SK140699A3

SK140699A3 - Amidine derivatives, preparation method thereof, compositions containing them and their use for the treatment

Info

Publication number: SK140699A3
Application number: SK1406-99A
Authority: SK
Inventors: James Macdonald; James Matz; William Shakespeare
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2000-06-12
Also published as: AU734394B2; DK0983266T3; PT983266E; CA2287999A1; EP0983266A1; ZA983740B; DE69802923T2; JP2001523263A; EE9900475A; KR20010012227A; AR012602A1; ATE210661T1; MXPA99009874A; AU7460098A; DE69802923D1; HUP0003766A2; US6166030A; NZ500676A; TR199902719T2; NO995404D0

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka nových amidínových derivátov, spôsobov ich prípravy, kompozícií, ktoré ich obsahujú a ich použitia na liečenie.

Doterajší stav techniky

Oxid dusičný sa produkuje v bunkách cicavcov z L-arginínu pôsobením špecifických syntáz oxidu dusičného (NOS). Tieto enzýmy spadajú do dvoch rozličných tried - konštitutívnej NOS (cNOS) a indukovateľnej NOS (iNOS). Doposiaľ boli identifikované dve konštitutívne NOS a jedna indukovateľná NOS. Z konštitutívnych NOS endotelový enzým (ecNOS) je zapojený do relaxácie hladkého svalstva a regulácie krvného tlaku a prietoku krvi, zatiaľ čo neurónový enzým (ncNOS) slúži ako neurotransmiter a javí sa, že je zapojený do regulácie rôznych biologických funkcií, ako je cerebrálna ischémia. Bola preukázaná účasť indukovateľnej NOS pri patogenéze zápalových ochorení. Špecifická regulácia týchto enzýmov by mala preto poskytnúť značný potenciál pri liečbe širokého spektra chorobných stavov.

Ako inhibítory NOS boli opísané zlúčeniny rôznych štruktúr a bolo nárokované ich použitie v terapii. Pozri napríklad patent WO 95/09 619 (The Wellcome Foundation) aWO 95/11 231 (G. D. Searle). Prihlasovateľ predtým opísal v patente WO 95/05 363 a vo WO 96/01 817 amidínové deriváty, ktoré sú NOS inhibítormi, ktoré vykazujú určitú selektivitu pri inhibícii neurónového enzýmu, ncNOS.

Teraz je opísaná skupina amidínov, ktoré spadajú do všeobecného rozsahu patentu WO 96/01 817, ale ktoré nie sú špecificky doložené príkladmi v patente WO 96/01 817. Tieto zlúčeniny vykazujú prekvapivo výhodné vlastnosti a sú predmetom predloženej prihlášky vynálezu.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka zlúčeniny všeobecného vzorca I

Ri v ktorom

R¹ predstavuje 2-tienylový alebo 3-tienylový kruh; a

R² znamená C1-C4 alkyl;

a ich optické izoméry a racemáty a ich farmaceutický prijateľné soli.

Výhodne R¹ predstavuje 2-tienyl.

Predovšetkým výhodné zlúčeniny podľa vynálezu zahrňujú:

N-(2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

N-(2-izopropyl-1_l2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid; N-(2-etyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid; N-(2-propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yi)-2-tiofénkarboximidamid; N-(2-metyl-1₎2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-3-tiofénkarboximidamid; a ich farmaceutický prijateľné soli.

Špecificky výhodnou zlúčeninou podľa vynálezu je: N-(2-metyl-1,2_I3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid; a jeho farmaceutický prijateľné soli.

Pokiaľ nie je uvedené inak, tu uvedený pojem “C1-C4 alkyl označuje alkyiovú skupinu s priamym alebo rozvetveným reťazcom s počtom atómov uhlíka od 1 do 4. Príklady takýchto skupín zahrňujú metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl a terc-butyl.

Predložený vynález zahrňuje zlúčeniny vzorca I vo forme solí, najmä kyslých adičných solí. Vhodné soli zahrňujú také soli, ktoré sa tvoria ako s organickými tak i s anorganickými kyselinami. Takéto kyslé adičné soli budú bežne farmaceutický prijateľné, hoci soli farmaceutický neprijateľných kyselín sa môžu využiť pri príprave a čistení uvedenej zlúčeniny. Výhodné soli teda zahrňujú soli, ktoré vzniknú s použitím kyseliny chlorovodíkovej, bromovodíkovej, sírovej, fosforečnej, citrónovej, vínnej, mliečnej, pyrohroznovej, octovej, jantárovej, fumarovej, maleínovej, metánsulfónovej a benzénsulfónovej.

Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy zlúčenín vzorca I a ich optických izomérov a racemátov a ich farmaceutický prijateľných solí, ktorý zahrňuje:

a) prípravu zlúčeniny vzorca I reakciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca II

R-’ kde R² má vyššie uvedený význam, so zlúčeninou vzorca III alebo jej kyslou adičnou soľou

NH

kde R¹ má vyššie uvedený význam a L predstavuje odštiepiteľnú skupinu;

b) prípravu zlúčeniny vzorca I reakciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca IV (IV) hä.h₂n

kde R² má vyššie uvedený význam a HA znamená kyselinu, so zlúčeninou vzorca V

R¹—=N (V) kde R¹ má vyššie uvedený význam;

c) prípravu zlúčeniny vzorca I reakciou zlúčeniny vzorca VI

kde R¹ má vyššie uvedený význam, so zlúčeninou vzorca VII

R² - L (VII) kde R² predstavuje C1-C4 alkyl a L znamená odštiepiteľnú skupinu; alebo

d) prípravu zlúčeniny vzorca I, v ktorom R² predstavuje metyl, reakciou zlúčeniny vzorca VI s formaldehydom a kyselinou mravčou;

a kde sa vyžaduje alebo je nevyhnutná konverzia získanej zlúčeniny vzorca I alebo jej ďalšej soli na jej farmaceutický prijateľnú soľ alebo naopak, a kde sa vyžaduje konverzia získanej zlúčeniny vzorca I na jej optický izomér.

V spôsobe a) sa reakcia uskutočňuje miešaním zmesi reaktantov vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v N-metyl-2-pyrolidinóne alebo v nižšom alkanole, ako je etanol, izopropanol alebo terciárny butanol, pri teplote medzi laboratórnou teplotou a teplotou refluxu rozpúšťadla. Doba reakcie bude závisieť okrem iného od rozpúšťadla a vlastností odštiepiteľnej skupiny a môže byť až 48 hodín; avšak typicky bude od 1 do 24 hodín. Vhodné odštiepiteľné skupiny, ktoré L môže predstavovať, zahrňujú tioalkylovú, sulfonylovú, trifluórmetylovú sulfonylovú, halogenidovú skupinu, alkylakoholy, arylalkoholy a tozylovú skupinu; ďalšie sú vymenované v “Advanced Organic Chemistry”, J. March (1985), 3th Edition, strana 315, a sú dobre známe v odbore.

V spôsobe b) sa reakcia výhodne uskutočňuje refluxovaním zmesi dvoch zlúčenín počas niekoľkých hodín v prítomnosti vhodného rozpúšťadla, pričom je reakčná teplota dostatočne vysoká, takže kondenzácia sa uskutočňuje ľahko, ale nie je dosť vysoká na to, aby sa vytvorený amidín rozkladal. Reakčná teplota sa môže meniť v rozmedzí od laboratórnej teploty do približne 250 °C, hoci je výhodné reakciu uskutočňovať pri teplotách približne od 100 °C do 200 °C. Zistili sme, že predovšetkým vhodným rozpúšťadlom je o-dichlórbenzén. Taktiež sme zistili, že často je užitočné pridať 4-dimetylaminopyridín ako katalyzátor. Pri ochladzovaní sa vytvárajú dve vrstvy, rozpúšťadlo možno dekantovať a reakciu sa môže spracovať pridaním vodnej zásady. Prípadne ak sú reaktanty rozpustné v rozpúšťadle, rozpúšťadlo sa môže odpariť vo vákuu a reakčná zmes sa môže spracovať pridaním vody. Kyselinou HA môže byť organická alebo anorganická kyselina, napríklad kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová, dusičná, fosforečná, octová, mliečna, jantárová, fumarová, jablčná, maleínová, vínna, citrónová, benzoová alebo metánsulfónová. Výhodné je, ak HA predstavuje halogénvodíkovú kyselinu.

V spôsobe c) sa reakcia uskutočňuje pri štandardných podmienkach, napríklad reakciou dvoch zlúčenín v inertnom rozpúšťadle, ako je DMF pri základných podmienkach pri vhodnej teplote, typicky pri laboratórnej teplote, počas 72 hodín alebo dovtedy, pokým sa reakcia neukončí. Často sme zistili, že je potrebné nechať reagovať amín s NaH pred reakciou so zlúčeninou vzorca VII. Vhodné odštiepiteľné skupiny L sú uvedené vyššie. Výhodné je, ak L predstavuje halogenid, predovšetkým bromid.

V spôsobe d) sa reakcia typicky uskutoční refluxovaním reakčnej zmesi počas až 4 hodín alebo dovtedy, pokým sa reakcia neukončí.

Soli zlúčenín vzorca I sa môžu tvoriť reakciou voľnej zásady alebo jej soli, enantioméru, tautoméru alebo chráneného derivátu s jedným alebo viacerými ekvivalentmi vhodnej kyseliny. Reakcia sa môže uskutočniť v rozpúšťadle alebo médiu, v ktorom je soľ nerozpustná, alebo v rozpúšťadle, v ktorom je soľ rozpustná, a následným odstránením rozpúšťadla vo vákuu alebo vysušením vymrazením. Vhodné rozpúšťadlá zahrňujú napríklad vodu, dioxán, etanol, izopropanol, tetrahydrofurán alebo dietyléter alebo ich zmesi. Reakcia môže byť reakciou podvojnej výmeny alebo sa môže uskutočniť na iónomeničovej živici.

Zlúčeniny vzorca II sa môžu pripraviť redukciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca VIII (VIII) kde R² má vyššie uvedený význam.

Redukčná reakcia sa môže uskutočniť pri rôznych podmienkach, napríklad pri takých, ako sú opísané v “Advanced Organic Chemistry, J. March, na stranách 1103 až 1104. Tieto zahrňujú katalytickú hydrogenáciu, použitie kovov Zn, Sn alebo Fe, AIHa-AICb, sulfidov a iných. Výhodné je, ak sa reakcia uskutoční hydrogenáciou pri atmosférickom tlaku v prítomnosti paládia a uhlíkového katalyzátora, kým sa reakcia neukončí, typicky v priebehu 3 až 6 hodín, alebo redukciou s použitím kovového zinku v kyseline octovej a metanole.

Zlúčeniny vzorca VIII možno pripraviť nitráciou zlúčeniny vzorca IX (IX) kde R² má vyššie uvedený význam.

Nitrácia sa uskutočňuje pri podmienkach, ktoré sú dobre známe odborníkovi v odbore, napríklad reakciou s kyselinou dusičnou a kyselinou sírovou alebo dusičnanom draselným a kyselinou sírovou, prípadne v inertnom organickom rozpúšťadle.

Vhodnou môže byť aj príprava zlúčenín vzorca VIII nitráciou karbonylového alebo dikarbonylového derivátu zlúčeniny vzorca IX; pričom nitrovaný karbonylový alebo dikarbonylový derivát sa môže redukovať na požadovanú zlúčeninu vzorca VIII s použitím napríklad diboránu.

Zlúčeniny vzorca Vili a IX, ako aj určité karbonyiové a dikarbonylové deriváty zlúčenín vzorca IX, ktoré boli práve uvedené, sa môžu pripraviť aj jedným z množstva spôsobov prípravy bicyklických heterocyklických zlúčenín.

Zlúčenina vzorca X

sa môže pripraviť expanziou kruhu cyklického ketónu XI (XI) reakciou s azidom sodným v kyseline (Grunewald a Dahanukar, J. Heterocyklic Chem., 1994, 31, 1609-1617).

Pre odborníka skúseného v odbore bude zrejmé, že zlúčeniny vzorca X sa môžu vhodne pripraviť aj v nitrátovej forme. Nitrácia sa môže dosiahnuť reakciou nenitrátovaného analógu s kyselinou dusičnou a kyselinou sírovou alebo dusičnanom draselným a kyselinou sírovou pri štandardných podmienkach.

Medziprodukty sa môžu pripraviť samotné alebo v chránenej forme. Chránené môžu byť predovšetkým amínové skupiny. Vhodné chrániace skupiny opísali v štandardnom texte “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2^nd Edition (1991), Greene a Wuts. Amín-chrániace skupiny, ktoré možno uviesť, zahrňujú alkyloxykarbonyl, ako je terc.butyloxykarbonyl, fenylalkyloxykarbonyl, ako je benzyloxykarbonyl, alebo trifluóracetát. Odstránenie chrániacej skupiny sa bežne uskutoční pôsobením vodnej zásady alebo vodnej kyseliny.

Zlúčeniny vzorca VIII a IX, v ktorých R² predstavuje C1-C4 alkyl, sa môžu pripraviť tiež alkyláciou zodpovedajúcej N-H zlúčeniny podľa vyššie uvedeného spôsobu c).

Zlúčeniny vzorca IV sa môžu pripraviť spôsobmi analogickými k tým, ktoré boli uvedené pri príprave zlúčenín vzorca II. Zlúčeniny vzorca IV sa môžu konvertovať na zodpovedajúce zlúčeniny vzorca II pôsobením zásady. Zlúčeniny vzorca II sa môžu konvertovať na zodpovedajúce zlúčeniny vzorca IV pôsobením protickej kyseliny HA, napríklad jednej z tých, ktoré boli uvedené vyššie.

Zlúčeniny vzorca III sú buď známe, alebo ich sa môžu pripraviť pomocou známych postupov. Napríklad zlúčeniny vzorca III, v ktorom L predstavuje tioalkyl, sa môžu pripraviť reakciou zodpovedajúceho tioamidu vzorca XII

S (XII)

kde R¹ má vyššie uvedený význam.

s alkylhalogenidom pri podmienkach, ktoré sú pre odborníka v odbore dobre známe.

Alternatívne sa kyslé adičné soli zlúčenín vzorca III, v ktorom L predstavuje tioalkyl, môžu pripraviť reakciou nitrilu vzorca V s alkyltiolom a kyselinou, napríklad kyselinou chlorovodíkovou, v rozpúšťadle, ako je dichlórmetán alebo dietyléter.

Zlúčeniny vzorca V, VII, X, XI a XII sú taktiež známe alebo sa môžu pripraviť konvenčnými všeobecne známymi postupmi.

Pre odborníka v odbore bude zrejmé, že sa môže vyžadovať chránenie amínovej alebo inej reakčnej skupiny medziproduktu s použitím chrániacej skupiny, ako opísali v štandardnom texte Protective Groups in Organic Synthesis”, 2^nd Edition (1991), Greene a Wuts. Vhodné amín-chrániace skupiny sú uvedené vyššie.

Zlúčeniny podľa vynálezu a medziprodukty sa môžu izolovať z reakčných zmesí a, podľa potreby, ďalej čistiť pomocou štandardných metód.

Zlúčeniny vzorca I môžu jestvovať vtautomérnych, enantiomérnych alebo diastereoizomérnych formách, z ktorých všetky sú zahrnuté do rozsahu vynálezu. Rôzne optické izoméry možno izolovať rozdelením racemickej zmesi zlúčenín s použitím konvenčných techník, napríklad frakčnou kryštalizáciou alebo HPLC.

Prípadne sa môžu jednotlivé enantioméry pripraviť reakciou vhodných opticky aktívnych východiskových materiálov pri reakčných podmienkach, ktoré nespôsobia racemizáciu.

Medziprodukty môžu tiež existovať v enantiomérnych formách a môžu sa použiť ako čistené enantioméry, diastereoizoméry, racemáty alebo zmesi.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I vykazujú užitočnú inhibičnú aktivitu syntézy oxidu dusičného, a predovšetkým vykazujú dobrú selektivitu pri inhibícii neurónovej izoformy syntézy oxidu dusičného. Sú využiteľné na liečenie alebo profýlaxiu ochorení človeka alebo stavov, ku ktorým prispieva syntéza alebo nadmerná syntéza oxidu dusičného syntázou oxidu dusičného. Príklady takýchto ochorení alebo stavov zahrňujú hypoxiu, ako napríklad v prípadoch zástavy srdca, mŕtvice a neonatálnej hypoxie, neurodegeneratívne poruchy vrátane degenerácie nervov a/alebo nekrózy nervov pri poruchách ako sú ischémia, hypoxia, hypoglykémia, epilepsia a pri vonkajších poraneniach (ako sú poranenia miechy a hlavy), hyperbarické kyslíkové kŕče a toxicita, demencia, napríklad presenilná demencia, Alzheimerova choroba a demencia súvisiaca s AIDS, Sydenhamova chorea, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, amyotrofická laterálna skleróza, Korsakoffova choroba, imbecilita súvisiaca s poruchou cerebrálnych ciev, poruchy spánku, schizofrénia, úzkosť, depresia, sezónne ochorenia, pásmová choroba, depresia alebo iné symptómy spojené s predmenštruačným syndrómom (PMS), úzkosť a septický šok. Zlúčeniny vzorca I sú tiež využiteľné na liečenie a zmiernenie akútnej a pretrvávajúcej zápalovej alebo neuropatickej bolesti alebo bolesti centrálneho pôvodu a na liečbu aiebo profýlaxiu zápalu. Podľa predpokladu budú zlúčeniny vzorca I vykazovať aktivitu aj pri prevencii a zvrate tolerancie na opiáty a diazepíny, liečení narkománie, liečení migrény a iných vaskulárnych bolestí hlavy. Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu rrí&žu tiež vykazovať užitočnú imunosupresívnu aktivitu a môžu byť využiteľné na liečenie porúch gastrointestinálnej motility a na vyvolanie pôrodu. Zlúčeniny môžu byť využiteľné aj na liečenie rakoviny, pri ktorej sa exprimuje syntáza oxidu dusičného.

Zlúčeniny vzorca I budú podľa predpokladu využiteľné najmä na liečenie alebo profýlaxiu hypoxie alebo mŕtvice alebo ischémie alebo neurodegeneratívnych stavov alebo schizofrénie alebo migrény alebo na prevenciu a zvrat tolerancie na opiáty a diazepíny alebo na liečenie narkománie alebo na liečenie bolesti a predovšetkým na liečenie alebo profylaxiu hypoxie alebo mŕtvice alebo ischémie alebo neurogeneratívnych porúch alebo schizofrénie alebo bolesti. V centre záujmu sú predovšetkým stavy zvolené zo skupiny zahrňujúcej hypoxiu, ischémiu, mŕtvicu, bolesť, schizofréniu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu alebo amyotrofickú laterálnu sklerózu.

Pri liečení Parkinsonovej choroby sa predpokladá, že zlúčeniny vzorca I sa budú využívať buď samostatne, alebo v kombinácii s inými činidlami, ako je L-Dopa.

Pri liečení bolesti sa predpokladá, že zlúčeniny vzorca I sa budú využívať buď samostatne, alebo v kombinácii s inými činidlami, ako sú opiáty, najmä morfín.

Predpokladá sa, že profylaxia bude predovšetkým dôležitá pri liečení osôb, ktoré už predtým utrpeli záchvat alebo ktoré sú z iného hľadiska považované za osoby so zvýšeným rizikom voči uvedenej chorobe alebo stavu. Medzi osoby predovšetkým ohrozené určitou chorobou alebo stavom patria vo všeobecnosti také osoby, u ktorých sa v rodinnej anamnéze vyskytla daná choroba alebo stav, alebo ktorých genetické testy a skríning preukázali zvýšenú náchylnosť na rozvoj danej choroby alebo stavu.

Vynález sa ďalej týka zlúčeniny vzorca I alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli na použitie ako liečivo.

Ďalej sa vynález týka použitia zlúčeniny vzorca I alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli na výrobu liečiva na liečenie alebo profýlaxiu vyššie uvedených chorôb alebo stavov; a spôsobu liečenia alebo profylaxie jednej z vyššie uvedených chorôb alebo stavov, ktorý zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny vzorca I alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli osobe trpiacej alebo náchylnej na takúto chorobu alebo stav.

Pri vyššie uvedených terapeutických indikáciách sa dávkovanie bude samozrejme meniť podľa použitej zlúčeniny, režimu podávania a požadovanej liečby. Vo všeobecnosti sa však uspokojivé výsledky dosiahnu vtedy, ak sa zlúčeniny podávajú človeku v dennej dávke medzi 0,5 mg a 2000 mg (merané ako účinná zložka), výhodne v dennej dávke medzi 2 mg a 500 mg.

Zlúčeniny vzorca (I), ich optické izoméry a racemáty a ich farmaceutický prijateľné soli sa môžu použiť samostatne, alebo vo forme vhodných liečivých prípravkov. Podávanie môže byť, nie je však obmedzené, enterálnym (vrátane orálneho, sublinguálneho alebo rektálneho), intranasálnym, intravenóznym, alebo topickým alebo iným parenterálnym spôsobom. Konvenčné postupy výberu a prípravy vhodných farmaceutických prípravkov sú opísané napríklad vo “Pharmaceuticals The Science of Dosage Form Designs, M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988.

Vynález ďalej poskytuje farmaceutický prípravok, ktorý výhodne obsahuje menej ako 95 % hmotnostných a predovšetkým výhodne menej ako 50 % hmotnostných zlúčeniny vzorca (I) alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, v zmesi s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom. Prípravok môže prípadne obsahovať tiež druhú farmakologicky účinnú zložku, ako je L-Dopa alebo opiátové analgetikum, ako je morfín.

Vynález tiež poskytuje spôsob prípravy takéhoto farmaceutického prípravku, ktorý zahrňuje zmiešanie zložiek.

Príkladmi takýchto riedidiel alebo nosičov sú: pre tablety a dražé: laktóza, škrob, mastenec, kyselina stearová; pre tobolky: kyselina vínna alebo laktóza; pre injekčné roztoky: voda, alkoholy, glycerín, rastlinné oleje; pre čipky: prírodné alebo stužené oleje alebo vosky.

Kompozície vo forme vhodnej na orálne, t.j. podanie pažerákom zahrňujú: tablety, tobolky a dražé; kompozície s trvalým uvoľňovaním zahrňujú také kompozície, v ktorých je účinná zložka viazaná na iónomeničovú živicu, ktorá je pripadne potiahnutá difúznou bariérou, aby sa modifikovali vlastnosti uvoľňovania živice.

Enzým syntáza oxidu dusičného má množstvo izoforiem a zlúčeniny vzorca I a ich optické izoméry a racemáty a ich farmaceutický prijateľné soli sa môžu podrobiť skríningu na inhibičnú aktivitu syntázy oxidu dusičného pomocou nasledujúcich postupov založených na postupoch Bredta a Snydera v Proc. Natl. Acad. Sci., 1990,

87. 682-685. Syntáza oxidu dusičného konvertuje ³H-L-arginín na ³H-L-citrulín, ktorý možno oddeliť katexovou chromatografiou a kvantifikovaf scintilačným počítaním.

Skríning inhibičnej aktivity neurónovej syntézy oxidu dusičného

Enzým sa izoluje z hippocampu alebo z malého mozgu potkana. Po anestézii zvieraťa s CO₂ a dekapitácii sa odstráni malý mozog alebo hippocampus potkanieho samca Sprague-Dawley (250 až 275 g). Supernatant z mozočka alebo hippocampu sa pripraví homogenizáciou v 50 mM Tris-HCl tlmivého roztoku s 1 mM EDTA (pH 7,2 pri teplote 25 °C) a centrifúgovaním počas 15 minút pri 20 000 g. Zvyškový L-arginín sa odstráni zo supernatantu postupne chromatografiou cez kolóny sodnej formy Dowex AG-50W-X8 a kolóny vodíkovej formy a ďalším centrifúgovaním pri 1000 g počas 30 sekúnd.

Pri skúške sa pridá 25 μΙ finálneho supernatantu do každej z 96 jamiek (96 jamkovej filtračnej platničky) obsahujúcich buď 25 μΙ skúšobného tlmivého roztoku (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCI₂, pH 7,4), alebo 25 μΙ testovanej zlúčeniny v tlmivom roztoku pri teplote 22 °C a 25 μΙ komplexného skúšobného tlmivého roztoku (50 mM HEPES, 1mM EDTA, 1,5 mM CaCI₂, 1 mM DTT, 100 μΜ NADPH, 10μg/ml kalmodulínu, pH 7,4). Po rovnovážnej perióde 10 minút sa pridá 25 μΙ roztoku L-arginínu (s koncentráciou 18 μΜ ¹H-L-arginínu, 96 nM ³H-L-arginínu) do každej jamky na iniciáciu reakcie. Reakcia sa zastaví po 10 minútach pridaním 200 μΙ suspenzie ukončovacieho tlmivého roztoku (20 mM HEPES, 2 mM EDTA, pH 5,5) a Dowexu AG-50W-X8 so zrnitosťou 200 až 400.

Značený L-citrulín sa oddelí od značeného L-arginínu filtráciou každej filtračnej platničky a 75 μΙ každej ukončenej reakčnej zmesi sa pridá do 3 ml scintilačného kokteilu. L-citrulín sa potom kvantifikuje scintilačným počítaním.

V typickom experimente s použitím supernatantu mozočku sa zvyšuje bazálna aktivita o 20 000 dpm/ml vzorky nad reagenčnú vzorku naslepo, ktorá vykazuje aktivitu 7000 dpm/ml. Referenčný štandard, N-nitro-L-arginín, ktorý poskytuje 80 % inhibíciu syntázy oxidu dusičného pri koncentrácii 1 μΜ, sa pri skúške testuje na overenie postupu.

Skríning inhibičnej aktivity endoteliálnej syntázy oxidu dusičného

Enzým sa izoluje z endoteliálnych buniek pupočnej žily človeka (HUVEC) postupom založeným na postupe Pollocka a kol. v Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 10 480-10 484. HUVEC sa získali od Clonetics Corp (San Diego, CA, USA) a kultivovali sa do súvislého rastu. Bunky sa môžu udržiavať do pasáže 35 až 40 bez signifikantnej straty výťažku syntázy oxidu dusičného. Keď bunky dosiahnu súvislý rast, znova sa suspendujú v Dulbeccovom fosforečnanovom pufrovanom fyziologickom roztoku, centrifúgujú sa pri 800 rpm počas 10 minút a granulky buniek sa potom homogenizujú v ľadovo chladnej 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10% glycerole, 1 mM fenylmetylsulfonylfluoride, 2 μΜ leupeptíne pri pH 4,2. Po centrifúgovaní pri 34 000 rpm počas 60 minút sa granulky rozpustia v homogenizačnom tlmivom roztoku, ktorý obsahuje tiež 20 mM CHAPS. Po 30 minútach inkubácie na ľade sa suspenzia centrifúguje pri 34 000 rpm počas 30 minút. Získaný supernatant sa skladuje pri teplote -80 °C až do použitia.

Pri skúške sa pridá 25 μΙ finálneho supernatantu do každej z 12 testovacích skúmaviek obsahujúcich 25 μΙ roztoku L-arginínu (s koncentráciou 12 μΜ ¹H-Larginínu, 64 nM ³H-L-arginínu) a buď 25 μΙ skúšobného tlmivého roztoku (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCb, pH 7,4), alebo 25 μΙ testovanej zlúčeniny v tlmivom roztoku pri teplote 22 °C. Do každej testovacej skúmavky sa pridalo 25 μΙ komplexného skúšobného tlmivého roztoku (50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1,5 mM CaCb, 1 mM DTT, 100 μΜ NADPH, 10μg/ml kalmodulínu, 12 μΜ tetrahydrobiopterínu, pH 7,4) na iniciáciu reakcie a reakcia sa zastaví po 10 minútach pridaním 2 ml ukončovacieho tlmivého roztoku (20 mM HEPES, 2 mM EDTA, pH 5,5).

Značený L-citrulín sa oddelí od značeného L-arginínu chromatografiou cez kolónu Dowex AG-50W-X8 so zrnitosťou 200 až 400. Na jednotlivú 1 ml kolónu sa pridá podiel 1 ml každej ukončenej reakčnej zmesi a eluent spojený s eluentom získaným z dvoch 1 ml premytí destilovanou vodou a 16 ml scintilačného kokteilu. L-citrulín sa potom kvantifikuje scintilačným počítaním.

V typickom experimente sa zvyšuje bazálna aktivita o 5000 dpm/ml vzorky nad reagenčnú vzorku naslepo s aktivitou 1500 dpm/ml. Referenčný štandard N-nitro-L14 arginín, ktorý poskytuje 70 až 90 % inhibíciu syntázy oxidu dusičného pri koncentrácii 1 μΜ, sa pri skúške testuje na overenie postupu.

Vskríningoch inhibičnej aktivity syntázy oxidu dusičného je aktivita zlúčeniny vyjadrená ako IC₅₀ (koncentrácia liekovej substancie, ktorá poskytuje 50 % inhibíciu enzýmu pri skúške). Hodnoty IC50 testovaných zlúčenín sa na začiatku určili z inhibičnej aktivity roztokov zlúčenín s koncentráciou 1, 10 a 100 μΜ. Zlúčeniny, ktoré inhibovali enzým najmenej o 50% pri 10 μΜ, sa znovu testovali s použitím vhodnejších koncentrácií tak, aby sa mohli stanoviť hodnoty IC₅o·

Pri testovaní vo vyššie uvedených skríningoch zlúčeniny z príkladov 1 až 6 uvedených nižšie vykazujú hodnoty IC50 inhibície neuronálnej syntázy oxidu dusičného menej ako 10μΜ a dobrú selektivitu inhibície neuronálnej izoformy enzýmu, čo naznačuje, že podľa predpokladu vykážu predovšetkým užitočnú terapeutickú účinnosť.

V porovnaní s inými zlúčeninami majú zlúčeniny vzorca I a ich optické izoméry a racemáty a ich farmaceutický prijateľné soli tú výhodu, že môžu byť menej toxické, účinnejšie, môžu dlhšie pôsobiť, môžu vykazovať širšie spektrum účinnosti, silnejšie účinky, byť selektívnejšie na neuronálnu izoformu enzýmu syntázy oxidu dusičného, produkovať menej vedľajších účinkov, ľahšie sa absorbovať alebo vykazovať ďalšie užitočné farmakologické vlastnosti.

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi:

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

N-(2-Metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid

a) 2-Metyl-7-nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín hydrochlórid

7-Nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín (20 g, 93,2 mmol), formaldehyd (37 % roztok vo vode, 50 ml) a kyselina mravčia (90 ml) sa zahrievali na reflux počas 1 hodiny, ochladili sa a preliali cez ľad. Reakčná zmes sa zalkalizovala koncentrovaným hydroxidom amónnym. Vyzrážaná pevná látka sa zachytila, rozpustila v teplom etanole (200 ml), okyslifa zmesou 95 % etanol-koncentrovaná HCl a produkt sa nechal vykryštalizovať. Získala sa zlúčenina uvedená v názve vo forme bielej pevnej látky (18,71 g, 87,8 %), teplota topenia 256 až 257 °C.

b) 2-Metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochlorid

2-Metyl-7-nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín hydrochlorid sa rozpustil v metanole a hydrogenoval sa pri 50 psi v prítomnosti katalytického množstva 10% Pd-C. Po 1 hodine sa zmes prefiltrovala cez sklo a odparila sa, čím sa získal 2-metyl-1,2,3,4tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochlorid, teplota topenia 137 až 138 °C.

c) Etylester kyseliny 2-tiofénkarboximidotiovej hydrochlorid

Do miešaného roztoku etántiolu (28,4 g, 0,45 molov) v metylénchloride (500 ml) sa pri teplote 10 °C pod dusíkom pridal 2-tiofénkarbonitril (50,0 g, 0,45 molov). Na tento roztok sa pôsobilo pomalým prúdom plynného HCl počas 6 hodín. Reakčná zmes sa potom nechala zahriať na laboratórnu teplotu v priebehu 18 hodín. Pridal sa éter (200 ml) a vykryštalizovala biela pevná látka. Pevný hydrochlorid etylesteru kyseliny 2-tiofénkarboximidotiovej sa zachytil filtráciou a vysušil na vzduchu (65,8 g), teplota topenia 196 až 197 °C.

d) N-(2-Metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid

2-Metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochlorid (34,66 g) v 95% etanole (600 ml) sa zahrial na teplotu 65 °C, aby sa rozpustila väčšina z pevných podielov a zmes sa potom nechala za miešania ochladiť. Nasledujúci deň sa jemná suspenzia pevných látok nechala reagovať s hydrochloridom etylesteru kyseliny 2tiofénkarboximidotiovej (41 g) a zmes sa miešala pri teplote 23 °C. Do 2 hodín sa všetky pevné podiely rozpustili a do 4 hodín sa vyzrážali nové pevné látky. Zmes sa spracovala s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (2 ml). Zmes sa ochladila na teplotu 0 °C a miešala sa počas 30 minút. Pevné podiely sa odfiltrovali, premyli etanolom (2x50 ml) a vysušili na vzduchu, čím sa získal N-(2-metyl-1,2,3,4tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid, teplota topenia 142 až 146 °C; MS^m/z272 [M+H]⁺.

Príklad 2

N-(2-lzopropyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid

Do miešaného roztoku N-(-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamidu (7,0 g, 21 mmol) v dimetylformamide (100 ml) sa pridal uhličitan draselný (14,6 g, 100 mmol). K tejto zmesi sa pridal 2-brómpropán (5,1 g, 42 mmol) a zmes sa potom zahrievala pri teplote 40 °C počas 72 hodín. Reakčná zmes sa vliala do vody (500 ml) a extrahovala sa etylacetátom (3x100 ml). Spojené etylacetové extrakty sa premyli vodou (200 ml) a vysušili nad síranom horečnatým. Odparením rozpúšťadla sa získal surový olej, ktorý sa potom rozpustil v horúcom cyklohexáne (250 ml) aetylacetáte (10 ml). Státím vykryštalizovala zlúčenina uvedená v názve a zachytila sa filtráciou (3,2 g), teplota topenia 110 až 111 °C.

Príklad 3

N-(2-Etyl-1,2,3,4,-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid hydrochlorid

a) 2-Etyl-7-nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín hydrochlorid

Ku 7-nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolínu (5 g, 30 mmol) v acetonitrile (100 ml) sa pridal etylester kyseliny metánsulfonónovej (6,38 g, 60 mmol) a uhličitan draselný (5 g). Zmes sa zahrievala pri teplote 40 °C počas 18 hodín. Zmes sa prefiltrovala a zahustila sa na olej. Olej sa rozpustil v metanole a spracoval sa s izopropanolomHCI. Hydrochloridová soľ sa zachytila filtráciou (4,89 g, 67 %), teplota topenia 259 až 260 °C.

b) 2-Etyl-1,2,3,4-tetrahydroízochinolin-7-yfamín hydrochlorid

2-Etyl-7-nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín hydrochlorid (4,89 g) sa rozpustil v metanole (250 ml) a hydrogenoval sa pri 50 psi v prítomnosti katalytického množstva 5 % Pd-C. Po 1 hodine sa zmes prefiltrovala cez sklo a odparila sa na olej, ktorý sa okamžite použil v nasledujúcom kroku.

c) N-(2-Etyl -1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamíd hydrochlorid

Ku 2-etyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochloridu (2,48 g, 10 mmol) v izopropanole (25 ml) sa pridal hydrojodid metylesteru kyseliny 2-tiofénkarboximido17 tiovej (5,68 g, 20 mmol). Zmes sa zahrievala pri teplote 50 °C počas 24 hodín. Zmes sa vliala do vody (50 ml), potom do zásaditej vody (150 ml). Zmes sa extrahovala etylacetátom (3x100 mi). Extrakty sa premyli vodou, vysušili síranom horečnatým, prefiltrovali a zahustili sa na olej, ktorý pri státím vykryštalizoval. Pevné podiely sa rozpustili v étere a spracovali sa s izopropanolom-HCI. Pevné podiely sa zachytili filtráciou (1,41 g, 49 %), teplota topenia 122 až 126 °C.

Príklad 4

N-(2-Propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid

a) 7-Nitro-2-propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín hydrochlorid

Zlúčenina uvedená v názve sa pripravila zo 7-nitro-1,2,3,4-tetrahydroizochinolínu (5 g, 30 mmol) a 1-brómpropánu (7,36 g, 60 mmol) postupom analogickým s postupom z príkladu 3(a).Takto sa získala hydrochloridová soľ (3,29 g, 43 %), MS^m/z 221 [M+Hf.

b) 2-Propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochlorid

7-Nitro-2-propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín hydrochlorid (príklad 4(a), 3,29 g, 13 mmol) sa hydrogenoval postupom opísaným v príklade 3(b). Takto získaná hydrochloridová soľ zlúčeniny uvedenej v názve (3,07 g, 100 %) sa ihneď použila v nasledujúcom kroku.

c) N-(2-Propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid

2-Propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochlorid (3,07 g, 13 mmol) v DMF (30 ml) sa nechal reagovať s hydrojodidom metylesteru kyseliny 2-tiofénkarboximidotiovej (2,84 g, 10 mmol) podľa spôsobu z príkladu 3(c). Pevné podiely sa rekryštalizovali z éteru (1,28 g, 43%), MS”¹⁷² 300 [M+H]⁺. Hydrochloridová soľ sa pripravila rozpustením týchto pevných látok v etanole, spracovaním so zmesou etanol-HCI a triturovaním s etylacetátom (0,86 g, 73 %) teplota topenia 241 až 243 °C.

Príklad 5

N-íž-Metyl-I.Ž.S^-tetrahydroizochinolin-ľ-yO-S-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid

a) Metylester kyseliny 3-tiofénkarboximidotiovej.hydrojodid

Zlúčenina uvedená v názve sa pripravila z 3-tiofénkarbotioamidu a metyljodidu postupom analogickým k postupu, ktorý bol opísaný v príklade 1(d) WO 95/05 363.

b) N-ÍŽ-Metyl-I.Z.S^-tetrahydroizochinolin-ľ-ylJ-S-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid

Zmes 2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-ylamín hydrochloridu (1,5 g, 7,55 mmol) a hydrojodidu metylesteru kyseliny 3-tiofénkarboximidotiovej (2,69 g, 9,44 mmol) v N-metyl-2-pyrolidinóne (10 ml) sa zahrievala pri teplote 50 °C počas 5 hodín. Získaná pevná látka sa spracovala s izopropanolom (50 ml), rozpustila vo vode, zalkalizovala koncentrovaným hydroxidom amónnym a dvakrát extrahovala chloroformom. Spojené extrakty sa vysušili nad síranom horečnatým, rozpúšťadlo sa odparilo a zvyšok sa spracoval s etanolom-HCI, čim sa získala zlúčenina uvedená v názve (1,37 g, 52 %), MS^m,z 272 [M+H]⁺.

Príklad 6

N-(2-Butyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid

N-(1,2,3,4-Tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid (3,0 g, 9 mmol) a 1chlórbután (1,67 g, 18 mmol) sa nechali spolu reagovať podľa spôsobu z príkladu 2 s tou výnimkou, že ako rozpúšťadlo sa použil 95 % etanol. Takto získaný surový olej sa chromatografoval na silikagéle eluovaním so zmesou 10% metanolchloroformom, čím sa získal olej, ktorý vykryštalizoval z horúceho hexánu (1,12 g, 40 %), teplota topenia 95 až 96 °C.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlúčenina vzorca I

Ri v ktorom:

R¹ predstavuje 2-tienylový alebo 3-tienylový kruh; a

R² znamená C1-C4 alkyl;

a ich optické izoméry a racemáty a ich farmaceutický prijateľné soli.
2. Zlúčenina vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R¹ predstavuje 2-tienyl.
3. Zlúčenina vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R² predstavuje metyl.
4. Zlúčenina vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R¹ predstavuje 2-tienyl a R²predstavuje metyl.
5. Zlúčenina vzorca I, ktorou je:

N-(2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

N-(2-izopropyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

N-(2-etyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

N-(2-propyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

N-(2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

N-(2-butyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-7-yl)-2-tiofénkarboximidamid;

alebo optický izomér alebo racemát ktoréhokoľvek z nich alebo farmaceutický prijateľná soľ ktoréhokoľvek z nich.
6. Zlúčenina vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na použitie ako liečivo.
7. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optický izomér alebo racemát alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ, pripadne v zmesi s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.
8. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optický izomér alebo racemát alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ, v kombinácii s L-Dopa alebo opiátovým analgetikom, predovšetkým morfínom, pripadne v zmesi s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.
9. Spôsob liečenia alebo zníženia rizika ochorenia človeka alebo stavu, pri ktorom je prospešná inhibícia aktivity syntázy oxidu dusičného, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli osobe trpiacej alebo náchylnej na takúto chorobu alebo stav.
10. Spôsob liečenia podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa inhibuje prevažne neurónová izoforma syntázy oxidu dusičného.
11. Spôsob liečenia alebo zníženia rizika hypoxie alebo mŕtvice alebo ischémie alebo neurodegeneratívnych porúch alebo schizofrénie alebo bolesti alebo migrény, alebo prevencie a zvratu tolerancie na opiáty a diazepíny, alebo liečenia narkománie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli osobe trpiacej alebo náchylnej na takúto chorobu alebo stav.
12. Spôsob liečenia podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že stav, ktorý sa má liečiť, je vybraný zo súboru zahrňujúceho hypoxiu, ischémiu, mŕtvicu, Huntingtonovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, amyotrofickú laterálnu sklerózu, schizofréniu a bolesť.
13. Spôsob liečenia podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že stavom, ktorý sa má liečiť, je mŕtvica.
14. Spôsob liečenia podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že stavom, ktorý sa má liečiť, je amyotrofická laterálna skleróza.
15. Spôsob liečenia podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že stavom, ktorý sa má liečiť, je bolesť.
16. Spôsob liečenia podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že stavom, ktorý sa má liečiť, je Huntingtonova choroba.
17. Spôsob liečenia podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že stavom,' ktorý sa má liečiť, je Parkinsonova choroba.
18. Spôsob liečenia podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že stavom, ktorý sa má liečiť, je schizofrénia.
19. Spôsob liečenia alebo zníženia rizika bolesti, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli v kombinácii s opiátovým analgetickým činidlom, predovšetkým morfínom, osobe trpiacej alebo ohrozenej bolesťou.
20. Spôsob liečenia Parkinsonovej choroby, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, v kombinácií s L-Dopa, osobe trpiacej alebo ohrozenej zvýšeným rizikom voči Parkinsonovej chorobe.
21. Použitie zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli na výrobu liečiva na liečenie alebo profylaxiu ochorení človeka alebo stavov, pri ktorých je prospešná inhibicia aktivity syntázy oxidu dusičného.
22. Použitie podľa nároku 21, pričom sa inhibuje prevažne neurónová izoforma syntázy oxidu dusičného.
23. Použitie zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli na výrobu liečiva na liečenie alebo profylaxiu hypoxie alebo mŕtvice alebo ischémie alebo neurogeneratívnych stavov alebo schizofrénie alebo bolesti alebo migrény alebo na prevenciu a zvrat tolerancie na opiáty alebo diazepíny alebo na liečenie narkománie.
24. Použitie podľa nároku 23, pričom stav je zvolený zo súboru zahrňujúceho hypoxiu, ischémiu, mŕtvicu, amyotrofickú laterálnu sklerózu, Huntingtonovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, schizofréniu a bolesť.
25. Použitie podľa nároku 24, pričom stavom je mŕtvica.
26. Použitie podľa nároku 24, pričom stavom je amyotrofická laterálna skleróza.
27. Použitie podľa nároku 24, pričom stavom je bolesť.
28. Použitie podľa nároku 24, pričom stavom je Huntingtonova choroba.
29. Použitie podľa nároku 24, pričom stavom je Parkinsonova choroba.
30. Použitie podľa nároku 24, pričom stavom je schizofrénia.
31. Použitie zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli v kombinácii s opiátovým analgetickým činidlom, predovšetkým morfínom, na výrobu liečiva na liečenie alebo profylaxiu bolesti.
32. Použitie zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo jej optického izoméru alebo racemátu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, v kombinácii s L-Dopa, na výrobu liečiva na liečenie alebo profylaxiu Parkinsonovej choroby.
33. Spôsob prípravy zlúčeniny vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 a jej optických izomérov a racemátov a jej farmaceutický prijateľných solí, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje:

a) prípravu zlúčeniny vzorca I reakciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca II (II) kde R² má význam uvedený v nároku 1, so zlúčeninou vzorca lll alebo jej kyslou adičnou soľou (III) kde R¹ má význam uvedený v nároku 1 a L predstavuje odštiepiteľnú skupinu;

b) prípravu zlúčeniny vzorca I reakciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca IV

HA.H,N (IV) kde R má význam uvedený v nároku 1 a HA znamená kyselinu, so zlúčeninou vzorca V

R¹—=N (V) kde R¹ má význam uvedený v nároku 1;

c) prípravu zlúčeniny vzorca I reakciou zlúčeniny vzorca VI (VI) kde R¹ má význam uvedený v nároku 1, so zlúčeninou vzorca VII

R²-L (VII) kde R² má význam uvedený v nároku 1 a L predstavuje odštiepiteľnú skupinu; alebo

d) prípravu zlúčeniny vzorca I, v ktorom R² predstavuje metyl, reakciou zlúčeniny vzorca VI s formaldehydom a kyselinou mravčou;

a kde sa vyžaduje alebo je nevyhnutná konverzia získanej zlúčeniny vzorca I alebo jej ďalšej soli na jej farmaceutický prijateľnú soľ alebo naopak a kde sa vyžaduje konverzia získanej zlúčeniny vzorca I na jej optický izomér.