 분리한 후, 정제하는 단계;

4) 상기 2) 단계에서 처리한 동일한 제한효소를 벡터에 처리하는 단계;

5) 상기 3) 단계의 정제된 유전자 절편과 상기 4) 단계의 벡터를 클로닝 하여 클론을 얻는 단계;

6) 상기 5) 단계의 클론을 단백질 발현시켜 항원성을 조사하고 항원결정기 서열을 맵핑하는 단계;

7) 상기 6) 단계의 맵핑된 항원결정기 서열에 발현단백질의 수용화를 위해 서열번호 14와 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 추가로 삽입하여 증폭한 후, 융합대상 벡터와 클로닝 하여 클론을 얻는 단계; 및

8) 상기 7) 단계의 클론을 발현하여 발현단백질을 얻는 단계:

를 포함하는 헬리코박터 파이로리 편모A 단백 항원결정기재조합 단백질의 제조방법.
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