SK138896A3

SK138896A3 - Genes of the latent virus of hop and a detection method of them

Info

Publication number: SK138896A3
Application number: SK1388-96A
Authority: SK
Inventors: Narushi Suda; Yutaka Itoga; Tatsuzi Hataya
Original assignee: Sapporo Breweries
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 1997-08-06
Also published as: US5869235A; CZ317096A3; US6132960A; AU717790B2; EP0775747B1; SK283202B6; DE69635882T2; CN1154731C; CZ293438B6; AU7033796A; EP0775747A3; CA2188900A1; DE69635882D1; CN1157325A; JPH09173100A; EP0775747A2

Description

GÉNY LATENTNÉHO VÍRUSU CHMEĽU A SPOSOB ICH DETEKCIE.

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka génov latentného vírusu chmeíu a spôsobu a metód detekcie uvedeného vírusu.

Doterajší stav techniky

Rozšírenie infekcie chmeíovým latentným vírusom (ďalej skracované ako HLV) bolo hlásené zo všetkých oblastí pestovania chmeíu (Tresh & Ormerod, Rep. E. Mailing Res. Stn. for 1968: 41 (1969), Probasco & Skotland, Phytopathology 68: 278 (1978), Adams & Barbara, Ann. appl. Biol., 101: 483 (1982), Inoue et al., Ann. Phytopath. Soc. Japan 39: 229 (1973 ) .

HLV má filamentný tvar a patrí do skupiny carlavírusov. Doteraz nebola zistená ani génová, ani primárna štruktúra obalovej bielkoviny. Preto, ako metóda na selekciu bezvírusových kolón chmeíu sa vyžíva enzýmoimunoadsorbentné stanovenie (ELISA), s použitím protilátok voči HLV. Avšak diagnostická detekcia HLV s ELISA spôsobovalči rôzne problémy, tak ako redukciu detekčnej citlivosti závislej na dobe odberu vzoriek a na zdĺhavej príprave protilátok.

Z týchto dôvodov, technickým problémom predkladaného vynálezu je poskytnúť pohotovú a presnú metódu identifikácie HLV - infikovaných rastlín.

Tento technický problém je vyriešený uskutočnením vyjadreným v patentových nárokoch.

Menovite, predkladaný vynález je založený na identifikácii génu obalovej bielkoviny HLV· a vyriešení jeho bázovej sekvencie, a tým aj primárnej štruktúry uvedenej bielkoviny.

Využitím génu pre HLV obalovú bielkovinu, alebo DNK nasyntetizovanej podía jeho bázovej sekvencie, môže byť HLV detekovaný genetickou metódou, tak ako polymerázovou reťazovou reakciou (ďalej skratka PCR) a Southernovou hybridzáciou. Napríklad v PCR s časťou bázovej sekvencie, alebo s DNK sekvenciu ako očko, je HLV amplifikovaných produktov DNK, obsahujúcou komplementárnu detekované pomocou tvorby špecifických ku HLV - infikovaným rastlinám. Okrem toho, použitím hybridizácie komplementárneho vlákna DNK HLV génu, ako nukloetidovej sondy, môžu byt Southernovou analýzou pozorované špecifické pásy s HLV - infikovaných rastlín.

Podstata vynálezu

Takto, podľa prvého aspektu sa predkladaný vynález týka DNK, ktorá kóduje bielkovinu latentného vírusu chmeľu vybranej zo skupiny pozostávajúcej z:

(a) molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 6 alebo 7;

(b) molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 1;

(c.) molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 58 až 975, alebo od nukleotidu 981 až 1292 z nukleotidovej sekvencie udanej v SEKV IČ:1;

(d) molekúl nukleovej kyseliny hybridizujúcich k molekulám nukleových kyselín ako sú definované v (a),, (b), alebo (c); a (e) molekúl nukleových kyselín, ktorých nukleotidová sekvencia je degenerovaná výsledkom genetického kódu, voči nukleotidovej sekvencii molekúl nukleových kyselín definovaných v (a), (b), (c), alebo (d).

V tomto kontexte, termín hybridizácia zodpovedá skôr obvyklým hybridizačným podmienkam, ako hybridizačným podmienkam prísnej hybridizácie.

Podlá ďalšieho aspektu, predkladaný vynález sa týka DNK, ktoré hybridizujú s DNK podlá vynálezu, a ktoré kóduju fragment, alebo mutovanú verziu bielkoviny, kódovanú vyššie opísanými DNK.

Predkladaný vynález sa ďalej týka špecifickej sekvencie molekúl nukleových kyselín odvodených od DNK podľa predkladaného vynálezu.

V tomto kontexte, termín špecifická sekvencia zodpovedá molekulám nukleových kyselín, ktoré počas hybridizácie môžu špecificky hybridizovaí s génmi a DNK podlá predkladaného vynálezu. Tak môžu byt molekuly nukleových kyselín -použité napr.. akó špecifické nukleotidové. sondy, alebo špecifické očká pre amplifikáciu špecifickej sekvencie, napr. pre polymerázovú reťazovú reakciu.

Výhodné uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka DNK kódujúcej obalovú bielkovinu latentného vírusu chmeľu, ktorá obsahuje bázovú sekvenciu opísanú pod identifikačným číslom 1 v sekvenčnom zozname, kde,

a) nukleotidová sekvencia od 58 do 975 kóduje 306 aminokyselinových zvyškov a b) bázová sekvencia od 981 do 1292 kóduje 104 aminokyselinových zvyškov.

Predložený vynález sa ďalej týka polypeptidov kódovaných s niektorou vyššie uvedenou DNK podľa vynálezu.

Tiež sa vztahuje na spôsoby výroby uvedených polypeptidov, vrátane kultivácie hostiteľskej bunky, ktoré obsahujú hociktorú DNK podľa vynálezu, a izoláciu polypeptidu z kultúry. Dôležité je, že uvedené DNK sú účinne viazané na regulačnú jednotku umožňujúcu ich expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Ako prokaryotické bunky sú výhodné E. coli, a ako bunky.

eukaryotické bunky sú výhodné rastlinné

Ďalšie výhodné uskutočnenie podľa vynálezu zahrňuje rastlinné bunky, ktoré obsahujú hociktorú z DNK vyššie uvedených vo vynáleze. Presnejšie povedané rastlinné bunky sú odvodené z chmeľu.

Ďalej sa vynález týka protilátok špecificky rozpoznávajúcich polypeptidy z vynálezu.

Predkladaný vynález sa ďalej týka diagnostického zloženia, ktoré obsahuje hociktorú z doteraz uvedených DNK, molekúl nukleových kyselín, a/alebo obsahuje vektor, polypeptidy, alebo protilátky špecificky rozpoznávajúce takéto polypeptidy, samotné, alebo v kombinácii a optimálne výhodné na detekciu.

Podlá ďalšieho uskotočnenia sa vynález týka použitia vyššie uvedených DNK a molekúl nukleových kyselín, vektorov, polypeptidov, a protilátok pre inžinierstvo patogénnej rezistencie rastlín.

Najvýhodnejšie uskutočnenie je, ak je patogén vírus, predovšetkým carlavírus, a najvýhodnejší je HLV, a z rastlín je to chmeľ.

Gén, obsahujúci DNK a RNK, kódujúci HLV obalovú bielkovinu a časti z nej, môže byt použitý na detekciu HLV. Ako nukletotidová sonda vhodná pre PCR a Southernovu hybridizáciu, môže byt s výhodou použitá bázová sekvencia zo zoznamu sekvencii, napr.

a) sekvencia s identifikačným číslom 2 (zhodná so sekvenciou s identifikačným číslom 1, od 405 do 23),

b) sekvencia s identifikačným číslom 3 (zhodná so sekvenciou s identifikačným číslom 1, od 457 do 474),

c) sekvencia s identifikačným číslom 4 (zhodná so sekvenciou s identifikačným číslom 1, od 618 do 637),

d) sekvencia s identifikačným číslom 5 (zhodná so sekvenciou s identifikačným číslom 1, od 761 do 781).

Tieto DNK môžu byť získané extrakciou a purifikáciou z HLV, alebo pripravené s použitím automatického syntetizátora DNK. Najmä, krátke jednovláknové DNK, tak ako sú bázové sekvencie s identifikačným číslom od 2 do 5, môžu byť obvykle získané chemickou syntézou.

Podľa iného aspektu, predložený vynález sa týka spôsobu detekcie HLV, pričom spôsob zahrňuje amplifikáciu DNK reverznou transkripciou PCR, uskutočnenú s nuklevou kyselinou extrahovanou z chmeľu, ktorá slúži ako templát, a hociktorá syntetická sekvencia s identifikačným číslom 2 až 5 slúži ako očko, a na elektroforetickú analýzu takto získaných produktov.

Presnejšie, HLV môžu byť detekované s DNK, amplifikovanou reverznou transkripciou PCP. so syntetickými sekvenciami DNK s identifikačným číslom 2 a 4 slúžiacimi ako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto obdržaných amplifikovaných produktov na potvrdenie špecifického DNK fragmentu obsahujúceho 233 bázových párov.

Podobne, HLV môžu byť detekované s DNK, amplifikovanou reverznou transkripciou PCR, so syntetickými sekvenciami DNK s identifikačným číslom 3a 4, slúžiacimi ako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktov potvrdzujúcich špecifický DNK fragment obsahujúci 188 bázových párov.

Tiež, HLV môžu byt detekované s DNK, amplifikovanou reverznou transkripciou PCR, so syntetickými sekvenciami DNK s identifikačným číslom 2a 5, slúžiacimi ako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktov potvrdzujúcich špecifický DNK fragment obsahujúci 377 bázových párov.

Okrem toho, HLV môžu byť detekované s DNK, amplifikovanou reverznou transkripciou PCR so syntetickými sekvenciami DNK s identifikačným číslom 3 a 5 slúžiacimi ako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto záskaných amplifikovaných produktov potvrdzujúcich špecifický DNK fragment obsahujúci 325 bázových párov.

Podľa iného aspektu, sa predložený vynález týka spôsobu detekcie HLV, pričom spôsob zahrňuje hybridizáciu nukleovej kyseliny extrahovanej z chmelu, očko obsahujúce syntetickú DNK s identifikačným číslom 4 alebo 5, alebo komplementárne vlákno DNK predĺžené s DNK používanými ako očko.

Podlá iného aspektu, sa predložený vynález týka spôsobu detekcie HLV, pričom spôsob zahrňuje nukleovú kyselinu extrahovanú z chmelu a reštrikčný enzýmový fragment DNK opísaný v sekvencii s identifikačným číslom 1 slúžiaci ako nukleotidová sonda.

Podlá ďalšieho aspektu, predložený vynález sa týka HLV obalovej bielkoviny, prepísanej z bázovej sekvencie od 58 do 975 sekvenčného identifikačného čísla 1 v sekvenčnom zozname, obsahujúca 306 aminokyselinových zbytkov sekvencie s identifikačným číslom 6 v sekvenčnom zozname.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na Obr. 1. je aminokyselinová sekvencia obalovej bielkoviny latentného vírusu chmelu, analyzovaná bielkovinovým sekvenčným analyzátorom.

Obr. 2. je elektroforetická fotografia zobrazujúca výsledky génovej diagnózy latentného vírusu chmelu, použitím PCR.

V predloženom vynáleze, gén HLV je analyzovaný nasledujúcimi postupmi na identifikáciu obalovej bielkoviny HLV a vyriešenie jej bázovej sekvencie.

1. Izolácia HLV.

HLV môže byť z chmelu izolované štandardnými metódami, napr., zahrňujúcimi koncentráciu vírusu s polyetylénglykolom, prečistenie extraktu, organickými rozpúšťadlami a tepelným spracovaním, frakčnou centrifugáciou, centrifugáciou v sacharózovom gradiente, atď.

2. Extrakcia RNK z HLV.

Extrakcia môže byť uskutočnená štandardnými metódami, tak ako SDS-fenolovou metódou, ktorá sa hlavne používa pre iné rastlinné vírusy.

3. Klónovanie s cDNK.

Ako templát sa využíva RNK a dvojvláknová DNK je in extrahovaná z častí HLV, vitro syntetizované

Gubler-Hoffmanovou metódou (Gubler and Hoffman, Gene, 25, 263 (1983)). Takto nasyntetizovaná cDNK je inkorporovaná do použitím štandardných techník, ktoré môžu byť použité, sú bunky E. coli sú zmesi. Z takto a purifikované plazmidového vektoru ligáciou,

Prípadné plazmidové vektory, pUC119, pBluescriptII, atď. Kompetentné transformované použitím uvedenej ligačnej získaných transformantov, sú vybrané rekombinantné plazmidy, ktoré obsahujú cDNK.

4. Bázová sekvencia cDNK odvodená z genómu HLV, pri použití rekombinantného plazmidu, obdržaného vyššie opísanou metódou, môže byť stanovená podlá Maxam-Gilbertovej metódy (Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560 (1977)), alebo s dideoxy metódou (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).

Takže, bázová sekvencia DNK zahrňujúca gén kódujúci HLV obalovú bielkovinu (ďalej skrátené ako HLV gén obalovej bielkoviny) je stanovená a je opísaná v sekvencii s identifikačným číslom 1 v zozname sekvencii.

5. Stanovenie čiastočnej sekvencie aminokyselín HLV obalovej bielkoviny.

Toto je vykonávané pomocou bielkovinového analyzátora (ABI) po čiastočnom opracovaní HLV obalovej bielkoviny, následnou frakcionáciou a purifikáciou výťažku s vysokotlakou kvapalinovou chromatografiou. Takto stanovená čiastočná aminokyselinová sekvencia obalovej bielkoviny je ukázaná na obr. 1. Ak sa porovná táto čiastočná aminokyselinová sekvencia HLV obalovej bielkoviny so sekvenciou deďukovanou z bázovej sekvencie HLV génu obalovej bielkoviny ukázanej v sekvenčnom zozname, primárna štruktúra (aminokyselinová sekvencia ) obalovej bielkoviny bola vyriešená (pozri Obr.l).

6. Virálna génová diagnóza HLV-infikovaného chmeľu..

1) Diagnóza génu reverznou transkripciou PCR

Očko DNK, dlhé okolo 20 báz, obsahujúce čiastočnú sekvenciu HLV génu obalovej bielkoviny, ktorá bola stanovená metódou, alebo bázovú sekvenciu jeho vlákna, je syntetizované štandardnými vyššie opísanou komplementárneho metódami. Virálna génová diagnóza HLV-infikovaného chmeľu sa stáva možnou detekciou prítomného, alebo neprítomného amplifikovaného produktu získaného s PCR, pri použití uvedeného očka.

Ako očká môžu byt použité oligonukleotidy,. zahrňujúce bázovú sekvenciu so sekvenciami s identifikačným číslom 2 až 5 v sekvenčnom zozname. Medzi nimi, bázová sekvencia, opísaná v sekvencii identifikačného čísla 2 sekvenčného zoznamu je rovnaká ako bázová sekvencia od 405 do 423 opísaná v sekvencii identifikčného číslo 1, a ďalej označená 3P. Bázová sekvencia, opísaná v sekvencii identifikčného čísla 3 sekvenčného zoznamu je rovnaká ako bázová sekvencia od 457 do 474 bázovej sekvencie opísanej v sekvencii identifikačného čísla 1, a ďalej označená 4P. Tiež, bázová sekvencia, opísaná v sekvencii identifikačného čísla 4 sekvenčného zoznamu je komplementárne vlákno bázovej sekvencie od 518 do 637 bázovej sekvencie opísanej v sekvencii identifikačného čísla 1, a ďalej označená 3M. Bázová sekvencia, opísaná v sekvencii identifikačného čísla 5 v sekvenčnom zozname, je komplementárne vlákno bázovej sekvencie od 761 do 781 bázovej sekvencie opísanej v sekvencii identifikačného čísla 1, a ďalej označená 4M.

Tiež, ako očká môžu byt použité oligonukleotidy zahrňujúce čast bázovej sekvencie opísanej s identifikačným číslom 2 až 5. To znamená, primárnou metódou pre amplifikáciu kópii špecifických génových informácii získaných z mnohých bázových sekvencii, oligonukleotidy obsahujúce bázovú sekvenciu podobnú očkám v predloženom vynáleze, môžu byt použité podobne ako očká.

Očká DNK, použité v predloženom vynáleze môžu byt získané, napr, β-kyanoetylfosfoamidovou ‘ metódou, alebo komerčným automatickým DNK syntetizérom používajúcim tiofosfitovú metódu.

z chmelových rastlín, môžu byt extrahované ktorá je obvyklou metódou v sekvenciách pokial PCR je

Nukleové kyseliny v predloženom vynáleze, štandardnou metódou, použitých hociktorou extrakcie nukleových kyselín.

Použijúc takto získané nukleové kyseliny a očká opísané hore, DNK odvodené od HLV amplifikované kombináciou techník reverznej transkripcie virálnych RNK s polymerázovou retazovou reakciou (PCR). PCR je z chmelu, génomu sú procedúra opakujúceho sa DNK replikačného cyklu, zahrňujúca stupeň denaturácie, tepelnej hybridizácie očka a predĺženie s DNK polymerázou, a táto všeobecná metóda je opísaná napr. v Saiki et al., Science, 230, 1350-1354, atď.

PCR vykonávaná v predloženom vynáleze je doložená metódou, v ktorej DNK replikačný cyklus sa opakuje okolo 20 až 50 - krát, skôr okolo 25 až 40 - krát, V amplifikačnom tlmimovom roztoku skladajúcom sa z 1,0 mM až 4,0 mM, skôr 1,5 mM až 3,0 mM MgCl, roztoku, ktorý bol predtým zmiešaný so syntetickými oligonukleotidmi, DNK polymerázou, 4 typmi nukleotidov (dATP, dTTP, dCTP,a dGTP) a chmeíovými DNK, chloridom draselným, želatínou, hovädzím sérum albumínom, povrchovo aktívnou látkou (Tween 20, NP-40, Triton X-100, atď. (všetko obchodné názvy)), dimetylsulfoxidom, atď.

Okrem toho, každý krok v PCR môže byt vykonaný za nasledovných podmienok.

Denaturačný krok je uskutočnený zohriatím všeobecne od 90 °C do 95 °C, vhodnejšie pri 94 °C do 95 °C okolo 1. až 3 minút, vhodnejšie, okolo 1 až 2 minút.

Stupeň tepelnej hybridizácie očka, je vykonaný inkubáciou s očkami všeobecne pri teplote 30 °C až 50 °C, výhodnejšie pri teplote 35 °C až 42 °C po dobu 1 až 3 minút, výhodnejšie po dobu 1 až 2 minút.

Predlžovací stupeň s DNK polymerázou je vykonaný pomocou termostabilnej DNK polymerázy všeobecne pri teplote 70 °C až 73 °C, výhodnejšie pri teplote 72 °C až 73 °C, počas 1 až 4 minút, výhodnejšie počas 2 až 3 minút. Ako príklad termostabilnej DNK polymerázy, môže byt uvedený komerčný produkt od Perkin Elmera, s.r.o..

Takto amplifikované DNK môžu být vizualizované vyfarbovacou metódou, použitím zlúčeniny, ktorá interaguje s nukleovými kyselinami, napr., farbivá fenantridínovej série, tak ako etídiumbromid, atď’., a ktorá je predtým pridaná ku elektroforetickému tlmivému roztoku, napr., pri konečnej koncentrácii okolo 5μg/ml, a počas elektroforézy, s ožiarením gélu s ultrafialovým svetlom pri 254 nm, alebo 366 nm v tme môžu byt pozorované červené pásy DNK-etídiumbromidového komplexu. Avšak vo všeobecnosti, červené pásy DNK-etídiumbromidového komplexu sú detekované ponorením elektroforetického gélu do roztoku etídiumbromidu, atď. na okolo 10 až 60 minút po skončení elektroforézy, a následne sa gél ožiari s ultrafialovým svetlom pri 254 nm alebo 366 nm, v tme.

Virálna infekcia môže byt identifikovaná potvrdením prítomnosti, alebo neprítomnosti amplifikovaných DNK. Takže, istým očkom, špecifická so vzorkami pochádzajúcimi ale nie so vzorkami keď PCR je vykonaná s tým amplifikovaná DNK je detekovaná z vírusu infikovaného chmeľu, z neinfikovaného chmelu.

Napr. HLV môže byt detekovaný podlá metódy patentového nároku 14, prítomnosťou špecifického DNK fragmentu obsahujúceho 233, 181, 377 a respektíve 325 bázových párov.

2) Diagnóza génu hybridizáciou

Diagnóza HLV, na rozdiel od obvyklého stanovenia imuno-testom, môže byt uskutočnená nukleotidmi, ktoré majú sekvenciu komplementárnu ku génu kódujúcemu HLV obalovú bielkovinu, pripravenými alebo chemickou syntézou, alebo génovou manipuláciou, a hybridizujúcimi s oligonukleotidmi ako očkami.

Používané nukleotidové sondy sú všeobecne dlhé 20 až niekoľko tisíc bázových párov, a mali by byt napr. také, ktoré majú bázovú sekvenciu opísanú v sekvenčnej identifikácii číslo 6 a 7 v sekvenčnom zozname, a fragmenty DNK získané účinkom reštrikčných enzýmov z cDNK, ktorá bola pripravená z plazmidov získaných klónovaním génu HLV obalovej bielkoviny. Tieto nukleotidové sondy sú používané na hybridizáciu po značení izotopmi, biotínom, fluorescerom, atď, štandardnými metódami.

Aby sa nukleové kyseliny použili na hybridizáciu môžu sa extrahovať štandardnými metódami, napr. štandardnými metódami extrakcie nukleových kyselín ktoré sú opísané napr. v Murray & Thompson, Nucl. Acid Res., 8, 4321-4325, (1980), atď. Takto získané nukleové kyseliny sú predmetom denaturačného opracovania, a potom sú nakvapkané na membránový filter, tak ako nitrocelulózový filter, alebo nylonový filter, vhodný je napr., Hybond-N⁺ (Amersham).

Denaturačné opracovanie nukleových kyselín sa uskutočňuje zahriatím nukleovej kyseliny v roztoku obsahujúcom formamid, formaldehyd, MOPS, kyselinu octovú, EDTA atď. pri 60 °C až 70 °C, výhodnejšie pri 75 °C, 5 až 20 minút, výhodnejšie 15 minút, s následným rychlýra ochladením. Po tomto denaturačnom opracovaní, sa nukleové kyseliny zmiešajú s 20 x SSC, a potom sa nakvapkajú na membránový filter.

Hybridizácia sa uskutoční použitím takto obdržaného membránového filtra (s nakvapkanými nukleovými kyselinami z chmeľu) a sondy v hybridizačnom roztoku pri 42 °C až 65 °C, výhodnejšie pri 46 °C, 12 až 20 h, výhodnejšie 16 h. Potom sa membránový filter premyje, vysuší a prítomnosť alebo neprítomnosť signálu v kvapkách sa preverí detekčnými metódami, ako je napr. autorádiografia, atď.

Takže, signál je detekovaný nukleovými kyselinami pochádzajúcimi z vírusom-infikovaného chmeľu, pretože hybridizujú s nukleotidovou sondou, ale nedetekovateľný, ak pochádzajú z neinfikovaného chmeľu, pretože chýba hybridizácia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcom, bude predložený vynález opísaný detailne s odkazmi na príklady, ktoré sú určené na ilustráciu, neobmedzujúc vynález.

Príklad 1.

Izolácia HLV

Mladá úponková rastlina HLV-infikovaného chmeľu (1 kg) sa zomlela s 3-mi objemami 0,05 M fosfátového tlmivého roztoku (obsahujúceho 0,2 % askorbovej kyseliny, 0,2 % nikotínu, a 0,2 % PVP, pH 8,0), nechala sa stáť 1 h pri izbovej teplote a filtrovala sa cez gázu, aby sa získala surová šťava. Šťava sa tepelne spracovala (pri 55 °C, 8 min.), okamžite ochladila vo vodnom ľadovom kúpeli, a centrifugóvala 'pri 3 000 x g , 30 min, aby sa obdržal supernatant. K tomutu supernatantu sa pridal polyetylénglykol a chlorid sodný, v koncentrácii 5 %, respektíve 0,5 M, a výsledný roztok sa 1 h miešal, a potom centrifugoval pri 3 000 x g, 30 min. Takto obdržaná zrazenina bola suspendovaná v 0,5 M fosfátovom tlmivom roztoku (obsahujúcom 0,2 M EDTA, pH 7,4).

Ďalej, . hore uvedená suspenzia sa centrifugóvala pri vysokých otáčkach (pri 15 000 x g, 10 min.), aby sa získal supernatant, ktorý bol potom ultracentrifugovaný (pri 100 000 x g, 120 min), aby sa získala zrazenina. Tento proces sa opakoval dvakrát, aby bola virálna frakcia bez kontaminácie.

Takto získaná zrazenina sa suspendovala v 2 ml 0,01 M fosfátového tlmivého roztoku (pH 8.0) a centrifugovala (pri 150 OOO x g, 120 min.) v sacharózovom hustotnom gradiente (20 až 10 %), aby sa zbierali frakcie, ktoré obsahujú vírus.

Konečne, frakcie.boli centrifugované pri 180 000 x g, 150 min.,, aby sa získala zrazenina obsahujúca vírusové častice, ktorá bola ďalej resuspendovaná v 0,01 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 8,0) a odložená ako vyčistený vírusový preparát.

Treba ešte uviesť, že hore opísané postupy sa uskutočňovali pri 4 °C.

Príklad 2.

Extrakcia RNK z HLV.

Extrakcia RNK z častíc HLV sa vykonala SDS-fenolovou metódou (Proll et al., Potato research 24, 1--10, (1981).

K vyčistenému preparátu HLV (l pg/ml, 84μ1), obdržaného tou istou metódou ako v príklade 1, sa pridal 20 % SDS (5 μΐ), 20 x SCC (1 μΐ) a proteáza (výrobný názov: Proteáza K) (10 mg/ml, 10 μΐ), a výsledná zmes sa zohrievala pri 37 °C, 30 min.

Potom, sa vykonala fenolová extrakcia pridaním 0,5 % bentonitovej suspenzie (50μ1) a TE-nasýteného fenolu (150 μΐ) k hore uvedenej zmesi, a následná druhá extrakcia pri použití zmesy fenol:chloroform (1:1, v/v). Vodná vrstva sa extrahovala chloroformom. K tejto vodnej vrstve sa pridal 3 M octan sodný (10 μΐ) a chladený etanol (250 μΐ), a zmes sa nechala stáť pri -80 θθ, 30 min. Potom sa zmes centrifugovala pri 15 000 x g, 5 min, aby sa získala zrazenina. Zrazenina sa premývala centrifugáciou v 70 % etanole. Po odstránení etanolu sušením, takto získaná zrazenina sa rozpustila v destilovanej vode (50 μΐ). K tomuto roztoku sa pridal 4M chlorid lítny (50 μΐ), a výsledná zmes sa nechala stáť cez noc na lade.

Vyššie uvedená zmes sa centrifugovala pri 15 000 x g, 5 min., aby sa získala zrazenina, ktorá sa znovu premyla centrifugáciou v 70 % etanole, ako bolo uvedené vyššie. Po odstránení etanolu sušením, sa zrazenina rozpustila v destilovanej vode (8 μΐ) a odložila ako vzorka RNK.

Príklad 3 a defosforylol. (1 μΐ), 10 mM

Klónovanie cDNK cDNK bola pripravená zo vzorky RNK pripravenej v Príklade 2 za použitia cDNK syntetizačnej súpravy (Amersham) podlá protokolu špecifikovaného dodávatelom, a rozpustená v TE tlmivom roztoku (1 μΐ).

Potom sa plazmid pUC119 (500 ng/μΐ) rozštiepil so Smal K štepu (2μ1) sa pridala nasyntetizovaná cDNK ATP, 10 x ligačný tlmivý roztok (Behringer),

T4DNK ligáza (5υ/μ1, Behringer) a destilovaná voda (13 μΐ), a zmes sa inkubovala pri 22 °C cez noc na ligáciu.

Pripravili sa kompetentné bunky Escherichia coli MV1184, a zmiešali s ligačným reakčným roztokom (100 μΐ), a nechali sa štát na lade 30 min.

Potom sa reakčný roztok zohrievaný 60 sekúnd pri 37 °C, okamžite ochladil ladom, zmiešal s SOC médiom (500 μΐ), a výsledná zmes sa udržiavala 1 h, pri 37 °C. K tejto zmesi sa pridalo z každého, 2% X-gal, a 100 mM IPTG, po 50μ1, a výsledná zmes sa rozotrela na dve 2 x YT agarové platničky, obsahujúce ampicilín (50μ1/ιη1), a inkubovala cez noc pri 37 °C.

Z bielych kolónii E. coli takto získané plazmidy DNK sa extrahovali štandardnými metódami, a vybrali sa a odložili bunky majúce dlhé cDNK inzertné fragmenty.

Potom na potvrdenie, že cDNK pochádza z HLV genómu, vyčistená HLV-RNK sa čiastočne denaturovala alkáliami, a vybraná jednovlákonavá cDNK sa podrobila Southernovej hybridizácii za požitia nukleotidovej sondy, značenej s T4 polynukleotid kinázou na 5 -konci s [^,r³²P]ATP.

Výsledkom je, že sa získali kmene E. coli, nesúce plazmid cDNK inzertnými fragmentárni, dlhými 0,7 kb‘,‘ 1,2 kb, 1,3 5 kb,

3,5 kb a 5,0 kb, pochádzajúcimi z HLV genómu.

Príklad 4:

Stanovanie bázovej sekvencie cDNK, pochádzajúcej z HLV genómu

Bunky E. coli, nesúce plazmid s cDNK inzertným fragmentom pochádzajúcim z HLV genómu, ktorý bol získaný v Príklade 3, sa kultivavali na trepačke cez noc, v 2 x YT médiu, pri 37 °C, a plazmid sa vyčistil štandardnou metódou. cDNK fragmenty, pochádzajúce z HLV genómu boli pripravené z plazmidu štandardnými metódami, a s fragmentárni ako templátom, a ich bázová sekvencia bola dekódovaná s dideoxy metódou (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)), použitím DNK sekvenátora (ABI) a sekvenčnej súpravy (USB, SEQUENASE), a z toho sa stanovila sekvencia dlhá 1375 báz.

Výsledkom toho bola identifikácia dvoch otvorených čítacích rámcov (bázová sekvencia od 58 ' do 975 a bázová sekvencia od 981 do 1292 sekvencie identifikačného čísla 1 zo sekvenčného zoznamu) údajne kódujúcich HLV obalovú bielkovinu (306 aminokyselinových zvyškov, molekulová hmotnosť okolo

31,4 kD) a bielkovinu okolo 12,0 kD a 101 aminokyselinových zvyškov.

Okrem toho, domnelé aminokyselinové sekvencie odvodené z každej bázovej sekvencie sú ukázané v sekvencii identifikačného čísla 6 a 7 sekvenčného zoznamu. Medzi nimi, pretože aminokyselinová sekvencia ukázaná v sekvencii identifikačného čísla 6 obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu časti aminokyselinovej sekvencie HLV obalovej bielkoviny opísanej detailne dole, ich prítomnosť bola potvrdená.

Velmi sa očakáva, že tento vynález prispeje k produkcii chmelovej rezistencie uvedeného vírusu transformáciou takto získaného génu kódujúceho HLV obalovú bielkovinu. A tak, transformácia takých mikróbov, ako E.coli. atď., s menovanou obalovou bielkovinou, kódovanou takto získaným génom umožňuje produkciu uvedenej bielkoviny. Teda, na základe aminokyselinovej sekvencie uvedenej bielkoviny, môže sa získať z nej hociktorý fragmet použitím napr. bielkovinového analyzátora, atď. Obalová bielkovina, alebo fragment z nej, môže sa použiť na produkciu HLV protilátok, využiteľných na detekciu HLV.

Príklad 5

Stanovenie čiastočnej aminokyselinovej sekvencie HLV obalovej bielkoviny

Vyčistená vzorka HLV obalovej bielkoviny (ΙμΙ/ml, 120 μΐ) pripravená v Príklade 1, sa čiastočne opracovala proteolytickým enzýmom (Lysyl Endopeptidase, Wako Pure Chemikals), 16 h, pri izbovej teplote (25 °C).. Fragmenty takto obdržaných peptidov sa čistili frakcionáciou reverznou fázovou HPLC (použitím RepRPC HR5/5 kolónou, Pharmácia), a ich aminokyselinová sekvencia sa analyzovala z N-konca bielkovinovým sekvenátorom (ABI). Zistilo sa, že aminokyselinová sekvencia na N-koncoch troch peptidových fragmentov je kompletne identická s domnelou aminokyselinovou sekvenciou HLV obalovej bielkoviny. N-koniec aminokyselinovej sekvencie týchto troch peptidových fragmentov, a ich lokalizácia v aminokyselinovej sekvencii v HLV obalovej bielkovine, sú znázornené na Obr.l.

Príklad 6

Stanovenie -prítomnosti HLV, v HLV-infikovanom chmele, reverznou transkripciou PCR

Lístky HLV-infikovaného chmeíu (kultivar, Shinshu Wase) a bez-vírusivého chmelu (kultivar, Shinshu Wase) (každého 0,1

g) sa zomleli v 0,05 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 8,0, 1 ml) a extrahovali chloroformom. Potom sa supernatant opracoval s fenolom a trikrát s éterom, a aby sa nukleové kyseliny vyzrážali, pridal sa etanol. Takto získaná zrazenina sa premyla centrifugáciou v 70 % etanole, a potom sa nadbytočný etanol odstránil sušením, a zrazenina sa rozpustila v TE tlmivom roztoku (100 μΐ). Z tohoto sa použilo 2 μΐ podielu na reverznú transkripciu PCR.

Pre PCR boli vybrané štyri rôzne očká na základe jestvujúcich bázových sekvencii, a syntetizované štandardnými metódami s použitím DNK syntetizátora Model 380B (ABI), ktoré majú bázovú sekvenciu opísanú v sekvenciach identifikačného čísla 2 až 5 (označených 3P, 4P, 3M, resp. 4M). Každé očko sa pre reverznú transkripciu PCR použilo v kombinácii 3P/3M, 4P/3M, 3P/4M, a 4P/4M.

Reverzná transkripčná reakcia sa uskutočnila v tlmivom roztoku Tris-HCI (pH 8,3) pozostávajúcom ž 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT a 0,5 mM dNTPs, s komplementárnym vláknovým očkom (25 pmol), a reverznou transkriptázou (ANV-RTase XL, Takara Shuzo, 5 jednotiek) a k tomu sa pridala chmelová nukleová kyselina (2μg) pripravená ako je uvedené predtým, na 30 min., pri 55 °C.

Potom sa k vyššie uvedenej reakčnej zmesi pridala termostabilná DNK polymeráza (Behringer, 0,5 jednotky) a pre amplifikáciu očko (25 pmol), a vykonala sa PCR. Objem reakčného roztoku bol upravený na 10 μΐ, a na povrch sa navrstvil minerálny olej (20 μΐ), aby sa zabránilo odparovaniu reakčnej zmesi.

Každý stupeň sa uskutočnil za nasledujúcich podmienok. Jeden cyklus PCR pozostáva z denaturačného stupňa pri 94 °C, 1 min., z tepelnej hybridizácie očka, pri 55 °C, 1 min., a zo stupňa predĺženia DNK pri 72 ®C, 5 min., a odloží sa pri 4 θθ.

Amplifikované genomické DNK, získané vyššie opísaným

PCR, sa analyzovali elektroforézou na agarózovom géli.

DNK sa frakcionovali elektroforézou na 2 % agarózovom géli, v Tris-borátovom tlmivom roztoku (pH 8,0), obsahujúcom 2mM EDTA, 30 min., pri 100 V. Ako markery veíkosti sa použili markery molekulových hmotností DNK a DNK opracovaná s reštrikčnými enzýmami HindlII a EcoRI (Nippon Energy).

Po ukončenií elektroforézy, sa gél ponoril na 10 min. do vodného roztoku etídiumbromidu (0,5 μg/ml), a červené pásy DNK-etídium bromidového komlexu boli detekované po ožiarení gélu v tme s UV 254 nm.

Výsledky elektroforézy (dvakrát opakované) sú znázornené na Obr. 2, kde DW znamená sterilizovaná voda.

Výsledkom agarózovej gélovej elektroforézy je, že sa získali špecifické DNK amplifikované fragmenty z HLV-infikovaného chmeíu v závislosti od použitého očka, ale neboli získané z neifikovaného chmeíu, čo umožňuje tieto dve vzorky rozlíšiť.

Špecifické amplikované fragmenty DNK zodpovedajúce použitým očkám boli nasledovné,

3P/4M: 233 bázových párov 4P/3M: 181 bázových párov

3P/4M: 377 bázových párov a 4P/4M: 325 bázových párov.

Príklad 7

Stanovanie prítomnosti HLV v HLV-infikovánom chmele, dot blotovou hybridizáciou

Lístky HLV-infikovaného chmeíu (kultivar, Shinshu Wase) a bez-vírusového chmeíu (kultivar, Shinshu Wase) (každého 0,1 g) sa zomleli v 0,05 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 8,0, 1 ml) a extrahovali chloroformom. Potom sa supernatant opracovaný s chloroformom a trikrát s éterom, a na vyzrážanie nukleových kyselín sa pridal etanol. Potom sa takto získaná zrazenina premyla centrifugáciou v 70 % etanole, a po odstránení prebytočného etanolu, sa rozpustila v TE tlmivom roztoku (100 μΐ). Z toho sa 2 μΐ podielu pridalo k trom objemom tlmivého roztoku denaturujúceho nukleové .kyseliny (pozostávajúceho zo 63 formamidu, 20 % formaldehydu, 1,54 M MOPS, 6,5 mM ·. octanu sodného a 1,3 mM EDTA), a zmes sa zahrievala 15 min. pri 65 °C a potom sa okamžite ochladila. K tomuto roztoku sa pridalo 8 μΐ 20 x SSC (pozostávajúceho z 0,15 M chloridu sodného ,'-0,015 M citrátu sodného, pH 7,0), a pomiešalo. Z toho sa 10 μΐ podielu kvaplo na membránový filter (Amersham/ výrobnýnázov Hyobond-N⁺) a uskutočnila sa bodová hybridizácia; ·/'·''··· :

Výsledkom toho 'je výriešenie génovej štruktúry, ktorá kóduje HLV obalovú bielkovinu, a vyvinutie spôsobu detekcieHLV podía vynálezu, kde» zdĺhavé . postupytak ako ' Sú Obvyklá izolácia HLV, príprava; antiséra,.'čistenie protilátok atď, ;sa· stávajú nepotrebnéä·. stáva .- sa .-prístupná diagnóza vírusov HLV-infikovaného ; chmelú/; ktorá jé. pohodlnejšia a ;presnejšia ako ELISA. Okrem toho· predložený vynález môže prispieť k produkcii chmeíu rezistentného voči HLV použitím nukleových kyselín, bielkovín-a protilátok z vynálezu. · ' í.. .. ...

SEKVENČNÝZOZNAM 1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ:

(A) NÁZOV : SAPPORO BREWERIES LTD.

(B) ULICA: 20-1, Ebisu 4-chome, Shibuya-ku (C) MESTO: Tokyo (E) KRAJINA: Japonsko (F) POŠTOVÝ KÓD: 150 ii) NÁZOV VYNÁLEZU: GÉNY LATENTNÉHO VÍRUSU CHMEĽU A SPOSOB

ICH DETEKCIE iii) POČET SEKVENCIÍ: 7 iv) FORMA ROZPOZNÁVACIA POČÍTAČOM (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) PRÁVO PREDNOSTI Z PRIHLÁŠKY:

(A) PRIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-302297 (B) DÁTUM PODANIA: 27.10.1995 (vi) PRÁVO PREDNOSTI Z PRIHLÁŠKY:

(A) PRIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-352285 (B) DÁTUM PODANIA: 28.12.1995 (2) INFORMÁCIA O SEKV. IČ 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1375 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: bielkovina (xi) OPIS SEKVENCIE IČ 1:

TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAÁTG 60

GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120

GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180

TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240

AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300

CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360

CCGTACAATA AACCCJCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420

AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480

CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540

AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600

GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCG1 CTGCAGGTTG 660

TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720

GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780

AATGCTGCGG CTGTGCAACG ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840

ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900

GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960

TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020

TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080

ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAGAAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140

GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGAŤA 1200

ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260

GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320

TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCAGC 1375 (2) INFORMÁCIA O SEKV. IČ 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ 2:

TGAGGTCGTG TCAAACAAC 19 (2) INFORMÁCIA O SEKV.IČ: 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA 18 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ: 3:

GTTGATCTGG AGGGGTTG 18 (2) INFORMÁCIA O SEKV: IČ: 4:

' (i) CHARAkTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párových báz (B) TYPE: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovlákonavá (D) TOPÓLOGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ:4:

TCTCGGCATC CTTCTTTATT 20

2) INFORMÁCIA O SEKV: IČ: 5:

(i) CHARACTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párových báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovlákonavá ' (D) TOPÓLOGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ:5:

TTTCAACGTA ATCCAAGCAA T 21 (2) INFORMÁCIE O SEKV. IČ: 6:

(j) CljARAKTERISTjKA SEKyENCjE:

^! (A) DĹŽKA: 306 ^piinokysajín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÄKNAi jednovláknová · >'<·.·.

(D) TpPOLÓGIÁflineáma;': 1

C|i) TYR MOLEKULY: peptid , · , (xi) OPIS SEKVENCIE IČ: 6:

Met Ala Asp Lyz Gin Gly Gin Met Tre Glu Gin Gin Lyz.Val Asp Ser 15 10 15

Gin Lyz Leu Gin Gly Glu Ala Lyz Asn Lys Glu Lyz Ala Glu Ser Ser 20 25 30

Lyz Arg Lyz Asp Glu Leu Leu Lyz Lyz Tyr lle Asp Pro Gly Leu Gly 35 40 45

Ser Asp Asp Asp Glu Glu Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lyz Leu 50 55 60

Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg Ala Ala lle Arg Val Tre Asn Ala 65 70 75 80

Gly Leu Glu Tre Gly Arg Pro Ala Leu Lyz Pro Tre Pro Asp Met Leu 85 90 95

Pro Asp Pro Tre Asn Pro Tyr Asn Lyz Pro Ser Leu Asp Ala Leu Leu 100 105 110

Met lle Lyz Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Tre Ser Glu Asp 115 . 120 125

Met Met Lyz lle Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu 130 135 140

His Val Gin Ser Val lle Leu Gin Ala Val Phe Tyr Cys Lyz Asp Ser 145 150 155 160

Ser Ser Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Try Arg Gly 165 170 175

Gly Ala lle Ser Ala Asp Ser Val Leu Ala lle lle Lyz Lyz Asp Ala 180 185 190

Glu Tre Leu Arg Arg Val Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Tre Try Asn 195 200 205 u

Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro Pro Ser Asp Try Ser Glu Met Gly . 210 215 220

Phe Gin Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe Asp Cys Leu Asp Tyr Val 225 230 235 240

Glu Asn Ala Ala Ala Val Gin Pro Leu Glu Gly Leu lle Arg Val Pro 245 250 255

Tyr Ala Arg Glu Lyz lle Ala Asn Lyz Tre His Lyz Asp Leu Ala Leu 260 265 270

Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gin Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu lle 275 · 280 285

Tre Gly Gly Lyz Asn Gly Pro Glu Leu Gin Arg Asp Tyr Ser Lyz Ser 290 295 300

Asn Asn 305 .

(2) INFORMÁCIE O SEKV. IČ.: 7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 104 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE IČ:7:

Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lyz Phe Leu Glu 15 10 15

Gin Cys Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met lle Ser Leu Gin 20 25 30

Val His Arg Pro Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg 35 40 45

Arg Ala Lys Leu Val Gly Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Try Pro 50 55 60

Pro Tre Ala Phe Tre Tre Arg Cys Asp Asn Lyz Tre Cys Phe Pro Gly 65 70 75 80

Leu Tre Tyr Asn Ala Ser lle Ala Arg Phe lle Arg Asp Gly Val Tre 85 90 95

Glu Val lle Pro Ser Ala Pro Asn 100

Claims

1. DNK, kódujúca bielkovinu latentného vírusu chmelu vybraná zo skupiny pozostávajúcej z:

(a) molekúl nukleových kyselín kódujúcich polypetid obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 6 alebo 7;

(b) molekúl nukleových kyselín obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 1;

(c) molekúl nukleových kyselín obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 58 do 975, alebo od 981 do 1292 nukleotidovej sekvencie udanej v SEKV. IČ: 1;

(d) molekúl nukleových kyselín hybridižujúcimi s molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je definovaná v (a), (b), alebo (c); a (e) molekúl nukleových kyselín, ktorých nukleotidová sekvencia je vytvorená výsledkom genetického kódu ku nukletidovej sekvencii molekuly nukleovej kyseliny ktorá je definovaná v (a), (b), (c), alebo (d). .

2. DNK, ktorá hybridižuje s DNK podlá patentového nároku 1 a ktorá kóduje fragment, alebo mutovanú verziu polypeptidu, ktorý je definovaný v patentovom nároku 1.

3. Molekula nukleováj kyseliny, najmenej 15 nukleotidov dlhá, hybridizujúca špecificky s DNK podlá patentového nároku 1 alebo 2 alebo jej komplementárne vlákno.

4. Molekula nukleovej kyseliny podlá patentového nároku 3, vybraná zo skupiny pozostávajúcej z molekúl nukleových kyselín obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 2, 3, 4,a 5.

5. Vektor obsahujúci DNK podlá patentového nároku 1 alebo 2.

6. Vektor podlá patentového nároku 5, ktorého DNK je účinne viazaná na regulačnú jednotku, umožňujúcu expresiu v prokaryotických, alebo eukaryotických hostiteľských bunkách.

7. Hostiteľská bunka, obsahujúca vektor podľa patentových nárokov 5 alebo 6.

8. Hostiteľská bunka podľa patentového nároku 7, ktorou je bakteriálna, hubová, rastlinná alebo živočíšna bunka.

9. Spôsob výroby polypeptidu latentného vírusu chmeľu, alebo fragmentu, alebo jeho mutovanej verzie, pozostávajúci z kultivácie hostiteľských buniek podľa patentového nároku 7a 8 za podmienok dovolujúcich expresiu polypeptidu a získavanie produkovaných polypeptidov z kultúry.

10. Polypeptid kódovaný s DNK podlá patentového nároku 1 alebo 2, alebo pripravený spôsobom podlá patentového nároku 9.

11. Protilátky rozoznávajúce špecificky polypeptidy podlá patentového nároku 10.

12. Diagnostické zloženie obsahujúce DNK podlá patentového nároku 1 alebo 2, molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4, vektor podlá patentového nároku 5 alebo 6, polypeptid podľa patentového nároku 10 a/alebo protilátku podľa patentového nároku 11, a podmienky vhodné na detekciu.

13. Spôsob detekcie latentného vírusu chme.lu alebo príbuzného rastlinného vírusu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

(a) získanie nukleových kyselín z rastlín;

(b) amplifikáciu cielenej nukleovej kyseliny reverznou transkripčnou reťazovou reakciou, použijúc nukleovú kyselinu z (a) ako templát, a molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4 ako očko;

a voliteľne, (c) elektroforetickú analýzu takto získaných amplifikovaných produktov a tým detekciu prítomnosti latentného vírusu chmeľu, alebo príbuzného vírusu.

14. Spôsob podľa patentového nároku 13, vyznačujúci sa tým, že ako očká n$ amplifikáciu cieľovej nukleovej kyseliny sú vybraté párové očka zo skupiny pozostávajúcej z oligonukleotidov, ktorých sekvencia nukleových kyselín je udaná v SEKV. IČ: 2 a 4, SEKV. IČ: 3 a 4, SEKV. IČ: 2 a 5, a SEKV. IČ: 3 a 5 a elektroforetická analýza takto získaných amplifikovaných produktov potvrdzuje prítomnosť, alebo neprítomnosť špecifických fragmentov DNK obsahujúcich 233, 181, 377, respektíve 325 bázových párov.

15. Spôsob detekcie latentného vírusu chmeľu, vyznačujúci sa tým že zahrňuje (a) extrakciu nukleových kyselín z rastlín; a (b) hybridizáciu nukleovej kyseliny, ktorá bola získaná s očkom obsahujúcim DNK podľa patentového nároku 1 alebo

2 a molekuly nukloevej kyseliny podľa patentového nároku

3 alebo 4.

16. Spôsob podľa patentového nároku 15, vyznačujúci sa tým, že očko obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 4 alebo k nej komplementárnu nukleovú kyselinu predĺženú s uvedenou nukleovou kyselinou, ako očko.

17. Rastlinné bunky, obsahujúce DNK podľa patentového nároku 1 alebo 2, alebo molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4, a/alebo vektor podľa patentového nároku 5 alebo 6.

18. Rastlinné bunky podľa patentového nároku 17, vyznačujúce sa tým, že rastlinou je chmeľ.

19. Použitie DNK podľa patentového nároku 1 alebo nukleovej kyseliny podľa patentového nároku a/alebo vektora podľa patentového nároku 5 alebo hostiteľskej bunky podľa patentového nároku a/alebo polypeptidu podľa patentového nároku protilátky podľa patentového nároku 11 pre patogénnej rezistencie rastlín.

2, molekuly 3 alebo 4,

6, a/alebo 7 alebo 8, 10, a/alebo inžinierstvo

20. Použitie podlá patentového nároku 19, vyznačujúce sa tým že, patogénom je vírus.

21. Použitie podlá patentového nároku 20, vyznačujúce sa tým že vírusom je latentný vírus chmeľu, a rastlinou je chmel.

~rv mí-ic

170

AAGATGAGTT GCTTAAG

180

AAG TAC ATT GAT CCT GGG CTA GGG TCT GAT GAT GAT GAA GAG GAG ATG GTG Lyz Tyr lle Asp Pro Gly Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Glu Met Val

240

GAATTGAGATTG AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAAC

310

TAACGCAGGG CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGAC ATG CTG CCT

Met Leu Pro

380

GACCCTACC AAC CCGTACAAT AAACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTA Asp Pro Tre Asn Pro Tyr Asn

450

GGGT CGTGTCAAAC AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATC TGC GTT GAT lle Cys Val Asp

490

CTG GAG GGG TTG GGC GTG CCC ACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro

Obr. 1

M 3P/3M 4P/3M 3P/4M 4P/4M 3P/4M VI VF VI VF VI VF VI VF DW DW