SK140997A3

SK140997A3 - Hybridoma 199m and monoclonal antibody produced by this hybridoma

Info

Publication number: SK140997A3
Application number: SK1409-97A
Authority: SK
Inventors: Michael W Gallatin; Monica Van Der Vieren
Original assignee: Icos Corp
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 1998-09-09
Also published as: JP2001526524A; BR9702101A; AU2133397A; CA2218755C; CZ287921B6; FI974018A0; CN1189851A; CN1103812C; NO974852D0; NO318764B1; EP0835301A1; DE69733051D1; NO974852L; FI974018A; IL122011A; CZ328697A3; SK283135B6; ATE293685T1; EP0835301B1; HUP9901579A2

Description

Oblasť techniky

Vynález popisuje klonovanie a expresiu polynukleotidov kódujúcich novú oŕ podjednotku ludského integrínu a-., označovanú ako oí_d. ktorá je štruktúrne podobná známym d podjednotkám ludského integrínu a_Ä, označovaným CDlla, CDllb a CDllc. Vynález sa takisto týka polynukleotidov. ktoré vykazujú homológiu k sekvencii kódujúcej ludský oŕ_d, izolovaných z iných živočíšnych druhov.

Doterajší stav techniky

Integríny sú triedou molekúl asociovaných s membránou, ktoré sa aktívne zúčastňujú na procese bunkovej adhézie. Integríny sú transmembránové heterodiméry zložené z podjednotky d, ktorá je nekonvalentne asociovaná s podjednotkou e. V súčasnosti je známych prinajmenšom štrnásť podjednotiek d a osem podjednotiek e (zhrnuté v Springer, Náture 346:425 až 434 (1990)). Podjednotky a sú obvykle schopné asociácie s viac ako jednou podjednotkou d a heterodiméry majúce spoločnú podjednotku a vytvárajú v populácii Integrínov jednotlivé podtriedy.

Jedna podtrieda ľudských integrínov, ktorá je exprimovaná len na povrchu bielych krviniek, je charakterizovaná prítomnosťou spoločnej podjednotky a₂. Výsledkom tejto bunkovej špecifickej expresie je skutočnosť, že tieto integríny sú obvykle označované ako leukocytové integríny, Leu-CAľl alebo leukointegríny. Vzhľadom na prítomnosť spoločnej podjednotky a_a, je inou alternatívou označovať tieto integríny ako integríny a_s. Pod jednotka a₂. CCD18) bola už predtým Izolovaná v spojení s jednou z troch rozdielnych podjednotiek d, označovaných CDlla, CDllb a CDllc. Izolácia cDNA kódujúcej ludský CD18 je popísaná v publikácii Kishimoto a ďalší. Celí 48:681 až 690 (1987). Podía oficiálnej nomenklatúry WHO (Svetová zdravotnícka organizácia) sú tieto heterodimérne proteíny označované ako CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18; vo všeobecne používanej nomenklatúre sú tieto označované ako LFA-1 <CDlla/CD18>, Mac-1 alebo Mol C CDllb/CD18) a pl5095 alebo LeuM5 C CDl:lc/CD18) ĽCobbold a ďalší, v Leukocyte Typing III, McMichael Ced), Oxford Press, strana '788 C1987)). Bolo dokázané, že ai podjednotky CDlla, CDllb a CDllc ľudského integrínu migrujú pri elektroforéze uskutočňovanej v redukujúcich podmienkach so zdanlivými molekulovými hmotnosťami približne 180 kD CCDlla), 155 kD CCDllb) a 150 kD CCDllc). DNA kódujúca tieto podjednotky už boli klonované CCDlla, Larson a ďalší, J. Celí Biol. 180:703 až 712 C1989); CDllb, Corbi a ďalší, J. Biol. Chem. 263:12403 až 12411 C1988) a CDllc, Corbi a ďalší, EMBO J. 6:4023 až 4028 ¢1987)1. Domnelé homológy cŕ a β reťazcov ľudského integrínu definované podľa približnej podobnosti molekulových hmotností, boli pomocou najrôznejších metód identifikované u iných živočíšnych druhov, vrátane opíc a primátov CLe tvin a ďalší, Blood 61:408 až 410 ¢1983),3, myší ĽSanchez-Madrid a ďalší, J. Exp. Med. 154:1517 ¢1981)3 a psov [Moore a ďalší, Tissue Antigéne 36:211 až 220 ¢1990)3.

Ukázalo sa, že absolútne molekulové hmotnosti predpokladaných homológov oí a e reťazcov ľudského integrínu b₂, získaných z iných živočíšnych druhov, sa podstatne líšia C pozri napríklad Danilenko a ďalší, Tissue Antigens 40:13 až 23. ¢1992)3 a vzhľadom na absenciu informácií týkajúcich sa sekvencie týchto homológov nie je možné s určitosťou definovať vzťah medzi podjednotkami ľudského integrínu a podjednotkami identifikovanými u iných druhov. Medzi rôznymi druhmi boli. navyše pozorované rozdiely v počte zástupcov jednotlivých rodín proteínov. Uvážme napríklad, že z králikov bolo izolovaných viac izotypov IgA ako ich existuje u ľudí CBurnett a ďalší, EMBO J. 8:4041 až 4047 ¢1989) a Schneiderman a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sex. ^ISA) 86:7561 až 7565 ¢1989)3. Obdobne, u ľudí bolo doteraz identifikovaných prinajmenšom šesť variánt metalotxoneínov C Karin a Richards, Náture 299.797 až 802 ¢1982) a Varshney a ďalší, Mol. Celí. Biol. 6:26 až 37, ¢1986)3, zatiaľ čo u myší existujú dôkazy o prítomnosti len dvoch takýchto variánt CSearle a ďalší, Mol.

Celí. Biol. 4:1221 až 1230 <1984)3. Z existencie viacerých zástupcov proteínov u Jedného druhu sa teda nedá jednoznačne odvodil, žeby príslušný zástupcovia rodiny proteínov museli existoval aj u iných druhov.

Pokial ide o integríny e>^., bolo u psov pozorované, že predpokladaný psí náprotivok ľudského CD18 je schopný vytváral diméry až so štyrmi rozdielnymi· podjednotkami a CDanilenko a ďalší, pozri vyššie]. Výsledkom imunizácie myši pomocou sp'lenocytov získaných z organizmov psov bolo vytvorenie monoklonálnych protilátok, ktoré imunoprecipitovali s proteínmi experimentálne označenými ako psie homológy k ľudským CD1S, CDlla, CDllb a CDllc; táto homológia na zistení podobných, ale nie hmotnosti. Ďalšia protilátka namierená proti splenocytom získaným z organizmu psov, označená Call.8H2, rozpoznávala a imunoprecipltovala so štvrtou podjednotkou (psiou) podobnou pod jednotke oŕ. Táto štvrtá psia pod jednotka je takisto schopná asociácie s podjednotkou e₂, ale má jedinečnú molekulovú hmotnosl a je exprimovaná len na subpopulácii diferencovaných tkanivových makrofágov.

bola predovšetkým založená identických, molekulových

Výsledkom imunizácie chrčkov pomocou dendritických buniek získaných z organizmov myší bolo vytvorenie dvoch monoklonálnych protilátok namierených proti integrínom C Metlay a ďalší, J. Exp. Med. 171:1753 až 1771 (1990)3. Jedna z týchto protilátok, označená 2E6,. imunoprecipltovala prevažne s heterodimérom tvoreným podjednotkami so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 180 kD a 90 kD a v menšej miere potom s proteínmi so zdanlivými molekulovými hmotnosťami v rozmedzí 150 až 160 kD. Druhá z týchto protilátok, označená N418, imunoprecipltovala s ďalším zdanlivým heterodimérom tvoreným podjednotkami so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 1.50 kO a 90 kD. Z výsledkov štúdií, pri ktorých bola blokovaná bunková adhézla, bolo usúdené, že protilátka 2E6 rozpoznáva myšací náprotivok ľudského CD18, zatiaľ čo molekulová hmotnosť zistená u antigénu N418 naznačovala, že ide o myšací homológ ľudského CDllc/CD18, ďalšie analýzy ukazujú, že tento myšací antigén vykazuje distribúciu v tkanivách, ktorá nezodpovedá distribúcii pozorovanej u ľudského CDllc/CD18.

Antigény rozpoznávané prostredníctvom psej protilátky Call.8H2 a myšacej protilátky N418 môžu reprezentovať rôzne varianty (napríklad s rôznym stupňom glykozylácie alebo produkty rôzne zostrihnutých mRNA) už predtým identifikovanej psej alebo myšacej podjednotky d. Inou možnosťou je, že tieto antigény môžu reprezentovať unikátne podjednotky d psích alebo myšacích integrínov. U momente, kedy nie sú dostupné informácie týkajúce sa primárnej štruktúry, nie je možné tieto dve alternatívy odlíšiť.

U ludí je heterodimér CDlla(CD18 exprimovaný na povrchu všetkých lymfocytov. Heterodimér CDllb/CD18 a CDllc/CD18 sú v podstate exprimované len na povrchu monocytov, granulocytov, makrofágov a NK buniek (natural killer cellô), avšak CDllc/CD18 bol takisto detegovaný u niektorých typov B~huniek. Všeobecne je možné povedať, že CDlla/CD18 prevažuje u lymfocytov, CDllb/CD18 u granulocytov a CDllc/CD18 na povrchu makrofágov C pozri súhrnný článok Arnaout, Blood 75:1037 až 1050 (1990)]. Expresia reťazcov d sa však líšia v závislosti od stupňa aktxvácie a diferenciácie jednotlivých typov buniek t pozri súhrnný článok, Larson a Springer, Immunol. Rev. 114:181 až 217 (1990)].

Pri použití protilátok, ktoré sú schopné blokovať bunkovú adhéziu sprostredkovanú pomocou integrínov e>_a, bolo dokázané, že tieto integríny sa v organizme človeka zúčastňujú na imunitnej a zápalovej reakcii. Napríklad heterodlméry CDlla/CD18, CDllb/CD18 a CDllc/CD18 sa aktívne zúčastňujú na väzbe NK buniek na bunky lymfómu a adenokarcinómu CPatarroyo a ďalší, Immunol. Rev. 114:67 až 108 (1990)], akumulácii granulocytov ĽNourshargh a ďalší, J. Immunol. 142:3193 až 3198 (1989)], úniku plazmy nezávislému od činnosti granulocytov CArfors a ďalší, Blood 69:338 až 340 (1987)], chemotaktickej odpovedi stimulovaných leukocytov CArfors a ďalší, pozri vyššie] a adhézii leukocytov k vaskulárnemu endote'lu CPrice a ďalší, J. Immunol. 139:4174 až 4177 a Smith a ďalší, J. Clxn. Invest. 83:2008 až 2017 (1989)].

Hlavná úloha integrinov pri imunitných a zápalových reakciách Je zrejmá z klinického syndrómu označovaného ako nedostatočnosť adhézie leukocytov C LAD - leukocyte adhesion deficiency), medzi ktorého klinické prejavy patria neustále sa opakujúce bakteriálne infekcie ohrozujúce život. LAD je zapríčinená rôznorodými mutáciami v podjednotke B_a CKishimoto a ďalší. Celí 50:193 až 202 ¢1987)3 a závažnosť chorôb koreluje so stupňom deficiencie v expresii podjednotky Vytvorenie kompletného heterodiméru integrínu je mutáciou v podjednotke sťažené CKishimoto a ďalší, Celí 50:193 až 202 ¢1987)3.

Je zaujímavé, že prinajmenšom u jednej protilátky špecificky namierenej proti D18 bolo dokázané, že in vitro inhibuje tvorbu syncýcií spôsobenou vírusom ľudskej imunodeficiencle typu 1 ¢810--1), aj keď presný mechanizmus tejto inhibície je nejasný CHlldreth a Orentas, Science 244:1075 až 1078 ¢1989)3. Toto pozorovanie je v súlade s objavom, že hlavný receptor pre CDlla/CD18, ktorým je ICAH-1, je takisto povrchovým receptorom pre veľkú skupinu rinovírusov EGreve a ďalší, Ce'll 56:839 ¢1989)3.

Význam väzbovej aktivity integrínu b-, pri imunitnej a zápalovej reakcii u ľudí. podčiarkuje nevyhnutnosť dosiahnutia dokonalejšieho poznania tejto triedy povrchových proteínov. Identifikácia doteraz neznámych členov tejto subpopulácie, ako aj ich zodpovedajúcich receptorov a produkcia monoklonálnych protilátok alebo iných rozpustných látok, ktoré môžu pozmeniť biologickú aktivitu integrinov b_ä, poskytnú prostriedky Využiteľné v praxi) pre terapeutickú intervenciu pri imunitných a zápalových odpovediach zviazaných s integrínmi b_;í .

Podstata vynálezu

Jedna stránka vynálezu popisuje novo purifikované a izolované polynukleotidy ¢napríklad DNA a RNA transkrlpty, ako kódujúce tak antikódujúce vlákna) kódujúce novú d podjednotku ľudského Integrínu b-₂, označovanú oŕ_d a jej varianty ¢ napríklad delečné, adičné alebo substitučné analógy). ktoré majú väzbové a/alebo imunologické vlastnosti vlastné podjednotke oŕ_d. Vo výhodnej realizácii vynálezu patria medzi tieto molekuly DNA. genómová DNA, cDNA a úplne alebo čiastočne syntetizované molekuly DNA. V súčasnosti sa ako najvýhodnejší polynukleotid javí molekula DNA, ako je zobrazená v SEK. ID. č.: 1, kódujúca polypeptid so sekvenciou SEK. ID. č.t 2. Vynález takisto popisuje konštrukciu rekombinantných plazmidových a vírusových konštruktov DNA (expresívne konštrukty), ktoré obsahujú kódujúcu sekvenciu pre pričom táto sekvencia kódujúca && je funkčne pripojená k homológnemu alebo heterológnemu regulačnému prvku/prvkom transkripcie.

Vynález takisto popisuje polynukleotidy izolované z myší a laboratórnych potkanov, ktoré vykazujú homológiu k polynukleotidom kódu júcim ľudský aŕ_d. Vo výhodne j realizácii ide o polynukleotid získaný z myší, zobrazený v SEK. ID. č.: 52 a o polynukleotid získaný z laboratórnych potkanov zobrazený v SEK. ID. č.: 54.

Iná stránka vynálezu sa týka prokaryotických a eukaryotických hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných sekvenciami DNA podľa vynálezu, ktoré na svojom povrchu exprimujú polypeptid cŕ_d alebo nejaké jeho varianty. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú veľmi užitočné pre produkciu veľkých množstiev polypeptidu 8_<:1, ktorý môže byt izolovaný buď zo samostatnej hostiteľskej bunky alebo z média, v ktorom sú tieto bunky kultivované. Hostiteľské bunky exprlmujúce polypeptid cŕ_d na extracelulárnej strane membrány môžu byť takisto použité ako imunogény pri produkcii protilátok špecificky namierených proti oc,;, . Vo výhodne j realizácii vynálezu budú hostiteľské bunky transfekované DNA kódujúcou oŕ_td kotransfekované DNA kódujúcou pod jednotku a-_;>, aby boli na ich povrchu umožnené expr esie tohoto heterodiméru.

Vynález sa takisto týka purifikovaných a polypeptidov, ich fragmentov a rôznych variánt.

izolovaných Vo výhodnej realizácii vynálezu sú polypeptidy oe_d polypeptidy so sekvenciou znázornenou ako SEK. ID. č. s 2. Nové produkty aí_cí podlá vynálezu môžu byt izolované z prirodzených zdrojov, ale vo výhodnej realizácii sú, spolu s produktmi rôznych variánt produkované s využitím rekombinantných postupov, v ktorých sú využité hostiteľské bunky podlá vynálezu. Pri použití rôznych hostiteľských buniek a/alebo špecifickým spracovaním po izolácii, môžu byt pripravené úplne glykozylované, čiastočne glykozylované a úplne deglykozylované formy polypeptldu o:_d. Medzi varianty polypeptidov oŕ_d podľa vynálezu patria vo vode rozpustné a vo vode nerozpustné polypeptidy </_d, vrátane ich analégov, v ktorých je jedna alebo viac aminokyselín odstránená alebo nahradená: (1) bez straty,a vo výhodnej realizácii, s posilnením jednej alebo viacerých biologických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre ; alebo (2) pri špecifickom zablokovaní určitého druhu väzby llgand/receptor alebo pri zablokovaní signalizačnej funkcie. Vynález takisto popisuje fúzne polypeptidy, v ktorých sú aminokyselinové sekvencie z polypeptidu oŕ_<=1 exprimované v návážnosti na aminokyselinové sekvencie z iných polypeptidov. Takéto fúzne polypeptidy môžu mat, v porovnaní s polypeptidom oŕ_d divokého typu, pozmenené biologické, biochemické a/alebo imunologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu patria analógy polypeptidov obsahujúce navyše aminokysellnový zvyšok (napríklad lyzín alebo cysteín), ktorý uľahčuje tvorbu multlmérov.

Vynález sa takisto týka polypeptidov a molekúl s nepeptidovou povahou, ktoré špecificky viažu rf_d. Medzi výhodné molekuly, ktoré viažu </,_d, patria protilátky (napríklad monoklonálne a polyklonálne protilátky), receptory (napríklad ich rozpustné formy alebo formy asociované s membránou) a iné ligandy (napríklad prirodzene sa vyskytujúce alebo umelo pripravené molekuly) vrátane molekúl, ktoré sa za prítomnosti monoklonálnych protilátok namierených proti a/alebo špecifických receptorov pre oŕ_d, kompetitívne viažu na oc_d . Molekuly, ktoré sa viažu na rt_d, môžu byt použité pri purifikácii polypeptidov oŕ_d a identifikácii typov buniek exprimu júcich <x_d. Molekuly, ktoré sa viažu na a:_d, môžu byt takisto použité s cieľom modulácie Cto znamená inhibí.cie, blokovania alebo stimulácie) väzbových aktivít polypeptidov oc_d C in vivo) a/alebo s cieľom modulácie pr enosu signálov uskutočňovaných prostredníctvom oí_d.

Vynález i d e n t i f i k á c i u využívajúcich ktorých je takisto molekúl väzbu väzba popisuje viažúcich imobilizovaného ledovaná v stanovenie slúžiace na oŕc, vrátane stanovení ligandu, stanovení, pri roztoku, SPA Cseintillation využívajúcich priblíženie proximity assay - stanovení rádioaktívnej značky k fluorofóru a potom monitorovanie svetla emitovaného fluroforom), stanovení, pri ktorých sú použité dve hybridné molekuly a podobne.

Medzi in vitro stanovenia slúžiace na identifikáciu protilátok alebo iných zlúčenín, ktoré modulujú aktivitu polypeptidu <z_d, môže patril napríklad imobilizácla polypeptidu oc_dalebo imobilizácla prirodzeného ligandu, ku ktorému sa o!_d viaže, detegovatelné značenie neimobilizovaného väzbového par tnera, spoločná inkubácia väzbových partnerov a stanovenie vplyvu testovanej zlúčeniny na množstvo naviazanej značky, pričom zníženie množstva naviazanej značky za prítomnosti testovanej zlúčeniny C v porovnaní s množstvom značky naviazane j bez prítomnosti testovanej zlúčeniny) naznačuje, že testovaná látka je inhibítorom väzby na oc_d.

Iným typom stanovenia použiteľným na identifikáciu zlúčení, ktoré modulujú interakciu medzi o<_d a jeho ligandom, je stanovenie, pri. ktorom je polypeptid alebo jeho fragment imobilizovaný na povrchu pevného nosiča potiahnutého C alebo napusteného) fluorescenčným agens a ligand je označený zlúčeninou schopnou excitovat uvedené fluorescenčné agens. Pri tomto stanovení dôjde, za prítomnosti alebo neprítomnosti domnelého modulátora, ku kontaktu imobilizovaného polypeptidu oŕ_(J so značeným ligandom a potom je delegované svetlo emitované prostredníctvom fluorescenčného agens a sú identifikované zlúčeniny s modulačnými vlastnosťami. Ako zlúčeniny s modulačnými vlastnosťami sú uvažované tie zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú emisiu svetla sprostredkovanú fluorescenčným agens v porovnaní, s emisiou svetla sprostredkovanou fluorescenčným agens v neprítomnosti modulačnej zlúčeniny. Inou možnosťou Je imobilizácia ligandu pre oí_d a označenie polypeptidu .

Ďalšou metódou patriacou do rozsahu vynálezu a slúžiacou na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú interakciu medzi a Jeho ligandom.

je alebo transfekcia vhodných hostiteľských buniek nejakým konštruktom DNA nesúcim reportérový gén pod kontrolou skladajúcim sa z n á s 1 e d n á e x p r e s i a kódujúcej promótora, regulovaný transkripčným faktorom aktivačnej domény, prvej sekvencie DNA časť alebo celý domény viažúcej DNA a C v hostiteľskej bunke) prvý fúzny protein obsahujúci poly pep t id d,* spolu s doménou viažúcou DNA alebo aktivačnú doménu a expresia druhej hybridnej DNA kódujúcej druhý fúzny protein s obsahom časti alebo celého ligandu pre c/,., a spolu s doménou viažúcou DNA alebo aktlvačnou doménou transkripčného faktora, ktoré nie sú inkorporované v prvom fúznom proteíne. Ďalej je potom vyhodnotený vplyv domnelej modulačnej zlúčeniny na interakciu medzi θ',,, a Jeho ligandom. Tento vplyv je sledovaný detekciou väzby ligandu na v danej hostiteľskej bunke tak, že je v danej hostitelskéj bunke stanovovaná tvorba produktu reportérového génu za prítomnosti alebo neprítomnosti domnelého modulátora, a ako modulačné zlúčeniny sú identifikované tie zlúčeniny, ktoré pozmieňajú tvorbu produktu reportérového génu v porovnaní, s tvorbou produktu repor térového modulačnej zlúčeniny. Pri tomto stanovení, používané promótor lexA, doména viažúca zodpovedajúcou lexA, transaktivačná doména GAL4, reportérový gén lacZ a ako hostitelské bunky kvasinky.

génu v neprítomnosti sú v dnes s výhodou DNA so sekvenciou

Pri izolácii polynukleotidu kódujúceho protein, ktorý sa viaže na d,^, môže byť použitá upravená verzia vyššie uvedeného stanovenia. Pri tejto modifikovanej verzii sú vhodné hostitelské bunky transformované alebo transfekované konštruktom DNA nesúcim reportérový gén pod kontrolou promótora regulovaného transkripčriým faktorom zloženým z domény viažucej DNA a aktivačnej domény. Nasleduje expresia C v hostiteľskej bunke) prvej sekvencie DNA kódujúcej prvý fúzny proteín obsahujúci časť alebo celý polypeptid oí_d spolu s doménou viažúcou DNA alebo nejakou aktivačnou doménou uvedeného transkripčného faktora a expresia faktora knižnice druhej hybridnej DNA kódujúcej druhý fúzny proteín obsahujúci časť alebo celý polypeptid, u ktorého existuje predpoklad väzby na od_d a spolu s doménou viažúcou DNA alebo aktivačnou doménou transkripčného faktora, ktoré nie sú inkorporované v prvom fúznom proteíne. Ďalej je potom vyhodnotený vplyv domnelej modulačnej zlúčeniny na interakciu medzi a jeho ligandom. Tento vplyv je sledovaný detekciou väzby proteínu viažúceho ď_d na v danej hostiteľskej bunke, že je v danej hostiteľskej bunke delegovaná tvorba produktu reportérového génu. Nakoniec je z príslušnej hostiteľskej bunky izolovaná druhá hybridná sekvencia DNA kódu júca proteín viažúci .

Vynález sa takisto týka hybridómov produkujúcich protilátky špecificky namierené proti . V súčasností sú veľmi dobre známe techniky slúžiace na produkciu hybridómov, ktoré sekretujú monoklonálne protilátky. Bunkové línie hybridómov môžu byt vytvorené imunizáciou nejakého živočícha prostredníctvom purifikovaného variánt polypeptidu alebo buniek, ktoré na svojom extracelulárneho povrchu exprimujú polypeptid alebo jeho varianty. Medzi imunogénne bunkové typy patria bunky, ktoré exprimujú od_<d in vivo, alebo transf ekované bunkové línie eukaryotických alebo prokaryotických buniek, ktoré pri normálnych okolnostiach in vivo polypeptid neexprimujú. Vo výhodnej realizácii. sú uprednostňované sekretované hybridómami označovanými 169A, 169B, 170D, 170F, 170E, 170X, 170H, 188A, 188B, 188C, 188E, 188F, 188G, 1881, 1881, 188K, 18L, 1881*1, 188N, 188P, 188R, 1881, 195A, 1.95C, 195D, 195E, 195H, 197A-1, 197A-2, 197A-3, 197A-4, 199A, 199H a 1991*1.

Hodnota informácií poskytnutých odhalením sekvencií DNA kódujúcich oí,_d a aminokyselinových sekvencií <y_d je zrejmá. Sekvencia cDNA kódujúca cí,_d, uvedená v jednej sérii príkladov umožňuje izoláciu prvkov riadiacich alebo potkanov) .

DNA pre cŕ_c, z š t a n d a r d n ý c h t e c h n í k sekvencie genómovej DNA kódujúcej cc,,,, vrátane transkripciu tejto génovej sekvencie. Vynález sa takisto týka možnosti identifikácie alelických variánt DNA kódujúcich a:,-, a DNA kódujúcej cŕ_d z iných druhov (napríklad myši Izolácia ľudskej genómovej DNA kódujúcej a iných druhov, môže byt uskutočnená pomocou hybridizácie DNA/RNA, uskutočňovanej pri vhodných podmienkach, pri použití časti alebo celej sekvencie cDNA pre o:_t:i (táto sekvencia cDNA pre ot,_d je použitá ako sonda pre testovanie (screening) vhodnej knižnice). Inou možnosťou použiteľnou pre amplifikáciu a identifikáciu sekvencii genómovej DNA kódujúcej oe,_:;l je využitie polymerázovej retazcovej reakcie (PĽR), pri ktorej sú ako priméry použité oligonukleotidy vytvorené na základe známej sekvencie cDNA. Pomocou konvenčných metód syntézy môže byt pripravená syntetická DNA kódujúca polypeptid Qŕ_d, vrátane jeho fragmentov a rôznych variánt.

Informácie o sekvencii DNA podľa vynálezu takisto umožňujú vytvoriť, prostredníctvom prístupu využívajúceho rekombinantné techniky alebo stratégie knockoutovania génov Ľ pozri napríklad Kapecchi, Science 244x1288 až 1292 (2989)3, hlodavce, ktoré nie sú schopné exprimovať funkčný polypeptid cy._d, alebo ktoré exprimujú nejakú z variánt polypeptidu . Tieto hlodavce môžu slúžiť ako vhodný model, pre štúdium aktivít polypeptidu oí_d a modulátorov polypeptidu a:,.., in vivo.

Sekvencie DNA a aminokyselinové sekvencie podľa vynálezu takisto umožňujú uskutočniť analýzu tých epitopov ktoré sa aktívne zúčastňujú na väzbe na receptor, a takisto epitopov, ktoré môžu túto väzbu nejakým spôsobom regulovať, skôr ako sa na nej aktívne zúčastňovať. Vynález takisto zahrnuje možnosť identifikácie epitopov, ktoré sa môžu zúčastňovať na prenose signálov cez membránu.

DNA podía vynálezu je takisto použiteľná na detekciu tých typov buniek, ktoré expr imu jú polypeptid oc_d. Na stanovenie hladiny konštitutívnej transkripcie cč_d v bunkách, ako aj na stanovenie zmien v transkripcii v závislosti od prítomnosti Interných alebo externých látok, môžu byt využité štandardné techniky hybridizácie DNA/RNA, ktoré na detekciu RNA kódujúcej polypeptid využívajú DNA pre Identifikácia látok modifikujúcich transkripciu a/alebo transláciu polypeptidu ot_dmôže byt zasa využitá na stanovenie potenciálnych terapeutických alebo preventívnych účinkov týchto látok. DNA podlá vynálezu takisto umožňuje hybridizáciu DNA pre oc_d a bunkovej RNA in situ, čím je možné urči.t lokalizáciu RNA pre oí_<=, v populácii buniek obsahujúcich viac bunkových typov a v tkanivách.

DNA podľa vynálezu môže byt takisto použitá na identifikáciu polynukleotidových sekvencli z iných organizmov ako z človeka, ktoré vykazujú homológiu k sekvenciám ľudského . Znalost sekvencli DNA pre cŕ_d u iných organizmov ako u ludí umožňuje vytvorenie živočíšnych modelov (vrátane napríklad transgénnych modelov) k ľudskému systému.

Iná stránka vynálezu sa týka monoklonálnych a polyklonálnych protilátok špecificky namierených proti ktoré môžu byt využité pri imunohistochemických analýzach pre lokalizáciu polypeptidu oc_d v bunkových kompartmentoch alebo v jednotlivých bunkách tkanív. Tento typ imunohistochemických stanovení je veľmi výhodne používaný v kombinácii s hybridizáciou in situ, pričom sú lokalizované ako mRNA pre <í_d, tak aj polypeptidový produkt génu pre .

Identifikácia typov buniek, ktoré exprlmujú polypeptid <y_d, môže výrazne pomôcť pri vývoji látok s terapeutickým alebo preventívnym účinkom. Predpokladá sa, že produkty podľa vynálezu, ktoré sú príbuzné oí,_d, môžu byt využité pri liečení chorôb, pri hrajú dôležitú úlohu makrofágy. V množstvo živočíšnych modelov pre s pozmenenou aktivitou makrofágov.

procese chorôb je popísané stavy spojené ktorých v súčasnosti patologlck é Napríklad v publikácii Jutila a ďalší, J. Leukocyte Biol. 54=30 až 39 (1993) je u myší popísané hromadenie makrofágov v miestach ako chronických, tak aj akútnych zápalov. IJ laboratórnych potkanov popisujú Adams a ďalší ĽTransplantation 53:1115 až 1119 C1992) a Transplantation 56:794 až 799 C1993)] model pre artériosklerózu štepu vznikajúcu po transplantácii heterotropných abdominálnych srdcových aloštepov. Rosenfeld a ďalší ĽArteriosclerosis 7:9 až 23 C198 7) a Arteriosclerosis 7:24 až 34 ¢1987)] popisujú indukciu artériosklerózy u králikov kŕmených diétou s prídavkom cholesterolu. Hanenberg a ďalší. L Diabetológia 32:126 až 134 ¢1989)] uvádzajú spontánne rozvinutie inzulíndependentného dlabetes u laboratórnych potkanov BB. Yamada a ďalší ĽGastroenterology 104:759 až 771 ¢1993)1 popisujú u laboratórnych potkanov injikovaných polymérmi peptidoglykáripolysacharid z baktérie Streptococcus výskyt zápalovej choroby čriev a chronickej granulomatóznej kolltídy. Cromartie a ďalší EJ. Exp. Med. 146-.1585 až 1602 ¢1977)] a Schwab a ďalší

CInfection and Immunity 59:4436 až 4442 ¢1991)] uvádzajú, že injekcie proteínov bunkovej steny z baktérie Streptococcus do organizmu laboratórnych potkanov má za následok artritický stav charakterizovaný zápalom periférnych kĺbov a následným poškodením týchto kĺbov. A nakoniec Huitinga a ďalší E Eur. J. Immunol 23-.709 až 715 ¢1993)1 popisu jú u laboratórnych' potkanov Lewis výskyt encefalomyelitídy E ložiskový zápal mozgu a miechy), ktorá Je modelom pre roztrúsenú sklerózu. Pri každom z týchto modelov sú na zmiernenie priebehu chorôb využívané protilátky proti a:_d alebo iné proteíny viažúce polypeptid oŕ_d alebo rozpustné formy polypeptldu oc,. Cieľom tohoto pôsobenia Je pravdepodobne zamedziť aktivácii makrofágov.

Vynález sa takisto týka farmaceutických kompozícií použiteľných pri liečení týchto a iných chorôb. Farmaceutické kompozície sú navrhované tak, aby inhibovali interakcie medzi a Jeho llgandomE dmi). Medzi tieto farmaceutické kompozície patria najrôznejšie rozpustné formy polypeptldu a formy polypeptldu cc._d asociované s membránou E s obsahom celého polypeptldu cť_d alebo Jeho fragmentov, ktoré sa aktívne zúčastňujú pri väzbe polypeptldu cc_trJ), najrôznejšie rozpustné formy proteínov viažúcich oc_d a formy proteínov viažúcich asociované s membránou (vrátane protilátok, ligandov a podobne), intracelulárny a extracelulárny modulátor väzbovej aktivity oŕ_a a/alebo modulátor expresie polypeptidu a/alebo polypeptidu -ligand, vrátane modulátorov transkripcie, translácie, posttranslačných úprav a/alebo intracelulárneho transportu.

Vynález sa takisto týka metód slúžiacich na liečenie chorôb.

pri ktorých lokalizovaná svoju úlohu hrá väzba polypeptidu o;_d alebo akumulácia buniek exprimujúcich polypeptid ac#. V týchto metódach Je pacientovi postihnutému uvedenou chorobou podávaná farmaceutická kompozícia podlá vynálezu v množstve dostačujúcom na ovplyvnenie úrovne väzby polypeptidu alebo v množstve dostačujúcom na ovplyvnenie akumulácie buniek exprimujúcich polypeptid tfa. Tieto metódy liečenia podlá vynálezu sú použiteľné pri chorobách akými sú napríklad, ale nielen, diabetes I. typu, ateroskleróza, roztrúsená skleróza, astma, lupienka, zápal pľúc, syndróm akútnej respiračnej tiesne a reumatická artritída.

Prehlad obrázkov na výkresoch

Množstvo ďalších aspektov a výhod vynálezu bude zrejmejšie, ak sa zoberie do úvahy nasledujúci popis vynálezu, kde sú uvedené aj nasledujúce obrázky, kde:

Na obrázkoch 1A až ID sú znázornené aminokysellnové sekvencie ľudských CDllb CSEK. ID. č.: 3), CDllc (SEK. ID. č.: 4) a C SEK. ID. č.: 2).

Príklady realizácie vynálezu

Vynález Je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi týkajúcimi sa Izolácie klonu DNA kódujúcej polypeptid z knižnice cDNA z ľudskej sleziny. Presnejšie povedané. Príklad 1 ilustruje použitie protilátky proti psiemu ď_TMi pri pokuse detegovat homológny ľudský proteín. Príklad 2 detailnej popisuje purifikáciu psieho polypeptidu «_Tmi a sekvenáciu N-koncovej časti tohoto polypeptidu, aby bolo možné vytvoriť oligonukleotidové priméry použiteľné na ampliflkáclu psieho génu pre oítmi pomocou PCR. Príklad 3 sa týka purifikácie veľkého množstva polypeptidu oítmi z organizmu psas, aby bolo možné určiť, vnútorné sekvencie tohoto polypeptidu a potom pripraviť ďalšie priméry pre PCR. Príklad 4 popisuje použitie printerov komplementárnych k vnútornej sekvencií génu pre oí_tm1 pri amplif ikácil fragmentu génu kódujúceho psí q;··, mi pomocou PCR. Príklad 5 sa týka kionovania sekvencie cDNA kódujúcej ľudský o;,-,. Príklad 6 popisuje analýzu expresie mRNA kódujúcej oí_cJ v ľudských tkanivách a bunkách, uskutočňovanú metódou Northern blot. Príklad '7 detailne popisuje konštrukciu expresívnych plazmidov obsahujúcich sekvenoiu kódujúcu ľudský oí_tľ, a transfekciu buniek CCJS týmito plazmldmi. Príklad 8 sa týka analýzy expresie polypeptidu oí_tJv transfekovaných bunkách C(JS uskutočňovanej metódou ELISA. Príklad 9 popisuje analýzu buniek COS transfekovaných expresívnymi plazmldmi obsahujúcimi sekvenoiu kódujúcu ľudský u s k u t o č ň o v a n ú p o m o c o u F A C S C F1 u o r e s c e o c e A c t i v a t e d C e 11. S o r t e r ) . Príklad 10 sa týka imunoprecipitácie polypeptidu CD18 asociovaného s v k o t r ansf ekovaných bunkách CDS.

Príklad 11 č í o s k e h o o h r č k a o L) s a h u j ú c e h o s e k v e n o i u k ó d u j ú c u popisuje stabilnú transfekciu buniek ovárií C C H O b u o k y ) pomoeou expresívneho k onštruk tu

O<, ’ríklad 12 sa týka väzby polypeptidu o<_t-, C závisle j od prítomnosti polypeptidu CD18) na intercelulárnu adhezívnu molekulu ICAIJ-R, mutantný proteín 1CAIJ -R a molekulu komplementu iC3b. Príklad '13 popisu je techniku SPA slúžiacu na identifikáciu inhibítorov alebo pošilňovačov C to znamená modulátorov) väzbových oŕ_d/anti-ligand pre «c,. Príklad interakcií llgandov pre

P o p i s u j e k o n š t r u k c i u expresívnych plazmidov, ktoré kódujú rozpustné formy polypeptidu expresie. Príklad '15 sa týka a monoklonáiných protilátok Príklad 16 popisuje použitie c/..., a väzbové analýzy produktov P r o d u k c i e p o 1 y k 1 o n á 1 n y c h s é r špecificky namierených proti oc,.

po’lyklonáloeho séra namiereného prot oí_d pri analýze tkanivovej distribúcie polypeptidu oí_d, expresie c/,,, na povrchu leukocytov periférneho krvného obehu a expresie polypeptidu </,_;i v zápalovej a nezápalovej synovi! Cklbna mazotvorná blana). Príklad 17 popisuje izoláciu sekvencii cDNA, ktoré vykazujú homológiu k sekvenciám ľudského génu pre z organizmu laboratórnych potkanov.

Príklad 18 sa týka konštrukcie expresívnych plazmidov kódujúcich celý polypeptid or_a, expresívnych plazmidov kódujúcich doménu 1 polypeptidu a:,-,, vrátane fúznych proteínov domény i/IgG a produkcie monoklonálnych protilátok proti celému polypeptidu a fúznyin proteínom obsahujúcim doménu I. Príklad '19 sa týka izolácie sekvencii cDNA, ktoré vykazujú homológiu k sekvenciám ľ u d s k é h o g é n u p r e z o r g a n i zrnu myš i. F’ r í k 1 a d 2 0 p o p i s u j e ďalšiu izoláciu l< lono v cDNA kódujúcich ο;,-, použitých na potvrdenie výsledkov sekvenčnej analýzy. Príklad 21 sa týka hybridizačných analýz uskutočňovaných in situ v rôznych myšacích tkanivách, ktoré slúžia na stanovenie špecificlty a bunkovej expresie predpokladaného myšacieho homológu ľudského oí_<rj. Príklad 22 popisuje konštrukciu expresívnych konštruktov, ktoré kódujú predpokladaný myšací homológ ľudského . Príklad 23 sa týkai vytvorenia ''knockoutovane j myši, u ktorej je rozrušený gén kódujúci predpokladaný myšací homológ ľudského oí_d. Príklad 24 sa týka izolácie sekvencii cDNA, ktoré vykazujú homológiu ku kódujúcim sekvenciám ľudského génu pre «y,-,, z organizmu králikov. Príklad 25 popisuje živočíšny model choroby človeka, v ktorom sú stanovované možnosti modulácie oŕ_d. Príklad 26 popisuje expresiu polypeptidu ¢/.-, u živočíšneho modelu choroby.

Príklad 1

Pokus delegovať ľudský homológ psieho polypeptidu oc_TMj.

S cieľom pokúsiť. sa identifikovať ľudský homológ psieho polypeptidu d_TMi bola na ľudských leukocytoch periférneho krvného obehu testovaná krížová reaktivita monoklonáInej protilátky Call.8H2 špecificky namierenej proti psiemu oí_TM1 Iľ Hoore a ďalší, pozri vyššie ľl . Bunky (obvykle 1 x IO'⁵’ buniek) boli n sa ľade za prítomnosti 0, 1% azidu sodného inkubované s nariedeným supernatantom získaným po kultivácii hybridómov alebo s purifikovanou kontrolnou myšacou protilátkou IgG-negatívnou (10 ug/ml). Väzba monoklonálnej protilátky bola delegovaná následnou inkubáciou konskou protilátkou (s koncentráciou 6 ug/ml) namierenou proti myšacím XgG konjugovaňou s FITC (Vector 10 Laboratories, Burlingame, CA). Označené bunky boli vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom CPBS) fixované pomocou 2 / w/v paraformaldehydu a potom analyzované pri použití prístroja FACS Facstar Plus (Becton Dickinson, ľlountain View, CA). Pri obvyklej realizácii bolo s využitím logaritmického zosilnenia intenzity fluorescencie analyzovaných 10 000 buniek.

Z í s k a n é v ý s 1 e d k y n a z n a č u j ú, í e p r o t i I á L k a C a 11.8 H 2 n e r e a g u j e krížovo s povrchovými proteínmi exprlmovanými na povrchu ľudských leukocytov periférneho krvného obehu, zatiaľ čo v podstate všetky kontrolné bunky, ktorými p e r i f é r n e h o l< r v n é h o o h e h u, exprimovall.

sú neoplastické P o 1 y p e p t i d di-ι j.

psie lymfocyty n a s v o jom p ovr chu

P r e t o ž e m on o k1onáina pro ti1átk a Ca11.8H2 špec ifick y namierená proti psej podjednotke d nereagovala krížovo s nejakým ľudským homológom tejto podjednotky, bola nevyhnutným predpokladom izolácia príslušného ludského náprotivku DNA kódujúcej psí oŕ-ri-ix (ak však tento ludský náprotivok existuje) izolácia uvedenej DNA kódu júcej psi ·

Príklad 2

Afinltná puriflkácia psieho polypeptidu s e k v e n o v a n 1 e M - k o n c o v e j o b 1 a s t i použitého na

S cieľom stanovenia N—koncovéj sekvencie hol afinitne purifikovaný psi polypeptid oí-_rM1 a získaná aminokyselinová sekvencia bola použitá pri návrhu oligonukleotidovej sondy alebo P r im é r u. Str učne povedané, moook1oná1na proti1átk a Ca11.8H2 namierená proti polypeptidu </tmi , bola naviazaná na chromátografický nosič Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) a požadovaný proteín bol izolovaný pomocou špecifickej Interakcie protilátka-proteín. Protilátka bola na nosič konjugovaná postupom doporučeným firmou BioRad a výsledná koncentrácia bola 5 mg protilátka na ml nosiča. F’o konjugácii bol. prebytok protilátky odstránený a nosič bol zablokovaný pomocou trojnásobného objemu 0,11*1 etanolamínu. Nosič bol potom premytý fyziologickým roztokom pufrovaným f osf átovým pufrom (PBS) s objemom zodpovedajúcim tridsiatim objemom kolóny.

V 250 ml. pufra obsahujúceho 0, 32 1*1 sacharózu v 25 ml*l Trls-HCI, pH 8, 0, s inhibítormi proteáz, bolo homogenizovaných 25 gramov sleziny získanej z jedného psa. Bunkové „jadrá a celé bunky boli odstránené centrifugáciou uskutočňovanou pri 1000xg počas 15 minút. Membrány boli od supernatantu oddelené centrifugáciou pri 100 OOOxg počas 30 minút. Takto získaná peleta tvorená membránami bola rozsuspendovaná v 200 ml. lyzačného pufra (50 mM NaCl, 50 mM sol kyseliny boritej, pH 8,0, spolu s 2 X NP-40) a počas 1 hodiny

Inkubovaná na lade. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 100 OOOxg počas 60 minút. Desať mililitrov číreho lyzátu bolo spolu s 0, 5 ml. nosiča A f f igel 10 s k o i ί j u <3 o v a n o u p r o t i 1 á t k o u C a 11.8 H 2 C p o zri v y Č š i e ) p r e n e s e n ý c h d o polypropylénovej skúmavky s objemom 15 ml. Táto skúmavka bola pri stálom miešaní inkubovaná cez noc pri 4 premytý päťdeslatnásobným množstvom D-PBS.

prenesený do mi k r o cent ríf ugaČne ...i skúmavky a počas 10 minút varený za prítomnosti 1 ml Laemliovho vzorkového pufra (neredukujúci) so zložením 0, 1 M Tris-HCl, pH 6, 8, 2. X SDS, 20 % glycerol a 0, 002 % brómfenolová meď. Nosič bol. potom odstránený centrif ugáciou; k supernatantu bola pridaná 1/1.5 objemu B-merkaptoetaoolu (Sigma, a vzorka bola podrobená elektroforéze na 7 X géle. Rozdelené proteíny boli. prenesené na °C a nosič bol. potom Potom bol. tento nosič

St. I...oui s, MO)

P o1y ak r y1am1d o v om membránu Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) nasledujúcim spôsobom.

Gély boli raz premyté deionizovanou vodou filtrovanou cez membránu Millipore a potom počas 15 až 30 minút ekvillbrované v transferovom pufri so zložením 10 mM kysel ina 3 IZ cyklohexylaminol-í-propánsul.fónová CCAPS), pil 10,5 s 10 X metanolom. Membrány Immobilon boli navlhčené metanolom, premyté filtrovanou vodou a počas 15 až 30 minút ekvillbrované v transferovom pufri

CAPS. Začiatočný prenos bol uskutočňovaný pri použití prístroja pre Western Blát firmy BioRad pri 70 voltoch počas 3 hodín.

Membrány Immobilon boli potom z prístroja vybrané a počas 10 minút zafarbené 0,1% roztokom Coomasie R250. Potom boli membrány v troch cykloch po desiatich minútach odfarbené zmesou 50 % metanol/10 % kyselina octová. Po odfarbení boli membrány premyté filtrovanou vodou a vysušené na vzduchu.

Boli delegované prúžky proteínov so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 150 kD, 95 kD, 50 kD a 30 kD. Prúžky so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 50 l< D a 30 k D vznikli pravdepodobne v dôsledku kontaminácie protilátkou. Ako pre prúžok zodpovedajúceho proteínu s molekulovou hmotnosťou 150 kD, tak aj pre prúžok zodpovedajúci proteínu s zdanlivou molekulovou hmotnosťou 95 kD bol uskutočnený pokus určiť N-koncovú sekvenciu, avšak proteín so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 95 l<D bol blokovaný, takže túto sekvenciu nebolo možné určiť, molekulovou hmotnosťou '159 k D

Prúžok bol z proteínu membrány so zdanlivou vystrihnutý a pomocou proteínového sekvenátora Applied Biosystems (Foster City, CA) model 472A priamo sekvenovaný postupom podlá vynálezu. Získaná aminokyselinová sekvencia je pri použití jednopísmenového aminokyselinového kódu znázornená ako SEK. ID. č.: 5-.

FNLDCEEPMýFO (SEK. ID. č.: 5)

Táto identifikovaná sekvencia obsahuje sekvenciu FLDN charakteristickú pre podjednotky rodiny in t e gr í no v ĽTamura a ďalší, J. Celí. Blol. 111:1593 až 1604 <1990)3.

Vytvorenie prímérov a pokus o amplifíkáciu sekvencií kódujúcich psí rtTi-ii

S využitím získanej informácie o N-koncovej sekvencií boli s cieľom hybridizácie navrhnuté tri oligonukleotldové sondy; a) ’ Γ o m m e r'' - ú p 1 n e d e g e n e r o v a n ý o 1 i g o n u k 1 e o t i d ; b ) '' P a t m e r --čiastočne degenerovaný ollgoriukleotid; a c)

Guessmer

2.0 nedegenerovaný oligoriukleotid so sekvenciou založenou na kodónoch používaných u cicavcov. Tieto sondy sú znázornené nižšie ako SEK.

Symboly v sekvenciách nukleových kyselín

ID. č. = 6, 7 a 8.

použité vo všetkých nukleotidových zodpovedajú §1,882 37 C. R. F.

sekvenciácl vynálezu (SEK. ID. š.: h)

- -TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3’ (SEK. ID.

7) (SEK. ID. é.: 8)

Pri použití týchto oligonukleotidov (vytvorených na základe dát získaných sekvenáciou polypeptidu) neboli pri niekoľkých h y b r í d i z a š n ý c h a n a 1 ý z a c h, p r i p o dm i e n k a c h um o žň u j ú c i c h hybridizáciu nedokonale komplementárnych sekvencii, v knižnici cDNA získanej z psích makrofágov periférneho krvného obehu/slezinných buniek zaklonovanej do lambdaZAP (Stratagene, La J o 11 a, C A ) , d e t e g o v a n é p r í s 1 u š n é k 1 o o y .

Potom holi na základe odhadnutej sekvencie N-konca polypeptidu vytvorené štyri oligonukleotidové priméry označované

5’ Deg, 5' Spec

3’Deg a 3'Spec (ako sú zobrazené v SEK. ID. č.=

9,10, 11 a 12, kde Deg označuje degenerovanú sekvenciu a Spec nedegenerovanú sekvenciu). S týmito oligonukleotidovými primérml hol. uskutočnený pokus o amplifikáciu (pomocou PCR) sekvencii kódujúcich psí oí-_rMX z DNA fágovej knižnice purifikovanej z lyzátov knižnice firmy Stratagene popísanej vyššie.

TYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3’

5--TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3' (SEK. ID. č.: 9) (SEK. ID. č.: 10)

GRAANACCATNGGYTC-3' (SEK. ID. č.: 11)

5' -TTGGAAGACCATNGGYTC-3' (SEK. ID. č.= 12)

Ollgonukleotidové prlméry pre amplifikáciu oí_Tmi boli. použité v dvojiciach s primármi komplementárnymi k sekvencii vektora označenými T3 a T7 znázornenými v SEK. ID. é.: 13 CT3) a 14 (17), ktoré hybridizujú so sekvenciami ohraničujúcimi oblasť polylinkéra fágmidu Bluescript nachádzajúcom sa v lambdaZAP.

:>' -ATTAACCCTCACTAAAG · -3'

3' -AATACGACTCACTATAG-3' (SEK. ID. č.: 13) (SEK. ID. č.= 14)

Amplifikácia metódou PCR bola uskutočnená v pufri ľag (Boehringer Nannheim, Indlanapolis, IN) obsahujúcom horečnaté ióny, pri použití 150 ng knižnice DNA, 1 j.ig jednotlivého priméru, 200 každého z dNTP a 2,5 jednotky polymerázy Taq (Boehringer Nannheim). Produkty POP reakcie boli separované elektroforézou na IX agarózovom géle v pufri Tris-äcetát-EDTA (TAE) s prídavkom etldium bromidu s koncentráciou 0,25 ug/ml. DNA bola metódou

S S F Ľ . P o p r e n e: s e n í d e n a t u r o v a n á p ô s o b e n im kapilárneho prenosu prenesená na membránu Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Transfer bol uskutočnený cez noc v 10x na membránu bola imobilizovaná DNA 0, 5 1*1 NaOH s 0, 6 1*1 NaCI, neutralizovaná

1, 0 1*1 Tris-HCI, pH 8, 0, v 1, 5 1*1 NaCI a pred zosieťovaním pomocou 0V žiarenia uskutočňovaným na pristrojí Stratalinker (Stratagene) premytá 2.x SPE. Pri stálom trepaní, bola membr án pri 50 °C Inkubovaná počas 2 hodin v prehybridizačnom pufri (5x SSPE, 4x

Denharclts, 0, 8 X SDS, 30 X formamid) .

Pri použití pufra pre kinázu firmy'Boehringer Nannheim so 100 až 300 u C i τΡ^3:2-άΑΤΡ a 1 až 3 jednotiek polynukleotid kinázy b o 1 i o 1 i g o n u k 1 e o t i d ové s o n d y 5' D e g, 5' S p e s, 3' D e g a 3 ’ S r> e c (SEK.

ID. č.t 9, 10, 11 a 12) rádioaktívne označené. Značenie prebiehalo 1 až 3 hodiny pri 37 °C. Nezaínkorpárovaná rádioaktívna značka bola odstránená cbromatografiou na kolóne Sephadexu G-25 fine (Pharmacia, Plscataway, N J) pri použití, pufra so zložením 10 mľl Tris-HCI, pH 8,0, 1 mN EDTA (TE) a pretečená frakcia bola priamo pridaná k prehybridizačnému roztoku. Hybridizácia s rádioaktívnou sondou prebiehala pri 42 ^raC počas 16

Hodín pri stálom trepaní. Nakoniec, boli membrány premývané pri 50 °C počas 15 minút roztokom lx SSPE/O, 1 °A SDS. Membrány boli potom pri -80 °C počas 1 až 4 Hodín exponované na film Kodak X-11m a t A R.

Oligonukleotid 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg a 3'Spec hybridizovali len s produktmi tých PCR reakcií, pri ktorých boli použité ako priméry, a nehybridizovali, ako sa očakávalo s produktmi PCR reakcií, pri ktorých ako priméry použité neboli. Usúdilo sa teda, že žiadny z produktov reakcie PCR nie je špecifický pre pretože ani jeden z produktov nehybiridizoval s všetkými použitými sondami.

Príklad 3

F³ u r i f i k á c 1 a v e 1 k é h o m n o ž s t v a uskutočňovaná s cielom určenia polypeptidu cŕ-n-ii z. organizmu psa v n ú t o r n e j s e k v e n c 1 e p o 1 y p e p t i d u

Aby bolo možné získat ďalšiu aminokyselinovú sekvenciu použiteľnú pre vytvorenie prlmérov, bol s cielom určenia vnútornej sekvencie polypeptidu purlfikovaný psí. polypeptid oítmi · Na purifikáciu proteínu použiteľného na určenie vnútornej sekvencie boli použité tri kusy zmrazenej sleziny (každá s hmotnosťou približne 50 g) a zmrazené bunky získané z dvoch slezín dospelých psov. V 200 až 300 ml borátového pufra bolo v miešacom zariadení Waring H o m o g e n i z o v a n ý m a t e r i á 1 b o J.

homogenizovaných 50 g sleziny. zriedený rovnakým objemom pufra obsahujúcim 4% NP-40 a zmes bola ľahko trepaná prinajmenšom jednu hodinu. Väčšie kusy boli z lyzátu odstránené centrífugáciou pri 2 OOOxg počas 20 minút a supernatant bol preflitrováný buď cez filter Corning (Corning, NY) alebo cez filtračný systém Corning s membránou s veľkosťou pórov 0,8 mikrónov. Lyzát bol potom prečistený filtráciou cez filtračný systém Corning s membránou s veľkosťou pórov 0,4 mikrónov.

Lyzát zo sleziny a nosič protilátkou (popísaný v Príklade 2.) v alikvótach s objemom 100 ml a pri

Affigel 10 s konjugovanou boli zmiešané v pomere 150:1 stálom trepaní inkubované cez noc pri 4 °C. Lyzát bol potom odstránený centrifugáciou uskutočňovanou pri 1 OOOxg počas 10 minút, zmiešaný s ďalším alikvótom nosiča Affigel 10 s konjugovanou protilátkou a inkubovaný cez noc pri podmienkach uvedených vyššie. Alikvóty nosiča s naviazaným proteínom boli potom spojené a premyté SO-násobným objemom pufra D-PBS/O, 1 % Tween 20 a nosič bol umiestený na kolónu BioRad s objemom 50 ml. Naviazaný proteín bol z nosiča eluovaný 3 až. 5 násobným objemom 0,1 1*1 gly cínu C pH 2,5); boli zozbierané frakcie s objemami 900 i_il a tieto frakcie boli neutralizované pomocou 100 j_il puf r a 11*1 Tris, pH 8,0. Z každej frakcie bol odobraný alikvót s objemom 15 j_tl a tento alikvót bol povarený s rovnakým objemom 2.x Laemmliovho vzorkového pufra s 1/15 objemu 11*1 ditiotreitolu (DTT). Tieto vzorky boli analyzované elektroforézou na 8% polyakrylamidovom géle Novex CSan Diego, CA) a vizualizované: farbením Coomasie alebo striebrom pri použití Dalíchiovho kitu (Enprotech, Natick, l*IA), postupom popísaným výrobcom. Frakcie obsahujúce najväčšie množstvo proteínu boli zmiešané: a skoncentrované vo vákuu. Zvyšný roztok bol zriedený na polovicu redukujúcim Laemmliovým vzorkovým pufrom a elektroforeticky rozdelený na 7% polyakrylamidovom géle s hrúbkou 1,5 mm v pufri Tris-glycín/SDS. Po elektroforéze boli proteíny pri použití prístroja pre Western Blot firmy Hoefer prenesený z gélu na membránu Immobilom postupom popísaným v Príklade 2.

Prúžky proteínov s veľkosťou zodpovedajúcou ač-i-_Mi boli z 10 membrán P ú Dl- vyrezané; celkový obsah proteínu bol približne 47 ug. Tieto vyrezané prúžky boli odfarbené v 4 ml 50% metanolu (5 minút), vysušené na vzduchu a rozrezená na kúsky s veľkosťou 1x2 leto kúsky membrán boli pri 4 °C na 30 minút ponorené do 2 ml 95% acetónu, občas vor texované nakoniec vysušené: na vzduchu.

P r e d v 1 a s t n ý m p r o t e o .1. y t i c k ý m š t i e p e n í m p r o t e í n u n a v i a z a n é h o na membránu boli v 1, 5 ml 70% kyseliny mravčej rozpustené 3 mg brómkyanu (CNBr) (Pierce, Rockford, ÍL). Tento roztok bol pridaný do skúmavky obsahujúcej kúsky membrány PVDF a skúmavka bola inkubovaná počas 24 hodín pri izbovej teplote v tme. Supernatant C SI) bol potom prenesený do inej skúmavky a kúsky membrány boli premyté 0,25 ml '70% kyseliny mravčej. Tento supernatant CS2) bol potom pridaný k supernatantu SI. K spojeným supernatantom (SI. a S2) boli pridané 2 m 1 vody l*lilli 0 a vzniknutý roztok bol. 1 y o f i 1 i z o v a n ý. Kú s l< y m em b r á n P V D F^ľ b o i i v y s u š e n é p o d p r ú d om d u s í k a a pri 42 °C počas 17 Hodín opäť extrahované i, 25 ml roztoku so zložením 60 % acetonitril, 0,1% kyselina tetrafluóroctová (TFA). Tento super na t ant (SO) bol odobraný a kúsky membrán PVDF boli pri 42 °C počas 1 hodiny opát extrahované 1,0 ml roztoku so zložením 8 0 % a c e t o n11r i1, 0,08 % k yse1ina tetr af1uór oc tová. Te í ί to supernatant (S4) bol zmiešaný s predchádzajúcimi supernatantmi (SI, S2 aSO) a zmes super natantov bola vysušená vo vákuu.

Vysušené fragmenty proteínu získané štiepením pomocou CN-Br boli potom rozpustené v 80 1..1I roztoku so zložením 814 močovina,

0,4 ΓΙ NFL,.HCO₃. Tieto fragmenty boli redukované pridaním 5 j_il 45 m 14 ditiotreitolu (DlT) a následnou Inkubáciou pri 50 počas .1.5 minút. Vzniknutý roztok bol potom ochladený na izbovú teplotu a fragmenty boli alkylované pridaním 5 j.il 100 ml4 jódacetamidu (Sigma, S t. Louis, 140). Po 1.5-minútovej inkubácii pri izbovej teplote bola vzorka zriedená 187 ul vody 141.11.1 0 na výslednú koncentráciu močoviny zodpovedajúcu 2,0 14. Potom bol k vzorke P r i d a n ý t r y p s í n ( W o r t h i n g t on, F r e e b o 1 d, N J ) v p o m e r e enzým:protein 1x25 (w/w) a štiepenie prebiehalo pri 37 počas 24 h o d í n . S t i e p e n i e b o 1 o s k o n č e n é p r í d a v k o m 3 0 u 1. T P A . P r o t e í. n o v é fragmenty boli potom separované pomocou k v a p a 11 n o v e j e h r om a t o g r a f i e ( H P L. C ) n a p r í s t r o j i 1411 f o r d, 14 A) pri použití kolóny rozmermi 2, 1 x 250 mm (Vydac, v y s o k o ú č i n n e j Waters 625) L C (Millipore, mikrónov) s

Vydac C-18

Hesperia,

ĽA) ekvilibrovanej v roztoku

Peptidy boli eluované

0,05 % TFA vo vode pre H P L C (pufer A), zvyšujúcou sa koncentráciou 80 % acetonitrilu v 0,04 % TFA (pufer B) s gradientom 38% až 75% pufer minút a 75% až 98% pufer B počas 95 až. 105i prietoku 0, 2 ml/minúta a počas 65 až minút. Peptidy boli delené pri delegované pri vlnovej dĺžke 210 nm

Po bola peptidov stanovovaná aminokyselinová sekvencia. Stanovenie aminokyselinovej sekvencie bolo uskutočnené automaticky Edmanovým odburávaním na proteínovom sekvenátore 13i o systém s Model 473A pri použití štandardných cyklov doporučených výrobcom. Analýza získaných dát bola uskutočnená softwarovým programom Data Analysls ľlodel 610A, verzia 1.2.1. Všetky sekvenačné reagencie boli. dodané firmou Applied Biosystems. Aminokyselinové sekvencie siedmich z celkových ôsmich

	vnútorných fragmentov sú znázornené nižšie.	pričom	X	označuje
	aminokyseliny, u ktorých nie je možné s i aminokyselinu vlastne ide.	stotou	urči	t	o akú
	VFOEXGAGFGU	C SEK.	ID.	č.	: 15)
	LYDXVAATGLXQPI	C SEK.	ID.	č.	_: 16)
•	PLEYXDVIPQAE	C SEK.	ID.	č.	_: 17)
	FQEGFSXVLX	(SEK.	ID.	č.	18)
	TSPTFIXMSUENVD	(SEK.	ID .	č.	• 19)
	LVVGAPLEVVAVXUTGR	(SEK.	ID.	č.	: 20)
	LDXKPXDTA	(SEK.	ID.	č.	s 21)
	Vytvor en i. e p r im é r u
•	Jedna zo získaných aminokyselinových se ako SEK. ID. č.: 22) bola použitá na d e g e n e r ovaň é h o o .1 i. g o n u k 1 e o 11 d o v é h o p r 1 m é r u zobrazeného ako SEK. ID. č.: 23.	:kvencií (zobrazená vytvor e n i e ú p 1. n e o z n a č e n é h o p 4 ( R ) a
	FGEQFSE	(SEK.	ID.	č.	: 22)
	5' -RAAMCCYTCYTGRAAACTYTC-3'	(SEK.	ID.	č.	: 23)

Príklad 4

Klonovanie fragmentu psieho λ_Τμι metódou PCR

S využitím PCR bola z dvojvláknovej cDNA z psej sleziny amplifikovaná čast na 5' konci génu kódujúceho psi polypeptid oí ri-i :i. ·

A. Vytvorenie dvojvláknovej cDNA z psej sleziny

Jeden gram zmrazeného materiálu získaného zo sleziny mladého psa bol v zmesi, kvapalného dusíka a suchého ľadu rozdrvený a homogenizovaný v 20 ml pufri RNA-Stat 60 < TelTest B, ľne, Friendswood, TX). Potom boli pridané 4 ml chloroformu a roztok bol oddelený eentrifugáciou uskutočňovanou pri 12 OOOxg počas 15 minút. Z vodnej vrstvy bola RNA precipitovaná prídavkom 10 ml. etanolu. RNA obsahujúca poly-A sekvenciu bola potom oddelená s využitím nosiča Dynal Oligo dT Dynabeads < Dynal, Oslo, Norsko) . Päť alikvótov RNA s celkovou hmôtnostou 100 ug bolo zmiešaných a zriedených rovnakým objemom 2x väzbového pufra <20 mľl Trls-HCl, pH 7, 5, 1, 0 1*1 LÍCI, 1 mľl EDTA, 0. IX SDS) . RNA bola potom počas 5 minút inkubovaná nosičom Oligo dT Dynabeads <1,0 ml alebo 5 mg nosiča na všetky vzorky). Pred vlastnou elúciou poly-A mRNA uskutočňovanou roztokom so zložením 2 mľl EDTA, pH 7, 5, boli guľôčky nosiča premyté pufrom so zložením 10 mľl Tris-l-ICl, pH 7, 5, 0, 15 ľl LÍCI, Imľl EDTA a 0, IX SDS podľa postupu popísaného výrobcom. Potom hoľa, postupom podľa výrobcu a pri použití eluovanej mRNA s poly--A sekvenciou a kitu pre syntézu cDNA firmy Boehringer ľlannheim, syntetizovaná dvojvláknová cDNA.

B . ľ. z o I. á c i a c DNA k ó d u j ú c: e j č a s t p s i e h o p o 1 y p e p t i d u cr, m x

Pri. štandardnej reakcii PCR uskutočňovanej pri použití 150 n g dvoj vláknovej cDNA, 500 n g každého z primárov, 200 u 1*1 každého dNTP a 1,5 jednotky polymerázy Taq <Boehringer ľlannheim) v pufrl Taq <Boehringer Mannheim) s prídavkom horečnatých iónov, boli použité oligonukleotidové priméry 5’Deg <SEK. ID. č.: 9) a p4<R) <SEK. ID. č.: 23). Vzniknuté produkty <1 j_il pôvodnej reakcie) boli, s cieľom dosiahnutia vyšších výťažkov, použité v ďalšej r eakcii. PCR so rovnakými primármi. Tieto pr úžky boli pri 60 ^C’C v pa tri so zložením 10 mľl Tris-HCl, pH 8, 1 ml^vl F D T A, 1, 5 14 NaCl eluované z 1% agarózového gélu na papier Sehleider & Shuell (Keene, NH) NA4S, preclpitované a pri použití k 1 ono v a c i. eh o kĺbu TA (Invitrogen) zaligované do vek tora pCR ^tn’l! (Invitrogen, San Diego, CA) (postupom doporučeným výrobcom). Ligačné zmesi boli elektroporačne transformované baktérie XL-1 Blue (Stratagene). Jeden kloň, označený 2.7, obsahoval sekvencie zodpovedajúce sekvenciám DNA pre polypeptid oŕ-r_M1, ktoré neboli využité pri návrhu primárov.

Sekvenácia bola uskutočnená pomocou sekvenátora DNA Applied Biosystems 373A (Foster City, CA) pri. použití sekvenačného kltu využívajúceho pre termináciu reakcie deoxynukleotidy s naviazanou značkou (AB1). Pri tejto sekvenácxi boli asymetrickou reakciou PCR CNcCabe, Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR“, v PCR Protocols: A Guide to Nethods and Applications, Innis a ďalší (eds.), strany 76 až 83, Academic Press: New York (1990)] inkorporované fluorescenčné značené dNTP nasledujúcim postupom

Vzorky holi inkubované počas 4 minút pri 96 °C a potom podrobené 25 cyklom: 96 °C počas 15 sekúnd; 50 °C počas 1 sekundy; 60 °C počas 4 minút. Získané dáta (vrátane chromátografu a textových súborov) boli automaticky načítané do referenčných súborov. Celá sekvenčia inzertu v klone 2.7 je znázornená ako SEK. ID. č.: 24.

Pokusy o izoláciu cDNA (z knižnice firmy Stratagene; ako je popísaná v Príklade 2), kódujúcej celý psí polypeptid or, mi, boli neúspešné. Pri. použití k lonu 2.7 ako sondy, bolo v podmienkach umožňujúcich hybridizáciu sekvencli s nižším stupňom komplementarity (použitie 30% formamidu) otestovaných približne 1 x IO*⁵* f ágov ý ch plakov, ale neboli identifikované žiadne pozitívne klony. Takisto neúspešné boli. pokusy o amplifikáclu príslušných sekvencli nachádzajúcich sa v smere transkripcie od sekvencli reprezentovaných v klone 2.7. Pokusy o amplifikáciu týchto sekvencli nachádzajúcich sa v smere transkripcie od sekvencli r e pr e z en to v a ný ch v k1one 2.7 bo1i usk utočňované pr i použití špeci fick ých o1i gonu k1eotidov odvodených z k1onu 2.7 ai eb o degenerovaných primérov so sekvenciou vychádzajúcou z aminokyselinovej sekvencie iných peptidových fragmentov, a ako druhý primár bol použitý degenerovaný oligonukleotid so s e k v e n c i o u vy c h á d z a j ú c o u z l< o n z e r v a t í v n e h o a m i n o k y s e 1 i n o v é (ί o motívu GFFKR pod jednotky cŕ Iľ. Tamura a ďalší, pozri vyššleľl .

Príklad 5

KÍ o no v a nie predpokladaného ludského hom o lég a k psiemu oí-_rM:1,

Pri pokuse o izoláciu ľudskej sekvencie homológnej k psej sekvencií kódujúcej «tmi bol ako sonda použitý fragment psieho cŕ_rM.i. s veľkosťou približne 1 k b z k lonu 2.7. Táto sonda bola vytvorená reakciou PCR pri podmienkach popísaných v Príklade; 2 a pri použití primérov MT2 (pozri SEK. TD. c.-. 25) a p4(R) (SEK. ID. š.; 23).

-GTNÍ TYCARGARGAYGG-3' (SEK. ID. č.

25)

Produkt reakcie PCR bol purifikovaný pri použití kitu Quick Spin firmy Qiagen (Chatsworth, GA) postupom doporučeným výrobcom. Takto petrifikovaná DNA bola pri použití, kitu Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupom doporučeným výr o b c oni „ r á d i o akt í v n e o z n a č e n á 2 0 D i..t C i <r⁵ ·^Ά - P d G T F’.

Nezainkorporovaný izotop bol odstránený chromatografiou na kolóne Sephadexu G25 Cf i ne). Pred vlastným použitím bola sonda denaturovaná pôsobením 0, 2 1*1 NaOH a neutralizovaná roztokom 0, 4 1*1 Trls-HCl, pH 8,0.

Na filtračných papieroch Hybond (Amersham) boli pripravené kolónie knižnice cDNA z ľudskej sleziny zaklonované do vektore; pCDNA/Amp (Invitrogen, Sao Diego, CA). Filtre boli najprv vystavené pôsobeniu denaturačnýcb činidiel a potom neutralizované postupom popísaným v Príklade 2 a potom pri miernom trepaní počas 2 hodín najprv inkubované pri 50 ^,::>C v pre hybridizačnom roztoku C 8 mi/fliter) s 30% formamídom. K tomuto roztoku bola pridaná rádioaktívne značená sonda (pozri vyššie) a spolu s filtrami bol tento roztok inkubovaný pr i. 42 °C počas 14 hodín. Filtre boli dvakrát premyté roztokom 2x SSC/O,1 % SDS s teplotou 37 °C a dvakrát roztokom 2x SSC/O,1 % SDS s teplotou 50 °C. Nakoniec boli filtre premyté dvakrát roztokom lx SSC/O,1 X SDS s teplotou 65 “C Clx SSC má zloženie 150 mM NaCl, 15 mM citronan sodný, pH 7,0). Počas 6 hodín boli filtre v kazete s kontrastným filtrom exponované na film Kodak X-Omat AR. Kolónie poskytujúce signál boli z duplikátu filtračného papiera natrené na platne s LB médiom obohateným horečnatým! iónmi CLBM)/karbenicilín a Inkubované cez noc pri 37 °C. Vyrastené kolónie boli prenesené na filtre l-lybond a tieto filtre boli spracované postupom popísaným vyššie. Tieto filtre: boli, pri použití sondy s veľkosťou í k b z klonu 2.7, rádioaktívne označené postupom popísaným vyššie, bybrldizované v podmienkach, pri ktorých Je pre; dosiahnutie: pozitívneho signálu nevyhnutná vyššia komplementarita medzi sondou a testovanou DNA než v predchádzajúcom prípade; podmienky hybridizácie: boli 50/ roztok f ormamidu, 50 °C počas 3 hodín.

SLltre boli nakoniec premyté dvakrát roztokom lx ;c/o, i % sds s teplotou 65 °C a počas 2, 5 hodiny boli filtre: pri —00 ^C,C v kazete: s kontraktným filtrom exponované na film Kodak X-Clinat AR. Boli identifikované; pozitívne kolónie a tieto kolónie boli cez noc k u 11 i v o v a n é v L B 1*1 / k a r b e o 1 c. i '1 in. pomocou k i tu P r omega Wizard pre: d o p o r u č o v a n ý m výr o b c o m, 1 z. o 1 o v a n á

Z Jednotlivých kultúr bola minipreparáciu DNA, postupom DNA a táto DNA bola potom sekvenovaná.

Prvým screeningom bolo ako pozitívnych vybraných 18 klonov, z a t i a 1 č o v ý s 1 e d l< om d r u h é h o s c r e: e: n i n g u u s k u t o č ň o v a n é h o p r 1 podmienkach, pri ktorých je pre dosiahnutie: pozitívneho signálu nevyhnutná vyššie komplementarita medzi sondou a testovanou DNA, b o 1 a i d e n t i f i k á c i a je: d n é h o p o z i t í v n e: h o k 1 o n u o z o a č e n é h o '19 A 2 . Sekvencia DNA a odhadnutá aminokyselinovú sekvencia klonu 19A2 ľudského cŕ_d sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 1 a 2.

Charakteristiky cDNA pre ľudský cť,-, a predikovaného polypeptidu

Kloň 19 A2 obsahuje: celú kódujúcu oblast pre: ma túrovaný a in :i. n o k y s e 1 d., n o v ý c h zvýš k o v ) proteín a navyše ešte 48 báz (. 16 signálnej sekvencie nachádzajúcej sa na 5^J konci proti smeru transkripcie od kódujúcej ohlas t d. a 241 báz neprekladanej sekvencie na 3' konci, ktorá nie je ukončená polyadenylačnou sekvenciou. Predpokladá sa, že molekulová hmotnosť maturovaného proteínu bude približne 125 kD. Predpokladaná extracelulárna doména zahrnuje približne aminokyselinové zvyšky 17 až 1108 (v SEK. ID. č.: 2). Ma túto extracelulárnu oblast nadväzuje sekvencia asi 20 aminokyselín, ktorá je homológna k transmembránovej oblasti ľudského CDllc Caminokyselinové zvyšky 1109 až 1128 v SEK. ID. č.: 2). Cytoplazmatická doména je tvorená približne 30 aminokyselinami Caminokyselinové zvyšky 1129 až 1161 v SEK. ID č.: 2). Proteín takisto obsahuje oblasť C približne aminokyselinové zvyšky 150 až 352) tvorenú asi 202 aminokyselinami, ktorá je homológna k doméne I (inzerčnej) spoločnej pre polypeptidy CDlla, CDllb a CDllc ĽLarson a

Springer, pozri. vyššie!, polypeptid ĽShaw a ďalší, J. Biol.

Chem. 269:6016 až 6025 (1994)! a proteíny VLA-1 <i VLA-2 ETamura a ďalší, pozri vyššie!. Bolo dokázané int egri.no v participuje s ICAM Ľ L. and i. s 120:1519 až 1527 (1993); Diamond a

120:1031 až 1043 (1993)!, čo ukazuje, že polypeptid d_o môže takisto viazať zástupcu povrchových molekúl proteínovej rodiny IC A M. B o 1 o d o k á z a n é, že t á t o o b 1 a s ť n e e x i. s t u j e v ž i a d n e j d. n e j p o d j e d n o t k e d. n t e g r í n o v .

že doména I u a ďalší, J. Celí. ďalší, J . Celí.

iných Biol. Biol.

CJdhadnutá aminokyselinové sekvencia polypeptidu a;_o je z približne 36% homológna k aminokyselinovéj sekvencii polypeptidu CDlla, z približne 60% homológna k aminokyselinovéj sekvencii polypeptidu CDllb a z približne 66% homológna k aminokyselinovéj sekvencii polypeptidu CDllc. IMa obrázku 1 sú zobrazené porovnané a m d_ n o k y s e 1 d. nové s e k v e n c i. e p o 1 y p e p 11 d o v C D11 b ( S E K. ID . č . : 3 ) , CDllc (SEK. ID. č.: 4) a d_a (SEK. ID. č.: 2).

Prd. organizmoch jedného druhu sa obvykle cytoplazmatické domény pod ..jednotiek d v integrínoch o> podstatne líšia, zatiaľ čo ...jednotlivé typy pod jednotiek d vykazujú medzd. jednotlivými, druhmi.

v y s o l< ý s t u p e ň h om o 1 ó g i e:. c y t o p lazin a t i c k á o b I. a s t c y t o p 1 a zm a 11 c k ý c h avšak s výnimkou ý súlade s týmito pozorovaniami sa polypeptidu o<_c> podstatne Uši od oblastí polypeptidov CDlla, CDllb a CDllc, aminokyselinovej sekvencie GFFKR C nachádzajúcej sa v tesnej blízkosti membrány), ktorá je konzervovaná medzi všetkými pod jednotkami Ľ Roj lani a ďalší, Biochemistry 30: 9059 až 9866 <1991)3. Pretože oblasť cytoplazmatlckého konca integrínov sa zúčastňuje na inslde out” signalizácii a regulácií, a vidí. t y CLandis a ďalší, pozri vyššie!, je možné, že polypeptid cŕ_o interaguje s molekulami cytozolu, ktoré sú odlišné od molekúl interagujúcich s CDlla, CDllb a CDllc a výsledkom toho môže byt skutočnosť, že polypeptid sa zúčastňuje na signálnych dráhach odlišných od signálnych dráh, v ktorých participujú iné integríny

e.--,.

Extracelulárna doména polypeptidu <z_ľ:, obsahuje, v pozícii vedia domény I, konzervovanú aminokyselinovú sekvenciu DGSGS; pokial ide o polypeptid CDllb, je sekvencia DGSGS oblasťou viažúcou kovy a je nevyhnutná pre interakciu s ligandom Γ. Mlchishita a ďalší, Celí. '72:857 až 867 <1993)3. ý aminokyselinove j sekvencií polypeptidu cŕ_o k lonu 19 A2 (SEK. ID. č.·. 1) sú na pozíciách 4615 až 474, 518 až 527 a 592 až 600 konzervované ďalšie tri miesta, ktoré sú v polypeptidoch CDllb a CDllc pravdepodobne zodpovedné za väzbu katiónov. Doména I polypeptidu θ',-, vykazuje;: 36%, 62% a 57% homológiu k príslušným oblastiam polypeptidov CDlla, CDllb resp. CDllc. Tento relatívne nízky stupeň sekvenčnej homológie naznačuje, že podjednotka môže Interagovat so skupinou extracelulárnych proteínov, ktoré sú odlišné od proteínov, s ktorými reagujú iné známe integríny . Takisto afinita polypeptidu oŕ₀ k známym ligandom integrínov akými sú napríklad ICAM-l, Ι0ΑΙΊ-2 odlišná od afinity demonštrovanej u Príklad 12).

a/alebo ICAM-R, môže byť i n t e r a k c i í e. _;Z /1C A 1*1 (p o z r i

Izolácia ďalších klonov cDNA otvor e n1e sek vencie pre ludský c<o, použitých na

Aby bolo možné potvrdil sekvenciu DNA kódujúcu ľudský cŕ_D, l:> o 1 i z knižníc e c D NA z 1 u d s k e j s 1, c z i n y CI n v i t r o g en) z a k 1 o nová n e j do vektora pcDNA/Amp (popísanej v Príklade 5), pomocou hybridizácie, Izolované ďalšie molekuly cDNA. Elektroforézou na agarózovom géle boli vybrané len cDNA s dĺžkou prevyšujúcou 3 kb. Sonda ·použitá pri hybridizácii bola odvodená od 5' koncovej oblasti oíc (ako je popísané nižšie). Hybridizačné podmienky boli totožné s podmienkami pri izolácii prvého klonu ľudského oŕo, len s tou výnimkou, že po hybridizácii boli filtre pri izbovej teplote dvakrát premyté v roztoku 2x SSC/O,1/ SDS a raz roztokom 2x SSC/O, 1% SDS s teplotou 42 °C. Filtre boli cez exponované na film Kodak X-Omat AR.

Hybridizačná sonda 5' o<i_;> bola vytvorená pomocou reakcie PCR z klonu 19A2 pri použití, primérov CDllc 5' For (SEK. ID. č.: 94) a CDllc

R e v (SEK. ľlľ D . č . : 9 b ) . Reakcia b o 1 a u s k u t o č ň o v a n á nasledujúcim postupom. Vzorky boli počas 4 minút udržiavané pri 94 °C a potom vystavené, v cykléri Perkin-Elmer 9600, 30 cyklom zmien teploty; 1) 94 °C počas 15 sekúnd; 11) 5 °C počas 30 sekúnd;

a iii) '72 ^C,C počas í minúty.

CDllc 5' For ·. ( 5' ) CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG( 3' )

CDllc 5’ Rev: (5’)CCTGAGCAGGAGCACCTGGCCÍ3 ’ ) (SEK. ID. č.: 94) (SEK. ID. č.: 95)

Produkt amplifikačnej reakcie bol purifikovaný pri použití, kitu Prep-A-Gene firmy BioRad (Hercules, CA) postupom doporučeným výrobcom. Získaný sonda 5’ o<₀ bola dlhá približne 72D báz, čo zodpovedá oblasti začínajúcej oligonukleotidom i121 a končiacej oligonukleotidom 1839 v SEK. ID. č.: 1. Puri fikovaná DNA (približne 50 ng) bola, postupom doporučeným výrobcom, pri použití. kitu Random Prime Labelling kit firmy Boehringer ľlannheim ³'^aP-dCTP. stĺpcov Adelphia, označená (Ind1anopo1is, Indiana) rádioaktívne označená izo topom Nezalnkorporovaný izotop bol odstránený pri použití.

’Centrisep Spln Columns (Princeton NJ) postupom doporučeným výrobcom.

sonda bola pridaná k filtrom

S e p a r a t i o n s,

R á d 1 o a k t í v n e namočeným v prehybrldizačnom roztoku obsahujúcom 45% formamid a inkubácia prebiehala cez noc pri 50 °C. Po tejto inkubácii boli filtre premyté postupom popísaným vyššie.

Trinásť kolónií poskytlo na obidvoch duplikátoch filtrov P o z i t í v n y s i g n á 1. P o z i t í v n e k o 1 ó n 1. e b o 11 z o z b i e r a n é zo z á s o b n e j platne, zriedené pomocou LOM s karbenicilínom C100 pg/ml) a v rôznych riedeniach vysiate na filtre Hybond (Amersham). Duplikáty týchto filtrov boli hybridlzované v roztoku s rovnakým zložením ako pri prvej hybridizácii a po hybridizácii boli filtre premyté roztokom 2x SSC/O, 1% SDS s teplotou 42 °C a potom exponované na film .

Pri druhom teste bolo potvrdených desať z pôvodne i d e n t i f i k o v a n ý c h t r i n á s 11ch pozitívnych k o1óni í. Dva z t ýchto desiatich klonov (označené A7.Q a A8.ÍÍ) boli sekvenované a bolo stanovené, že kódujú ludský d,_:>. Pre kloň A7. Q bolo zistené, že je približne 2,5 kb dlhý, obsahuje vedúcu sekvenciu na 5' konci, časť kódujúcej oblasti a dalšich 6D báz neprekladanej sekvencie na 5’ konci. Bolo zistené, že nekompletná kódujúca oblasť je výsledkom nesprávne zostrihnutej oblasti intrónu v mieste zodpovedajúcom oligonukleotidu 2152 v SEK. ID. č.= 1. Pre kloň A8.Q bolo zistené, že je približne 4 kb dlhý, obsahuje celú kódujúcu oblasť pre polypeptid oŕ_D a takisto obsahuje sekvenciu intrónu v mieste zodpovedajúcom báze šesť v SEK. ID. č.: 1. V porovnaní s pôvodne izolovaným k lonom oc_c> (SEK. ID. č.: 1) bol u obidvoch klonov, ako A7.Q, tak aj A8.0, pozorovaný jeden rozdiel. Týmto rozdielom bola skutočnosť, že klony A7.Q a A8.C1 majú v mieste bázy :14 95 vložený kodón tvorený troma bázami CAG. Sekvencie klonov A7.0 a A8.0 sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 96 a 97 a zložené ľudské sekvencie odvodené od klonov A7.C1 a A8.Q spolu so zodpovedajúcimi amiriokyselinovými sekvenciami sú zobrazené ako SEK. ID. č.: 98 a 99.

Príklad 6

Analýza expresie ľudského d,-, v tkanivách, uskutočňovaná metódou

Northern Blot

S cieľom stanovenia relatívnej hladiny a tkanivovej špecifity expresie loola pri použití fragmentov z klonu 19A2 ako sondy, uskutočnená analýza metódou Northern Blot. Na agarózovy gel formaldehydom a 1 j_ig etídium bromidu bolo z každej vzorky, získanej z niekoľkých ľudských tkanív a k u1t i v o v a o ých bunk ových 1ínií, nanesených prib1ižne 10 ug RNA. Po elektroforéze uskutočňovanej počas 4 hodín pri napätí '100 V bola RNA prenesená na nitrocelulózovú membránu (Schleicher & Schuell) metódou kapilárneho prenosu uskutočňovanou v lOx SSC cez noc. Membrána bola zapečená vo vákuu pri 80 °C počas 1,5 hodiny. Na blokovanie membrány bol použitý prehybridizačný roztok obsahujúci 50% formamid v pufrl kyseliny 3-(N-morfolino)propánsulfdnovej (MOPS). Prehybridizácia prebiehala 3 hodiny pri 42 °C. Fragmenty klonu 19A2 boli, postupom doporučeným výrobcom, pri použití kitu Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim r á d 1 o a k t í. v n e ozná č e n á i z o t o p o m

32p_ dCTP cr^P-ďTTP.

Nezainkorporovaná značka bola odstránená na kolóne Sephadexu G25 v pufrl TE. Pre hybridizáciu bol použitý hybridizačný pufer s aktivitou 1, 5 x 10^& c.p.m./ml. Potom bol blot pri izbovej teplote; premytý roztokom 2x SSC/O, 1% SDS, ďalej potom roztokom 2x SSC/O,1% SDS s teplotou 42 °C, roztokom 2x SSC/O,1% SDS s teplotou 50 °C, roztokom lx SSC/O,1% SDS s teplotou 50 °C, roztokom 0,5x SSC/O,1% SDS s teplotou 50 °C, a nakoniec roztokom 0, lx SSC/O, 1% SDS s teplotou 50 °C.. Potom bol blát počas 18 hodín exponovaný na film.

Hybridizácia pri použití, fragmentu vyštlepeného z klonu 19 A 2 reštrikčným enzýmom BstXI (zodpovedajúcim nukleotidorn 2.011 až 3388 v SEK. ID. č.: 1) poskytla slabo signály u RNA, s veľkosťou približne; 5 kb, z pečene, placenty, týmusu a mandlí (tonzíl). Vo vzorkách z obličiek, mozgu a srdca nebol delegovaný žiadny signál. Množstvo RNA prítomné vo vzorke z. obličiek bolo minimálne (ako ukázalo farbenie etídium bromidom).

Pri použití druhého fragmentu z klonu 19A2 (zahrnujúceho oblasť báz tkanivách,

Sekvenciou rozdielnymi detegovaný leukocytoch

500 až 2100 v SEK. metódou Northern Blot C C1 o n t e c h ), d e t e g o v ca n é veľkosťami. V slezine prúžok s veľkosťou 6, 5 periférneho krvného oh

ID. é.: 1) holi v ľudských využívajúcou RNA s poly-A

RNA transkripty s dvoma a kostrových svaloch hol kb, zatiaľ čo v pľúcach a shu hol. detegovaný prúžok s v e ľ. k o s ť o u 4, 5 k b . R o z d i e 1 y v p o z o r o v a n ý c h v e ľ k o s t i a c h m ô ž u b y ť s p ô s o b e n é t k a n i v o v o š p e c i f i c k o u p o 1 y a d e n y 1. á c i o u, k r í ž o v o u reaktivitou uvedenej sondy s inými zástupcami rodiny integrínov alebo hybridizáciou sondy s alternatívne zostrihnutými RNA.

Analýza uskutočňovaná metódou Northern Blot a využívajúca tretí fragment z klonu 19A2, zahrnujúci nukleotidy 2000 až 3100 v SEK. ID. č.: 1, poskytla obdobné výsledky ako analýzy využívajúce i n é f r a gin e n ty k 1 o n u 19 A 2 .

Pri použití fragmentov zodpovedajúcich nukleotidom 500 až 21.00 a 2000 až 3100 v SEK. 10. č. t 1 bola takisto testovaná RNA získaná z troch línii myeloidných buniek. Bunková línia THP-1, stimulovaná prostredníctvom PMA, poskytla neostrý signál v tej istej oblasti (približne 5,0 kb), ako to bolo pri signáloch z iných tkanív; tento signál hol však trocha silnejší. RNA získaná z nestimulovaných buniek HL-60 a z buniek Ι-IL-60 stimulovaných prostredníctvom DMSO, poskytla pri Hybridizácii so sondou a:,;, signál s intenzitou zodpovedajúcou intenzite signálu pre vzorku tkaniva, avšak zdalo sa, že vystavenie buniek pôsobeniu ΡΙΊΑ zvyšuje intenzitu tohoto signálu. Keďže ako PMA, tak aj Dl*lSO, smerujú diferenciáciu buniek HL-60 po dráhe monocyty/makrofágy ( F’ M A ) r e s p . g r a n u 1 o c y t y ( D M SO), n a z n a č u j e t e n t o v ý s 1 e d o k existenciu zvýšenej expresie polypeptidu «:_α pri bunkovom type monocyty/makrofágy. V bunkách 0937 je prítomná mRNA pre a stimuláciou prostredníctvom PMA nedochádza k zosilneniu signálu. Žiadna pozitívna odpoveď nebola delegovaná pri bunkách Molt, Daudi, H9, JY alebo Jurkat.

Príklad 7

P r e c h o d n á e x p r e: si a k o n š t r u k t o v k ó d u j ú c i c h ľ u d s ký d _c>

A. Vytvor e; o i e e x p r e s n ý c h k o n š t r u k t o v

Ľudskému klonu 19A2 chýba iniciačný kodón pre metionín a práv d e: p o d o b n e t i e ž č a s t s 1. g n á 1 n e j s e: k v e n c i e: n a 5^J k o n c i. N a vytvorenie expresívneho plazmidu obsahujúceho sekvencie ludského klonu 19A2 boli teda použité dva odlišné prístupy. Pri prvom prístupe boli skonštruované dva plazmidy, v ktorých boli na vytvorenie chirnerickej sekvencie kódujúcej použité sekvencie kúdujúce signálny peptid odvodené od génov kódujúcich polypeptidy

CDllb alebo CDllc, ktoré boli pripojené k sekvencii pre oí₀ .

ti druhom prístupe bol skonštruovaný tretí plazmid, v ktorom bol na pozícii 0 v klone 19A2 pridaný adenozín a tým bol vytvorený kodón pre iniciačný metionín.

Uvedené tri plazmidy obsahovali rôzne oblasti, ktoré sa líšia na 5' konci sekvencie kódujúcej polypeptid oŕ_D alebo chimér ický polypeptid oí,-> . Oblasť kódujúca d_rj bola pomocou PCR ( pozri podmienky š p e c i f i c k é h o vlákna (rfale

Príklade 2) amplifikovaná pri použití prlméru BamRev vymedzujúceho 3' koniec kódujúceho len 3' primér alebo reverzný primér) (pozri SEK.

ID. č.: 26) a jedného z troch primérov vymedzujúcich k 5’ koniec kódujúceho vlákna (ďalej len 5^J primér alebo priamy primér). Uvedené tri 5' priméry v sekvencii obsahovali: (i) na pozíciách ·+· až 6 Identické nešpecifické bázy umožňujúce reštrikčné štiepenie, na pozíciách 7 až 12 reštrikčné miesto EcoRI a na pozíciách 13 až 18 konvenčnú Kozákovu sekvenciu; (2) časť signálnej sekvencie odvodenej od CDllb (primér ER1B) adenozín (primér ER1D); a komplementárnych k sekvenciám na alebo CDllc (primér ER1C) alebo (3) ďalších 15 až 17 báz 5‘ k o i ί ci k1onu 19A2, aby bo1o priméru na DNA. Priméry ER1B, ERIC alebo ER1D sú zobrazené v SEK. ID. č.: 27, 28 alebo 29, kde je iniciačný kodón pre metionín vyznačený hrubo a reštrikčné miesto E c o RI j e p o d č i a r k n u t é.

-CCAC1GTCAGGAIGCCCGTG-3' (SEK. ID. č.= 26)

S ’ -AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3' C SEK.

27)

5' -AGTTACGAATTC.GCCACCATGACTCGGAC1 G T GCT ÍCTTCTG-- 3' < SEK.

28)

5' -AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCAtľ.TGTG-3' C SEK. ID

29)

Produkty získané reakciou PCR boli rozštiepené reštrikčnými, enzýmami EcoRI a BamHI.

Všetky tri plazmidy obsahovali totožnú druhú čast kódujúcu ¢/,:, : bola vložená v smere transkripcie hneď za 5’ oblasť popísanú v predchádzajúcom odstave!), vrátane: 3' konca klonu d_a. Táto druhá časť kódujúca c/,.,, ktorá zasahuje od nukleotidu 625 až. do reštrikčného miesta Xbal nachádzajúceho sa na 3' konci polylinkéra vektora klonu 19A2, bola izolovaná štiepením klonu 19A2 reštrikčnými enzýmami BamHI/Xbal.

Boli pripravené tri ligaoné reakcie, pri ktorých bol •fragment 3' </,::> rozštiepený enzýmami BamHI/Xbal zaligovaný, pri. použití pufra pre 1 i.gázu a ligázy T4 <1 Jednotka na 20 reakcii) firmy Boehringer Mannheim, do Jedného z troch klonov 5' &_r_, rozštiepených reštrikčnými. enzýmami EcoRI/BamHI. Po š t v o r h o d I n o v e: J r e a k c I i, s p o 1. u inkubácii pri 14 °C bolo ku každej ligačneJ s J e d n o u J e d n o t k o u 1 i g á z y „ p r i. d a n é z o d p o veda J ú o e množstvo vektora pcDNA.3 (Invitrogen) rozštiepeného reštrikčnými enzýmami EcoRI a J e d n o u d e s a t i n o u k om p e t e n t n é b u n k y kultivované bola z

Xbal. Reakcie prebiehali ďalších 14 hodín, reakčnej zmesi boli potom transformované XL“1 Blue. Vyrastené kolónie boli ďalej n a. c izolovaná DMA (pozri Príklad h).

Štiepením pomocou EcoRI boli identifikované tri klony, ktoré obsahovali reštrikčné miesto EcoRI a teda aj umelo vytvorené signálne sekvencie. Tieto klony boli označené pATM.Bl (CDllb/cŕ_D, prlmér ERIB). pATM.ClO < CD11c/oí_d» pr imér ER1C) a pATI*I.D12 (adenozín/oŕc, primér ERld) . Prítomnosť zodpovedajúcich signálnych sekvencií. bola u každého klonu potvrdená sekvenovaním príslušnej n u k 1 e o v e J k y s e 1.1 n y .

B. Transfekcia buniek CCS

Expresia z plazmidov kódujúcich </_c, (uvedených vyššie) bola dosiahnutá kotransfekciou buniek CBS vždy jedným z týchto plazmidov, spolu s expresívnym plazmidom pre CD18, označeným pCR.CDIS. Ako pozitívne kontroly boli použité bunky CBS kotransfekované plazmidom pCR.CDIS a expresívnym plazmidom pre CDlla, označeným pDC.CD11a.

hodín pred vlastnou transfekciou boli, pri 5DX konfluencii, bunky v kultivačnom médiu (DMEM/lOXFBS/penlcllín-streptomycín prepasážované do Petriho misiek pre tkanivové kultúry firmy Corning priemerom cm.

Pri všetkých pasážovaniach boli bunky z kultivačných misiek odstránené pomocou Ver seno vho pufra (0,5 m 1*1 NaEDTA v PBS). Pred vlastnou transf ekciou boli misky raz premyté médiom D 1*1 E 1*1 bez prídavku séra. Do každej misky bolo pridaných 15 j_ig jednotlivého plazmidu v 5 ml transfekčného pufra (DI*IEI*I s 2D ug/ml DEAE-Dextranu a D, 5 m 1*1 chlórochínom) . Po 1, 5 hodinove j inkubácii pri 3'7 °C boli bunky vystavené šoku pridaním 5 ml DI*IEI*l/10X DI*ISB. Tento roztok DI*ISB bol potom nahradený kultivačným médiom s objemom 10 ml/miska.

Vzniknuté transfektanty boli analyzované metódami ELISA, FACS a imunoprecipitáciou, ako je popísané v Príkladoch 8, 8 a 10.

Príklad 8

Analýza transfekovaných buniek CBS metódou ELISA

S cielom zistenia, či bunky CBS transfekované expresívnym plazmidom pCR. CD18 plazmidom exprimovali na svo jom povrchu polypeptid oí,-, asociovaný s pol y pep t í dom CD 18, bola, pri použití primárnych protilátok proti CD18 (napríklad TS1/18 petrifikovaná z ATCC HB203), uskutočnená analýza metódou ELISA. Ako pozitívna kontrola boli použité bunky kotransfekované expresívnym plazmidom pre CD18 a expresívnym plazmidom pre CDlla, označeným pDC.CDlla. Pri tejto kontrole boli ako primárne protilátky použité protilátky proti CD18 a protilátky proti CDlla (napríklad TS 1/22 purifIkované z ATCC HB202).

S cielom uskutočnenia analýzy metódou ELISA boli bunky z každej misky odstránené pomocou ýersenovho pufra a prenesené na jednu 96-jamková doštičku pre firmy Corning. Bunky boli pred kultivačnom médiu počas 2 dní, kultiváciu tkanivových kultúr vlastnou analýzou ponechané v

Potom boli. doštičky dvakrát premyté roztokom D-PBS/O,5% želatína z kože rýb (nadradu Kostnaté) (Sigma) v objeme 1.50 j..il/jamka. Tento pufer bol požívaný pri všetkých krokoch okrem farbenia. Všetky premývania a inkubácie boli. uskutočňované pri. izbovej teplote. Potom boli .jamky počas jednej hodiny blokované roztokom želatíny. Primárne protilátky boli roztokom želatíny zriedené na koncentráciu 10 j..ig/ml a do každej jamky bolo pridaných 50 jil tohoto roztoku. Po j ednohodi.no vej inkubácii boli doštičky 3x premyté roztokom želatíny v objeme 150 j_il/jamka. V zriedení 1:3500 bola pridaná sekundárna protilátka (kozia protilátka namierená proti myšacej

Ig/HRP

CJackson, West Grove, ΡΑΊ v objeme 50 ul/jamka a doštičky boli inkubované počas 1 hodiny. Po troch premytiach boli. doštičky, pred pridaním 15% kyseliny sírovej v objeme 50 ul/jamka, počas 20 minút farbené v roztoku o-fenyldíamínu (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD v citrátovom pufri.) .

Analýza transfekovaných buniek, uskutočňovaná metódou ELISA pri použití protilátok špecificky namierených proti. CD18, neodhalila u buniek transfekovaných len plazmidom kódujúcim CD18 žiadnu výrazne vyššiu hladinu expresie, než aké bolo pozadie. Bunky kotransf©kované plazmidmi kódujúcimi CDlla a CD18 vykazovali. pri analýzach, pri. ktorých boli použité protilátky špecificky namierené proti CD'18 alebo protilátky špecificky namierené proti. CDlla, vyššie hladiny expresie, než aké bolo pozadie. Ďalšie analýzy buniek transfekovaných plazmidom kódujúcim CD18 a ...jedným z expresných konštruktov kódujúcich cŕ_C)(p ATM. CIO alebo pATM.D12) o d h a 1.1.11, že expresia C Dl 8 na povrchu buniek .je zvýšená súbežnou expresiou polype p tidu oŕ_c>. Zvýšenie e x p r e s 1 e f> o 1 y p e p t i cl u C D18, cl e t e g o v a n é u b u n i e k t r a n s f e kov a n ý c h plazmidmi pATľl. CIO alebo pATI*l.D12, bolo porovnateíné so zvýšením pozorovaným u kontrolných buniek kotransfekovaných plazmidmi kódujúcimi CDlla/CDl8.

Príklad 9

Analýza transfekovaných buniek

CCS uskutočňovaná využitím FAOS

Bunkám v Petriho miskách bolo jeden deň pred transfekciou vymenené kultivačné médium za čerstvé a pred vlastnou analýzou uskutočňovanou s využitím FAOS boli bunky Inkubované počas 2 dni. Transfekované bunky boli pomocou 3 ml Versenovho pufra odstránené z misiek, raz premyté 5 ml puf r a pre: FAOS C DI*IEI*l/2% FBS/O, 2% azicl sodný) a zriedené 0,1 ml pufra pre FAOS na koncentráciu 500 000 buniek/vzorka. Ku každej vzorke bolo pridaných 10 ul protilátok Špecificky namierených proti CD18, CDlla a CDllb s

1mg/ml k o njugovanýc h s FITC C Becton D1ck inson) m y š a c e j p r o t i 1 á t k y 23 F' 2 G C p r o t i C D18) C A T C C H B110 81) s koncentráciou 800 i_ig/ml konjugovanej s OFSE. Potom boli vzorky inkubované 45 minút na lade, 3x premyté pufrom pre FAOS s objemom 5ml/premytie a rozsuspendované v 0,2 ml pufri pre FAOS. Vzorky boli merané na prístroji FACScan firmy Becton Dickinson a získané analyzované pri použití k o n o e n t r á c i o u alebo 10 ul dáta boli

Dickinson).

programu Lysys II (Becton

Bunky COS, transfekované len plazmidom kódujúcim CD18, neboli značené protilátkami (s konjugovaným markérom) namierenými proti CD18, CDlla alebo CDllb- Ak boli bunky kotransfekované sekvenciami kódujúcimi CDlla/CD18, bolo protilátkami namierenými proti CDlla alebo OD18 označených približne 15% buniek. Žiadna z buniek transfekovaných plazmidom kódujúcim CD18 spolu s akýmkoľvek konštruktom kódujúcim nebola značená protilátkou namierenou proti polypeptidom CDlla a CDllb. 4%, 13% a 8% buniek zo skupín transfekovaných plazmidmi pATľl. BI, pATľl. CIO a resp. P A T 1*1. D12 r e a g o v a 1 o tu p o z i. t í v n e n a f a r b e n 1 e p r o t i 1 á t k o u p r o t i

CD18. 1ntenz11a f1uarescencie pozitívnych popu1ác1í zo sk upiny CDlla/CD18 bola štvornásobne vyššia než pozadie. IMa porovnanie, kotransfekcia buniek konštruktom kódujúcim or,-, a konštruktom pre CD18 viedla k vytvoreniu pozitívnej populácie buniek, ktorá vykazovala Stvor až sedemnásobné zvýšenie intenzity fluorescencie oproti hodnotám pozadia.

Príklad 10

Imunoprecipitácia komplexov ľudský oí_d/CD18 z kotransf ekovaných buniek COS značených blotinom

S cieľom zistenia, či môže byt polypeptid Izolovaný ako čast heterodimérneho komplexu <yi?> s charakteristikou integrínov, bol u buniek kotransfekovaných expresívnym plazmidom kódujúcim CD18 a každým z expresívnych plazmidov kódujúcich polypeptid oí_DC popísaných v Pr íklade 7), uskutočnený pokus o imunoprecipitáciu oí_d/CD18 .

Transfekcvané bunky Cl až 3 x 10® buniek/skupina) boli z Petriho misiek odstránené pomocou Versenovho pufra a trikrát premyté roztokom D-PBS v objeme 50 ml/skupina. Každá vzorka bola označená pomocou 2mg Sulpho-NHS Biotín C Pier ce, Rockford, ÍL) . Značenie prebiehalo 15 minút pri izbovej teplote a bolo ukončené premytím C trikrát) chladným roztokom D-PBS v objeme 50 ml/vzorka. Premyté bunky boli rozsuspendované v 1 ml lyzačného pufra Cl% NP40, 50 ml*l Tris-HCl, pH 8, 0, 0, 2 1*1 NaCl, 2 inľl C’ i n h i b i t o r y p r o t e á z )

1nkubované počas 1b minút na ľade.

N e r o z p u s t n ý mate r i á '1 pri 10 OOOxg poča P r á z d ny c h s k úm a v i ek bol odstránený centrifugáciou uskutočňovanou s 5 minút a supernatant bol prenesený do Aby bol odstránený materiál nešpecifický reagujúcimi s myšacím imunoglobulínom, bolo na začiatku uskutočnené predčistenie vzorky. Pri 4 ^,:>C bolo so supernatantmi inkubovaných 25 ug myšacieho imunoglobulínu CCappel, West Chester, PA). Po 2, 5 hodinách bolo ku každej vzorke pridaných 100 ul C 25 ug) Sepharózy konjugovanej s králičou protilátkou namierenou proti myšacím lg C pripravené z Proteínu A-Sepharózy 4B a králičej protilátky namierenej proti myšaciemu IgG, obidva od firmy Zymed, San Franeiseo, CA); inkubácia prebiehala pri stálom trepaní pri 4 °C počas 16 hodín. Častice Sepharózy boli od super na t ant u odstránené eentrif ugáciou . F’o tomto predč istení bolí supernatanty pri 4 °C počas 2 hodín inkubované s 20 j_ig protilátky namierenej proti CD18 (TS1.18) . Od supernatantov boli komplexy protilátka/antigén izolované inkubáciou s prípravkom králičej protilátka proti myšacím Ig/Proteín A-Sepharóza s objemom í06 ul/vzorka, postupom popísaným vyššie. Častice nosiča boli štyr ikr át pr emyté roztokom 1.0 mľl HEPES, 0, 2 ľl NaCl a 1 X Triton-X 100. Premyté častice boli scentrlfugované a počas 10 minút varené v 20 jjl 2x Laemmllovho vzorkového pufra s 2X β-merkaptoetanolom. Vzorky boli scentrlfugované a rozdelené elektroforézou na polyakrylamidovom géle Novex (Novex) uskutočňovanou počas 30 minút pri napätí. í00V. Proteíny boli potom v pufrl TBS-T prenesené na nitrocelulózové membrány (Schleicher & Schuell.); 100 mA počas 1 hodiny. Membrány boli 2 hodiny blokované pomocou 3X BSA v TBS-T. Počas 1 hodiny boli membrány inkubované s chrenovou peroxidázou so strepavidínom (POD) (Boehringer ľlannheim) v zriedení. 1:6 000 a potom trikrát premyté v TBS-T. Na ofarbenie blotu bol použitý (postupom popísaným výrobcom) Enhanced

Amersham. Membrány boli na 0, 5

CHemiluminescence kit firmy až 2 minúty exponované na

Hyperf11m MP (Amersham).

Imunopreeipitácia komplexov CD18 z buniek transfekovaných plazmldom pRC~CD18 spolu s jedným z plazmidov pATM.Bl, pATľl.ClO a 1 e b o p A T ľl. D12 o d h a 1 i 1 a p o v r c h o v ú e x p r e s 1 u h e t e r o d im é r o v zložených z reťazca e. s molekulovou hmotnosťou približne 100 k D, ktorá zodpovedá predpokladanej veľkosti molekulovou hmotnosťou približne 150 m o 1 e k u 1 o v e j hm o t n o s 11 p o 1 y p e p t i d u v, _o .

6018 a reťazca ď s kD, ktorá zodpovedá

Príklad 11

Stabilná transfekcia ľudského do buniek o varil čínskeho chrčka

S cielom zistenia, či je polypeptid «n exprimovaný na povrchu buniek vo forme heterodiméru spolu s CD18, boli bunkové línie, ktorým chýba ako <*_D, tak aj CD18, prechodne: a stabilne trnasfekované molekulami cDNA kódujúcimi tieto jednotlivé reťazce.

Pre tieto experimenty bola, spôsobom popísaným v Príklade 7, k cDNA kódujúcej pridaná ďalšia vedúca sekvencia a Kozákova konvenčná sekvencia a celý tento konštrukt bol zaklonovaný do pcDNA3. Výsledným konštruktom, označeným modifikovaným komerčne dostupným vektorom C D1.8, b o 11 k o t r a n s f e k o v a n é b u n k y deficientné v aktivite dihydrofolát e x p r e sí vn e ho vektorá P A T 1*1. D12, s p o 1 o č n e s P D C1.C D i 8 k ódu jú cim 1u dsk ý ovárií čínskeho chrčka (CHO) r e d u k t á z y C D H F R ) ”. P1 a zm i d

P D C1. C D18 k ó d u j e mar k é r D H F R ⁺' a transfekované bunky môžu byt selektované pri použití. vhodného média neobsahujúceho príslušný nukleozld. Pre: vytvorenie plazmidu P D C1. C D18 b o 1 i p o u ž i t é n a s 1 e d u j ú c e m o d i f i k á c i e .

Plazmid pRC/CI*IV (Invitrogen) je cicavčí, expresívny vektor s promótorom cytomegalovírusu a ako selekčný markér obsahuje gén pre; rezistenciu voči ampicilínu. Gén kódujúci DHFR z plazmidu pSC1190-DHFR bol vložený na 5’ koniec začiatku replikácie SV4D vo vektore pRC/GMV. Navyše: bol do plazmidového konštruktu pRC/CMV/DHFR zaligovaný, na 3' koniec génu pre: DHFR, polylinkér z 5' oblasti plazmidu pHF2G-DHF. Potom boli do vzniknutého plazmidu zaklonované, medzi oblasť polyilnkéra na b' konci a sekvencie bovinného rastového hormónu, CD18.

oblasť poly-A s e k v e; n c i e p r e:

kódujúce

Povrchová expresia polypeptidu CD18 bola analyzovaná prietokovou cytometriou pri použití monoklonálnej protilátky T SI/1.8. Tvorba heterodimérov medzi o<_c, a CD18 u tejto bunkovej línie bola v súlade s údajmi získanými imunoprecipitáciou popísanou v Príklade 10 pri prechodnej expresii buniek CCS.

Príklad 1.2

Ľudský oí _D sa vi ti ž u πει molekulu ICAM-R a táto väzba je závislá od P r í. t om n o s t i C D18

Vzhľadom πει publikované údaje, ktoré dokazujú interakcie medzi integrínmi leukocytov a medzibunkovými adhezívnym! molekulami CICAM), ktoré sprostredkúvajú kontakt bunka-bunka Ľ H y ne s, Celí 69:11 až 25 C 1992)11, bola schopnosť buniek CHU exprimu .júcich oí_d/CD18 viazať 1CAM-1, TCAM-R alebo VCAM analyzovaná dvoma metódami.

V opakovaných stanoveniach boli rozpustné fúzne proteíny ICAM-1, ICAM-R alebo VCAM s IgGl imobilízované na povrchu plastu a bolel stanovovaná schopnosť buniek CCS transf skovaných plazmidmi kódujúcimi oč,_::,/CD18 viazať s T r a n s f e k o v a n é h u n k y b o 1.1 a k týmto imobilizovaným ligandom. i n t ra c e1u1ár oe označené pomocou kalceínu, premyté väzbovým pufrom CRPMI s 1% BSA) a inkubované buď v samotnom pufri C s alebo bez prítomnosti 10 ng/ml PMA) alebo v pufrl s monoklonálnymi protilátkami namierenými proti CD18 v koncentráciách 10 ug/ml. Transfekované bunky boli umiestené do štyroch 96-jamkových mikrotitračných doštičiek Immulon s jamkami dopredu potiahnutými, rozpustnými fúznymi proteínmi ICAM-1/IgGl, ICAM—R/IgGl alebo VCAM-1/IgGl alebo hovädzím sérovým albumínom negatívnou kontrolou. Rozpustné formy týchto molekúl sú dokonale popísané v doteraz nevybavenej

CBSA) ako adhezívnych Patentovej podanej prihláške US augusta 1993.

jamky blokované roztokom u s k u t o č ň o v ει n ý m p o n o r e: n im buniek boli doštičiek, minút do roztoku 0, 1%

č. 08/182852 C s rovnakým vlastníkom) Pred pridaním značených

1% BSA v PBS. Po premytí doštičiek na 28

BSA v PBS, bola pri použití prístroja Cytofluor 2300 (Millipore Milford, MA) meraná celková fluorescencia v každej jamke.

V experimentoch s imobilizovariými molekulami ICAM vykazovali, bunky kotransfekované plazmidmi kódujúcimi. oŕ_D/CD18 v jamkách s ICAM-R/lgGl, v porovnaní s jamkami potiahnutými násobne vyššiu intenzitu väzby. Specifita tejto závislosť od prítomnosti CD18 bola dokázaná inhibičnými účinkami protilátky TS1/18 namierenej proti CD18. Bunky transfekované

BSA, 3 až 5 väzby ει jej plazmidmi kódujúcimi CDlla/CD18 vykazovali 2 až 3-násobne vyššiu intenzitu väzby v „jamkách s ICAI*l-l/IgGl len keď boli tieto bunky dopredu vystavené pôsobeniu P 1*1 A. Pôsobenie P 1*1 A na bunky transfekované oŕ_c,/CD18 nemalo na intenzitu fluorescencie v jamkách potiahnutých ICAI*l-l/IgGl alebo ICAM-R/IgGl žiadny vplyv. Nebola delegovaná žiadna väzba buniek t r a n s f okovaných oŕo/CD18 na „jamky P o t i a h n u t é V C A 1*1 -1 /1 g G '1.

Väzba buniek, transfekovaných oŕ_D/CD18, k rozpustným fúznyrn proteinom ICAI*l-l/IgGl, TCAI*l-R/IgGl alebo VCAI*l-l/IgGl bola stanovovaná prietokovou cytometrlou. Na každé meranie bol v 100 l_il väzbového puf r a C R P 1*11 a P r o t i i á t k y n a m i e r e n e j p r o t i r o z s u s p e n d o v a n ý p r i b i i ž n e 1

1/ BSA), s alebo bez prítomnosti CD18 v koncentrácii 10 ng/ml, milión buniek CHO transfekovaných oŕ₀/CD18 C kultivovaných s cieľom vyššej expresie vo fľašiach s miešadlom - Spinner fiask). Po 20-minútovej inkubácii pri izbovej teplote boli bunky premyté väzbovým pufrom a boli k nim pridané fúzne proteíny ICAlí-l/IgGl a ICAľl-R/IgGl na výslednú koncentráciu 5 ng/ml. Naväzovanie prebiehalo 30 minút pri 37 °C a potom boli bunky trikrát premyté a rozsuspendované v 100 j..tl väzbového pufra obsahujúceho v zriedení 1:100 ovčiu protilátku konjugovanú s FITC. Po 30 vzorky trikrát premyté a a analyzované na namierenú proti ľudskému IgGl m 1 n ú t o v e „j i n k u b á c 11 b o 1 i rozsuspendované v 200 nl väzbového pufra pristroj! FACScan firmy Becton Dlckinson.

Približne 40 až 50/ buniek transf ekovaných oí_d/CD18 viazalo ICAM-R/lgGi, ale nebola pozorovaná žiadna väzba na proteíny TCAI*I—Ι/IgGl a VCAI*l-l/IgGl. Vystavenie transf ekovaných buniek predbežnému pôsobeniu ΡΓΙΑ nemalo žiadny vplyv na väzbu oí_c,/CD18 k proteinom ICAI*l~l/IgGl, ICAI*l-R/TgGl alebo VCAI*l-l/IgGl, čo zodpovedá stanoveniam uskutočňovaným s imobilizovanýml proteínmi. Pri vystavení buniek transf ekovaných oŕ_D/CD18 pôsobeniu protilátky TS1/18 namierenej proti CD18, bola intenzita väzby k ICAM-R/IgGl znížená na hodnoty pozadia.

Dáta získané obidvoch t ý c h t o s t a n o v e n í i. 1 u s t r u j ú b

skutočnosť, že oŕ₀/CD18 sa prednostne viaž k molekule ICAM-R C v porovnaní s väzbou k ICAM-l alebo VCAM-1) . Uprednostňovanie väzby oí_d/CD18 k 18AM R oproti väzbe k ICAM--1 je v protiklade k skutočnostiam zisteným pre CET.L'la/CD'1.8 a CDllb/CDÍ8. Môžeme teda očakávať, že módu lá c i a väzby <x_d/CD18 môže selektívne ovplyvniť normálne a patologické funkcie imunitného systému, v ktorých hrá molekula ICAM-R prominentnú úlohu. Navyše výsledky podobných s t a n o v e n í, p r 1 k t o r ý c h b o I a testov a n á s c h o p n o s ť p r o t i I. á t o k, špecificky namierených proti rôznym extracelulárnym doménam proteínu ICAM-R, inhibovať väzbu na bunky transf ek ované oŕ_D/8D18, naznačujú, že heterodlméry <x_o/8D18 a 8Dlla/8D18 interagujú s odlišnými doménami polypeptldu ICAM-R.

Nemožnosť delegoval v roztoku väzbu CDlla/CD18 k fúznym proteínoni ICAM-l/IgGl a ICAM-R/IgGl naznačuje, že afinita väzby medzi heterodlmérom CDlla/CD18 a ICAM-1 alebo ICAM-R je príliš nízka na to, aby umožnila väzbu týchto molekúl v roztoku. Detekcia väzby heterodiméru of_D/8D18 k fúznemu proteínu ICAM-R/IgGl však naznačuje neobvykle vysokú hodnotu afinity.

Pre testovanie väzby mutantu proteínu ICAM-R, označeného

E37A/Ig, na bunky a d h) é z i a a n a I y z o v a n á B o 1 o d o kázané, že

CHO exprimu júce heterodimér oŕ_c,/CD18 bola s využitím FACS, postupom popísaným vyššie. E37A/Ig sa neviaže k chimerickému proteínu

LFA-l/Ig E Sadbu a ďalší, Celí Adhesion a Communicatlon 2:429 až 440 <1994)1. Tento mutantný proteín bol vo svojej rozpustnej forme produkovaný stabilne transfekovanou bunkovou

Líniou CHO a bol purifikovaný na kolóne ProsepA publikácii Sadbu a ďalší, pozri vyššie.

postupom popísaným v ú opakovaných pokusoch nebol.a delegovaná väzba proteínu E37A/Ig na bunky transfekované cŕ_o/CD18. intenzita fluorescencie v hlavnom piku C MET — mean fluorescence intenslty) chimerického proteínu E37A/Ig, delegovaná s využitím protilátky namierenej proti ľudskému IgGl konjugovanej s FITC, bola totožná s MEI nameranou pre samotnú protilátku, čo naznačuje, že pri použití mutantného proteínu E.37A/Ig nie je v tomto experimente delegovaný žiadny signál prevyšujúci hodnoty pozadia. Podobne pri analýze uskutočňovanej metódou ELISA, postupom popísaným v Príklade 14, sa mutantný E37A/Ig najskôr neviazal na imobilizovaný oío/CDI.8 .

Väzba polypeptidu k proteínu iCb3

Komponent komplementu označovaný C3 môže byt proteolyticky štlepený, čím dôjde k vytvoreniu komplexu ::i..C3b, ktorý iniciuje aktiváciu alternatívnej cesty aktivácie komplementu, ktorej výsledkom je bunkovo sprostredkované zničenie dela. Ako CD 11b, tak aj CDllc, sa môžu zúčastňoval na väzbe k iCb3 a následnej fragmatóze častíc obalených komplexom !Cb3. Ako miesto Interakcie s komplexom iCb3 bol nedávno identifikovaný peptidový fragment domény I v polypeptíde CDllb C Deda a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sd. (USA) 91:10680 až 10684 (1994)3. Ohlast zodpovedná za väzbu ::LCb3 je v polypeptidoch CDllb, CDllc a oi_D velmi konzervatívna, čo naznačuje existenciu väzbovej interakcie očo/lCbS.

Väzba polypeptidu oc₀ k iCb3 bola analyzovaná ružicovým testom Ľ Dana a ďalší, J. Clin. Invest. 79:153 až 159 (1984)1 pri použití transfekovaných buniek alebo bunkových línií prirodzene exprimujúcich polypeptid oŕ_C) (napríklad bunky HL60 stimulované pomocou ΡΙΊΑ) . Za prítomnosti alebo neprítomnosti monoklonálnej protilátky namierenej proti CD18 (napríklad protilátky TS1/18.1) bola porovnávaná schopnosť buniek CHO transf ekovaných cŕ_D/CD18, buniek CHO transfekovaných VLA-4 (negatívna kontrola) a buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PI^VIA (pozitívna kontrola), vytvárať ružice.

Príklad 13

Testovanie uskutočňované technikami SPA

Inhibítory špecificky inhibujúce väzbu medzi ligandmi α^, podlá vynálezu a ich väzbovými partnermi (páru ligand oí_D/anti-lingand”) môžu byt analyzované najrôznejšími, spôsobmi, napríklad technikami SPA popísanými v Patentovej prihláške US č.

4271139, p u b 1 i k á c i ái c h 267 (1979) a Hart a (1979).

Hart a Greenwald, ľlol. Immunol. 12:266 až Greenwald, J. Nuc. ľled. 20:1062 až 1065

Stručne povedané, jeden cien dvojice ligand priamo alebo nepriamo naviazaný na pevný nosič. Nepriama väzba môže byt sprostredkovaná monoklonálnou protilátkou priamo naviazanou na pevnú podložku, pričom táto protilátka rozpoznáva špecifický e pi top na C-konci rozpustného e. reťazca integrínu. Týmto epitopom by mohol byt huď hemaglutinln alebo mykobakteriálny epitop IIIE9 CAnderson a ďalší, J. Immuno. 141:607 až 613 (1988)3. Ma nosič je priamo naviazaná tiež fluorescenčná látka. Inou možnosťou môže byt inkorporácia priamo v pevnom nosiči, ako je popísané v č . 4568649 . T e n č 3. e n d v o j i c e 3_ i g a n d o v f 1 u o r e s c e n č n e ..j 1 á t k y P a t e n t o v e j p r i h 1 á š k e U S rf,_:;,/ anti-ligand, ktorý ole je naviazaný na nosič, je označený rádioaktívnou zlúčeninou, ktorá emituje žiarenie schopné excitovat fluorescenčné agens. V prípade, kedy ligand viaže rádioaktívne značený anti-ligand, sa rádioaktívna značka dostane dostatočne blízko k fluóroféru naviazanému na nosič a môže tento fluorofór excitovat a vyvolať tým svetelnú emisiu. Ak nedochádza vzdialená k väzbe, od pevného je rádioaktívna značka obvykle príliš aby bola schopná excitovat agens a intenzita emitovaného svetla je nízka. Emitované svetlo je merané a korelované medzi ligandom a '' a n 11. -11 i g a n d orn . F’ r i d a n i e i n h i b í t o r a väz b y k v z o r k e s p ô s o b í zníženie emisie svetla flurofórom tým, že zabráni naviazaniu rádioaktívnej značky v blízkosti pevného nosiča. Inhibítory väzby môžu byt teda identifikované meraním ich vplyvu na emisiu svetla f1u or ofór om vo vzorcoch. Podobne môžu byt tak isto ídentifikováné ' ’ a n t .1 - 3. i g a n d y p o 1 y p e p 11 d u rf _D .

Pri testovaní modulátorov uvedeným nižšie je pri SF’A konštrukt rf_D/CD18 s leucínovým r e k o m b i n a n t n ý 1 n t e g r í n j e väzby CAPÍ uskutočňovaným postupom použitý rozpustný rekombinantný zipsom (pozri Príklad 14). Tento P om o c o u n e b 3. o k u j ú c e j p r o 111 á t k y n a m i e r e n e j p r o t i pod jednotke rf alebo proti pod jednotke o.

imobilizovaný na doštičke dopredu pokrytej fluorescenčnou látkou. Zlúčeniny chemickej knižnice a biotinylovaný chimerický protein CAM/lg sú na doštičku pridané súčasne. Väzba chimerického proteínu CAM/Ig je delegovaná pomocou rádioaktívne značeného streptavidínu. V tomto stanovení, sú chimerické proteíny ICAM-'l/Ig a ICAM-3(Ig biotinylované pomocou kilu NHS-Sulfo-biotin l_C (dlhý reťazec, Pierce) postupom doporučeným výrobcom. Takto označené proteíny stále reagujú s protilátkami špecificky namierenými proti CAM a s využitím metódy ELISA môže byt ukázané, že reagujú s imobilizovaným proteínom LFA-1. Detekcia je uskutočňovaná s využitím konjugátu Strepavidin-HRP a následným ofarbením s využitím OPD.

Inou čiastočne m o ž n o s Ľ o u j e p r i a m e n a v 1. a z a n i e p u r 1 f i k o v a n é h o a 1 e b o p u r i f i k o v a n é h o r e k o m b i n a n t n é h o 1 e u c í n o v é h o z i p s u n a d o š t i č k u d o p r e d u p o k r y t ú f 1 u o r esc e n č n o u 1 á t k o u . L1 ú č e n i. n y chemickej knižnice: a neznačený chimerický protein CAM/Ig sú na doštičku pridané súčasne. Naviazaný CAM/Ig je delegovaný protilátkou namierenou proti ľudskému Ig označenou izotopom ^;I=;SI.

Ešte inou možnosťou je imobilizovať na scintilačnú doštičku P u r i f :i. k o v a n ý p r o t e í n C AM/1 g . P o t om s ú n a d o š 11 č l< u p r 1 d a o é zlúčeniny chemickej knižnice a koncentrovaný superriatant z buniek exprimu júcich rekombinantný integrín typu leucinového zipsu. Väzba tohoto rekombinantného integrínu je delegovaná pomocou značenej neblokujúcej protilátky namierenej proti podjednotke d alebo proti podjednotke o.

Príklad 14

Expresívne konštrukty rozpustného ľudského polypeptidu očd

E x p resia neskráteného rozpustného ľudsk ého heterodiméru oío/CDlS poskytuje ľahko purifikovateľný materiál, použiteľný pre imunizáciu a väzbové štúdie. Výhodou vytvorenia rozpustného proteínu je skutočnosť, že tento protein môže byt purifikovaný zo supernatantov a nemusí sa purifikovať z lyzátov buniek (ako neskrátený heterodimér oí,_::,/CD18 viazaný na membránu) ·, tento protein je teda získaný ľahšie a s menším zastúpením nečistôt.

Expresívny plazmid kódujúci rozpustný o:_c, hol vytvorený nasledujúcim postupom Štiepenie reštrikčnými enzýmami Hindlll a AatlI bol z plazmidu ρΑΤΙΊ.012 izolovaný nukleotidový fragment zodpovedajúci oblasti báz 0 až 3161 v SEK. ID. č.: 1. S využitím prlmérov sHAD.5 a sHAD.3, zobrazených ako SEK. 10. č.: 30 a 31, bol z plazmidu pATI*I.D12 reakciou PCR amplifIkovaný fragment zodpovedajúci oblasti báz 3130 až 3300 v SEK. ID. č.: 1.

Sekvencia tohoto fragmentu sa prekrýva so sekvenciou fragmentu získanou štiepením reštrikčnými enzýmami HindlII/AatlI a na 3’ konci obsahuje navyše reštrikčné miesto 1*1 lul.

5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3' (SEK. ID. č.: 30)

5’-GTTCTGACGCGTAAIGGCAíTGTAGACCTCGTC1TG-3' (SEK. ID. č.t 31)

Produkt získaný amplifikáciou uskutočňovanou PCR bol rozštiepený enzýmami AatI a l*llul a zaligovaný s fragmentom získaným štiepením reštrikčnými enzýmami HindlII/AatlI. Získaný P r o d u k t h o 1 z a 1 i g o v a n ý d o p I a zm i d u p D C . 1. s r o z š t i e p e n é h o reštrikčnými enzýmami HindIII/l*lluI.

Tento konštrukt bol v stabilne transfekovaných bunkách OHO exprimovaný spoločne s rozpustným proteínom CD18 a expresia bola d e t e gov a n á autorádio gr afick ou v izua1izáciou imunopr ecipitovaných komplexov CD18 získaných z buniek Tento konštrukt bol takisto spolu s 293 C Bernian a ďalší, J. Celí. Biochem.

označených ^35SS-metionínom. CD18 exprimovaný v bunkách

52:183 až 195 (1993)3.

R o z p u s t n ý n e s k r á t e n ý k o n š t r u k t d ,

Vynález sa takisto týka alternatívnych expresívnych konštruktov pre d_o. Na uľahčenie expresie a purifikácie in taktného heterodiméru oŕo/CD18 budú skonštruované expresívne ρ .1 a zm i d y k ó d u j ú c e r o z p u s t n ý d _c> a G D18 . P o 1 y p e p t i d y k ó d o v a n é

týmito plazmidmi. budú obsahovať fúznu sekvenciu leucínového zipsu, ktorá bude počas purifikácie tento heterodimér stabilizovať CChang a ďalší, Proc. NatľL. Acad. Sci. (IJSA), 91:11408 až 11412 (1994)J. Stručne povedané, DNA kódujúce aminokyselinové reťazce tvorené kyslými a zásaditými aminokyselinami tvoriacimi leucínový zips boli vytvorené pripojením primérov pri použití oligonukleotidov popísaných v publikácii Chang a ďalší. Sekvencie DNA boli ďalej modifikované tak, že do nich boli na 5' a 3' koncoch zavádzané reštrikčné m i e s t a 1*11 u 1 ( 5' k o n i e c ) a X b a ľ. ( 3' k o n i e c ) . T á t o m o d i f i k á c i a slúži na ulahčenle zakTónovania týchto sekvencií do expresívnych konštruktov pre CD18 alebo ο:,-, popísaných predtým. K uvedeným sekvenciám DNA boli tiež pripojené sekvencie kódujúce hemaglutinín alebo polyhistidín a za reštrikčné miesto Xbal bol vložený stup kodón. Sekvencie kódujúce; hemaglutinín alebo polyhistidín boli vložené s cielom uľahčenia afinítnej purifikácie exprimovaného proteínu. Do expresívneho vektora kódujúceho CD18 sú vložené sekvencie kódujúce reťazec leucínového zipsu tvorený bázickými aminokyselinami; do konštruktu kódujúceho reťazec oŕ» je vložená sekvencia kódujúca reťazec leucínového zipsu tvorený kyslými aminokyselinami. Predpokladá sa, že po expresii modifikovaných proteínov d_r_> a CD 18 v hostitelských bunkách, bude interakcia medzi reťazcom tvoreným bázickými aminokyselinami a reťazcom tvoreným kyslými aminokyselinami stabilizovať tento heterodimér a umožní izoláciu intaktnej molekuly oŕ_c,/CD18 metódou afinít ne j purif ikácie popísanou vyššie.

Boli. skonštruované plazmidy pre expresiu rozpustného a CD18 s leucínovým zipsom tvoreným sekvenclaml kódujúcimi kyslé a bázické aminokyseliny a týmito plazmidmi boli, metódou využívajúcou DEAE/Dextran popísanou v Príklade 7, transfekované bunky C OS. Vzniknutý proteín bol označený ako oŕ_c>/CD18LZ. !ransfekované bunky boli počas 14 dní kultivované v médiu so zníženým obsahom séra (2/). Supernatanty z transfekovaných buniek boli zozbierané každý piaty deň a metódou ELISA popísanou v P r í kla d e 8, v n i c I ί b o 1. a analýz o v a n á p r o d u k c; i a p r o t e í n o v . S t r u č n e povedané, heterodimér oŕ_D/CD18LZ bol imobilizovaný na doštičkách po tiahnutých inonoklonálnou protilátkou 16 9B namierenou proti (pozri Príklad 15). Komplex oŕ_p/CD18LZ bol. delegovaný pridaním biotinylovanej monoklonálnej protilátky namierenej proti CD18 (TS1/18.1, pozri Príklad 8) s následným pridaním konjugátu streptavidín/chrenová peroxidáza (HRP) a o-fenyldiamínu (OPD). V supernatantoch bola delegovaná prítomnosť týchto proteínov.

ý ä z b o v é š t ú d i e u s k u t o č ň o v a n é p r i p o u ž i t i n e s k r á t e n é h o e x p r e s i v n e h o p r o d u l< t u or _o

Funkčné väzbové analýzy rozpustným neskráteným heterodiraérom oŕ_D/CD18LZ, popísaným vyššie, boli uskutočňované pri m o b i 1 i z á c 1 i b e t e r o d im é r u n a d o š t i č k y p o t i a h n u t é m o n o k 1 o n á 1 n o u protilátkou 1698 alebo neblokujúcou monoklonáInou protilátkou namierenou proti CD18 (pozri Príklad 15). S cieľom zamedzenia nešpecifických väzieb boli jamky, pred pridaním chimerických proteínov CAM/T.g (pozri Príklad 12) v začiatočnej koncentrácii 10 ug/ml, blokované pomocou želatíny získanej z rybacej kože. Väzba uvedených chimerických proteínov k heterodiméru oé_d/CD18LZ bola delegovaná prostredníctvom konjugátov HRP s koziou protilátkou namierenou proti ludskému lg (Jackson Labs) a následným ofarbením pomocou OPD.

Bolo pozorované, že

VCAM—1/Ig sa k Imobilizovanému

heterodiméru oŕ_D/CD18LZ viaže 3 až 5-krát intenzívnejšie ako k imobilizovanému heterodiméru CD11a/CD18. Molekuly ICAM-l/Ig a I.CAM-2/lg poskytujúce pri väzbe na rozpustný heterodlmér C D11 a / C D18 15 - k r á t r e s p. 10 - k r á t i n t e n z í v n e j š í s i g n á 3. ( v porovnaní s pozadím), ale neviažu sa na heterodlmér oŕ_D/CD18LZ. Väzba VCAM-1 bola, za prítomnosti kombinácie protilátok 130K a 130P špecificky namierených proti VCAM-1, znížená približne, o 50%.

Väzbové štúdie bolí. takisto uskutočňované na 96—jamkových doštičkách s imobilizovaným proteínom ICAM/Ig a následným pridaním rozpustného rekombinantného Integrínu prítomného v bunkovom super nataňte. Väzba rozpustných integrínov bola detegovaná pomocou neznačnej neblokujúcej myšacej protilátky namierenej proti reťazcu cc alebo b a následnou Inkubáciou s kozlou protilátkou špecificky namierenou proti myšacím Ig konjugovanou s HRF’ a ofarbením s využitím OPD.

Získané výsledky naznačujú, že nameraná hodnota pri väzbe oŕ₀/CD18LZ k ICAM-R/Ig, delegovanej pomocou neblokujúcej protilátky, bola IQ-krát vyššia ako to bolo v kontrolných jamkách neobsahujúcich žiadnu protilátku. Nebola delegovaná väzba rozpustného heterodlméru oŕ_D/CD18 k imobilizovanému ICAľl-l/Ig, ale oproti tomu bola delegovaná väzba medzi oí_d/CD18LZ a imobilizovanýml heterodimérmi CDUb/CD18 a CDlla/CD18 15-krát (CDllb/CD18) a 5-krát (CDlla/CD18) vyššia ako boli hodnoty pozadia.

Keďže predchádzajúce štúdie ukázali, že molekuly CDllb a CDllc viažu lipopolysacharid (LPS) CWright, Curr. Opin. Immunol. 3:83 až 90 (1991); Ingalls a Golenbock, J. Exp. ľled. 181:1473 až 1479 (1995)3, bola, pomocou prietokovej c y tonie tried a stanovení uskutočňovaných na titračných doštičkách, takisto analyzovaná väzba EPS na heterodimér oŕ_D/CD18. Získané výsledky ukazujú, že EPS, značený FITC, Izolovaný z mikroorganizmov S. Minnesota a S. typhosa (obidva získané od firmy Sigma) sa v koncentrácii 20 jjg/ml slabo viazal na bunky OHO transfekované oí_d/CD18 . U netransfekovaných buniek CHO nebola detegovaná žiadna väzba. Pri stanoveniach uskutočňovaných metódou ELISA sa biotinylovaný EPS

LL.uk a ďalší, Alan. ElLochem. 232:217 až 224 (1995)3 v množstve 0, 5 až 3, 0 ug viazal k imobilizovanému heterodlméru <z_o/CD18 a poskytoval štyrikrát väčší signál, ako to bolo v jamkách so samotnou protilátkou a blokujúcim agens. Zdanlivá väzba EPS na CDlla/CD18 bola, po odčítaní hodnôt pozadia (väzba protilátky TS2/4 namierenej proti CDlla), nevýznamná.

Aby bolo možné identifikovať ďalšie Ugandy pre oŕ_D/CD18, je rekomblnantný proteín oíd/CD18EZ použitý v dvoch prevádzkových štúdiách. S cieľom stanovení, ktoré bunky na svojom povrchu expr 1mu j ú Ugandy pre of₀, je analyzovaná väzba rôznych typov buniek na imobilizovaný protein. Potom je využitá inhibícia väzby s využitím protilátok, pomocou ktorých je možné stanoviť, ktoré známe povrchové adhezivoe molekuly sú zodpovedné z ti pozorovanú väzbu buniek. Ak nie je pozorovaná žiadna inhlbícia, je pri pokuse o identifikáciu ligandu využitá koimunoprecipitácia heterodiméru of_D/CDlEíLZ naviazaného na proteíny (ktoré budú viazať or_D) z lyzovaných buniek.

Expresívne konštrukty kódujúce doménu I rozpustného ľudského polypeptidu aí_o

Už predtým bolo publikované, že doména 1 v molekule CDlla môže byť exprimovaná ako nezávislá štruktúrna jednotka, ktorá si udržiava schopnosť viazať ligandy a schopnosť byť rozpoznaná protilátkami CRandi a Hogg, J. Biol. Chem. 269=12395 až 12398 (1994); Zbout a ďalší, J. Biol. Chem. 269=17075 až 17079 (1994); ľlichishita a ďalší. Celí 72 = 857 až 867 (1993)1. S cielom vytvorenia rozpustného fúzneho proteínu zloženého z domény 1 polypeptidu a ľudského IgG4, bola pomocou PCR ampliflícovaná sekvencia kódu júca doménu ľ polypeptidu ai_o. Pre túto PCR reakciu boli použité priméry, ktoré, kvôli uľahčeniu klonovanla, pridávajú na konce sekvencie reštrikčné miesta BamHI a Xhol. Tieto priméry sú zobrazené ako SEK. 10. č. = 32 až. 33 a reštrikčné miesta sú tu podčiarknuté.

-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3'

-ACľGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3 (SEK. 10. č.= 32) (SEK. ID. č.= 33)

Nukleotid C nachádzajúci sa v SEK. ID. č.= 32 na 3' konci vedľa reštrikčného miesta Baml-II zodpovedá nukleotidu 435 v SEK. ID. č.= 1; nukleotid G nachádzajúci sa v SEK. ID. č.= 33 na 3' konci vedľa reštrikčného miesta Xhol zodpovedá nukleotidu 1067 v SEK. ID. č.= 1. Amplif ikovariá doména I je rozštiepená zodpovedajúcimi reštrikčnými enzýmami a purlfIkovaný fragment je žaligovaňý do cicavčieho expresívneho vektora pDCs a prokaryotlckého expresívneho vektora pGEX-4T~3 (Pharmacia) a sekveriovaný. Fúzny proteín je potom fragment domény í je exprímovaný v bunkách CBS, CHB alebo E. coli transfekovaných alebo transformovaných zodpovedajúcimi expresívnym konštruktom.

Vzhladom na afinitu polypeptid u </,- k ICAM-R, môže mat exprimovaná doména I polypeptidu c^_c, dostatočnú afinitu, aby mohla byt použitá ako inhibítor bunkovej adhézie, pri ktorej aktívne P a r t i c i p u j e p o 1 y p e p t i d d _c,.

Analýza fúzneho proteínu tvoreného doménou I ľudského of₀/IgG4

Proteín bol rozdelený pomocou SDS-PAGE v redukujúcich a neredukujúcich podmienkach a vizualizovaný farbením striebrom alebo farbením Coomasie. Potom bol proteín prenesený na membrány Immobilon PVDF a analyzovaný pomocou monoklonálnych protilátok namierených proti ľudskému IgG alebo monoklonálnych protilátok namierených proti bovionému IgG.

Pre delegované proteíny bolo stanovené, že v neredukujúcich podmienkach migrujú so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 120 kD a redukujúcich podmienkach migrujú so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 45 l<D. Na géle z elektroforézy uskutočňovanej v neredukujúcich podmienkach boli takisto delegované menej intenzívne prúžky so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 4D až 5B l<D, ktoré reagovali s protilátkami namierenými proti ľudskému IgG, ale nereagovali s protilátkami namierenými proti bovinnému IgG. ľlenej intenzívny prúžok so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 200 l< D bol metódou Western Blot delegovaný ako bo vlnný Ig.

Väzbové štúdie uskutočňované pri použití expresívnych produktov domény I

Metódou ELISA bola testovaná schopnosť domény I špecificky rozpoznávať chimerický proteín ICAM-R/IgG. Jednotlivé sériové riedenia fúzneho proteínu IgG4 a domény I polypeptidu d_c, ( I d,-, /1 g G 4 ) v T B S b o 1 i 1 oku b ovaň é s IC A M - í / ΞΙΞ g G, I (ľ. A M - R ( I g G, VCAM-l/IgG alebo IgGl proteínom (produkovaným bunkami myelómu) imobilizovanými na doštičkách Immulon IV pre RIA/EIA. Ako negatívna kontrola boli použité chimerický proteín domény 1 CDlla/IgG a ľudský myelómový proteín IgG4/kappa. Naviazaný igG4 bol delegovaný prostredníctvom biotinylovanej monoklonálnej protilátky HP6023 namierenej proti IgG4 s následným pridaním konjugátu streptavidin-peroxidáza a farbením pri použi t ίο u b s t r átu o-f e n y1di amínu.

V opakovaných stanoveniach nebola delegovaná väzba medzi proteínom CDlla/IgG4 alebo myelómovýni proteínom IgG4 a ktorýmkoľvek z imobilizovaných proteínov. Proteín Ioŕ,~,/IgG4 sa neviazal na ľudský IgGl, ICAI4- Ι/IgGl alebo blokujúce agens, ako je želatína z rybacej kože alebo bovinný sérový albumín. Pri použití proteínu Ia;_o/IgG4 v koncentráciách í až 5 ug/ml bola v jamkách potiahnutých ICAI*l-R/IgG delegovaná, v porovnaní s pozadím, dvoj- až trojnásobne vyššia intenzita signálu. Intenzita signálu v jamkách potiahnutých VCAľl-l/lgG bola 7 až 10 krát vyššia ako pozadie. V predchádzajúcich stanoveniach sa bunky CI-10 transfekované cŕ_c,/CD18 neviazali na VCAI4~I/IgG, čo naznačuje, že väzba VCAľl-I môže byt charakteristická pre aminokyselinovú sekvenciu Izolovanej domény I.

Ďalšie konštrukty domény 1 polypeptidu cŕ_o

Ďalšie konštrukty domény 1 polypeptidu oí₀ boli vytvorené rovnakým spôsobom ako predchádzajúci konštrukt s výnimkou toho, polypeptidu oj₀„ začlenených viac k o n š t r u kly o b s a h u jú: i) sek vencie v SEK. íD. č.= 2), umiestené ‘EF-hand (motív v že tu bolo, okolo domény 1 am i n o l< y s e 1 í n . T i e t o š p e c i f i c k é z exónu ES (aminokyseliny 127 až 353 pred doménou 1; ii) opakovania motívu oblastiach zodpovedných na väzbu vápenatých iónov) (aminokyseliny 17 až 603 v SEK. ID. č.: 2) umiestené za doménou I; 111) reťazec transmembránovej oblasti (aminokyseliny 17 až spolu s IgG4 použitým pre purifikáciu a sú zaligované ako do cicavčieho a 1 f a u k o n č e n ý v 1029 v SEK. ID. č.: 2) d e t e k e. i. u . T i e to k o n š t r u k t y e x p r e s í v n e ho vektor a p D CS1, e x p r e s í v n e h o v e k t o r a p G E X - 4- T - 3 tak aj do prokaryotického (Pharmacia) a doména I je sek venovaná. Fúzne proteíny sú potom exprímované o bunkách COS, CHO alebo E. coli transformovaných alebo transfekovaných príslušnými expresívnymi konštruktmi. Proteíny sú purifikované na kolóne ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, England) a je testovaná ich reaktivita s monoklonálnou protilátkou HP6023 namierenou proti IgG4. Tieto proteíny sú na polyakrylamidovom góle ofarbené pomocou Coomassie.

Aby bolo možné skonštruovať expresívnym plazmid kódujúci kompletný polypeptid je plazmid pATľl. 1112 C popísaný vyššie) modifikovaný nasledujúcim spôsobom tak, aby z neho bolo možné exprimovať fúzny proteín oÍa/IgG4 . DNA kódu júca lgG4 je pomocou PCR pri použití prlmérov, ktoré zavádzajú na 5' koniec reštrikčné miesto Aatll CSEL. ID. č.: 89) a na 3' koniec reštrikčné miesto

Xbal (SEK. ID. ŕ

90), izolovaná z vektora pDCSl.

5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3’ (SEK. ID. č.= 89)

5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3’ (SEK. ID. č.t 90)

Plazmid pATľl.D12 je rozštiepený reštrikčnými, enzýmami Aatll a Xbal a rozštiepený a purlfikovaný produkt PCR reakcie, IgG4, je z a 1 i g o v a n ý d o 11 n e a r i z o v a n é h o v e ktorá.

Príklad 15

Produkcia protilátok špecificky namierených proti ľudskému oí,_:,

A. Produkcia monoklonálnych protilátok

Prechodne transfekované bunky z Príkladu 7 boli trikrát p r e m y t é f y z i o1o g i c k ým roztokom pufrovaným fosfátovým pufrom podía

Dulbecca (D-PBS) a v P EJ S injikované, v množstve b u n1ek/myš spólu Balb/c. ľlyši v dva jtýždennom z im u n i z o v a n ý o h s 50 ug/myš muramyl dipeptidázy (Sigma), boli Injikované rovnakým spôsobom

Intervale. Prelmunizačné séra a myší boli testované s využitím FACS, x 1C^Ädo myší. dvakrát séra ako je popísané v Príklade 9 a slezinné bunky z myší s najvyšší reaktivitou proti bunkám transfekovaným oíp/CD18, boli použité p r fúziu. Supernatanty z kultúr hybridómov boli jednotlivo testovane s cielom zistenia, či nereagujú s bunkami CDS transfokovanými pomocou CDlla/CD18 a takisto, či reagujú s bunkami k o t r a n s f e k o v a n ým i e x p r e s í v n y m i p 1 a zm i dm i k ó d u j ú c:: im i p o 1 y p e p t i d y t/p a C D.L 8.

Týmto postupom sa nepodar ilo pripraviť žiadne rnonokloriálne protilátky.

2. Ako alternatíva pre produkciu monoklonálnych protilátok bol použitý postup, pri ktorom bol rozpustný fúzny proteín domény I polypeptidu oí_D/IgG4 afinitne purifikovaný zo super natantu stabilne transf ekovaných buniek COS a bol použitý pre imuriizáciu myší EJalb/c, ako je popísané vyššie. Boli vytvorené hybridómy a supernatanty získané pri kultivácii týchto hybridómov boli metódou ELISA testované s cielom zistenia reaktivity proti fúznemu proteínu domény 1 polypeptidu oí_c . Pozitívne kultúry boli potom analyzované s cielom zistenia. Či reagujú s neskrátenými komplexmi oí_d/CD18 exprimovanými na povrchu transf ekovaných buniek CHD.

Myš bola najprv trikrát imunizovaná bunkami CHD transfekovanými oí_d/CD18 a potom dvoma posilňovacími dávkami, obsahu júcimi r ozpustný heterodlmér oí_c,/CD18 . Dávky pre posledné dve imunizácie obsahovali takisto fúzny proteín doména I polypeptidu oc_c,/IgG4 v množstve 50 ug/myš. Výsledkom týchto imunizáclí holo 279 jamiek, v ktorých hybridómy produkovali protilátky proti IgG. Pomocou metódy ELISA bolo stanovené, že supernatanty zo 45 jamiek vykazovali prinajmenšom 7-krát silnejšiu väzbu k fúznemu proteínu Iofo/IgG4 než k samotnému ľudskému IgG. Analýzou s využitím FACS bolo zistené, že žiadny z t ý c h t o s u p e r n ci t a n t o v n e r e a g u j e oíc/CDIS .

bunkami CHD transfekovanýml

S cieľom zistenia, či sú protilátky v týchto supernatantoch schopné rozpoznávať alfa podjednotku integrínu v inom kontexte, boli pomocou supernatant o v C z 24 z celkového počtu 45 ..jamiek) o z n a č e n é č e r s t v o z m r a z e n é r e z y s 1 e z i n y . T r i s u p e r n a t a n t y p o s k y 11 i pozitívnu reakciu: jeden ofarbil veľké bunky červenej pulpy, zatiaľ čo ďalšie dva ofarbili bunky roztrúsené v červenej pulpe a t a k 1 s t o v t r a b e k u 1 e.

U týchto supernatantov bola ďalej analyzovaná ich schopnosť imunoprecipitovat biotlnylované komplexy CD1S buď z buniek CHO transf ekovaných oí_c,/CD18 alebo buniek H L 60 stimulovaných prostredníctvom PI*1A. Pre ďalšie pasážovanie boli vybrané jamky, v ktorých boli prítomné supernatanty reagujúce z lyzátov získaných pôsobením detergentov (tieto proteíny by nemali mat tak definované štruktúry ako pokiaľ ide o proteíny exprimované ako heterodiméry). Monoklonálne protilátky, ktoré rozpoznávajú proteíny v detergente, môžu byt užitočnejšie pri. 1 m u n o p r e c:: i p i t á c i. 1 h e t e r o d Im é r n y c h k o m p I e x o v z t r a n s f e kovaný c h buniek, tkanív a bunkových línií.

3. Ako ďalšia alternatívna pre produkciu monoklonálnych protilátok bol použitý postup, pri ktorom boli z lyzátov ľudskej sleziny, pomocou monoklonálne j protilátky 23I-2C namierenej proti C D18, im u n o p r e c i p i t o v a n é k om p 1 e x y C D18; t e j t o i m u n o p r e c i p i t á c i 1 predchádzalo odstránenie komplexu CDUa/CD18 (pomocou monoklonálnej protilátky TS2/4) a komplexu CDTlb/CD18 (pomocou monoklonálne j protilátky ľlo-1) . Päť myší Balb/c, starých 19 až 12 týždňov, bolo imunizovaných subkutánnou injikáciou približne 30 j..ig proteínu, pripraveného postupom popísaným vyššie, v kompletnom Freundovom adjuvans. Táto imunizácia bola uskutočnená 0. deň a potom nasledovali imunizácie dvoma dávkami obsahujúcimi 30 j_ig imunogénu/myš v nekompletnom Freundovom adjuvans, ktoré boli uskutočňované 28. a 43 deň. Desať dní po poslednej imunizácii bola myšiam odobraná krv a pre získané séra zriedené v pomere 1: 5 D D ti o I a metódou W e s t e r n B1 o t s t a n o v o v a n á r e a k t :i.. vitá voči imunogénom, v množstve 1 ug/drába. Séra z troch myši detegovali prúžky zodpovedajúce proteínom s molekulovou hmôtnostou približne 95 a 150 kD; v dráhach, v ktorých boli na detekciu použité séra v z neimunizovaných myši zriedení 1:50, nebol delegovaný žiadny signál. Predpokladalo sa, že prúžok s veľkosťou 150 t<D reprezentuje in vivo glykozylovariý polypeptid oí₀. Všetky séra získané z imunizovaných myší navyše imunoprecipltovali s proteínom z lyzátov biotinylovaných buniek CHO transfekovaných oŕ_D/CD18, ktorý pri SDS elektroforéze na polyakrylamidovom géle migroval s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou heterodlméru. Na základe týchto výsledkov bola v y br anti myš #2212 a táto myš bola ďalej imunizovaná intraperitoneálnou injekciou obsahujúcou 30 uo imurtogénu v PBS (uskutočňovaná 64 deň). Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená a z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina.

Suspenzia jednotlivých slezinných buniek bola vytvorená rozmelením tkaniva medzi dvoma namrazenýmí podložnými sklíčkami ponorenými do média RPMI 1640 bez prítomnosti séra s prídavkom 2 mľl l....--glutamínu, 1 ml! pyruvátu sodného, penicilínu v koncentrácii 100 jednotiek/inl a streptomycínu v koncentrácii 100 ug/ml (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilné bunkové sitko Nltex s veľkosťou ok 212 um (Beoton Dickinson, Parsippany, New Jersey), dvakrát premytá centrifugáclou pri 200xg počas 5 minút a peleta bola potom rozsuspendovaná v 20 ml média RPI*II bez. prítomnosti séra. Tymocyty z troch myší Balb/c (neimunizovaných) b o 1 i p r i p r a v e n é p o d o b n ý m s p ô s o b o m.

Nyelómy N S -- :1 udržiavané tri dni pred fúziou v log fáze v médiu RPNI L a b o r a t o r i e s, obsahom 10% fetálneho séra (FBS)

C Hyclone

Inc. Logan, Utah), boli centrifugované pri 200xg počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá, postupom popísaným vyššie, a bunky boli spočítané. Približne 1,15 x 10^θ slezinných buniek bolo zmiešaných s 5, 8 x 10^x buniek NS-1, scentrifugovaných a supernatant bol odstránený. Peleta bola poklepom uvoľnená odo dna kyvety. K bunkovej pelete boli, pri stálom miešaní počas jednej minúty, pridávané 2 ml PEG 1500 (Boebrlnger Nannheim) (50% roztok v pufrl 75ml*l HEPES s pl-l = 8, 0) zahriateho na teplotu 37 °C. Potom bolo k bunkovej suspenzii, pridaných 14 ml média RPľll bez prítomnosti séra a suspenzia bola miešaná počas 7 minút. Nasledoval prídavok 16 ml média RPľlI a bunky boli eentrif ugované počas 10 minút pri 200xg. Supernatant bol odstránený a peleta bolai resuspendovaná v 200 ml média RPľlI obsahujúceho 15X PBS, 100 mľl hypoxantín sodný, é, 4 mľl amlnopterín, 16 mľl tymidín CHAT) (Giboo), IL.....6 s koncentráciou 25 jednotlek/ml (Boehringer ľlannheim) a 1,5 x 10* tymocytov/ml. Suspenzia bola rozdelená do 10-tich 96-jamkových (s plochým dnom) doštičiek pre tkanivové kultúry (Corning, Velká Británia) v objeme 200 ul/jamka a bunky boli vyživované 4., 5., 6. a 7. deň odohraním ul média z každej jamky 18G-ihlou (Becton Dlckinson) a pridaním 100 ul. čerstvého média, popísaného vyššie, ale s 1L-6 v koncentrácii 10 jednotlek/ml a neobsahujúceho tymocyty.

až 10 dní po fúzii, boli supernatanty z každej jamky testované metódou ELISA, na pritomnost myšacích IgG. Štyri doštičky Immulon (Dynatech, Cainbridge, ľlassachusetts) boli pri teplote ’C potiahnuté kozio protilátkou namierenou proti myšacím imunoglobulínom IgA, IgG alebo Igľl (Organon ľekníka) v množstve 50 ul/jamku, zriedenú v pomere 1:5000 v uhličitanovom pufri s pH = 9,6. Doštičky holi trikrát premyté pufrom PBS obsahu júcim 0, 05X Tween 20 (PBS'ľ) a bolo do nich pridaných 50 ul sup ernat a n tu z í s k a n é bo prebieha júce j 30 minút popísaným vyššie, bola z b u n k o v ý o h k u1túr. Po i nk ub á e i i pri teplote 37 °C a premytí, postupom pridaná kozia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou namierená proti myšaciemu IgG(Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvanla) zriedená v pomere 1:3500 v roztoku PBST. Doštičky boli inkubované, postupom popísaným vyššie, a štyri razy premyté roztokom PBSľ. Hneď potom bolo pridaných 100 ul substrátu, ktorý obsahoval o-fenyléndiamín v koncentrácii 1. mg/ml (Sigma) a 0,1 ul/m..L 30X H_Ä0_s v 100 mľl c i t r á t o v om p u f r i

Pl-I

4,

Farebná reakcia zastavená prídavkom 50 ul 15X stanovovaná pri vlnovej dĺžke 490 nm Dynatech.

H.-.SCL·,.

bola po 5 minútach A b s o r b a n c i a b o 1. a na čítačke doštičiek firmy

Hybridómy boli. ďale j charakterizované nasledu júcim postupom.

Supernatanty získané kultiváciou klonov produkujúcich IgG boli analyzované prietokovou cytometriou, či sú reaktívne voči. bunkám CHCI transformovaným of_c,/CD18 a pritom nie sú Imunoreaktívne voči bunkám JY (línie B-buniek exprímu„juca LFA-1, ale nie iné integríny k,·,-?) . Táto skutočnosť bola pozorovaná v predchádzajúcich experimentoch).

t r a n s f o r m o v a n ý c h

10^s buniek CHO buniek J'Y bolo boli k 50 ul supernatantov, produkujúcich TgG, pridané

Stručne povedané, 5 x of_D/CDÍ8 alebo oŕo/CDISrozsuspendovaných v 50 ul média RPMI obsahujúceho 2% FBS a 10 mM NaN_:-j (pufer pre FACS) . Do jamiek na 96-...jamkových doštičkách (s jamkami s guľatým dnom) (Corning) získaných z klonov hybridómov jednotlivé suspenzie buniek. Po 30 minútovej inkubácii na ľade b o 1 i b u n k y d vak r á t s c e n t r i f u g o v a n é ( a p r e myté), j e d n o 11.1 v é supernatanty boli odstránené a pele t y boli. rozsuspendované v 200 až 300 ul puf rl. pre FACS. Posledný premývaní roztok bol nahradený konjugátom fragmentu P(ab')_a ovčej protilátky namiereným proti myšaciemu TgG (l-h-L)-FTTC (Sigma, St. Louis, Missouri) v objeme 50 ul/jamka zriedeného v púmere 1:100 v pufri pre FACS. Po inkubácii, uskutočňovanej postupom popísaným vyššie, boli. bunky dvakrát premyté PBS modifikovaným podľa Dulbacca (D-PBS) doplneným 10 mM MaM_:3 a nakoniec rozsuspendované v B-PBS obsahujúcom 1% paraformaldehyd. Potom boli vzorky prenesené do polystyrénových skúmaviek pre analýzu prietokovou cytometriou (FACS) a analyzované na analyzátore FACscan firmy Becton Diokinson.

Výsledkom fúzie bolo vytvorenie štyroch bunkových kultúr, ktoré spĺňali obidve kritéria. Keď bol približne: po štyroch dňoch uskutočňovaný u supernatantov sekundárny screening, tri zo štyroch kultúr zostali pozitívne. Kultúry z týchto troch jamiek, označené 169A, 169B a 169D boli. dvakrát až trikrát úspešne pasážované vždy dvojnásobným zriedením v médiu RPMT obsahujúcom 15 % FBS, 100 mM hypoxantín sodný, 16 mM tymidín a TL-6 s koncentráciou 10 „jednotiek/ml. Po štyroch dňoch boli jamky na doštičkách vizuálne zhodnotené a v jamkách s najmenším počtom kolónií, bol určený počet týchto kolónií. Po 7 až 10 dňoch boli kultúry vo vybraných „jamkách z každého pasážovania analyzované s využitím FACS. U dvoch týchto kultúr, 169A a 1698, bola delegovaná aktivita. Pri poslednom pasážovaní boli kolónie z pozitívne r eagu júcich jamiek ( prítomná vždy jedna v jamke) rozrastené v médiu RPI4I s 11% FBS. U protilátok zo super na t a n to v klonov 169A a 169B bol pri použití kitu IsoStrip (Boehringer ľlannheim), postupom doporučeným výrobcom, stanovovaný ich Izotyp. Bolo zistené, že ide o protilátky izotypu IgGl.

Pri terciálnom testovaní špecifity týchto protilátok bola využitá precipitácia s komplexmi rf_c,/CD18 získanými z transfokovaných buniek GHG a buniek HL60 stimulovaných prostredníctvom PľlA. Protilátky produkované hybrldómami 169A a Ϊ69Β precipitovali s prúžkami s príslušnou veľkosťou (proteíny z.

línií CHO) a precipitovali takisto s zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150 jedným typom reťazca rf so až 160 kD z buniek HL60.

Táto skutočnosť bola stanovená pomocou SDS-PAGE, Hybridómy 169A a 1698 boli 31. mája 1995 uložené v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 a bolo im pridelené prístupové číslo HB11907 (169A) a HB11906 (1698).

Aby bolo možné lepšie charakterizovať väzbové vlastnosti protilátok i69A a 1698, holá u každej z týchto protilátok testovaná ich schopnosť inhibovať väzbu druhej protilátky alebo protilátky TS1/18.1 namierenej proti CD18 l< rozpustnému heterodiméru rf_c,/CD18. Rozpustný neskrátený beterodlmér rf_o/CD18 bol pomocou každe j z týchto protilátok C neznačených) jednotlivo imobillzovaný na 96-jamkovej doštičke a na detekciu proteínu, naviazaného prostredníctvom rovnakej alebo odlišnej neznačenej P r o t i i á 11< y, b o 3. i p o u ž 11 é p r o t i 3. á t k y o z n a č e n é b 1 o t í n om . Väzba b o 3. a delegovaná pri použití konjugátu kozia protilátka namierená proti myšacím Ig/HRP s následným farbením substrátom OPD. Získané výsledky naznačujú, že protilátka 169A holá schopná blokovať väzbu biotinyTovaných protilátok 169A a TS1/18.1, zatial čo protilátka 1698 blokovala len väzbu seba samej.

4.

Iná z myší (112214) imunlzovaná rovnakým postupom ako myš (;;> *4·

112212, bola 70. deň ďale j imunizovaná pomocou 30 iig purlfikovaného polypeptldu získaného z lyzátu sleziny, v PBS. Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená a z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina.

Fúzia a selekcia pozitívne reagujúcich buniek bola uskutočňovaná postupom popísaným vyššie. Výsledkom fúzie bol vznik piatich hybridómov produkujúclch monoklonálne protilátky proti cťo, ktoré boli označené 1700, 170F, 170E, 170X a 17OH. Pri použití kitu IsoStrip CBoehringer Mannheim), postupom doporučeným výrobcom, bol stanovený izotyp týchto protilátok a bolo zistené, že ide o protilátky izotypu IgGl.

Iná z myší <#2211), Imunizovaná rovnakým postupom ako myši #2.2.12 a #2.214, bola 88. deň ďalej imunizovaná pomocou 30 ug imunogénu a 203. deň prebehla, s využitím 30 j.ig imunogénu, ďalšia Imunizácia. Po štyroch dňoch bola táto myš usmrtená, z jej organizmu bola sterilné odobraná slezina a fúzia buniek prebehla postupom popísaným vyššie. Superriatant získaný pri kultivácii hybrldómov bol testovaný metódami cytometriou, odstaveoch.

ako d e t a 11 n e p o p í s a n é

SA a prietokovou v p r e d o (> á d z a j ú c: i c b

Pomocou metódy ELISA bolo identifikovaných 15 pozitívne reagujúcich hybrid όπιο v označených 188 A, 18 8B, 188 C, 188 E, 188E, 188G, 1881, 1.88 J, 188K, 188L, 1881*1, 188N, 188P, 188R a 1881. IJ týchto klonov bol takisto stanovený izotyp produkovaných protilátok. Stručne povedané, štyri doštičky Cambridge,

Imm u1on C Dyna tech, P o t i a h n u t é k o z i o u

Massachusetts) boli. pri 4 °C protilátkou namierenou proti myšacím IgA, G, 1*1 (Organon Teknika) zriedenou v pomere 1:5800 v 50 ml*l uhličitanovom pufri, pH 9, 6, v objeme 50 ul/janika. Doštičky boli počas 30 minút pri 37 °C blokované pomocou 1% BSA v PBS, trikrát premyté v PBS/0,05 % Tween 20 (PBST) έΐ do .jamiek bolo pridaných 50 jjI supernatantu získaného pri kultivácii hybrldómov (zriedeného v pomere 1:10 v PBS). Po inkubácii a premytí, uskutočňovanom postupom popísaným bolo do každej jamky pridaných 50 i.tl králičej protilátky <konjugovanej s chrenovou peroxidázou) namierenej proti myšacím IgGi, IgG_2a alebo IgG_Ä (Zymed, San Francisco, California), zriedenej v pomere 1:1660 v PBST e, 1% normálnym kozím sérom. Doštičky boli inkubované postupom popísaným vyššie, štyri razy premyté pomocou PBST a potom bolo do každej jamky pridaných 100 jj! substrátu obsahu júceho 1 mg/ml o-fenyldiamínu (Sigma) a 0,1 jjl/ml 30% H-11-. v 100 ml*l citrátovom pufri, pH 4, 5. Farbenie bolo zastavené po 5 minútach prídavkom 50 nl 15% H_s.SCU. Ma čítačke doštičiek (Dynatech) bola pri vlnovej dĺžke 490 nm odčítaná intenzita a bolo zistené, že všetkých 15 protilátok je izotypu IgGi.

Zvyšné k r y o s k ú m a v k e slezinné bunky z myši 42211 boli zmrazené v a s k 1 a d o v a n é v kva p a 1 n o m d u s í k u . 0b s; a h t e j t o kryoskúmavky bol rozmrazený umiestením kryoskúmavky do vodného k úpela s teplotou 37 ^C,C a trepaním do chvíle, kedy sa bunky práve roztopili. Bunky boli prenesené do centrífugačnej skúmavky s objemom 15 ml a po jednom mililitre k nim bolo pridávané teplé médium R P ľll obsahujúce 11% FBS. Medzi jednotlivými prídavkami média boli tri až päťminútovú intervaly. Bolo pridaných ďalších 5 ml teplého média RPMI centrifugovaná počas' 5 o d s t r á o e n ý . B u n k y b o 11 po päťminútovom státí bola skúmavka a supernatant bol RPMI a fúzia bola minút pri 200xg r o z s u s p e n d o v a n é v uskutočnená postupom popísaným vyššie. Supernatant získaný pri kultivácii hybridómov bol testovaný metódami ELISA a prietokovou cy tometr iou postupom popísaným vyššie.

Výsledkom fúzie bol vznik piatich klonov označených 195A, 195C, 195D, 195E a 195H. U týchto klonov bol. metódou ELISA, postupom popísaným vyššie, stanovený ich izotyp; bolo zistené, že monoklonáľLne protilátka 195A, 195C, 195D a 195E sú protilátky izotypu IgGi a monoklonálna protilátka 195H je protilátka izotypu XgGsja, .

6. Aby boli získané protilátky schopné inhibovať funkčnú väzbu polypeptidu d_rj„ bol na imunizáciu použitý rozpustný rt_o/CDlSLZ (pozri Príklad 14). Tento protein bol izolovaný zo supernatantu získaného pri kultivácii prechodne transfekovaných buniek CDS na nosiči pre afinitnú chromatografiu a ako imunogén bol použitý polypeptid cŕ_D naviazaný na nosič. Vybraná myš bola imunizovaná postupom popísaným vyššie; a posledná posilňovacia dávka jej bola podanej dva týždne; po prvej imunizácii. Imunizácia uskutočňovaná týmto postupom zamedzuje: možným zmenám v konformácii proteínu, ktoré sú často spojené s lýzou buniek uskutočňovanou prostredníctvom detergentu. Ďalšie myši boli imunlzované pomocou rekombinantného proteínu, takisto naviazaného na nosič, ale: tieto myši neboli na začiatku imunlzované proteinom purifikovaným z lyzátu buniek .

Hybridómy, získané postupom popísaným vyššie, ktoré sú výsledkom imunizácie, boli testované metódou EL.ISA na rekombinantných proteínoch izolovaných z bunkových supernatantov pri použití l-ab fragmentov neblokujúcej protilátky. Inou možnosťou testovania je využitie prietokovej cytometrie pre stanovenie reaktivity proti bunkám transf orinované cDNA kódu júcou oí₀.

J Y, ktoré boli dopredu

7. Inou možnosťou Je produkcia monoklonálnych protilátok nasledujúcim spôsobom. Pre imunizáclu myši Balb/c, uskutočňovanú postupom popísaným vyššie, bol použitý heterodimérny proteín ďo/CDlB, purifikovaný afinítnou chromatografiou z lyzátov stabilne transfekovaných buniek CHO, spolu s muramyl dipeptidázou v koncentrácii ESO jag/ml. Predtým, ako bola imunoprecipitáciou t> 1 o t i n y 1 o v a n ý c h k o m p 1 e x o v t r a n s f e k o v a n ý c h b u n i. e k

CHO stanovovaná reaktivita séra proti <*_D/CD18, boli myši, z ktorých bolo toto sérum získané, trikrát imunizované. Z pozitívne reagujúcich zvierat boli, pomocou štandardných techník, získané línie hybridómov. Potom boli tieto hybridómy kultivované a potom selektované pomocou prietokovej cytometrie, pri použití buniek transfekovaných oŕc/CDlS. Bunky transfekované CDlla/CD18 boli využité ako kontrola pre identifikáciu protilátok reagujúcich lén s CD18.

Ako ďalšia alternatíva pre produkciu monoklonálnych protilá tak bal využitý postup, pri ktorom bol. pre myši Balb/c použitý protokol imunizácie/imunosupresie, ktorý bol navrhnutý tak, aby bola znížená reaktivita voči imunogénnym determinantom transfskovaných buniek CHO, použitých pre imunizáciu. Tento protokol využíva Imunizáciu uskutočňovanú pomocou netransfekovaných buniek CHO a potom následne zničenie B-bunlek (v štádiu blastov) reaktívnych voči CHO bunkám, čo .je dosahované pôsobením cyklofosfamidu. Po triách kolách imunizácíe a následného zničenia reaktívnych B~buniek prídavkom cyklofosfamidu sú myši imunizované pomocou buniek transf ekovaných <ť_D/CD18, postupom popísaným vyššie.

9. Inou alternatívou je postup, pri ktorom sú, postupom popísaným vyššie, lyzáty buniek HL60 stimulovaných pomocou PI4A (získalo sa pôsobením detergentu) obohatené o frakciu komplexov CD18. Ma rovnakých stĺpcom sú odstránené iné integríny β₂· Imunlzácie pomocou získaných komplexov, produkcia hybridómov a ich testovania sú uskutočňované postupmi popísanými vyššie.

B. F’ r o d u k e i a p o 1 y k 1 o r» á 1 n e h o s é r a

S cieľom vytvorenia polyklonálneho antiséra v organizme králikov bol použitý purifikovaný chimerický proteín doména I polypeptidu oCo/IgG4 (Príklad 14). Ma začiatku bol antigén doména I polypeptidu cí_o/IgG4 injikovaný do organizmu králikov v kompletnom F-reundovom adjuvans v množstve 100 lag/králik a potom nasledovali tri posilňovacie dávky, obsahujúce rovnaké množstvo proteínu v nekompletnom Freundovom adjuvans. Po tretej a štvrtej imunizácii boli analyzované vzorky krvi. Králičí imunoglobulin (I g ) b o 1 z o s é r a p u r i f i k o v a n ý n a k o 1 ó n e S e r> h a r o z a - p r o t e í n A a n a kolóne 'ľudský IgG/Affigel 10 bol zbavený frakcie namierenej proti 1 u d s k é m u I g G. M a p o t v r d e n i e d o k o n a 1 é h o o d s t r á n e n i a f r a k c i e namierenej proti .Ľudskému IgG ktorej bolo testované, že sérum bola využitá metóda ELISA, pri nereaguje s Ľudským IgG, ale len s častou chimerického proteínu zodpovedajúcou doméne I.

T a k t o p r e d č i s t e n é p o 1 y k 1. o n á 1 n e sérum bolo použité na tí tí imunoprecipitáciu proteínov z lyzátov buniek CHB, ktoré boli na povrchu biotinylované, a ktoré boli dopredu transfekované expresívnymi vektormi kódujúcimi d_n a CD18. Imunoprecipitácia bola uskutočňovaná postupom popísaným v Príklade 10. Toto predčlstené sérum rozpoznávalo proteínový komplex s rovnakou molekulovou hmôtnostou akú mal komplex precipitovaný pomocou m o n o k 1 o n tí 1 n e j r > r o t i 1 á t k y T S1.1 tí n a m i e r e n e j p r o t i C 018 . P r i analýze komplexov CD18 získaných z buniek CHB transfekovaných pomocou oč_d/CD18, uskutočňovanej metódou Western Blot, rozpoznávalo toto sérum jeden prúžok s príslušnou veľkosťou. Králičie polyklonáIne sérum nerozpoznávalo afinitne purifikované integríny CDlla/CD18, CDllb/CD18 a proteín V L. A 4 z ľudskej sleziny. Ako bolo stanovené prietokovou cytometrlou, toto sérum takisto v roztoku nereagovalo s bunkami CHB transf okovanými d,_:,. Bolo teda usúdené, že polyklonálne králičie sérum je schopné rozpoznávať len denaturované proteíny domény T. polypeptidu oío/lgG4.

myš

Pri pokuse o izoláciu polyklonálneho séra proti oc_c,/CD18 bola trikrát imunizovaná pomocou buniek CHB transfekovaných d_f:t raz bola Posledná

Prídavkom Ό imu n x z ovaň e j m y š i 1/5000, ľudskej

Γ á t o p o 1 y k 1 o n á 1 n a 1/20000, zatiaľ čo pri (Dtí.CHB, cŕ_o/CD18) spolu s adjuvantným peptidom a im u n i z o v a n á p u r 1 f i k o v a o ý m h e t e r o d im é r om d. _D / C D18 . posilňovacia dávka obsahovala len heterodímér oŕ₀/CD18 asi 10® buniek CHB transfekovaných LFft-1 (na 2 hodiny pri 4 bolo približne 100 ul séra získaného z

Predčistených. IJ takto upraveného séra bola, v riedeniach 1/10000, 1/20000 a 1/40000, analyzovaná, na bunkách sIeziny, reaktivita voči po1ypeptidu d_t protilátka bola reaktívna v riedení riedení 1/40000 boli bunky farbené veľmi slabo.

Príklad 16

Analýza dl t r i b ú c i e p o 1 y p e p 11 d u d. _lľJ

Pomocou polyklonálneho séra, vytvoreného postupom popísaným v Príklade 15, bola stanovovaná tkanivová distribúcia komplexu ď_D/CD18.

roztoku obsahujúcom 1% králičie sérum. Na každý

Pre irnunocy tochemické analýzy zmrazených rezov ľudske j sleziny bola purifikavaná králičia polyklonálna protilátka použitá v koncentráciách v intervale 120 ng/ml až 60 ug/ml. Rezy s hrúbkou 6 mikrometrov boli umiestené na podložné sklíčka Superfrost Plus (VWR) a skladované pri -70 ‘’C. Pred použitím boli sklíčka vybrané z -70 °C a na 5 minút umiestené do teploty 55 °C. Potom boli rezy počas 2 minút fixované acetónom a vysušené na vzduchu. Rezy boli počas 90 minút pri Izbovej teplote blokované v BSA, 90% normálne ľudské sérum a 5% rez bola aplikovaná primárna protilátka pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Nenaviazaná protilátka bola odstránená trojnásobným premytím sklíčok v IBS (počas 5 minút). Ďalej bola na každý rez nanesená králičia protilátka namierená proti myšaciemu IgG v rovnakom pufri IBS. Na detekciu sekundárnej P r o t i 1 á t k y b o 1 a p o u ž i t á 3 0 - m i n ú t o v ú d. n k u b á c i a ( p r i i z b o v e j teplote) s myšacou protilátkou namierenou proti alkalickej fosfatáze značenou alkalickou fosfatázou CAPAAP). Potom boli sklíčka trikrát premyté v pufri IBS. Potom bol pridaný substrát Pást Blue (Vector Labs) a farbenie bolo zastavené ponorením sklíčka do vody . Sklíčka boli d o farbené pomocou Nuciear F a s t R e; d a pred ukotvením pomocou Aqua ľlount (Baxter) premyté V červenej pulpe sleziny bolo detegované farbenie pri tejto protilátky, ale nie pri použití králičieho polyklonálneho Ig (proti iným proteínom) alebo pri použití nepurifikovaného séra získaného z rovnakého jedinca pred imunizáciou.

(Sigma) vodou. požití

Hneď ako bola raz pre myšacie sérum stanovená špecifická reaktivita voči d_c„ bolo toto sérum použité na zničenie rôznych lýmfoidných a nelymfoidných tkanív. V totožných experimentoch boli ako kontroly využité monoklonálne protilátky rozoznávajúce polypeptidy CD1.8, CDlla, CDllb a CDllc. Značením rezov z n o r m á 1 n ej s 1 e z i n y u s k u t o č ň o v a n ým p om o c o u p o 1 y k 1 o n á 1 n e h o s é r a proti t/ο a pomocou monoklonálnych protilátok proti CD 18, CDlla, CDllb a CDíle, boli získané tieto výsledky. Distribúcia markéra pozorovaná pri. použití polyklonálneho séra proti cŕ_D bola odlišná od distribúcie značky namierenej proti polypeptidom C D 1.8, CDlla, CDllb ti CDllc. Existuje odlišná distribúcia značky u niektorých buniek umiestených v hraničnej zóne bielej pulpy a odlišná distribúcia značky u periférnych buniek hraničnej zóny. Takáto distribúcia nebola pozorovaná pri použití, iných protilátok. Jednotlivé bunky roztrúsené v červenej pulpe boli takisto označené. Tieto bunky môžu, ale nemusia, byt z rovnakej populácie alebo podskupiny ako bunky označené pomocou protilátok proti CDlla a CD1S.

Značenie protilátkou proti CDllc ofarbilo nejaké bunky v hraničnej zóne, ale nebol pozorovaný, v porovnaní s použitím polyklonálneho séra proti d v, zreteľný kruh okolo bielej pulpy. Takisto distribúcia značky v červenej pulpe nezodpovedala distribúcii značky pri použití polyklonálneho séra proti rf_D.

Distribúcia značky pozorovaná pri použití polyklonálneho séra proti ο:,-, bola teda jedinečná v porovnaní s distribúciou pozorovanou pri použití protilátok proti iným integrínom e>_s. CDlla, CDllb, CDllc a CD18. Tieto výsledky naznačujú, že in vivo distribúcia polypeptidu v organizme človeka, je odlišná od distribúcie iných integrínov .

Charakterizácia expresie ľudského polypeptidu oí₀ uskutočňovaná P o m o c o u m o n o k 1 on á 1 n y c h p r o t i 1 á t o k

Pri analýze expresie ľudského polypeptidu d_a uskutočňovanej imunocytochemicky na zmrazených tkanivových rezoch a pomocou prietokovej cytometrie na bunkových líniách a leukocytoch periférneho krvného obehu, holi použité protilátky sekretované hybridómami 1.69A a 169B. V obidvoch experimentoch holi supernatanty získané kultiváciou hybridómov použité v nezriedenej forme.

Všetky značenia, okrem značení rezov pečene uskutočňovaného podľa protokolu popísaného ďalej, holo uskutočňované postupom popísaným vyššie. Po fixácii acetónom boli rezy počas 15 minút pri Izbovej teplote premyté v roztoku 1% H^.0_Ä a 1% azidu sodného v TBS. Po označení primárnou protilátkou bola na rezy na 30 minút pri izbovej teplote aplikovaná králičia protilátka namierená proti myšaciemu IgG konjugovaná s peroxidázou. Rezy boli trikrát premyté v pufri TBS. S cieľom detekcie sekundárnej protilátky bola použitá inkubácia s prasačou protilátkou (kon.jugovaňou s peroxidázou) namierenou proti králičej protilátke, uskutočňovaná pri izbovej teplote počas 30 minút. Rezy boli potom trikrát premyté v pufri TBS, bol. k nim pridaný substrát AEC (Vector Labs) a reakcia bola ponechaná prebiehať. Rezy boli dofarbené Hematoxylínom Gill č. 2 (Sigma) a potom, pred vysušením a ukotvením boli premyté vodou.

V rezoch zo sleziny bolel väčšia expresie lokalizovaná v červenej pulpe a to na bunkách morfologicky zodpovedajúcich granulocytom a makrofágom. Označené bolo veľké množstvo granulocytov, zatiaľ čo signál poskytla len čast z makrofágov.

Pomocou protilátok proti o£,_;> bolo slabo ofarbené malé množstvo folikulárnych dendritických buniek prítomných v bielej pulpe. Farbenie pomocou protilátok proti CDlla a CD18 poskytlo signál ako v červenej, tak aj v bielej pulpe. Farbenie pomocou protilátok proti CDllc bolo výraznejšie u veľkých buniek prítomných v bielej pulpe sleziny (predpokladá sa, že ide o makrofágy) a v hraničnej zóne obklopujúcej bielu pulpu; bola tiež pozorovaná difúzne rozptýlená značka v červenej pulpe. Zdá sa, že distribúcia polypeptidu CDllb v červenej pulpe sa prekrýva, ale nie je identická, s distribúciou ale distribúcia CDllb v bielej pulpe.

n..i.e je pozorovaná

Bolci porovnávaná expresia integrínov v normálnom a (reumatodnom) artritiekom tkanive synovia. V zdravom (normálnom) tkanive bola, pri značení, akoukoľvek protilátkou namierenou proti integrínu (vrátane protilátok špecificky imunoreaktívnych voči CDlla, CDllb, CDllc, CD18 a tiež «<>), pozorovaná minimálna odpoveď s distribúciou značky na rezldentných bunkách, prevažne m a k r o f á g o c h . U z a p á 1 e n é h o tkaniva b o 1 a e x p r- e s i a v š e t k ý c: b integrínov viac lokalizovaná a to na bunkách nazhlukovaných okolo lymfatických ciev. Zatiaľ čo distribúcie expresie oŕ_D CDllb boli podobné, ukázalo sa, že polypeptid CDllc nie je exprimovaný v tak veľkej miere a jeho expresia je obmedzená len na podskupinu leukocytov.

U tkanivových rezov z pečene psa bola na pečeňových makrofágocb, čiže Kuppférových bunkách, pozorovaná expresia CDllb, ale nie expresia polypeptidu oŕ_c.. Značenie r ezov z pečene zdravých ľudí C uskutočňované postupom popísaným pre značenie rezov z psej pečene, distribúcie tejto značky n í z k a b 1 a d i n a e x p r e s i e p o s t i h n u t ý c h h e p a t d. 11 d o u pozri vyššie) potvrdilo konzervovanosť u človeka. Navyše tu bola delegovaná CDllc. V rezoch z pečene pacientov bola intenzita značky pre všetky leukoiotegríny vyššia, ako to bolo u normálnych pečení, zatiaľ čo na povrchu granulocytov a makrofágov bola v týchto vzorkách d e t e g o v a r i á e x p r e s i a p o 1 y p e p t i d u d _D .

Pri farbení. pomocou protilátok proti oí_d bolo u rezov z hrubého čreva zdravých ľudí pozorované len nevýrazné farbenie; bola pozorovaná slabá intenzita značky na bunkách hladkého svalstva a leukocytoch. U rezov získaných od pacientov postihnutých Crohnovou chorobou bola delegovaná zvýšená hladina e x p r e s 1 e v š e t k ý c h I e u k o int e g r í n o v .

Na rezoch z pľúc zdravých jedincov bolo pozorované obmedzené množstvo buniek pozitívnych na prítomnosť. ď_D; tieto bunky zodpovedali, morfologicky makrofágom a neutrof11om. U tkanivových rezov z pľúc postihnutých rozdutím bol výskyt značky proti oí_ľ:ipozorovaný u neutrofilov a makrofágov obsahujúcich hemoslderin, čo je pigment obsahujúci železo. Táto skutočnosť naznačuje pohltenie červených krviniek týmito bunkami.

Expresia integrínov bola takisto analyzovaná na tkanivových rezoch mozgu zdravých jedincov a tkanivových rezoch z lézií od pacientov postihnutých roztrúsenou sklerózou CMS ..... multiple sclerosis). ý tkanivových rezoch zo zdravých jedincov holo farbenie o<_c, mene j. intenzívne ako farbenie CDlla, CDllb a CDllc a toto farbenie bolo obmedzené na bunky, morfologicky a prítomnosťou CD68, zodpovedajúce mikrogliálnym bunkám. Bunky expr1mujúce CDllb boli sltované v miestach obklopujúcich cievy a rozptýlené v tkanive. CD 11.c⁺ bunky boli situované vnútri cievy, zatiaľ čo «ίο¹- bunky obklopovali tieto cievy, ý tkanivových rezoch z mozgu pacientov postihnutých 1*1 S bola expresia polypeptidu <z_ozistená ako na mikrogliálnych bunkách, tak aj na časti leukocytov iných ako makrofágov; oŕ_D ⁺ bunky boli situované vnútri lézií a takisto v kortexe týchto lézií. Signál. pre mal rovnakú intenzitu ako signál pre CDllc, ale je Intenzita bola nižšia ako pokiaľ, ide o signál pre CDllb.

Pomocou protilátok proti leukointegrínom a CAI*I boli analyzované vzorky tkanivových rezov ako hrudnej aorty, tak aj brušnej aorty z PDAY (Patobiologické Determinanty Aterosklerózy u mladých ľudí; LSIJ ľledlcal Center). Skúmané lézie zodpovedali aterosklerotlckým platom, ktoré pod intimou obsahovali agregáty v e 1 k ý c h p e o o v ý c h b u n i e k C p r e v a ž. n e m a k r o f á g o v n a p c h a n ý c h'' lipldmi) a boli infiltrované menšie leukocyty. Štúdie, pri ktorých boli samostatne použité protilátky špecificky namierené proti <Xi;, alebo iným a reťazcom integrínov e>_a C CDlla, CDllb a CDllc) spolu s protilátkou proti, ma r k éru makrof ágov (CD68) odhalili, že väčšina makrofágov napchaných lipldmi exprImovala oŕ_D a C D18 v priemernej hladine, zatiaľ, čo expresia CDlla bola slabá a expresia CDllc bola v rozmedzí slabá až stredná. CDllb bol exprlmovaný veľmi slabo a to len na časti makrofágov.

S cieľom zistenia relatívnej lokalizácie antigénu o<_D a ICAľl--R, boli na rezoch aorty uskutočnené štúdie, pri ktorých bolo použité súčasné značenie;: dvoma značkami. Keďže penové bunky v týchto rezoch boli značené namierenou proti markéru protilátkou Ham 56, špecificky ale neboli značené mak r o f ágov, protilátkami proti aktívnu buniek hladkej svaloviny, bolo stanovené, že penovej bunky neboli odvodenej od subintimálnych '74 buniek hladkej svaloviny. CD68'¹' makrofágy expriinujúce boli obklopené malými leukocytmi exprlmujúcimi ICAľl--R; tieto leukocyty boli takisto prítomné medzi CD68* makrofágmi exprlmu júcimi cŕ_o. Zdalo sa, že existuje obmedzené množstvo malých leukocytov, ktoré neexprimujú CD68, ale sú značené ako protilátkami proti αί_α, tak aj protilátkami proti ICAľl.....R.

Distribúcia polypeptid u na leukocyt o oh prítomných v tkanivách zdravých jedincov sa prekrývala, ale nebola identická.

CDllb s distribúciou leukointegrínov, ktoré boli už predtým charakterizované ako reťazce, ktorých expresia je omedzená na leukocyt. Bunková morfológia naznačila, že značkou namierenou proti o:_D sú farbené predovšetkým makrofágy a granulocyty a obmedzene lymfocyty. Všeobecne je možné povedať, že zápal v tkanive zvyšuje, spolu s výskytom vyššej intenzity značenia leukointegrínov, množstvo aj počet typov leukocytov pozorovaných v príslušnom tkanive. Keďže distribúcia leuk ointegrínov nebola v Identická, bolo odvodené, že každý člen má, v

CDllc, dvoma ďalšími cŕ reťazcami bunková a priestorová P a t o 1 o g i c k ý c h t k a n i v á c h rodiny in t e gr í no v, vrátane oío, f u n k e i e a 1 i g a n d y.

danom kontexte, odlišné

Zaujímavé

J e.

ze expresia polypeptidu aterosklerotických léziách bola výraznejšia ako expresia CDlla, CDllb a CDllc, čo naznačuje, že oíô môže brať kľúčovú úlohu vo vytváraní týchto lézlí. Spoločná distribúcia oŕ,_:7' a ICAľf-R' buniek, podporená dôkazmi naznačujúcimi možnosť interakcie medzi oŕ₀ a ICAľl.....R naznačuje, že polypeptid môže, v skorých štádiách týchto lézií, hrať úlohu pri infiltrácii leukocytov alebo pri ich aktivácil.

Značenie bunkových línií a leukocytov periférnej krvi

Bunková íinía promyeloidných monocytov HL60 značená protilátkami 1G9A a 169B bola analyzovaná s využitím FACS. Expresia a:_Ľl na povrchu týchto buniek je negatívne ovplyvnená stimuláciou pomocou Ι-’ľlA, ktorý indukuje difereciáciu po makrofágovej dráhe, ale nie ovplyvnená stimuláciou DMSO, ktorý Indukuje difereciáciu po dráhe granuloeytov CCollins a ďalší, Blood 70:1233 až 1244 (1987)3. Distribúcia značky bola (v analýze s využitím FACS) pri použití protilátok 169A a 169B pri stimulácii buniek pomocou PMA odlišná od distribúcie značky získanej pri použití inonoklonálnyoh protilátok namierených proti CDllb a CDllc. Bunková línia monocytov THP-1 je takisto slabo značená

P r o t i 1 á t k a m 3. J. 6 9 A pe r iférnej krvi patr iacich monocytov sa pr:i_ analýze a 169B. Navyše časť z leukocytov do oblasti (gate) lýmfocytov a s využitím FACS javila len slabo pozitívna. Časť monocytov perliérnej krvi bola slabo značená protilátkami 169A a 169B, zatial čo na povrch B-lymfocytov nebola zistená žiadna expresia oí_d. Časť CDS pozitívnych T-lýmfocytov bola tiež o:,-, pozitívna. Ďalej sa nepodarilo protilátkami 169A a 169B delegovať antigén na líniách B-buniek JY, Ramos, na línii bazofilov KU8Í 2 a na líniách I-buniek Jur kat, SKUI a Mol t 16.

Ma základ výsledkov analýz s bunkami HL60 boli, pomocou gradientovej centrlfugácie s nosičom Ficoll/Hypaque a následnou analýzou červených krviniek, z periférnej krvi izolované granulocyty. Všetky izolované preparáty obsahovali viac ako 90% F³ M N ( p o 3. y m o r f o n u k 3. e á r n y c b 1 e u k o c y t o v ) , ak o b o 1 o z 3. s t e o é vizualizáciou morfológie jadier v kyseline octovej. Jednotlivé populácie boli vystavené na 30 minút pôsobeniu 50 ng/ml alebo 10“^θ M formyl peptidu (fMLP), aby sa uvoľnili potencionálne spôsoby integrínov. Nestlmulované populácie vykazovali v porovnaní s IgGl kontrolou síce nízku, ale štatisticky významnú expresiu antigénov 169A a 169B, ktorá po stimulácii rástla. Hladiny expresie oí_C) a CDllc na povrchu polymorfonukleárnych leukocytov s3_ zodpovedali viac, ako tieto hladiny pozorované pre bunky HL60. Protilátka 169B bola potom použitá na precipitáciu heterodimérnej molekuly z blotinylovaných PMN lyzovaných detergentom. Podjednotky so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 150 resp. 95 kD zodpovedali veľkosti. oí_c> resp. CD18.

Výskyt ct_r_, na PMN nemohol. byť predpovedaný na základe znalosti &,_a u psov. Psie neutrof 11y, na rozdiel, od ludských náprotivkov, exprimujú na pomocných Ί-bunkách markér 604 a tiež Integrín VLA-4 ti teda môžu byť v organizme psov iné Ugandy a funkcie, ako je to u človeka.

Značenie subpopulácií PBL

Táto štúdia poslúžila o a určenie distribúcie integrínov i?>_;? v leukocytoch ľudskej periférnej krvi. Okrem toho bola porovnávaná hustota oí_d v porovnaní s inými iotegríoml Nakoniec bola tiež vyhodnotená okamžitá regulácia expresie oí_D v petrifikovaných 1 u d s k ý c h e o z i n o f i 1 o c h.

Leukocyty ľudskej periférnej krvi boli izolované centrifugáciou v hustotnom gradiente a rozdeleného do frakcie mononukleárnych buniek C s obsahom monocytov, lymfocytov a bazofilov) a do frakcie granulocytov Coeutrofily a eozlnofily) L Warner a ďalší., J. Immunol. Meth. 105:107-110 C1987) J . Pre niektoré experimenty boli eozlnofily purifikované imunomagnetlcky na čistotu väčšiu ako 95% použitím 6016 [Hansel a ďalší, J. Immunol. I*leth. 1.22:97 103 <1989)1. Kožné žírne bunky boli enzymaticky oddelene’ z ľudskej kože a namnožené, ako to holo popísané vyššie tLawrence a ďalí, J. immunol. 1.39:3062—3069 <1987)1.

Bunky holi značené v hodnými r i edeni am i monok1oná1ny c h p r o t i 1 á t o k š p e c i f 1 c k y <H5A4), GDI1c <BU-15) z a r a d e n ý m y š a c. í 1 g G1.

IgG konjugovaňou s bunky inkubované v n a m i e r e n ý c. h p r o t i C D11. a < 1*1 H 1*12 4 ), C D11B alebo proti oí_d <1..69A). Ako kontrola bol Bunky boli. premyté a potom inkubované s koziou protilátkou namierenou proti myšacím fykoerytrínom. V niektorých pokusoch boli nadbytku myšacieho IgG a myšacej monoklonálnej protilátky alebo kozej polyklonálnej protilátky, ktoré boli značené Ι-1Γ6 <špecifické pre antigén konkrétnej bunky) <napríklad 603, 604 alebo 608 pre T-bunky; 0016 lymfocyty pre NK bunky; anti.....igE pre bazofily) ĽBochner a ďalší, J. Immunol. I*leth. 125:265--271 <1989)3. Potom holi tieto vzorky skúmané prietokovou cytometriou CCoulter EPT.6S profil) pri použití vhodného gatingu, aby mohli byť identifikované podskupiny buniek.

V experimentoch s ľudskými eozlnofÍlmi bola skúmaná okamžitá aktlvácia expresie oí,₃ . Bunky boli stimulované 15 minút pri 37 °C esterom forbolu <10 ng/ml), RANTES C100 ng/ml) Iľ.Schal1, Cytokino 3:155--183 20 (1991)ľJ alebo interleukInom (10 ng/ml) a potom boli značené rôznymi monoklonálnynd protilátkami, ako je to popísané vyššie.

Výsledky ukázali, že polypeptid oc,-, bol prítomný na všetkých e o z 1 n o f i 1 o c h, b a z o f 11 o c h, n e u t r o f i 1 o c: h, m o n o c y t o c h a N K - b u n k á c: h periférnej krvi. Tiež malý podiel (približne 30%) CDS* lymfocytov vykazoval expresiu oí_t;,. Kožné žírne bunky a 004' lymfocyty pod jednotku oč,_::, neexprimovali. Všeobecne sú CDlla a CDllb prítomné na leukocytoch vo vyššej hustote ako oŕ_D. P od jedno t k a o:_c> je exprimovaná na relatívne nízkej hladine expresie CDllc. Pokial ide o leukocyty, je polypeptid a:,-, s najväčšou hustotou exprimovaný na monocytoch a CD8¹ bunkách, zalial čo eozinof.ily majú úroveň expresie najnižšiu. Hladina expresie na neutrafÍloch, baza fÍloch a NKbunkách je stredná.

Akt i v á c 1 a e o z i n o f L 1 o v p e r i f é r n e j krvi v y v o 1 a n á p ô s o b e n í m

CC-chemokínu RANTES nespôsobuje zmenu v expresii i n t e g r í no v i?>

Pôsobenie estéru forbolu malo však dvoj..... až trojnásobné zvýšenie expresie CDllb žiadneho z za následok ot_r!, avšak neovplyvnilo expresiu CDlla alebo CDllc. Pôsobením interleukinu

11-5 sa selektívne aktivovala n e b o 1 a o v p 1. y vn e n á hla d i o či pi o d j e d n o 11 e k .

e x p r e s i a p o d j e d n o 11< y C D11 b, p r i č o m expresie Iných integr ínových

Získané výsledky ukázali, že podjednotka je u leukocytov perl.f éroo j krvi exprimovaná v pr ibližne rovnakom množstve ako podjednotka CDllc. Najvyššia hladina expresie bola zistená oa monocytoch a populácii CD8* lymfocytov. Žírne bunky ludskej kože polypeptid oí,, neexprimovali. Pokial ide o purif lícované eozlnof11y, boli vnútri cytoplazmy objavené predvytvorené zásoby pod jednotiek CDllb a oí_C). Z pozorovanej rozdielne j aktivácle interleukínom IL-b oproti F’ľlA sa usudzuje, že tieto zásoby P o d j e d n o t i e k s ú o d s e b a o d d e 1 e n tá .

Distribúcia značky u subpopulácií leukocytov periférnej krvi (PBL) bola tiež určovaná metódou prietokovej cy tonie trie pri použití kombinácie gatingu (definovanie jednotlivých bunkových typov na základe hodnôt rozptylu svetlil meraných v priamom smere a v uhle 8D °C) a povrchových značiek, ako to bolo popísané vyššie. Táto metóda bola použitá pri pokuse presnejšie definovať populáciu lymfocytov, ktorá exprimu je 169 A/B. PBL boli izolované pomocou Ficollu, postupom popísaným vyššie a jednotlivo označené protilátkami 169A, 169B a monoklonálnymi protilátkami proti CD14 C z n a č k a m o n o c y t o v a mak r o f á g o v ) , C D 2 0 ( B - b u o k y ), C D 5 E! (N K- b u n k y ) , receptora cx/e> Ϊ-buniek (T-bunky), CD16 (néutrofily a NK-bunky) a oí4 C negatívny markér neutr ofilov) . Jednotlivé oblasti (gates) boli de f in o varná na základe buniek a distribúcie značiek.

Získané výsledky naznačujú, že bunky v oblasti (gate) C D14' monocytov vykazujú nízku hladinu značenia protilátkami 169 A a 169B. Bimodálna distribúcia značky pozorovaná v predchádzajúcich experimentoch v oblastiach (gate) lymfocytov bola rozlíšená pri zvýšenom rozptyle meranom v priamom smere. Zmiešaná TCR~''/C02D buniek vykazovala nízku, ale homogénnu hladinu expresie antigénov pre 169A/B. Populácia mapovaná pri mierne zvýšenom bočnom rozptyle (bunková komplexita), ktorá bola pre CDS 6 z 150X pozitívne označená, sa ukázalo jasne 169A/B nagetívnou populáciou. Negatívna populácia nebola takisto rozpoznaná pomocou protilátok namierených proti. TCR, CD2D, CD'14 alebo CD16.

Distribúcia ac_D v synoviu

S cieľom určenia distribúcie polypeptidu ďalších integrínov a ich príslušných receptorov u zápalovej a nezápalovej synovie boli použité imunohlstologické štúdie využívajúce monoklonálne protilátky namierené proti rôznym integrínom a supergénovým rodinám imunoglobulínov. Expresia proteínov bola stanovovaná v normálnych, osteoar'tritidických a reumatodiných tkanivových kultúrach synovi!.

Získané výsledky naznačujú, že vrstva epiteliálnych buniek synovia iná vysokú úroveň expresie V C Al*l -1, CDllb/CD18 a rf_o/CD1.8. V týchto bunkách je obmedzená expresia CDllc/CD 1.8 a expresia CDlla/CD18 nie je väčšinou delegovaná. Pri r eumatoidnorn artrltlckom zápale synovlálnej blany vzrastá expresia integrínu e._r;, na synovlálnych bunkách úmerne stupňu hyperplázie. Množstvo buniek exprimujúcich CDllc sa podstatne zväčšuje, čím sa blíži, množstvo buniek exprimujúcich CDllb a «_o, ale nie je pozorované zvýšenie expre s i e C D11a.

V šube p i t e1iá1nych ob1astiach lymfocyty, vo forme agregátov r o z s t r ú s e n é m e d z 1 C D 6 8 / C D11 b / ac tkanív sú CD3/CDlla/ICAM-R* a difúznych infiltrátov, makrof ágmi.. Na vysoký počet a g r e g á t o v p o u k a z u j e i n t e n z 1 v n e oblastiach bohatých na T-bunky.

značenie rfo to hlavne

Synovlálny endotel premenlivo exprimuje ICAM--1 a 1CAM-2, minimálnymi stopami expresie 1CAM-R.

a. j v týchto v epiteliálnych, tak veľk ému poinnoženiu

Tieto výsledky dokazujú, že synoviálne makrofágy a makrofágom podobné synoviálne bunky konštitutívne exprlmujú vysoké množstvo pod. jednotiek CDllb a In t egri.no v . Pri zápale synoviálnej blany dochádza, ako s u b e p i. t e 11 á 1 n y c h o b 1 a s t i ach, k populácií buniek, súčasne so zrejmým nárastom v expresii CDllc. S p (2 c 1. f i c ké p o p u 1 á c i e r e um a t o i. d n ý c h s y n o v i á 1 n y c h ľ - i. y m f o c y t o v exprimujú nielen CDlla a ICAM-R, ale tiež veľké množstvo rf_o. Táto molekula, ako bolo ukázané vyššie, je exprimovaná v nízkej úrovni na lýmfocytocb periférnej krvi.

Príklad 17

Izolácia kloriov potkanej cDNA

Vzhladom na existenciu psích í; ľudských pod jednotiek oí₀ holi uskutočňované pokusy izolovať homológne gény z iných druhov, v r á t a n e 1 a b o r a t ó r n y c h μ; o t k a n o v C t e n t o p r í k 1 ad) a m y š 1 C P r í k 1 a d 17, pozri vyššie).

Čiastočná sekvencia potkanej cDNA vykazujúca homológiu l< ľudskému génu pre bola získaná využitím lambdadtlO knižnice z potkanej sleziny (Clontech). Knižnica bola vysiata v koncentrácii 2 x 10* pfu/miska na LBM/agarových miskách s priemerom 150 mm.

Knižnica bola prenesená denaturovaná 3 minúty, 3 na membránu Hybond (Amersham), minúty neutralizovaná a 5 minút premývaná puf r am i popísanými v štandardnom protokole E Sarnbrook a ďalší, ľlolecular Cloning: a laboratory manual, strana 2.1103. Membrány boli okamžite prenesené do Stratallnkéra (Stratagene) a DNA zosieťovaná pomocou autozosieťovacieho nastavenia. S cieľom dosiahnutia podmienok, pri ktorých je pre hybridizáciu potrebný nízky, resp. vysoký stupeň komplementarity medzi sondou testovanou sekvenciou, boli membrány prehybrldizované a bybrldlzované v 30% resp. 50% formamide. Membrány boli na začiatku testované pomocou sondy značenej ^3:2P získanej z cDNA kódujúcej ľudský zodpovedajúcej oblasti., od bázy 500 do 2100 v klone 19A2 (SEK. ID. č.: 1). Sonda bola pri použití kitu Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupom doporučeným výrobcom, rádioaktívne označená. Filtre boli premyté v 2x SSC pri teplote 55 °C.

Boli identifikované dva klony, označené 648.3 a 705.1, ktoré vykazovali sekvenčnú homológiu k sekvencií ludského cč,-„ ľudského CDllb a ludského CDU c. Obidva klony zodpovedajú 3' oblasti génu pre ľudský os_c, a začínajú od bázy 1871 a pokračujú až. k báze 3012. pre kloň 648.3, resp. od bázy 1551 až k 3387 pre kloň 705.1.

S cieľom získania úplnejše.j potkanej sekvencie, zahrnujúcej aj oblasť zodpovedajúcu 5' koncu, bola, postupom rovnakým ako pre prvé testovanie, opäť testovaná rovnaká knižnica, ale pri tomto testovaní, boli použité myšacie sondy získané z k lonu A1160 (pozri Príklad 17, pozri nižšie). Pomocou druhého testovania boli vyselektované jednotlivé izolované plaky, ktoré boli uchované ako jednotlivé klony na miskách s LBI*l/agar. S cielom vytvorenia DNA použiteľnej pre sekvenovanie, boli v štandardnej PCR reakcii použité sekvenačné priméry 434F t a 434FR (SEK. ľ. D. é.: 34 resp. 35) .

5’-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3' (SEK. ID. č.·. 34)

5'-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3’ (SEK. ID. č.: 35)

DNA získaná metódou PCR bola purifíkovaná pri použití kolóny Uuick Spln (Uiagen) podľa protokolu doporučeného výrobcom.

Boli identifikované dva klony, označené 741.4 a 741.11, ktorých sekvencie sa prekrývali so sekvenciami klonov 684.3 a 705.1; v prekrývajúcich sa oblastiach boli klony 741.4 a 741.11 100% homológne s kIónmi 684.3 a 705.1. Zložená potkania cDNA homológna k ľudskému génu pre oí_C), je zobrazená v SEK. ID. č.= 36; predpovedaná aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEK. ID: č.: 37 .

Klonovanie 5' konca sekvencie kódujúcej potkaní o<_CJ

Fragment 5’ konca cDNA pre gén získaný z potkanej sleziny s využitím (Clontech) postupom doporučeným výrobcom. špecifické pre tento gén boli označené 741 ID. č.s 59 resp. 58).

kódujúci potkaní oí_d bol klonovacieho kitu RAČE F³ o u ž i t é o 1 i g o n u k 1 e o t i d y .114217 a 741.241R (SEK.

5’-CCAAAGCTGGXTGCATCCTCTC 3’ (SEK. Dl. č.; 59)

5’ -GGCC.TTGCAGCTGGACAATG-3’ (SEK. ID. č.; 58)

Oligonukleotid 741.1142R zahrnuje bázy 131 až 1.52 v SEK. ID. č.= 36 v opačnej orientácii a oligonukleotid 741.241R zahrnuje bázy 696 až 715 v SEK. ID. č.: 36 tiež v opačnej orientácii.

Primárna reakcia PCR bola uskutočnená pri použití oligonukleotidu

741.2#1R vymedzujúce 3’ koniec kódujúceho vlákna (najbližšie 3’ -koncu) . Následná druhá reakcia PCR bola uskutočnená pári použití oligonukleotidu 741.11#2R a DNA získanej z prvej reakcie. Na IX agarózovom géle bol delegovaný prúžok s velkoslou približne 300 párov báz.

Produkt ci o p o r u Č e n é h o (Invitrogen).

druhej reakcie PCR bol, podía protokolu výrobcom, zaklonovaný do plazmldu pCRTAII Do každej z 96 jamiek (s gulatým dnom) na doštičke pre tkanivové kultúry, boli, do 100 ul LBľl média obsahujúceho 1 ul zásobného roztoku karbenicilínu s koncentráciou 5Omg/ml a 1 ul kultúry fágu 1*113 K07, pridané biele (pozitívne) kolónie. Zmes 30 minút až jednu hodinu pri teplote 37 °C. Po bolo pridaných 100 ul LBľl média (obsahujúceho 1 ul zásobného roztoku karbenicilínu s koncentráciou 50mg/ml. a zásobný roztok kanamycínu s koncentráciou .10 mg/ml v riedení bola inkubovaná t e j t o i. n k u b á c i. i

1.250) a inkubácia pokračovala pri teplote 37 °C cez noc.

Sterilnou kovovou transferovou vidlicou bol supernatant z

96.....jamkovej doštičky prenesený na štyri nyIónové filtre Hybond

Filtre boli denaturované, neutralizované a DNA podlá štandardných protokolov. Filtre boli (Amersham). zosieťovaná prehybridizované pri stálom trepaní v 20 ml prehybridizačného pufra (5x SSPE; 5x Denhardts; IX SOS; 50 ug/ml denaturovanej DNA z lososích spermií) pri teplote 50 °C počas niekolkých hodín.

Oigonukleotldové sondy 741.11#1 a 741.11#1R (SEK. 57), zahrnujúce páry báz 86 až 105 (SEK. ID. č.: 36) r e v e r z ne j o r i e n t á e i i, bo1i rádioak tívne označené n a pôsobom.

ID . č.: 56 v priamej sledujúcim

5'.....CCTGTCATGGGTCTAACCTG3 ’ (SEK. 10

56)

5‘.....AGGTTAGACCCATGACAGG-3 (SEK. ID

57)

Približne 66 ng oligonukleotidovéj DNA bolo dve minúty pri teplote 65 °C zahrievaných v 12 ul dH_ÄO. Do skúmavky boli pridané ul 10 rnCi/ml τ-^Ρ-ΑΤΡ spolu s 4 ul 5x pufra pre kinázu (Gibco) a 1 ul DNA kinázy 14 (Glbeo) . Zmes bola inkubované 30 minút pr i. teplote 37 °C. Po skončení inkubácie bolo 16 ul každej zo značený c h o 1 i g o n u k 1. e o t i d o v ý c h s o n d p r i d a n ý c h k f litrom v P r e hybridizačnom pufrl a inkubácia pokračovala pri. 42 °C cez noc. Filtre boli. trikrát, počas 5 minút pri. izbovej teplote, premývané roztoku 5x SSPE s 0,1% SDS a 6 hodín autorádiografované. Pozitívne klany boli. namnožené a DNA bola purif ikovaná kitom pre minipreparáciu DNA ľlagic Mini. (Promega) podl'a výrobcom doporučeného protokolu. Pre sekvenovanie bol vybraný kloň 2F7 a tento kloň vykázal, v prekrývajúcej sa oblasti, 100% homológiu ku klonu 741.11. Kompletná potkania nukleotidová sekvencia génu pre d_a je zobrazená v SEK. ID. č.: 54; amlnokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.= 55.

Charakteristlky potkane cDNA a aminokyselinovéj sekvencie

Nukleotidová ani amlnokyselinová sekvencia potkanej pod jednotky integrínu neboli, predtým publikované. Porovnanie týchto sekvencií s publikovanými sekvenciami kódujúcimi, pod jednotky a ľudských in t egri.no v naznačuje, že izolovaný potkaní, kloň podjednotky oí_c má veľmi podobnú nukleotidovú a am i n o k y s e 1 i n o v ú s e k v e n c i u .

Na úrovni sekvencie potkanej cDNA 80% zhodu v nukleotidov vykazuje izolovaný kloň porovnaní s cDNA pre .ľudský c<_o; 68% zhodu s cDNA pre ľudský CDllb; 70% zhodu s cDNA pre ľudské CDllc a 65% zhodu s cDNA pre myšací CDlla.

Na úrovni sekvencie aminokyselín vykazuje predpokladaný potkaní. polypeptid, kódovaný izolovanou cDNA, 70% zhodu v porovnaní s ľudským polypeptldom a:_o; '28% zhodu s ľudskou podjednotkou CDlla; 58% zhodu s ľudskou podjednotkou CDllb; 61% zhodu s ľudskou pod jedno t kou CDllc; 2.8% zhodu s myšacou pod jednotkou CDlla ta 55% zhodu s myšacou pod jednotkou CDllb.

Príklad 18

Produkcia a charakterizácia protilátok špecificky namierených P r o 11 p o d j (3 d n o t k e <z _o h 1 o d a v c o v

A. Protilátky namierené proti fúznym proteínom doména 1 P o t k a n 1 e ho p o 1 y p e p t i (d u <z _D / H u I g G 4

Keďže bolo dokázané, že doména 1 ludského integrínu e-, sa zúčastňuje na väzbe Ugandu, predpokladalo sa to isté pre potkaní proteín <z_D. Imunošpecifické monoklonálne protilátky proti <z_D by preto mali byt užitočné u potkaních modelov ľudských chorôb, pri k t o r ý c h h r á ú 1 o ti u väz b a p o d j e d o o t k y cz _c,.

Oligonukleotidy alfa--D15 (SEK. ID. č.: 87) a alfa—Dl'3 (SEK.

ID . č . : 88) b o 1 i v y t v o r e n é z o s e k v e n c i e r-’ o t k a n e j cz _Ľ)zodpovedajúcej oblasti bázy 469 až 493 resp. 1101 až 1125 (v reverznej orientácii) v SEK. ID. č.: 54. Oligonukleotidy boli použité v Štandardnej PCR reakcii pre vytvorenie fragmentu DNA kódujúceho potkaní. <z_o s obsahom domény 1 oblasti báz 459 až 1125 v SEK. ID. č.: 54. Produkt PCR bol vklonovaný do vektora pCR1AII (Invitrogen) podľa výrobcom doporučeného protokolu. Bola vybraná pozitívna kolónia a z jej rozrastenej kultúry bola, pri použití kitu pre izoláciu DNA ľlidi Prép” firmy Qiagen (Chatswoth, CA) podlá protokolu výrobcu, Izolovaná DNA. DNA bola klasicky naštiepená reštrikčnými enzýmami Xhoi a BglII. Vzniknutý fragment s veľkosťou 600 báz bol izolovaný z gélu a potom zaklonovaný do expresívneho vek tora pDCSľ.L/HuIgG4. Pozitívne kolónie boli selektované a namnožené a pri použití kitu pre izoláciu DNA 1*1 a x 1¹' f i r m y 0u i a g e n z n i c h b o 1 a p u r i f i k o v a n á D N A .

Bunky COS boli v polovičnej konfluencii vysiate na misky s priemerom 100 mm a kultivované cez noc pri teplote 37 °C v 7% COs,. Bunky boli lx prepláchnuté 5 ml média D 1*1 E 1*1. K 5 ml DMEM bolo pridaných 50 j..tl DEAE-Dextánu, 2 jil chlórokinu a '15 ug potkanej DNA kódujúcej fúzny proteín doména 1 polypeptidu <z_o/Hu lgC4 popísaný vyššie. Táto zmes bola pridaná k bunkám CCS a bunky boli inkubované tri hodiny pri teplote 37 °C. Médium bolo odstránené a bunky beli. presne jednu minútu inkubované v 5 ml 10% DMSO v CMF-PBS. Bunky boli raz mierne prepláchnuté v DMEM. K týmto bunkám bolo pridaných desať mililitrov DMEM obsahujúceho 10% FBS a inkubácia pokračovala cez noc pri teplote 37 °C v 7% Cf .t>. Ďalší deň bolo médium nahradené čerstvým médiom a inkubácia prebiehala nasledujúce tri dni. Toto médium bolo odobrané a do misky bolo pridané čerstvé médium. Po troch dňoch bolo médium opát odobrané a misky boli vyhodené. Postup bol opakovaný, dokial neboli z kultúry získané 2 litre supernatantu.

Supernatant získaný vyššie popísanou metódou bol nanesený na k o I. ó n u P r o s e p - A (Bi o p r o e e s s i n g L i m i t e d ) a p r o t e i n b o 1 purifikovaný postupom popísaným nižšie.

Kolóna bolel najprv premytý 15 násobným objemom premývacieho pufra obsahujúceho 35 mM Tris a 150mM NaCI s pH - 7,5.

Supernatant bol. nanášaný pri rýchlosti menšej ako približne 60 objemov kolóny za hodinu. Potom bola kolóna premytá 15-násobným ob jemom premývacieho pufra, 15-násobriým objemom roztoku 0, 55 M dietanolamínu s pH = 8,5 a 15-násobným objemom roztoku 50 mM kyseliny citrónovej s pH = 5,0. Proteín bol eluovaný roztokom 50 mM citrónove j kyseliny s pH - 3, 0 a ďale j neutralizovaný roztokom 1,0 M Tris a dialyzovaný do sterilného roztoku PBS.

Doména I potkanieho proteínu oí₀ bola analyzovaná postupom popísaným v Príklade 14. Delegovaný proteín putoval, rovnakým spôsobom ako proteín .ľudskej domény 1.

B. Produkcia monoklonálnych protilátok namierených proti fúznemu P r o t e í n u do m é n a I p o t k a n i e f t o poly p e p t i d u oŕ ,-> / H u I g G 4

Myši boli Jednotlivo imunizované ĽQ ug purlfikovaného fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu o<_a/HuIgG4, ktorý bol najprv emulgovaný rovnakým objemom Freundovho kompletného adjuvans (Sigma). Približne 200 j..il. tohoto preparátu bolo na štyroch miestach vs t r leknu tých do chrbát u a boku myši. (J dva týždne neskôr bola mys druhý raz indikovaná 100 ul antigénu doména I potkanieho polypeptidu oŕ_D/HuIgG4 C v množstve 50 ug/ml), ktorý bol predtým emulgovaný rovnakým objemom Freundovho nekompletného adjuvans. Počas nasledujúcich dvoch týždňov boli myšiam intravenózne aplikovaných 50 ug antigénu v 200 ul roztoku PBS.

S cieľom zistenia titru krvného séra imunizovaných myši bol desať dni po tretej imunizácii uskutočnený retroorbitálny odber krvi. Krv sa nechala zraziť, sérum bolo izolované centrifugáciou a použité na imunoprecipitáciu proteínov zo slezinných buniek potkanov značených blotinom CBIP). Sérum získané z každej myši imunoprecipitovalo proteínové prúžky s molekulovou hmotnosťou

P r e d p o k 1 a d a n o u p r e pre fúziu a štvrtý t r e t i u 1 n j e k c i u ) .

potkaní cí_a a CD 18. Jedna z myši bola vybraná raz injikovaná, postupom popísaným vyššie C pre

Protilátky v superoatantoch získaných kultiváciu hybridómov boli testované nasledujúcim spôsobom. Štyri doštičky Tmmulon CDynatech, Cambridge, Massachusetts) boli pri teplote 4 °C potiahnuté kozinu protilátkou namierenou proti myšacím imunoglobulínom IgA, IgG alebo ľgľl COrganon Teknlka) v množstve ul/jamka, zriedenou v pomere 1:5000 v uhličitanovom puf r i s pH = 9,6. Doštičky boli trikrát premyté pufrom PBS obsahujúcim 0,05/ Tween 20 CPBST) a bolo do nich pridaných 50 ul supernatantu získaného z bunkových kultúr . Po inkubácii prebiehajúcej '30 minút pri teplote 37 °C a premytí, postupom popísaným vyššie, bola pridaná kozia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou namierená proti myšaciemu IgG9CFc) CJackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zriedená v pomere 1:3500 v roztoku PBST.

Misky boli inkubované, postupom popísaným vyššie, a štyri razy premytej roztokom PBST. Hneď potom bolo pridaných 100 ul substrátu, ktorý obsahoval o~fenyléndlamín v koncentrácii 1 mg/ml (Sigma) a 0,1 ul/ml 30/ H->fl> v 100 mM citrátu s pH = 4,5. Farebná reakcia bola po 5 minútach zastavená prídavkom 50 ul 15/ H^SCU. Absorbancia bola stanovovaná pri vlnovej dĺžke 490 nm na čítačke doštičiek Dynatech.

Superriatant z jamiek obsahujúcich protilátku bol ďalej analyzovaný metódou ELISA pri použití linobilizovanébo fúzneho proteínu doména I potkanieho polypeptidu oí,-,/HulgG4. Ako kontrola reaktivity proti fúznemu partnerovi IgGi bola použitá metóda ELISA, pri. ktorej boli doštičky potiahnuté protilátkou HulgG4. Pre ďalšie testovanie metódou E3IP s potkaním slezinným lyzátom boli, technikami popísanými vyššie, selektované pozitívne reagujúce jamky.

C. Produkcia polyklonálneho séra namiereného proti, fúznemu proteínu doména I potkanieho polypeptidu oŕ_D/HuIgG4

Dvom adjuvans, využitím potkanieho králikom bola pred imunizáeiou, uskutočňovanou s 100 j.ig purif Ikovaného fúzneho proteínu doména I polypeptidu cŕ_D/HuIgG4 vo Freundovom kompletnom odobraná krv. Každé tri týždne boli králiky injikovani rovnakou dávkou, tentokrát však vo Freundovom nekompletnom adjuvans. Po troch injekciách bola králikom odobraná krv a získané sérum bolo použité pre štandardnú imunoprecipltáciu s lyzátom potkaních splenocytov. Sérum z obidvoch králikov bolo imunoreaktívne voči potkaniemu polypeptidu d_r_,. Králiky boli opäť injikované 100 ug antigénu vo Freundovom nekompletnom adjuvans a získané sérum bolo, s delom detekcie rastúcej imunoreaktivíty, testované iinunoprecipitáciou s potkaním Po desiatich dňoch od aplikácie poslednej posilňovacej dávky bola králikom odobraná krv a získané sérum.

Histológia potkanieho d_rj

Králičie polyklonálne sérum namierené proti. doméne 1 potkanieho polypeptidu o<_D bolo použité pri. imunobi.stochemi.ckom značení potkaních tkanivových rezov. Toto značenie bolo uskutočňované technikami, popísanými v Príklade 16. Distribúcia značky, zistená na zmrazených alebo do parafínu zapustených rezoch potkaních slezín, bola v podstate identická s distribúciou pozorovanou pri značení jednotlivých buniek vnútri červenej pulpy protilátkami proti ludskému α;_ο. Distribúcia značky sa líšila od yy distribúcie značky pri značení. uskutočňovanom pomocou monoklonálnych protilátok namierených proti potkaniemu CDlla, CDllb a CD18. Okrem toho bol pozitívny signál detegovaný u jednotlivých buniek v kôre týmusu. Ani jedno z týchto tkanív neposkytlo pozitívny signál pri značení králičím sérom odobraným p r e d im u n i z á c i o u .

D . A n a 1 ý z a š p e c i f i c i t y p r o t i 1 á t o k

Potkany boli usmrtené asfyxiou oxidom uhličitým a ich sleziny boli odobrané štandardnými technikami. Slezinné bunky boli získané jemným pretlačením sleziny pomocou piesta injekčnej striekačky cez drôtené sitko do 20 ml RPMI média. Bunky boli zozbierané do kónickej banky s objemom 50 ml a premyté vhodným pufrom.

Bunky boli trikrát premyté roztokom studeného D-PBS a rozsuspendovaná na hustotu 1.0® až IC'⁵’ buniek v 40 ml PBS. K suspenzii buniek boli pridaného štyri mg NHS—Biotínu (Pierce) a reakcia prebiehala pri izbovej teplote presne 15 minút. Bunky boli scentrlfugované a trikrát premyté studeným D-PBS.

Bunky boli v studenom lyzačnom pufri (zloženie: mM Tris-HCl s pH = 8,C; 150 mM NaCl; 2 mM CaCI_sroztok pepstatinu, leupeptinu a aprotinu v riedení í

IX NP40; 50 2 mM MgCl; 1.00 pridaný do pufra pred pridaním buniek; a 0, 0001. g kryštalického PMSF pridaného do pufra tesne pred pridaním buniek) rozsuspendovaná na hustotu 10® buniek/ml. Lyzáty boli pretrepávané 30 sekúnd, potom inkubované 5 minút pri Izbovej teplote a ďalej 15 minút na lade. Potom boli centrif ugované 10 minút pri 1.0 OOOxg, aby sa odstránil nerozpustný materiál.. Supernatant bol prevedený do novej skúmavky a uchovaný pri teplotách v rozmedzí. 4 ^,:>C až 20

Jeden mililiter inkubáciou s 200 ul uskutočňovanou cez noc i u n k o v é h o lyzátu b o1 s u s p e n z i e p r o t e í n u pri teplote 4 čias t očné prečistený A-Sepharózy (Zymed)

Takto prečistený lyzát bol pre každú testovanú protilátku rozdelený do mikrosk únia vlek v objeme 50 μΙ/skúmavka. K lyzátu bolo pridaných 25 μΐ polyklonálneho séra alebo 100 až 500 ul supernatantu obsahujúceho monoklonálnu protilátku a táto zmes bola pri stálom trepaní inkubované 2 hodiny pri 4 °C. Potom boli pridaných 100 ul králičej protilátky namierenej proti myšaciemu IgG (Jackson) viazanej na guľôčky Sepharózy s proteínom A v PBS a inkubácia pokračovala pri stálom trepaní 30 minút pri izbovej teplote. Po miernej centrifugácii boli guľôčky trikrát premyté studeným premývaním pufrom (zloženie: 10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1/ Triton X-100). Supernatant bol odstr ánený odsatím a ku guľôčkam holo pridaných 20 ul 2x SOS vzorkového pufra obsahujúceho 10% β-merkaptoetanolu. Vzorka bola ponorená 2 minúty vo vodnom kúpeli a nanesená na 5% SDS-polyakrylamidový gél pre elektroforézu. Po rozdelení boli proteíny prenesené na nitrocelulózovú membránu. Tento prenos prebiehal cez noc pri konštantnom prúde. Membrána bola blokovaná 1 hodinu pri izbovej teplote v 3% BSA v pufri T F3 S - T . F’ o o d s t r á n e n í b 1 o k o v a c i e h o p u f r a b o I. k v n ú t r o c e 1 u 1 é z o v e j membráne pridaný konjugát streptavidin-HRP (Jackson) v 0,1% BSA v Pufr i IBS-T a inkubácia pokračovala ďalších 30 minút pri izbovej teplote. Membrána bola trikrát počas 15 minút premývaná pufrom IBS-· T. Následná autorádiogr af la bola uskutočnená kitom ECL (Amersham) postupom doporučeným výrobcom.

E. Produkcia monoklonálnych protilátok namierených proti neskrátenému potkaniemu proteínu

P u r i. f i k á c i a p o t k a n i e h o p r o t e í n u d _o

S cielom m o n o k 1 o n á 1 n y c h p o 1 y p e p t i d u d _Dslezinných normálnych) prípravy imunogénu použiteľného pre P r o t i1átok n am1e r enýc h p r o t i d o p u r i f i k o v a n ý z izolované starých 12 produkciu potkaniemu potkaních z približne 50 až 20 týždňov.

b o 1 p o t k a n í p r o t e í n buniek. Sleziny boli samíc potkanov Leuis

Jednotlivá bunková suspenzia bola získaná pasírovaním tkaniva cez jemné drôtené sitko. Červené krvinky boli odstránené lýzou v pufrl. s pH - 7, 4 obsahujúcom 150 mM NH^.C1, 10 mM KHCO₃, 0, 1 mM

EDTA a zvyšné leukocyty boli. dvakrát premyté pufrom PBS. Slezinné bunky boli odstredené a lyzované v pufrl obsahujúcom 50 mľl Trís, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl^, 2 mM MgCl_Ä, 1.0 mM PMSE, leupeptín, pepstatln a 1% Triton X - 100. Lýza slezinných buniek prebiehala na lade počas 30 minút v jednom mililitri lyzačného pufra na 5 x 10® slezinných buniek. Nerozpustný materiál bol odstránený c e o t r i f u g á i?, i o u .

Polypeptidy CDlla, CDllb a CDllc boli zo slezinného lyzátu o d s t r á n e n é im u n o p r e c i. p i t á c i o u u s k u t o č ŕí o v a n o u p o s t u p on, p o p i s a n ým ďalej. Počas 30 minút bolo, pri teplote 4 °C, '750 i..il .suspenzie protein A-Sepharózy inkubovaných s 2 mg králičej protilátky namierenej proti myšaciemu imunoglobulinu. Vzniknutý komplex bol trikrát premytý pufrom a nakoniec rozsuspendovaný v 1, 5 inl K 50 ml potkanieho slezinného lyzátu bolo pridaných približne 200 u g každej zo špecifických monoklonálnych P r o t i 1 á t o k, 515 E ( š p e c i f i c k y n am i e r e n á p r o t i p o t k a n i em u C D1 la),

0X--42 (špecificky namierená proti potkaniemu CDllb) a lOOg (špecificky namierená proti potkaniemu CDllc). Po 30-miriútovej inkubácii pri teplote 4 °C bolo k lyzátu pridaných 500 ul komplexu králičej protilátky s protein A-Sepharézou a táto zmes bola trepaná pri teplote 4 °C počas 30 minút na trepáčke. Lyzát bol centrifugovaný pri 2500xg počas 10 minút, aby sa oddelili 0011a, CDllb a CDllc naviazané na komplex králičej protilátky s protein A~ Sepbarózou. Supernatant bol prevedený do novej centrif ugačne j k y vety. Táto linunopreclpitácia s protilátkami 51.5F, 0X 42 a lOOg bola opakovaná ešte dvakrát, aby bolo zaistené kompletné odstránenie CDlla, CDllb a CDllc.

Zvyšné integríny e_a boli z lyzátu izolované pomocou afinitnej chromatografie. K lyzátu bolo pridaných približne 250 ul suspenzie obsahujúcej monoklonálnu protilátku 20C5B namierenú proti myšaciemu CD18 naviazanému na CNBr-Sepharózu a vzniknutý roztok bol pri teplote 4 °C trepaný počas 30 minút na trepačke. Komplex protilátka/antigén bol centrif ugovaný pri. 2500xg počas 10 minút, peleta bola trikrát premytá lyzačným pufrom a skladovaná pri teplote 4 °C.

Im u n 1 z á c i a a r m é n s k y c h c h r č k o v

Arménske chrčky, staré šesť. až osem týždňov, boli prvý raz imunlzované pomocou približne 50 j..ig rekombinantného proteínu zloženého z domény 1 potkanieho polypeptidu pripojenej k ťažkému reťazou ľudského IgG4. Tento proteín bol pred imunizáciou emulgovaný Freundovým kompletným adjuvans. Následné imunizácie prebehli s rovnakým proteínom emulgovaným vo Freundovom nekompletnom adjuvans 14. deň, 33. deň a 95. deň po prvej imunizácii. Boli uskutočnené dve oddelené Túzie, označené 197 a 199.

Štyri dni pred fúziou 197 (306.

deň) bola jednému chrčkovi aplikovaná zmes potkanieho proteínu qí_o purlf ikovaného zo slezinných buniek a buniek CHO transfekovaných potkaním . Tri dni pred fúziou (307. deň) bola chrčkovi aplikovaná posilňovacia dávka obsahujúca purlfikovaný potkaní, proteín oíd a CHO bunky transf ekované cč_d . Transfekcia buniek CHO potkaním cť_D bola uskutočnená nasledujúcim postupom.

Segment génu kódujúci neskrátený potkaní proteín o<_D bol vložený do vektora pDCl, ktorým boli, spolu s ľudským konštruktom CDlB-pRC, elektroporáciou transfekované bunky CHO. Transfekované bunky boli kultivované v prítomnosti hypoxantínu a g418, aby sa vyselektovali bunky úspešne transf ekované konštruktom pDCl. F⁵ o troch týždňoch holi bunky značené špecifickým polyklonálnym sérom namiereným proti potkaniemu </_c, a rozdelené s využitím FACS. Malý podiel buniek, ktoré na svojom povrchu vykazovali najvyššiu hladinu expresie polypeptidu a:_tl (približne s e p a r o v a n ý a b u n k y b o 1 i ď a I. e j m n o ž e n é . niekoľkokrát opakovaný, aby bola získaná najvyššou povrchovou expresiou .

3% populácie), bol.

Tento postup bol populácia buniek s

T r a n s f e k o v a n é c y t o m e t r i o u p r i n a m i e r e n é h o p r o t i bunky boli tiež. charakterizované prietokovou použití polyklonálneho séra špecificky P o t k a rt 1 em u p o 1 y p e p 11 d u oí _o a m o n o k 3. o n á 1 n e j protilátky TS1.18.1 špecificky namierenej proti ľudskému CD18. Získané výsledky potvrdili vysokú hladinu expresie obidvoch antigénov na povrchu transfekovaných buniek CHCI.

Expresia cc_a a CD18 v bunkách bola nakoniec analyzovaná imunoprecipitáciou. Králičie polyklonálne sérum špecificky namierené proti potkaniemu polypeptidu <y,·, imunoprecipitovalo s dvoma proteínmi s rozdielnou molekulovou hmotnosťou. Molekulové hmotnosti boli 170 kDa pre väčší protein a 95 kDa pre menší proteín. Tieto výsledky boli v súlade s expresiou heterodimérneho komplexu potkanieho oŕ_D/ludský CD18 na povrchu transfekovaných buniek C1-10.

Deň, kedy prebiehal fúzia, bola vybraná slezina. Suspenzia jednotlivých slezinných buniek bola vytvorená rozmelením tkaniva medzi dvoma namrazenými podložnými sklíčkami ponorenými do média RPMI bez prítomnosti séra s prídavkom 2 ml*l L-glutamínu, 1. ml*l pyruvátu sodného, penicilínu v koncentrácii 100 jednotiek/ml a streptomycínu v koncentrácii 100 ng/ml (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilné bunkové sitko Nitex s veľkosťou ôk 212 um (Becton Dickinson, Parslppany, New Jersey), dvakrát premytá centrifugáciou pri 200xg počas 5 minút a peleta bola potom rozsuspendované v 20 ml média RPMI bez prítomnosti

Balb/c (neimunizovaných) boli Myelómy NS-1, udržiavané počas RPMI s obsahom 10% Ino. Logan, l J tah), séra. Tymocyty z troch myší pripraveného obdobným spôsobom. troch dní pred fúziou v log fáze v médiu f e t á 1 n e h o s é r a ( F B S ) ( H y c 1 o n e L. a b o r a t o r i e s, boli centrifugované pri 200xg počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá, postupom popísaným vyššie.

Približne 1, 15 x 10^θ slezinných buniek bolo zmiešaných s 5, 8 x ÍO⁷” buniek NS-1, scentrifugovanýeh a supernatant odstránený odsatím. Peleta bola poklepom uvoľnená odo dna kyvety. K bunkovej pelete bolo, pri stálom miešaní, počas jednej minúty, pridávaných 7 ml PEG 1500 (Boehringer Mannheim) (50% roztok v pufri 75mM HEPES s pH - 8,0) zahriateho na teplotu 37 °C. Potom bolo k bunkovej suspenzii pridaných 14 ml média RPMI bez prítomnosti séra a suspenzia bola miešaná 7 minút. Bolo pridaných ďalších 8 ml média RPMI a bunky boli centrifugované počas 10 minút pri 200xg. Supernatant bo1 odstránený a peleta bola resuspendovaná v 200 ml média RPMI obsahujúceho 15% FBS, 100 mM h y p o x a n t i n s o d n ý, (Gibco), IL-6 í

0,4 m M amiriopterín, 1(5 m M tymidín CHAT) koncentráciou 25 jednotiek/rnl C Boehringer ľlannheim) a 1,5 x 10^Ä tymoeytov/ml. Suspenzia bola rozdelená do 10-tlch 96-jamkových C s plochým dnom) doštičiek pre tkanivové kultúry (Corning, Veľká Británia) v objeme 200 ul/jamka a bunky 6. a 7.

(Becton boli vyživované 4., b., každej jamky 18G-ihlou čerstvého tymocyty.

média, popísaného deň odobranim Dlckinson) ej vyššie, avšak

100 ul média z pr idaním 100 ul n e o b s a h u j ú c e h o

Desiaty deň bol supernatant cytometriou, či reaguje s heterodimérom potkaní oí_D/ľudský CD18.

z jamiek testovaný prietokovou bunkami OHO transfokovanými x 10 buniek ľade, trikrát azid sodný) a minút na FBS, 0, 05%

OHO transf okovaných potkaním oí_d bolo rozsuspendovaných v 50 j_il média RPMI obsahujúceho 2, 0% PBS a 0,05% azid sodný a na 96-jamkových doštičkách s jamkami s guľatým dnom pridaných k 100 ul supernatantu získaného pri kultivácii hybridómov. Pozitívnou kontrolou bolo značenie pomocou králičieho polyklonálneho séra namiereného proti <x_a a protilátky TS1/18 namierenej proti ľ u d s k ému CD18. B u n k y b o1i ink ubo vané premyté v puf r i FACS (RPMI, 2,0%

Inkubované 30 minút na Tade s kozinu protilátkou značenou FITC namierenou proti chrčím Ig (Jackson Immunol Research Labs) zriedenou v pomere 1.:200 v puf r i FACS. Bunky boli trikrát premyté v pufri FACS a resuspendovarié v 200 ml t o hm t o pufra. Vzorky boli analyzované na analyzátore FACscan firmy Becton Dlckinson. S cieľom potvrdenia, že klony z pozitívne reagujúcich jamiek špecifické proti potkaniemu a(_a, bol. celý pokus opakovaný netransfekovanými bunkami OHO. Klony, ktoré reagovali s bunkami CHCI transf e k o v a ným i splnili podmienky a potkaním oŕ_D, ale nereagovali s netransfekovanými bunkami, boli ďalej pomnožené.

Po primárnom screeningu boli bunky z pozitívne reagujúcich jamiek pasážované najprv dvojnásobným zriedením a potom medzným zriedením v médiu RPMI obsahujúcom 15 % FBS, 100 mM hypoxantín sodný, 16 ml*l tymidín a 1L-6 v koncentrácii 10 jednotiek/ml. ú tomto kroku bolo určené percento jamiek vykazujúcich rast a s využitím Poissonovej distribučnej analýzy bola predpovedaná klonalita. Po 10 až 12 dňoch boli jamky obsahujúce množiace sa populácie analyzované s využitím FACS. Po poslednom pasážovaní. boli bunky z pozitívnych jamiek namnožené v médiu RPMI s 11% PBS. Bola získaná jedna kultúra, ktorá sa podlá týchto kritérií javila a k o p o z i t í v n a . Z t e j t o k u ľ.L t ú r y b o 1 i r o z r a s t e n é s u b klony o z n a č e n é 197A-1, 197A-2, 197A-3 a 197A-4.

. deň aplikovaných 2, 3 x 10^ώ buniek oío . Dve zavárečné imunizácie boli (334. deň) a opát 3 dni pred zo dňa 334, aplikovaná 10^ώ buniek CHO transfokovaných

Druhému chrčkovl bolo 307 C H 0 t r a n s f e k o v a n ý c h p o t k a n í m uskutočnené 4 dni pred fúziou 199 f ú z i o u ( 335. d e ň ) . I. n j e k c i a intraperitoneálne, obsahovala 2 x potkaním oc₀ a 200 ul purlf ikovanej potkanej podjednotky oj_C)naviazanej k Sepharóze (popísané predtým). Injekcia z 335. dňa, aplikovaná takisto intraperitoneálne, obsahovala 5 CHO transf e k o vari ý ch potkaním . Postup fúzie x 10^& buniek a protokol· testovania bol rovnaký ako pri fúzii 197. Boli identifikované a pomnožené tri hybridómy označené 199A, 1991-1 a 199M. Hybridóm 199M bol 1. marca 1996 uložený v American Type Culture Collection, 1230.1. Parklawn Drlve, Rockville, Maryland 20852 pod prístupovým číslom HB-12058.

C h a r a k t e r i z á c i a polypeptldu

P r o t i1á to k prot i po t k aniemu

Aby bolo možné charakterizovať protilátky namierené proti potkaniemu oc_D, boli, postupom popísaným v Príklade 1.8, oddiel D, pripravené biotínom značené slezinné lyzáty. Pred vlastnou .1 m u n o p r e c i p i t á c i o u b o 1 i 1 y z á t y p r e d č 1 s t e n é .Na z ti č 1 a t k u b o 1 k lyzátu pridaný normálny myšací imunoglobulín v koncentrácii 50 ug/ml a výsledná zmes bola počas 30 minút pri teplote 4 ^C,C trepaná na rotačnej trepáčke. K tejto zmesi bolo pridaných 75 ul suspenzie proteín A-Sepharózy potiahnutéj králičou protilátkou namierenou proti myšacím Ig a trepanie pokračovalo ďalších 30 minút. Guľôčky s naviazanou protilátkou boli odstredené pri 150GG otáčkach za minútu v stolnej centrifúge. Gentrifugácla prebiehala počas 5 minút pri teplote 4 °C. Supernatant bol odobraný a peleta odstránená.

Z každého klonu hybrldómu bolo do mlkroskúmaviek odobraných približne 300 ul supernatantu. K tomuto supernatantu bolo pridaných 30 ul '10% Tri tonu X-100, 30 ul zo 100 x zásobného roztoku pepstatínu, leupeptínu a aprotin, ďalej 100 ug kryštalického F’ľlSF a 50 ul predčisteného biotinylovaného lyzátu z potkanej sleziny. Obsah mlkroskúmaviek bol mierne pretrepariý a na minút pri teplote 4 °C umiestený na rotačku. Kontrolná vzorka bola pripravená pridaním králičej polyklonálnej protilátky špecificky namierenej proti potkaniemu polypeptidu oŕ_D s koncentráciou 10 mg/ml k 50 ul potkanieho slezinného lyzátu.

Po 30 minútach Inkubácii bolo ku každej vzorke pridaných 75 ul suspenzie guľôčok proteín A-Sepharózy v PBS pufri a vzorka bola i n kubova n á na r otáčke ďalších) 30 minút pri teplote 4 °C. Guľôčky Sepharózy boli centrlfugované počas 5 minút pri teplote 4 °C pri 15000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge a supernatant bol odobraný. Guľôčky boli postupne premyté jedným mililitrom z každej z nasledujúcich detergentných vzoriek ·. pufer 41 obsahujúci 10 m 14 Tris, 400 mľl NaCI, 1,0% Tri t on X-100, pH 8,0;

400 mľl NaCI, 0, 5% íriton X-100, pH mľl Tris, 400 pufer 42 obsahujúci. 10mľl Tris 8,0; pufer 43 obsahujúci 10

X-100, 0, 1% deoxycholát

Tris, 400 m 14 NaCI, 0, 5 uskutočnené pufrom 41 pH 8, 0; a pufer mľl NaCI, 1, 0% Trltori 44 obsahujúci. 10 mľl ľl LiCl, pH 8, 0. Posledné premytie bolo

I4edzi jednotlivými premytiami boli guľôčky mierne pretrepané na vortexe a odstredené v stolnej centrifúge. Supernatant bol vždy odstránený pipetou a po poslednom premytí bol zvyšný pufer od guľôčok odstránený striekačkou CHamilton). Ku každej pelete guľôčok bol pridaný alikvót C50 ul) SDS vzorkového pufra obsahujúceho brómfenolovú modrú, farbivo Pyronín Y a a-merkaptoetanol s výslednou koncentráciou 10%. Zmes bola y tí prudko 1 až 2 minúty trepaná a inkubované 5 až 10 minút pri izbovej teplote. Vzorky boli centrifugované počas 5 minút pri 15000 otáčkach za minútu v stolnej centrifúge pri teplote 4 °C a uvoľnený proteín bol prenesený do novej míkroskúmavky. Vzorky boli povar ené 4 minúty na vodnom kúpeli a nanesené na 7, 5% SDS polyakrylamldový gél. Po ukončení, delenia boli proteíny prenesené na nitrocelulózové filtre. Transfer prebiehal pri 200 mA počas 1 hodiny. Filtre boli. blokované v roztoku 3,0% E? S A v p uf r i IBS-T oez noc pri teplote 4 °C. Ku každému filtru bol. pridaný roztok 0, 1% BSA v pufri TBS-T s obsahom streptavidinu-OPD v riedenú 1:6000, v ktorom bol ponechaný Jednu hodinu pri izbovej teplote. Filtre boli premývané päťkrát vždy 10 minút v pufri TBS-T a ofarbené použitím kitu ECL (Amersham) postupom doporučeným výrobcom.

Bolo dokázané, že kloň 1991*1 imunopr ecipituje heterodimérny proteín. Väčšia proteínová podJednotka mala približnú molekulovú hmotnosť 1.70 až i. m u n o p r e c i p 11 o v a n é h o P r o t i. p o t k a n i em u d _CJ

1.75 kDa, z o d p o veda1o ve1k osti kontrolnou králičou protilátkou namierenou Druhá imunoprecipitovaná podJednotka mala zdanlivú molekulovú hmotnosť 95 kDa, zhodnú s veľkosťou CD18.

Príklad 19

Izolácia klonov myšacej cDNA

Bol uskutočnený pokus o izoláciu myšacieho homológu d_O.

Pomocou dvoch) sond vytvorených metódou PCR bola uskutočnená medzidruhová hybridizácia. Prvou sondou bol fragment s veľkosťou 1, E, kEj zodpovedajúci bázam 522 až 2é47 z ľudského klonu 19A2 (SEK. ID. č.: 1), druhou sondou bol potkaní fragment s veľkosťou 1, 0 kb zodpovedajúci bázam 1900 až 2900 z ludského klonu 1.9A2 (SEK. ID. C.si). Ľudská sonda bola vytvorená polymérázovou reťazovou reakciou primár ov označených ATI4-2 a 9-10.1 (SEK. ID. č.: 38 resp, 39). Potkania sonda bola vytvorená s využitím primérov 434L a 434R (SEK. I.D. č.: 84 resp. 35), Vzorky boli.

inkubované 4	minúty pri teplote	94 °C a podrobené	30 cyklom s
nasleduj úcim minúty pri 72	teplotným režimom: °C.	94 °C, 2 minúty	pri 50 °C_; 4
5' -GTCCAAGCTG'	1 LA ľGGbCCAb-3'	(SEK.	ID. č.: 38)
5' -GTCCAGCAGAl	... ľ G A A b A & L A L. b b—3	(SEK.	ID. č.: 39)

Produkt reakcie PCR bol petrifikovaný pomocou kitu Ouick Spln firmy Qiagen, postupom doporučeným výrobcom a približne 180 ng DMA bolo pri použití kitu Random Prime Labeling kit firmy Boehringer ľlannheim, postupom doporučeným výrobcom, rádioaktívne označených 200 uCi C ^3:aP]-dCTP. Nenaviazaný izotop bol odstránený pomocou kolóny Centri-sep Spln (Princeton Separations, Adelphia, NJ ). Sondy boli pred použitím denaturované 0, 2 N NaOH a neutralizované roztokom 0,4 1*1 Tris-HCl s pH = 8,0.

Knižnica cDNA získaná z buniek týmusu s využitím sekvencie oligo~dT ako priméru zabudovaná v lambda ZAP II (Stratagene) bola vysiata v koncentrácii približne 30000 plakov na 1. misku s P r e n e s e n é n a n i t r o c e 1 u 1 ó z o v é Keene, NH) °C priemerom 15 cm. Plaky (Schleicher & Schuell, inkubované pri teplote boli pri stálom filtre miešaní počas jednej hodiny v prehybridizačnom roztoku (8 ml/prenos) obsahujúcom 30% formamid. K prehybridizačnému roztoku boli pridané značené ludské a potkanie sondy a inkubácia pokračovala cez noc pri. teplote 50 °C. Filtre boli dvakrát premyté v 2X SSC/O,IX SDS pri izbovej SDS s teplotou 37 °C a raz v 2X teplote, raz v 2X SSC/O,IX SSC/O,IX SDS s teplotou 42 X-Omat AR prebiehala pri P o u ž i t í kont r a st né h o f i i t r a.

°C. Expozícia filtrov na film Kodak teplote -80 °C počas 27 hodín pri

Štyri plaky, ktoré poskytli pozitívny signál pri dvakrát opakovanom prenose, boli opät vysiate na misky s LB médiom s prídavkom horčíka a karbenicilínu v koncentrácii 100 mg/ml a Inkubované cez noc pri 37 °C. l-ágové plaky boli prenesené na filtre Hybond (Amersham), označené ako v prvo pokuse a exponované na film Kodak X-CJinat AR pri teplote -80 °C počas 24 hodín pri použití kontrastného filtra.

Dvanásť pozitívnych plakov bolo prenesených do riediaceho roztoku s nízkym obsahom Mg^' iónov (10 mM Tris- HCl a ImM MgOl-.) . Velkost inzerčného fragmentu bola určená pomocou PCR reakcie s 13 a T'7 prirnérmi (SEK. ID. č. = 13 a 14) pri nasledu júcich reakčných podmienkach. Vzorky boli inkubované pri 94 °C počas 4 minút a vystavené 30 cyklom s týmto teplotným režimom: 15 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 50 °C a 1 minútu pri '72 °C.

Šesť

300 báz pomocným

Bluescript vzoriek poskytla rozdielne prúžky DNA s veľkosťou od do 1 kb. Fágmidy boli uvoľnené pomocou koinfekcie fágom a prevedením do cyklickej formy bol vytvorený SK (Stratagene). Vzniknuté kolónie rástli v 1...614 médiu s karbenicllínom (iOOmg/ml) cez noc. DNA bola izolovaná pomocou kitu pre minipreparáciu DNA Wizard“ firmy Promega (Madison, WI) podľa návodu výrobcu. Reštrikčná analýza izolovanej DNA enzýmom EcoRI potvrdila molekulové hmotnosti, zodpovedajúce molekulovým hmotnostiam zisteným z POR. Fragment DNA bol sekveriovaný pri použití priméru M13 a reverzného priméru.l 1413, ktorých sekvencie sú zobrazené v SEK. ID. č.:40 resp. 41.

5’ TGTAAAACGACGGCCAGT- 3‘

5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3‘

Sekvenovanie b o I. o u s k u t o č ň o v a n é

Príklade 4.

(SEK. ID. č.: 40) (SEK. ID. č.: 41) postupom popísaným v

L e n dva z o š i e s t i c (ί k 1 o n o v, o z n a č e n é 10.3 -1 a í 0.5 - 2, poskytli identickú sekvenciu s veľkosťou 600 párov báz. Táto sekvencia bola z 68X Identická s príslušnou oblasťou ľudského d_o., zo 40X identická s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, z 58X identická s príslušnou oblasťou ľudského CDllc a z. 54X identická s príslušnou oblasťou myšacieho CDllb. Tento fragment s veľkosťou 600 bp bol potom využitý pre získanie úplne, j š e. j cDNA kódu júce j yy predpokladaný myšací homológ d_a.

Knižnica cDŇA z myšace j sleziny C vytvorená s využitím oligo-dl primárov a primérov s náhodnými sekvenciami), zaklonovaná do tágu lambda ’Zap II (Stratagene), bola vysiata v koncentrácii 2,5 x ICť fágov na LBľl misku s priemerom 15 cm. P1ak y bo1i prenesené na ny1ónovú membránu Hybond (Amersham) denaturované 0, 5 ΙΊ NaOH s 1, 5 1*1 NaCl, neutrallzované 0, 51*1 Tris-HCI s '1, 51*1 NaCl a premyté v 2X SSC. DNA bola na membráne zosletovaná ultrafialovým žiarením.

Pomocou sond 10.3-1 a 10.5-2, značených postupom popísaným vyššie, bolo testovaných približne 5000DO plakov. Sondy boli pridané do prehybridlzačného roztoku a Inkubované cez noc pri teplote 50 °C. Filtre boli dvakrát premyté v 2X SSC/O, 1% SDS pri izbovej teplote, raz v 2X SSC/O, 1% SDS s teplotou 3'7 ^,::>C a raz v 2X SSC/O, 1% SDS s teplotou 42 °C. Expožicla filtrov na film Kodak X-Omat AR prebiehala pri teplote -80 °C počas 13 hodín pri P o u ž11 í kontrasiného fi11ra.

Osemnásť pozitívnych plakov bolo prenesených do roztoku s nízkym obsahom ľlg®¹ iónov a veľkosť fragmentu bola určená PCR metódou, postupom popísaným vyššie. Každá zo siedmich vzoriek poskytla jediný prúžok DNA s velkosťou Reštrikčná analýza purifikovanej DNA m o 1 e k u 1 o v é hm o t n o s ti, z o d p o v e d a j ú c e od 600 párov báz do 4 kb. enzýmom EcoRI potvrdila m o 1 e k u 1 o v ý m h m o t n o s 11 a m zisteným z PCR. Fragment DMA bol sekvenovaný pri použití priméru 1*113 a reverzného priméru. 1 1*113 (SEK. ID. č. 40 resp. 41).

Kloň označený B3800 obsahoval inzert s veľkostnú 4kb, ktorý zodpovedal oblasti nachádza j ú c. e j sa 200 báz v smere transkripci e od 5' konca k lonu 19 A2 ľudského oŕo a obsahoval 553 báz 3' neprekladanej oblasti. Kloň B3800 bol zo 77% identický s príslušnou oblasťou ľudského ο;₀, 44% identický s príslušnou oblasťou ľudského CD11a, 59% identický s príslušnou oblasťou ľudského CD11c a 51% Identický s príslušnou oblasťou myšacieho C D 1:1 b. Druhý kloň A1160 mal veľkosť 1,2 k b a zodpovedal 5' koncu

100 kódujúcej oblasti ľudského α:_ο, približne 12 báz v smere transkripcie od iniciačného kodónu pre metionín. Kloň A1160 bol. zo 75% Identický s príslušnou oblasťou ľudského oí_C), 46% identický s príslušnou oblasťou ľudského CDlla, 62% identický s príslušnou oblasťou ľudského CDllc a 66% identický s príslušnou oblasťou myšacieho CDllb.

Klan A1160, fragment bližšie k 5' koncu ľudského klonu 19A2, sa prekrýva s klonom B3800 od bázy 205 až k báze 1134. Kloň A1160 má vložený úsek 110 báz (Báza '704 až 814), ktorý nie je v prekrývajúcej sa oblasti klanu B3800. Tento vložený úsek DNA sa o a j s k ô r v y s k y t u j e n a h r a n i c 1 e x ó n u a 1 n t r ó n u C F1 em i. n g a rfa 1 š í, J . Immunol. 150:480 až 490 (1993)3 a bol pred následným spojením k 1 o nov A116 0 a E)3800 o d s t r á n e n ý .

Rýchla ampliflkácia 5’ konca cDNA predpokladaného klonu myšacieho a: o

S cielom získania chýbajúcich 5' úsekov predpokladaných klonov myšacieho or,··,, vrátane 5' neprekladanej sekvencie a Iniciačného metionínu, bola použitá RAČE PCR EFrohman, RAČE: Rapld Amlifi.catl.on of cDNA Ends, v PCR Protocols: A Guide to Methods and Ampllfications, Innis a cľalší, (editori) 2.8 až 38, A c a d em i c F⁵ r e s s : NEW York ( 1990)3. Myšací slez 1 n o ý k 11 RAČE -Ready (Clontech, Palo Alto, CA) bo3. použitý podľa návodu výrobcu. Pre uskutočnenie prvej a vnorenej

Xcíntisense špecifické priméry

PCR boli vybrané dva (A1160 RACE1-primárny primér a

A11.60 RACE2- vnorený primér, >EK. ID. č.: 42 resp. 43).

-GGACA1GT ICAC3 GCCI C IAGG.....3”

-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3’

Priméry, SEK. ID. č.: 42 a 43, začínajúcim 302 resp. 247 bázou od 5' priméru (SEK. ID. č.: 44) a myšacej s (SEK. ID. č.: 42) (SEK. ID. č.: 43) zodpovedajú konca. Pri.

e z 1. n n e j c Ľ) N A oblastiam použití 5' dodanej v kite bola, postupom popísaným vyššie, uskutočnená PCR.

101 ’ -CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3'

C SEX. ID. č.: 44)

Elektro foréza produktu PCR reakcie odhalila prúžok s oelkosťou 280 báz, ktorý bol zaklonovaný pomocou klonovacieho kitu TA (Invitrogen), postupom doporučeným výrobcom. Desat získaných kolónii bolo pomnožených, DNA izolovaná a zistená jej sekvencia. Touto metódou bolo Identifikovaných ďalších 60 báz 5' sekvencie, ktoré zodpovedajú bázam 1 až 60 v SEX. ID. č.: 45.

Charakteristiky myšacej cDNA a predpokladanej aminokyselinovej sekvencie

Zložená ekvencia myšace cDNA kódujúcej predpokladaný hornológ ľudskej je zobrazená v SEK. TD. č.: 45. Aj keď homológla medzi vonkajšími doménami ľudských a myšacích klonov je vysoká, homológla medzi cytoplazmatickými doménami je len 30%. Pozorované odchýlky môžu naznačovať rozdiel vo funkcii

C.....koncovej domény medzi ľudskými a myšacími proteínmi. Odlišnosti v cytoplazmatických doménach môžu byt byt takisto výsledkom rozdielneho zostrihu RNA alebo môžu naznačovať existenciu ďalších génov pre integríny o·-..

Aminokyselinová sekvencia proteínu, predpovedaná na základe sekvencie myšacej cDNA je z 28% identická s myšacou CDlla, z 53% s myšacou CDllb, z 28% s ľudskou CDlla, z 55% s ľudskou CDllb, z 5‘3% s ľudskou C D 1.1 c a zo 70% s ľudskou oŕ_c>· Z porovnaní am i n o k y s e I i nový c h s e k v e n c i í c y t o p 1 a zm a t i c: k ý c h d om é n ľ u d s k é h o polypeptidu </_r:> a predpokladaného myšacieho homológu vyplýva, že síce obsahujú oblasti s rovnakou dĺžkou, ale s odlišnou primárnou veľkosti sekvencii v týchto oblastiach druhovú odlišnosť než možnosť vzniku rozdielnych variánt zostrihom. Keď porovnáme myšaciu sekvenciu s predpokladaným potkaním polypeptidom (príklad 16 uvedený vyššie), dostávame väčšiu ako 66% zhodu myšacej a potkanej š t r u k t ú r o u . F’ o d o h n é

P r e d p o k 1 a d a j ú s k ô r cytoplazmatickej domény.

102

Príklad 20

Izolácia ďalších klonov myšacej cDNA <y_n uskutočňovaná s cielom p o t v r d e n i a s e k v e n c i e

Aby bola potvrdená nukleotidová sekvencia a aminokyselinová sekvencia myšacieho oŕ_D popísaného v Príklade 19, boli izolované ďa1š ie my š ao ie sek v e nc i e .

Hybridizácia s od 5' konca) bola, vytvorene j p o m o c: o u v y t v o r e n e j p oni o c o u dvoma homológnymi a:,-, sondami (od 3' konca a s využitím ako myšacej slezinnej knižnice náhodných primérov, tak aj knižnice cDNA primárov oligo-dT, zaklonovaných do fágu lambda ZAP II Knižnica bola (Strata g e ne), u s k u t o č n e n á nanesená v koncentrácii Ej

1zo1áoia my ša cej cDNA. x 10^s fágov/miska na misky s LBM s priemerom 1E> cm. Plaky boli prenesené na ny Iónové membrány Hybond (Amersham). Membrány boli denaturované (0,5 M NaOH/1, 5 M NaCI), neutralizované (D, 5 M Tris/1, 5 M NaCI/11,5 M HC1) a premyté (2X SSC). DNA bola na membránach zosieťovaná pomocou ultrafialového žiarenia.

Sondy boli vytvorené pomocou primérov popísaných nižšie v

PCR reakcii, uskutočňovanej pri. nasledujúcich podmienkach. Vzorky boli vystavené 4 minúty teplote 94 °C a potom nasledovalo 30 cyklov s týmto teplotným režimom: 15 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd prd. 50 °C a 3. minútu pri 72 °C v cykléri Per kín- -E lm e r 9600.

3' -sonda, ktorá bola približne 900 báz dlhá, prekrývala oblast nukleotidov 2752 a 3653. (v SEK. ID. č. ·. 1, v smere od 5' k 3') a bola vytvorená pomocou primérov 11.b~l/2F0Rll a 11.b-l/2REV2 zobrazených v SEK. ID. č.: 69 resp. 74). Táto sonda bolia použitá v prvej sérii prenosov.

5'-sonda, ktorá bola približne 800 báz dlhá, zahrnovala oblast nukleotidov 145 do 946 (v SEK. ID. č.: 1, v smere od 5' k 3’) a bola bola vy tvorená pomocou primérov 13.. b—1/2FOR1 a ll.a-l/IREVI zobrazených v SEK. ID. č.: 50 resp. 85). Táto

103 sonda bola použitá v druhej sérii prenosov.

V tretej sérii prenosov boli použité obidve sondy spoločne n a r o v n akých m i s k á c h .

Pomocou obidvoch sond, popísaných vyššie, značených spôsobom popísaným v Príklade 17, bolo testovaných približne 500000 plakov. Značené sondy boli pridané k prehybridizačnému roztoku s 45% formamidom a inkubované cez noc pri teplote 50 °C. Membrány boli premyté dvakrát v 2X SSC/O,1% SDS pri izbovej teplote (22 °C). Posledné premytie bolo uskutočnené v 2X SSC/O, 1% SDS pri teplote 50 °C. Autorádlografia bola uskutočňovaná 19 hodin pri teplo t (3 -80 °C na film Kodak X-Chmat AR pri použití kontrastného filtru.

Trinásť plakov pozitívnych najmenej pri dvoch prenosoch bolo podrobených druhému testovaniu, ktoré bolo uskutočnené rovnako ako prvé testovanie, až na dve výnimky. Pre hybridizáciu boli použité obidve značené sondy 3’ a 5' a bolo pridané záverečné premytie v 2X SSC/O,1% SOS pri teplote 55 °C. Autorádlografla bola uskutočnená rovnakým postupom popísaným vyššie, ale prebiehala len počas 2,5 hodiny.

Trinásť pozitívnych plakov C označených MS2P1 až MS2P13) bolo prenesených do riediaceho roztoku s nízkym obsahom horečnatých iónov. V e1k osť inzertu bo1a stanovená metódou PCR C cyk1ér Perkin-Elmer 9600) pri použití primérov 13 a 17, ktoré prlsadajú k fágmidu Bluescript zabudovanému vo vektore ZAP 11 (sekvencia už predtým popísaná). Podmienky PCR v y š š í e . V e; 1 k o s 11 p r ú ž k o v D N A s a

4kb. Fágmidy boli izolované a sekvenované : a reverzného priméru.1 M13 (SEK. ID. č.:

boli. rovnaké, ako bolo popísané pohybovali od 500 párov báz do s využitím priméru M13 40 resp.

41). Päť z trinástich klonov (MS2P-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12 a MS2P-13) bolo sekvenovaných a po zložení reprezentovali, oblasť od bázy 200 na 5' konci až k 300. báze za prvým stop kodónom na 3' konci.

cieľom zistenia sek vene Íri koncov všetkých klonov a určenia

104 ich relatívnej pozície voči konštruktu #17 C SEK. ID. č.: 45) bolo, postupom rovnakým ako v Príklade 4, uskutočnené automatické sekvenovanie s využitím priméru 1*113 a reverzného priméru.l 1*113 CSE'K. ID. č.: 40 resp. 41). Každý kloň bol potom úplne sekvenovaný použitím vhodných primérov (uvedených nižšie) pre konkrétne oblasti.

ll.b-l/2F0Rl	5'	-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3'	(SEK.	ID.	Č:	50)
Il.a-1/1FOR2	5'	-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3'	(SEK.	ID.	Č:	60)
Il.a-1/1FOR3	5'	-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3'	(SEK.	ID.	Č:	61)
ll.b-l/2FOR4	5'	-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3'	(SEK.	ID.	Č:	62)

105

ll.b-l/2FOR5	5'	-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3'	(SEK. ID.	Č:	63)
ll.b-l/2FOR6	5'	-CAGATCGGCTCCTACTITGG-3'	(SEK. ID.	Č:	64)
ll.b-l/2FOR7	5'	-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3'	(SEK. ID.	Č:	65)
ll.b-l/2FOR8	5'	-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3'	(SEK. ID.	Č:	66)
ll.b-l/2FOR9	5'	-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3'
			(SEK. ID.	Č:	67)
Il.b-1/2FOR10	5'	-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3'	(SEK. ID.	Č:	68)
ll.b-l/2FORll	5'	-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3'	(SEK. ID.	Č:	69)
ll.b-l/2FOR12	5'	-GTCACAGAGGGAACCTCC-3'	(SEK. ID.	Č:	70)

ll.b-l/2FOR13

5'-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3 ll.b-l/2FOR14

5'-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3

ll.b-l/2FOR15	5'
ll.b-l/2REV2	5'
ll.b-l/2REV3	5'
ll.b-l/2REV4	5'
ll.b-l/2REV5	5'
ll.b-l/2REV6	5'
ll.b-l/2REV7	5'
ll.b-l/2REV8	5'
ll.b-l/2REV9	5'
ll.b-l/2REV10	5'
ll.b-l/2REVll	5'
Il.b-1/2REV12	5'
ll.b-l/2REV13	5'
11.a-l/IREVI	5'

-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3'

-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3'

-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3'

-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3'

-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3'

-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3'

-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3'

-GATCCAACGCCAGATCATACC-3'

-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3'

-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3'

-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3'

-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3'

-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3'

-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3' (SEK.

t (SEK.

(SEK.

ID. Č

ID. Č:

ID. Č

71)

72)

73)

74)

75)

76)

77)

78)

79)

80)

81)

82)

51)

83)

84)

85) j

106

Il.a-1/1REV2 5'-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3' (SEK. ID. Č: 86)

Sekvencie boli upravené, priradené a porovnané s predtým izolovanými sekvenciami myšacieho oíd (konštrukt #17, SEK. ID. č.: 45) .

Priradenie nových sekvencií odhalilo v korištrukte # deléciu 18 báz, ktorá začínala od nukleotidu 2308. Táto delécia nezapríčinila posun čítacieho rámca. Kloň MS2P-9 obsahoval rovnakú deléciu s dĺžkou 18 báz. Výskyt tejto delécie bol pozorovaný u 50% myšacích klonov obsahujúcich túto oblasť, avšak táto delécia nebola zistená v potkaních ani ľudských klonoch podjednotky α:_ο. Delécia 18 báz je charakterizovaná palindrómovou sekvenciou 12 báz AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEK. ID. č.: 91). Táto inverzná repeticia je komplementárna sama k sebe a môže vytvoriť slučku, ktorá spôsobuje štiepenie počas reverznej transkripcie.

Sekvencia myšacieho <j:_d, ktorá obsahuje navyše 18 báz, je zobrazená v SEK. ID. č.: 52; odvodená aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č.: 53.

Príklad 21

In situ hybridizácia u myší

D1stribúcía myša cích mohlo byť uskutočnené jej P o p í s a n é h o v P r i k 1 a d e 6 .

o<_c, v tkanivách bola určená preto, aby porovnanie s distribúciou ľudského a:_C),

Pomocou transkripcie RNA uskutočňovanej in vitro s použitím ^3SS-UTP (Amersham) bola z templátu DNA získaná jednovláknová sonda mRNA s veľkosťou 200 bp, zodpovedajúca nukleotidom 3460 až 3707 v cytoplazmatlckej oblasti myšacej cDNA.

Celé myšacie embryá (odobrané 11 až dní 18 dni po oplodnení) a rôzne myšacie tkanivá (slezina, oblička, pečeň, črevo a týmus) boli in situ hybridizované s rádioaktívne značenou jednovláknovou sondou mRNA.

107

Z tkanív boli pripravené rezy s hrúbkou 6 um, ktoré boli adherované na sklíčka potiahnuté prípravkom Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) a uložené pri teplote -70 °C. Pred použitím boli. sklíčka vystavené 5 minút teplote 50 °C. Rezy boli. počas 20 minút pri. teplote 4 °C fixované v 4% P ii r a f o r m a 1 d e h y d e, d e h y d r a t o v a n é z v y š u j ú e o u s a k o n o e n t r á o i o u etanolu (70-95-100%) (1 minútu pri teplote 4 °C pre každú koncentráciu) a vysušené na vzduchu (30 minút pri izbovej teplote). Rezy boli denaturované 2 minúty pri teplote 70 °C v roztoku 70% formamid/2X SSC, dvakrát propláchnuté v 2X SSC a dehydratované etanolom (postupom popísaným vyššie) a 30 minút vysúšané na vzduchu. Hybridizácia bola uskutočnená cez noc (12 až 16 hodín) pri teplote 55 °C v roztoku obsahujúcom sondu značenú izotopom ^3E5S v koncentrácii 6 x 10“^ä cpm na rez a vodu (vystavenú účinkom dletylpyrokarbonátu - DEPO tak, aby bolo dosiahnutá koncentrácia 50% formamid, 0,3 1*1 NaCl, 20 ml*l Tris-HCI. (pH ·= 7,5), 10% dextrán sulfát, IX Denhardtov roztok, 100 ml*l ditiotreitol (DTT) a 5 ml*l EDTA. Po hybridizácii boli rezy premývané 1 hodinu pri izbovej teplote v 4X SSC/10 ml*l DTT, 40 minút pri 60 °C v 50% formamldu/2X SSC/10 ml*l DTT, 30 minút pri izbovej teplote v 2X SSC a 30 minút pri izbovej teplote v 0,IX SSC. Rezy boli dehydratované, počas 2 hodín vysúšané na vzduchu, potiahnuté fotografickou emulziou Kodak NTB2, vysúšané 2 hodiny na vzduchu, vyvolané (uchovanie pri 4 °C v úplnej tme) a dofarbené h e m a t o x y 1. í n o m / e o z í n om.

Slezinné tkanivové vykazálo silný signál hlavne v červenej P u 1 p e . T á t o d i s t r i b ú c i a s i g n á 1 u z o d p o v e d á d i s t r i b ú c i i t k a n i v o v ý c h makrofágov v slezine, ale nevylučuje prítomnosť iných typov buniek.

Príklad 22

Príprava myšacích expresívnych konštruktov

Aby mohol, byt vytvorený expresívny plazmid obsahujúci

108 sekvenc i u myšacej e ON A vykazujúcu homológiu k ľudskej cí_o, aby boli spojené Inzer t y k lono v A1160 a 83800. Pred Ugáciou bolel k 1nz er tu z k1onov A1160 pr1da ná vedúca C 1eader) sek vencia obsahujúca na 5' konci kodón pre iniciačný metionin. Primér označený 5'-PCR leader (SEK. ID. č.: 47) bol navrhnutý tak, aby obsahoval: C.1) identické nešpecifické bázy na pozíciách 1 až 6 umožňujúce štiepenie; C2) reštrikčné miesto BamHl od pozície 7 až 12. umožňujúce z ak lono vanie do expresného vektora; C 3) konzervatívnu Kozákovu sekvenoiu od pozície 13 do 18; C 4) s i g n á 1 n u s e k v e n o i u o b s ah u j ú o u l< o d ó n v SEK. ID. č.; 47) a ďalších 31 sek venci u na 5' konci klonu A1.160,

P r im é r u. P r e am p 1. i. f i k á c i u i n z e r t u pnmérom frag C SEK.

5'-PCR leader ID. č.: 48).

použitý

P r e i n i c i a č n ý m e t i o n í n C h r u b o b á z š p e c i f 1 c: k y pr ek r ýv a j ú c i c h aby bolo umožnené prisadnutie z klonu A.1160 bol. spolu druhý primér nazvaný 3’-end

-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3’

C SEK. 10. Č.: 47)

5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3

C SEK. ID. č.: 48)

Vzniknutý PCR produkt nebol štiepený reštrikčným enzýmom BanHI pravdepodobne preto, že pred reštrikčným miestom bol nedostatočný počet báz, čo znemožnilo rozpoznanie miesta enzýmom. Pokial ide o 5'-primér, bola predĺžená dĺžka sekvencie

P r e d c h á d z a ...j ú c e miesto pre BamHl (SEK. 10. produktom prvej sekvencie bola

č.: 47) a s opakovaná PCR reakcia. 5'-primér označený mAD.5' .2 C SEK. 10. č.: 49) bol vytvorený pridaním nešpecifických báz na pozícii 1 až 4 a ďalších 20 báz špecificky prekrývajúcich predtým použitý 5'-PCR leader primér.

5' -GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3

C SEK. 10. č.: 49)

Priméry mAD.5'.2” a 3'-end frag boli spoločne použité v PCR reakcii, kde bol templátom produkt z prvej amplifikačnej reakcie. Vzniknutý druhý PCR produkt bol zaklonovaný do plazmidu

109 pCRtmlI (. Invitr ogen), podľa návodu doporučeného výrobcom a vzniknutým plazmidom boli transformované kompetentné bunky One shot (Invitrogen). Analýzou reštrikčnými. enzýmami BamHI a EcoRI bol Identifikovaný jeden kloň, ktorý obsahoval PCR produkt a tento kloň bol sek veno vaný. Po overení, bol Inzer t vy š t lepený reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI a izolovaný z gélu.

Inzer! z klonu B3800 bol získaný reštrikčným štiepením enzýmami EcoRI a Nôti a následnou izoláciou z gélu. Tento i. ožer t bol, spolu s fragmentom A.1.160 rozštiepeným reštrikčnými enzýmami BamHI/EcoRI, pridaný do ligačnej reakcie, ktorá prebiehala 14 °C. K ligačne j reakcii. bol pridaný vektor š t.lepený enzýmami. BamHI a Nôti a reakcia 12 hodín. Z reakčnej zmesi, bol odobraný transformované kompetentné bunky E. coli.

boli namnožené a s využitím hodín pri. teplote 14 P c D N A . 3 C I n v i. t r o g e n ), po k r a č o v a I a d'a .1 š í c h alikvót, ktorým boli. Vzniknuté k o .1 é n i e prlmérov ll.b 1/2F0R.I. a .1. í. b- Í/2REV11 (SEK. 10. č.= 50 resp. 51) bol analýzou POR identifikovaný PCR identifikovaný jeden pozitívny kloň. Priméry 11.b-í/2FOR1 a 11.b-1/2REV11 premosťujú fragmenty A1160 a B3800 a teda slúži na detekciu úspešnej ligácie obidvoch fragmentov (vznik PCR produktov). Sekvencia pozitívneho klonu bola overená pomocou prlmérov (zobrazené v SEK. 10. č.: 50 a 51), ktoré amplifikujú od bázy 100 do 1405 za kodónom pre š t a r t o v n ý m e t i o n í. n .

Príklad 23

Koríš t r uk cla k nock ou to vaných myší.

Aby bolo možné presnejšie určiť imunologickú úlohu proteínu kódovaného predpokladanou myšacou cDNA, bola vytvorená knockoutovaná myŠ, v ktorej organizme je sekvencia genómovej DNA kódujúcej homológ a:_o prerušená pomocou homológnej rekombinácie. Na význam proteínu kódovaného porušeným génom je: usudzované z jeho neprítomností. Produkcia knockoutovaných myší j e: popísaný v publikácii Deng a ďalší, 1*1 o 1. Celí. Biol. 13=2134 až 2140 (1993).

110

Prvým krokom pri. pro clu k c 1:1 takýchto myší. je konštrukcia plazmidu, ktorý v sebe obsahuje sekvencie, ktoré budú vyradené Cknockoutované”) homológne rekombinácie. Pre identifikáciu myšacej genómovej sekvencie kódujúcej predpokladaný myšací bomológ genómovej knižnice lambdaFIXII bol použitý fragment myšacej cDMA s veľkosťou 7SO báz (zodpovedajúci nukleotidom 1985 až 2733 v SEK. ID. č.: 45). Výsledkom prvého testovania bolo 14 pozitívnych testovaním. najsilnejší konvenčných metód. R e: P o t v r - d i. '1 a h o d n o v e r n o s ť DNA bol reštrikčné štie Bluescript SKII*.

plakov, z ktorých sedem Z dvoch plakov boli signál a lambda DNA š t r i k č o é m a p o v a n 1 jedného z klonov pený enzýmom MotI bolo potvrdených druhým získané lyzáty dávajúce bola izolovaná pomocou e a Soutbernová ( o z n a č e n ý 14 -1) a z a k 1 o n o v a n ý d o analýza Inzert vektor a

Pre identifikáciu reštrikčného enzýmu s veľkosťou približne 9 až 14 kb, čo je dĺžka udávaná ako optimálna pre uskutočnenie homológnej rekombinácie, bola s cDNA sondou s veľkosťou 750 bp uskutočnená Soutbernová hybridizácia. Pred hybridizáciou bola pre kloň 14-1 vytvorený fragment s veľkosťou 12 kb, ktorý bol zaklonovaný do vektora pBluescript SKII* do pozície, kde je myšacia DNA ohraničená kazetami kódujúcimi tymidín kinázu. Ďalšia analýza tohoto klonu pomocou sondy domény I (zodpovedajúcej nukleotidom 454 až 1064 v SEK. ID. č.: 45) ukázala, že tento kloň neobsahuje kódujúcu doménu 1.

Genómová knižnica lambdaFIXII bolia opäť testovaná použitím rovnakej sondy domény I. Z šiestich pozitívnych klonov zostal jeden pozitívny aj po druhom testovaní. DNA izolovaná z tohoto klanu silne reagovala pri Soutbernovej analýze so sondou domény I. Pri použití pôvodnej sondy s veľkosťou 750 bp nebola delegovaná žiadna odpoveď, avšak bolo zistené, že tento kloň zahrnuje nukleotidy 1985 až 2773 v 5’ oblasti zo SEK. ID. č.: 45.

Neexistencia hybridizácie so sondou s veľkosťou 750 bp môže tiež naznačovať, že tento kloň je ďalším členom z rodiny

111 integrínových proteínov. Z dôvodu overenia vierohodnosti tohoto vysvetlenia bo1 inzert s veľkosťou 13 kb zaklonovaný do vektora pBluescript SKU*. Pri použití prlmérov zodpovedajúcich nukleotidovým sekvenciám 44i až 461, 591 až 612, '717 až 739 a nukleotidovej sekvencií 898 až 918 v reverznej orientácii v doméne I «τ, (SEK. ID. č. s 52) bola zistená sekvencia purifikované j DMA. Sekvencia DNA’ bola získaná len pri. použití prvého priméru (441 až 461) a účinne ampllfikovaný bol len exón nachádzajúci sa najbližšie 5' koncu sekvencie domény ľ.. Amplifikácia zvyšku domény I neprebehla. Výsledný kloň teda obsahuje exón šesť génu myšacieho oŕ_D a sekvencie intrónov priľahlých k 3' a 5' koncu tohoto exórtu* Exón 7 nebol v tomto klene prítomný. Po sekvenovaní bol vytvorený konštrukt obsahujúci gén pre rezistenciu na neomycín a gén pre tymidín kinázu.

Gén pre rezistenciu na neomycín (neo^r) bol. vnesený do plazmidu spôsobom, ktorý prerušil sekvenciu genómovej myšacej DNA kódujúcej proteín. Vzniknutý plazmid teda obsahuje gén neo^rvnútri sekvencie myšacej genómovej DNA a to všetko je vnútri oblasti kódujúcej tymidín kinázu. Takto skonštruovaný plazmid je vyžadovaný preto, aby bola uprednostnená homológna rekombinácia P r e d n á h o d n o u r e k o m b i n á c i o u C C h i s a k a a rf a 1 ši, N a t u r e 355 = 516 a ž 520 (1992) ľl.

Príklad 24

Klonovanie králičieho oí_c>

vytvorenie a testovanie králičej cDNA knižnice

Nájdenie ľudských homológ rfo v organizme potkanov a myší. viedlo k výskumu existencie králičieho homológu, ktorý by mohol byt užitočný v králičích modeloch ľudských chorôb popísaných nižšie.

Pomocou kitu FastTraok firmy Invitrogen (San Diego, CA), podía návodu uvedeného výrobcom a reakčných činidiel dodaných v kite bola z celej králičej sleziny pripravená poly-A¹' RNA. Z 1,65

112 g tkaniva bolo izolovaných 73 ug poly-A* RNA. Táto RNA z králičej sleziny bola použitá pre konštrukciu cDNA knižnice ZAP Express s využitím kitu od firmy Stratagene (La Jolla, CA). Získaná cDNA bola smerovo zal<tónovaná do reštr ikčných miest EcoRI a Xhol v lambda ramenách fágmidového vektora pBK-CMV. Ma zabalenie lambda ramien do fágových častíc bol použitý kit Gigapack II Cold (Stratagene). liter vzniknutej knižnice bol odhadnutý na približne 8 x 1O⁵⁵ častíc, s Inzer tom s priemernou veľkosťou 1, 2 kb.

Knižnica bola raz amplifikovariá tak, aby narastené plaky boli konfluentné a bunkový lyzát bol zozbieraný. Namnožená knižnica transformovaná do E. coli bola vysiata v koncentrácii 3(1000 pfu/miska (priemer 150 mm) a vzniknutá zmes bola inkubované 12 až 18 hodín pri. teplote 37, aby došlo l< vytvoreniu plakov. Fágové DNA boli prenesené na nylénové membrány Hybond N* ( A m e r s h am, A r 1. i n g t on H e i g h t s, 111 i. n o i s ) . 14 e m b r á n y b o 1 i hybridizované so zmesou dvoch rádioaktívne značených sond myšacieho PCR DMA pripravených pomocou primérov s náhodnou sekvenciou. Prvá sonda bola získaná z PCR produktu, ktorý zahrnuje nukleotidy 149 až 948 v SEK. ID. č.: E)2. Druhá sonda bola získaná z PCR produktu, ktorý zahrnuje nukleotidy 2752 až 3651 v SEK. ID. č. s 52. Sondy boli pri použití kitu Random Prime Labelling kit firmy Boehringer Mannheim, postupom doporučeným výrobcom, rádioaktívne označené a reakčná zmes bola nanesená na kolónu Sephadex G-50, aby boli n u k 1 e o t i. d y . H y b r i d i z a č n ý r o z t o k Denhardtovho činidla, 1% SDS, 40% v koncentrácii. 1 x 10* dpm/ml. Hybridizácia prebiehala počas 16 až 18 hodín pri teplote 42 °C. Membrány boli intenzívne premyté v 2X SSPE/0, 1% SDS pri izbovej teplote a exponované na rontgénový film, aby došlo k vizualizácil všetkých hybridlzovaných plakov.

n e z a i. n k o r p o r o v a n é z 5X SSPE, 5X odstránená s a s k 1 a d a 1 formamidu a zo značených sond

Boli identifikované dva klony, ktoré vykázali, vysoký stupeň sekvenčnej homológie so sekvenciou ludského Kloň 42 bol približne 800 bp dlhý a mapoval 5' koniec ľudského Kloň 42 obsahuje kodón pre štartovný met i. oni n a kompletnú vedúcu

11..3 sekvenciu. Kloň #7 bol približne 1,5 kb dlhý a zahrnuje kodón pre štartovný metionin. 5' koniec klonu #7 prekrýval kloň #2, zatiaľ čo sekvencie: na 3' koncoch končili v miestach za sekvenciaml. domény I. Kloň #7 bol kompletne: osekvenovaný pomocou sekvenačnej metódy ”primer-walking. Nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia klonu #7 sú zobrazené v SEK. I. D. č.: 130 resp. 101.

Predpovedaná N-koncová aminokyselinová sekvencia pre: králičí oío, ako bola určená z klenov #2 a 1í7, naznačila, že tento protein je zo 73% identický s ľudským c(_o, z 65% identický s myšacím oí_c a z 58% Identický s myšacím CDllb, ľudským 6011b a ľudským 6011c. Nukleotidová sekvencia klonu #2 je zobrazená v SEK. ID. č.: 32; predpovedaná aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEK. ID. č . : 93 .

S využitím rádioaktívne značeného králičieho klonu #7 a opätovného testovania cDNA knižnice, z ktorej tento fragment pochádzal, bol uskutočnený pokus o získanie neskrátenéj cDNA kódujúcej králičí oío. Bolo identifikovaných ďalších 25 klanov a najdlhší bol kloň označený ako #49. S využitím techniky sieťových delécií bola zistená kompletná sekvencia klonu #49. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia klonu #49 sú zobrazené v SEK. ID. č.= 102 resp. 103. Keďže sa klony #7 a #49 neprekrývajú, boli oligonukleotidy, ktoré by mohli byť použité ako priméry pri. PCR s prvým reťazcom slezinnej cDNA; cieľom tohoto postupu je izolácia chýbajúcej sek venc1e.

Vzťah m e d z i p r e d p o k 1 a d a n ý m 1 a m j. n o k y s e 1 i. n o v ý m i s e k v e n c 1. am 1. týchto dvoch neúplných klenov a ostatných leukointegrínov je popísaný v tabuľke 1.

Tabuľka 1.

Percento zhody v aminokyselinovej sekvencii u členov rodiny 1 n t e g r í n o v β

11.4 ľudská oŕo králičia #7 králičia #49

ľudská oŕo	100	74	80
myšacia oŕ₀	70	67	74
potkania oŕ_D	70	66	73
myšacia CDlla	náhodná*	28	28
myšacia	55	59	53
ľudská CDlla	36	28	28
ľudská CDllb	60	58	55
ľudská CDllc	66	59	62

* ak je zhoda < 2b%, považuje sa táto zhoda za náhodnú izolácia klonov králičej cť_o umožňuje expresiu proteínu a to buď na povrchu transfekovaných buniek alebo vo forme rozpustného neskráteného alebo skráteného proteínu. Získaný proteín je potom použitý ako imunogén pre produkciu monoklonálnych protilátok, ktoré nájdu uplatnenie v králičích modeloch ľudských chorôb.

Príklad 25

Živočíšne modely pre určenie terapeutickej využiteľnosti oŕ_D

Imunohistologické dáta získané u psov a in situ hybridizácia u potkanov a myši určili, že oŕ₀ je exprlmovaný hlavne makrofágmi prítomnými v červenej pulpe sleziny. V miazgových uzlinách bol nájdený v kapilárach a dutinách v dreni. Distribúcia polypeptidu je značne podobná distribúcii, ktorá bola získaná pre dva myšacie antigény rozpoznávané monoklonálnymi protilátkami F4/80 a SK39. Zatiaľ čo biochemická charakterizácia týchto myšacích antigénov ukázala ich odlišnosť od c<_D, je veľmi pravdepodobné, že oŕ_D určuje rovnakú subpopuláciu makrofágov ako myšacie antigény

F4/80 a SK39.

U myší bol zistený výskyt SK39makrofágov v červenej pulpe sleziny, kde sa najskôr zúčastňujú odstraňovania cudzorodých

115 materiálov z obehu, a v dreni mlazgových uzlín IľJutila a ďalší, J. Leukocyte Biol. 54:30 až 39 (1993)3. SK39* makrofágy boli pozorované tiež v miestach akútneho a chronického zápalu. Navyše monocyty infiltrované v dutinách peritonea, v ktorých bol zápal vyvolaný pôsobením tloglykolátu, tiež exprimujú antigén SK39. Súhrnom tieto výsledky naznačujú, že ak sú SK39* bunky tiež <x_Dpozitívne, potom sú tieto bunky zodpovedné za odstránenie cudzorodého materiálu v slezine a zúčastňujú sa pri zápaloch, kde hrajú makrofágy dôležitú úlohu.

neznáma, iné, o velia lepšie zúčastňujú mnohých adhéznych

Zatiaľ! čo funkcia o:_L·, c h a r a k t e r i z o v a n é i n t e g r í n y zostáva sa dejov, ktoré uľahčujú migráciu buniek, posilňujú fagocytózu a podporujú medzibunkovej interakcie. Všetky tieto udalosti vedú k urýchleniu zápalových dejov. Preto je veľlľml pravdepodobné, že ovplyvnenie normálnej funkcie môže súčasne narušiť priebeh zápalu, kde hrajú makrofágy dôležitú úlohu. Takýto protizápalový účinok by mohol byť výsledkom: a) zamedzenia infiltrácie makrofágov do miest zápalu; b) zamedzenia aktivácle makrofágov v mieste zápalu alebo c) rušenia účinku eLektorových funkcií makrofágov, ktoré poškodzujú zdravé hostitelské tkanivo buď špecifickou autoimunltnou reakciou alebo následkom poškodzovania okolitých buniek.

Medzi makrofágy artritída, zápalové choroby, pre ktoré existujú dôkazy tom, že tu hraj ú d ô 1. e ž i t ú a r t e r i o s k 1 e r ó z a č revné chor oby.

patrí roztrúsená skleróza, niektoré formy diabetes a ž i v o č í š n e m o d e 1 y, ide úlohu, štepu,

Pokialľ diskutované nižšie, bolo dokázané, že tieto modely reprodukujú mnoho črt uvedených ľudských porúch. Aby bolo možné určit, či existuje možnosť liečby príslušných chorôb u ľudí, boli na týchto modelových systémoch testované inhibítory funkcie oí_d .

A. Artérioskleróza štepu

Trnsplantácia srdca je teraz, pokialľ Ide o niektoré typy srdcových chorôb v konečnom štádiu, prijímanou formou lekárskeho

116 zákroku. Používanie cyklosporínu A zvýšilo počet preživších prvý rok po transplantácii na 8lľ)%, avšak rozvoj progresívnej formy artériosklerózy štepu sa prejavil ako najčastejšia príčina smrti u osôb po prvom roku po transplantácii srdca. Nedávne štúdiu ukázali u 36 až 44% prípadov výskyt artériosklerózy štepu v období troch rokov po transplantácii srdca EAdams a ďalší, Transplantation 53 »1115 až 1119 C1992),- Adams a ďalší, ľ r a n s p 1 a n t a t i o n 5 E; = 794 a t 799 (1993)1 .

Pri artérioskleróze štepu sa typicky vyskytujú difúzne, oklúzne a intlmálne lézie, ktoré postihujú stenu vencových ciev. ú týchto léziách dochádza často k ukladaniu lipidov. Patogenéza artériosklerózy štepu zostáva neznáma, avšak pravdepodobne je spojená s blstokoinpatibilltnou odlišnosťou medzi darcom a príjemcom, a je vo svojej podstate vyvolaná činnosťou imunitného systému. Z. histologického hľadiska sú oblasti, v ktorých dochádza k zhrubovaniu vnútornej cievnej steny, tvorené predovšetkým makrofágmi, aj keď je tu občas pozorovaná aj prítomnosť T--buniek. Je preto možné, že makrofágy exprimujúce hrajú pri indukcii a/alebo rozvoji artériosklerózy štepu dôležitú úlohu, ú takýchto prípadoch by osobám s transplantovaným srdcom, u ktorých existuje riziko rozvinutia artériosklerózy štepu, mohli byť preventívne podávané inonoklonálne protilátky alebo nízkomolekulárne inhibítory funkcie oc_C) (napríklad rozpustný ICAľl-R) .

Aj keď artérioskleróza štepu predstavuje najväčšie ohrozenie života pre pacientov s transplantovaným srdcom, bol výskyt artériosklerózy štepu pozorovaný takisto u pacientov s inými t r a n s p 1 a n t o v a n ým i o r g á nm x v r á t a n e p e č e n e a o b 1 i č i e k . T e r a p e u t i c k é použitie látok blokujúcich funkciu by mohlo zabrániť vzniku artériosklerózy štepu u osôb s inými transplantovaným! orgánmi a znížiť komplikácie vyplývajúce zo zlyhania transplantovanébo orgánu.

Jeden model pre artériosklerózu štepu u potkanov zahrnuješ heterotypické srdcové aloštepy transplantované cez menšie histokompatibilné bariéry. Aj keď sú srdcové aloštepy z potkanov

117

Lewis transplantované do organizmu príjemcov F-344, vyznačujúcich sa vzhladom na darcov kompatibili tou MHC gly k oprotei.no v I. a Íl. triedy, 80% aloštepov prežíva aspoň 3 týždne a 25% aloštepov prežíva neobmedzene dlhý čas. Pri tomto velmi nízkom počte odmietnutých štepov sa v srdci darcu vytvárajú arteriosklerotické lézie. Arteriálne lézie v áloštepoch starých 120 dni obvykle vykazujú difúzné f ibrotické zhruhnutie vnútornej steny cievy, ktoré je na pohlad nerozlíšitelné od lézií v arteriosklerotickýcb š t e p o c: h p o z o r o v a n ý c h u o dm i e t n u t ý c ti 1. u d s k ý c h s r d c o v ý c h a 1. o š t e p o v .

Potkanom sú transplantované srdcia, ktorá sa v menej dôležitých histokompatibilných antigénoch líšia od genotypu príjemcu. Takýmto príkladom sú transplantácie z potkanov Lewis do potkanov F-344. Príjemcom transplantátov sú monoklonálne protilátky špecifické proti nízkomolekulárne inhibítory oí_d. Očakáva sa,

P r~ a v i d e 1 n e p o d á v a n é P o t k a n i em u or _D a 1 e b o že táto liečba zníži incldenciu artériosklerózy štepu v neodvrhnútých srdciach darcov.

Liečba potkanov n í z k o m o 1 e k u 1 á r n y c h pomocou monoklonálnych protilátok alebo inhibítorov nemusí. byt obmedzená len na prevenciu. Očakáva sa, že zablokovanie funkcie d,-, povedie k zmierneniu zápalu sprostredkovaného makrofágmi a umožní zvrat poškodzovania artérií v transplantáte.

8. Artérioskleróza u králikov kŕmených cholesterolom

U králikov, ktoré boli, počas približne 12 až 16 týždňov, kŕmené diétou s prídavkom cholesterolu, došlo k vzniku lézií na vnútornej strane ciev a povrchu v z o s t u p n é h o

A r t e r 1 o s c e 1 r o s i s 7 :9 A r t e r i o s c 1 e r o s i s 7 t 2 4 tieto lézie pokrývali väčšinu lumenálneho úseku aorty CRosenfeld a ďalší, až 23 C1987); Rosenfeld a ďalší, až 34 C1987)). Aterosklerotické lézie pozorované u týchto králikov sú miernejšie ako tie isté u ludí. ú týchto léziách je prítomný velký počet T-buniek, z ktorých väčšina exprimu.j e

CD45R0, ktorý je m a r k é r om p am ä t o vý c h

T -lýmfocytov. Približne polovica z infiltrovaných T-buniek exprimu je antigén l*IHC II. triedy a niektoré exprimujú receptor pre IL-2, čo naznačuje, že mnohé z týchto buniek sa nachádzajú v

118 aktivovanom stave.

Jednou z čňt aterosklerotických lézií pozorovaných u k r á11kov k ŕmených e h o I e s t e r o I. om ktorá a ale nevyskytuje u h ľ.L o d a v č í c ti m o d e 1 o v penových buniek.

( m a k r o f á g y ) je d ô je akumulácia P r e d p o k 1 a d á s a, 1 e d k om p r í. j m u lézií bohatých na prítomnosť že vznik penových buniek oxidovaných lipoproteínov s nízkou hustotou C LDL) prostredníctvom špecifických receptorov. Bolo zistené, že oxidovaňé Častice LDL sú toxické pre niektoré typy buniek vrátane endoteliáIných buniek a buniek hladkej svaloviny. Príjem týchto potenciálne toxických oxidovaných častíc LDL. makrofágmí slúži ako iritant a pomáha aktivovať makrofágy, čo prispieva k vytvoreniu zápalov sprevádzajúcich výskyt a t e r o s l< 1 e r o t i c k ý c h 1 é z i í.

Hneď ako bolí pripravené monoklonálne protilátky proti králičiemu d_rj, začala liečba králikov kŕmených cholesterolom. Liečba zahrnovala podávania monoklonálnych protilátok alebo nízkomolekulárnych Inhibítorov, aby bolo dokázané, že d_rj' makrofágy sa zúčastňujú na týchto procesoch počas choroby. Dodatočné štúdie by ukázali, že monoklonálne protilátky proti alebo nízkomolekulárne inhibítory môžu zvrátiť cievne poškodenia delegované u králikov počas aterogénnej diéty.

C. 1 n z u 1 í n - - d e p e n d e n t n ý d i a b e t e s

U potkanov BB sa inzulín-dependentný diabetes samovoľne vyvinul v období medzi 70. až 150. dňom života. Pomocou imunohistochemických analýz bola už v rannom štádiu choroby pozorovaná v Langerhansových ostrovčekoch prítomnosť infiltrovaných 1*1 H C 1.1’· a ΙΞΟΙ·¹' makrofágov. Mnoho m ak r o tágo v sa zdá byť zamestnaných fagocytézou bunkových trosiek alebo normálnych buniek.

počet takisto

S postupom makrofágov sa zdá, že choroby je pozorovaný stále sa zväčšujúci i n f i 11 r u. j ú c i c h L a n g e r h a n s o v e o .s t r o v č e k y a sa do tohoto miesta sústredí veľké množstvo

T-buniek a neskôr tiež B-buniek Ľ Hanenberg a ďalší, Diabetológia 32:126 až 134 ¢1989)3.

119 byť závislý, ako od aj od následného pomocou častíc oxidu

Rozvoj cukrovky u potkanov BE3 sa zdá včasnej infiltrácie makrofágov, tak sústreďovania T--buniek . Liečba potkanov 1313 kremičitého, ktoré sú pre makrofágy toxické, bola účinná tým, že zabránila infiltrácii makrofágov do Langerhaosových ostrovčekov v skorom štádiu choroby. E) e z včasnej infiltrácie makrof ágov nenastáva následná poškodenie tkaniva autoagresívnou populáciou lýmfocytov. Podávanie monoklonálnej protilátky OX—19 (špecifickej proti potkaniemu CDS) alebo monoklonálnej protilátky OX-8 (špecifickej proti potkaniemu CDS), ktoré blokujú fázu choroby spojenú s T-bunkami, je takisto účinné pri potláčaní rozvoja diabetes.

Centrálna úloha, ktorú majú makrofágy v patológií, tohoto modelu, robí. tento model atraktívnym pre testovanie inhibítorov funkcie oí_D. Potkany geneticky p r e disponovali é pre rozvinutie inzu lín-dependentného diabetes sú liečené inonok lonálnymi protilátkami proti oe,-, alebo nízkoniolekulárnyini inhibítormi a je u nich vyhodnocovaný vývoj choroby. Zabránenie: alebo oddialenie nástupu choroby je dôkazom, že oŕ_D hrá klúčovú úlohu v poškodení buniek ostrovčekov spôsobenom makrofágmi.

D. Zápalové črevné choroby (Crobnova choroba, vredovítá kolitída)

Živočíšne modely, použité pri štúdiu zápalovej črevnej choroby (1BD inflammatory bowel disease), sú zvyčajne vystavené intrarektálnemu podávaniu škodlivých dráždldiel (napríklad kyselina octová alebo kyselina trinitrobenzénsulfónová/etanol).

týmito látkami je výsledkom

Zápal hrubého čreva vyvolaný c h e m i c k é h o a 1. e b o m e t a b o 11 c k é h o a spontánne rečidivný charakter črevné choroby. Zdá sa však poškodenia a nemá chronický s p r e v á d z a j ú c i 1 u d s k é z á p a 1 o v é že nedávno popísaný model využívajúci subserózne injekcie purif lícovaného polyméru peptidoglykán- polysacharid (PG-PS) získaného zo streptokokov skupiny A alebo skupiny D, poskytuje lepší, fyziologicky relevantný model, pre ľudské 1BD ĽYainada a ďalší, Gastr oenterology

120

104:759 až 771 ¢1993)1.

V tomto modele je PG-PS aplikovaný do subseróznej vrstvy distálrieho hrubého čreva. Vyvolaná zápalová choroba má dve fázy, prvú akútnu fázu tri dni po injekcii, ktorá je nasledovaná spontánnou chronickou fázou o tri až štyri týždne neskôr. Odpoveď neskorej fázy je vo svojej podstate granulomatózna a vedie k zhruhnutiu hrubého čreva, adhéziáin, k vzniku uzlíkov a mukóznych lézií. Okrem poškodenia sliznica vedie kolitída C vyvolaná PG-PS) často k artritíde, anémii a granulomatóznej hepatitíde. Extraintestinálne prejavy choroby robia model atraktívnym pre štúdium Crohnovej kolitídy, pretože veľké množstvo pacientov s rozvinutou Crohňovou chorobou trpiaci zápalmi kĺbov a hepatobiliárnymi zápalmi.

Vznik granulomatóznych lézií. je dôsledkom chronického zápalu, ktorý vedie k infiltrácii a potom aktivácii buniek z línie monocyty/makrofágy. Výskyt granulomatóznych lézií pri Crohnovej chorobe a u vyššie uvedeného živočíšneho modelu, robí. z tohoto modelu atraktívny klinický cieľ pre monoklonálne protilátky namierené proti a pre iné inhibítory funkcie o;₀ Pokiaľ ide o inhibítory funkcie očakáva sa zamedzenie tvorby lézií. sprevádzajúcich ľ BO či dokonca zvrat v tkanivových poškodeniach vyskytujúcich sa pri tejto chorobe.

E. Artritída

Zdá sa, že artritída je multifaktoriálna choroba, na ktorej sa zúčastňujú rôzne typy buniek zápalu, vrátane neutrofilov, T-lymfocytov a fagocytárnych makrofágov. Aj keď existuje množstvo modelov artritídy, aplikácia proteglykánu získaného z bunkovej steny streptokokov spôsobuje poruchu najviac podobnú ľudskej choroby.

V organizme potkanov vyvoláva bunková stena streptokokov zápal periférnych kĺbov, ktorý je charakterizovaný opakovanými záchvatmi postupujúcej choroby nasledovanými remislami a

12:1.

nakoniec, počas niekolkých mesiacov, končí deštrukciou kĺbov LCromartie a ďalší, J. Exp. Med. 146,1585 až 1602 (1977); Schwab a ďalší, Infection and Immunity 59,4436 až 4442 (1991)3. Predpokladá sa, že najväčšiu úlohu v deštrukcii synovie hrajú počas chronickej fázy choroby niononukleárne fagocyty a inakrofágy. Okrem toho látky potláčajúce Infiltráciu makrofágov do synovie účinne znižujú zápalové a patologické charakteristiky artritídy.

Centrálna úloha makrofágov p r 3. deštrukcii, synovie vedúcej k artritíde naznačuje, že monoklonálne protilátky proti. a inhibítory funkcie môžu byt pri liečbe tejto choroby terapeuticky účinné. Rovnako ako pri vyššie popísaných modeloch sa predpokladá, že tieto monoklonálne protilátky a nízkomolekulárne inhibítory podávané preventívne zablokujú alebo zm i e r n i a k 1 b n y z á p a 3. a za b r á n i a z n i č e n i u s y n o v i e. L. á t k y majú c e rušivý vplyv na funkciu môžu takisto zmierniť prebiehajúci zápal tým, že zabránia infiltrácii ďalších makrofágov ku kĺbu a zablokujú aktiváciu makrofágov. Výsledným efektom by bol zvrat postupujúcej deštrukcie kĺbu a u3ľahčenie uzdravenia tkaniva.

R o z t r ú s e n á s k 1 e r é z a

Aj keď patogenéza roztrúsenej sklerózy (MS) zostáva nejasná, je všeobecne prijímané, že choroba je sprostredkovaná CD4¹ 3-bunkami, ktoré rozpoznáva jú autoantigény prítomné v centr álnom nervovom systéme a zahajujú tak zápalovú kaskádu. Vzniknutá imunitná odpoveď má za následok infiltráciu ďalších buniek zápalu, vrátane aktivovaných makrofágov, ktoré prispievajú k rozvoju choroby. Živočíšny model experimentálnej autoimunitnej e n c e f a1omy e111ídy (EAE) reproduk u j e niek toré aspek ty chor oby MS. Nedávno bolo dokázané, že monoklonálne protilátky reagujúce s CDllb/CD18 prítomnými na makrofágoch spôsobujúcich zápal CHuitinga a ďalší, Eur. J. Immunol. 23,709 až 715 (1993)3 blokujú ako klinické, tak aj histologické príznaky choroby. Výsledky napovedajú, že monoklonálne protilátky alebo nízkomolekulárne inhibítory polypeptidu sú pravdepodobne pri chorobe EAEľ účinné v blokovaní zápalovej reakcie. Tieto látky majú teda dôležité

122 t e r a p e u 11 c k é u p 1 a t n e n i e p r j. 1 i e č b e M S.

G. Alveolitída Alveolitis) vyvolaná imunitným komplexom (Immune Complex

Alveolárne makrofágy lokalizované v alveolách, kanálikocb, spojivovom tkanive a pohrudničných dutinách plúc, predstavujú prvú obrannú líniu pľúc proti látkam vdychovaným z okolitého prostredia. Ako odpoveď na simuláciu látkami (bakteriálny liposacharid, intergerón 11-N-τ a imunitný komplex) produkujú alveolárne makrofágy mnohé silné mediátory zápalu, vrátane veľmi reaktívnych kyslíkových radikálov a dusíkatých medzíproduktov. Zatiaľ čo byperoxidové anióny, peroxidy vodíka a oxidy dusíka (MQ-) majú dôležitú funkciu pri ničení patogénov a lýze nádorov, môžu tieto látky v zdravých tkanivách spôsobiť ich poškodenie.

Pre potkaní model. alveolitídy vyvolanej imunitným komplexom bolo dokázané, že produkcia NO- alveolárnymi makrofágmi. spôsobuje mnohé z poškodení plúc Ľ Mul. liga n a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. (IJSA) 88:638 až 6342 (1991)]. Radikály NO vykonávajú funkciu médiátorov aj pri iných poškodeniach spojených imunitným komplexom, vrátane dermálnej vaskulitídy EMulligan a ďalší, Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) potenciálne hrať úlohu g j. om e r u 1 o n e f r 11 í. d a .

88:638 až 6342 pri chorobách, (1991)3 ako je a mohli by napríklad

Poškodenia spôsobené NO“ nie sú obmedzené len na zápaly účasťou imunitného komplexu. Napríklad mikrogliálne bunky stimulované látkami ako je PMA, LPS alebo IFN-τ, produkujú NO v množstve schopnom usmrtiť ollgodendrocyty E Merrill a ďalší, Immunol. '151:2132 (1993)3. Bolo zistené, že pankreatické ostrovčeky sú citlivé k radikálom NO- a uvoľňovanie tohoto mediátora makrofágu spôsobilo poškodzovanie tkanív, ktoré viedlo k diabetes [Kroncke a ďalší, BBRC 175:752 až 758 (1991)3. Nedávno bolo presvedčivo dokázané, že produkcia MO hrá dôležitú úlohu pri endotoxickom šoku Ľ MacMicking a ďalší, Celí. 81:641 až 650 (1995)3. Keď bol aplikovaný lipopolysacharid (LPS) zdravým myšiam

123 divokého typu, bol pozorovaný tlaku končiaci smrťou. Pokial indukovať tvorbu IM (ľ) -, bol P o z o r o v a n ý o v e I a m e n g í p o k 1 e s experiment prežili.

vážny progresívny pokles tepnového ide: o myši, u ktorých nie: je možné v reakcii na prítomnosť I....PS, tepnového tlaku a všetky myši tento

Pokusy uskutočňované in vitro ukázali, že zablokovanie: je účinné pri potlačení niektorých aspektov aktivácie makrofágov C a 1 e: b o v š e o b e c n e 1 e u k o c y t o v e x p r im u. j ú o 1 c h a _C)) , v r á t a n e uvoľňovania NO-. Alveolárne makrofágy stimulované za prítomnosti polyklonálneho séra proti. oí_c, (proti potkanej doméne 1 polypeptidu pripravenej v králikoch) produkovali podstatne menej dusltan/dusičnanových produktov pri odburávaní NO, než makrofágy vystavené pôsobeniu kontrolného séra. Tieto zistenia dokazujú, že monoklonálne protilátky namierené proti a:_C), konkrétne proti I-doméne, môžu byť účinnými protizápalovými činidlami s možným využitím pri MS, diabetes, zápale plúc: a endotoxickom šoku. Navyše, v protiklade k CD18 podjednotke, ktorá ovplyvňuje funkciu mnohých typov leukocytov, obmedzená distribúcia robí z tejto pod .jednotky oveľa atraktívnejší ciel (ako je to pri CD18) pre blokovanie aktivácie makrofágov (alebo všeobecne leukocytov e x p r im u j ú c i c h <y. _a ) .

Alveolitída vyvolaná potkaním IgG imunitným komplexom je všeobecne používaný experimentálny model dôležitý pre porozumenie akútnemu poraneniu plúc. Toto poranenie je vyvolané nakvapkaním protilátok namierených proti hovädziemu sérovému albumínu (BSA) do plúc pomocou tracheálnej kanyly, nasledovaným Intravenóznou injekciou BSA. Sformovanie imunitných komplexov v pľúcnych vedie kapilárach neutrofilov do plúc. k om p 1 e x o v v p 1 ú o a c h, následnému uvoľnenie pohybu infiltrácii

Imunitných z krvi a

Následné a NO- z k aktivácii komplementu a Podlá všetkého, po sformovaní dôjde k extravazácli leukocytov leukocytov cez pľúcny epitel, médiá t or o v vrátane radikálov, TNF-oí aktivovaných endoteliálnych buniek, neutrofilov a makrofágov, prispieva k postupu choroby. Patologické črty choroby zahrnujú zväčšenie vaskulárnej permeablllty vedúce k otolcom a prítomnosti

124 veľkého počtu erytrocytov a polymor fonukleárnych buniek v alveolárnych dutinách.

Polyklonálne sérum Špecifické proti doméne 1 polypeptidu oé_dbolo testované na potkaniom modele alveolitldy vyvolanej imunitným komplexom. P ľ ú c t r a c h e á 1 n o u

Toto polyklonálne sérum bolo aplikované do kanylóu spolu s protilátkami proti BSA. Poranenie pľúc bolo potom vyvolané intravenózne alikáciou BSA so stopovým množstvom BSA značeného izotopom ^:l-²⁵I (približne 800000 cpm), aby mohol byt kvantifikovaný otok vzniknutý poranením pľúc. Pľúcne poranenie prebiehalo ďalšie 4 hodiny a veľkosť poranenia bola vyhodnotená z hodnoty pľúcnej permeability, ktorá je definovaná ako pomer BSA značeného izotopom ^X:2S1 v pľúcach k jeho množstvu prítomnom v krvi. Typické hodnoty pľúcnej permeability pre pozitívnu kontrolu leží. medzi 0, 6 až D, 8, n e d o s t a1i BSA) zatiaľ, čo negatívne majú hodnotu pľúcnej k o n t r o 1 y ( p o t k a n y, k t o r é permeability v rozsahu 0,1 až 0, 2.

Prvé štúdie dokázali, že pri liečbe pomocou polyklonálneho séra proti d_o sa znižuje permeabilita pľúc o viac ako 50%, čo predstavuje dramatické zmiernenie pľúcneho poranenia. Z histórie je známe zníženie permeability pľúc o 60%, ktoré bolo dosiahnuté podávaním protilátok proti CD18. Tieto zistenia dokazujú, že oŕ_Dmôže byt najdôležitejší integrín počas akútneho poranenia pľúc, aj keď nemôže byť presne zabraňuje extravazácii leukocytov z c e z p ľú eny e p i t e1.

určené, či účinok protilátok krvi alebo pohybu leukocytov

Ďalším dôkazom skutočnosti priebeh poranenia pľúc, bolo stanovenie hladiny TNF-α: v kvapaline získanej výplachom ich bronchoalveolárnej časti. Pri podávaní protilátok proti oŕ_c, bol zistený štvornásobný pokles hladiny INF- -d. INF-alfa bol už dlho považovaný za dôležitý mediátor pri akútnom zápale pľúc: a látku zodpovednú za infiltráciu buniek aktiváclu buniek a cŕo pravdepodobne že polypeptid oí,_;) zmierňuje zápalu

Sérum do miest zápalu, namierené proti rezidentných alveolárnych makrofágov poča:

P o š k o d e n i e t k a n í. v . blokuje aktivácie vzniku a1veo1itíds

125 vyvolanej imunitným komplexom a tým zmierňuje uvoľňovanie TNF-alfa a NO a znižuje následné poškodenie tkanív spôsobené týmito látkami a infiltráciou neutrofilov.

Príklad 26

Expresia oí_c> v prekliniekých modeloch

Aby mohla byt stanovená rozdielna expresia c<_D v rôznych štádiách choroby, boli rezy tkanív z živočíšnych modelov choroby značené polyklonálnym sérom proti d_o získaným postupom popísaným vyššie (pozri Príklad 18). Tkanivá zo zdravých a chorých potkanov boli rozrezané na hrúbku 6 um a vysušené na vzduchu na podložných sklíčkach Superfrost Plus (VWR Scientific) cez noc pri izbovej teplote. Po vysušení boli rezy až do použitia skladované pri teplote ~70 °C. Pred použitím boli sklíčka preložené z -70 °C na približne 5 minút od 50 ^c,0. Rezy boli počas 10 minút pri izbovej teplote fixované studeným acetónom (4 °C) (Stephens Scientific) a ponechané schnúť pri izbovej teplote. Každý rez bol, počas 30 minút pri izbovej teplote, blokovaná 150 ul roztoku so zložením 30% normálne potkanie sérum (Harlan Bioproducts), 5% normálne kozie sérum (Vector Laboratories) a 1% hovädzie sérum (BSA) (Sigma Chemical Company) v IX IBS a potom bol roztok z rezov jemne odsatý. Králičie polyklonálne sérum (koncentrácia proteínu 34 ug/ml) a sérum z rovnakého králika (získané pred imunizáciou) (Koncentrácia proteínu 38,5 ug/ml) bolo zriedené v blokovacom roztoku. Ku každému rezu bolo potom, na čas 30 minút pri teplote 37 °C, pridaných 100 ul jednotlivého séra. Roztok protilátok bol potom odsatý a nenavíazané protilátky odstránené trojnásobným premytím v IX IBS vždy počas 5 minút. Po poslednom premytí bol nadbytok IBS odstránený odsatím. Biotinylovaná kozia protilátka namierená proti králičím Ig bola pripravená s využitím kitu Elite Rabbit IgG Vectastain ABC (Vector), podlá návodu doporučeného výrobcom a 100 ul výsledného roztoku bolo nanesených na každý rez na 15 minút pri teplote 37 °C. Sklíčka boli dvakrát premývané v IX IBS, vždy počas 5 minút. Potom bolo na tkanivové rezy nanesených 100 ul konjugátu streptavldín-zlato (Goldmark

126

Biologicals) riedeného v pomere 1:100 v 5% normálnom potkaniom sére a 1% EISA a tento roztok bol ponechaný pôsobiť 1 hodinu pri izbovej teplote. Sklíčka boli trikrát premývané pufrom IBS, vždy počas 5 minút a potom na ne bolo na 5 minút pri izbovej teplote nanesených 100 j.tl 1% glutaraldehydu (Sigma) v TBS pufri. Sklíčka boli opát trikrát premývané v TBS, vždy počas 5 minút a päťkrát v sterilnej deionlzovanej vode, vždy počas 3 minút. Prebytok kvapalín bol odsatý a na každý rez boli nanesené dva kvapky strieborného zosilňujúceho roztoku a dva kvapky iniciačného roztoku (Goldmark Niologicals). Reakcia bola ponechaná prebiehať 20 až 30 minút pri izbovej teplote. Potom boli rezy dôkladne opláchnuté sterilnou deionizovanou vodou, vysušené cez noc pri izbovej teplote na vzduchu a prekryté Gytoseal 60 (VWR). Ako kontrola boli, pri rovnakých pokusoch a podlá rovnakého protokolu, použité rezy P r o t i 1 á t k am d. r o z p o z n á v a .j ú c im i tkanív značené monoklonálnymi. CDlla, CDllb, CDllc a CD18.

Značenie polyklonálnym sérom proti tón a značenie monoklonálnymi protilátkami proti CDlla, CDllb, CDllc a CD18 odhalilo pre v porovnaní s distribúciou pozorovanou pre iné pod jednotky odlišnú distribúciu značky.

ý normálnom pľúcnom tkanive bola expresia cz_D delegovaná na respiračnom epiteli pr iedušiek (avšak nie na epiteli, pľúcnych alveol) a na jednotlivých bunkách, čo by mohli byť alveolárne makrofágy vo vzduchových kanálikoch. Signál pozorovaný pri značení pomocou polyklonálneho séra bol podstatne silnejší než signál pozadia, pozorovaný pri kontrole uskutočňovanej so sérom získaným pred imunizáciou. V pľúcnom granulomatóznom tkanive bol, 24 a 96 hodín po aplikácii glykánu, detegovaný odlišný signál, kedy sa oc_D značenie objavilo v respiračnom epiteli vnútri, pľúcnych alveol a silnejší signál bol zaznamenaný na alveolárnych makrofágoch vnútri vzduchových kanálikov. ú pľúcnom tkanive živočíchov podľa všetkého zotavených z choroby (usmrtených 16 dní po aplikácii glykánu), nebol pozorovaný žiadny signál pri. značení protilátkou proti . U každe j z týchto tkanív bol detegovaný, pri značení pomocou séra získaného pred imunizáciou, velmi slabý

127 signál pozadia.

Pri použití, potkanieho pľúcneho tkaniva v modele astmy vyvolanej antigénom bol, v respiračnom epiteli ako priedušiek, tak aj pľúcnych alveol, delegovaný velmi silný signál, protilátky namierenej proti oío . Intenzita tohoto signálu bola podstatne vyššia ako úroveň signálu pozadia získaná pri použití kontrolného séra z neimunlzovaného živočícha.

Je možné predpokladal, že odborníkov napadnú ďalšie modifikácie a variácie vynálezu vysvetleného vo vyššie uvedených i'lustratívnych príkladoch. Preto by pre vynález mali platil len tie obmedzenia, ktoré sú uvedené v pripojených patentových

128

ZOZNAM SEKVENCIÍ

Cl) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

C i) PRIHLASOVATEĽ.: Gallatin, W. Michael Van de Vieren, Monica

Cii) NÁZOV VYNÁLEZU: Nová alfa podjednotka ľudského integrínu 0-2

Ciii) POČET SEKVENCIÍ: 183

Civ) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:

C A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOREJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelár

CB) ULICA: Národní 32

CC) MESTO-. Praha 1

CD) ŠTÁT: Česká republika C E) PSČ: 116 66

C v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

C A) TYP MÉDIA: Floppy disk C B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný

CC) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS

CD) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verzia ó. 1.25

C vi) DÁTA O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:

C A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

C B) DÁTUM PODANIA:

CC) ZATRIEDENIE:

C vil) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

C A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/173497 C B) DÁTUM PODANIE: 23. decembra 1993

Cvii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

C A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/286889 C B) DÁTUM PODANIE: 5. októbra 1994

Cvii) DÁTA O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

C A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/362652 C B) DÁTUM PODANIE: 21. decembra 1994

C vili) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:

C A) MENO: GOWSHALL, Jonathan Vallance C B) ČÍSLO SPISU: P11779SK-JVG/smt

Cix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

C A) TELEFÓN:

C B) TELEFAX: 0422 242 141 87 CC) TELEX:

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 1:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 3726 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLOGIA: lineárna

129 (11) TYP MOLEKULY: cDNA (lx) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) NÁZOV/KLIJČ: CDS (B) UMIESTENIE: 3..3485 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 1:

TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 47

Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His

1

5

10

15

GGA

TTC

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

CCT

ACG

ATC

TTC

CAG

GAG

GAT

GCA

95

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

íle

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

20

25

30

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC

GTG

CAG

TTC

GGT

GGA

TCT

CGÁ

CTC

GTG

143

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG

GTG

GCG

GCC

AAC

CAG

ACG

GGA

CGG

CTG

191

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC

GGC

ATG

TGC

CAG

CCC

ATC

CCG

CTG

CAC

239

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

íle

Pro

Leu

His

65

70

75

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

TTG

GGC

CTG

ACC

CTG

GCA

GCC

287

íle

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

80

85

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG

GCC

TGT

GGC

CCG

ACC

CTG

CAC

AGA

335

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

no

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA

AAG

GGT

TCC

TGC

CTC

CTG

GGC

383

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

TCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA

GTC

CCC

GAC

GCC

ACG

CCA

GAG

TGT

431

Ser

Arg

Trp

Glu

íle

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

CCA

CAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATC

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGA

AGC

479

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

ATT

GAC

CAA

AAT

GAC

TTT

AAC

CAG

ATG

AAG

GGC

TTT

GTC

CAA

GCT

GTC

527

íle

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

160

165

170

175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC

ACC

CTG

TTT

GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

575

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

TTC

ACC

TTC

ACC

CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

623

Ser

Asn

Leu

Lys

íle

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

130

CCG AGC CAG CAG

AGC CTG GTG GAT

CCC Pro

ATC GTC CAA CTG

AAA Lys

GGC CTG

671

Pro

Ser

Gin Gin 210

Ser

Leu

Val

Asp 215

íle

Val

Gin

Leu 220

Gly

Leu

ACG

TTC

ACG

GCC

ACG

GGC

ATC

CTG

ACA

GTG

ACA

CAG

CTA

TTT

CAT

719

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

CAT

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATT

GTC

ATC

767

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

240

245

250

255

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

GAA

TAC

AGT

GAT

GTC

ATC

815

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

260

265

270

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC

CGC

TAC

GCT

ATC

GGG

GTG

GGA

863

Pro

Gin.

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

275

280

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

911

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

959

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

AAG

ATC

TAT

GCA

GTT

GAG

1007

Leu

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Tyr

Ala

Val

Glu

320

325

330

335

GGA

ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

TCC

TTC

CAG

CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1055

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA

ATG

GAT

GGC

CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1103

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

CTG

TAT

CCC

CCA

AAT

1151

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1199

Het

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GAG

CTA

GCC

CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1247

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

400

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC

CGC

TAC

CAG

CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1295

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

¹

430

GTC

ATC

TTC

ACC

CAG

GTG

TCC

AGG

CAA

TGG

AGG

AAG

GCC

GAA

GTC

1343

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

131

ACA GGG ACG CAG ATC

GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC

TGC Cys

TCC Ser

GTG Val

1391

Thr Gly Thr Gin

íle

Gly

Ser

Tyr 455

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu 4 60

450

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

CCC

1439

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

íle

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

465

470

475

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

1487

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

480

485

490

495

CCT

AGG

GGG

CAG

AGG

GTG

CAG

TGG

CAG

TGT

GAC

GCT

GTT

CTC

CGT

GGT

1535

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

500

505

510

GAG

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

1583

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

GGG

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

1631

Gly

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

íle

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

530

535

540

GGA

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

1679

Gly

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

545

550

555

GAA

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

1727

Glu

Ser

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Ser

Gin

560

565

570

575

CTC

TCC

CCC

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

GCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

1775

Leu

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

580

585

590

GAC

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

1823

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

605

CAG

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

1871

Gin

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

610

615

620

ATG

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

1919

Met

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

625

630

635

GAA

GAG

AAG

CCC

AGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

1967

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

640

645

650

655

ACC

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

2015

Thr

íle

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

íle

Gin

Ser

660

665

670

GTC

AGG

TTT

GAT

CTG

GCA

CTG

GAC

CCA

GGT

CGT

CTG

ACT

TCT

CGT

GCC

2063

Val

Arg

Phe

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser

Arg

Ala

67 5

680

685

132

ATT íle

TTC AAT

GAA ACC

AAG AAC CCC ACT

TTG Leu

ACT Thr

CGA Arg

AGA AAA

ACC Thr

CTG Leu

2111

Phe

Asn 690

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro 695

Thr

Arg 700

Lys

GGA

CTG

GGG

ATT

CAC

TGT

GAA

ACC

CTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAT

TGT

2159

Gly

Leu

Gly

íle

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

705

710

715

GTG

GAG

GAT

GTG

AGC

CCC

ATC

ATT

CTG

CAC

CTC

AAC

TTC

TCA

CTG

2207

Val

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

íle

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

720

725

730

735

GTG

AGA

GAG

CCC

ATC

CCC

TCC

CCC

CAG

AAC

CTG

CGT

CCT

GTG

CTG

GCC

2255

Val

Arg

Glu

Pro

íle

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

2303

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

TGT

GGG

CAA

GAT

GGC

CTC

TGT

GAA

GGG

GAC

CTG

GGT

GTC

ACC

CTC

AGC

2351

Cys

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

770

775

780

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

2399

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

785

790

795

GTG

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

AAC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

2447

Val

He

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

800

805

810

815

GTC

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

2495

Val

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

820

825

830

GCC

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA .

2543

Ala

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

835

840

845

GTG

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

2591

Val

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

850

855

860

CAC

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

2639

His

Pro

íle

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

íle

Val

Thr

Phe

865

870

875

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

2687

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala .

880

885

8 90

895

AC-T

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

2735

Ser

A 1.3

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

900

905

910

CAG

CTG

GAG

CTC

CCG

GTG

AAG

TAT

GCA

GTC

TAC

ACC

ATG

ATC

AGC

AGG

2733

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Thr

Met

íle

Ser

Arg

915

920

925

133

CAG Gin

GAA GAA TCC ACC AAG

TAC Tyr

TTC AAC TTT GCA ACC

TCC GAT GAG

AAG Lys

2831

Glu

Glu 930

Ser

Thr

Lys

Phe 935

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser Asp 940

Glu

AAA

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC CTC

AGC

CAG

2879

Lys

Met 945

Lys

Glu

Ala

Glu

His 950

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn 955

Asn Leu

Ser

Gin

CGA

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC CTG

CTG

AAC

2927

Arg 960

Asp

Leu

Ala

íle

Ser 965

íle

Asn

Phe

Trp

Val 970

Pro

Val Leu

Leu

Asn 975

GGG

GTG

GCT

GTG

TGG

GAT

GTG

GTC

ATG

GAG

GCC

CCA

TCT CAG

AGT

CTC

2975

Gly

Val

Ala

Val

Trp 980

Asp

Val

Met

Glu 985

Ala

Pro

Ser Gin

Ser 990

Leu

CCC

TGT

GTT

TCA

GAG

AGA

AAA

CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC TTC

CTG

ACC

3023

Pro

Cys

Val

Ser 995

Glu

Arg

Lys

Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp Phe Leu 1005

Thr

CAG

ATT

TCA

AGA

AGT

CCC

ATG

CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT GAC

TGC

CTG

3071

Gin

íle

Ser Arg 1010

Ser

Pro

Met

Leu Asp 1015

Cys

Ser

íle

Ala Asp 1020

Cys

Leu

CAG

TTC

CGC

TGT

GAC

GTC

CCC

TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG GAG

CTG

GAT

3119

Gin

Phe Arg 1025

Cys

Asp

Val

Pro Ser 1030

Phe

Ser

Val

Gin Glu Glu 1035

Leu

Asp

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAT

CTC

AGT

TTC

GGC

TGG

GTC

CGC GAG

ACA

TTG

3167

Phe Thr 1040

Leu

Lys

Gly

Asn Leu 1045

Ser

Phe

Gly

Trp Val 1050

Arg Glu

Thr

Leu 1055

CAG

AAG

GTG

TTG

GTC

GTG

AGT

GTG

GCT

GAA

ATT

ACG TTC

GAC

ACA

3215

Gin

Lys

Val

Leu Val 1060

Val

Ser

Val

Ala Glu 1065

íle

Thr Phe

Asp Thr 1070

TCC

GTG

TAC

TCC

CAG

CTT

CCA

GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

ATG AGA

GCT

CAG

3263

Ser

Val

Tyr

Ser Gin 1075

Leu

Pro

Gly

Gin Glu 1080

Ala

Phe

Met Arg Ala 1085

Gin

ATG

GAG

ATG

GTG

CTA

GAA

GAC

GAG

GTC

TAC

AAT

GCC ATT

CCC

ATC

3311

Met

Glu

Met Val 1090

Leu

Glu

Asp Glu 1095

Val

Tyr

Asn

Ala íle 1100

Pro

íle

ATC

ATG

GGC

AGC

TCT

GTG

GGG

GCT

CTG

CTA

CTG

GCG CTC

ATC

ACA

3359

íle

Met Gly 1105

Ser

Val

Gly Ala 1110

Leu

Leu Ala Leu 1115

íle

Thr

GCC

ACA

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAA

CGC

CAC

TAC AAG

GAA

ATG

3407

Ala Thr 1120

Leu

Tyr

Lys

Leu Gly 1125

Phe

Lys

Arg His 1130

Tyr Lys

Glu

Met 1135

CTG

GAG

GAC

AAG

CCT

GAA

GAC

ACT

GCC

ACA

TTC

AGT

GGG GAC

GAT

TTC

3455

Leu

Glu

Asp

Lys

Pro Glu 1140

Asp

Thr

Ala

Thr Phe 1145

Ser

Gly Asp

Asp Phe 1150

AGC Ser

TGT Cys

GTG Val

GCC CCA Ala Pro 1155

AAT Asn

GTG Val

CCT Pro

TTG TCC Leu Ser 1160

TAATAATCCA CTTT'

CCTGTT

3505

134

TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC	ATGGAAACAA	3566
CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC	CTTCTCGGAG	3625
AGATAGAGAT TGTAATGTTT TTACATATCT GTCCATCTTT TTCAGCAATG	ACCCACTTTT	3685
TACAGAAGCA GGCATGGTGC CAGCATAAAT TTTCATATGC T		3726

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: protein

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 2:

Thr Phe Gly Thr Val

Leu Leu Leu Ser Val 10

Leu

Ala Ser

Tyr

His 15

Gly

1

5

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

íle

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

Gly

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

íle

Pro

Leu

His

íle

65

70

75

80

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

Ser

85

90

95

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

Val

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

115

120

125

Arg

Trp

Glu

íle

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

His

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

145

150

155

160

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

Met

165

170

175

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

180

185

190

Asn

Leu

Lys

íle

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

. Phe

Arg

Thr

Ser

Pro

195

200

205

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

Thr

210

215

220

135

Phe Thr 225

Ala

Thr

Gly

íle Leu Thr Val Val Thr Gin

Leu

Phe

His

His 240

230

235

Lys

Asn

Gly.

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

Thr

245

250

255

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

Pro

260

265

270

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

His

275

280

285

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

Leu

305

310

315

320

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Tyr

Ala

Val

Glu

Gly

325

330

335

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

340

345

350

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu.

Phe

Leu

Gly

Ala

Val

355

360

365

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Met

370 375 380

Ser 385

Pro

Thr

Phe

íle

Asn 390

Met

Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg Asp

395

400

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

Gin

405

410

415

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

Val

420

425

430

íle

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

Thr

435

440

445

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

450

455

460

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

íle

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

His

465

470

475

4 80

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

Pro

485

490

495

Arg

Gly

Gin

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

íle

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

136

Glu 545

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly 550

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe 555

His

Gly

Ala

Ser

Glu 560

Ser

Gly

íle

Ser

Pro 565

Ser

His

Ser

Gin

Arg 570

íle

Ala

Ser

Gin 575

Leu

Ser

Pro

Arg

Leu 580

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin 585

Ala

Leu

Ser

Gly

Gly 590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin 595

Asp

Gly

Leu

Met

Asp 600

Leu

Ala

Val

Gly

Ala 605

Arg

Gly

Gin

Val

Leu 610

Leu

Arg

Ser

Leu 615

Pro

Val

Leu

Lys

Val 620

Gly

Val

Ala

Met

Arg 625

Phe

Ser

Pro

Val

Glu 630

Val

Ala

Lys

Ala

Val 635

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu 640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala 645

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp 650

Ala

Thr

Val

Cys

Leu 655

Thr

íle

Gin

Lys

Ser 660

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu 665

Gly

Asp

íle

Gin

Ser 670

Ser

Val

Arg

Phe

Asp 675

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro 680

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser 685

Arg

Ala

íle

Phe

Asn 690

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro 695

Thr

Leu

Thr

Arg

Arg 700

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu 705

Gly

íle

His

Cys

Glu 710

Thr

Leu

Lys

Leu

Leu 715

Leu

Pro

Asp

Cys

Val 720

Glu

Asp

Val

Ser 725

Pro

íle

Leu

His 730

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu 735

Val

Arg

Glu

Pro

íle

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

740 745 750

Gly

Ser Gin 755

Asp Leu

Phe Thr Ala Ser Leu 760

Pro Phe Glu Lys Asn 765

Cys

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

íle

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

137

Pro 865

íle

Phe

His

Glu

Gly Ser 870

Asn Gly

Thr

Phe 875

íle

Val

Thr

Phe

Asp 880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala 885

Thr Leu

Gly Asp

Arg 890

Met

Leu

Met

Arg

Ala 895

Ser

Ala

Ser

Glu 900

Asn

Asn Lys

Ala Ser 905

Ser

Lys

Ala

Thr 910

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu 915

Pro

Val

Lys Tyr

Ala Val 920

Tyr

Thr

Met

íle 925

Ser

Arg

Gin

Glu

Glu 930

Ser

Thr

Lys

Tyr Phe 935

Asn Phe

Ala

Thr

Ser 940

Asp

Glu

Lys

Met 945

Lys

Glu

Ala

Glu

His Arg 950

Tyr Arg

Val

Asn 955

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg 960

Asp

Leu

Ala

íle

Ser 965

íle Asn

Phe Trp

Val 970

Pro

Val

Leu

Asn 975

Gly

Val

Ala

Val

Trp 980

Asp

Val Val

Met Glu 985

Ala

Pro

Ser

Gin

Ser 990

Leu

Pro

Cys

Val

Ser 995

Glu

Arg

Lys Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp

Phe Leu 1005

Thr

Gin

íle

Ser Arg 1010

Ser

Pro

Met Leu Asp Cys 1015

Ser

íle

Ala Asp 1020

Cys

Leu

Gin

Phe Arg 1025

Cys

Asp

Val

Pro Ser 1030

Phe Ser

Val

Gin Glu 1035

Glu

Leu

Asp

Phe 1040

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn Leu Ser 1045

Phe Gly

Trp Val 1050

Arg

Glu

Thr

Leu Gin 1055

Lys

Val

Leu Val 1060

Val Ser

Val Ala Glu 1065

íle

Thr

Phe

Asp Thr 1070

Ser

Val

Tyr

Ser Gin 1075

Leu

Pro Gly

Gin Glu 1080

Ala

Phe

Met

Arg Ala 1085

Gin

Met

Glu

Met Val 1090

Leu

Glu

Glu Asp Glu Val 1095

Tyr

Asn

Ala íle 1100

Pro

íle

Met Gly 1105

Ser

Val

Gly Ala 1110

Leu Leu

Leu

Leu Ala 1115

Leu

íle

Thr

Ala 1120

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu Gly Phe 1125

Phe Lys

Arg His 1130

Tyr

Lys

Glu

Met Leu 1135

Glu

Asp

Lys

Pro Glu 1140

Asp Thr

Ala Thr Phe 1145

Ser Gly

Asp

Asp Phe 1150

Ser

Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Lys Ser 1155 1160

138

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 3=

C i)

charakterist:

ĽKA

SEKVENCIE:

C A)

DLZKA:

115

Í3 aniinokys

elít

'1

(B)

TYP

: aniinokys

elina

(C)

POČ

ET REŤAZCOV:

jede

n

CD)

TOPOLOl

JIA:

T i. ne á r

~na

C ii)

TYP MOLEKULY

: proteín

( xi)

POPIS

SEKVENl

ČIE:

S E

K. ID.

Č . :

3 :

Met

Ala Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Ala

Leu

Thr

Leu

Cys

His

Gly

1

5

10

15

Phe

Asn Leu

Asp

Thr

Glu

Asn

Ala

Met

Thr

Phe

Gin

Glu

Asn

Ala

Arg

20

25

30

Gly

Phe Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Ser

Arg

Val

35

40

45

Gly

Ala Pro

Gin

Glu

íle

Val

Ala

Asn

Gin

Arg

Gly

Ser

Leu

Tyr

50

55

60

Gin

Cys Asp

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ser

Cys

Glu

Pro

íle

Arg

Leu

Gin

Val

65

70

75

80

Pro

Val Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

85

90

95

Thr

Ser Pro

Pro

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Gin

Thr

100

105

110

Cys

Ser Glu

Asn

Thr

Tyr

Val

Lys

Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

Phe

Gly

Ser

115

120

125

Asn

Leu Arg

Gin

Pro

Gin

Lys

Phe

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Gly

Cys

130

135

140

Pro

Gin Glu

Asp

Ser

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

íle

íle Pro

His

Asp

Phe

Arg

Met

Lys

Glu

Phe

Val

Ser

Thr

Val

165

170

175

Met

Glu Gin

Leu

Lys

Ser

Lys

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Glu Glu

Phe

Arg

íle

His

Phe

Thr

Phe

Lys

Glu

Pne

Gin

Asn

195

200

205

Pro

Asn Pro

Arg

Ser

Leu

Val

Lys

Pro

íle

Thr

Gin

Leu

Gly

Arg

210

215

220

Thr

His Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

Lys

Val

Arg

Glu

Leu

Phe

Asn

225

230

235

240

íle

Thr Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Asn

Ala

Phe

Lys

íle

Leu

Val

íle

245

250

255

139

Thr Asp Gly Glu Lys 260

Phe Gly Asp

Pro

Leu 265

Gly Tyr

Glu

Asp

Val 270

íle

Pro

Glu

Ala

Asp

Arg

Glu

Gly

Val

íle

Arg

Tyr

Val

íle

Gly

Val

Gly

275

280

285

Asp

Ala

Phe

Arg

Ser

Glu

Lys

Ser

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ala

290

295

300

Ser

Lys

Pro

Arg

Asp

His

Val

Phe

Gin

Val

Asn

Phe

Glu

Ala

305

310

315

320

Leu

Lys

Thr

íle

Gin

Asn

Gin

Leu

Arg

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

íle

Glu

325

330

335

Gly

Thr

Gin

Thr

Gly

Ser

Phe

Glu

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Thr

Ser

Asn

Gly

Pro

Leu

Ser

Thr

355

360

365

Val

Gly

Ser

Tyr

Asp

Trp

Ala

Gly

Val

Phe

Leu

Tyr

Thr

Ser

Lys

370

375

380

Glu

Lys

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Thr

Arg

Val

Asp

Ser

Asp

Met

Asn

385

390

395

400

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ala

íle

Leu

Arg

Asn

Arg

Val

405

410

415

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

íle

Gly

Leu

Val

420

425

430

Ala

Met

Phe

Arg

Gin

Asn

Thr

Gly

Met

Trp

Glu

Ser

Asn

Ala

Asn

Val

435

440

445

Lys

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ala

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

Asp

Val

Asp

Ser

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly

Gin

Arg

Ala

Arg

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Tyr

Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

Gin

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asp

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Thr

Ser

545

550

555

560

Gly

Ser

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Gly

Ser

Lys

565 570 575

140

Leu Ser Pro Arg Leu Gin Tyr Phe Gly Gin Ser Leu Ser Gly Gly Gin 580 585 590

Asp

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Thr

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

595

600

605

His

Val

Leu

Arg

Ser

Gin

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Lys

Ala

íle

610

615

620

Met

Glu

Phe

Asn

Pro

Arg

Glu

Val

Ala

Arg

Asn

Val

Phe

Glu

Cys

Asn

625

630

635

640

Asp

Gin

Val

Lys

Gly

Lys

Glu

Ala

Gly

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Leu

645

650

655

His

Val

Gin

Lys

Ser

Thr

Arg

Asp

Arg

Leu

Arg

Glu

Gly

Gin

íle

Gin

660

665

670

Ser

Val

Thr

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Ser

Gly

Arg

Pro

His

Ser

675

680

685

Arg

Ala

Val

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Thr

Arg

Gin

Thr

Gin

690

695

700

Val

Leu

Gly

Leu

Thr

Gin

Thr

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Gin

Leu

Pro

705

710

715

720

Asn

Cys

íle

Glu

Asp

Pro

Val

Ser

Pro

íle

Val

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

725

730

735

Ser

Leu

Val

Gly

Thr

Pro

Leu

Ser

Ala

Phe

Gly

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

740

745

750

Leu

Ala

Glu

Asp

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Thr

Ala

Leu

Phe

Pro

Phe

Glu

755

7 60

765

Lys

Asn

Cys

Gly

Asn

Asp

Asn

íle

Cys

Gin

Asp

Leu

Ser

íle

Thr

770

775

780

Phe

Ser

Phe

Met

Ser

Leu

Asp

Cys

Leu

Val

Gly

Pro

Arg

Glu

785

790

795

800

Phe

Asn

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Asp

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Arg

805

810

815

Thr

Gin

Val

Thr

Phe

Pro

Leu

Asp

Leu

Ser

Tyr

Arg

Lys

Val

820

825

830

Ser

Thr

Leu

Gin

Asn

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg

Ser

Trp

Arg

Leu

Ala

Cys

835

840

845

Glu

Ser

Ala

Ser

Thr

Glu

Val

Ser

Gly

Ala

Leu

Lys

Ser

Thr

Ser

850

855

860

Cys

Ser

íle

Asn

His

Pro

íle

Phe

Pro

Glu

Asn

Ser

Glu

Val

Thr

Phe

865

870

875

880

Asn

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Asp

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Asn

Lys

Leu

885

890

895

141 ¢2)

Leu	Leu Lys	Ala Asn 900	Val	Thr Ser Glu Asn Asn Met 905	Pro	Arg 910	Thr	Asn
Lys	Thr Glu	Phe Gin	Leu	Glu Leu Pro Val Lys Tyr	Ala	Val	Tyr	Met
	915			920	925
Val	Val Thr	Ser His	Gly	Val Ser Thr Lys Tyr Leu	Asn	Phe	Thr	Ala
	930			935 940
Ser	Glu Asn	Thr Ser	Arg	Val Met Gin His Gin Tyr	Gin	Val	Ser	Asn
94 5			950	955				960
Leu	Gly Gin	Arg Ser	Leu	Pro íle Ser Leu Val Phe	Leu	Val	Pro	Val
		965		970			975
Arg	Leu Asn	Gin Thr	Val	íle Trp Asp Arg Pro Gin	Val	Thr	Phe	Ser
		980		985		990
Glu	Asn Leu	Ser Ser	Thr	Cys His Thr Lys Glu Arg	Leu	Pro	Ser	His
	995			1000	1005
Ser	Asp Phe	Leu Ala	Glu	Leu Arg Lys Ala Pro Val	Val	Asn	Cys	Ser
	1010			1015 1020
íle	Ala Val	Cys Gin	Arg	íle Gin Cys Asp íle Pro	Phe	Phe	Gly	íle
1025		1030 1035				1040
Gin	Glu Glu	Phe Asn	Ala	Thr Leu Lys Gly Asn Leu	Ser	Phe	Asp	Trp
		1045	1050			1055
Tyr	íle Lys	Thr Ser	His	Asn His Leu Leu íle Val	Ser	Thr	Ala	Glu
		1060		1065		1070
íle	Leu Phe	Asn Asp	Ser	Val Phe Thr Leu Leu Pro	Gly	Gin	Gly	Ala
	1075		1080	1085
Phe	Val Arg	Ser Gin	Thr	Glu Thr Lys Val Glu Pro	Phe	Glu	Val	Pro
	1090			1095 1100
Asn	Pro Leu	Pro Leu	íle	Val Gly Ser Ser Val Gly	Gly	Leu	Leu	Leu
1105		1110 1115				1120
Leu	Ala Leu	íle Thr	Ala	Ala Leu Tyr Lys Leu Gly	Phe	Phe	Lys	Arg
		1125	1130			1135
Gin	Tyr Lys	Asp Met	Met	Ser Glu Gly Gly Pro Pro	Gly	Ala	Glu	Pro
		1140		1145		1150
Gin’
INFORMÁCIE	0 SEK..	ID.	č . : 4 :

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 1163 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden CD) TOPOĽÓGIA: 1ineárna

Cii) TYP MOLEKULY: proteín

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 4:

151

142

Met 1

Thr

Arg Thr

Arg Ala Ala Leu Leu Leu

Phe Thr

Ala

Leu

Ala 15

Thr

5

10

Ser

Leu

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Thr

Glu

Leu

Thr

Ala

Phe

Arg

Val

20

25

30

Asp

Ser

Ala

Gly

Phe

Gly

Asp

Ser

Val

Gin

Tyr

Ala

Asn

Ser

Trp

35

40

45

Val

Gly

Ala

Pro

Gin

Lys

íle

Ala

Asn

Gin

íle

Gly

50

55

60

Gly

Leu

Tyr

Gin

Cys

Gly

Tyr

Ser

Thr

Gly

Ala

Cys

Glu

Pro

íle

Gly

65

70

75

80

Leu

Gin

Val

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Ala

Ser

Thr

Ser

Pro

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

100

105

110

His

Glu

Cys

Gly

Arg

Asn

Met

Tyr

Leu

Thr

Gly

Leu

Cys

Phe

Leu

115 120 125

Leu

Gly 130

Pro Thr

Gin

Leu Thr Gin Arg Leu 135

Pro

Val 140

Ser

Arg

Gin

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Gin

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

145

150

155

160

Ser

íle

Ser

Arg

Asn

Phe

Ala

Thr

Met

Asn

Phe

Val

Arg

Ala

165

170

175

Val

íle

Ser

Gin

Phe

Gin

Arg

Pro

Ser

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

180

185

190

Phe

Ser

Asn

Lys

Phe

Gin

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Glu

Phe

Arg

195

200

205

Thr

Ser

Asn

Pro

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Val

His

Gin

Leu

Gin

Gly

210

215

220

Phe

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Ala

íle

Gin

Asn

Val

His

Arg

Leu

Phe

225

230

235

240

His

Ala

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

Asp

Ala

íle

Lys

íle

Leu

íle

Val

245

250

255

íle

Thr

Asp

Gly

Lys

Glu

Gly

Asp

Ser

Leu

Asp

Tyr

Lys

Asp

Val

260

265

270

íle

Pro

Met

Ala

Asp

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

275

280

285

Gly

Leu

Ala

Phe

Gin

Asn

Arg

Asn

Ser

Trp

Lys

Glu

Leu

Asn

Asp

íle

290

295

300

Ala

Ser

Lys

Pro

Ser

Gin

Glu

His

íle

Phe

Lys

Val

Glu

Asp

Phe

Asp

305

310

315

320

1.43

Ala

Leu Lys

Asp íle Gin Asn Gin Leu Lys

Glu

Lys

íle

Phe

Ala 335

íle

325

330

Glu

Gly

Thr

Glu

Thr

íle

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Met

Ala

340

345

350

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Val

Phe

Thr

Pro

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

355

360

365

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Thr

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Asn

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

385

390

395

400

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

405

410

415

Val

Gin

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

íle

Gly

Lys

420

425

430

Ala

Val

íle

Phe

íle

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Met

Lys

Ala

Glu

435 440 445

Val

íle Gly Thr Gin íle Gly

Ser

Tyr

Phe Gly Ala Ser Leu 460

Cys

Ser

450

455

Val

Asp

Val

Asp

Thr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

465

470

475

480

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

485

490

495

Leu

Pro

Arg

Gly

Trp

Arg

Trp

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Tyr

Gly

500

505

510

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

515

520

525

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Lys

Leu

Thr

Asp

Val

íle

Gly

Ala

Pro

530

535

540

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Val

Leu

545

550

555

560

Gly

Pro

Ser

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Gly

Ser

Gin

565

570

57 5

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

580

585

590

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

595

600

605

Gin

Val

Leu

Arg

Thr

Arg

Pro

Val

Leu

Trp

Val

Gly

Val

Ser

610

615

620

Met Gin Phe íle Pro Ala Glu íle Pro Arg Ser Ala Phe Glu Cys Arg 625 630 635 640

144

Glu

Gin

Val

Ser 645

Glu

Gin

Thr

Leu

Val 650

Gin

Ser

Asn

íle

Cys 655

Leu

Tyr

íle

Asp

Lys 660

Arg

Ser

Lys

Asn

Leu 665

Leu

Gly

Ser

Arg

Asp 670

Leu

Gin

Ser

Val 675

Thr

Leu

Asp

Leu

Ala 680

Leu

Ala

Pro

Gly

Arg 685

Leu

Ser

Pro

Arg

Ala 690

íle

Phe

Gin

Glu

Thr 695

Lys

Asn

Arg

Ser

Leu 700

Ser

Arg

Val

Arg

Val 705

Leu

Gly

Leu

Lys

Ala 710

His

Cys

Glu

Asn

Phe 715

Asn

Leu

Pro 720

Ser

Gys

Val

Glu

Asp 725

Ser

Val

íle

Pro

íle 730

íle

Leu

Arg

Leu

Asn 735

Phe

Thr

Leu

Val

Gly 740

Lys

Pro

Leu

Ala 745

Phe

Arg

Asn

Leu

Arg 750

Pro

Met

Leu

Ala

Ala 755

Leu

Ala

Gin

Arg

Tyr 7 60

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu 765

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn 770

Cys

Gly

Ala

Asp

His 775

íle

Cys

Gin

Asp

Asn 780

Leu

Gly

íle

Ser

Phe 785

Ser

Phe

Pro

Gly

Leu 7 90

Lys

Ser

Leu

Val 795

Gly

Ser

Asn

Leu

Glu 800

Leu

Asn

Ala

Glu

Val 805

Met

Val

Trp

Asn

Asp 810

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr 815

Gly

Thr

íle

Thr

Phe

Ser

His

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Val

820 825 830

Ala

Glu Gly 835

Gin

Lys

Gin Gly

Gin 840

Leu

Arg

Ser Leu His 845

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Pro

Val

Gly

Ser

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Thr

Ser

Cys

Arg

850

855

860

íle

Asn

His

Leu

íle

Phe

Arg

Gly

Ala

Gin

íle

Thr

Phe

Leu

Ala

865

870

875

880

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Pro

Lys

Ala

Val

Gly

Leu

Asp

Arg

Leu

885

890

895

íle

Ala

Asn

Val

Ser

Glu

Asn

íle

Pro

Arg

Thr

Ser

Lys

Thr

900

905

910

íle

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

íle

Val

915

920

925

Ser

His

Glu

Gin

Phe

Thr

Lys

Tyr

Leu

Asn

Phe

Ser

Glu

Ser

Glu

930

935

940

Glu Lys Glu Ser His Val Ala Met His Arg Tyr Gin Val Asn Asn Leu 945 950 955 960

145

Gly Gin Arg	Asp	Leu Pro Val Ser íle 965	Asn 970	Phe	Trp	Val	Pro	Val 975	Glu
Leu Asn Gin	Glu 980	Ala Val Trp Met Asp 985	Val	Glu	Val	Ser	His 990	Pro	Gin
Asn Pro Ser 995	Leu	Arg Cys Ser Ser Glu 1000	Lys	íle	Ala	Pro 1005	Pro	Ala	Ser
Asp Phe Leu 1010	Ala	His íle Gin Lys Asn 1015	Pro	Val	Leu 102C	Asp 1	Cys	Ser	íle
Ala Gly Cys 1025	Leu	Arg Phe Arg Cys Asp 1030	Val	Pro Ser 1035	Phe	Ser	Val	Gin 1040
Glu Glu Leu	Asp	Phe Thr Leu Lys Gly 1045	Asn Leu 1050	Ser	Phe	Gly	Trp Val 1055
Arg Gin íle	Leu Gin Lys Lys Val Ser Val 1060 1065	Val	Ser	Val	Ala Glu 1070	íle
íle Phe Asp Thr 1075	Ser Val Tyr Ser Gin 1080	Leu	Pro	Gly	Gin 108E	Glu	Ala	Phe
Met Arg Ala 1090	Gin	Thr íle Thr Val Leu 1095	Glu	Lys	Tyr Lys 1100	Val	His	Asn
Pro íle Pro 1105	Leu	íle Val Gly Ser Ser 1110	íle	Gly Gly 1115	Leu	Leu	Leu	Leu 1120
Ala Leu íle	Thr	Ala Val Leu Tyr Lys 1125	Val Gly 1130	Phe	Phe	Lys	Arg Gin 1135
Tyr Lys Glu Met Met Glu Glu Ala Asn Gly Gin 1140 1145 Gly Thr Gin Thr Pro Ser Pro Pro Ser Glu Lys 1155 1160 INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 5: Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: C A) DĹŽKA: 12 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna	íle	Ala	Pro Glu 1150	Asn

(ii) TYP MOLEKULY: pepticl

Cxi) POPIS	SEKVENCIE: SEK.	ID.	Č. :	t) :
Phe Asn Leu	Asp Val Glu Glu Pro	Met	Val	Phe

10

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP·, nukleová kyselina CC) POČET REŤAZCOV: jeden

146 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 6:

TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA 35 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. C.: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 7:

TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 8= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DMA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 8:

TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. o.: 9:

TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC ²³ (2) INFORMÁCIE 0 SEK. ID. č.: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA

1.47

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 10:

TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 11:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. C.: 11:

TGRAANACCA TNGGÝTC ¹⁷ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 12:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 18 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 12:

TTGGAAGACC ATNGGYTC 18

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.= 13:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 17 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č..- 13:

ATTAACCCTC ACTAAAG 17

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 14:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 17 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 14:

AATACGACTC ACTATAG 17

148

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.= 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 11 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina CD) T OF’ C )L ÓG TA: T i n e; á r n a (11) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 15:

Val Phe Gin Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin 1 5 10

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 16:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 14 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLOGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 16:

Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gin Pro íle 1 5 10

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 17:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 12 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 17:

Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val íle Pro Gin Ala Glu 1 5 10

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 18:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 10 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 18=

Phe Gin Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa 15 10

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 19:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 14 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina

149

CD) TOPOLÓGIA; lineárna

(11)	TYP MOLEKULY: peptid
Cxi)	POPIS SEKVENCIE: SEK.	ID. č.	: 19:
Thr	Ser Pro Thr Phe íle Xaa Met	Ser Gin	Glu Asn Val Asp
1	5	10

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 20:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 17 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cli) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 20:

Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gin Thr Gly 15 10 15

Arg

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 21:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA·. lineárna

Cli) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 21:

Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala 1 5

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 22:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA; 7 aminokyselín C B) TYP·, aminokyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) T OP OL OGIA: 11neárna Cli) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 22:

Phe Gly Glu Gin Phe Ser Glu 1 5

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 23:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLOGIA: lineárna

150 (11) TYP MOLEKULY: DMA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 23:

RAANCCYTCY TGRAAACTYT C	21
C 2) INFORMÁCIE 0 SEK. ID. č.: 24: C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: C A) DĹŽKA: 1006 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET REŤAZCOV: j eden CD) TOPOĽOGIA : lineárne, Cii) TYP MOLEKULY: cDNA Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 24= TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCAAGAGGA TGGAGCTGGC TTTGGACAGA	60
GCGTGGCCCA GCTTGGCGGA TCTAGACTCG TGGTGGGAGC CCCCCTGGAG GTGGTGGCGG	120
TCAACCAAAC AGGAAGGTTG TATGACTGTG TGGCTGCCAC TGGCCTTGTC AACCCATACC	180
CCTGCACACA CCCCCAGATG CTGTGAACAT GTCCCTGGGT CTGTCCCTGT CAGCCGCCGC	240
CAGTCGCCCC TGGCTGCTGG CCTGTGGCCC AACCATGCAC AGAGCCTGTG GGGAGAATAT	300
GTATGCAGAA GGCTTTTGCC TCCTGTTGGA CTCCCATCTG CAGACCATTT GGACAGTACC	360
TGCTGCCCTA CCAGAGTGTC CAAGTČAAGA GATGGACATT GTCTTCCTGA TTGATGGTTC	420
TGGCAGTATG AGCAAAGTGA CTTTAAACAA ATGAAGGATT TGTGAGAGCT GTGATGGGAC	480
AGTTTGAGGG CACCCAAACC CTGTTCTCAC TGATACAGTA TCCCACCTCC CTGAAGATCC	540
ACTTCACCTT CACGCAATTC CAGAGCAGCT GGAACCCTCT GAGCCTGGTG GATCCCATTG	600
TCCAACTGGA CGGCCTGACA TATACAGCCA CGGGCATCCG GAAAGTGGTG GAGGAACTGT	660
TTCATAGTAA GAATGGGGCC CGTAAAAGTG CCAAGAAGAT CCTCATTGTC ATCACAGATG	720
GCAAAAATAC AAAGACCCCC TGGAGTACGA GGACGTATCC CCAGGCAGAG AGAGCGGATC	780
ATCCGCTATG CCATTGGGGT GGGAGATGCT TTCTGGAAAC CCAGTGCCAA GCAGGAGCTG	840
GACAACATTG GCTCAGAGCC GGCTCAGGAC CATGTGTTCA GGGTGGACAA CTTTGCAGCA	900
CTCAGCAGCA TCCAGGAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTTTG CACTCGAAGG AACCCAGTCG	960
ACGACAAGTA GCTCTTTCCA ACATGAGATG TTCCAAGAAG GGTTCA	1006

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. C.: 25 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 17 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden CD) TOPOLÓGIA: lineárna

151 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 25:

GTNTTYCARG ARGAYGG 17 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA:20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (11) TYP MOLEKULY: DMA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 26:

CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20 (2) INFORMÁCIE; O SEK. ID. Č.: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLOGIA: lineárna (11) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 27=

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 28:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (11) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 28:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 86 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (11) TYP MOLEKULY: DNA

152 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 29:

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2D párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. o.: 30:

TTGCTGACTG CCTGCAGTTC ²⁰ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 31:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3(3 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 31:

GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 32= (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden ( D ) T OF⁵ OL OGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 32:

ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT 36 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 37 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 33:

ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC

153

C 2) INFORMÁCIE O SEK. IO. č.: 34:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DLZKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina CC) POČET REŤAZCOV: jeden CO) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č,: 34:

TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.·. 35:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 24 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 35:

TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 36.·

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

	C A) DĹŽKA: 3528 párov báz C B) TYP.· nukleová kyselina CC) POČET REŤAZCOV: jeden
CD)	TOPOLOGIA:	lineárna
Cii)	TYP MOLEKULY: cDNA
C ix)	CHARAKTERISTICKÝ	ZNAK:
	C A)	NAZOV/KLUC:	CDS
	CB)	UMIESTENIE:	1..3456
C xi)	POPIS	SEKVENCIE:	SEK. ID. Č.: 36:

GGC TGG GCC Gly Trp Ala 1

CTG Leu

GCT TCC

TGT Cys

CAT GGG

TCT AAC CTG GAT GTG GAG GAA

4 S

Ala 5

Ser

His

Gly

Ser 10

Asn

Leu

Asp

Val

Glu 15

Glu

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

GGA

CAG

ACT

GTG

96

Pro

íle

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

20

25

30

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

144

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

35

40

45

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

GCA

CCT

GCC

ACT

GGC

192

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

Asp

Cys

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

5C

55

60

154

ATG Met 65

TGC CAG

CCC Pro

ATC GTA CTG CGC

AGT Ser

CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG

240

Cys

Gin

íle

Val 70

Leu Arg

Pro

Leu 75

Glu

Ala

Val

Asn

Met 80

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

288

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

85

90

95

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

AAG

AAC

ATG

TAT

GCG

336

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

100

105

110

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

384

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

115

120

125

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

432

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

130

135

140

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

480

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

145

150

155

160

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

528

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

165 170 175

ACC TTG TTC

TCC Ser 180

CTG Leu

ATG CAA TAC

TCG AAC ATC CTG AAG ACC CAT

TTT Phe

576

Thr

Leu

Phe

Met

Gin

Tyr

Ser 185

Asn

íle

Leu

Lys

Thr 190

His

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

624

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

íle

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

195

200

205

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

672

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

210

215

220

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

720

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

768

Ala

Lys

íle

Leu

Val

íle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

816

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

íle

260

265

270

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

864

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

275

280

285

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

CCA

CAG

GAC

CAC

GTG

912

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

290 295 300

TTC

AAG

GTA

GGC

AAC

TTT

GCA

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

AGG

CAA

CTT

960

Phe 305

Lys

Val

Gly

Asn

Phe 310

Ala

Leu

Arg

Ser 315

íle

Gin

Arg

Gin

Leu 320

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

TCA

AGG

TCA

AGT

1008

Gin

Glu

Lys

íle

Phe 325

Ala

íle

Glu

Gly

Thr 330

Gin

Ser

Arg

Ser

Ser 335

Ser

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

1056

Ser

Phe

Gin

His 340

Glu

Met

Ser

Gin

Glu 345

Gly

Phe

Ser

Ala 350

Leu

Thr

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GYG

GGA

AGC

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

1104

Ser

Asp

Gly 355

Pro

Val

Leu

Gly

Ala 360

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser 365

Trp

Ser

Gly

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

1152

Gly

Ala 370

Phe

Leu

Tyr

Pro

Pro 375

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr 380

Phe

íle

Asn

Met

TCT Ser 385

CAG GAG AAT

GTG GAC

ATG AGA GAC TCC TAC CTG GGT TAC TCC ACC

1200

Gin

Glu

Asn

Val

Asp 390

Met

Arg

Asp

Ser Tyr 395

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr 400

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

1248

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

GCC

AGG

1296

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

CAT

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

1344

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

1392

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

450

455

460

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

1440

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465

470

475

480

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TKC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

1488

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

485

490

495

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GRC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

1536

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Xaa

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

500

505

510

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

1584

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

AGC

AGA

GGT

GCT

GTC

1632

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

530 535 540

TAC ΑΤΑ

TTT Phe

CAT His

GGA Gly

GCC TCG

AGA Arg

CTG GAG ATC ATG CCC TCA CCC AGC

1680

Tyr 545

íle

Ala 550

Ser

Leu Glu

íle 555

Met

Pro Ser

Pro

Ser 560

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

1728

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

1776

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

585

590

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

1824

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

595

600

605

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

1872

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

íle

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

610

615

620

AAG Lys 625

GCT Ala

GTG Val

TAC Tyr

CAG Gin

TGC Cys 630

TGG GAA AGG ACT

CCC ACT GTC CTC GAA

GCT Ala 640

1920

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro 635

Thr

Val

Leu

Glu

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

1968

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTA

GAT

CCG

2016

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro .

660

665

670

GGC

CGC

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

2064

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Arg

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

2112

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

690

695

700

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

GTG

AGC

CCT

ATC

2160

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

íle

705

710

715

720

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

2208

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

725

730

735

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

2256

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

íle

Thr

Ala

Ser

740

745

750

CTG

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

2304

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

755

760

765

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GTG

GGA

2352

Leu

Gly

íle

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Gly

770

775

780

157

GGC Gly 785

TCC Ser

CCA GAG CTC ACT

GTG ACA GTC

ACT GTG

TGG Trp

AAT Asn

GAG Glu

GGT Gly

GAG Glu 800

2400

Pro

Glu

Leu Thr 790

Val

Thr

Val

Thr

Val 795

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

24 48

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

805

810

815

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

2496

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

820

825

830

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

GAC

CTG

AGG

AGC

2544

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

835

840

845

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCA

AAG

ACC

2592

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

850

855

860

TTC ATG ATC ACA

TTC Phe

GAT Asp 870

GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTA GGA GAC AGG

2640

Phe 865

Met

íle

Thr

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala 875

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg 880

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

2688

Leu

Arg

Ala 885

Lys

Ala

Ser

Glu 890

Asn

Lys

Pro

Asp 895

Thr

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

AAG

TAC

ACC

GTC

TAT

2736

Asn

Lys

Thr

Ala 900

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu 905

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr 910

Val

Tyr

ACC

CTG

ATC

AGT

AGG

CAA

GAA

GAT

TCC

ACC

AAC

CAT

GTC

AAC

TTT

TCA

2784

Thr

Leu

íle 915

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp 920

Ser

Thr

Asn

His

Val 925

Asn

Phe

Ser

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG

CAA

GAA

GCC

GCA

CAT

CGC

TAT

CGT

GTG

2832

Ser

Ser 930

His

Gly

Arg

Arg 935

Gin

Glu

Ala

His 940

Arg

Tyr

Arg

Val

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG

CTG

GCC

GTC

AGA

GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

2880

A.sn 945

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu 950

Lys

Leu

Ala

Val

Arg 955

Val

Asn

Phe

Trp

Val 960

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG

GCT

GTG

TGG

GAC

GTG

ACT

CTG

AGC

2923

Pro

Val

Leu

Asn 965

Gly

Val

Ala

Val

Trp 970

Asp

Val

Thr

Leu

Ser 975

Ser

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC

GTG

TCC

CAG

ATG

AAA

CCT

CAG

AAT

2976

Pro

Ala

Gin

Gly 980

Val

Ser

Cys

Val

Ser 985

Gin

Met

Lys

Pro

Pro 990

Gin

Asn

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT

CAG

AGA

CGT

TCT

GTG

CTG

GAC

TGC

TCC

3C24

Pro

Asp

Phe 995

Leu

Thr

Gin

íle

Gin Arg 1000

Arg

Ser

Val

Leu Asp 1005 .

Cys

Ser

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TCC

CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

GAC

ATC

3072

íle

Ala Asp 1010

Cys

Leu

His

Ser Arg Cys 1015

Asp

íle

Pro Ser 1020

Leu

Asp

íle

193

CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC CTC	AGC TTC GGC TGG	3120
Gin Asp 1025	Glu Leu	Asp	Phe íle Leu Arg Gly Asn Leu	Ser	Phe	Gly	Trp 1040
1030	1035
GTC AGT	CAG ACA	TTG	CAG GAA AAG GTG TTG	CTT GTG	AGT	GAG	GCT	GAA	3168
Val Ser	Gin Thr	Leu	Gin Glu Lys Val Leu	Leu Val	Ser	Glu	Ala	Glu
		1045	> 1050			1055
ATC ACT	TTC GAC	ACA	TCT GTG TAC TCC CAG	CTG CCA	GGA	CAG	GAG	GCA	3216
íle Thr	Phe Asp	Thr	Ser Val Tyr Ser Gin	Leu Pro	Gly	Gin	Glu	Ala
	1060	1065			1070
TTT CTG	AGA GCC	CAG	GTG GAG ACA ACG TTA	GAA GAA	TAC	GTG	GTC	TAT	3264
Phe Leu	Arg Ala	Gin	Val Glu Thr Thr Leu	Glu Glu	Tyr	Val	Val	Tyr
	1075		1080		1085
GAG CCC	ATC TTC	CTC	GTG GCG GGC AGC TCG	GTG GGA	GGT	CTG	CTG	TTA	3312
Glu Pro	íle Phe	Leu	Val Ala Gly Ser Ser	Val Gly	Gly	Leu	Leu	Leu
1090		1095	1100
CTG GCT	CTC ATC	ACA	GTG GTA CTG TAC AAG	CTT GGC	TYC	TYC	AAA	CGT	3360
Leu Ala	Leu íle	Thr	Val Val Leu Tyr Lys	Leu Gly	Xaa	Xaa	Lys	Arg
1105			1110	1115				1120
CAG TAC	AAA GAA	ATG	CTG GAC GGC AAG GCT	GCA GAT	CCT	GTC	ACA	GCC	3408
Gin Tyr	Lys Glu	Met	Leu Asp Gly Lys Ala	Ala Asp	Pro	Val	Thr	Ala
		1125 1130			1135
GGC CAG	GCA GAT	TTC	GGC TGT GAG ACT CCT	CCA TAT	CTC	GTG	AGC	TAGGAATCCA
3463
Gly Gin	Ala Asp	Phe	Gly Cys Glu Thr Pro	Pro Tyr	Leu	Val	Ser
	1140	1145			1150
CTCTCCTGCC TATCTCTGNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA TGAGTCTACT	GGCATGGGAA	3523
CGAGT									3528

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 1151 aminokyselín C EJ) TYP: am i n o k y s e 3. i n a CD) TOPOLÓGIA: lineárna

C íl) TYP MOLEKULY: proteín

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 37:

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala

Ser

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

1

5

10

15

Pro

íle

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

20

25

30

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

35

40

45

Ala Val Asn Gin Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly 50 55 60

159

Met 65

Cys

Gin

Pro

íle

Val 70

Leu Arg

Ser

Pro

Leu Glu Ala Val Asn Met

75

80

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

85

90

95

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

115

120

125

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

130

135

140.

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

145

150

155

160

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

180

185

190

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Asn

íle

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

195

200

205

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

210

215

220

Thr

Val

Met

Glu

Leu

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

225

230

235

240

Ala

Lys

íle

Leu

Val

íle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

245

250

255

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

íle

260 265 270

íle Arg Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly 280

Asp Ala

Phe Gin Glu Pro Thr Ala 285

275

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

290

295

300

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

305

310

315

320

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

íle

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

325

330

335

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Xaa

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

355

360

365

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

370

375

380

160

Ser Gin Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr 400

385

390

395

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

405

410

415

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

420

425

430

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

435

440

445

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

450

455

460

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

465.

470

475

480

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Xaa

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

485 490 495

Cys

Glu Ala

Thr 500

Leu

His Gly Glu Gin Xaa His 505

Pro

Trp

Gly 510

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

515

520

525

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

Ser

Árg

Gly

Ala

Val

530

535

540

Tyr

íle

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

íle

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

545

550

555

560

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

565

570

575

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

580

585

590

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

595

600

605

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

íle

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

610

615

620

Lys

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

625

630

635

640

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

645

650

655

Leu

Gly

Asn

Val

Gin

Gly

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

660

665

670

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Arg

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

675

680

685

Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val 690 695 700

161

Lys 705	Leu	Leu Leu Pro Asp Cys 710	Val Glu Asp Ala 715	Val	Ser	Pro	íle	íle 720
Leu	Arg	Leu Asn Phe Ser Leu	Val Arg Asp Ser	Ala	Ser	Pro	Arg	Asn
		725	730				735
Leu	His	Pro Val Leu Ala Val	Gly Ser Gin Asp	His	íle	Thr	Ala	Ser
		740	745			750
Leu	Pro	Phe Glu Lys Asn Cys	Lys Gin Glu Leu	Leu	Cys	Glu	Gly	Asp
		755	7 60		765
Leu	Gly	íle Ser Phe Asn Phe	Ser Gly Leu Gin	Val	Leu	Val	Val	Gly
	770	775		780
Gly	Ser	Pro Glu Leu Thr Val	Thr Val Thr Val	Trp	Asn	Glu	Gly	Glu
785		790	795					800
Asp	Ser	Tyr Gly Thr Leu Val	Lys Phe Tyr Tyr	Pro	Ala	Gly	Leu	Ser
		805	810				815
Tyr	Arg	Arg Val Thr Gly Thr	Gin Gin Pro His	Gin	Tyr	Pro	Leu	Arg
		820	825			830
Leu	Ala	Cys Glu Ala Glu Pro	Ala Ala Gin Glu	Asp	Leu	Arg	Ser	Ser
		835	840		845
Ser	Cys	Ser íle Asn His Pro	íle Phe Arg Glu	Gly	Ala	Lys	Thr	Thr
	850	855		860
Phe	Met	íle Thr Phe Asp Val	Ser Tyr Lys Ala	Phe	Leu	Gly	Asp	Arg
865		870	875					880
Leu	Leu	Leu Arg Ala Lys Ala	Ser Ser Glu Asn	Asn	Lys	Pro	Asp	Thr
		885	890				895
Asn	Lys	Thr Ala Phe Gin Leu	Glu Leu Pro Val	Lys	Tyr	Thr	Val	Tyr
		900	905			910
Thr	Leu	íle Ser Arg Gin Glu	Asp Ser Thr Asn	His	Val	Asn	Phe	Ser
		915	920		925
Ser	Ser	His Gly Gly Arg Arg	Gin Glu Ala Ala	His	Arg	Tyr	Arg	Val
	930	935		940
Asn	Asn	Leu Ser Pro Leu Lys	Leu Ala Val Arg	Val	Asn	Phe	Trp	Val
945		950	955					960
Pro	Val	Leu Leu Asn Gly Val	Ala Val Trp Asp	Val	Thr	Leu	Ser	Ser
		965	970				975
Pro	Ala	Gin Gly Val Ser Cys	Val Ser Gin Met	Lys	Pro	Pro	Gin	Asn
		980	985			990
Pro	Asp	Phe Leu Thr Gin íle	Gin Arg Arg Ser	Val	Leu	Asp	Cys	Ser
		995	1000		1005
íle	Ala	Asp Cys Leu His Ser	Árg Cys Asp íle	Pro	Ser	Leu	Asp	íle
	1010 1015	1020

162

Gin Asp 1025	Glu	Leu	Asp Phe íle Leu Arg Gly Asn Leu	Ser	Phe Gly Trp 1040
1030	1035
Val Ser	Gin	Thr	Leu Gin Glu Lys Val 1045	Leu Leu Val 1050	Ser	Glu Ala Glu 1055
íle Thr	Phe	Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gin Leu Pro 1060 1065	Gly	Gin Glu Ala 1070 .
Phe Leu	Arg Ala 1075	Gin Val Glu Thr Thr 1080	Leu Glu Glu	Tyr Val Val Tyr 1085
Glu Pro íle 1090	Phe	Leu Val Ala Gly Ser 1095	Ser Val Gly Gly 1100	Leu Leu Leu
Leu Ala 1105	Leu	íle	Thr Val Val Leu Tyr 1110	Lys Leu Gly 1115	Xaa	Xaa Lys Arg 1120
Gin Tyr	Lys	Glu	Met Leu Asp Gly Lys 1125	Ala Ala Asp 1130	Pro	Val Thr Ala 1135
Gly Gin	Ala	Asp	Phe Gly Cys Glu Thr	Pro Pro Tyr	Leu	Val Ser

1140 1145 1150

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 38 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA; 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.= 38=

GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č,= 39:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 23 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 39=

GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.= 40 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 18 párov báz C B ) TYP: n u l< 1 e o v á l< y s e 1 i n a

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

163 (11) TYP MOLEKULY; DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.= 40:

TGTAAAACGA CGGCCAGT ₁₈ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.= 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 41:

GGAAACAGCT ATGACCATG 19 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 42= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. £.= 42:

GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 43= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV.- jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 43:

GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG 25 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č. ·. 44:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 38 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden ( D ) T OP OL ÓCIA : 1 i n e á r n a (11) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 44:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG

164 ¢2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 3519 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) T OP OLOGIA: 1ine árna

C11) TYP MOLEKULY: cDNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) NÁZOV/KLÚČ: CDS C B) UMIESTENIE: 5..3519

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 45:

GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC 57

Met Val

CGT GGA GTT Arg Gly Val

GTG ATC CTC

CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT

TCC Ser

TGT Cys

CAT His

105

Val

íle

Leu

Leu Cys 10

Gly Trp

Ala

Leu

Ala 15

5

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

GAT

GCA

153

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

Asp

Ala

20

25

30

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

201

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

50

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CAG

TCG

249

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Gin

Ser

55

60

65

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

GCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

CTG

CAC

297

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

íle

Leu

His

70

75

80

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

GCT

345

íle

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

85

90

95

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

393

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

100

105

110

GCT

TGT

GCA

AAG

AAC

ATG

TAT

GCA

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTG

GGC

441

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

130

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

GAG

TGT

43 5

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

íle

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

Glu

Cys

135

140

145

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

GGC

AGC

537

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

150 155 160

165

ATT íle

GAT CAA AGT

GAC Asp

TTT Phe

ACC CAG ATG

AAG Lys

GAC Asp

TTC Phe

GTC Val 175

AAA Lys

GCT Ala

TTG Leu

Asp

Gin 165

Ser

Thr Gin 170

Met

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

AGC

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

Ser

195

200

205

210

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

GGC

CTG

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

íle

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

215

220

225

ACG

TAC

ACA

GCC

TCG

GGC

ATC

CAG

AAA

GTG

AAA

GAG

CTA

TTT

CAT

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

íle

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

Phe

His

230

235

240

AGC

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATA

CŤA

ATT

GTC

ATC

Ser

Lys

Asn 245

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser 250

Ala

Lys

íle

Leu 255

íle

Val

íle

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TTC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGA

CAT

GTC

ATC

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

Val

íle

260 265 270

CCT Pro 275

GAA GCA Glu Ala

GAG AAA GCT

GGG ATC

ATT íle

CGC Arg

TAT GCT Tyr Ala 285

ATA GGG GTG GGA

Glu Lys

Ala 280

Gly

íle

Gly

Val

Gly 290

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Gly

295

300

305

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

GTA

GCA

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

310

315

320

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

ATT

GAA

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

íle

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

íle

Glu

325

330

335

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Seŕ

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGT

TTC

AGC

TCA

GCT

CTC

TCA

ATG

GAT

GGA

CCA

GTT

CTG

GGG

GCT

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

355

360

365

370

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

TCA

AAT

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Ser

Asn

375

380

385

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

ATG

AGG

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

Met

Arg

390 395 400

585

633

681

729

777

825

873

921

969

1017

1065

1113

1161

1205

1257

166

GAC Asp

GCT Ala

TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT

TGG Trp 415

AAG GGG

GTC Val

1305

Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Lys

Gly

405

410

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

1353

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

420

425

430

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

TCC

AGG

CAC

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

GAA

GTC

1401

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

Glu

Val

435

440

445

450

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTT

GGG

GCA

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

1449

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

455

460

465

GAC

ATG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACT

GAC

CTG

GTC

CTG

ATT

GGA

GTC

CCC

1497

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Val

Pro

470

475

480

CAT TAC TAT GAG CAC

ACC CGA GGG GGG

CAG GTG TCG GTG TGC CCC ATG

1545

His

Tyr Tyr 485

Glu

His

Thr Arg Gly 490

Gly

Gin

Val

Ser

Val 495

Cys

Pro

Met

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

GGG

GAG

1593

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

Gly

Glu

500

505

510

CAG

GGC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTA

GGG

1641

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

530

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

CCC

GGA

1689

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

535

540

545

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

TCG

AGA

1737

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

íle

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Arg

550

555

560

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

1785

Gin

Asp

íle

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Leu

565

570

575

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1833

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

1881

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

Gly

His

595

600

605

610

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

TCC

ATT

1929

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

íle

Ser

íle

615

620

625

AGA

TTT

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GGA

1977

Arg

Phe

Ala

Pro

Ser

Glu

Val

Ala

Lys

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys

Trp

Gly

630 635 640

167

AGG Arg

ACT CCC

ACT Thr

GTC Val

CTC Leu

GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT

CTC ACT Leu Thr

2025

Thr

Pro 645

Glu Ala 650

Gly

Glu

Ala Thr

Val 655

Cys

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

TCT

GTC

2073

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

Val

660

665

670

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

GCC

ATT

2121

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Arg

Ala

íle

675

680

685

690

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

2169

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

695

700

705

CTT

GGT

GAT

CAC

TGC

GAA

ACA

ATG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAC

TGT

GTG

2217

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

710

715

720

GAG GAT Glu Asp

GCA Ala 725

GTG Val

ACC Thr

CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC CTG GCA

2265

Pro

íle

íle 730

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu 735

Ser

Leu

Ala

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

2313

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

740

745

750

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

TGT

GAG

2361

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Glu

755

760

765

770

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

2409

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

775

780

785

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

2457

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

790

795

800

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

2505

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

íle

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

805

810

815

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

GCC

CAG

CAA

CCT

CAT

CCG

TAC

CCA

2553

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

Tyr

Pro

820

825

830

CTA

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

2601

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

835

840

845

850

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

2649

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

855

860

865

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

2697

Ala

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

870

875

880

168

GAC AGG

TTG CTT

CTG AGG

GCC AGC

GCA Ala

AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT

2745

Asp

Arg

Leu 885

Leu

Arg

Ala

Ser 890

Ser

Glu

Asn 895

Asn

Lys

Pro

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

2793

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

900

905

910

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

2841

Val

Tyr

Thr

Val

íle

Ser

Arg

Gin

Glu

Asp

Ser

Thr

Lys

His

Phe

Asn

915

920

925

930

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

CAG

AAA

GAG

GCC

GAA

CAT

CGA

TAT

2889

Phe

Ser

His

Gly

Glu

Arg

Gin

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

935

940

945

CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

TTG

ACG

CTG

GCC

ATC

AGC

GTT

AAC

TTC

2937

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

Thr

Leu

Ala

íle

Ser

Val

Asn

Phe

950

955

960

TGG Trp

GTC Val

CCC Pro 965

ATC íle

CTT Leu

CTG Leu

AAT Asn

GGT Gly 970

GTG GCC GTG TGG

GAT Asp 975

GTG Val

ACT Thr

CTG Leu

2985

Val Ala

Val

Trp

AGG

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGT GTG

TCA

CAG

AGG

GAA

CCT

3033

Arg

Ser 980

Pro

Ala

Gin

Gly

Val 985

Ser

Cys Val

Ser

Gin 990

Arg

Glu

Pro

CAA

CAT

TCC

GAC

CTT

CTG

ACC

CAG

ATC CAA

GGA

CGC

TCT

GTG

CTG

GAC '

3081

Gin 995

His

Ser

Asp

Leu

Leu Thr 1000

Gin

íle Gin

Gly Arg 1005

Ser

Val

Leu

Asp 1010

TGC

GCC

ATC

GCC

GAC

TGC

CTG

CAC

CTC CGC

TGT

GAC

ATC

CCC

TCC

TTG

3129

Cys

Ala

íle

Ala

Asp Cys 1015

Leu

His

Leu Arg Cys 1020

Asp

íle

Pro

Ser Leu 1025

GGC

ACC

CTG

GAT

GAG

CTT

GAC

TTC

ATT CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

3177

Gly

Thr

Leu

Asp Glu 1030

Leu

Asp

Phe

íle Leu 1035

Lys

Gly

Asn

Leu Ser 1040

Phe

GGC

TGG

ATC

AGT

CAG

ACA

TTG

CAG

AAA AAG

GTG

TTG

CTC

CTG

AGT

GAG

3225

Gly

Trp

íle Ser 1045

Gin

Thr

Leu

Gin Lys Lys 1050

Val

Leu

Leu Leu 1055

Ser

Glu

GCT

GAA

ATC

ACA

TTC

AAC

ACA

TCT

GTG TAT

TCC

CAG

CTG

CCG

GGA

CAG

3273

Ala

Glu íle 1060

Thr

Phe

Asn

Thr Ser 1065

Val Tyr

Ser

Gin Leu 1070

Pro

Gly

Gin

GAG

GCA

TTT

CTG

AGA

GCC

CAG

GTG

TCA ACG

ATG

CTA

GAA

TAC

GTG

3321

Glu Ala 1075

Phe

Leu

Arg

Ala Gin 1080

Val

Ser Thr

Met Leu 1085

Glu

Tyr

Val 1090

GTC

TAT

GAG

CCC

GTC

TTC

CTC

ATG

GTG TTC

AGC

TCA

GTG

GGA

GGT

CTG

3369

Val

Tyr

Glu

Pro

Val Phe 1095

Leu

Met

Val Phe Ser 1100

Ser

Val

Gly

Gly Leu 1105

CTG

TTA

CTG

GCT

CTC

ATC

ACT

GTG

GCG CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

3417

Leu

Ala Leu 1110

íle

Thr

Val

Ala Leu 1115

Tyr

Lys

Leu

Gly Phe 1120

Phe

169

AAA Lys	CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG GAT CTA CCA Arg Gin Tyr Lys Glu Met Leu Asp Leu Pro	TCT Ser	GCA GAT CCT GAC Ala Asp Pro Asp 1135
1125	1130
CCA	GCC GGC CAG	GCA GAT TCC AAC CAT GAG ACT	CCT	CCA CAT CTC ACG
Pro	Ala Gly Gin	Ala Asp Ser Asn His Glu Thr	Pro	Pro His Leu Thr
	1140	1145	1150
TCC	TAG
Ser
1155
(2)	INFORMÁCIE	: 0 SEK. ID. Č . : 46:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
	C A)	DLZKA: 1151 aminokyselín
	CB)	TYP: aminokyselina
	CD)	TOPOLÓGIA: lineárna

3465

3513

3519 (ii) TYP MOLEKULY: proteín

(xi) POPIS

; SEKVENCIE

: SEK.

ITJ.

č.

: 46 :

Met

Val

Arg

Gly

Val

íle

Leu

Cys

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

35

40

45

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

Gin

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

íle

Leu

65

70

75

80

Leu

His

íle

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

íle

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

130

135

140

Glu

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

Gly

Ser

íle

Asp

Gin

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

Ala

Leu

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

1.7 Ο

Gin Tyr

Ser 195

Asn

íle

Leu Lys Thr 200

His

Phe Thr

Phe

Thr 205

Glu

Phe

Lys

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

íle

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

íle

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

245

250

255

Val

íle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

Val

íle

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

275

280

285

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

íle

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

325

330

335

íle

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355 360 365

Gly Ala

Val

Gly

Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

Met

Arg

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

Gly

Val

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

465

470

475

480

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His 500 505 510

171

Gly

Glu

Gin 515

Gly

His

Pro

Trp

Gly 520

Arg

Phe

Gly

Ala

Ala 525

Leu

Thr

Val

Leu

Gly 530

Asp

Val

Asn

Gly

Asp 535

Ser

Leu

Ala

Asp

Val 540

Ala

íle

Gly

Ala

Pro 545

Gly

Glu

Asn 550

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr 555

íle

Phe

His

Gly

Ala 560

Ser

Arg

Gin

Asp

íle 565

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser 570

Gin

Arg

Val

Thr

Gly 575

Ser

Gin

Leu

Phe

Leu 580

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe 585

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser 590

Gly

Gin

Asp

Leu 595

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu 600

Val

Asp

Leu

Ala

Val 605

Gly

Ala

Gin

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

íle

610 615 620

Ser 625

íle

Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gin Cys

630

635

640

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

Arg

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asp

Val

Gin

Ser

660

665

670

Ser

Val

Arg

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

íle

Ser

Arg

675

680

685

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Met

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

Leu

Ala

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

770

775

780

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

785

790

795

800

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

íle

Lys

Phe

Tyr

Pro

805

810

815

Ala

Glu

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Gin

Pro

His

Pro

820

825

830

172

Tyr	Pro	Leu 835	Arg	Leu Ala Cys	Glu Ala 840	Glu Pro Thr Gly 845	Gin	Glu	Ser
Leu	Arg 850	Ser	Ser	Ser Cys Ser 855	íle Asn	His Pro íle Phe 860	Arg	Glu	Gly
Ala 865	Lys	Ala	Thr	Phe Met íle 870	Thr Phe	Asp Val Ser Tyr 875	Lys	Ala	Phe 880
Leu	Gly	Asp	Arg	Leu Leu Leu 885	Arg Ala	Ser Ala Ser Ser 890	Glu	Asn 895	Asn
Lys	Pro	Glu	Thr 900	Ser Lys Thr	Ala Phe 905	Gin Leu Glu Leu	Pro 910	Val	Lys
Tyr	Thr	Val 915	Tyr	Thr Val íle	Ser Arg 920	Gin Glu Asp Ser 925	Thr	Lys	His
Phe	Asn 930	Phe	Ser	Ser Ser His 935	Gly Glu	Arg Gin Lys Glu 940	Ala	Glu	His
Arg 945	Tyr	Arg	Val	Asn Asn Leu 950	Ser Pro	Leu Thr Leu Ala 955	íle	Ser	Val 960
Asn	Phe	Trp	Val	Pro íle Leu 965	Leu Asn	Gly Val Ala Val 970	Trp	Asp 975	Val
Thr	Leu	Arg	Ser 980	Pro Ala Gin	Gly Val 985	Ser Cys Val Ser	Gin 990	Arg	Glu
Pro	Pro	Gin 995	His	Ser Asp Leu	Leu Thr 1000	Gin íle Gin Gly Arg 1005	Ser	Val
Leu	Asp Cys 1010	Ala	íle Ala Asp Cys Leu 1015	His Leu Arg Cys 1020	Asp	íle	Pro
Ser Leu 1025	Gly	Thr	Leu Asp Glu 1030	Leu Asp	Phe íle Leu Lys 1035	Gly	Asn	Leu 1040
Ser	Phe	Gly	Trp	íle Ser Gin 1045	Thr Leu	Gin Lys Lys Val 1050	Leu	Leu Leu 1055
Ser	Glu	Ala	Glu íle Thr Phe 1060	Asn Thr Ser Val Tyr Ser . 1065	Gin Leu 1070	Pro
Gly	Gin	Glu Als 1075	Phe Leu Arg	Ala Gin 1080	Val Ser Thr Met Leu 1085	Glu	Glu
Tyr	Val Val 1090	Tyr	Glu Pro Val Phe Leu 1095	Met Val Phe Ser 1100	Ser	Val	Gly
Gly Leu 1105	Leu	Leu	Leu Ala Leu 1110	íle Thr	Val Ala Leu Tyr 1115	Lys	Leu	Gly 1120

Phe Phe Lys Arg Gin Tyr Lys Glu Met Leu Asd Leu Pro Ser Ala Asp 1125 1130 * 1135

173

Pro Asp Pro Ala Gly Gin Ala Asp Ser Ásn His GÍu Thr Pro Pro His 1140 1145 1150

Leu Thr Ser 1155

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 47:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 49 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET REŤAZCOV = .jeden CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 47:

AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG 49

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 48:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 19 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 48:

GCTGGACGAT GGCATCCAC 19

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 49:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 24 párov báz C B) TYP·, nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOĽ ÓGIA: 1ineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 49:

GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 50:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE·. SEK. ID. č.: 50:

GCAGCCAGCT TCGGACAGAC

174 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz CEO TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: .jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi.) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 51:

CCATGTCCAC AGAACAGAGA G

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 52:

C i.) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DL.Ž.KA: 3803 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV-, jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: cDNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) MÁZOV/KLÚČ: CDS C B) UMIESTENIE: 1..3486

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 52:

ATG Met 1

GTC Val

CGT GGA

GTT GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT TCC

48

Arg

Gly

Val Val 5

íle

Leu

Cys 10

Gly

Trp

Ala

Leu

Ala 15

Ser

TGT

CAT

GGG

TCT

AAC

CTG

GAT

GTG

GAG

AAG

CCC

GTC

GTG

TTC

AAA

GAG

96

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Lys

Pro

Val

Phe

Lys

Glu

20

25

30

GAT

GCA

GCC

AGC

TTC

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

14 4

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

35

40

45

CTC

GTG

GGA

GCC

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

192

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

CAG

TCG

TCT

GAC

TGT

CCG

CCT

GCC

ACT

GGC

GTG

TGC

CAG

CCC

ATC

TTA

240

Gin

Ser

Asp

Cys

Pro

Ala

Thr

Gly

Val

Cys

Gin

Pro

íle

Leu

65

70

75

80

CTG

CAC

ATT

CCC

CTA

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

283

Leu

His

íle

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

GTG

GCT

GAC

ACC

AAT

AAC

TCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

335

Val

Ala

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

175

CAG Gin

AGA GCT

TGT Cys

GCA AAG AAC ATG

TAT GCA AAA GGT

TCC TGC CTC CTT

384

Arg

Ala 115

Ala

Lys

Asn Met 120

Tyr Ala

Lys

Gly

Ser 125

Cys

Leu

CTG

GGC

TCC

AGC

TTG

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

ATC

CCT

GCT

ACC

ATG

CCA

432

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

íle

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

130

135

140

GAG

TGT

CCA

GGA

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGC

TCC

480

Glu

Cys

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

GGC

AGC

ATT

GAT

CAA

AGT

GAC

TTT

ACC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTC

GTC

AAA

528

Gly

Ser

íle

Asp

Gin

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

GCT

TTG

ATG

GGC

CAG

TTG

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TCG

TTC

TCC

CTG

ATG

576

Ala

Leu

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

CAA

TAC

TCA

AAC

ATC

CTG

AAG

ACT

CAT

TTT

ACC

TTC

ACG

GAA

TTC

AAG

624

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

AGC

CTG

AGC

CCT

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

GCC

ATC

GTC

CAG

CTC

CAA

672

Ser

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

íle

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

GGC CTG

ACG TAC Thr Tyr

ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG

CTA Leu 240

720

Gly 225

Leu

Thr

Ala 230

Ser Gly íle Gin

Lys 235

Val

Lys

Glu

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATA

CTA

ATT

768

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

245

250

255

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAA

TTC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGA

CAT

816

Val

íle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

GTC

ATC

CCT

GAA

GCA

GAG

AAA

GCT

GGG

ATC

ATT

CGC

TAT

GCT

ATA

GGG

864

Val

íle

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

275

280

285

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

CGG

GAA

CCC

ACT

GCC

CTA

CAG

GAG

CTG

AAC

ACC

912

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

ATT-

GGC

TCA

GCT

CCC

TCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GGC

AAT

TTT

960

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

GTA

GCA

CTT

CGC

AGC

ATC

CAG

CGG

CAA

ATT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTT

GCC

1003

Val

Ala

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

íle

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

325

330

335

ATT

GAA

GGA

ACC

GAA

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

1056

íle

Glu

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340 345 350

176

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

AGC

TCA

GCT

CTC

TCA

ATG

GAT

GGA

CCA

GTT

CTG

1104

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

GGG

GCT

GTG

GGA

GGC

TTC

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

TTG

TAC

CCC

1152

Gly

Ala

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

370

375

380

TCA

AAT

ATG

AGA

TCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAC

GAG

GAT

1200

Ser

Asn

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

385

390

395

400

ATG

AGG

GAC

GCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

CTG

GCC

TTT

TGG

AAG

1248

Met

Arg

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

GGG

GTC

CAC

AGC

CTG

ATC

CTG

GGG

GCC

CCT

CGC

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

1296

Gly

Val

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

ACC

CAG

GAA

TCC

AGG

CAC

TGG

AGG

CCC

AAG

TCT

1344

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ser

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

GAA

GTC

AGA

GGG

ACA

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTT

GGG

GCA

TCT

CTC

TGT

1392

Glu

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

TCT

GTG

GAC

ATG

GAT

AGA

GAT

GGC

AGC

ACT

GAC

CTG

GTC

CTG

ATT

GGA

1440

Ser

Val

Asp

Met

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

465

470

475

480

GTC

CCC

CAT

TAC

TAT

GAG

CAC

ACC

CGA

GGG

CAG

GTG

TCG

GTG

TGC

1488

Val

Pro

His

Tyr

Glu

His

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

485

490

495

CCC

ATG

CCT

GGT

GTG

AGG

AGC

AGG

TGG

CAT

TGT

GGG

ACC

CTC

CAT

1536

Pro

Met

Pro

Gly

Val

Arg

Ser

Arg

Trp

His

Cys

Gly

Thr

Leu

His

500

505

510

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCG

GCT

CTG

ACA

GTG

1584

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

CTA

GGG

GAC

GTG

AAT

GGG

GAC

AGT

CTG

GCG

GAT

GTG

GCT

ATT

GGT

GCA

1632

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

530

535

540

CCC

GGA

GAG

AAC

AGA

GGT

GCT

GTC

TAC

ATA

TTT

CAT

GGA

GCC

1653

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

íle

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

TCG

AGA

CAG

GAC

ATC

GCT

CCC

TCG

CCT

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

1725

Ser

Arg

Gin

Asp

íle

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

CAG

CTC

TTC

CTG

AGG

CTC

CAA

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTA

AGT

GGG

GGT

177 ó

Gin

Leu

Phe

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580 585 590

177

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

Gin

Asp

Leu 595

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu 600

Val

Asp

Leu

Ala

Val 605

Gly

Ala

Gin

GGG

CAC

GTG

CTG

CTT

AGG

AGT

CTG

CCT

TTG

CTG

AAA

GTG

GGG

ATC

Gly

His 610

Val

Leu

Arg 615

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu 620

Lys

Val

Gly

íle

TCC

ATT

AGA

TTT

GCC

CCC

TCA

GAG

GTG

GCA

AAG

ACT

GTG

TAC

CAG

TGC

Ser 625

íle

Arg

Phe

Ala

Pro 630

Ser

Glu

Val

Ala

Lys 635

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys 640

TGG

GGA

AGG

ACT

CCC

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACC

GTC

TGT

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro 645

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

CTC

ACT

GTC

CGC

AAA

GGT

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

GAT

GTC

CAA

AGC

Leu

Thr

Val

Arg 660

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asp

Val 670

Gin

Ser

TCT

GTC

AGG

TAT

GAT

CTG

GCG

TTG

GAT

CCG

GGC

CGT

CTG

ATT

TCT

CGT

Ser

Val

Arg 675

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu 680

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu 685

íle

Ser

Arg

GCC

ATT

TTT

GAT

GAG

ACG

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACC

CGA

AGG

AAG

ACT

Ala

íle 690

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Arg

Lys

Thr

CTG GGG

CTT Leu

GGT Gly

GAT Asp

CAC TGC

GAA ACA ATG AAG CTG CTT

TTG Leu

CCA Pro

GAC Asp 720

Leu 705

Gly

His 710

Cys

Glu Thr

Met

Lys 715

Leu

TGT

GTG

GAG

GAT

GCA

GTG

ACC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTT

AAC

TTA

TCC

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Leu

Ser

725

730

735

CTG

GCA

GGG

GAC

TCT

GCT

CCA

TCC

AGG

AAC

CTT

CGT

CCT

GTG

CTG

GCT

Leu

Ala

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

CAT

GTA

ACA

GCT

TCT

TTC

CCG

TTT

GAG

AAG

AAC

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Val

Thr

Ala

Ser

Phe

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

TGT

AAG

CAG

GAG

CTC

CTG

TGT

GAG

GGG

AAC

CTG

GGC

GTC

AGC

TTC

AAC

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asn

Leu

Gly

Val

Ser

Phe

Asn

770

775

780

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

GTC

TTG

GAG

GTA

GGA

AGC

TCC

CCA

GAG

CTC

ACT

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Glu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

GTG

ACA

GTA

ACA

GTT

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACC

TTA

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

ATC

AAG

TTC

TAC

CCA

GCA

GAG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTG

ACA

AGA

íle

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Glu

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Arg

820 825 830

1824

1872

1920

1968

2016

2064

2112

2160

2208

2256

2304

2352

2400

4 S

2496

178

GCC CAG Ala Gin

CAA Gin 835

CCT Pro

CAT His

CCG TAC CCA CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG

2544

Pro Tyr

Pro Leu 840

Arg

Leu

Ala

Cys 845

Glu

Ala

Glu

CCC

ACG

GGC

CAG

GAG

AGC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATC

AAT

CAC

2592

Pro

Thr

Gly

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

850

855

860

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

GGT

GCC

AAG

GCC

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTT

GAT

2640

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Ala

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

TTC

CTG

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AGC

2688

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Ser

885

890

895

GCA

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GAA

ACC

AGC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

2736

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Glu

Thr

Ser

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

CTG

GAG

CTT

CCG

GTG

AAG

TAC

ACG

GTC

TAT

ACC

GTG

ATC

AGT

AGG

CAG

2784

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Val

íle

Ser

Arg

Gin

915

920

925

GAA

GAT

TCT

ACC

AAG

CAT

TTC

AAC

TTC

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

GAG

AGA

2832

Glu

Asp

Ser

Thr

Lys

His

Phe

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Glu

Arg

930

935

940

CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG

2880

Gin Lys 945

Glu Ala

Glu His 950

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn 955

Asn Leu

Ser

Pro

Leu 960

ACG CTG

GCC ATC

AGC GTT

AAC

TTC

TGG

GTC

CCC

ATC CTT

CTG

AAT

GGT

2928

Thr Leu

Ala íle

Ser Val 965

Asn

Phe

Trp

Val 970

Pro

íle Leu

Leu

Asn 975

Gly

GTG GCC

GTG TGG

GAT GTG

ACT

CTG

AGG

AGC

CCA

GCA CAG

GGT

GTC

TCC

2976

Val Ala

Val Trp 980

Asp Val

Thr

Leu

Arg 985

Ser

Pro

Ala Gin

Gly 990

Val

Ser

TGT GTG

TCA CAG

AGG GAA

CCT

CAA

CAT

TCC

GAC CTT

CTG

ACC

CAG

3024

Cys Val

Ser Gin 995

Arg Glu

Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp Leu Leu 1005

Thr

Gin

ATC CAA

GGA CGC

TCT GTG

CTG

GAC

TGC

GCC

ATC

GCC GAC

TGC

ČTG

CAC

3072

íle Gin Gly Arg 1010

Ser Val

Leu Asp 1015

Cys

Ala

íle

Ala Asp 1020

Cys

Leu

His

CTC CGC

TGT GAC

ATC CCC

TCC

TTG

GGC

ACC

CTG

GAT GAG

CTT

C-AC

TTC

3120

Leu Arg 1025

Cys Asp

íle Pro Ser 1030

Leu

Gly

Thr

Leu Asp Glu 1035

Leu

Asp

Phe 1040

ATT CTG

AAG GGC

AAC CTC

AGC

TTC

GGC

TGG

ATC

AGT CAG

ACA

TTG

CAG

3168

íle Leu

Lys Gly

Asn Leu 1045

Ser

Phe

Gly

Trp íle 1050

Ser Gin

Thr

Leu Gin 1055

AAA AAG

GTG TTG

CTC CTG

AGT

GAG

GCT

GAA

ATC

ACA TTC

AAC

ACA

TCT

3216

Lys Lys

Val Leu Leu Leu 1060

Ser

Glu

Ala Glu 1065

íle

Thr Phe

Asn Thr 1070

Ser

179

GTG TAT

TCC CAG CTG

CCG Pro

GGA Gly

CAG GAG GCA TTT

CTG AGA GCC

CAG Gin

GTG Val

3264

Val

Tyr

Ser Gin 1075

Leu

Gin Glu 1080

Ala

Phe

Leu

Arg Ala 1085

TCA

ACG

ATG CTA

GAA

TAC

GTG GTC

TAT

GAG

CCC

GTC TTC

CTC

ATG

3312

Ser

Thr

Met Leu

Glu

Tyr

Val Val

Tyr

Glu

Pro

Val Phe

Leu

Met

1090

1095

1100

GTG

TTC

AGC TCA

GTG

GGA

GGT

CTG CTG

TTA

CTG

GCT

CTC ATC

ACT

GTG

3360

Val

Phe

Ser Ser

Val

Gly

Leu Leu

Leu

Ala

Leu íle

Thr

Val

1105

1110

1115

1120

GCG

CTG

TAC AAG

CTT

GGC

TTC

TTC AAA

CGT

CAG

TAT

AAA GAG

ATG

CTG

3408

Ala

Leu

Tyr Lys

Leu

Gly

Phe

Phe Lys

Arg

Gin

Tyr

Lys Glu

Met

Leu

1125

1130

1135

GAT

CTA

CCA TCT

GCA

GAT

CCT

GAC CCA

GCC

GGC

CAG

GCA GAT

TCC

AAC

3456

Asp

Leu

Pro Ser

Ala

Asp

Pro

Asp Pro

Ala

Gly

Gin

Ala Asp

Ser

Asn

1140

1145

1150

CAT

GAG

ACT CCT

CCA

CAT

CTC

ACG TCC

TAGGAATCTA CTTTCCTGTA

3503

His

Glu

Thr Pro

Pro

His

Leu

Thr Ser

1155

1160

TATCTCCACA ATTACGAGAT TGGTTTTGCT TTTGCCTATG AATCTACTGG CATGGGAACA 3563

AGTTCTCTTC AGCTCTGGGC TAGCCTGGGA AACTTCCCAG AAATGATGCC CTACCTCCTG 3623

AGCTGGGAGA TTTTTATGGT TTGCCCATGT GTCAGATTTC AGTGCTGATC CACTTTTTTT 3683

GCAAGAGCAG GAATGGGGTC AGCATAAATT TACATATGGA TAAGAACTAA CACAAGACTG 3743

AGTAATATGC TCAATATTCA ATGTATTGCT TGTATAAATT TTTAAAAAAT AAAATGAAAN 3803

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 53·.

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

			C A)	DLZKA	: 1161 aminoky	selín
	C B) TYP-, aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY-, protein Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID.	Č.: 53:
Met 1	Val	Arg	Gly	Val Val 5	íle Leu Leu Cys 10	Gly Trp	Ala	Leu	Ala 15	Ser
Cys	His	Gly	Ser 20	Asn Leu	Asp Val Glu Lys 25	Pro Val	Val	Phe 30	Lys	Glu
Asp	Ala	Ala 35	Ser	Phe Gly	Gin Thr Val Val 40	Gin Phe	Gly 45	Gly	Ser	Arg
Leu	Val 50	Val	Gly	Ala Pro	Leu Glu Ala Val 55	Ala Val 60	Asn	Gin	Thr	Gly
Gin 65	Ser	Ser	Asp	Cys Pro 70	Pro Ala Thr Gly	Val Cys 75	Gin	Pro	íle	Leu 80

180

Leu	His
Val	Ala
Gin	Arg
Leu	Gly 130
Glu 145	Cys
Gly	Ser
Ala	Leu
Gin	Tyr
Ser	Ser 210
Gly 225	Leu

Phe

Val

Val íle

305

Val íle

Ser

Gly

Ser

385

His íle íle

Gly

290

Gly

Ala

Glu

Gin

Ala

370

Asn

íle

Pro

Leu 85

Glu

Ala Val Asn Met 90

Ser

Leu Gly

Leu

Ser 95

Leu

Asp

Thr

Asn

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Ala

Cys

Ala

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

íle

Pro

Ala

Thr

Met

Pro

135

140

Pro

Gly

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

150

155

160

íle

Asp

Gin

Ser

Asp

Phe

Thr

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

165

170

175

Met

Gly

Gin

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

Leu

Ser

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Ala

íle

Val

Gin

Leu

Gin

215

220

Thr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Gly

íle

Gin

Lys

Val

Lys

Glu

Leu

230

235

240

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

245

250

255

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Phe

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Arg

His

260

265

270

Pro

Glu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

275

280

285

Asp

Ala

Phe

Arg

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

295

300

Ser

Ala

Pro

Ser

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

310

315

320

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

íle

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

325

330

335

Gly

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Ser

Ala

Leu

Ser

Met

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

355

360

365

Val

Gly

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

375

380

Met

Arg

Ser

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Glu

Asp

390

395

400

181

Met

Arg

Asp

Ala

Tyr 405

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr 410

Ala

Leu

Ala

Phe

Trp 415

Lys

Gly

Val

His

Ser 420

Leu

íle

Leu

Gly

Ala 425

Pro

Arg

His

Gin

His 430

Thr

Gly

Lys

Val

Val 435

íle

Phe

Thr

Gin

Glu 440

Ser

Arg

His

Trp

Arg 445

Pro

Lys

Ser

Glu

Val 450

Arg

Gly

Thr

Gin

íle 455

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly 460

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser 465

Val

Asp

Met

Asp

Arg 470

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp 475

Leu

Val

Leu

íle

Gly 480

Val

Pro

His

Tyr

Tyr 485

Glu

His

Thr

Arg

Gly 490

Gly

Gin

Val

Ser

Val 495

Cys

Pro

Met

Pro

Gly 500

Val

Arg

Ser

Arg

Trp 505

His

Cys

Gly

Thr

Thr 510

Leu

His

Gly

Glu

Gin 515

Gly

His

Pro

Trp

Gly 520

Arg

Phe

Gly

Ala

Ala 525

Leu

Thr

Val

Leu

Gly 530

Asp

Val

Asn

Gly

Asp 535

Ser

Leu

Ala

Asp

Val 540

Ala

íle

Gly

Ala

Pro 545

Gly

Glu

Asn 550

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr 555

íle

Phe

His

Gly

Ala 560

Ser

Arg

Gin

Asp

íle

Ala

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565 570 575

Gin

Leu

Phe

Leu 580

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe 585

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser 590

Gly

Gin

Asp

Leu 595

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu 600

Val

Asp

Leu

Ala

Val 605

Gly

Ala

Gin

Gly

His 610

Val

Leu

Arg 615

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu 620

Lys

Val

Gly

íle

Ser 625

íle

Arg

Phe

Ala

Pro 630

Ser

Glu

Val

Ala

Lys 635

Thr

Val

Tyr

Gin

Cys 640

Trp

Gly

Arg

Thr

Pro 645

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

Leu

Thr

Val

Arg 660

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asp

Val 670

Gin

Ser

Val

Arg 675

Tyr

Asp

Leu

Ala

Leu 680

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu 685

íle

Ser

Arg

Ala

íle 690

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 695

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr 700

Arg

Lys

Thr

Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp 705 710 715 720

182

Cys	Val	Glu Asp	Ala 725	Val Thr Pro íle	íle 730	Leu Arg Leu Asn	Leu 735	Ser
Leu	Ala	Gly Asp 740	Ser	Ala Pro Ser Arg 745	Asn	Leu Arg Pro Val 750	Leu	Ala
Val	Gly	Ser Gin 755	Asp	His Val Thr Ala 760	Ser	Phe Pro Phe Glu 765	Lys	Asn
Cys	Lys 770	Gin Glu	Leu	Leu Cys Glu Gly 775	Asn	Leu Gly Val Ser 780	Phe	Asn
Phe 785	Ser	Gly Leu	Gin	Val Leu Glu Val 790	Gly	Ser Ser Pro Glu 795	Leu	Thr 800
Val	Thr	Val Thr	Val 805	Trp Asn Glu Gly	Glu 810	Asp Ser Tyr Gly	Thr 815	Leu
íle	Lys	Phe Tyr 820	Tyr	Pro Ala Glu Leu 825	Ser	Tyr Arg Arg Val 830	Thr	Arg
Ala	Gin	Gin Pro 835	His	Pro Tyr Pro Leu 840	Arg	Leu Ala Cys Glu 845	Ala	Glu
Pro	Thr 850	Gly Gin	Glu	Ser Leu Arg Ser 855	Ser	Ser Cys Ser íle 860	Asn	His
Pro 865	íle	Phe Arg	Glu	Gly Ala Lys Ala 870	Thr	Phe Met íle Thr 875	Phe	Asp 880
Val	Ser	Tyr Lys	Ala 885	Phe Leu Gly Asp	Arg 890	Leu Leu Leu Arg	Ala 895	Ser
Ala	Ser	Ser Glu 900	Asn	Asn Lys Pro Glu 905	Thr	Ser Lys Thr Ala 910	Phe	Gin
Leu	Glu	Leu Pro 915	Val	Lys Tyr Thr Val 920	Tyr	Thr Val íle Ser 925	Arg	Gin
Glu	Asp 930	Ser Thr	Lys	His Phe Asn Phe 935	Ser	Ser Ser His Gly 940	Glu	Arg
Gin 945	Lys	Glu Ala	Glu	His Arg Tyr Arg 950	Val	Asn Asn Leu Ser 955	Pro	Leu 960
Thr	Leu	Ala íle	Ser 965	Val Asn Phe Trp	Val 970	Pro íle Leu Leu	Asn 975	Gly
Val	Ala	Val Trp 980	Asp	Val Thr Leu Arg 985	Ser	Pro Ala Gin Gly 990	Val	Ser
Cys	Val	Ser Gin 995	Arg	Glu Pro Pro Gin 1000	His	Ser Asp Leu Leu 1005	Thr	Gin
íle	Gin Gly Arg 1010	Ser	Val Leu Asp Cys 1015	Ala	íle Ala Asp Cys 1020	Leu	His
Leu Arg 1025	Cys Asp	íle	Pro Ser Leu Gly 1030	Thr	Leu Asp Glu Leu 1035	Asp	Phe 1040

188

íle

Leu

Lys

Gly Asn 1045

Leu

Ser

Phe

Gly

Trp 1050

íle

Ser

Gin

Thr

Leu 1055

Gin

Lys

Val

Leu 1060

Leu

Ser

Glu

Ala 1065

Glu >

íle

Thr

Phe

Asn 1070

Thr

Ser

Val

Tyr

Ser 1075

Gin 1

Leu

Pro

Gly

Gin 108C

Glu 1

Ala

Phe

Leu

Arg Ala 1085

Gin

Val

Ser

Thr 109C

Met I

Leu

Glu

Tyr Val 1095

Val

Tyr

Glu

Pro Val 1100

Phe

Leu

Met

Val Phe 1105

Ser

Val

Gly 111C

Gly 1

Leu

Leu Ala 1115

Leu

íle

Thr

Val 1120

Ala

Leu

Tyr

Lys

Leu 1125

Gly

Phe

Lys

Arg 1130

Gin 1

Tyr

Lys

Glu

Met 1135

Leu 1

Asp

Leu

Pro

Ser 114C

Ala 1

Asp

Pro

Asp

Pro Ala 1145

Gly Gin

Ala

Asp 115C

Ser 1

Asn

His

Glu

Thr Pro 1155

Pro

His

Leu

Thr Ser 1160

C 2)

INF

ORMÁCIE

ľ O

SEK

. ID. é

54 :

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 3597 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: .jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: cDNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) NÁZOV/KLIJČ: CDS C B) UMIESTENIE: 40..3525

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 54:

AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCAGTG ATG GCC GGT GGA GTT 54

Met Ala Gly Gly Val

5

GTG ATC CTC

CTG TGT Leu Cys 10

GGC TGG GTC CTG GCT TCC TGT CAT

GGG TCT Gly Ser 20

AAC Asn

102

Val

íle

Leu

Gly

Trp

Val Leu

Ala 15

Ser Cys

His

CTG

GAT

GTG

GAG

GAA

CCC

ATC

GTG

TTC

AGA

GAG

GAT

GCA

GCC

AGC

TTT

150

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

íle

Val

Phe

Arg

Glu

Asp

Ala

Ser

Phe

25

30

35

GGA

CAG

ACT

GTG

CAG

TTT

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

GGA

GCC

19S

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

Gly

Ala

40

45

50

CCT

CTG

GAG

GCG

GTG

GCA

GTC

AAC

CAA

ACA

GGA

CGG

TTG

TAT

GAC

TGT

246

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

Asp

Cys

55

60

65

184

GCA CCT

GCC ACT GGC ATG TGC CAG

CCC Pro

ATC íle

GTA Val 80

CTG Leu

CGC Arg

AGT Ser

CCC Pro

CTA Leu 85

Ala 70

Pro

Ala

Thr Gly Met 75

Cys

Gin

GAG

GCA

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCT

CTG

GTG

ACT

GCC

ACC

AAT

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

90

95

100

AAC

GCC

CAG

TTG

CTG

GCT

TGT

GGT

CCA

ACT

GCA

CAG

AGA

GCT

TGT

GTG

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

105

110

115

AAG

AAC

ÁTG

TAT

GCG

AAA

GGT

TCC

TGC

CTC

CTT

CTC

GGC

TCC

AGC

TTG

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

120

125

130

CAG

TTC

ATC

CAG

GCA

GTC

CCT

GCC

TCC

ATG

CCA

GAG

TGT

CCA

AGA

CAA

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

135

140

145

GAG

ATG

GAC

ATT

GCT

TTC

CTG

ATT

GAT

GGT

TCT

GGC

AGC

ATT

AAC

CAA

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Gin

150

155

160

165

AGG

GAC

TTT

GCC

CAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AAA

GCT

TTG

ATG

GGA

GAG

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Lys

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

170

175

180

TTT

GCG

AGC

ACC

AGC

ACC

TTG

TTC

TCC

CTG

ATG

CAA

TAC

TCG

AAC

ATC

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

185 190 195

CTG

AAG

ACC

CAT

TTT

ACC

TTC

ACT

GAA

TTC

AAG

AAC

ATC

CTG

GAC

CCT

Leu

Lys

Thr 200

His

Phe

Thr

Phe

Thr 205

Glu

Phe

Lys

Asn

íle 210

Leu

Asp

Pro

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

CCC

ATT

GTC

CAG

CTG

CAA

GGC

CTG

ACC

TAC

ACA

Gin

Ser 215

Leu

Val

Asp

Pro

íle 220

Val

Gin

Leu

Gin

Gly 225

Leu

Thr

Tyr

Thr

GCC

ACA

GGC

ATC

CGG

ACA

GTG

ATG

GAA

GAG

CTA

TTT

CAT

AGC

AAG

AAT

Ala 230

Thr

Gly

íle

Arg

Thr 235

Val

Met

Glu

Leu 240

Phe

His

Ser

Lys

Asn 245

GGG

TCC

CGT

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

CTT

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser 250

Ala

Lys

íle

Leu 255

Leu

Val

íle

Thr

Asp 260

Gly

CAG

AAA

TAC

AGA

GAC

CCC

CTG

GAG

TAT

AGT

GAT

GTC

ATT

CCC

GCC

GCA

Gin

Lys

Tyr

Arg 265

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr 270

Ser

Asp

Val

íle

Pro 275

Ala

GAC

AAA

GCT

GGC

ATC

ATT

CGT

TAT

GCT

ATT

GGG

GTG

GGA

GAT

GCC

TTC

Asp

Lys

Ala 280

Gly

íle

Arg

Tyr 285

Ala

íle

Gly

Val

Gly 290

Asp

Ala

Phe

CAG

GAG

CCC

ACT

GCC

CTG

AAG

GAG

CTG

AAC

ACC

ATT

GGC

TCA

GCT

CCC

Gin

Glu 295

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys 300

Glu

Leu

Asn

Thr

íle 305

Gly

Ser

Ala

Pro

294

342

390

438

486

534

582

630

678

726

774

822

870

918

966

185

CCA CAG

GAC CAC

GTG TTC AAG GTA

GGC AAC Gly Asn

TTT Phe 320

GCA GCA CTT CGC AGC

1014

Pro 310

Gin

Asp

His

Val

Phe 315

Lys

Val

Ala

Leu

Arg

Ser 325

ATC

CAG

AGG

CAA

CTT

CAG

GAG

AAA

ATC

TTC

GCC

ATT

GAG

GGA

ACT

CAA

1062

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

íle

Glu

Gly

Thr

Gin

330

335

340

TCA

AGG

TCA

AGT

TCC

TTT

CAG

CAC

GAG

ATG

TCA

CAA

GAA

GGT

TTC

1110

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

345

350

355

AGT

TCA

GCT

CTC

ACA

TCG

GAT

GGA

CCC

GTT

CTG

GGG

GCC

GTG

GGA

AGC

1158

Ser

Ala

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

360

365

370

TTC

AGC

TGG

TCC

GGA

GGT

GCC

TTC

TTA

TAT

CCC

CCA

AAT

ACG

AGA

CCC

1206

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

375

380

385

ACC

TTT

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGA

GAC

TCC

TAC

1254

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

390

395

400

405

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GCA

GTG

GCC

TTT

TGG

AAG

GGG

GTT

CAC

AGC

CTG

1302

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

Gly

Val

His

Ser

Leu

410

415

420

ATC

CTG

GGG

GCC

CCG

CGT

CAC

CAG

CAC

ACG

GGG

AAG

GTT

GTC

ATC

TTT

1350

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Val

íle

Phe

425

430

435

ACC CAG

GAA Glu 440

GCC Ala

AGG Arg

CAT TGG AGG CCC AAG

TCT GAA GTC AGA GGG ACA

1398

Thr

Gin

His

Trp

Arg 445

Pro Lys

Ser Glu Val 450

Arg

Gly

Thr

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCT

CTC

TGT

TCT

GTG

GAC

GTG

GAT

1446

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

Asp

Val

Asp

455

460

465

AGA

GAT

GGC

AGC

ACY

GAC

CTG

GTC

CTG

ATC

GGA

GCC

CCC

CAT

TAC

TAT

1494

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

His

Tyr

470

475

480

485

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

CAG

GTC

TCA

GTG

TTC

CCC

GTG

CCC

GGT

GTG

1542

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

Pro

Val

Pro

Gly

Val

4 90

495

500

AGG

GGC

AGG

TGG

CAG

TGT

GAG

GCC

ACC

CTC

CAC

GGG

GAG

CAG

GGC

CAT

1590

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Glu

Gin

Gly

His

505

510

515

CCT

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GTG

GCT

CTG

ACA

GTG

CTG

GGG

GAC

GTA

AAC

1633

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

520

525

530

GGG

GAC

AAT

CTG

GCA

GAC

GTG

GCT

ATT

GGT

GCC

CCT

GGA

GAG

168 5

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

Glu

535

540

545

186

AGC AGA

GGT Gly

GCT GTC

TAC Tyr 555

ATA íle

TTT Phe

CAT His

GGA Gly

GCC TCG

AGA Arg

CTG Leu

GAG Glu

ATC íle 565

1734

Ser 550

Arg

Ala

Val

Ala 560

Ser

ATG

CCC

TCA

CCC

AGC

CAG

CGG

GTC

ACT

GGC

TCC

CAG

CTC

TCC

CTG

AGA

1782

Met

Pro

Ser

Pro

Ser 570

Gin

Arg

Val

Thr

Gly 575

Ser

Gin

Leu

Ser

Leu 580

Arg

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

TCA

TTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

CTT

ACA

CAG

1830

Leu

Gin

Tyr

Phe 585

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser 590

Gly

Gin

Asp

Leu 595

Thr

Gin

GAT

GGC

CTG

GTG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGA

GCC

CAG

GGG

CAC

GTA

CTG

1878

Asp

Gly

Leu 600

Val

Asp

Leu

Ala

Val 605

dy

Ala

Gin

Gly

His 610

Val

Leu

CTC

AGG

AGT

CTG

CCT

CTG

AAA

GTG

GAG

CTC

TCC

ATA

AGA

TTC

GCC

1926

Leu

Arg 615

Ser

Leu

Pro

Leu

Leu 620

Lys

Val

Glu

Leu

Ser 625

íle

Arg

Phe

Ala

CCC

ATG

GAG

GTG

GCA

AAG

GCT

GTG

TAC

CAG

TGC

TGG

GAA

AGG

ACT

CCC

1974

Pro 630

Met

Glu

Val

Ala

Lys 635

Ala

Val

Tyr

Gin

Cys 640

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro 645

ACT

GTC

CTC

GAA

GCT

GGA

GAG

GCC

ACT

GTC

TGT

CTC

ACT

GTC

CAC

AAA

2022

Thr

Val

Leu

Glu

Ala 650

Gly

Glu

Ala

Thr

Val 655

Cys

Leu

Thr

Val

His 660

Lys

GGC

TCA

CCT

GAC

CTG

TTA

GGT

AAT

GTC

CAA

GGC

TCT

GTC

AGG.

TAT

GAT

2070

Gly

Ser

Pro

Asp 665

Leu

Gly

Asn

Val 670

Gin

Gly

Ser

Val

Arg 675

Tyr

Asp

CTG GCG Leu Ala

TTA GAT CCG

GGC Gly

CGC CTG ATT TCT CGT GCC ATT

TTT Phe

GAT Asp

GAG Glu

2118

Leu 680

Asp

Pro

Arg Leu 685

íle

Ser

Arg

Ala

íle 690

ACT

AAG

AAC

TGC

ACT

TTG

ACG

GGA

AGG

AAG

ACT

CTG

GGG

CTT

GGT

GAT

2166

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

695

700

705

CAC

TGC

GAA

ACA

GTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCG

GAC

TGT

GTG

GAA

GAT

GCA

2214

His

Cys

Glu

Thr

Val

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

710

715

720

725

GTG

AGC

CCT

ATC

CTG

CGC

CTC

AAC

TTT

TCC

CTG

GTG

AGA

GAC

TCT

2262

Val

Ser

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

730

735

740

GCT

TCA

CCC

AGG

AAC

CTG

CAT

CCT

GTG

CTG

GCT

GTG

GGC

TCA

CAA

GAC

2310

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

745

750

755

CAC

ATA

ACT

GCT

TCT

CTG

CCG

TTT

GAG

PAG

AAC

TGT

AAG

CAA

GAA

CTC

2358

His

íle

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

760

765

770

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

GGC

ATC

AGC

TTT

AAC

TTC

TCA

GGC

CTG

CAG

2406

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

íle

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

775

780

785

187

GTC Val 790

TTG GTG Leu Val

GTG Val

GGA Gly

GGC Gly 795

TCC Ser

CCA Pro

GAG CTC ACT GTG ACA GTC ACT GTG

2454

Glu

Leu Thr Val 800

Thr Val

Thr

Val 805

TGG

AAT

GAG

GGT

GAG

GAC

AGC

TAT

GGA

ACT

TTA

GTC

AAG

TTC

TAC

2502

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

810

815

820

CCA

GCA

GGG

CTA

TCT

TAC

CGA

CGG

GTA

ACA

GGG

ACT

CAG

CAA

CCT

CAT

2550

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Gin

Pro

His

825

830

835

CAG

TAC

CCA

CTA

CGC

TTG

GCC

TGT

GAG

GCT

GAG

CCC

GCT

GCC

CAG

GAG

2598

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

840

845

850

GAC

CTG

AGG

AGC

TGT

AGC

ATT

AAT

CAC

CCC

ATC

TTC

CGA

GAA

2646

Asp

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

855

860

865

GGT

GCA

AAG

ACC

TTC

ATG

ATC

ACA

TTC

GAT

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

2694

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

870

875

880

885

TTC

CTA

GGA

GAC

AGG

TTG

CTT

CTG

AGG

GCC

AAA

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

2742

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu

Asn

890

895

900

AAT

AAG

CCT

GAT

ACC

AAC

AAG

ACT

GCC

TTC

CAG

CTG

GAG

CTC

CCA

GTG

2790

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

905

910

915

AAG TAC Lys Tyr

ACC GTC Thr Val 920

TAT Tyr

ACC CTG ATC AGT AGG CAA GAA GAT TCC

ACC Thr

AAC Asn

2838

Thr

Leu

íle 925

Ser

Arg

Gin

Glu Asp 930

Ser

CAT GTC

AAC TTT

TCA

TCT

TCC

CAC

GGG

AGA

AGG CAA

GAA

GCC

GCA

2886

His Val 935

Asn Phe

Ser

Ser 940

His

Gly

Arg

Arg Gin 945

Glu

Ala

CAT CGC

TAT CGT

GTG

AAT

AAC

CTG

AGT

CCA

CTG

AAG CTG

GCC

GTC

AGA

2934

His Arg 950

Tyr Arg

Val

Asn 955

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu 960

Lys Leu

Ala

Val

Arg 965

GTT AAC

TTC TGG

GTC

CCT

GTC

CTT

CTG

AAC

GGT

GTG GCT

GTG

TGG

GAC

2982

Val Asn

Phe Trp

Val 970

Pro

Val

Leu

Asn 97 5

Gly

Val Ala

Val

Trp 980

Asp

GTG ACT

CTG AGC

AGC

CCA

GCA

CAG

GGT

GTC

TCC

TGC GTG

TCC

CAG

ATG

3030

Val Thr

Leu Ser 985

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly 990

Val

Ser

Cys Val

Ser 995

Gin

Met

AAA CCT

CCT CAG

AAT

CCC

GAC

TTT

CTG

ACC

CAG

ATT CAG

AGA

CGT

TCT

3078

Lys Pro

Pro Gin 1000

Asn

Pro

Asp

Phe Leu 1005

Thr

Gin

íle Gin Arg 1010

Arg

Ser

GTG CTG

GAC TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAC

TTC CGC

TGT

GAC

ATC

3126

Val Leu Asp Cys 1015

Ser

íle

Ala Asp 1020

Cys

Leu

His

Phe Arg 1025

Cys

Asp

íle

138

CCC TCC Pro Ser 1030

TTG Leu

GAC Asp

ATC íle

CAG GAT Gin Asp 1035

GAA Glu

CTT Leu

GAC Asp

TTC ATT Phe íle 1040

CTG Leu

AGG Arg

GGC Gly

AAC Asn 1045

3174

CTC AGC

TTC

GGC

TGG

GTC AGT

CAG

ACA

TTG

CAG GAA

AAG

GTG

TTG

CTT

3222

Leu Ser

Phe

Gly

Trp 105C

Val Ser 1

Gin

Thr

Leu 1055

Gin Glu 1

Lys

Val

Leu Leu 1060

GTG AGT

GAG

GCT

GAA

ATC ACT

TTC

GAC

ACA

TCT GTG

TAC

TCC

CAG

CTG

3270

Val Ser

Glu

Ala Glu 1065

íle Thr

Phe

Asp Thr 1070

Ser Val

Tyr

Ser Gin 1075

Leu

CCA GGA

CAG

GAG

GCA

TTT CTG

AGA

GCC

CAG

GTG GAG

ACA

ACG

TTA

GAA

3318

Pro Gly

Gin Glu 1080

Ala

Phe Leu

Arg Ala 1085

Gin

Val Glu

Thr Thr 1090

Leu

Glu

GAA TAC

GTG

GTC

TAT

GAG CCC

ATC

TTC

CTC

GTG GCG

GGC

AGC

TCG

GTG

3366

Glu Tyr Val 1095

Val

Tyr

Glu Pro íle 1100

Phe

Leu

Val Ala Gly 1105

Ser

Val

GGA GGT

CTG

TTA

CTG GCT

CTC

ATC

ACA

GTG GTA

CTG

TAC

AAG

CTT

3414

Gly Gly 1110

Leu

Leu Ala 1115

Leu

íle

Thr

Val Val 1120

Leu

Tyr

Lys

Leu 1125

GGC TTC

TYC

AAA

CGT

CAG TAC

AAA

GAA

ATG

CTG GAC

GGC

AAG

GCT

GCA

3462

Gly Phe

Xaa

Lys

Arg Gin Tyr 1130

Lys

Glu

Met Leu Asp 1135

Gly

Lys

Ala Ala 1140

GAT CCT

GTC

ACA

GCC

GGC CAG

GCA

GAT

TTC

GGC TGT

GAG

ACT

CCT

CCA

3510

Asp Pro

Val

Thr

Ala

Gly Gin

Ala

Asp

Phe

Gly Cys

Glu

Thr

Pro

1145 1150 1155

TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATGAAGATTG 3562

Tyr Leu Val Ser

1160

GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT 3597 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.-. 55:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 11,61 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (11) TYP MOLEKULY: proteín

(x:

i.) P

OPI!

S SE

ľKVE

NCIE

ľ: S

;ek.

ID.

. e.

: 5!

ľ) :

Met

Ala

Gly

Val

íle

Leu

Cys

Gly

Trp

Val

Leu

Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

His

Gly

Ser

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

íle

Val

Phe

Arg

Glu

20

25

30

Asp

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

40 45

189

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Ala

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

50

55

60

Arg

Leu

Tyr

Asp

Cys

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

íle

Val

65

70

75

80

Leu

Arg

Ser

Pro

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

85

90

95

Val

Thr

Ala

Thr

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Ala

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Cys

Val

Lys

Asn

Met

Tyr

Ala

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Ser

Leu

Gin

Phe

íle

Gin

Ala

Val

Pro

Ala

Ser

Met

Pro

130

135

140

Glu

Cys

Pro

Arg

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Ala

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

145

150

155

160

Gly

Ser

íle

Asn

Gin

Arg

Asp

Phe

Ala

Gin

Met

Lys

Asp

Phe

Vaľ

Lys

165

170

175

Ala

Leu

Met

Gly

Glu

Phe

Ala

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Leu

Met

180

185

190

Gin

Tyr

Ser

Asn

íle

Leu

Lys

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Glu

Phe

Lys

195

200

205

Asn

íle

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Gly

Leu

Thr

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Arg

Thr

Val

Met

Glu

Leu

225

230

235

240

Phe

His

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

245

250

255

Val

íle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

260

265

270

Val

íle

Pro

Ala

Asp

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

275

280

285

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Glu

Pro

Thr

Ala

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Thr

290

295

300

íle

Gly

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Ala

Leu

Arg

Ser

íle

Gin

Arg

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Phe

Ala

325

330

335

íle

Glu

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

340

345

350

Ser Gin Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu 355 360 365

190

Gly

Ala 370

Val Gly

Ser

Phe

Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr

Pro

375

380

Pro

Asn

Thr

Arg

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

385

390

395

400

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Trp

Lys

405

410

415

Gly

Val

His

Ser

Leu

íle

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

His

Gin

His

Thr

Gly

420

425

430

Lys

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Glu

Ala

Arg

His

Trp

Arg

Pro

Lys

Ser

435

440

445

Glu

Val

Arg.

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

450

455

460

Ser

Val

Asp

Val

Asp

Arg

Asp

Gly

Ser

Xaa

Asp

Leu

Val

Leu

íle

Gly

465

470

475

480

Ala

Pro

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Phe

485

490

495

Pro

Val

Pro

Gly

Val

Arg

Gly

Arg

Trp

Gin

Cys

Glu

Ala

Thr

Leu

His

500

505

510

Gly

Glu

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Val

Ala

Leu

Thr

Val

515

520

525

Leu

Gly

Asp

Val

Asn

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

530

535

540

Pro

Gly

Glu

Ser

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

íle

Phe

His

Gly

Ala

545

550

555

560

Ser

Arg

Leu

Glu

íle

Met

Pro

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

565

570

575

Gin

Leu

Ser

Leu

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ser

Leu

Ser

Gly

580

585

590

Gin

Asp

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Val

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Gin

595

600

605

Gly

His

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Leu

Lys

Val

Glu

Leu

610

615

620

Ser

íle

Arg

Phe

Ala

Pro

Met

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

C-ln

cys

625

630

635

640

Trp

Glu

Arg

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Cys

645

650

655

Leu

Thr

Val

His

Lys

Gly

Ser

Pro

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

C-ln

Gly

660 665 670

Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu íle Ser Arg 675 680 685

191

Ala

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Asn

Cys

Thr

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Thr

690

695

700

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

His

Cys

Glu

Thr

Val

Lys

Leu

Pro

Asp

705

710

715

720

Cys

Val

Glu

Asp

Ala

Val

Ser

Pro

íle

Leu

Arg

Leu

Asn

Phe

Ser

725

730

735

Leu

Val

Arg

Asp

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

Asn

Leu

His

Pro

Val

Leu

Ala

740

745

750

Val

Gly

Ser

Gin

Asp

His

íle

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

755

760

765

Cys

Lys

Gin

Glu

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

íle

Ser

Phe

Asn

770

775

780

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Val

Leu

Val

Gly

Ser

Pro

Glu

Leu

Thr

785

790

795

800

Val

Thr

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Leu

805

810

815

Val

Lys

Phe

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

Gly

820

825

830

Thr

Gin

Pro

His

Gin

Tyr

Pro

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Ala

Glu

835

840

845

Pro

Ala

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Ser

Cys

Ser

íle

Asn

His

850

855

860

Pro

íle

Phe

Arg

Glu

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Met

íle

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Lys

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Asp

Thr

Asn

Lys

Thr

Ala

Phe

Gin

900

905

910

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Thr

Val

Tyr

Thr

Leu

íle

Ser

Arg

Gin

915

920

925

Glu

Asp

Ser

Thr

Asn

His

Val

Asn

Phe

Ser

His

Gly

Arg

930

935

940

Arg

Gin

Glu

Ala

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

945

950

955

960

Lys

Leu

Ala

Val

Arg

Val

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965

970

975

Val

Ala

Val

Trp

Asp

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Gin

Gly

Val

Ser

980

985

990

Cys Val Ser Gin Met Lys Pro Pro Gin Asn Pro Asp Phe Leu Thr Gin 995 1000 1005

192

íle	Gin Arg 1010	Arg Ser	Val Leu Asp Cys Ser íle Ala Asp Cys Leu His
1015	1020
Phe Arg Cys 1025	Asp íle	Pro Ser Leu 1030	Asp íle Gin Asp Glu Leu Asp Phe 1035 1040
íle	Leu Arg	Gly Asn Leu Ser Phe 1045	Gly Trp Val Ser Gin Thr Leu Gin 1050 1055
Glu	Lys Val	Leu Leu 1060	Val Ser Glu	Ala Glu íle Thr Phe Asp Thr Ser 1065 1070
Val	Tyr Ser Gin Leu 1075	Pro Gly Gin Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gin Val 1080 1085
Glu	Thr Thr 1090	Leu Glu	Glu Tyr Val 1095	Val Tyr Glu Pro íle Phe Leu Val 1100
Ala Gly Ser 1105	Ser Val	Gly Gly Leu 1110	Leu Leu Leu Ala Leu íle Thr Val 1115 1120
Val	Leu Tyr	Lys Leu Gly Xaa Xaa 1125	Lys Arg Gin Tyr Lys Glu Met Leu 1130 1135
Asp Cys	Gly Lys Ala Ala 1140 Glu Thr Pro Pro 1155	Asp Pro Val Thr Xaa Gly Gin Ala Asp Phe Gly 1145 1150 Tyr Leu Val Ser 1160

C 2) INFORMÁCIE C SEK. ID. č.: 56:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz CEO TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden CD) TOPOLÓGIA·. lineárna
Cii) TYP MOLEKULY: DNA	ID. e.: 56:
Cxi)	POPIS SEKVENCIE: SEK.
CCTGTCATGG	GTCTAACCTG

C 2) INFORMÁCIE Q SEK. ID. e.= 57:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 19 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: ..jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 57:

AGGTTAGACC CATGACAGG 19

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 56:

193

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz CEO TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA= lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 58:

GGCCTTGCAG CTGGACAATG 20

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 59:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 22 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 59:

CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC 22

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.-. 60:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B ) T Y P : n u l< 1 e o v á k y s e 1 i n a

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. o.: 60:

CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. o.: 61:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 22 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET _REŤAZCOV: j eden C D ) T OP OL ÓGIA : 1 i n e á r n a

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 61:

CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA 22

C2) INFORMÁCIE 0 SEK. ID. č.: 62 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

194

C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 62=

GCTGGGATCA TTCGCTATGC 20

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 63;

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz CEO TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) T OF’ OL OG ΙΑ: 11 n e: á r n a C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 63:

CAATGGATGG ACCAGTTCTG G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 64:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET REŤAZCOV: j eden C D ) T CJP OL OG IA : 1 i n e á r n a

Cii) TYP MOLEKULY: DMA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.= 64:

CAGATCGGCT CCTACTTTGG 20

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 65 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 19 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA ·. lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 65:

CATGGAGCCT CGAGACAGG 19

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 66:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21. párov báz C B ) TYP: n u k 1 e o v á k y s e 1. i n a C C) POČET , REŤ AZCOV: j eden CD) TOF’OLOGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

195

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 66:

CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 67:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 67:

CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č. : 68:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 2.1 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 68:

CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č. = 69 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 2.1 párov báz C B) TYP: nuk1eov á k y se1ina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 69:

CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 70:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 18 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 70:

GTCACAGAGG GAACCTCC

196

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 71

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 23 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: ...jeden

CD) T OP OL OGIA: 1ineár na Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 71=

GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA 23

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 72:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE -.

C A) DĹŽKA: 23 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cli) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi.) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 72:

GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC 23

C 2.) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.·. 73·.

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 22 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi.) POPIS SEKVENCIE·. SEK. ID. č.·. 73-.

CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG 22

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 74:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV-, jeden

CD) TOPOLOGIA: lineárna Cli) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 74=

GTGGATCAGC ACTGAAATCT G 2¹

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 75:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

197

CC) POČET REŤAZCÓV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 75:

CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 76:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOĽÚGIA: lineárna C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 76:

CACAGCGGAG GTGCAGGCAG 20

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 77:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 18 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna C11) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č. : 77:

CTCACTGCTT GCGCTGGC 1S

C 2.) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 78 =

C1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna C11) TYP MOLEKULY·- DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 78:

CGGTAAGATA GCTCTGCTGG 2C

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 79:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET REŤAZCOV: j eden CD) TOPOLÓGIA: lineárna

C11) TYP MOLEKULY: DNA

198

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 79:

GAGCCCACAG CCAGCACAGG 20

C 2.)	INFORMÁCIE 0 SEK. ID. č.: 80:
	CD	CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová k yse1ina C C) POČET _REŤAZCOV: j eden CD) TOPOLOGIA: lineárna
	(ii)	TYP MOLEKULY: DNA
	Cxi)	POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.
GATCCAACGC	CAGATCATAC C
C2)	INFORMÁCIE 0 SEK. ID. č.= 81:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 2D párov báz CEO TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLOGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 81=

CACGGCCAGG TCCACCAGGC 20

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 82:

CD CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET _REŤAZCOV = j eden CD) TOPOLOGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 82:

CACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21

C2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 83:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 22 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 83:

TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG 22

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 84:

199

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 84:

GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. C.: 85 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 85:

CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. C.= 86:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 21 párov báz č B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 86:

GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 87:

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 93 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET REŤAZCOV = jeden CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 87:

GTÄAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 88:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 33 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET REŤAZCOV: j eden CD) T OF’ OL ÓGIA : I i ne á r n a

200 (ii) TYP MOLEKULY: DMA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 88:

CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33

INFORMÁCIE	0 SEK. ID.	Č.: 89:
(i) CHARAK	TERISTIKA	SEKVENCIE:
(A)	DĹŽKA: 32	párov báz
(B)	TYP: nukle	ová kyselina
(C)	POČET REŤAZCOV: jeden
(D)	TOPOLOGIA:	lineárna

(ii) TYP MOLEKULY: DMA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 83:

CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: ...jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 30:

GGTGACACTA TAGAATAGGG C .21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina ( C) POČET REŤAZCOV ...jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 31:

AAGCAGGAGCTCCTGTGT ₁₅ (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 92= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 852 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) MÁZ0V/KLĽ1Č: CDS

2C1

C B) UMIESTENIE: .61..852 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 92:

TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60

ATG GCC CTT

GGG GCT Gly Ala 5

GTG GTC

CTC CTT

GGG GTC

CTG Leu

GCT Ala

TCT Ser

TAC Tyr 15

CAC His

108

Met 1

Ala

Leu

Val

Leu

Gly 10

Val

GGA

TTC

AAC

TTG

GAC

GTG

ATG

AGC

GGT

GAT

CTT

CCA

GGA

AGA

CGC

AGC

156

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Met

Ser

Gly

Asp

Leu

Pro

Gly

Arg

Ser

20

25

30

GGG

CTT

CGG

GCA

GAG

CGT

GAT

GCA

GTT

TGG

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

204

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Val

Trp

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

CGG

CTG

TAC

252

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

CCA

TTC

ATG

300

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

íle

Phe

Pro

Phe

Met

65

70

75

80

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

GCA

GCC

TCC

348

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

85

90

95

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

CAT

AGA

GCC

.396

Pro

Asn

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Arg

Ala

100

105

110

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

GAT

GCC

444

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

Asp

Ala

115

120

125

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

GAG

TGC

CCA

492

His

Ala

Gin

Pro

íle

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

GGC

AGC

ATT

540

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

145

150

155

160

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

GCT

GTG

ATG

588

Ser

Asn

A.sp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Ala

Val

Met

165

170

175

GAC

CAG

TTC

A_AG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

CAG

TAC

TCC

636

Asp

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

Gin

Tyr

Ser

130

185

190

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

AAC

AGC

TCC

684

Asn

Val

Leu

Val

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

Asn

Ser

195

200

205

AAT

CCT

CAG

GGC

CTA

GTG

GAG

CCC

ATT

GTG

CAG

CTG

ACA

GGC

CTC

ACG

732

Asn

Pro

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210 215 220

202

TTC Phe 225

ACG Thr

GCC ACA

GGG ATC Gly íle 230

CTG Leu

AAA GTG GTG

ACA GAG CTG TTT CAA ACC Thr Glu Leu Phe Gin Thr

780

Ala

Thr

Lys

Val

235

240

AAG

AAC

GGG

GCC

CGC

GAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

GTC

ATC

ACA

828

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

Thr

245

250

255

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GCG

GCA

852

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Ala

260 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 264 aminokyselín C B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 93:

Met 1

Ala Leu

Gly Ala 5

Val

Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His

10

15

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Met

Ser

Gly

Asp

Leu

Pro

Gly

Arg

Ser

20

25

30

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Val

Trp

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly

Arg

Leu

Tyr

50

55

60

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

cys

Thr

Pro

íle

Phe

Pro

Phe

Met

65

70

75

80

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

85

90

95

Pro

Asn

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

His

Arg

Ala

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

Asp

Ala

115

120

125

His

Ala

Gin

Pro

íle

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Cys

Pro

130

135

140

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

íle

145

150

155

160

Ser

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Ala

Val

Met

165

170

175

Asp Gin Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gin Phe Ser Leu Met Gin Tyr Ser 180 185 190

203

Asn Val

Leu 195

Val

Thr

His

Phe

Thr 200

Phe Ser Ser

Phe

Arg 205

Asn

Ser

Asn

Pro

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

210

215

220

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

Phe

Gin

Thr

225

230

235

240

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

Thr

245

250

255

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Ala

260 (2) INFORMÁCIE Ο SEK. ID. č.: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden CD) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 94:

CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.-- 95·.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: j eden (D) TOPOLOGTA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 95:

CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2.499 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina C C) POČET _χREŤ AZCOV: j eden ( D ) T OP OL OGIA : 1 i n e á r n a (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 96:

ATGACCTTCG GCACTGTGCT TCTTCTGAGT GTCCTGGCTT CTTATCATGG ATTCAACCTG 60

GATGTGGAGG AGCCTACGAT CTTCCAGGAG GATGCAGGCG GCTTTGGGCA GAGCGTGGTG 12C

CAGTTCGGTG GATCTCGACT CGTGGTGGGA GCACCCCTGG AGGTGGTGGC GGCCAACCAG 180

204

ACGGGACGGC	TGTATGACTG	CGCAGCTGCC	ACCGGCATGT	GCCAGCCCAT	CCCGCTGCAC	240
ATCCGCCCTG	AGGCCGTGAA	CATGTCCTTG	GGCCTGACCC	TGGCAGCCTC	CACCAACGGC	300
TCCCGGCTCC	TGGCCTGTGG	CCCGACCCTG	CACAGAGTCT	GTGGGGAGAA	CTCATACTCA	360
AAGGGTTCCT	GCCTCCTGCT	GGGCTCGCGC	TGGGAGATCA	TCCAGACAGT	CCCCGACGCC	420
ACGCCAGAGT	GTCCACATCA	AGAGATGGAC	ATCGTCTTCC	TGATTGACGG	CTCTGGAAGC	480
ATTGACCAAA	ATGACTTTAA	CCAGATGAAG	GGCTTTGTCC	AAGCTGTCAT	GGGCCAGTTT	540
GAGGGCACTG	ACACCCTGTT	TGCACTGATG	CAGTACTCAA	ACCTCCTGAA	GATCCACTTC	600
ACCTTCACCC	AATTCCGGAC	CAGCCCGAGC	CAGCAGAGCC	TGGTGGATCC	CATCGTCCAA	660
CTGAAAGGCC	TGACGTTCAC	GGCCACGGGC	ATCCTGACAG	TGGTGACACA	GCTATTTCAT	720
CATAAGAATG	GGGCCCGAAA	AAGTGCCAAG	AAGATCCTCA	TTGTCATCAC	AGATGGGCAG	780
AAGTACAAAG	ACCCCCTGGA	ATACAGTGAT	GTCATCCCCC	AGGCAGAGAA	GGCTGGCATC	840
ATCCGCTACG	CTATCGGGGT	GGGACACGCT	TTCCAGGGAC	CCACTGCCAG	GCAGGAGCTG	900
AATACCATCA	GCTCAGCGCC	TCCGCAGGAC	CACGTGTTCA	AGGTGGACAA	CTTTGCAGCC	960
CTTGGCAGCA	TCCAGAAGCA	GCTGCAGGAG	AAGATCTATG	CAGTTGAGGG	AACCCAGTCC	1020
AGGGCAAGCA	GCTCCTTCCA	GCACGAGATG	TCCCAAGAAG	GCTTCAGCAC	AGCCCTCACA	1080
ATGGATGGCC	TCTTCCTGGG	GGCTGTGGGG	AGCTTTAGCT	GGTCTGGAGG	TGCCTTCCTG	1140
TATCCCCCAA	ATATGAGCCC	CACCTTCATC	AACATGTCTC	AGGAGAATGT	GGACATGAGG	1200
GACTCTTACC	TGGGTTACTC	CACCGAGCTA	GCCCTGTGGA	AGGGGGTACA	GAACCTGGTC	1260
CTGGGGGCCC	CCCGCTACCA	GCATACCGGG	AAGGCTGTCA	TCTTCACCCA	GGTGTCCAGG	1320
CAATGGAGGA	AGAAGGCCGA	AGTCACAGGG	ACGCAGATCG	GCTCCTACTT	CGGGGCCTCC	1380
CTCTGCTCCG	TGGATGTGGA	CAGCGATGGC	AGCACCGACC	TGATCCTCAT	TGGGGCCCCC	1440
CATTACTATG	AGCAGACCCG	AGGGGGCCAG	GTGTCCGTGT	GTCCCTTGCC	TAGGGGGAGG	1500
GTGCAGTGGC	AGTGTGACGC	TGTTCTCCGT	GGTGAGCAGG	GCCACCCCTG	GGGCCGCTTT	1560
GGGGCAGCCC	TGACAGTGTT	GGGGGATGTG	AATGAGGACA	AGCTGATAGA	CGTGGCCATT	. 1620
GGGGCCCCGG	GAGAGCAGGA	GAACCGGGGT	GCTGTCTACC	TGTTTCACGG	AGCCTCAGAA	1680
TCCGGCATCA	GCCCCTCCCA	CAGCCAGCGG	ATTGCCAGCT	CCCAGCTCTC	CCCCAGGCTG	1740
CAGTATTTTG	GGCAGGCGCT	GAGTGGGGGT	CAGGACCTCA	CCCAGGATGG	ACTGATGGAC	1800
CTGGCCGTGG	GGGCCCGGGG	CCAGGTGCTC	CTGCTCAGGA	GTCTGCCGGT	GCTGAAAGTG	18 60
GGGGTGGCCA	TGAGATTCAG	CCCTGTGGAG	GTGGCCAAGG	CTGTGTACCG	GTGCTGGGAA	1920
GAGAAGCCCA	GTGCCCTGGA	AGCTGGGGAC	GCCACCGTCT	GTCTCACCAT	CCAGAAAAGC	1930
TCACTGGACC	AGCTAGGTGA	CATCCAAAGC	TCTGTCAGGT	TTGATCTGGC	ACTGGACCCA	2040

206

GGTCGTCTGA	CTTCTCGTGC	CATTTTCAAT	GAAACCAAGA	ACCCCACTTT	GACTCGAAGA	2100
AAAACCCTGG	GACTGGGGAT	TCACTGTGAA	ACCCTGAAGC	TGCTTTTGCC	AGTGAGGACT	2160
TTGGGTTCTG	GGAAGGGGGA	GAGAGGAGGA	GCCCAAGGCT	GGCCTGGAGC	ACCCCCGTTC	2220
TCTGCTGAGC	GAGGTGGGAA	GGGTTAGGAT	GTTGGGGCTG	GAGAGAGGGA	CATTAGGGCA	2280
GGAGAACCTG	GCTCCACGGC	TTGGAGGGAG	CACTGTCAGG	GCAGTGGGGA	GTGGATGCAG	2340
TGGAGGAGGA	CTTGTGGTGG	AGCGTAGAGA	GGACAGCAGG	TTCTTGAAAG	CCTGTTCTCT	2400
CTCAGGATTG	TGTGGAGGAT	GTGGTGAGCC	CCATCATTCT	GCACCTCAAC	TTCTCACTGG	2460
TGAGAGAGCC	CATCCCCTCC	CCCCAGAACC	TGCGTCCTG			2499

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.= 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 3956 párov báz ( D ) T Y P -. n u k 1 e; o v á k y s e 1 i n a ( C) POČET _REŤAZCOV . j eden (D) TOPOLOGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.= 97-.

TTTAACTGCA CCAACTTTAA AATACGCTAT TGGAGCTGGA ATTACCGCGG CTGCTGGCAC 60

CAGACTTGCC CTCCAATGGA TCCTCGTTAA AGGATTTAAA GTGGACTCAT TCCAATTACA 120

GGGCCTCGAA AGAGTCCTGT ATTGTTATTT TTCGTCACTA CCTCCCCGGG TCGGGAGTGG 180

GTAATTTGCG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA TGTGGTAGCC GTTTCTCAGG CTCCCTCTCC 240

GGAATCGAAC CCTGATTCCC CGTCACCCGT GGTCACCATG GTAGGCACGT GCAGTTCGGT 300

GGATCTCGAC TCGTGGTGGG AGCACCCCTG GAGGTGGTGG CGGCCAACCA GACGGGACGG 360

CTGTATGACT GCGCAGCTGC CACCGGCATG TGCCAGCCCA TCCCGCTGCA CATCCGCCCT 420

GAGGCCGTGA ACATGTCCTT GGGCCTGACC CTGGCAGCCT CCACCAACGG CTCCCGGCTC 480

CTGGCCTGTG GCCCGACCCT GCACAGAGTC TGTGGGGAGA ACTCATACTC AAAGGGTTCC 540

TGCCTCCTGC TGGGCTCGCG CTGGGAGATC ATCCAGACAG TCCCCGACGC CACGCCAGAG 600

TGTCCACATC AAGAGATGGA CATCGTCTTC CTGATTGACG GCTCTGGAAG CATTGACCAA 660

AATGACTTTA ACCAGATGAA GGGCTTTGTC CAAGCTGTCA TGGGCCAGTT TGAGGGCACT 720

GACACCCTGT TTGCACTGAT GCAGTACTCA AACCTCCTGA AGATCCACTT CACCTTCACC 780

CAATTCCGGA CCAGCCCGAG CCAGCAGAGC CTGGTGGATC CCATCGTCCA ACTGAAAGGC 340

CTGACGTTCA CGGCCACGGG CATCCTGACA GTGGTGACAC AGCTATTTCA TCATAAGAAT 900

GGGGCCCGAA AAAGTGCCAA GAAGATCCTC ATTGTCATCA CAGATGGGCA GAAGTACAAA 960 (J b

GACCCCCTGG	AATACAGTGA	TGTCATCCCC	CAGGCAGAGA	AGGCTGGCAT	CATCCGCTAC	1020
GCTATCGGGG	TGGGACACGC	TTTCCAGGGA	CCCACTGCCA	GGCAGGAGCT	GAATACCATC	1080
AGCTCAGCGC	CTCCGCAGGA	CCACGTGTTC	AAGGTGGACA	ACTTTGCAGC	CCTTGGCAGC	1140
ATCCAGAAGC	AGCTGCAGGA	GAAGATCTAT	GCAGTTGAGG	GAACCCAGTC	CAGGGCAAGC	1200
AGCTCCTTCC	AGCACGAGAT	GTCCCAAGAA	GGCTTCAGCA	CAGCCCTCAC	AATGGATGGC	1260
CTCTTCCTGG	GGGCTGTGGG	GAGCTTTAGC	TGGTCTGGAG	GTGCCTTCCT	GTATCCCCCA	1320
AATATGAGCC	CCACCTTCAT	CAACATGTCT	CAGGAGAATG	TGGACATGAG	GGACTCTTAC	1380
CTGGGTTACT	CCACCGAGCT	AGCCCTGTGG	AAGGGGGTAC	AGAACCTGGT	CCTGGGGGCC	1440
CCCCGCTACC	AGCATACCGG	GAAGGCTGTC	ATCTTCACCC	AGGTGTCCAG	GCAATGGAGG	1500
AAGAAGGCCG	AAGTCACAGG	GACGCAGATC	GGCTCCTACT	TCGGGGCCTC	CCTCTGCTCC	1560
GTGGATGTGG	ACAGCGATGG	CAGCACCGAC	CTGATCCTCA	TTGGGGCCCC	CCATTACTAT	1620
GAGCAGACCC	GAGGGGGCCA	GGTGTCCGTG	TGTCCCTTGC	CTAGGGGGAG	GGTGCAGTGG	1680
CAGTGTGACG	CTGTTCTCCG	TGGTGAGCAG	GGCCACCCCT	GGGGCCGCTT	TGGGGCAGCC	1740
CTGACAGTGT	TGGGGGATGT	GAATGAGGAC	AAGCTGATAG	ACGTGGCCAT	TGGGGCCCCG	1800
GGAGAGCAGG	AGAACCGGGG	TGCTGTCTAC	CTGTTTCACG	GAGCCTCAGA	ATCCGGCATC	1860
AGCCCCTCCC	ACAGCCAGCG	GATTGCCAGC	TCCCAGCTCT	CCCCCAGGCT	GCAGTATTTT	1920
GGGCAGGCGC	TGAGTGGGGG	TCAGGACCTC	ACCCAGGATG	GACTGATGGA	CCTGGCCGTG	1980
GGGGCCCGGG	GCCAGGTGCT	CCTGCTCAGG	AGTCTGCCGG	TGCTGAAAGT	GGGGGTGGCC	2040
ATGAGATTCA	GCCCTGTGGA	GGTGGCCAAG	GCTGTGTACC	GGTGCTGGGA	AGAGAAGCCC	2100
AGTGCCCTGG	AAGCTGGGGA	CGCCACCGTC	TGTCTCACCA	TCCAGAAAAG	CTCACTGGAC	2160
CAGCTAGGTG	ACATCCAAAG	CTCTGTCAGG	TTTGATCTGG	CACTGGACCC	AGGTCGTCTG	2220
ACTTCTCGTG	CCATTTTCAA	TGAAACCAAG	AACCCCACTT	TGACTCGAAG	AAAAACCCTG	2280
GGACTGGGGA	TTCACTGTGA	AACCCTGAAG	CTGCTTTTGC	CAGATTGTGT	GGAGGATGTG	2340
GTGAGCCCCA	TCATTCTGCA	CCTCAACTTC	TCACTGGTGA	GAGAGCCCAT	CCCCTCCCCC	2400
CAGAACCTGC	GTCCTGTGCT	GGCCGTGGGC	TCACAAGACC	TCTTCACTGC	TTCTCTCCCC	2460
TTCGAGAAGA	ACTGTGGGCA	AGATGGCCTC	TGTGAAGGGG	ACCTGGGTGT	CACCCTCAGC	2520
TTCTCAGGCC	TGCAGACCCT	GACCGTGGGG	AGCTCCCTGG	AGCTCAACGT	GATTGTGACT	258 0
GTGTGGAACG	CAGGTGAGGA	TTCCTACGGA	ACCGTGGTCA	GCCTCTACTA	TCCAGCAGGG	2 640
CTGTCGCACC	GACGGGTGTC	AGGAGCCCAG	AAGCAGCCCC	ATCAGAGTGC	CCTGCGCCTG	2700
GCATGTGAGA	CAGTGCCCAC	TGAGGATGAG	GGCCTAAGAA	GCAGCCGCTG	CAGTGTCAAC	27 60
CACCCCATCT	TCCATGAGGG	CTCTAACGGC	ACCTTCATAG	TCACATTCGA	TGTCTCCTAC	2320

207

AAGGCCACCC TGGGAGACAG GATGCTTATG AGGGCCAGTG CAAGCAGTGA GAACAATAAG 2880

GCTTCAAGCA GCAAGGCCAC CTTCCAGCTG GAGCTCCCGG TGAAGTATGC AGTCTACACC 2940

ATGATCAGCA GGCAGGAAGA ATCCACCAAG TACTTCAACT TTGCAACCTC CGATGAGAAG 3000

AAAATGAAAG AGGCTGAGCA TCGATACCGT GTGAATAACC TCAGCCAGCG AGATCTGGCC 3060

ATCAGCATTA ACTTCTGGGT TCCTGTCCTG CTGAACGGGG TGGCTGTGTG GGATGTGGTC 3120

ATGGAGGCCC CATCTCAGAG TCTCCCCTGT GTTTCAGAGA GAAAACCTCC CCAGCATTCT 3180

GACTTCCTGA CCCAGATTTC AAGAAGTCCC ATGCTGGACT GCTCCATTGC TGACTGCCTG 3240

CAGTTCCGCT GTGACGTCCC CTCCTTCAGC GTCCAGGAGG AGCTGGATTT CACCCTGAAG 3300

GGCAATCTCA GTTTCGGCTG GGTCCGCGAG ACATTGCAGA AGAAGGTGTT GGTCGTGAGT 3360

GTGGCTGAAA TTACGTTCGA CACATCCGTG TACTCCCAGC TTCCAGGACA GGAGGCATTT 3420

ATGAGAGCTC AGATGGAGAT GGTGCTAGAA GAAGACGAGG TCTACAATGC CATTCCCATC 3480

ATCATGGGCA GCTCTGTGGG GGCTCTGCTA CTGCTGGCGC TCATCACAGC CACACTGTAC 3540

AAGCTTGGCT TCTTCAAACG CCACTACAAG GAAATGCTGG AGGACAAGCC TGAAGACACT 3600

GCCACATTCA GTGGGGACGA TTTCAGCTGT GTGGCCCCAA ATGTGCCTTT GTCCTAATAA 3660

TCCACTTTCC TGTTTATCTC TACCACTGTG GGCTGGACTT GCTTGCAACC ATAAATCAAC 3720

TTACATGGAA ACAACTTCTG CATAGATCTG CACTGGCCTA AGCAACCTAC CAGGTGCTAA 3780

GCACCTTCTC GGAGAGATAG AGATTGTCAA TGTTTTTACA TATCTGTCCA TCTTTTTCAG 3840

CAATGACCCA CTTTTTACAG AAGCAGGCAT GGTGCCAGCA TAAATTTTCA TATGCTTAAG 3900

AATTGTCACA TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTTTAG 3956

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 98=

Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 3785 párov báz (B) TYP= nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cil) TYP MOLEKULY: cDNA

Clx) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

C A) NÁZOV/KLÚČ: CDS C B) UMIESTENIE = 1. . 3486

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 98=

ATG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT Met Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His

208

GGA Gly

TTC Phe

AAC CTG GAT GTG

GAG GAG CCT ACG ATC

TTC Phe

CAG Gin

GAG GAT GCA

96

Asn

Leu 20

Asp

Val

Glu

Pro 25

Thr

íle

Glu 30

Asp

Ala

GGC

TTT

GGG

CAG

AGC

GTG

CAG

TTC

GGT

GGA

TCT

CGA

CTC

GTG

144

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

GTG

GGA

GCA

CCC

CTG

GAG

GTG

GCG

GCC

AAC

CAG

ACG

GGA

CGG

CTG

192

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

TAT

GAC

TGC

GCA

GCT

GCC

ACC

GGC

ATG

TGC

CAG

CCC

ATC

CCG

CTG

CAC

240

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

íle

Pro

Leu

His

65

70

75

80

ATC

CGC

CCT

GAG

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

TTG

GGC

CTG

ACC

CTG

GCA

GCC

288

íle

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

85

90

95

TCC

ACC

AAC

GGC

TCC

CGG

CTC

CTG

GCC

TGT

GGC

CCG

ACC

CTG

CAC

AGA

336

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

GTC

TGT

GGG

GAG

AAC

TCA

TAC

TCA

AAG

GGT

TCC

TGC

CTC

CTG

GGC

384

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

TCG

CGC

TGG

GAG

ATC

CAG

ACA

GTC

CCC

GAC

GCC

ACG

CCA

GAG

TGT

432

Ser

Arg

Trp

Glu

íle

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130 . 135 140

CCA CAT CAA GAG ATG GAC ATC GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGA AGC 480

Pro His Gin Glu Met Asp íle Val Phe Leu íle Asp Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

ATT GAC íle Asp

CAA Gin

AAT GAC TTT AAC CAG ATG AAG

GGC TTT GTC CAA GCT

GTC Val

528

Asn Asp 165

Phe Asn

Gin Met

Lys 170

Gly Phe

Val

Gin

Ala 175

ATG

GGC

CAG

TTT

GAG

GGC

ACT

GAC

ACC

CTG

TTT

GCA

CTG

ATG

CAG

TAC

576

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

TCA

AAC

CTC

CTG

AAG

ATC

CAC

TTC

ACC

TTC

ACC

CAA

TTC

CGG

ACC

AGC

624

Ser

Asn

Leu

Lys

íle

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

CCG

AGC

CAG

AGC

CTG

GTG

GAT

CCC

ATC

GTC

CAA

CTG

AAA

GGC

CTG

672

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

210

215

220

ACG

TTC

ACG

GCC

ACG

GGC

ATC

CTG

ACA

GTG

ACA

CAG

CTA

TTT

CAT

720

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

240

CAT

AAG

AAT

GGG

GCC

CGA

AAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATT

GTC

ATC

768

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

245 ' 250 255

209

ACA GAT

GGG CAG AAG Gly Gin Lys 260

TAC AAA GAC CCC CTG GAA TAC AGT GAT GTC

ATC íle

816

Thr

Asp

Tyr

Lys

Asp

Pro 265

Leu Glu Tyr

Ser

Asp 270

Val

CCC

CAG

GCA

GAG

AAG

GCT

GGC

ATC

CGC

TAC

GCT

ATC

GGG

GTG

GGA

864

Pro

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

Val

Gly

275

280

285

CAC

GCT

TTC

CAG

GGA

CCC

ACT

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

AAT

ACC

ATC

AGC

912

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

TCA

GCG

CCT

CCG

CAG

GAC

CAC

GTG

TTC

AAG

GTG

GAC

AAC

TTT

GCA

GCC

960

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

CTT

GGC

AGC

ATC

CAG

AAG

CAG

CTG

CAG

GAG

AAG

ATC

TAT

GCA

GTT

GAG

1008

Leu

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

GGA

ACC

CAG

TCC

AGG

GCA

AGC

TCC

TTC

CAG

CAC

GAG

ATG

TCC

CAA

1056

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

GAA

GGC

TTC

AGC

ACA

GCC

CTC

ACA

ATG

GAT

GGC

CTC

TTC

CTG

GGG

GCT

1104

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

GTG

GGG

AGC

TTT

AGC

TGG

TCT

GGA

GGT

GCC

TTC

CTG

TAT

CCC

CCA

AAT

1152

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

ATG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

GAG

AAT

GTG

GAC

ATG

AGG

1200

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

GAC

TCT

TAC

CTG

GGT

TAC

TCC

ACC

GAG

CTA

GCC

CTG

TGG

AAG

GGG

GTA

1248

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

CAG

AAC

CTG

GTC

CTG

GGG

GCC

CCC

CGC

TAC

CAG

CAT

ACC

GGG

AAG

GCT

1296

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

GTC Val

ATC TTC ACC

CAG GTG TCC AGG CAA TGG AGG AAG

AAG GCC GAA Lys Ala Glu 445

GTC Val

1344

íle

Phe Thr 435

Gin

Val

Ser

Arg 440

Gin

Trp

Arg Lys

ACA

GGG

ACG

CAG

ATC

GGC

TCC

TAC

TTC

GGG

GCC

TCC

CTC

TGC

TCC

GTG

1392

Thr

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

GAT

GTG

GAC

AGC

GAT

GGC

AGC

ACC

GAC

CTG

ATC

CTC

ATT

GGG

GCC

CCC

1440

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

íle

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

CAT

TAC

TAT

GAG

CAG

ACC

CGA

GGG

GGC

CAG

GTG

TCC

GTG

TGT

CCC

TTG

1488

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485 490 495

210

CCT AGG GGG AGG GTG CAG TGG CAG TGT GAC GCT GTT

CTC CGT Leu Arg 510

GGT Gly

GAG Glu

1536

Pro

Arg

Gly

Arg Val 500

Gin Trp Gin Cys 505

Asp

Ala

Val

CAG

GGC

CAC

CCC

TGG

GGC

CGC

TTT

GGG

GCA

GCC

CTG

ACA

GTG

TTG

GGG

1584

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

GAT

GTG

AAT

GAG

GAC

AAG

CTG

ATA

GAC

GTG

GCC

ATT

GGG

GCC

CCG

GGA

1632

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

íle

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

GAG

CAG

GAG

AAC

CGG

GGT

GCT

GTC

TAC

CTG

TTT

CAC

GGA

GCC

TCA

GAA

1680

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

TCC

GGC

ATC

AGC

CCC

TCC

CAC

AGC

CAG

CGG

ATT

GCC

AGC

TCC

CAG

CTC

1728

Ser

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

TCC

CCC

AGG

CTG

CAG

TAT

TTT

GGG

CAG

GCG

CTG

AGT

GGG

GGT

CAG

GAC

1776

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

CTC

ACC

CAG

GAT

GGA

CTG

ATG

GAC

CTG

GCC

GTG

GGG

GCC

CGG

GGC

CAG

1824

Leu

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Met

Asp

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

595

600

605

GTG

CTC

CTG

CTC

AGG

AGT

CTG

CCG

GTG

CTG

AAA

GTG

GGG

GTG

GCC

ATG

1872

Val

Leu

Arg

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Met

610

615

620

AGA

TTC

AGC

CCT

GTG

GAG

GTG

GCC

AAG

GCT

GTG

TAC

CGG

TGC

TGG

GAA

1920

Arg

Phe

Ser

Pro

Val

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Val

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu

625

630

635

640

GAG

AAG

CCC

ÁGT

GCC

CTG

GAA

GCT

GGG

GAC

GCC

ACC

GTC

TGT

CTC

ACC

1968

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Val

Cys

Leu

Thr

645

650

655

ATC

CAG

AAA

AGC

TCA

CTG

GAC

CAG

CTA

GGT

GAC

ATC

CAA

AGC

TCT

GTC

2016

íle

Gin

Lys

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu

Gly

Asp

íle

Gin

Ser

Val

660

665

670

AGG Arg

TTT Phe

GAT Asp 675

CTG GCA CTG

GAC Asp

CCA GGT

CGT CTG

ACT Thr

TCT Ser 685

CGT Arg

GCC Ala

ATT íle

2064

Leu Ala

Leu

Pro 680

Gly

Arg

Leu

TTC

AAT

GAA

ACC

AAG

AAC

CCC

ACT

TTG

ACT

CGA

AGA

AAA

ACC

CTG

GGA

2112

Phe

Asn

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro

Thr

Leu

Thr

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

690

695

700

CTG

GGG

ATT

CAC

TGT

GAA

ACC

CTG

AAG

CTG

CTT

TTG

CCA

GAT

TGT

GTG

2160

Leu

Gly

íle

His

Cys

Glu

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

705

710

715

720

GAG

GAT

GTG

AGC

CCC

ATC

ATT

CTG

CAC

CTC

AAC

TTC

TCA

CTG

GTG

220Ξ

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

íle

Leu

His

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

725 730 735

211

AGA Arg

GAG CCC ATC

CCC TCC CCC

CAG AAC CTG CGT CCT GTG CTG GCC GŤG

2256

Glu

Pro

íle 740

Pro

Ser

Pro

Gin Asn Leu 745

Arg

Pro

Val

Leu 750

Ala

Val

GGC

TCA

CAA

GAC

CTC

TTC

ACT

GCT

TCT

CTC

CCC

TTC

GAG

AAG

AAC

TGT

2304

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

755

760

765

GGG

CAA

GAT

GGC

CTC

TGT

GAA

GGG

GAC

CTG

GGT

GTC

ACC

CTC

AGC

TTC

2352

Gly

Gin

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

770

775

780

TCA

GGC

CTG

CAG

ACC

CTG

ACC

GTG

GGG

AGC

TCC

CTG

GAG

CTC

AAC

GTG

2400

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

ATT

GTG

ACT

GTG

TGG

AAC

GCA

GGT

GAG

GAT

TCC

TAC

GGA

ACC

GTG

GTC

2448

íle

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

AGC

CTC

TAC

TAT

CCA

GCA

GGG

CTG

TCG

CAC

CGA

CGG

GTG

TCA

GGA

GCC

2496

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

CAG

AAG

CAG

CCC

CAT

CAG

AGT

GCC

CTG

CGC

CTG

GCA

TGT

GAG

ACA

GTG

2544

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

CCC

ACT

GAG

GAT

GAG

GGC

CTA

AGA

AGC

CGC

TGC

AGT

GTC

AAC

CAC

2592

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

CCC

ATC

TTC

CAT

GAG

GGC

TCT

AAC

GGC

ACC

TTC

ATA

GTC

ACA

TTC

GAT

2640

Pro

íle

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

íle

Val

Thr

Phe

Asp

865

870

875

880

GTC

TCC

TAC

AAG

GCC

ACC

CTG

GGA

GAC

AGG

ATG

CTT

ATG

AGG

GCC

AGT

2688

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885 890 895

GCA

AGC

AGT

GAG

AAC

AAT

AAG

GCT

TCA

AGC

AAG

GCC

ACC

TTC

CAG

2736

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

CTG Leu

GAG CTC CCG GTG AAG

TAT Tyr

GCA GTC TAC ACC ATG ATC AGC AGG CAG

2784

Glu

Leu 915

Pro Val

Lys

Ala 920

Val

Tyr Thr

Met

íle 925

Ser

Arg

Gin

GAA

TCC

ACC

AAG

TAC

TTC

AAC

TTT

GCA

ACC

TCC

GAT

GAG

AAG

AAA

2832

Glu

Ser

Thr

Lys

Tyr

Phe

Asn

Phe

Ala

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

930

935

940

ATG

AAA

GAG

GCT

GAG

CAT

CGA

TAC

CGT

GTG

AAT

AAC

CTC

AGC

CAG

CGA

2880

Met

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Gin

Arg

945

950

955

960

GAT

CTG

GCC

ATC

AGC

ATT

AAC

TTC

TGG

GTT

CCT

GTC

CTG

AAC

GGG

2923

Asp

Leu

Ala

íle

Ser

íle

Asn

Phe

Trp

Val

Pro

Val

Leu

Asn

Gly

965 970 975

212

GTG Val

GCT Ala

GTG TGG GAT

GTG GTC Val Val

ATG Met

GAG GCC

CCA TCT

CAG Gin

AGT Ser 990

CTC Leu

CCC Pro

2976

Val

Trp Asp 980

Glu 985

Ala

Pro

Ser

TGT

GTT

TCA

GAG AGA

AAA CCT

CCC

CAG

CAT

TCT

GAC

TTC

CTG

ACC

CAG

3024

Cys

Val

Ser 995

Glu Arg

Lys Pro

Pro Gin 1000

His

Ser

Asp

Phe 1005

Leu ľ

Thr

Gin

ATT

TCA

AGA

AGT CCC

ATG CTG

GAC

TGC

TCC

ATT

GCT

GAC

TGC

CTG

CAG

3072

íle

Ser Arg 1010

Ser Pro

Met Leu Asp 1015

Cys

Ser

íle

Ala Asp 1020

Cys

Leu

Gin

TTC

CGC

TGT

GAC GTC

CCC TCC

TTC

AGC

GTC

CAG

GAG

CTG

GAT

TTC

3120

Phe Arg 1025

Cys

Asp Val

Pro Ser 1030

Phe

Ser

Val

Gin Glu 1035

Glu

Leu

Asp

Phe 1040

ACC

CTG

AAG

GGC AAT

CTC AGT

TTC

GGC

TGG

GTC

CGC

GAG

ACA

TTG

CAG

3168

Thr

Leu

Lys

Gly Asn Leu Ser 1045

Phe

Gly

Trp Val 1050

Arg

Glu

Thr

Leu Gin 1055

AAG

GTG

TTG GTC

GTG AGT

GTG

GCT

GAA

ATT

ACG

TTC

GAC

ACA

TCC

3216

Lys

Val

Leu Val 1060

Val Ser

Val

Ala Glu 1065

íle

Thr

Phe

Asp Thr 1070

Ser

GTG

TAC

TCC

CAG CTT

CCA GGA

CAG

GAG

GCA

TTT

ATG

AGA

GCT

CAG

ATG

3264

Val

Tyr

Ser Gin Leu 1075

Pro Gly

Gin Glu 1080

Ala

Phe

Met

Arg Ala 1085

Gin

Met

GAG

ATG

GTG

CTA GAA

GAA GAC

GAG

GTC

TAC

AAT

GCC

ATT

CCC

ATC

3312

Glu

Met Val 1090

Leu Glu

Glu Asp Glu 1095

Val

Tyr

Asn

Ala íle 1100

Pro

íle

ATG

GGC

AGC

TCT GTG

GGG GCT

CTG

CTA

CTG

GCG

CTC

ATC

ACA

GCC

3360

Met Gly 1105

Ser

Ser Val

Gly Ala 1110

Leu

Leu Ala 1115

Leu

íle

Thr

Ala 1120

ACA

CTG

TAC

AAG CTT

GGC TTC

TTC

AAA

CGC

CAC

TAC

AAG

GAA

ATG

CTG

3408

Thr

Leu

Tyr

Lys Leu Gly Phe 1125

Phe

Lys

Arg His 1130

Tyr

Lys

Glu

Met Leu 1135

GAG

GAC

AAG

CCT GAA

GAC ACT

GCC

ACA

TTC

AGT

GGG

GAC

GAT

TTC

AGC

3456

Glu

Asp

Lys

Pro Glu 1140

Asp Thr

Ala

Thr Phe 1145

Ser

Gly

Asp

Asp Phe 1150

Ser

TGT	GTG	GCC	CCA	AAT	GTG	CCT	TTG	TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT	3503
Cys	Val	Ala	Pro	Asn	Val	Pro	Leu	Ser

1155	1160
TATCTCTACC	ACTGTGGGCT	GGACTTGCTT	GCAACCATAA	ATCAACTTAC	ATGGAAACAA	3563
CTTCTGCATA	GATCTGCACT	GGCCTAAGCA	ACCTACCAGG	TGCTAAGCAC	CTTCTCGGAG	3623
AGATAGAGAT	TGTCAATGTT	TTTACATATC	TGTCCATCTT	TTTCAGCAAT	GACCCACTTT	3633
TTACAGAAGC	AGGCATGGTG	CCAGCATAAA	TTTTCATATG	CTTAAGAATT	GTCACATGAA	37 4 3

ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAACTTT AG

3735

213

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 99:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE .

C A) DĹŽKA: 1161 aminokyselín CD) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: proteín

Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID. č.: 99:

Met 1

Thr Phe Gly

Thr 5

Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His

10

15

Gly

Phe

Asn

Leu

Asp

Val

Glu

Pro

Thr

íle

Phe

Gin

Glu

Asp

Ala

20

25

30

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

Leu

Val

35

40

45

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Glu

Val

Ala

Asn

Gin

Thr

Gly

Arg

Leu

50

55

60

Tyr

Asp

Cys

Ala

Thr

Gly

Met

Cys

Gin

Pro

íle

Pro

Leu

His

65

70

75

80

íle

Arg

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

85

90

95

Ser

Thr

Asn

Gly

Ser

Arg

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Leu

His

Arg

100

105

110

Val

Cys

Gly

Glu

Asn

Ser

Tyr

Ser

Lys

Gly

Ser

Cys

Leu

Gly

115

120

125

Ser

Arg

Trp

Glu

íle

Gin

Thr

Val

Pro

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

Cys

130

135

140

Pro

His

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

Gly

Ser

145

150

155

160

íle

Asp

Gin

Asn

Asp

Phe

Asn

Gin

Met

Lys

Gly

Phe

Val

Gin

Ala

Val

165

170

175

Met

Gly

Gin

Phe

Glu

Gly

Thr

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

Met

Gin

Tyr

180

185

190

Ser

Asn

Leu

Lys

íle

His

Phe

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Arg

Thr

Ser

195

200

205

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Pro

íle

Val

Gin

Leu

Lys

Gly

Leu

210

215

220

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Thr

Val

Thr

Gin

Leu

Phe

His

225

230

235

240

His

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Lys

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

Val

íle

245

250

255

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

Glu

Tyr

Ser

Asp

Val

íle

260

265

270

214

Pro

Gin

Ala 275

Glu Lys Ala Gly íle 280

íle Arg Tyr

Ala

íle 285

Gly

Val

Gly

His

Ala

Phe

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asn

Thr

íle

Ser

290

295

300

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

His

Val

Phe

Lys

Val

Asp

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

Leu

Gly

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Gin

Glu

Lys

íle

Tyr

Ala

Val

Glu

325

330

335

Gly

Thr

Gin

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

Ser

Gin

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Ser

Thr

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

355

360

365

Val

Gly

Ser

Phe

Ser

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

Asn

370

375

380

Met

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Glu

Asn

Val

Asp

Met

Arg

385

390

395

400

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Leu

Ala

Leu

Trp

Lys

Gly

Val

405

410

415

Gin

Asn

Leu

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

His

Thr

Gly

Lys

Ala

420

425

430

Val

íle

Phe

Thr

Gin

Val

Ser

Arg

Gin

Trp

Arg

Lys

Ala

Glu

Val

435

440

445

Thr

Gly

Thr

Gin

íle

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Cys

Ser

Val

450

455

460

Asp

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Asp

Leu

íle

Leu

íle

Gly

Ala

Pro

465

470

475

480

His

Tyr

Glu

Gin

Thr

Arg

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Cys

Pro

Leu

485

490

495

Pro

Arg

Gly

Arg

Val

Gin

Trp

Gin

Cys

Asp

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Glu

500

505

510

Gin

Gly

His

Pro

Trp

Gly

Arg

Phe

Gly

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

515

520

525

Asp

Val

Asn

Glu

Asp

Lys

Leu

íle

Asp

Val

Ala

íle

Gly

Ala

Pro

Gly

530

535

540

Glu

Gin

Glu

Asn

Arg

Gly

Ala

Val

Tyr

Leu

Phe

His

Gly

Ala

Ser

Glu

545

550

555

560

Ser

Gly

íle

Ser

Pro

Ser

His

Ser

Gin

Arg

íle

Ala

Ser

Gin

Leu

565

570

575

Ser

Pro

Arg

Leu

Gin

Tyr

Phe

Gly

Gin

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Asp

580

585

590

215

Leu

Thr

Gin 595

Asp

Gly

Leu

Met

Asp 600

Leu

Ala

Val

Gly

Ala 605

Arg

Gly

Gin

Val

Leu 610

Leu

Arg

Ser

Leu 615

Pro

Val

Leu

Lys

Val 620

Gly

Val

Ala

Met

Arg 625

Phe

Ser

Pro

Val

Glu 630

Val

Ala

Lys

Ala

Val 635

Tyr

Arg

Cys

Trp

Glu 640

Glu

Lys

Pro

Ser

Ala 645

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp 650

Ala

Thr

Val

Cys

Leu 655

Thr

íle

Gin

Lys

Ser 660

Ser

Leu

Asp

Gin

Leu 665

Gly

Asp

íle

Gin

Ser 670

Ser

Val

Arg

Phe

Asp 675

Leu

Ala

Leu

Asp

Pro 680

Gly

Arg

Leu

Thr

Ser 685

Arg

Ala

íle

Phe

Asn 690

Glu

Thr

Lys

Asn

Pro 695

Thr

Leu

Thr

Arg

Arg 700

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu 705

Gly

íle

His

Cys

Glu 710

Thr

Leu

Lys

Leu

Leu 715

Leu

Pro

Asp

Cys

Val 720

Glu

Asp

Val

Ser 725

Pro

íle

Leu

His 730

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu 735

Val

Arg

Glu

Pro

íle 740

Pro

Ser

Pro

Gin

Asn 745

Leu

Arg

Pro

Val

Leu 750

Ala

Val

Gly

Ser

Gin 755

Asp

Leu

Phe

Thr

Ala 760

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu 765

Lys

Asn

Cys

Gly

Gin 770

Asp

Gly

Leu

Cys

Glu 775

Gly

Asp

Leu

Gly

Val 780

Thr

Leu

Ser

Phe

Ser

Gly

Leu

Gin

Thr

Leu

Thr

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Val

785

790

795

800

íle

Val

Thr

Val

Trp

Asn

Ala

Gly

Glu

Asp

Ser

Tyr

Gly

Thr

Val

805

810

815

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

His

Arg

Val

Ser

Gly

Ala

820

825

830

Gin

Lys

Gin

Pro

His

Gin

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Ala

Cys

Glu

Thr

Val

835

840

845

Pro

Thr

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Arg

Cys

Ser

Val

Asn

His

850

855

860

Pro

íle

Phe

His

Glu

Gly

Ser

Asn

Gly

Thr

Phe

íle

Val

Thr

Phe

Aso

865

870

875

880

Val

Ser

Tyr

Lys

Ala

Thr

Leu

Gly

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Arg

Ala

Ser

885

890

895

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Ala

Ser

Lys

Ala

Thr

Phe

Gin

900

905

910

216

Leu Glu Leu 915	Pro Val	Lys	Tyr Ala 920	Val. Tyr Thr	Met	íle 925	Ser	Arg	Gin
Glu Glu Ser	Thr Lys	Tyr	Phe Asn	Phe Ala Thr	Ser	Asp	Glu	Lys	Lys
930			935		940
Met Lys Glu	Ala Glu	His	Arg Tyr	Arg Val Asn	Asn	Leu	Ser	Gin	Arg
945		950		955					960
Asp Leu Ala	íle Ser	íle	Asn Phe	Trp Val Pro	Val	Leu	Leu	Asn	Gly
	965			970				975
Val Ala Val	Trp Asp	Val	Val Met	Glu Ala Pro	Ser	Gin	Ser	Leu	Pro
	980			985			990
Cys Val Ser	Glu Arg	Lys	Pro Pro	Gin His Ser	Asp	Phe	Leu	Thr	Gin
995			1000		1005
íle Ser Arg	Ser PrO	Met	Leu Asp	Cys Ser íle	Ala	Asp	Cys	Leu	Gin
1010			1015		1020
Phe Arg Cys	Asp Val	Pro	Ser Phe	Ser Val Gin	Glu	Glu	Leu	Asp	Phe
1025		1030	1035				1040
Thr Leu Lys	Gly Asn	Leu	Ser Phe	Gly Trp Val	Arg	Glu	Thr	Leu	Gin
	1045		1050				1055
Lys Lys Val	Leu Val	Val	Ser Val	Ala Glu íle	Thr	Phe	Asp	Thr	Ser
	1060			1065			1070
Val Tyr Ser	Gin Leu	Pro	Gly Gin	Glu Ala Phe	Met	Arg	Ala	Gin	Met
1075		1080		1085
Glu Met Val	Leu Glu	Glu	Asp Glu	Val Tyr Asn	Ala	íle	Pro	íle	íle
1090			1095		1100
Met Gly Ser	Ser Val	Gly	Ala Leu	Leu Leu Leu	Ala	Leu	íle	Thr	Ala
1105		1110	1115				1120
Thr Leu Tyr	Lys Leu	Gly	Phe Phe	Lys Arg His	Tyr	Lys	Glu	Met	Leu
	1125		1130				1135
Glu Asp Lys	Pro Glu	Asp	Thr Ala	Thr Phe Ser Gly	Asp	Asp	Phe	Ser
	1140			1145			1150
Cys Val Ala	Pro Asn	Val	Pro Leu	Ser

1155 1160

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 100 =

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

C A) DĹŽKA: 1318 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina

CC) POČET REŤAZCOV: jeden

CD) TOPOLÓGIA: lineárna

Cii) TYP MOLEKULY: oDNA

217

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK·.

_< (_xi)	C A) NÁZOV/KEIJČ; CDS C B) UMIESTENIE: 17.. POPIS SEKVENCIE: SEK.	1255 ID. č-	: 100:
AATTCGGCAC	GAGCTT	GGG GCT GTG GTC CTC	CTT GGG	GTC CTG	GCT	TCT
		Gly Ala Val Val Leu	Leu Gly	Val Leu	Ala	Ser
		1 5			10

TAC Tyr

CAC His

GGA Gly

TTC Phe 15

AAC TTG GAC GTG GAT GAG CCG GTG ATC TTC CAG GAA

97

Asn

Leu

Asp

Val

Asp 20

Glu

Pro Val

íle

Phe 25

Gin

Glu

GAC

GCA

GCG

GGC

TTC

GGG

CAG

AGC

GTG

ATG

CAG

TTT

GGA

TCT

CGA

145

Asp

Ala

Gly

Phe

Gly

Gin

Ser

Val

Met

Gin

Phe

Gly

Ser

Arg

30

35

40

CTC

GTG

GGA

GCC

CCC

CTG

GCG

GTG

TCG

GCC

AAC

CAC

ACA

GGA

193

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala

Val

Ser

Ala

Asn

His

Thr

Gly

45

50

55

CGG

CTG

TAC

GAG

TGT

GCG

CCT

GCC

TCC

GGC

ACC

TGC

ACG

CCC

ATT

TTC

241

Arg

Leu

Tyr

Glu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Gly

Thr

Cys

Thr

Pro

íle

Phe

60

65

70

75

CCA

TTC

ATG

CCC

GAA

GCC

GTG

AAC

ATG

TCC

CTG

GGC

CTG

TCC

CTG

289

Pro

Phe

Met

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Met

Ser

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

80

85

90

GCA

GCC

TCC

CCC

AAC

CAT

TCC

CAG

CTG

GCT

TGT

GGC

CCG

ACC

GTG

337

Ala

Ser

Pro

Asn

His

Ser

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Pro

Thr

Val

95

100

105

CAT

AGA

GCC

TGC

GGG

GAG

GAC

GTG

TAC

GCC

CAG

GGT

TTC

TGT

GTG

CTG

385

His

Arg

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Ala

Gin

Gly

Phe

Cys

Val

Leu

110

115

120

CTG

GAT

GCC

CAC

GCA

CAG

CCC

ATC

GGG

ACT

GTG

CCA

GCT

GCC

CTG

CCC

433

Leu

Asp

Ala

His

Ala

Gin

Pro

íle

Gly

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

125

130

135

GAG

TGC

CCA

GAT

CAA

GAG

ATG

GAC

ATT

GTC

TTC

CTG

ATT

GAC

GGC

TCT

'481

Glu

Cys

Pro

Asp

Gin

Glu

Met

Asp

íle

Val

Phe

Leu

íle

Asp

Gly

Ser

140

145

150

155

GGC

AGC

ATT

AGC

TCA

AAT

GAC

TTC

CGC

AAG

ATG

AAG

GAC

TTT

GTC

AGA

529

Gly

Ser

íle

Ser

Asn

Asp

Phe

Arg

Lys

Met

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

160

165

170

GCT

GTG

ATG

GAC

CAG

TTC

AAG

GAC

ACC

AAC

ACC

CAG

TTC

TCG

CTG

ATG

577

Ala

Val

Met

Asp

Gin

Phe

Lys

Asp

Thr

Asn

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Met

175

180

185

CAG

TAC

TCC

AAT

GTG

CTG

GTG

ACA

CAT

TTC

ACC

TTC

AGC

TTC

CGG

625

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val

Leu

Val

Thr

His

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Arg

190 195 200

218

AAC AGC TCC AAT

CCT Pro

CAG GGC CTA

GTG GAG CCC

ATT íle 215

GTG Val

CAG Gin

CTG Leu

ACA Thr

673

Asn

Ser 205

Ser Asn

Gin

Gly Leu 210

Val Glu

Pro

GGC

CTC

ACG

TTC

ACG

GCC

ACA

GGG

ATC

CTG

AAA

GTG

ACA

GAG

CTG

721

Gly

Leu

Thr

Phe

Thr

Ala

Thr

Gly

íle

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Leu

220

225

230

235

TTT

CAA

ACC

AAG

AAC

GGG

GCC

CGC

GAA

AGT

GCC

AAG

ATC

CTC

ATC

769

Phe

Gin

Thr

Lys

Asn

Gly

Ala

Arg

Glu

Ser

Ala

Lys

íle

Leu

íle

240

245

250

GTC

ATC

ACA

GAT

GGG

CAG

AAG

TAC

AAA

GAC

CCC

CTG

CAC

TAC

AGT

GCT

817

Val

íle

Thr

Asp

Gly

Gin

Lys

Tyr

Lys

Asp

Pro

Leu

His

Tyr

Ser

Ala

255

260

265

GTC

ATC

CCA

CAG

GCA

GAG

CAG

GCG

GGC

ATC

CGC

TAC

GCC

ATC

GGG

865

Val

íle

Pro

Gin

Ala

Glu

Gin

Ala

Gly

íle

Arg

Tyr

Ala

íle

Gly

270

275

280

GTG

GGG

GAC

GCG

TTC

CAG

AAA

CCC

ACA

GCC

AGG

CAG

GAG

CTG

GAC

ACC

913

Val

Gly

Asp

Ala

Phe

Gin

Lys

Pro

Thr

Ala

Arg

Gin

Glu

Leu

Asp

Thr

285

290

295

ATC

GCC

TCC

GAG

CCG

CCC

GAC

GCC

CAC

GTG

TTC

CAG

GTG

GAC

AAT

TTC

961

íle

Ala

Ser

Glu

Pro

Asp

Ala

His

Val

Phe

Gin

Val

Asp

Asn

Phe

300

305

310

315

TCA

GCA

CTC

AGC

ATC

CAA

AAG

CAG

CTG

TAT

GAC

AGG

ATC

TTT

GCC

1009

Ser

Ala

Leu

Ser

íle

Gin

Lys

Gin

Leu

Tyr

Asp

Arg

íle

Phe

Ala

320

325

330

GTC

GAG

GGA

ACC

CTG

TCA

TCG

GCA

AGC

ACC

TCC

TTC

CAG

CAT

GAG

ATG

1057

Val

Glu

Gly

Thr

Leu

Ser

Ala

Ser

Thr

Ser

Phe

Gin

His

Glu

Met

335

340

345

TCC

CAA

GAG

GGC

TTC

AGC

TCA

CTT

CTC

ACC

ACG

GAA

GGA

CCG

GTG

CTG

1105

Ser

Gin

Glu

Gly

Phe

Ser

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro

Val

Leu

350

355

360

GGG

GCT

GTG

GGC

AGC

TTC

GAT

TGG

TCC

GGG

GGT

GCT

TTC

CTG

TAC

CCC

1153

Gly

Ala

Val

Gly

Ser

Phe

Asp

Trp

Ser

Gly

Ala

Phe

Leu

Tyr

Pro

365

370

375

CCC

GGC

GGG

AGC

CCC

ACC

TTC

ATC

AAC

ATG

TCT

CAG

AAC

GTG

GAC

1201

Pro

Gly

Ser

Pro

Thr

Phe

íle

Asn

Met

Ser

Gin

Asn

Val

Asp

380

385

390

395

ATG

AGG

GAC

TCC

TAC

CTG

GGT

GAG

GAA

GGG

GTG

GGG

GTG

GGG

ACA

GGT

1249

Met

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Gly

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Gly

Thr

Gly

400 405 410

GGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGGCTG GGAGGGGAGG GAAGAGGAGG 1395

Gly Ser

GGAGAGGCAA AGA

131S

219 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. č.: 101: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

			C A)	DLZKA: 41	3 ani i ne	ikysi	elín
	CEO T Y F’: ani 1 n o l< y s e 11 n a CD) TOPOLÓGIA: lineárna Cli) TYP MOLEKULY: proteín Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEK. ID.	Č.: 101:
Gly 1	Ala	Val	Val	Leu Leu Gly 5	Val Leu	Ala 10	Ser Tyr	His	Gly	Phe 15	Asn
Leu	Asp	Val	Asp 20	Glu Pro Val	íle Phe 25	Gin	Glu Asp	Ala	Ala 30	Gly	Phe
Gly	Gin	Ser 35	Val	Met Gin Phe	Gly Gly 40	Ser	Arg Leu	Val 45	Val	Gly	Ala
Pro	Leu 50	Ala	Val	Val Ser Ala 55	Asn His	Thr	Gly Arg 60	Leu	Tyr	Glu	Cys
Ala 65	Pro	Ala	Ser	Gly Thr Cys 70	Thr Pro	íle	Phe Pro 75	Phe	Met	Pro	Pro 80
Glu	Ala	Val	Asn	Met Ser Leu 85	Gly Leu	Ser 90	Leu Ala	Ala	Ser	Pro 95	Asn
His	Ser	Gin	Leu 100	Leu Ala Cys	Gly Pro 105	Thr	Val His	Arg	Ala 110	Cys	Gly
Glu	Asp	Val 115	Tyr	Ala Gin Gly	Phe Cys 120	Val	Leu Leu	Asp 125	Ala	His	Ala
Gin	Pro 130	íle	Gly	Thr Val Pro 135	Ala Ala	Leu	Pro Glu 140	Cys	Pro	Asp	Gin
Glu 145	Met	Asp	íle	Val Phe Leu 150	íle Asp	Gly	Ser Gly 155	Ser	íle	Ser	Ser 160
Asn	Asp	Phe	Arg	Lys Met Lys 165	Asp Phe	Val 170	Arg Ala	Val	Met	Asp 175	Gin
Phe	Lys	Asp	Thr 180	Asn Thr Gin	Phe Ser 185	Leu	Met Gin	Tyr	Ser 190	Asn	Val
Leu	Val	Thr 195	His	Phe Thr Phe	Ser Ser 200	Phe	Arg Asn	Ser 205	Ser	Asn	Pro
Gin	Gly 210	Leu	Val	Glu Pro íle 215	Val Gin	Leu	Thr Gly 220	Leu	Thr	Phe	Thr
Ala 225	Thr	Gly	íle	Leu Lys Val 230	Val Thr	Glu	Leu Phe 235	Gin	Thr	Lys	Asn 240
Gly	Ala	Arg	Glu	Ser Ala Lys 245	Lys íle	Leu 250	íle Val	íle	Thr	Asp 255	Gly
Gin	Lys	Tyr	Lys 260	Asp Pro Leu	His Tyr 265	Ser	Ala Val	íle	Pro 270	Gin	Ala

220

Glu Gin Ala Gly íle	íle Arg Tyr Ala 280	íle Gly Val	Gly Asp Ala 285	Phe
	275
Gin	Lys Pro Thr Ala	Arg Gin Glu Leu	Asp Thr íle	Ala Ser Glu	Pro
	290	295	300
Pro	Asp Ala His Val	Phe Gin Val Asp	Asn Phe Ser	Ala Leu Ser	Ser
305		310	315		320
íle	Gin Lys Gin Leu	Tyr Asp Arg íle	Phe Ala Val	Glu Gly Thr	Leu
	325		330	335
Ser	Ser Ala Ser Thr	Ser Phe Gin His	Glu Met Ser	Gin Glu Gly	Phe
	340	345		350
Ser	Ser Leu Leu Thr	Thr Glu Gly Pro	Val Leu Gly	Ala Val Gly	Ser
	355	360		365
Phe	Asp Trp Ser Gly	Gly Ala Phe Leu	Tyr Pro Pro	Gly Gly Ser	Pro
	370	375	380
Thr	Phe íle Asn Met	Ser Gin Gin Asn	Val Asp Met	Arg Asp Ser	Tyr
385		390	395		400
Leu	Gly Glu Glu Gly	Val Gly Val Gly	Thr Gly Gly	Ser
	405		410
C 2)	INFORMÁCIE 0	SEK. ID. č.:	102 :
	C 1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
	C A) DĹŽKA: 1484 párov báz
	C B) TYP: nukleová kyselina
	CC) POČET REŤAZCOV:	jeden
	CD) TOPOLÓGIA: Hne	ár na
	Cii) TYP MOLEKULY: cDNA

Cix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

	C A) NÁZOV/KLĹIČ: C B) UMIESTENIE: Cxi) POPIS SEKVENCIE: S	CDS 1. . EK.	1482	: 11	32 :
ID.	č.
GAT	GTC CAG AGC TCC ATC AGC TAT	GAT	CTG	GCA	CTG	GAC	CCA	GGC	CGC
Asp 1	Val Gin Ser Ser íle Ser Tyr 5	Asp	Leu 10	Ala	Leu	Asp	Pro	Gly 15	Arg
CTG	GTC TCT CGG GCC ATT TTT CAA	GAG	ACC	CAG	AAC	CAG	ACT	TTA	ACT
Leu	Val Ser Arg Ala íle Phe Gin 20	Glu 25	Thr	Gin	Asn	Gin	Thr 30	Leu	Thr
CGA	AGG AAG ACC CTG GGG CTG GGG	CGT	CAC	TGT	GAA	ACC	ATG	AGG	CTA
Arg	Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly 35 40	Arg	His	Cys	Glu	Thr 45	Met	Arg	Leu
CTT	TTG CCA GAC TGC GTA GAG GAC	GTG	GTG	AAC	CCC	ATC	GTC	CTG	CAC
Leu	Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp	Val	Val	Asn	Pro	íle	Val	Leu	His

55 60

4

192

221.

CTC AAC

TTC Phe

TCC CTG

GAG Glu 70

GGA CAG

CCA Pro

ATC íle

CTC Leu 75

TCA Ser

TCC CAG

AAT Asn

CTG Leu 80

240

Leu 65

Asn

Ser

Leu

Gly

Gin

Ser

Gin

CGC

CCT

GTG

CTG

GCC

ACG

GGC

TCG

CAG

GAC

CAC

TTC

ATT

GCC

TCC

CTC

288

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Phe

íle

Ala

Ser

Leu

85

90

95

CCC

TTT

GAG

AAG

AAC

TGC

GGA

CAA

GAT

CGC

CTG

TGT

GAG

GGG

GAC

CTG

336

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Gly

Gin

Asp

Arg

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

100

105

110

AGC

ATC

AGC

TTC

AAC

TTC

TCG

GGC

TTG

AAT

ACC

CTG

GTG

GGG

CTC

384

Ser

íle

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Asn

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

115

120

125

TCC

CTG

GAG

CTC

ACA

GTG

ACA

GTG

ACC

GTG

CGG

AAT

GAG

GGC

GAG

GAC

432

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

130

135

140

TCC

TAT

GGG

ACC

GCC

ATC

ACC

CTC

TAC

CCA

GCA

GGG

CTA

TCC

TAC

480

Ser

Tyr

Gly

Thr

Ala

íle

Thr

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

145

150

155

160

AGG

CGG

GTG

TCG

GGC

CAG

ACA

CAA

CCC

TGG

CAG

CGC

CCC

CTG

CAC

CTC

528

Arg

Val

Ser

Gly

Gin

Thr

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

His

Leu

165

170

175

GCA

TGT

GAG

GCT

GTA

CCT

ACC

GAG

AGC

GAG

GGC

TTG

AGG

AGT.

ACC

AGC

576

Ala

Cys

Glu

Ala

Val

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Thr

Ser

180 185 190

TGC AGC GTC

AAC Asn

CAC His

CCC ATC

TTC Phe 200

CAA GGG GGT GCT

CAG GGC ACT Gin Gly Thr 205

TTC Phe

624

Cys

Ser

Val 195

Pro

íle

Gin

Gly Gly Ala

GTA

GTC

AAG

TTC

GAT

GTC

TCC

AAG

GCC

AGC

CTG

GGT

GAC

AGG

TTG

672

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

210

215

220

CTC

ATG

GGG

GCC

AGT

GCC

AGC

AGT

GAG

AAT

AAG

CCT

GCG

AGC

AAC

720

Leu

Met

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

AA.G

ACC

TCC

TTT

GAG

CTG

GAA

CTG

CCA

GTG

AAA

TAC

GCT

GTC

TAC

ATG

768

Lys

Thr

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Met

245

250

255

ATG ATC

ACA AGG CAC GAA

GGC TCC ACC AGG TTC TTC

AAC Asn

TTT Phe 270

TCC Ser

ACT Thr

816

Met

íle

Thr Arg 260

His

Glu

Gly Ser

Thr 265

Arg

Phe

TCC

GCT

GAG

AAG

AGC

AAA

GAG

GCC

GAG

CAC

CGC

TAT

CGG

GTG

AAC

864

Ser

Ala

Glu

Lys

Ser

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

275

280

285

AAC

CTG

AGT

CTG

CGA

GAT

GTG

GCC

GTC

AGC

GTG

GAC

TTC

TGG

GCC

CCC

912

Asn

Leu

Ser

Leu

Arg

Asp

Val

Ala

Val

Ser

Val

Aso

Phe

Trp

Ala

Pro

290

295

300

222

GTG Val 305

CAG Gin

CTG AAC GGA Leu Asn Gly

GCA GCT Ala Ala 310

GTG Val

TGG GAC GTG

GCG Ala

GTG GAG GCC CCT

960

Trp

Asp

Val 315

Val

Glu

Ala

Pro 320

GCC

CAG

AGC

CTG

CCC

TGT

GCG

CGG

GAG

AGG

GAA

CCT

CCG

AGG

ACC

TCT

1008

Ala

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Glu

Pro

Arg

Thr

Ser

325

330

335

GAC

CTG

AGC

CGG

GTC

CCG

GGG

AGT

CCC

GTG

CTG

GAC

TGC

AGC

GTT

GCG

1056

Asp

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Val

Leu

Asp

Cys

Ser

Val

Ala

340

345

350

CAC

TGC

CTG

AGG

TTC

CGC

TGC

CAC

ATC

CCC

TCC

TTC

AGC

GCC

AAG

GAG

1104

His

Cys

Leu

Arg

Phe

Arg

Cys

His

íle

Pro

Ser

Phe

Ser

Ala

Lys

Glu

355

360

365

GAG

CTC

CAC

TTC

ACC

CTG

AAG

GGC

AAC

CTC

AGC

TTC

GCC

TGG

GTC

AGC

1152

Glu

Leu

His

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Trp

Val

Ser

370

375

380

CAG

ATG

CTG

CAA

AAG

GTG

TCG

GTG

AGT

GTG

GCC

GAG

ATC

ACC

1200

Gin

Met

Leu

Gin

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Val

Ala

Glu

íle

Thr

385

390

395

400

TTC

AAC

AGG

GCC

GTG

TAC

TCC

CAA

GTT

CCG

GGC

GAG

CCC

TTT

ATG

1248

Phe

Asn

Arg

Ala

Val

Tyr

Ser

Gin

Val

Pro

Gly

Glu

Pro

Phe

Met

405

410

415

AGA

GCC

CAG

GTG

GAG

ACG

GTG

CTG

GAG

TAT

GAG

CAC

GAC

CCC

1296

Arg

Ala

Gin

Val

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

His

Asp

Pro

420

425

430

GTC

CCC

CTG

GTG

GGC

AGC

TGT

GTG

GGC

CTG

GCT

1344

Val

Pro

Leu

Val

Gly

Ser

Cys

Val

Gly

Leu

Ala

435

440

445

CTC

ATC

TCA

GCC

ACC

CTG

TAC

AAG

CTT

GGC

TTC

AAG

CGC

CGG

TAC

1392

Leu

íle

Ser

Ala

Thr

Leu

Tyr

Lys

Leu

Gly

Phe

Lys

Arg

Tyr

450

455

460

AAG

GAG

ATG

CTG

GGC

GAG

AAA

CCG

GGA

GAC

GCG

GCC

ACC

TTC

CCC

GGG

1440

Lys

Glu

Met

Leu

Gly

Glu

Lys

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Phe

Pro

Gly

465

470

475

480

GAG

GAC

GCC

AGC

TGC

GGG

GCT

TCA

GAT

TTG

CCT

TTG

TCC

CAG

1482

Glu

Asp

Ala

Ser

Cys

Gly

Ala

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Ser

Gin

485

490

TG 1484

C 2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.: 103:

C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

( A ) DĹŽKA: 494 am 1 n o k y s e 1 í. n CE3) TYP: aminokyselina C D ) ľ OP OL ÓGIA = 11 n e á r n a

Cii) TYP MOLEKULY: protein

223

(xi) POPIS SEKVENCI

Έ: Ser

SEK. ID

i. č Leu 10

.: 103:

Asp 1

Val

Gin Ser Ser 5

íle

Tyr

Asp

Ala

Leu

Asp

Pro

Gly 15

Arg

Leu

Val

Ser

Arg

Ala

íle

Phe

Gin

Glu

Thr

Gin

Asn

Gin

Thr

Leu

Thr

20

25

30

Arg

Lys

Thr

Leu

Gly

Leu

Gly

Arg

His

Cys

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

35

40

45

Leu

Pro

Asp

Cys

Val

Glu

Asp

Val

Asn

Pro

íle

Val

Leu

His

50

55

60

Leu

Asn

Phe

Ser

Leu

Glu

Gly

Gin

Pro

íle

Leu

Ser

Gin

Asn

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Val

Leu

Ala

Thr

Gly

Ser

Gin

Asp

His

Phe

íle

Ala

Ser

Leu

85

90

95

Pro

Phe

Glu

Lys

Asn

Cys

Gly

Gin

Asp

Arg

Leu

Cys

Glu

Gly

Asp

Leu

100

105

110

Ser

íle

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Leu

Asn

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

115

120

125

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Val

Thr

Val

Arg

Asn

Glu

Gly

Glu

Asp

130

135

140

Ser

Tyr

Gly

Thr

Ala

íle

Thr

Leu

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Ser

Tyr

145

150

155

160

Arg

Val

Ser

Gly

Gin

Thr

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

His

Leu

165

170

175

Ala

Cys

Glu

Ala

Val

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

Gly

Leu

Arg

Ser

Thr

Ser

180

185

190

Cys

Ser

Val

Asn

His

Pro

íle

Phe

Gin

Gly

Ala

Gin

Gly

Thr

Phe

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

210

215

220

Leu

Met

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Asn

Lys

Pro

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

Lys

Thr

Ser

Phe

Glu

Leu

Glu

Leu

Pro

Val

Lys

Tyr

Ala

Val

Tyr

Met

245

250

255

Met

íle

Thr

Arg

His

Glu

Gly

Ser

Thr

Arg

Phe

Asn

Phe

Ser

Thr

260

265

270

Ser

Ala

Glu

Lys

Ser

Lys

Glu

Ala

Glu

His

Arg

Tyr

Arg

Val

Asn

275

280

285

Asn

Leu

Ser

Leu

Arg

Asp

Val

Ala

Val

Ser

Val

Asp

Phe

Trp

Ala

Pro

290

295

300

224

Val Gin Leu Asn Gly Ala	Ala Val	Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro
305	310	315	320
Ala Gin	Ser Leu Pro Cys	Ala Arg	Glu Arg Glu Pro Pro Arg	Thr Ser
	325		330	335
Asp Leu	Ser Arg Val Pro	Gly Ser	Pro Val Leu Asp Cys Ser	Val Ala
	340		345 350
His Cys	Leu Arg Phe Arg	Cys His	íle Pro Ser Phe Ser Ala	Lys Glu
	355	360	365
Glu Leu	His Phe Thr Leu	Lys Gly	Asn Leu Ser Phe Ala Trp	Val Ser
370		375	380
Gin Met	Leu Gin Lys Lys	Val Ser	Val Val Ser Val Ala Glu	íle Thr
385	390		395	400
Phe Asn	Arg Ala Val Tyr	Ser Gin	Val Pro Gly Glu Glu Pro	Phe Met
	405		410	415
Arg Ala	Gin Val Glu Thr	Val Leu	Glu Glu Tyr Glu Glu His	Asp Pro
	420		425 430
Val Pro	Leu Val Val Gly	Ser Cys	Val Gly Gly Leu Leu Leu	Leu Ala
	435	440	445
Leu íle	Ser Ala Thr Leu	Tyr Lys	Leu Gly Phe Phe Lys Arg	Arg Tyr
450		455	460
Lys Glu	Met Leu Gly Glu	Lys Pro	Gly Asp Ala Ala Thr Phe	Pro Gly
465	470		475	480
Glu Asp	Ala Ser Cys Gly	Ala Ser	Asp Leu Pro Leu Ser Gin
□	485		490

225

7(/ -V

PATENT O V É

Claims

N Á R O K Y

1. Hybridóm označený 199M.

2. Monoklonálna protilátka sekretovaná hybridómom nároku 1.

podlá

U* P*» O c lt>

r·*» r* o cn Oh o to r**, oo «3- «T cn Oh cn pH r—í r-{

LO Px 00 cm ej cm

7/ W-7· to p** co Oh OY Oh CM CM CM nD TF-GT—-VLL LSVLASYIIGF NLDVEEPTIF QEDAGGFGQS VVQFGGSRLV CDllo MA-LR--VLL LTALTLCIIGF NLDTENAMTF QENARGFGQS VVQLQGSRVV CDllc HTRTRAALLL FTALATSLGF NLDTEELTAF RVDSAGFGDS VVQYANSWVV

CD CD CD —1 —J —J OO 00 00 >5» >

S CC UJ UJ O.> OCC Q. Q►O· 5» = ao tí UJO = acs Q-O-O. CSCSCS UJ CJ UJ o- os o

I--ICC c c 00

OLU>

O-O-O.

5» U.-J H-^sas 000 t—(o. hHd-J LUOO

I

I -J I dZH OO OO O.

-ju-u. —ÍLU Sní ZliíZ OO OO OO > >- U. 000

555

C 00 00

LuLuLu -1-10 H- k— HqScoo H-OO O. cdímSos LU^CO U.UL· αασ CD UJ 00 es os es CCC CD CD CD zz>

H OH S UJ «c u- 2=

CC CC 3 <0000 H^z O.UIOS CD 00 Z CD CC O Lu Lu Lu

ŠSS

CD CD CD eJUJcc H-os =

-Jaso ►—< ►—t CD CD < h-H-H CCC >->> CD CD CD ►—<►—4 1—1 OC >->->OS OS OS UJ UJUH UJ>UJ CD CD CD CUJC

O-OS CD CD CD CD •y y h- H-F— ^zc Ult-I W —J U- —J > >S> L.z> LUQQ 0.0. o_ o Ul Ul —J -1 -J -J LuLu SoôS H“>— j— -j os Lu CJ CJ CJ CS CJCJ > CD CD CD o. αία. zcoc 00 —J—I U. U. U. iaS-JO HHH cs cs cs CD CD CD CDUJZS «—I —J —S h-H-h- SxSStfSX 000 OOO c 00 00 OO > —J y y y 3» H“ 2 00 ui2 c>“ >“ >->->- OQSh- uj uj í> >->->- <Q CD OO h-X Z OS C 0-0-00 LU CD O CJ CS CJ Lu Lu Lu O SaS C -l-l-J □ 00 UJUIOS 002 1 0.0.00 >->->- CD 00 CD zzos -J-J-J 000 —J -J —I CJ CS CJ 00.00 00 00 00 s2cdcd OS 00 CD 5» h-UI o u-i 00 O OS —I >-LuUJ CD CD CD OSO = ·—1 1—< ►—< OO-O. SxSStfSSxS h— COUJ 2Z ZC ZS 00 00 00 0022 OLU^ OOO CD CD CD 0.0.00 CD CD CD 222 H- H H- 00 00 00 (ZJZh OOO

sss

Ϊ» >» UJ ϊ> ►—I UJ UJUJiaZ O

o. O. O.

CD CS CD CJ O O

333

CD CS CD □ dd WHW -J-J-J Lu Lu U.

HZK OSOQS LU Lu U. oujui

ĽiaCUI Lu Lu

HHH

MMUJ >5»>

H>H

O. O. U. CCC CD CD CD >?>> osoo 00 0-00 cd a. o. 200 00 U-1 UJ UJ QOO xoo3 UJ 0 UJ fcfct ΗΗΗ ieSLuuH CCC OOZQ CS (J CS O CS O a 0 CS U rH rH rH r-í pH rH rJ rH rH rH rH pH pH rH HH rH rH rH rH QQQ QOO QOO QOO QOO a cj cs a cscj a cs cs a cjcj a eso

CD r-j '<C or

OQ

CD od QEĽNTISSAP PQDIIVFKVDN FAALGSIQKQ LQEKIYAVEG TQSRASSSFQ 346 CDIIb QELNTIASKP PRDIIVFQVNN FEALKTIQNQ LREKIFAIEG TQTGSSSSFE 347 CDllc KELNDIASKP SQEIIIFKVED FDALKDIQNQ LKEKIFAIEG TETISSSSFE 348

O CO σι ολ en ofsco rr «3· rr rr rr vo r^.oo cr> Ch oS <3vo p* r* rr rr <T intntn

5>m>· UJ Z UJ 0.0.0. OLtlUJ zoz <<< -JJ-J UJ UJ UJ UJ 5u UJ 0.0.0. OOO OZO ^etnx O LJU 0.0.0. tn h- tn az ixi az >>> <<< S s x 222 tntntn OOO ZZ z ZZ o S o >» >1 HM ►—<»—( HM UM 1—( azazaz ooo <« LlLlLu tn h- tn OOO h- H- F— > z> OOO OOO o-tn c— OOO azazaz WHH tn tn h- az i—c t— F—F· —J—1—J suj2z U- U- U. o oo ^c^c^ ziťz U-t 2ζ HM UJ UJ UJ OOO o-tn o. > >->->- LU OO O. H· O. <>< >->->- Z Z SZ >->>- -j £2 ZZ zz ZZ —* > >» -J -J -J ooo 0-0. o. OOO Lx.Lx.Lj- f— t—1 U-c «C «X «c OOO O< O O ZZ ooo -J-J-I

OOO OOO J—< >—< j—( OOO >->->· —l-J-J F· F· F· tn <c tn azazaz UMÍ>>» -l-J-J T ~T o. o. o. -J -J-J *£«C<C tnoF- <c<r OOO <<< u->-Ll. OOO h“ H· h· OOO tntntn -J -J -J tn tntn Lx. Ix. Li- OOO > z> OOO CÍ CC CC >>> —1 —J —1 ozo OOO z tn tn tntnn· 222 o tn o OOO ooo 0.0.0. —j —j >z*s> z»z>s> U. -J z> O CC o OOO OOO —10.0. bCZisC OOO OOO 3K3 tn tntn UJ LU LU ozo —J —J —J OOO OOO stno. P- l·— h- 3G3 -J-J—J tntntn az>~>—l-J-J —iumLl. <o LU <C LU sss >>> <<<

oss σι σ*ι o*» m in in ooo tntntn ooo Li- Lx. lx. >->->ooo z az az o. o. tn tn tntn

OKO tntntn tnOO <<<

CCOZOC ooo intntn tntntn O-O-O. tOtOtO HM UM UM ootn tn tno. luoo (/)(/) -J <C h— > ooo

F-<< tn< tn Lx. U- Lx. OOO ZSS tntntn >->->- >->·>- OCJO LuU-Lu U- U- Lx. OOO tn«xtn ξ» Mg —J —1 —J OOO —J—J —J OOO >->“> LU LU UJ >->->- WUMH ΟΟΖ3 >>5u OOO tnetn OOO XZCC <<< tnin«c OOO F-F-h- az cccc OOO —i— —L· CC Z CC OOO 003 azazaz UJ UJ LU SSS fr-SnÍHM OOO zzz — Z—1 OOO >5>> ccccec UJOLU Q (J Q O Q (J o o ω u rM r—1 HH rM rM rM rM HH hM rM r—1 rM rM rM HH r—1 rM Q O O Q O O Q O O OOO OOO e o o acJCJ a ο o a oo aoo

CQ r*M '<Ľ cc

CO

CD od GLMDLAVGAR GQVLLLRSLP VLKVGVAMRF SPVEVAKAVY RCWEEKPSAL 646 CDlln GLVDLTVGAQ GHVLLLRSQP VLRVKAIMEF HPREVARHVF ECNDQVVKGK 647 CDllc GLVDLAVGAR GQVLLLRTRP VLWVGVSMQF IPAEIPRSAF ECREQVVSEQ 647 <r σιοσ) O CO LO «r «τ <r *3q-ss οσιο r*, cr cr cr r* co oo CO

CO Z Z CO Ch <71 00 00 00

z sz z OCDGÍ czxdcz) 33b CD CD—J Z Z Z cd CD o Z Z CD ZZZ tZ) C·«£ G. CZ) Z ococz l·— CZ) 3» ZZZ H“ 0> Z -J3-J 223 zzo W-l-J -J Z -j C CZ) CZ) Z Z ĽL· ZZZ h-ocz) CZ) Z Z 1 CZ) G. 1—( > t—< ZF^ QO^ ααζ 1 O CZ) sss CC CD CD >5>5> —J -J Z CD CZ) CD Z CZ) o G. Z CD 1 í* > 1 OO L/) CZ) CU ZZZ WZQ. ooo cz)c/)Z ZZZ U.L.LÍ. CZ)H-H —J cu. —J CZ) CZ) CZ) OOO Š53 os oí gí sh ap ry -JU.U. «CZ CD CD CD CD ZZZ h-H-CZ) CDh-LU U. LU U. Z QC CC >» HM HM CZ)CZ)< Hh-h αο<ς -j-jJ Z —J Z HM >· HM CD CZ) CD ZZZ > 2> H HM ľ 1 333 HM H-» H-( zzz LU 1 I G- CL· Z goz z>->- h- l 1 O OO CZ) CZ) HM Z O § CZ) CZ) CZ) CD 1 1

Lx. >** -J ooo -J —I -J ZZO Z F— h— :> o- cz) -J HM HM CD O CD cz>cz)«r CDZCD 3* D> D*· CO Cäj CO CD SCO <—K CZ) > CZ) ZZZ OOO zzz Z Z CD CZ) CZ) CZ) ooo >HM> CDO§ >-zz ZZZ O O O >-ZcZ) zzz HM HM Z Q3ECZ) OOO o z z HM HM HM ooo g. o- o. 2C 3b Z CZ) h- h- ZZZ CD CD z —J -J —J z z z 1 Z CZ) —I O -J LU LU LU >Sf zzz ( Z CD -JJ-J Z Z Z H· H· h“ 3> HM HM -1J-J Z zz CDZCD CZ) CZ) Z OZZ Z Z z ZZZ >>>“ OOO O O 2b h- H- 2b CZ)-J CZ) CZ) CZ) CZ) Z CZ) CZ) —IZiť! LULU LU <<< ooo CZ) 1— 1— CZ) J—CZ) CZ) CZ) z OOO fcfcfc zzz CD CD (D CZ) CZ) CZ) z^c i ooo H<O< CD h- Ϊ2 ZZ>C3 Z Z <oo z z š CD<f- h-Ohm -J—1-J ooo 3 Z 3 z cd cd

H*· S CD (D CD CZ)«C«£ s> >> i CZ)O U aaJ mJ J «hJ «u CDOZ H-ZX t >cz) ooo H- > > LU >>>» Q z CD >» J> HM ŕ-ZZ L·: o z GF> 333 z z z >>< Zh> Z CZ) z 1—OZ >>-x zzz Z CZ) 1 OZO H- Z CZ) zzz zzz x< CD CD zzz zzz zzz Z CZ) CZ) £ «J Z Z CZ) zzz zzz zzo Z Z H- G. CZ) Z zzz C/) zz ooo

m o Q O Q u ca u Q U z z zz z z z z zz pH hM z z z z z z z z ooo QQO ooo Q OO ooo e o o a oo a o o a oo aoo

c_o

CD hm '<C

C£L

CO

CD nD DRMĽMRASAS SENNKASSSK ATFQLELPVK YAVYTMISRQ EESTKYFNFA 938 CDIId NKLLLKANVT SENNMPRTNK TEFQLELPVK YAVYMVVTSH GVSTKYLHFT 943 CDllc DRLLLIAHVS SENNIPRTSK TIFQLELPVK YAVYIVVSSII EQFTKYLNFS 941

ľ>HO ΙΌΗΟ LfíHO LDHO Hmm ao en en ne cr co a·» cn ro er er o in o οσίοι o o o o o e HHH HHH Hrt rl HrtH rM rM rM

Q-U = aoa es os es ΧΣΧ < h-CZ) > h-o ui a ui UIS»S> CZ) O CZ) Lx.Lx.Lx. SOU Lx» LX» U. 5 o 5 >->-> >c.> CZ) Lx- CZ) ZOO >CSQ 0-0-0- a a a ZOSOS §§š > HM s* OOO aao 0.0-0- LX.LX.LX. O C_> C_5 _j -j -j Lx.lx.Ui <>»< es σ es a-ia ooo > h Ul LX. HM LX. cz) o cz) —I—1> ooo a es os Z 2= 2= OOO > > >· >->->- -J-JJ O <-) o CZ) CZ) CZ) OOO O fiSUl a >· cd H—OH- <s< S* > <<< aza a. o. o. t—-(»—1 ►—( LX.LX.LX. f— H-H- CZ) 1 CZ) CZ) CZ) H- —J HM »—1 »—-t ►—1 o c —J 3 OO o ►—( t—J1—C —1—10 Q. 1 Ul U. L·. U. ozo Ul Ul Ut <<< > 1 CZ) z>z —I>- -J <<< ooo zoo. W-Jw Σ >· H- > ooo Q. O. Ct. CZ) CZ) CZ) O. O. O. CZ) CZ) CZ) ooo <- l 1 H-C HM => t/)«=Z cs^2^s >>>- ooo > 1 1 <£C-O. OO —J D»hm> <OO O OO O 1 1 co os a O O CZ) CZ) 1 1 Q CZ) Q HM —1 HM SÉg > > HM Lx. I 1 CS CSCS auiz CZ) CZ) CZ) auícz) ooo cz>oo ZSS o = 3 CZ) CZ) CZ) ooo o < o. OOH- —J -J —J LX.lX.Lx. O CZ) O 2Z => CZ) O. O 2= 2= se aa a h- H- HM uiSsa O< HM HM Lx. I 1 zenz CZ) CZ) CZ) 1—( OO h- l l > —* > zz< cshď; O. 0.0. < O· H· OÍC3G acz)cu Šcšžä W-JH H* O O >->->- O- Q- O. <0.0. 1 1 z eac; Q-O< oao i i ui 2Z s z iSCSHM Lx. U. L·. >-Q-Z 1 1 Ο- oag CSUIiS UlixSlxJ CZ) CZ) CZ) 0—1-J SSS ι 1 < 1 1 HM LU>> CZ) h-CZ) zzz au->Lxj Q. Ss i i O íscsz >zcz> ooo 1 1 o Ženez) ooo UllXlUI 1 1 z l h-CS O—1—1 =ťS>! ΣΗΗ ao< Ul utz^s 1 CZ) O O. CZ) CZ) fcSĽ Ul Ul Lxj a. cz) ut a uiui —JOO. aza UIUI HM ihS 1 1 1 1 Ul CZ)ZZ o u. o §c5c5 a i i CZ) CZ) CZ) 01x10 UJ Ul Ul Ul 1 1 h— < UJ CZ) CZ) Q- Ul UJ Ul <CZ)< -1ΣΣ

CD '<T or

CQ

CD

a u a ω Q O Q U D U rM t—1 HH rM r—i i—l rM HH rM rM rM rM rM t-< rM rM rM rM aaa q aa aao aao □ ao ä o o tí o o tíOO tíOO tí o o