SK127797A3 - Fucopeptides, method for preparing the same, their use as medicaments and pharmaceutical composition containing the same - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka fukopeptidov,. spôsobu ich prípravy, ich použitie ako liečivá a farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú.

Doterajší stav techniky

Všeobecne sa uznáva, že skupina receptorov, nazývaných selektíny, sa podieľa na rozpoznávaní rôznych cirkulujúcich buniek endotelom a krvnými doštičkami a hrá úlohu pri niektorých ochoreniach, vrátane rakoviny, autoimunitných porúch, zápalov, aterosklerózy a zrážania krvi. Známe sú tri receptory patriace do tejto skupiny: L-selektín, P-selektín a E-selektín.

E-selektín (rovnako označovaný ako endotelová molekula pre adhéziu leukocitov, endothelial leukocyte adhesion molecule, ELAM-1), je proteín nachádzajúci sa na povrchu buniek, indukovateľne exprimovaný endotelovými bunkami. Jeho produkcia je napríklad zvýšená na vaskulárnych endotelových bunkách,, ak bolo susediace tkanivo poškodené alebo napadnuté mikroorganizmom. E-selektín rozpoznáva sialyl-Lewis X (SLe^x), čo je glycidový ligand nachádzajúci sa na povrchu neutrofilov a monocytov, zachytený na ich vonkajšej membráne pomocou integrálnych membránových glykoproteínov alebo/a glykolipidov. SLe sprostredkováva väzbu neutrofilov a monocytov na aktivované bunky cievneho endotelu pomocou väzby na E-selektín, takže tieto leukocyty môžu difundovať do poškodeného tkaniva.

Avšak existuje mnoho situácií, keď je príjem leukocytov adhéziou na endotelové bunky abnormálny a nadmerný a konečným výsledkom je namiesto opravy tkanív ich poškodenie.

Aj keď je SLe^x považovaný za potenciálne vhodné protizápalové činidlo, bola vypracovaná jeho syntéza a bol syntetizovaný vo veľkom množstve pre klinické hodnotenie, možno tento prirodzený sacharid použiť iba v injekčnej forme v prípadoch s akútnymi symptómami, nakoľko pri orálnom podaní je neaktívny a vykazuje krátky polčas v krvi.

Potrebné sú teda zlúčeniny, ktoré môžu brániť väzbe ligandov na selektíny a tým iniciácii procesu bunkovej adhézie.

Podstata vynálezu

Vynález opisuje zlúčeniny všeobecného vzorca I

v ktorom

i)

R predstavuje metylovú skupinu, a alebo

T

R znamená zvyšok všeobecného vzorca a^, alebo a2 <.

m má hodnotu 2 alebo 3, n má hodnotu 2 alebo 3,

M predstavuje katión,

R znamená atóm vodíka alebo nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový zvyšok s až 20 atómami uhlíka, prípadne nesúci v cu-polohe formylovú skupinu alebo acetalové zoskupenie odvodené od alkoholu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo diolu s 2 až 4 atómami uhlíka,

R³ predstavuje atóm vodíka, skupinu -CH₂OH alebo -CH₂CH₂OH, a

R⁴ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, skupinu -CH₂OH, -CH₂CH₂OH alebo -CH₂CH₂CH₂OH, s tými podmienkami, že

1) jeden zo symbolov R³ a R⁴ predstavuje atóm vodíka, a

2) ak R⁴ predstavuje atóm vodíka, R³ znamená skupinu

-CH₂OH alebo -CH₂CH₂OH, a

3) ak R³ predstavuje atóm vodíka, R⁴ znamená metylovú skupinu, skupinu -CH₂OH, -CH₂CH₂OH alebo -CH₂CH₂CH₂OH, alebo

R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca b

R⁵ predstavuje skupinu všeobecného vzorca b-|_,b₂,b₃ alebo b_a

R^7a

I

MOOC-ÝCH₂4z-CH-CO-NH-C— (b,) ^p I I

R⁶ R*

MOOC —CH—ŕCH₂-^—CO—NH— CH~ kde p má hodnotu 1 alebo 2, q má hodnotu 2 alebo 3, r má hodnotu 1 alebo 2, g v

R znamená atóm vodíka, aminoskupinu alebo skupinu -NHR , kde

R^x predstavuje ochrannú skupinu amínovej funkčnej skupiny

R^7a znamená skupinu -CH₂OH, -CH₂CH₂OH alebo -CH(OH)-CH₂OH, a *7

R^/d predstavuje atóm vodíka, alebo obidva symboly R^7a a R⁷^ znamenajú vždy skupinu CH₂OH,

Ί Ί

R predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu,

R¹³ znamená skupinu -(CH₂)j-COOM alebo -SO^M, kde j má hodnotu 1, 2 alebo 3, a

M má vyššie definovaný význam, pričom druhá hydroxyskupina ako substituent fenylovej skupiny vo zvyšku všeobecného vzorca b₄ je v ľubovoľnej meta-polohe, alebo

R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca c

I o-ch-ch₃

I (c) r⁹-co-nh-ch-cor⁸ kde

R⁸ predstavuje skupinu OM¹, OR¹⁴, R^s-rP alebo -NHRY, kde

M·!· znamená katión,

R¹⁴ predstavuje nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový zvyšok,

R^s znamená spojovaciu skupinu,

R^p predstavuje fosfatídylový zvyšok a

Rľ znamená nasýtený alebo nenasýtený lipofilný zvyšok, a

R⁹ predstavuje skupinu všeobecného vzorca 0^,02,0^ alebo c_a, OH zOH

R⁶ _R10d

I

Ŕ¹⁰

CH,

MOOC - CH—ŕ CH₂)_s- CO - NH - C MOOC - CH—ŕCH₂-^— CO - NH - CH Ιδ·

O-C_<4alkyl kde s má hodnotu 1 alebo 2, t má hodnotu 1 alebo 2, v má hodnotu 2 alebo 3, symboly M, R⁶,R¹¹ a R¹³ majú vyššie definované významy, a R^10a znamená skupinu -CH₂OH, -CH₂CH₂OH alebo -CH(OH)-CH₂OH a _R10b predstavuje atóm vodíka, alebo obidva symboly R^10a a R¹⁰^⁵ znamenajú vždy skupinu CH₂OH, pričom druhá hydroxyskupina ako substituent fenylovej skupiny vo zvyšku všeobecného vzorca c₂ je v ľubovoľnej meta-polohe, alebo v ktorom ii) rI predstavuje hydroxyskupinu, a

R znamená zvyšok všeobecného vzorca d o¹2a

FT 7

I H I

MO°C~tCH₂^-CH —CO-N—C-CO-NH-CH₂Ŕ^12b kde w má hodnotu 1 alebo 2,

R.l^2a znamená skupinu -CH (OH) - (CH₂) _χ-0Η, a

Rl2b predstavuje atóm vodíka, alebo obidva symboly R^12a a R¹²^ nezávisle na sebe znamenajú vždy skupinu -CH₂OH alebo -CH₂CH₂OH, x má hodnotu 2 alebo 3, a r symboly R a M majú vyššie definované vyznamy.

Symbol M môže predstavoval katión H⁺ alebo ľubovoľný katión tvoriaci soľ s karboxylovým alebo sulfátovým aniónom, ktorý zachováva rozpustnosť zlúčeniny všeobecného vzorca I vo vode, napríklad môže ním byť monovalentný katión alebo jeden ekvivalent polyvalentného katiónu. Môže ísť napríklad o ión alkalického kovu, ako je lítium, sodík alebo draslík, katión kovu alkalickej zeminy,, ako je vápnik alebo horčík, ako aj ióny zinku, železa a hliníka a amónny ión (NH₄ ⁺). M výhodne predstavuje katión H⁺, Li⁺ alebo Na⁺. Výhodne je katiónom M farmaceutický prijateľný katión. Ak je katión polyvalentný, je rovnako prítomný príslušný počet molekúl zlúčenín všeobecného vzorca I, alebo zmesi molekúl zlúčenín všeobecného vzorca I a jedného alebo viacerých príslušných aniónov, ako je acetátový anión, chloridový anión, karbonatový anión a podobne. M môže mať nezávisle jeden z významov uvedených vyššie pre symbol M, výhodne je rovnaký ako M.

Ak R^x predstavuje ochrannú skupinu amínovej funkčnej skupiny, môže ísť o skupiny opísané v práci Protective Groups in Organic Synthesis, T.W.Greene, J.Wiley and Sons NY, druhé vydanie, kapitola 7, 1991, a v prácach, ktoré sú tam citované, pričom sa výhodne jedná o farmaceutický prijateľnú ochrannú skupinu amínovej funkčnej skupiny, najmä terc-butoxykarbonylovú alebo benzyloxykarbonylovú skupinu.

Ak symbol R² vo zvyšku všeobecného vzorca a-]_ predstavuje nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový zvyšok, môže ísť napríklad o alkylovú skupinu s 1 až 20 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 20 atómami uhlíka alebo alkinylovú skupinu s 2 až 20 atómami uhlíka. Medzi príklady symbolov R^z ktoré nesú formylovú skupinu patrí napríklad 2-oxoetylová skupina, 3-oxopropylová skupina,5-oxo-3-pentenylová skupina,

8-oxooktylová skupina a 10-oxo-4-decenylová skupina. Ak R² znamená alkyl- alebo alkenylacetálové zoskupenie vytvorené z alkoholu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo diolu s 2 až 4 atómami uhlíka, môže sa jednať napríklad o ľubovoľné z acetalových zoskupení, ktoré sa môžu pripraviť z vyššie uvedených aldehy8 dových skupín s použitím alkoholov s 1 až 4 atómami uhlíka alebo diolov s 2 až 4 atómami uhlíka, napríklad metanolu, etanolu, izopropanolu, sek.butanolu, n-butanolu, etylénglykolu, propylénglykolu, 2,3-butándiolu, 1,4-butándiolu alebo 1,3-butándiolu. Výhodne R² predstavuje atóm vodíka.

Alkylovou skupinou s 1 až 4 atómami uhlíka vo význame symbolu R⁴ vo zvyšku všeobecného vzorca a₁ je výhodne metylová skupina.

Ak symbol R⁸ predstavuje skupinu R^s-rP alebo NHR^, výsledná zlúčenina všeobecného vzorca I môže byt, alebo je, vhodne použitá ako súčast lipozómovej membrány na prípravu lipozómov, ktoré slúžia ako prostriedok na podanie tejto zlúčeniny. Spojovacou skupinou R^s je zvyšok, ktorý spája karbonylovú skupinu s kyslíkom fosfatidylového zvyšku, napríklad uhľovodíkový zvyšok. Fosfatidylovým zvyškom je glycerofosfátový zvyšok esterifikovaný nasýtenými alebo/a nenasýtenými mastnými kyselinami, napríklad kyselinou myristovou, palmitovou, stearovou, palmitolejovou alebo olejovou.

Symbol R^ môže predstavovať nasýtený alebo nenasýtený alifatický zvyšok, ktorý prípadne obsahuje funkčnú skupinu, alebo je prerušený funkčnou skupinou, napríklad skupinou -C0-, napríklad sa jedná o zvyšok na báze diesteru dikarboxylovéj kyseliny nesúceho nasýtené alebo nenasýtené mastné alifatické zvyšky. R Y výhodne znamená skupinu vzorca

X-0

C - CH - CH₂ - CH₂ - C

O-Y

NH-Z· kde symboly X a Y nezávisle na sebe predstavujú vždy alkylovú skupinu s 8 až 20 atómami uhlíka alebo alkenylovú skupinu s 8 až 20 atómami uhlíka, a

Z znamená mostíkovú skupinu, napríklad polyetylénoxyskupinu, výhodne polyetylénoxyskupinu obsahujúcu 3 až 50, a ešte výhodnejšie 3 až 15, etylénoxydových jednotiek, alebo skupinu -alkylén-CO- s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylénovej časti alebo skupinu - fenylén-CO-.

V zlúčeninách všeobecného vzorca I sú výhodné nasledujúce významy jednotlivých všeobecných symbolov, a to buď jednotlivo alebo v ľubovoľnej kombinácií alebo subkombinácii:

1. R predstavuje metylôvú skupinu a R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca a^,

2. R vo zvyšku všeobecného vzorca aj_ znamená atóm vodíka, . vo zvyšku všeobecného vzorca symbol R³ znamená atóm vodíka a R⁴ predstavuje hydroxymetylovú skupinu,

4. vo zvyšku všeobecného vzorca a-^ symbol R³ znamená atóm vodíka a R⁴ predstavuje metylôvú skupinu,

5 .	R	predstavuje všeobecného	metylôvú skupinu vzorca b,	a R1 znamená	zvyšok
6 .	R5	vo zvyšku všeobecného	všeobecného vzorca vzorca b-j_,	b predstavuje	zvyšok
7 .	vo	zvyšku všeobecného vzorca b^	symbol R7a predstavuje

skupinu CH₂OH alebo CH(OH)-CH₂OH a R⁷^ znamená atóm vodíka,

8. vo zvyškoch všeobecného vzorca a₂ a b₃ je skupinou -O-alkyl s 1 až 4 atómami uhlíka výhodne metoxyskupina,

9. R predstavuje metylôvú skupinu a R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca c,

10. R⁸ vo zvyšku všeobecného vzorca c predstavuje alkoxyskupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, výhodne metoxyskupinu alebo etoxyskupinu, g

11. R vo zvyšku všeobecného vzorca c znamená zvyšok všeobecného vzorca c-^,

12. vo zvyšku všeobecného vzorca ο_Ί symbol R^18a predstavuje skupinu CH(OH)-CH₂OH a R¹⁰^ znamená atóm vodíka

13. R^y vo zvyšku všeobecného vzorca c znamená zvyšok všeobecného vzorca c₂,

14. R⁶ vo zvyšku všeobecného vzorca c₂ predstavuje aminoskupinu,

15. R¹ znamená hydroxyskupinu a R predstavuje zvyšok všeobecného vzorca d, i 9 a

16. vo zvyšku všeobecného vzorca d symbol R predstavuje skupinu CH (OH) - (ΟΗ₂)_χ-ΟΗ a R^²^¹ znamená atóm vodíka.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I môžu obsahovať jeden alebo viac asymetrických atómov uhlíka. Vynález zahŕňa, ak nie je uvedené inak, všetky individuálne izomérne formy, enantiomšry a diastereoizoméry, ako aj ich zmesi, napríklad racemáty.

Vo zvyšku všeobecného vzorca a-^ je asymetrický atóm uhlíka, ktorý nesie symbol R³ výhodne v nasledujúcej konfigurácii:

F#

RVo zvyšku všeobecného vzorca b_1# ak je atóm uhlíka, ktorý nesie symboly R^7a a R⁷^ asymetrický (keď R⁷^¹ predstavuje atóm vodíka), je tento atóm uhlíka výhodne v nasledujúcej konfigurácii: y_a n

A. x H

To isté platí pre asymetrický atóm uhlíka, ktorý nesie symbol R^10a, ak R¹⁰^ predstavuje atóm vodíka, vo zvyšku všeobecného vzorca c^.

Vo zvyškoch všeobecných vzorcov b₂ a c₂ zvyšok výhodne v nasledujúcej konfigurácii:

je pyrolidinylový

Vo zvyškoch všeobecných vzorcov a c₂ je asymetrický atóm uhlíka, ktorý nesie substituovaný benzylový zvyšok výhodne v nasledujúcej konfigurácii:

oh

X, OH

CH, H

K

Zvyšok všeobecného vzorca c vykazuje výhodne nasledujúce stereochemické usporiadanie:

O/, 'h„ /CH,

R⁹ - CO - HN

C\ Q / COOFT

Ί O

Vo zvyšku všeobecného vzorca d je v prípade, že R ° predstavuje atóm vodíka, asymetrický atóm uhlíka , ktorý nesie symbol R výhodne v nasledujúcej konfigurácii:

,12α

C — — NH

Vynález zahŕňa rovnako spôsob prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I. Tieto zlúčeniny sa môžu pripraviť, analogicky ku známym postupom. Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu pripraviť napríklad odstránením aspoň jednej ochrannej skupiny, ktorá je prítomná v zlúčenine všeobecného vzorca I v chránenej forme, napríklad vo forme s chránenou aminoskupinou alebo/a hydroxyskupinou.

Zlúčeninami všeobecného vzorca I v chránenej forme sú hlavne zlúčeniny, v ktorých je chránená hydroxyskúpina (alebo hydroxyskupiny) fukosového zvyšku. Skupiny ktoré je možné v prípade zlúčenín podľa vynálezu použiť na blokovanie alebo chránenie hydroxyskupiny sú odborníkovi v odbore dobre známe, a výhodne je možné tieto skupiny, ak je to žiadúce, odstrániť pomocou spôsobov ktoré nevyvolávajú žiadne zrejmé poškodenie zostávajúcej časti molekuly, napríklad chemickou alebo enzymatickou hydrolýzou, ošetrením chemickými redukčnými činidlami za miernych podmienok, ožiarením ultrafialovým svetlom alebo katalytickou hydrogenizáciou. Skupinami chrániacimi (blokujúcimi) hydroxylovú funkčnú skupinu, ktoré sa výhodne používajú, sú ochranné skupiny bežné v chémii glycidov najmä pre primárne alkoholy, sekundárne alkoholy a vicinálne cis- a trans-.

Vhodnými ochrannými skupinami hydroxylovej funkčnej skupiny môžu byť napríklad acylové skupiny, ako je acetylová, trichlóracetylová, fenoxykarbonylová, benzyloxykarbonylová, benzhydryloxykarbonylová, trityloxykarbonylová a 2,2,2 - tri chlóretoxykarbonylová skupina, éterové skupiny, ako je metoxymetylová skupina, benzyloxymetylová skupina, alylová skupina, benzylová skupina, p-metoxybenzylová skupina, p-nitrobenzylová skupina, benzhydrylová skupina, tritylová skupina alebo tri13 organosily- love skupiny, ako sú trialkylsilylové skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka v každej alkylovej časti (napríklad trimetylsilylová, trietylsilylová, triizopropylsilylová, izopropyldimetylsilylová, terc-butyldimetylsilylová, metyldiizopropylsilylová alebo metylditerc-butylsilylová skupina), terc-butyldifenylsilylová skupina, triarylsilylové skupiny (napríklad trifenylsilylová alebo tri-p-xylylsilylová skupina) alebo triaralkylsilylové skupiny (napríklad tribenzylsilylová skupina). Príklady skupín a iných vhodných ochranných skupín hydroxylovej funkčnej skupiny, napríklad na chránenie dvoch hydroxyskupín v polohách 1,2 alebo 1,3, ako sú napríklad cyklické éterové skupiny, ako sú prípadne substituované metylénacetalové alebo etylidénacetalové zoskupenia, a spôsoby ich vytvárania a odstraňovania sú v odbore známe, viď napríklad Protective Groups in Organic Synthesis, druhé vydanie, T.W.Greene a P.G.M.Wuts, John Wiley and Sons, New York, 1991, kapitola 2 a citácie tam uvedené.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R^ predstavuje skupinu NHR^X, sa môžu rovnako premeniť na zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R^ znamená aminoskupinu, odstránením skupiny R^x chrániacej aminoskupinu.

Takto získané zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu izolovať. vo voľnej forme alebo vo forme soli.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I v chránenej forme, v ktorých R predstavuje metylovú skupinu a R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca a, používané ako východiskové materiály, sa môžu pripraviť napríklad ako je uvedené v schéme 1.

Schéma i

X predstavuje ochrannú skupinu hydroxylovej funkčnej skupiny, napríklad ako sú uvedené vyššie. R' znamená odstupujúcu skupinu, napríklad ochrannú skupinu amínovej funkčnej skupiny, napríklad terc-butoxykarbonylovú skupinu (Boe) alebo 9-fluorenylmetoxykarbonylovú skupinu (Fmoc). Výhodne sa východiskové materiály na získanie zlúčenín všeobecného vzorca I v požadovanej konfigurácii používajú vo forme špecifických enantiomérov.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I v chránenej forme, v ktorých R predstavuje metylovú skupinu a R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca b, používané ako východiskové materiály, sa môžu pripraviť napríklad ako je uvedené v schéme 2.

zlúčenina II ___ kondenzácia

RV predstavuje odstupujúcu skupinu, napríklad atóm halogénu, výhodne atóm fluóru. Stupňom ii je redukcia, ktorá sa môže uskutočňovať pomocou dobre známych postupov pre redukciu azidoskupiny, ako je reakcia s fosfínom, napríklad trifenylfosfinom, alebo s hydridom, napríklad lítiumalumíniumhydridom. Stupeň iii je vytváranie amidovej väzby, napríklad ako je známe v odbore chémie peptidov. Zlúčenina II sa môže vybrať zo skupiny zahŕňajúcej napríklad zlúčeniny Asp-Se-OH, Glu-Ser-OH a Glu-(a-hydroxymetyl)Ser-OH v chránenej forme, napríklad môže ísť o nižšie uvedenú zlúčeninu 10. Stupeň iii môže zahŕňať rovnako kondenzáciu so zodpovedajúcou aminokyselinou v chránenej forme s nasledujúcou reakciou s derivátom dikyseliny, ako je to uvedené v schéme 1.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I v chránenej forme, v ktorých R predstavuje metylovú skupinu a znamená zvyšok všeobecného vzorca c, sa môžu pripraviť napríklad ako je uvedené v schéme 3.

Schéma 3

zlúčenina IV

Symbol R^8a predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka. Symbol R^a znamená ochrannú skupinu amínovej funkčnej skupiny. Zlúčenina IV sa môže vyrábať napríklad zo skupiny zahŕňajúcej 2-amino-3,4-dihydroxymaslovú kyselinu, a-hydroxymetylserín a Glu-Tyr-OH v chránenej forme, napríklad môže ísť o (2S,3R)-N-terc-butoxykarbonyl-2-amino-4-benzyloxy-3-hydroxyQ 3 maslovú kyselinu. Zoskupenie R CO predstavuje aminokyselinový zvyšok (prípadne zakončený zvyškom dikyseliny) zlúčeniny IV. Stupne i) a ii) sú reakciami, pri ktorých sa vytvára amidová väzba, ktorá sa uskutočňuje podl'a štandardných postupov. Stupeň ii) môže rovnako zahŕňať kondenzáciu so zodpovedajúcou aminokyselinou v chránenej forme s nasledujúcou reakciou s derivátom dikyseliny, ako je to uvedené v schéme 1. Stupeň ii) môže ďalej rovnako zahŕňať konverziu skupiny -COOR^8a na skupinu -COR⁸, napríklad na kyselinu, sol' kyseliny, lipofilný ester alebo lipofilný amid, napríklad ako je to opísané v príkladoch 44 a 45. Zlúčeninu III je možné použiť vo forme niektorého z jednotlivých enantiomérov alebo vo forme zmesí. Vyššie uvedená schéma 3 znázorňuje prípravu zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom R predstavuje metylovú skupinu a R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca c, vo výhodnej konfigurácii.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I v chránenej forme, v ktorých R¹ predstavuje hydroxyskupinu a R znamená zvyšok všeobecného vzorca d, kde R^³· predstavuje skupinu CH(OH)-(CH₂)_χ-0Η používané ako -východiskové materiály, sa môžu pripraviť napríklad ako je uvedené v schéme 4.

Schéma 4

zavedenie ochrannej skupiny na dusíku

OH o

RHN kondenzácia odstránenie ochrannej skupiny

OX

OX

OX

H/<

OX

z dusíka xo^ •(CHJx

OX ox

RHN

Výhodne dve vicinálne skupiny xylovej funkčnej skupiny) spoločne skupinu

X (ochranné skupiny hydrona fukózovom zvyšku tvoria

H₃C

Vyššie uvedené reakcie sa môžu uskutočňovať analogicky ku známym postupom, napríklad ako je opísané v nasledujúcich príkladoch. Pokiaľ nie je príprava východiskových materiálov konkrétne opísaná, tieto zlúčeniny sú známe alebo sa môžu pripraviť analogicky k postupom známym a používaným v odbore.

Vynález ilustrujú nasledujúce príklady, v ktorých sa používajú tieto skratky:

Ac = acetyl

Bn = benzyl

Boe = terc-butoxykarbonyl

Fmoc = 9 - fluorenylmetoxykarbonyl

DAST = dietylaminosulfurtrifluorid

EDCI = 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydrochlorid

EDAC = l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimid

DMF = dimetylformamid

HOBT = 1-hydroxybenzotriazol

TFA = kyselina trifluóroctová

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

AcO

HO

HO

BnO

Na⁺ -OjC- (CHj)₃

CONH í⁶) (7)

Zo zlúčeniny 6 sa odstránia ochranné skupiny tak, že sa podrobí reakcii s plynným vodíkom pri použití paládia na uhlí ako katalyzátora, a následne sa podrobí reakcii s metoxidom sodným, čím sa získa sodná sol' zlúčeniny 7.

^H-NMR (500 MHz, deutériumoxid) , hodnoty δ: 1,16 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 1,75 - 1,92 (m, 4H), 2,35 (m, 1H), 3,20 (m, 1H),

3,43 (m, 1H), 3,55 (dd, J = 6,0, 12,0 Hz, 1H), 3,67 (dd, J = 3,0, 12,0 Hz, 1H), 3,73 (m, 2H), 2,84 - 4,02 (m,4H).

¹³C-NMR (125 MHz, deutériumoxid) hodnoty δ:

34,3, 35,4, 37,5, 56,5, 63,4, 68,2,

72,6, 74,4, 166,8, 172,5, 177,0.

16.6, 21,6, 24,5,

68.7, 70,8, 71,9,

Hmotnostná spektrometria:

vypočítané pre ^ci7^H3i°io^N2^{: 423} nájdené pri elektrosprayovej ionizácii: m/z 423 (MH)

Zlúčeninu 6, používanú ako východiskový materiál, je možné pripraviť nasledovne:

a) Fukóza-tetraacetát sa podrobí pri laboratórnej teplote v suchom acetonitrile reakcii s alyltrimetylsilánom a bórtrifluorideterátom, čím sa získa zlúčenina 2 (pomer α : β je vyšší ako 10 : 1). [Kozikowsky, A.P. a Sorgi, K.L., Tetrahedron Lett. (1983) , 24 : 1563]

b) Zlúčenina 2 sa ozonolyzuje reakciou s ozónom s prítomnosťou trifenylfosfínu. Získaný aldehyd sa potom in situ podrobí redukčnej aminácii reakciou s plynným vodíkom pri použití paládia na uhlí ako katalyzátora, pri prítomnosti octanu amónneho, čím sa získa zodpovedajúci fukóza-tetraacetát, ktorý nesie 2-aminoetylovú skupinu (zlúčenina 3).

c) Zlúčenina 3, získaná vyššie, sa podrobí reakcii s (1S,2R)- 2 -N- terc-butoxykarbonylamino-4 -benzyloxy-3 -hydroxymaslovou kyselinou (pripravenou z glycínu a O-benzylglykoaldehydu reakciou katalyzovanou treonín-aldolázou, ako opísali Wong a kol., Tetrahedron Lett. , 1995, 36, 4081) v 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydrochloridovom roztoku, čím sa získa amid 5 .

d) Zo zlúčeniny 5 sa odstráni ochranná skupina reakciou s etylacetátom v roztoku v 4N kyseline chlorovodíkovej. Produkt, z ktorého bola odstránená ochranná skupina, sa potom in situ podrobí reakcii s anhydridom kyseliny glutarovej v trietylamínovom pufri, čím sa získa zlúčenina 6.

Analogickým postupom ako je opísaný vyššie v príklade 1 sa môžu pripraviť zlúčeniny všeobecného vzorca

♦ 1 0 v ktorom majú symboly R , R , n a m významy uvedené nižšie v tabuľke 1.

Tabuľka 1

príklad	R1	R2	n	m
2	ch2oh	H	2	3
3	CH 3	H	1	3
4	H	ch2oh	1	3
5a	ch3	H	1	2
5b	ch2ch2oh	H	1	2
5c	ch2ch2oh	H	1	3

Analogickým postupom ako je opísaný vyššie v príklade 1, ale s použitím príslušných východiskových materiálov, sa môže získať, zlúčenina z príkladu 6:

122 mg (0,12 mmol) sa rozpustí v 2 ml metanolu, pridá sa 20 mg hydroxidu paládnatého na uhlí a zmes sa mieša v atmosfére vodíka pri tlaku 100 kPa počas 12 hodín. Katalyzátor sa odstráni filtráciou cez celit a produkt sa vyčistí chromatografiou na silikagéli pri použití zmesi trichlórmetánu a metanolu v pomere 3 : 1 ako elučného činidla a chromatografiou na biogéle P2 pri použití vody. Po vyčistení sa získa zlúčenina 12.

^H-NMR (500 MHz, deutériumoxid), hodnoty δ: 1,48 (d, 3H, j = =7,0, H-6), 1,47 - 1,74 (m, 4H), 1,74 (s, 9H) , 2,00 - 2,11 (m, 3H), 2,47 (m, 1H), 3,64 (s, 1H, H-4), 3,76 (m, 1H), 3,97 - 4,25 (m, 6H, H-2, H-3, H-5), 4,65 - 4,74 (m, 2H) , 5,31 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-l) ¹³C-NMR (125 MHz, deutériumoxid)

24,51,

55,99,

170,9,

28,18,

62,39,

171,1,

30,18,

67,12,

174,7,

31,60,

68,42,

178,1.

hodnoty δ: 15,80, 23,73, 39,68, 49,47, 53,42, 55,89, 70,08, 72,39, 94,38, 94,65,

Hmotnostná spektrometria (HRMS) pre ^C24^H41^N3°12^Cs (M+Cs⁺): vypočítané : 696,1745 nájdené: 696,1717

Zlúčeninu 11, používanú ako východiskový materiál môžeme pripraviť nasledovne: a)

2,3,4-tri-O-benzyl-L-fukopyranóza sa pri teplote 0 °C rozpustí v bezvodom dichlórmetáne a prikvapká sa 1,06 g (0,0066 mol) dietylaminosulfurtrifluoridu (DAST). Zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas 30 minút a potom sa reakcia ukončí pridaním vody. Vodný roztok sa extrahuje dichlórmetánom a organické frakcie sa zmiešajú, vysušia sa nad síranom horečnatým a sfiltrujú. Odparí sa rozpúšťadlo a fluorid sa použije na glykosyláciu bez ďalšieho čistenia. K roztoku tohto fluoridu v 20 ml bezvodého dichlórmetánu sa pri teplote 0 °C pridajú molekulové sitá 4 x 10”¹⁰ m, 1,67 g (0,0088 mol) chloridu cínatého a 1,82 g (0,0088 mol) chloristanu strieborného. Zmes sa mieša počas 5 minút a potom sa pridá 0,93 g (0,0066 mol) (R,R)-azidocyklohexanolu. Reakčná zmes sa zohrieva na laboratórnu teplotu a mieša sa počas 6 hodín. Po sfiltrovaní cez celit sa filtrát zahustí a zvyšok sa podrobí chromatografii na silikagéli pri použití zmesi hexánu a etylacetátu v pomere 8 : 1 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina 8 vo forme číreho oleja.

b)

(9)

1,3 g (2,33 mmol) zlúčeniny 8 sa rozpustí v 10 ml tetrahydrof uráne obsahujúcom 1 % vody a pridá sa 63 8 mg (2,56 mmol) trifenylfosfínu. Zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 5 hodín. Po odparení rozpúšťadla sa zvyšok chromatograficky vyčistí na stĺpci silikagélu pri použití zmesi chloroformu a metanolu v pomere 50 : 1 —> 30 : 1 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina 9 vo forme sirupu.

c)

OH (io;

V bezvodom dichlórmetáne sa rozpustí kyselina O-benzyl-N-terc-butoxykarbonyl-L-asparágová a pridá sa 640,3 mg (3,34 mmol) 1-etyl-3 - (3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDAC) a 384,4 mg (3,34 mmol) N-hydroxysukcínimidu. Zmes sa mieša počas 12 hodín pri teplote 4 °C a potom ša rozpúšťadlo odparí.

Chromatografiou na silikagéli pri použití zmesi etylacetátu a hexánu v pomere 1 : 1,5 —> 1 : 1 ako elučného činidla sa získa N-hydroxysukcinimidester O-benzyl-N-terc-butoxykarbonylasparágovej kyseliny.

603 mg (1,44 mmol) N-sukcínimidesteru 0-benzyl-N-terc-butoxykarbonylasparágovej kyseliny a 281 mg (1,44 mmol) O-benzylserínu sa rozpustí v 2 ml dimetylformamidu a pridá sa 1 ml trietylamínu. Zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny. Po odparení rozpúšťadla a chromatografickom spracovaní na silikagéli pri použití chloroformu ako elučného činidla sa získa produkt 10.

d) 141 mg (0,29 mmol) kyseliny 10, 81 mg (0,42 mmol) EDAC a mg (0,42 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT) sa pri laboratórnej teplote rozpusti v 2 ml dichlórmetánu. Táto zmes sa mieša počas 5 minút a potom sa pridá 148 mg (0,56 mmol) zlúčeniny 9. Vzniknutá zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 3 hodín a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa podrobí chromatografii na stĺpci silikagélu pri použití zmesi hexánu a etylacetátu v pomere 1,5 : 1 —> 1 : 1 ako elučného činidla, čím sa získa zlúčenina 11 vo forme sirupu.

^H-NMR (500 MHz, deuterochloroform) , hodnoty Ô: 1,20 (d, 3H, J = 6,5 Hz, H-6), 1,08 - 1,60 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1, 73 (m, 1H), 1,94 (m, 3H), 2,71 (m, 1H), 3,05 (m,

1H), 3,65 (dd, 1H, J = 3,5, 9,5 Hz), 3,76 (m, 1H,

H-4), 3, 89 (dd, 1H, J = 3,0, 9,5 Hz), 3,98 (dd, 1H, J = 2,5, 10,0 Hz, H-3), 4,04 (dd, 1H, J = 3,5, 10,0

Hz, H-2) , 4,10 (m, 1H, H-5) , 4,44 (m, 1H) , 4,61 (m,

1H), 4,68 (m, 1H), 4,95 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-l),

4,45 - 5,17 (m, 10H), 5,68 (m,	1H), 7,	33 (m,	25H)
l^c-NMR (125 MHz, deuterochloroform) ,	hodnoty	δ: 16,72, 23,34,
23,82,	28,20,	36,29, 36,59,	50,42,	50,65,	52,45,
52,58,	25,82,	66,69, 66,72,	66,78,	69,26,	73,09,
73,18,	74,80,	75,98, 75,98	77,73,	79,35,	94,52,
128,0	(m), 135	,2, 135,3, 137,5, 183,6,	139,0,	155,3,

169,6, 170,2 170,6, 171,9

Hmotnostné spektrometria (HRMS) pre ^C59^H7i^N3°i2^Cs (^M+Cs+)^: vypočítané : 1146,4092 nájdené: 1146,4035

Analogickým postupom ako je opísaný vyššie v príklade 7, ale s použitím zodpovedajúcich východiskových materiálov, sa môžu pripraviť: nasledujúce zlúčeniny všeobecného vzorca

v ktorom symbol R⁵ má významy uvedené v tabuľke 2 .

Tabuľka 2

Hmotnostná spektrometria

Príklad R⁵ (HRMS) vypočítané nájdené ho.

CH

H

HO,C-ŕ CH,-j—CO-N ^{2 2} 2

T — CH—

CHjOH [M+Cs’]

611,1217 611,1241 ^H0^ ^.ΟΗ,ΟΗ CH

H T

HO,C—ŕ CH, ú—CO-N — CH^{2 2} 2 [M+Cs*]

611,1217 611,1241

Tabuľka 2 - pokračovanie

Hmotnostné spektrometria

Príklad R⁵ (HRMS) vypočítané nájdené

CHjOH

H

NaO.C-rCHj-r—CO-N -CH485,2111 435,2127

CHjOH OH •s. '

CH

H I

HO,C—rCHj-Ť— CO-N - CH— [MťCs']

625,1372 625,13;

CK-OH

H I

HOjC - CH, - CH - CO - N - CHi

NHBoc

OH [M+Cô’]

726,1850 726,1322 ^CH=^0H OH

X X⁰” ^CH

H

NaO₂C - CHj - CH - CO - N - CH —

Á

NH, [M-ŕNa*]

516,2159 515,2169

Tabuľka 2 - pokračovanie

Hmotnostné spektrometria

Príklad R⁵ (HRMS) vypočítané nájdené

HO OH [M+Cs*]

637,1373 637,1353

HO.C—ŕ CH, t-CO ² 3

NH. CH.

T H T

HO,C - CH - CH, - CO - N - CH[MCs']

672,1533 672,1545

HO,C -ŕ CH,-r- CO - N - CH—

Zlúčenina z príkladu 11:

¹H-NMR (500 MHz, deutériumoxid), hodnoty δ: 1,10 (d, 3H, J

= 6,5	i Hz,	H-6), 1,	20 (m, 4H), 1,75	(m,	6H) ,	2,16	(m, 1H)
2,56	(t,	2H, J =	7,5 Hz), 2,33	(m,	2H) ,	3,41	(m, 1H)
3/43	(m,	2H), 3,63	(m, 2H, H-2 a H	-3) ,	3,69	(m,	1H, H-4)
3,78	(m,	1H, H-5),	4,09 (ddd, 1H,	J =	2,5,	6,0,	8,5 Hz)
4,46	(d,	1H, J = 2	,5 Hz), 5,02 (d,	1H,	J =	3,0 H	Z, H-l)

¹³C-NMR (125 MHz, 23,71, 24,60, 62,73, 67,13, deutétiumoxid) 28,84, 31,41, 68,26, 69,88, , hodnoty δ: 15,85, 35,38, 35,45, 53,67,

71,65, 72,22, 75,19,

21,93,

55,19,

93,31,

172,3, 176,6

Zlúčenina z príkladu 12:

¹H-NMR (500 MHz, deutériumoxid), hodnoty δ: 1,12 (d, 3H, J = = 6,5 Hz, H-6), 1,08 - 1,26 (m, 4H), 1,39 (s, 9H), 1,65 - 1,80 (m, 3H) , 2,14 (m, 1H) , 2,74 (m, 2H) , 3,39 - 3,88 (m, 9H) , 4,37 (m, 2H)', 4,98 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-l) ¹³C-NMR (125 MHz, 24,58, 28,03, 62,93, 67,14, 94,06, 157,6, deutériumoxid), hodnoty δ: 15,82,

29,30, 61,78, 37,32, 68,32, 69,95, 71,99,

170,8, 173,4, 175,8

52,05, 53,40, 72,25, 76,23,

23,70,

55,55,

82,21,

Zlúčenina z príkladu 13:

H-NMR (500 MHz, deutériumoxid), = 6,5 Hz, H-6), 1,10 - 1,40 2,16 (m, 1H), 2,59 (dd, 1H, 1H, J =5,0, 17,5 Hz), 3,40 =6,0, 12,0 Hz), 3,56 (dd,

3,60 (m, 1H), 3,64 (dd, 1H, (m, 1H, H-4), 3,73 (m, 1H),

H-5), 4,15 (m, 1H), 4,40 (d,

1H, J = 4,0 Hz, H-l) hodnoty δ: 1,15 (d, 3H, J = (m, 4H), 1,66 - 1,85 (m, 3H),

J = 8,5, 17,5 Hz), 2,72 (dd, (m, 1H) , 3,51 (dd, 1H, J =

1H, J = 3,5, 10,0 Hz, H-3) ,

J = 4,0, 10,0 Hz, H-2), 3,69 3,85 (m, 1H), 3,91 (m, 1H,

1H, J = 7,0 Hz) , 5,00 (d, ¹³C-NMR (125 MHz, 24,62, 29,06, 67,09, 68,35, 176,8, 176,8 deutériumoxid) 31,80, 38,41, 69,91, 71,79, , hodnoty δ: 15,77, 51,47, 53,40, 55,59,

72,24, 75,68, 93,63,

23,69,

62,76,

170,6,

Príklad 18

BnCCC

Benzylové skupiny prítomné v zlúčenine 15 sa odstránia hydrogenáciou postupom podľa príkladu 5. Zlúčenina 16 sa získa vo forme amorfnej látky.

H-NMR (400 MHz,deutériumoxid) , hodnoty δ: 4,98 (d,J = 3,2 Hz,

IH, H-l), 4,61 (d, J = 2,2 Hz, IH) , 4,56 (d, J = 7,2 Hz, IH), 4,46 - 4,44 (d, J = 2,2 a 6,4 Hz, IH) , 4,28 - 4,13 (m, 3H) , 4,02 - 3,98 (m, IH) , 3,86 - 3,59 (m, 5H) , 2,42 - 2,22 (m, 4H), 1,90 - 1,79 (m, 2H), 1,30 - 1,18 (m, 9H)

Hmotnostná spektrometria (elektrospray negatívnych iónov; potenciál na rozbitie zhlukov = -80 V) : m/z 523 (M-H);

pre ^C21^H36^N2^13 vypočítané: 524

Zlúčeninu 15, používanú ako východiskový materiál, môžeme pripravič nasledovne:

,CH,

BocNH

COOEt (13)

Najskôr sa L-fukóza prevedie na tribenzylfukozylfosfit, ako opísali Wong a kol. (J. org. Chem. 1994, 59, 864) . 1,0 ekvivalentu výslednej zlúčeniny sa podrobí pri teplote 0 °C v metylénchloride reakcii s 1,1 ekvivalentom Boc-L-Thr-O-etyl s použitím 0,1 ekvivalentu kyseliny trifluórmetánsulfónovej ako katalyzátora, čím sa získa po štandardnom spracovaní a vyčistení zlúčenina 13.

b)

Najskôr sa zo zlúčeniny 13 odstránia terc-butoxykarbonylové ochranné skupiny pôsobením 30 % kyseliny trifluóroctovej v 0,1 mol dichlórmetánu počas 30 minút pri teplote 25 °C, potom sa prileje voda, zmes sa premyje hydrogénuhličitanom sodným a vysuší sa síranom sodným. Vyčistením veľmi rýchlou chromatografiou sa získa zodpovedajúci voľný amín. 1,0 ekvivalentu tohto amínu sa podrobí reakcii s 1,1 ekvivalentom (2S, 3R) -N- terc-butoxykarbonyl - 2 - amino-4 -benzyloxy-3 -hydroxymaslovej kyseliny s použitím 1,5 ekvivalentu 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydrochloridu (EDCI) a 1,5 ekvivalentu 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v 0,1 mol dichlórmetánu. Reakcia sa uskutočňuje počas 30 hodín pri teplote 0 °C. Po štandardnom spracovaní a vyčistení pomocou veľmi rýchlej stĺpcovej chromatografie sa získa zlúčenina 14.

c) Zo zlúčeniny 14 sa odstránia terc-butoxykarbonylové ochranné skupiny pôsobením 30 % kyseliny trifluóroctovej v 0,1 mol dichlórmetánu počas 30 minút pri teplote 25 °C, potom sa prileje voda, zmes sa premyje hydrogénuhličitanom sodným a vysuší sa nad síranom sodným. Produkt sa vyčistí veľmi rýchlou chromatografiou a potom sa podrobí' reakcii s 1,1 ekvivalentom monobenzylglutarátu s použitím 1,5 ekvivalentu 1 - (3 -dimetylaminopropyl) -3 -etylkarbodiimid-hydrochloridu (EDCI) a 1,5 ekvivalentu 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v dichlórmetáne. Reakcia sa uskutočňuje počas 20 hodín pri teplote 25 °C. Získa sa zlúčenina 15.

¹H-NMR (400 MHz, deuterochloroform), hodnoty δ: 8,00 (d, J = = 9,1 Hz, 1H) , 7,21 - 7,50 (m, 25H) , 6,75 (d, J = 7,6 Hz,

1H) , 5,12 - 4,57 (m, 11H) , 4,35 - 3,99 (m, 7H) , 3,80 - 3,60 (m, 5H), 2,45 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = = 7,0 Hz, 2H), 1,98 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,20 - 1,26 (m,

6H), 1,06 (d, J = 6,4 Hz, 3H)

Hmotnostné spektrometria (HRMS) pre ^c5g^Hg6^N2°i3^+Cs+(M+Cs⁺): vypočítané : 1107,3614 nájdené : 1107,3667

Analogickým postupom ako je opísaný vyššie v príklade 18, ale s použitím zodpovedajúcich východiskových materiálov, môžeme pripraviť zlúčeniny všeobecného vzorca

v ktorom symboly R⁸ a R⁹ majú významy uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Pri- R⁸ klad

RHmotnostná spektrometria vypočítané nájdené

HOjC•CH, ^^OH^CHjOH CO - NH - C—

ES (M-K')

496 495

L.

-CH,

CH'

T •CO-NH-CHES (M-H*)

495 495

C, Hl

C,K5

HO.C - CH - CHj

T

CO -NH - C

ES (M-H')

543 542

NHj

HOjC-ŕCHjd^CO

HO

HOjC-ŕCHj-^CO [M+Na*]

543,2166 543,2175 [M-H*+2Cs*]

543,2166

543,2148

Tabuľka 3 - pokračovanie

Pri- R⁸

RHmotnostná spektrometria klad vypočítané nájdené

HO

C₂Kä

HOjC-ŕCHj-r-CO [M-H*+2CS’]

785,0299 785,0328

HO,

C,

O, [M-H]'

519 519

HOjC-ŕCH₂-r-CO

HO

HOjC-ŕ-CK-j-CO

HO

C,H,

.OH

H'''·'/

HOjC-ŕCHj-J-CO [M+Cs*]

669,1272 669,1287 y><-oH

C,H= [M-H+2CS]

842,9708 842,9672

Príklad 29

(19) (20)

Roztok 23,7 mg (40 μτηοΐ) glykopeptidu 19 sa pri laboratórnej teplote mieša v 90 % kyseline trifluóroctovej vo vode (1 ml). Po uplynutí 3 hodín sa reakčný roztok odparí pri zníženom tlaku a dvakrát sa z neho azeotropicky odstráni voda vždy s 5 ml toluénu. Odmeria sa NMR-spektrum surového produktu pre potvrdenie, že izopropylidénové zvyšky boli odstránené, a produkt sa potom bez čistenia použije v nasledujúcom stupni.

Surový glykopeptid sa hydrogenuje postupom podľa príkladu

5, čím sa získa biela pevná látka 20.

Rý (zmes n-butanolu, vody a kyseliny octovej v pomere 4 : 1 : 1) : 0,29 ¹H-NMR (400 MHz, deutériumoxid): 5,23 (d, J 3, 7, H1_Ä), 4,55 (dd, J 7,9 a 4,7, Η1_Λ ) , 4,37 - 4,32 (m, H2 ' ce+A)) , 4,15 -4,05 (m, H5< + H3 '* ) , 3,95 - 3,92 (m, H4,c + H3 ) , 3,86 (d, J 3,4, H4_a ) , 3,83 (dd, J 10,3 a 3,2, H3_X ) , 3,78 (dd, J 10,3 a 3,7, H2J, 3,74 - 3,68 (m, H5* ) , 3,64 - 3,61 (m, H3^ + C6'H₂ u+v ), 3,55 - 3,44 (m, H2^ + C6H_aH_b ),

3,42 - 3,31 (m, C6H_aH_b (_Ä+_ó) ) , 2,62 - 2,48 (m, C2 ' ' H₂ μ+q) + + C3 ' ' H₂ (Í+/5) ), 1,76 - 1,47 (m, C4 ' H₂ (£+4) ' + C5'H₂ )

MR	(10	0 MHz,	deutériumoxid): 182,	, 93,		179,11,	175,20,
174	, 66 ,	98,86,	94,80,	75,19,	75,08,	75,	02	t	74,21,	72,91,
71,	78,	71,48,	71,28,	71,18,	70,71,	70,	52	1	63,84,	63,80,
61,	00,	60,90,	60,48,	42,15,	42,03,	34,	71	t	34,19,	34,12,
31,	84,	31,44,	31,14

Hmotnostná spektrometria s vysokou rozpoznávacom schopnosťou (HRMS, pri použití Nal) pre ^C16^H28^N2°11^: vypočítané : 447,1591 (M+Na) nájdené : 447,1570 (M+Na)

Zlúčeninu 19, používanú ako východiskový materiál, môžeme pripraviť nasledovne: a)

K miešanému roztoku 130 mg (500 gmol) 6-amino-6-deoxy-l,

2,3,4-diizopropylidén-a-L-galaktopyranozidu 177 mg (500 μιηοΐ) (2S, 3RS) -2-N- terc-butoxykarbonylamino-6-benzyloxy-3-hydroxyhexánovej kyseliny, 68 mg (500 μπιοί) 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT) a 108 μΐ (1000 μπιοί) 4-metylmorfolínu v 5 ml suchého dimetylformamidu sa v atmosfére argónu pri teplote -20 °C pridá 95,4 mg (500 μπιοί) 1-(3-dimetylaminopropyl) -3-etylkarbodiimid-hydrochloridu (EDCI) . Výsledná zmes sa mieša pri teplote -20 °C počas jednej hodiny a potom sa nechá pomaly zohriať na laboratórnu teplotu. Po uplynutí 14 hodín sa k reakčnému roztoku prileje 20 ml 5 % (hmotnosť/objem) roztoku kyseliny citrónovej a zmes sa extrahuje šesťkrát vždy 25 ml Zmiešané organické extrakty sa premyjú 50 ml roztoku hydrogénuhličitanu sodného a 50 ml roztoku chloridu sodného, vysušia sa síranom a odparia pri zníženom tlaku. Zvyšný olej sa vyčistí veľmi rýchlou chromatografiou na silikagéli s použitia elúcie s gradientom 40 % —> 50 % —> 66 % etylacetátu v hexáne, čím sa získa zlúčenina 17 vo forme svetlo žltej peny.

etylacetátu. nasýteného nasýteného .horečnatým

Rf (75 % etylacetát v hexáne): 0,66

b)

OH O T O

Sn

NH₂ H

Roztok 59,5 mg (1000 gmol) glykopeptidu 17 v 15 % (objem/objem) kyseliny trifluóroctovej v suchom 4-(dikyanmetylén) -2-metyl-6-(dimetylaminostyryl)-4H-pyranu (1 ml) sa mieša v atmosfére argónu pri laboratórnej teplote. Po uplynutí 2 hodín sa roztok odparí pri zníženom tlaku a olej, ktorý zostane sa rozpustí v 10 ml zmesi n-butanolu, vody a metanolu v pomere 5 : 3 : 2. K roztoku sa pridá 100 mg iónomeniča Dowex (Cl) vopred premytého metanolom a zmes sa mieša počas 30 minút. Zmes sa sfiltruje, pevná látka sa premyje trikrát vždy 5 ml metanolu a zmes filtrátu s premývacími kvapalinami sa odparí pri zníženom tlaku. Olej ktorý zostane sa vyčistí velmi rýchlou chromatografiou na silikagéli s použitím gradientovej elúcie zmesou dichlórmetánu, metanolu a vodného roztoku amoniaku v pomere 19 : 0,9 : 0,1 —> 9 : 0,9 : 0,1, čím sa získa zlúčenina 18 vo forme svetlo hnedého oleja.

R{ (zmes dichlórmetánu, metanolu a vodného roztoku amoniaku v pomere 9 : 0,9 : 0,1): 0,42

c) K miešanému roztoku 27,7 mg (56 gmol) aminoglykopeptidu 18 v 1 ml metanolu sa pri laboratórnej teplote pridá 6,0 mg (60 μπιοί) anhydridu kyseliny jantárovej . Po uplynutí jednej .hodiny sa roztok odparí pri zníženom tlaku. Pevná látka, ktorá zostane sa vyčistí velmi rýchlou chromatografiou na silikagéli s použitím gradientovej elúcie 5 —> 10 % kyselinou octovou v etylacetáte, čím sa získa zlúčenina 19 vo forme svetlo žltej živice.

Rý (10 % kyselina octová v etylacetáte): 0,49

Infračervené spektrum (film): 3303, 2980, 2935, 1644, 1558,

1436, 13,82, 1255, 1211, 1167, 1109, 1070, 1006, 901 cm^-1.

^H-NMR (400 MHz, perdeuterometanol) : 7,32 - 7,23 (5H, m, aromatický kruh), 5,44 (1H, d, J, 5,0 2 x Hl), 4,59 (1H, d, J 7,9 a 2,1, 2 x H3), 4,48 (2H, s, 2 x CH₂-fenyl,

4,38 - 4,34 (1H, m, 2 x H'2), 4,31 (1H, dd, J 5,0 a 2,4, 2 x H2), 4,21 (1H, d, J 7,9, 2 x H4), 4,00 - 3,89 (1, 5H, m, 2 x H5 + H3¹), 3,84 - 3,76 (0,5H, m, H3'), 3,52 3,46 (3H, m, 2 x C6H_aH_b + 2 x C6'H₂), 3,27 - 3,20 (lH,‘m, x C6H_aH_b), 2,56 - 2,48 (4H, m, 2 x C2H₂ + 2 x C3H₂), 1,80 - 1,54 (4H, m, 2 X C4'H₂ + 2 x C5'H₂), 1,45 (3H, s, acetonidový metyl), 1,40 (3H, s, acetonidový metyl), 1,32 (3H, s, acetonidový metyl), 1,29 (3H, s, acetonidový metyl) ¹³C-NMR (100 MHz, perdeuterometanol): 137,21, 126,78, 126,24, 126,03, 107,86, 107,34, 95,19, 71,24, 70,06, 69,56,

69,28, 69,24, 68,58, 64,68, 56,66, 38,02, 28,96, 28,35, 24,54, 23,83, 23,75, 22,62, 21,99

Hmotnostná spektrometria s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HRMS, pri použití Csl) pre ^C29^H42^N2°11^: vypočítané: 727,1843 (M+Cs) nájdené: 727,1875 (M+Cs)

Analogickým postupom ako je opísaný v príklade 29, ale pri použití zodpovedjúcich východiskových materiálov, je možné pripraviť zlúčeniny všeobecného vzorca

:torom symboly R^A a R^B majú významy uvedené

Príklad

NH,

Tabuľka 4 ho₂c - CH - CH - CO - N - CH HO ^CH-ŕ CH,)_z - OH

HO.C —ŕ CH, d— CO · NH - CH * '2

OH

OH

CH -í- CH, 4— OH 3

HO

HO,C—ŕ CH₂ d—CO - NH - CH OH

CHd-CH,d— OH

HO

HO.C -ŕ CH, d— CO - NH · CH —

HO

CH-t-CH-d— OH Z

OH

OH í

HO-d CH. d-CH-CH 1

HOjC-ŕ-CHj-b-CO-NH • •Hl OH

OH

HO -ŕ- CH. d— CH - CH ² 1

HOjC—d CHj-r· CO - NH •ΊΙΙΙΙ OH

HO \ ^ΟΗ,ΟΗ CH

OH

CHHOjC - (CHj)j - CO - N H

Tabuľka 4 - pokračovanie

Príklad

HO ^/ΟΗ,ΟΗ CH

OH

CH·

AT

HO.C - CH, - CH - CO - N ^H

NH.

HO. .CH.OH

CH

I

CHOH

HO.C-(CH,-1— CO-N ³ H

HO <^C^-°^H Ή. Z ‘ch

CH

OH

HO.C - CH, - CH - CO - N ^H

NH,

HO-CH, ΟΗ,ΟΗ \ ,.'^Λ

HO.C - (CH,), - CO · NH · C HO - CH CH,OH

OH

OH

HO,C - (CH,), - CO - NH - C ΟΗ,ΟΗ ^H0-ch,^_CHj

OH

HO.C - (CH-)-· CO - NH · C ·

Tabuľka 4 - pokračovanie

Príklad

R^a

CHjOH

HOCH. CH,

HOjC - (CHJj - CO -NH - C Príklad 44

HO.

^R’° OR’

Js^^0R’

O N

-Q

R’O

27: R' = Bn 28: R' = H

K roztoku 91,4 mg (59,2 gmol) zlúčeniny 27 v 5 ml metanolu sa pridá hydroxid paládnatý na uhlí (20 mg) . Táto zmes sa mieša počas dvoch dní v atmosfére vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa odparí vo vákuu. Zvyšok sa podrobí chromatografii na stĺpci silikagélu pri použití zmesi chloroformu a metanolu v pomere 1 : 1 ako elučného činidla a potom gélovej filtračnej chromatografii na stĺpci Sephadex-u LH20 pri použití metanolu ako elučného činidla, čím sa získa požadovaný amfifil 28.

¹H-NMR (500 MHz, perdeuterometanol), hodnoty δ: 0,80 (6H, t, J = 6,5), 1,16 (6H, d, J = 5,5), 1,23 - 1,41 (52H, m),

1, 60 -	1,71	(4H, m)	, 2,04 - 2,17	(2H, m) ,	2,31 -	2,60
(6H, m),	2,66	- 2,77	(2H, m), 2,97	- 3,09 (2H, m),	3,31
- 3,40	(3H,	m) , 3,50	- 3,71 (14H,	m) , 3,79	-3,87	(1H,
m) , 3,88	- 3,	98 (1H,	m), 4,04-4,	26 (4H,	m) , 4,	44 -
4,56 (3H	, m) ,	4,95 (1H, široký s)

Hmotnostná spektrometria (HRMS) pre Cg₂ ^Hii4^NzL⁰7^Gs ' vypočítané: 1319,7233 (M+Cs) nájdené: 1319,7264 (M+Cs)

Zlúčeninu 27, používanú ako východiskový materiál,' je možné pripraviť nasledovne:

cA^COsBn

Zlúčenina 21

Suspenzia 138 mg (0,204 mmol) dibenzyl-2,3,4-O-tribenzyl-a-L-fukopyranozylfosfidu, 77,5 mg (1 ekvivalent) alylesteru Ν-9-fluórenylmetoxykarbonyltreonínu a 470 mg molekulového sita 4 x 10”¹⁰m sa mieša počas 18 hodín pri laboratórnej teplote. K tejto zmesi sa pri teplote -15 °C pridá roztok 13,6 mg (0,3 ekvivalentu) TMSOTf v 1 ml dichlórmetánu. Zmes sa mieša pri uvedenej teplote počas 2 hodín, potom sa pridá nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného na ukončenie reakcie a zmes sa zriedi dichlórmetánom. Organická vrstva sa oddelí, vysuší sa síranom horečnatým a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa chromatograficky spracuje na stĺpci silikagélu pri použití zmesi hexánu a etylacetátu v pomere 4 : 1 ako elučného činidla, čím sa získa zlúčenina 21.

Zlúčenina 22

K roztoku 104 mg (0,13 mmol) zlúčeniny 21 v 5 ml dichlórmetánu sa pridá 0,72 ml (53 ekvivalentov) dietylamínu a zmes sa mieša počas 18 hodín pri laboratórnej teplote. Rozpúšťadlo a reakčné činidlo sa odstránia vo vákuu a zvyšok sa chromatograficky vyčistí na stĺpci silikagelu, pričom sa kolóna premýva . dichlórmetánom až zmesou dichlórmetánu a metanolu v pomere 100 : 3, čím sa získa zlúčenina 22.

Zlúčenina 23

K roztoku 242 mg (0,42 mmol) zlúčeniny 22 a 135 mg (1 ekvivalent) N-benzylglutarylamid-L-prolínu v 5 ml dichlórmetánu sa pri teplote 0 °C postupne pridá 86 mg (1,5 ekvivalentu) 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT) a 105 mg (1,3 ekvivalentu) 1- (3-dimetylaminopropyl) -3-etylkarbodiimid-hydrochloridu (EDC) Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri teplote 0 °C a potom sa v priebehu 18 hodín nechá teplota zvýšiť na laboratórnu teplotu. Reakčná zmes sa odparí vo vákuu a zvyšok sa rozpustí v etylacetáte. Tento etylacetátový roztok sa postupne premyje IN kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a roztokom chloridu sodného. Organická vrstva sa vysuší nad síranom horečnatým a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa chromatograficky spracuje na stĺpci silikagélu, pričom sa kolóna premýva toluénom až zmesou toluénu a acetónu v pomere 2:1, čím sa získa zlúčenina 23.

Zlúčenina 24

K roztoku 169 mg (0,192 mmol) zlúčeniny 23 a 167 mg (10 ekvivalentov) morfolínu v 10 ml tetrahydrofuránu a 1 ml dimetylformamidu sa v atmosfére argónu pri laboratórnej teplote pridá 23 mg (0,1 ekvivalentu) Pd (P-fenyl^)^ Reakčná zmes sa mieša počas 24 hodín a potom sa odparí vo vákuu. Zvyšok sa rozpustí v etylacetáte a premyje sa IN kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva sa oddelí, vysuší sa nad síranom horečnatým a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa chromatograficky vyčistí na stĺpci silikagélu, pričom sa kolóna premýva dichlórmetánom až zmesou dichlórmetánu a metanolu v pomere 10 : 1, čím sa získa zlúčenina 24.

b) Syntéza lipidovej časti

H

O^O(CH2)₁₅CH₃

26: R=NH₂

Zlúčenina 25

K 1,54 ml 2N roztoku oxalylchloridu v dichlórmetáne sa pri teplote -78 °C pridá roztok 277 mg (1,5 ekvivalentu) DMSO (dimetylsulfoxidu) v 3 ml dichlórmetánu a roztok 2-[2-(2-azidoetoxy)etoxy]etanolu v 5 ml dichlórmetánu, pričom každý z týchto roztokov sa pridáva v priebehu 2 minút. Zmes sa mieša pri uvedenej teplote počas 30 minút, potom sa pri teplote -78 °C pridá 1,64 ml trietylamínu a teplota sa v priebehu 1 hodiny nechá vystúpiť na laboratórnu teplotu. Reakčná zmes sa vyleje do ľadovej vody a extrahuje sa dichlórmetánom. Organická vrstva sa postupne premyje IN kyselinou chlorovodíkovou a nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vysuší sa nad síranom horečnatým a odparí sa vo vákuu. Surový aldehyd sa použije bez ďalšieho čistenia. K roztoku tohto surového aldehydu a 500 mg (1 ekvivalentu) soli 1' , 3 '-dicetyl-L-glutamátu s kyselinou p-toluénsulfónovou v 3 ml tetrahydrofuránu a 9 ml metanolu sa pri teplote 0 °C pridá 41 mg nátriumkyanborohydridu. Zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas 1 hodiny a potom sa teplota nechá vystúpiť v priebehu 18 hodín na laboratórnu teplotu. Rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu a zvyšok sa rozpustí v dichlórmetáne. Roztok sa premyje IN kyselinou chlorovodíkovou, potom sa organická vrstva vysuší nad síranom horečnatým a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa chromatograficky spracuje na stĺpci silikagélu s použitím zmesi hexánu a etylacetátu v pomere 4 : 1 ako elučného činidla, čím sa získa zlúčenina 25.

Zlúčenina 26

K roztoku 320 mg (0,427 mmol) zlúčeniny 25 v 13 ml metanolu, 3 ml tetrahydrofuránu a 1,3 ml IN kyseliny chlorovodíkovej sa pridá 99 mg paládia na uhlí. Zmes sa mieša počas 2 dní v atmosfére vodíka. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa odparí vo vákuu. Ku zvyšku sa pridá nasýtený roztok hydrogénuhličitanu sodného a zmes sa extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa vysuší nad síranom horečnatým a odparí vo vákuu, čím sa získa zlúčenina 26.

Spojenie časti napodobňujúcej sLe^x a lipidu

Zlúčenina 27

K roztoku 94,6 mg (0,113 mol) zlúčeniny 24 a 81,7 mg (1 ekvivalent) zlúčeniny 26 v 5 ml dichlórmetánu sa pri teplote 0 °C postupne pridá 23 mg (1,5 ekvivalentu) 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT) a 29 mg (1,3 ekvivalentu) 1-(3-dimetylaminopropyl )-3-etylkarbodiimid-hydrochloridu (EDC). Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 °C a teplota sa v priebehu 20 hodín nechá vystúpiť na laboratórnu teplotu. Reakčná zmes sa odparí vo vákuu a zvyšok sa rozpustí v etylacetáte. Roztok sa premyje nasýteným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, organická vrstva sa -vysuší nad síranom horečnatým a odparí sa vo vákuu. Zvyšok sa chromatograficky vyčistí na stĺpci silikagélu s použitím zmesi toluénu a acetónu v pomere 1 : 1 ako elučného činidla, čím sa získa zlúčenina 27.

’’Η-NMR (500 MHz, deuterochloroform) , hodnoty ô: 0,88 (6H,t, J= = 7,0), 1,12 (3H, d, J = 6,0), 1,17 (3H, d, J = 6,0),

1,21 - 1,41 (52H, m), 1,57 - 1,65 (4H, m), 1,88 - 1,97 (2H, m), 2,12 - 2,20 (1H, m), 2,22 - 2,29 (1H, m), 2,38 (2H, t, J = 7,0), 2,45 - 2,83 (5H, m), 3,18 - 3,27 (2H, m), 3,42 - 3,59 (10H, m), 3,63 (1H, široký s), 3,66 (1H, dd, J = 11,0, 4,0), 3,82 (1H, dd, J = 10,3, 3,0), 3,84 (1H, q, J = 7,0), 4,01 - 4,13 (4H, m), 4,48 - 4,58 (4H, m), 4,61 (1H, d, J = 11,5), 4,64 (1H, d, J = 11,5), 4,69 (1H, d, J = 11,5), 4,74 (1H, d, J = 11,5), 4,75 (1H, d, J = 11,5), 4,92 (1H, d, J =11,5), 4,96 (1H, d, J = 3,5), 5,06 (2H, s), 7,10 (1H, široký t, J = 3,0), 7,25 - 7,43 (20H, m), 7,87 (1H, t, J = 9,0)

Hmotnostná spektrometria C^gH^ggN^O_q7: m/z 1548 (M+H)

Príklad 45

Analogickým postupom ako je opísaný v príklade 44, ale s použitím zodpovedajúcich východiskových materiálov môžeme získať, nasledujúcu zlúčeninu:

¹H-NMR (500 MHz, deuterochloroform) , hodnoty δ: 4,80 (d, J = = 2,6 Hz, 1H) , 4,46 (t, J = 8,5 Hz, 1H) , 4,42 - 4,40 (m,

4H), 4,05 - 3,95 (m, 6H) , 3,76 - 3,43 (m, 6H) , 2,23 (t,J= = 7,7 Hz, 2H) , 2,30 - 2,20 (m, 3H) , 2,12 - 2,01 (m, 2H) ,

1,98 - 1,91 (m, 4H), 1,85 - 1,77 (m, 1H), 1,57 - 1,50 (m,

4H), 1,25 - 1,13 (široký signál, >50H), 1,11 (d, J = 6,3 Hz, 3H) , 1,09 (d, J = 6,6 Hz, 3H) , 0,78 (t, J = 6,7 Hz, 6H)

Hmotnostná spektrometria (m/e) pre ^C5g^Hio6^N4°16^Cs (M+Cs ⁺ ) : vypočítané: 1259,6658 nájdené : 1259,6620

Zlúčeniny všeobecného vzorca I a ich farmaceutický prijateľné soli vykazujú farmaceutickú účinnosť a je možné ich použiť tiež ako liečivo. Tieto látky inhibujú najmä adhéziu medzi bunkami obsahujúcimi na svojich povrchoch selektín, ako je E-selektín, a efektorovými bunkami, ako sú neutrofily alebo bunky HL-60, ktoré na svojich bunkových povrchoch obsahujú SLe^x, alebo syntetickým poly-SLe^x-produktom alebo poly-SLe^a-produktom. Konkrétnejšie zlúčeniny všeobecného vzorca I inhibujú väzbu sLe^x na E-selektín, ako o tom svedčia nasledujúce testy:

doména E-selektínu, fúzovaná reťazca K(mCK), sa klonuje vektora pVL941 (Invitrogén)

a) Príprava rozpustnej formy E-selektínu: Extracelulárna ku konštantnej oblasti ľahkého do baculovírusového kyvadlového a exprimuje v bunkách SF-9.

Rozpustný fúzny proteín sa purifikuje afinitnou chromatografiou s použitím krysej protimyšacej monoklonálnej protilátky 187.1 proti Ck, naviazanej na Sepharósu.

Testy väzby buniek: Pri zlúčeninách všeobecného vzorca I sa testuje ich schopnosť blokovať adhéziu buniek HL-60 na E-selektín imobilizovaný na doskách s 96 jamkami. Na dosky s 96 jamkami sa nanesie krysia protimyšacia protilátka proti CK v koncentrácii 20 ^g/ml v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufri s pH 9,5 a uskutočňuje sa inkubácia cez noc pri teplote 4 °C. Dosky sa blokujú 3 % BSA (albumínom hovädzieho séra) v testovacom pufri (20 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazín etánsulfónovej kyseliny (HEPES), pH 7,4, s obsahom 150 mM chloridu sodného a 1 mM chloridu vápenatého) počas 8 hodín pri laboratórnej teplote a premyjú sa trikrát testovacím pufrom. Pridá .sa fúzny proteín E-selektín - myšací CK v koncentrácii 10 /xg/ml v testovacom pufri a uskutočňuje sa inkubácia počas 2 hodín pri teplote 37 °C a cez noc pri teplote 4 °C. Dosky sa trikrát omyjú testovacím pufrom. Potom sa pridá zlúčenina, ktorá má byť testovaná a uskutočňuje sa inkubácia počas 15 - 30 minút pri teplote 37 °C. Do každej jamky sa vnesie lxlO⁵ označených buniek HL-60 v testovacom pufri a nechá sa prebiehať ich adhézia na E-selektín počas 30 - 45 minút pri teplote °C. Potom sa dosky trikrát až štyrikrát opatrne omyjú testovacím pufrom, čím a odstránia nenaviazané bunky. Počet buniek, u ktorých došlo k adhézii, sa stanoví meraním fluorescencie (systém Cytofluór 2350).

Fluorescenčné označovanie buniek HL-60 pomocou acetoxymetylesteru biskarboxyetylkarboxyfluoresceínu (BCECF-AM): Bunky HL-60 sa inkubujú v Iscovovom médiu doplnenom 20 % fetálneho teľacieho séra (FCS), glutamínom a neesenciálnymi aminokyselinami. Jeden deň pred uskutočnením experimentu sa bunky subkultivujú (pasážujú) na dosiahnutie koncentrácie 1 x 10⁶ buniek na ml. Bunky s koncentráciou 1 x 10⁶ buniek na ml sa označujú inkubáciou s BCECF-AM v koncentrácii 5 gg/ml (zriede- né zo zásobného roztoku v dimetylsulfoxide) počas 20 minút pri teplote 37 °C vo fosfátom pufrovanom roztoku chloridu sodného (PBS).

Materiály:

ELISA-dosky: Nunc Immuno Plate MaxiSorp (439454)

Bunky L-60: získané podľa katalógu od ATTC

Afinitne purifikovaný E-selektín: u každej dávky E-selektínu sa testuje funkčnosť, na stanovenie príslušnej koncentrácie pre použitie v teste

Fluorescenčné farbivo: acetoxymetylester biskarboxyetylkarboxyf luoresceínu (BCECF-AM), dostupný od firmy Molecular Probes

V tomto teste zlúčeniny všeobecného vzorca I inhibujú adhéziu buniek HL-60 na E-selektín v 0,3 až 10 mM koncentrácii. Zlúčeniny z príkladov 12, 13 a 18 inhibujú v koncentrácii 10 mM adhéziu buniek HL-60 na E-selektín zo 100 % resp. 80 % (v prípade dvoch posledne uvedených zlúčenín).

b) Test väzby sLe^a-polymér/E-selektín za neprítomnosti buniek: Mikrotitračné dosky sa pri teplote 4 °C cez noc potiahnu krysou protimyšacou protilátkou proti Ck (v koncentrácii 10 ^g/ml v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufri, pH 9,5), pripravenú z krysej hybridomovej bunkovej línie 187.1 (ATCC). Dosky sa dvakrát omyjú testovacím pufrom (20 mM 4 -(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsulfónovej kyseliny (HEPES) , pH 7,4, s obsahom 150 mM chloridu sodného a 1 mM chloridu vápenatého), blokujú sa počas 8 hodín pri teplote 4 °C s albumínom hovädzieho séra v koncentrácii 3 % v testovacom pufri a potom sa trikrát omyjú. Do každej jamky sa pridá fúzny proteín E-selektín - myšacie CK v koncentrácii 3 Mg/ml v testovacom pufri a uskutočňuje sa inkubácia cez noc pri teplote 4 °C. Vytvorí sa komplex medzi biotinylovaným sLe^a-polymérom (glykokonjugát polyakrylamidového typu, Syntesome GmbH, Mníchov, SRN) obsahujúcim 20 mol% sLe^a (čo zodpovedá 0,81 μιποί sLe^a/mg polyméru) a streptavidín-peroxidázou (Boehringer Mannheim, SRN), a to tak, že sa inkubuje 20 μΐ sLe^a-polyméru (1 mg/ml) s 80 μΐ streptavidín-peroxidázy, 20 μΐ fetálneho teľacieho séra a 80 μΐ testovacieho pufru bez chloridu vápenatého počas hodín pri teplote 37 °C. Takto vytvorený komplex sLe^a-polymér/streptavidín-peroxidáza je pri teplote 4 °C stabilný počas niekoľkých mesiacov. Tento komplex sa potom zriedi v pomere : 10 000 v testovacom pufri a pridá sa spolu so zlúčeninou, ktorá má byť testovaná, do jamiek potiahnutých E-selektínom. Komplex sa nechá viazať počas 2 hodín pri teplote 37 °C a potom sa dosky dvakrát premyjú studeným testovacím pufrom. Do jamiek sa pridá roztok peroxidázového substrátu ABTS (Biorad) a po 10 minútach sa reakcia ukončí. Množstvo naviazaného komplexu sLe^a-polyméru sa stanoví odmeraním optickej hustoty pri 405 nm v zariadení na meranie mikrotitračných dosiek. Zlúčeniny všeobecného vzorca I v tomto teste inhibujú väzbu sLe^a-poiymér/E-selektín pri použití v 0,07 až 10 nM koncentrácii .

Zlúčeniny z príkladov 12, 13 a 18 vykazujú pri inhibícii väzby sLe^a-polymér/E-selektín hodnotu IC₅₀ (50 % inhibícia) v koncentrácii 1 mM, 10 mM respektíve 0,5 mM.

c) Testy in vivo: Zlúčeninu všeobecného vzorca I je možné použiť ako náhradu (typu jednej zlúčeniny za inú) za SLe^x pri ošetreniach in vivo, napríklad ako ich opísali Mulligan a kol., Náture, 364: 149 - 151 (1993) na krysom modele s jedom kobry alebo Murohara a kol., Cardiovascular Research 30., 965 - 974 (1995) na mačacom modele myokardálnej ischémie s reperfúznym poranením. Zlúčeniny všeobecného vzorca I vykazujú v týchto modeloch priaznivý účinok.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa tiež môžu použiť na liečenie alebo/a prevenciu porúch alebo ochorení, ktoré sú sprostredkované bunkovou adhéziou v dôsledku väzby na selektíny, najmä E-selektín, ako sú napríklad akútne alebo chronické zápalové alebo autoimunitné ochorenia, ako je reumatická artritída, astma, alergické stavy, psoriáza, kontaktná dermatitída, syndróm respiračnej tiesne dospelých jedincov (ARDS), zápalové ochorenia čriev a oftalmické zápalové ochorenia, infekčné choroby, ako je septický šok, traumatický šok, trombóza a stavy súvisiace s nepatričnou agregáciou doštičiek, kardiovaskulárne ochorenia, ako je infarkt myokardu, reperfúzne poranenia, roztrúsená skleróza a neoplastické ochorenia, vrátane metastáz, mŕtvice a akútne alebo chronické odmietnutie transplantovaných orgánov alebo tkanív.

Dávka potrebná pre vyššie uvedené použitie bude samozrejme kolísať v závislosti na spôsobe podania, konkrétnom liečenom stave a požadovanom účinku. Všeobecne sa však uspokojivé výsledky dosiahnu pri dávkach od asi 0,5 do 80 mg/kg telesnej hmotnosti živočícha. Vhodné denné dávky pre väčšie cicavce, napríklad pre človeka, predstavujú rádovo od asi 100 mg do 1,5 g na deň. Účelne sa toto množstvo podáva v jedinej dávke denne, v delených dávkach dvakrát až štyrikrát za deň alebo vo forme umožňujúcej postupné uvoľňovanie účinnej látky. Jednotkové dávkovacie formy vhodne obsahujú od asi 25 mg do 0,750 g zlúčeniny všeobecného vzorca I, spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu podávať vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli. Takéto soli môžeme pripraviť bežným spôsobom a vykazujú rádovo

L·) rovnakú účinnosť ako zlúčeniny vo voľnej forme. Vynález rovnako zahŕňa farmaceutický prostriedok obsahujúci zlúčeninu podľa vynálezu, vo forme voľnej zásady alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, v kombinácii s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom. Takéto prostriedky môžeme formulovať bežným spôsobom. Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu podávať ľubovoľnou bežnou aplikačnou cestou, napríklad parenterálne, napríklad vo forme injikovateľných roztokov alebo suspenzií, alebo vo forme vhodnej pre nasálne podanie alebo vo forme čapíkov.

V súlade s tým, čo bolo uvedené vyššie, vynález ďalej opisuj e:

a) zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ na použitie ako liečiva;

b) spôsob prevencie alebo liečenia vyššie uvedených porúch u pacienta, ktorý takéto ošetrenie potrebuje, pri ktorom sa tomuto pacientovi podá účinné množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, a

c) zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ na použitie na prípravu farmaceutického prostriedku na použitie v spôsobe, ktorý je opísaný vyššie pod bodom b).

Claims (10)

PATENTOVÉ NÁROKY i) R predstavuje metylovú skupinu, a buď R^· znamená zvyšok všeobecného vzorca a^_ alebo a2 kde ΜΟΟΟΟγΟ (¾) m má hodnotu 2 alebo 3, n má hodnotu 2 alebo 3, M predstavuje katión, R2 znamená atóm vodíka alebo nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový zvyšok s až 20 atómami uhlíka, prípadne nesúci v -polohe formylovú skupinu alebo acetalové zoskupenie odvodené od alkoholu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo diolu s 2 až 4 atómami uhlíka, R8 predstavuje atóm vodíka, skupinu -CH2OH alebo -CH2CH2OH, a R4 znamená atóm vodíka, alkylóvú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, skupinu -CH2OH, -CH2CH2OH alebo -CH2CH2CH2OH, s tými podmienkami, že

1) jeden zo symbolov R³ a R⁴ predstavuj e atóm vodíka, a 2) ak R⁴ predstavuje atóm -CH₂OH alebo -CH₂CH₂OH, a vodíka, R³ znamená skupinu 3) ak R³ predstavuje atóm vodíka, R⁴ znamená metylovú skupinu, skupinu -CH₂OH, - -CH₂CH₂OH alebo -CH₂CH₂CH₂OH,

alebo znamená zvyšok všeobecného vzorca b kde

R- (b) predstavuje skupinu všeobecného vzorca b-pb^balebo b_{4 r}7q

MOOC-(-CH₂ý—CH— CO-NH-C— Φ_π)

L I

R⁶ R?b

CH₂

MOOC— CH—(-CH₂·)^—CO— NH~ CH— (b₄) kde

P má hodnotu 1 alebo 2, q má hodnotu 2 alebo 3, r má hodnotu 1 alebo 2, R⁶ znamená atóm kde vodíka, aminoskupinu alebo skupinu -NHR^X

R^x predstavuje ochrannú skupinu amínovej funkčnej skupiny,

R^7a znamená skupinu -CH₂OH, -CH₂CH₂OH alebo -CH(OH)-CH₂OH, a

R ^D predstavuje atóm vodíka, alebo obidva symboly R^7a a R⁷'³ znamenajú vždy skupinu CH₂OH,

R¹¹ predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu,

R¹³ znamená skupinu -(CH₂)j-COOM alebo -SOgM, kde j má hodnotu 1, 2 alebo 3, a M má vyššie definovaný význam, pričom druhá hydroxyskupina ako substituent fenylovej skupiny vo zvyšku všeobecného vzorca b₄ je v ľubovoľnej meta-polohe, alebo

R³· . znamená zvyšok všeobecného vzorca c

O-CH-CH·, ¹ 8 ^(C)

R -CO-NH-CH-COR^ä kde

R⁸ predstavuje skupinu OM¹, OR¹⁴, R^S-RP alebo -NHrY, kde

M·⁴ znamená katión,

R¹⁴ predstavuje nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový zvyšok,

R^s znamená spojovaciu skupinu, rP predstavuje fosfátidylový zvyšok a

R^ znamená lipofilný zvyšok, a

R⁹ predstavuje skupinu všeobecného vzorca ο-^,ο^Οβ alebo c₄, OH

OH

JOo.

MCOC - CH—t CH₂)_S- CO - NH - C MOOC-CH-

-40b (c,) (^C2 kde (ej (ej s má hodnotu 1 alebo 2, t má hodnotu 1 alebo 2, v má hodnotu 2 alebo 3, symboly M, r6,rÍÍ a R^ majú vyššie definované významy, a RÍ^^a znamená skupinu -CH₂OH, -CH₂CH₂OH alebo -CH (OH)-CH^OH a RlOb p_red_stavuje atóm vodíka, alebo obidva symboly R^10a a R¹⁰*³ znamenajú vždy skupinu CH₂OH, pričom druhá hydroxyskupina ako substituent fenylovej skupiny vo zvyšku všeobecného vzorca c₂ je v ľubovoľnej meta-polohe, alebo v ktorom ii)

R¹ predstavuje hydroxyskupinu, a

R znamená zvyšok všeobecného vzorca d _R6 _R12a

I H |

MOOC —(CH₂4^_rCH-CO-N-C-CO-NH-CH₂ - (d) .

il2b kde w má hodnotu 1 alebo 2,

R^12a znamená skupinu -CH (OH) - (CH₂) _χ-0Η, a η Q

R ^D predstavuje atóm vodíka, alebo obidva symboly R^^2a a R¹²^* nezávisle na sebe znamenajú vždy skupinu -CH₂OH alebo -CH₂CH₂OH, x má hodnotu 2 alebo 3, a g

symboly R a M majú vyššie definované významy.

2. Fukopeptid všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R predstavuje metylovú skupinu a R¹ znamená zvyšok všeobecného vzorca c pričom R predstavuje zvyšok všeobecného vzorca Cj_ alebo c₂ .

3. Fukopeptid všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R-¹- predstavuje hydroxyskupinu a R znamená zvyšok všeobecného vzorca d.

4. Fukopeptid všeobecného vzorca v ktorom M predstavuje katión.

5. Fukopeptid všeobecného vzorca alebo v ktorom M predstavuje katión.

6. Fukopeptid všeobecného vzorca alebo v ktorom M predstavuje katión.

7. Spôsob prípravy fukopeptidu všeobecného vzorca I podľa nároku 1,vyznačuj 'ú ci sa tým, že sa odstráni aspoň jedna ochranná skupina, ktorá je prítomná vo fukopeptide všeobecného vzorca 1 v chránenej forme, a ak je to žiaduce, izoluje sa takto získaný fukopeptid všeobecného vzorca I vo volnej forme alebo vo forme soli.

8. Fukopeptid podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 6 na použitie ako liečivo.

9. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fukopeptid podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 6, spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

10. Spôsob prevencie alebo liečenia porúch alebo ochorení sprostredkovaných bunkovou adhéziou v dôsledku väzby na selektíny u pacienta, ktorý takéto ošetrenie potrebuje, vyzná čujúci sa tým, že sa tomuto pacientovi.podá účinné množstvo fukopeptidu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 6.