SK10742003A3

SK10742003A3 - Vodná kompozícia amfotericínu B

Info

Publication number: SK10742003A3
Application number: SK1074-2003A
Authority: SK
Inventors: Srikanth Pai; Sangeeta Rivankar
Original assignee: Bharat Serums & Vaccines Ltd.
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2001-03-16
Publication date: 2004-01-08
Also published as: WO2002069983A1; PT1368041E; CN1505519A; KR20040018337A; EA006241B1; JP2004523566A; DE60105322T2; EP1368041B1; EP1368041A1; NZ528281A; CN1255114C; ATE274913T1; DE60105322D1; DK1368041T3; CZ20032264A3; IN188924B; US20040137049A1; ES2227172T3; AU2001250643B2; BR0116922A

Description

Vynález sa týka vodnej kompozície amfotericínu B s nízkou toxicitou. Vynález sa najmä týka vodnej kompozície amfotericínu B s nízkou toxicitou obsahujúcou fosfolipidy vhodné na parenterálne podanie.

Doterajší stav techniky

Amfotericín B patrí medzi polyénové fungicídy, lieky na báze antibiotík vhodné na liečbu inváznych plesňových infekcií. Nič na tom, vykazuje vysokú nefrotoxicitu.

Toxicita amfotericínu B sa znižuje rôznymi bežne používanými postupmi, ako sú (a) uzavretie lieku do lipozómov a (b) premena lieku na komplex lieku s lipidom (HDLC).

Príprava lipozomálneho amfotericínu B

V USA patente č. 4 973 465 (1990) sa opísala príprava HDLC, v ktorej sa použili steroly ako cholesterol, buď samostatne alebo v kombinácii s prírodnými fosfolipidmi, fosfatidylcholínom.

V USA patente Č. 5 616 334 (1997) sa opísal postup prípravy lipozomálneho amfotericínu B, ktorý zahŕňa začiatočné vytvorenie multi-lamelámych mechúrikov (MLV) a potom zmiešanie MLV mechúrikov so sonikovanou zmesou amfotericínu B vo vode. Tento postup nezahŕňa použitie žiadnych rozpúšťadiel. Nič na tom, tento postup špeciálne poskytuje lipozomálny amfotericín B, ktorý je toxickejší než HDLC amfotericín B. Tento postup zahŕňa opotomované pretlačovanie prázdnych lipozómov cez vrstvené polykarbonátové filtre za účelom roztriedenia lipozómov podľa veľkosti, a to desaťkrát. Tiež zahŕňa odstránenie nezačleneného amfotericínu B pomocou centrifugacie po naplnení lipozómov liekom.

Tento USA patent tiež opisuje postup prípravy HDLC v „systéme liek-lipidy s nízkou toxicitou“. V tomto patente sa opísal postup na prípravu lipidového komplexu amfotericínu B. Tento postup sa bežne uskutočňuje nasledovne:

Príprava HDLC:

Najskôr sa liek amfotericín B rozpučí v rozpúšťadle, ako je napríklad dimetylsulfoxid (DMSO) alebo metanol. Lipidy, vhodnejšie dimyristoylfosfatidylcholín (DMPC) a dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG) v molárnom pomere 7 : 3, sú rozpustené v rozpúšťadlách, ako sú: metanol, etanol, chlórované uhľovodíky. Roztok lieku a roztok lipidov sa zmieša.

-2Rozpúšťadlá sa odparia pri zníženom tlaku, čo vedie ku vznikom tenkého filmu lipidov s liekom. Tento film sa hydratuje pomocou vodného roztoku, ako je voda, soľný roztok, soľný, fosfátový pufer alebo glycínový pufer, aby vznikol HDLC.

V jednom variante tohto postupu sa vzniklý suchý film lipid-liek resuspenduje v rozpúšťadle, ako je napríklad dichlórmetán a znovu odparí pri zníženom tlaku pred tým, než sa film hydratuje.

V ďalšej obmene tohto postupe sa suchý film lipid-liek dehydratuje, aby vytvoril vločky; tieto vločky sa potom hydratujú pomocou vodného roztoku.

V ďalšom postupe sa vodný roztok ako: soľný roztok, pufer alebo voda, pridá k roztoku obsahujúcemu liek a lipid, a potom sa rozpúšťadlo odparí, aby vznikol HDLC. V tomto postupe sa nepožaduje vytvorenie tenkého filmu fosfolipidov.

V alternatívnom postupe na vytvorenie HDLC komplexov opísanom v tomto USA patente sa lipidové častice (alebo lipozómy) obsahujúce bioaktívne zložky, ako je amfotericín B, formujú najskôr vytvorením multilamelámych mechúrikov (MLV) obsahujúcich 6 až 50 molárnych percent bioaktívneho prípravku. Potom sa MLV vystavia zahrievaciemu cyklu, približne od 25 °C až 60 °C, najlepšie 60 °C. Takýto cyklus vytvára viac usporiadaný a menej toxický lipidový komplex amfotericínu B.

V tomto USA patente sa opísal ďalší alternatívny postup prípravy lipidového komplexu s amfotericínom B. V tomto postupe sa lipidy zmiešajú s 0,9 % roztokom chloridu sodného a homogenizujú pomocou homogenizátora. Amfotericín B sa rozpustí v dimetylsulfoxide (DMSO) a pridá k roztoku lipidov v priebehu homogenizácie a tento proces pokračuje ďalej asi 30 minút, dokiaľ sa veľkosť častíc nezmenší na menej než 10'² mm (10 mikrónov), výhodnejšie na približne 10'² mm (10 mikrónov). Výsledné lipidové častice sa vyberajú podľa veľkosti s použitím tangenciálnej prietokovej filtrácie. Nevýhodou tohoto postupu je, že použité rozpúšťadlo DMSO má vysokú teplotu varu a teda sa zle odstraňuje z produktu. Navyše v konečnom produkte zostávajú stopové množstvá DMSO. Nie je žiaduce, aby v kompozícii určenej na intravenóznu aplikáciu zostávali stopy takéhoto rozpúšťadla, pretože sa toto rozpúšťadlo preukázalo ako hapatotoxické (The journal of Infectious diseases 1991: 164, str. 418-421).

HDLC patrí medzi vhodné prípravky na zníženie toxicity amfotericínu B, ale postupy opísané v USA patente č. 5 616 334 (1997) vyžadujú použitie veľkých množstiev organických rozpúšťadiel, pretože amfotericín B je málo rozpustný vo väčšine bežne používaných, na parenterálne použitie, prijateľných organických rozpúšťadiel. Teda postup zahŕňa odstránenie veľkých množstiev organických rozpúšťadiel odparovaním. Alternatívne sa na rozpustenie

-3 amfotericínu B používajú také aprotické rozpúšťadlá, ako sú dimetylsulfoxid, dimetylformamid. Tieto aprotické rozpúšťadlá majú vysokú teplotu varu a stopy týchto rozpúšťadiel zostávajú v konečnej kompozícii. Pretože sú tieto aprotické rozpúšťadlá hepatotoxické, neodporúča sa ich použitie v procese výroby.

Stále je teda treba zdokonaliť postup pre veľkokapacitnú výrobu kompozícií amfotericínu B znížením použitého množstva rozpúšťadiel. Tým dôjde tiež ku zníženiu výrobných nákladov.

Hlavným cieľom vynálezu je vývoj vodnej kompozície s nízkou toxicitou obsahujúcou amfotericín B a fosfolipidy s ohľadom na jednoduchosť a zníženie nákladov na výrobu. Ďalším rozšírením hlavného cieľa vynálezu je vývoj vodnej kompozície na parenterálne podanie s nízkou toxicitou obsahujúcou amfotericín B a fosfolipidy a neobsahujúcou stopy DMSO a/alebo chlórovaných uhľovodíkov.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje parenterálne vodné kompozície s nízkou toxicitou obsahujúcou amfotericín B, chlorid sodný a fosfolipidy, ktorá neobsahuje dimetylsulfoxid.

Ďalej sa vynález zaoberá spôsobom výroby parenterálnej vodnej kompozície s nízkou toxicitou obsahujúcou amfotericín B, chlorid sodný a fosfolipidy, ktorá neobsahuje dimetylsulfoxid, pozostávajúci z týchto krokov:

(i) rozpustenie jedného alebo viac fosfolipidov v jednom alebo viac organických rozpúšťadlách vybraných zo skupiny rozpúšťadiel použiteľných na parenterálne podanie, ako sú: metanol. etanol, izopropylalkohol, trichlormetán (chloroform), tetrachlórmetán a dichlórmetán, a potom odstránenie rozpúšťadiel vyparovaním pri zníženom tlaku, aby došlo k vytvoreniu suchého filmu jedného alebo zmiešaných fosfolipidov;

(ii) rozmiešaním amfotericínu B vo vodnej fáze prijateľnej na parenterálne podanie, ktorá neobsahuje chlorid sodný alebo rozmiešaním mikronizovaného amfotericínu B vo vodnej fáze prijateľnej na parenterálne podanie, ktorá môže obsahovať chlorid sodný;

(iii) pridanie vodnej fáze obsahujúcej suspendovaný amfotericín B, vytvorený v závere kroku (ii) k uvedenému filmu fosfolipidov, ktorý sa získal v závere kroku (i) a zmiešanie týchto dvoch, aby vznikla suspenzia amfotericínu B spolu s fosfolipidmi v uvedenej vodnej fáze;

(iv) upravenie pH uvedenej suspenzie získanej na konci kroku (iii) na hodnotu 6,0 až 8.0 a homogenizovanie, dokiaľ nepôjde suspenziu filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2 μ);

(v) pridanie dostačujúceho množstva roztoku chloridu sodného vo vode na konci kroku (iv) tak. aby obsah chloridu sodného vo finálnom produkte bol aspoň 0,1 hmot./obj. %;

-4(vi) filtrovanie uvedenej homogenizovanej suspenzie získanej v závere kroku (v) cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2μ) a naplnenie filtrátu do ampuliek v dusíkovej atmosfére, utesnenie ampuliek a sterilizácia utesnených ampuliek autoklávovaním, aby sa získal konečný produkt vhodný na parenterálne podanie.

Vynález sa tiež zaoberá vodnou kompozíciou amfotericínu B s nízkou toxicitou obsahujúcou aspoň 0,1 hmot./obj. % chloridu sodného a fosfolipidov, ako sme tu opísali a vyrobenou spôsobom podľa vynálezu tak, ako je tu opísaný.

Obsah amfotericínu B v kompozícii podľa vynálezu sa pohybuje v rozmedzí od 0,1 hmot./obj. % do 1,0 hmot./obj. % kompozície, výhodnejšie je obsah amfotericínu B 0,5 hmot./obj. % kompozície.

Celkový obsah fosfolipidov sa pohybuje v rozmedzí od 0,1 hmot./obj. % do 1,0 hmot./obj. % kompozície. Výhodný obsah je od 0,4 hmot./obj. % do 0,6 hmot./'obj. %.

Hmotnostný pomer amfotericín B ku fosfolipidom je od 1:0,5 do 1:1,5. Výhodný hmotnostný pomer sa pohybuje od 1:0,8 do 1:1,2.

V tomto postupe sú fosfolipidy vybrané z vaječného fosfatidylcholínu, alebo zmesi dimyristoylfosfatidylcholínu (DMPC) a sodnej soli dimyristoylfosfatidylglycerolu (DMPG). Pokiaľ je použitá zmes dvoch fosfolipidov DMPC a DMPG, potom je hmotnostný pomer fosfolipidov DMPC : DMPG medzi 7:1 a 7:15, výhodnejšie je to 7:3.

Rozpúšťadlá použité na rozpustenie fosfolipidov sú vybrané z alkoholových rozpúšťadiel, ako sú: etanol, metanol, izopropylalkohol s prídavkom alebo bez prídavku chlórovaných uhľovodíkov, ako sú: trichlormetán, dichlórmetán, tetrachlórmetán. Na rozpustenie fosfolipidov sa môžu použiť samostatne alkoholové rozpúšťadlá alebo chlórované uhľovodíky samostatne. Prípadne možno tiež na rozpustenie fosfolipidov použiť kombináciu alkoholových rozpúšťadiel a chlórovaných uhľovodíkov. Pokiaľ nie sú vybrané chlórované uhľovodíky, neobsahuje kompozícia tieto chlórované uhľovodíky. Výhodným rozpúšťadlom na rozpustenie fosfolipidov je etanol.

Mikronizovaný amfotericín B použitý kdekoľvek v rámci vynálezu je mikronizovaný použitím vzduchového prúdového mlyna na veľkosť častíc menšiu než 10 ² mm (10 mikrónov).

pH vodnej fáze použité na dispergovanie amfotericínu B je upravené na hodnoty 6,0 až 8,0 s použitím zriedeného roztoku hydroxidu sodného vždy, pokiaľ nie je pufrovací roztok použitý v kompozícii.

Vodná fáza použitá na suspendovanie amfotericínu B je prostriedkom/nositeľom prijateľným na parenterálne podanie, ako je voda alebo fosfátový pufer. Pokiaľ je použitý

-5mikronizovaný amfotericín B, môže byť vodnou fázou použitou na suspendovanie amfoterínu B soľný roztok, soľný, fosfátový pufer (PBS), voda alebo fosfátový pufer.

Po homogenizácii a pred filtráciou sa pridá chlorid sodný ako roztok vo vode. Nič na tom, pokiaľ je použitý mikronizovaný amfotericín B, môže sa chlorid sodný pridať v ktoromkoľvek z krokov (ii) až (iv) výroby, ktoré sú uvedené vyššie.

Koncentrácia chloridu sodného sa pohybuje v rozmedzí 0,1 hmot./obj. % až 0,9 hmot./obj. % kompozície, výhodnejšie 0,4 hmot./obj. % až 0,9 hmot./obj. % kompozície.

Homogenizácia sa vykonáva vo vysokotlakovom homogenizátore pri aspoň 34,5 MPa až možno produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien a veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2 mikróny).

V ďalšom uskutočnení vynálezu sa lipidová suspenzia amfotericínu B pred homogenizáciou sonikuje v kúpele sonikátora, aby sa získala rovnomerná suspenzia po upravení pH na 6,0 až 8,0. Zriedený roztok hydroxidu sodného sa použije na úpravu pH zakaždým, pokiaľ nie je pufrovací roztok použitý v kompozícii.

Homogenizovaná lipidová suspenzia amfotericínu B sa filtruje cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2 mikróny) podľa obvyklých filtračných postupov pod tlakom, buď použitím filtrovaného dusíka alebo filtrovaného, stlačeného vzduchu.

Po filtrácii sa homogenizovaná suspenzia naplní do ampuliek pod atmosférou dusíka a sterilizuje sa bežným autoklávovaním pri 110 °C až 121 °C, s výhodou pri 121 °C po 20 minút alebo pri 110°C po dobu 40 minút. Sterilizáciu možno tiež uskutočniť špecializovaným postupom autoklávovania. pri ktorom je doba cyklu zahrievania a chladenia skrátená pomocou systému s rýchlym zahriatím a rýchlym ochladením.

V skorších postupoch prípravy HDLC komplexov, ako boli opísané v USA patentoch č. 4 973 465 (1990) a č. 5 616 334 (1997), sa amfotericín B rozpustil vo veľkom množstve organických rozpúšťadiel. V jednom z príkladov v USA patente č. 5 616 334 (1997), je použitý 1 1 metanolu na prípravu 1 ampulky s 20 ml lipidového komplexu amfotericínu B, ktorý odpovedá 100 mg amfotericínu B. V inom príklade, kde je snaha o zníženie objemu rozpúšťadla, sa použilo 5 ml DMSO na 100 mg amfotericínu B, ale DMSO sa neodporúča ako rozpúšťadlo na intravenóznu injekčnú aplikáciu, pretože sa v DMSO preukázala hepatotoxicita.

V spôsobe podľa vynálezu sa amfotericín B nerozpustil vôbec v žiadnom rozpúšťadle, zatiaľ čo tradičný postup používa DMSO na rozpustenie amfotericínu B.

V postupe podľa vynálezu, pokiaľ sa amfotericín B rozpustený vo vodnej fáze obsahujúcej chlorid sodný pridá k lipidovému filmu a homogenizuje, pozoroval sa vznik zhlukov a

-6homogenizovaný produkt sa nedal filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov

2x10'³ mm (2 mikróny) podľa bežných filtračných postupov.

Po rozsiahlom uskutočňovaní pokusov sa zistilo, že pokiaľ sa vodná fáza určená na suspendovanie amfotericínu B pripravila bez prídavku akéhokoľvek chloridu sodného, prebiehala homogenizácia hladko bez tvorby agregátov v suspenzii a homogenizovaný objem sa dal filtrovať.

Nič na tom, potom sa zistilo, že prítomnosť chloridu sodného v kompozícii je nevyhnutná na zníženie toxicity. Vodné kompozície amfotericínu B obsahujúce rôzne hodnoty koncentrácií chloridu sodného v dávke 80 mg/kg telesnej hmotnosti sa vpravili injekčné myšiam, v skupinách po 8. Vodné kompozície amfotericínu B bez akéhokoľvek chloridu sodného, ktoré sa pripravili podľa opisu v tu uvedených príkladoch, sa injekčné podali samostatne. Pred každou injekciou sa objemový ekvivalent odpovedajúci dávke 80 mg/kg telesnej hmotnosti zriedil na 0,5 ml pridaním 5 % dextrózovej injekcie, aby bol roztok osmotický/izotonický. Percentuálna úmrtnosť sa zaznamenala po uplynutí 72 hodín a je ukázaná v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Koncentrácia chloridu sodného vo vodnej kompozícii amfotericínu B	Pripravená podľa príkladu	Percentuálna úmrtnosť myší pri dávke 80 mg/kg
0,9 hmot./obj. %	III	Nula
0,7 hmot./obj. %	IV	Nula
0,4 hmot./obj. %	V	Nula
0,1 hmot./obj. %	VI	50 %
Nula	XIII	87,5 %

Z tabuľky 1 vyplýva, že minimálna koncentrácia chloridu sodného 0,1 % je nevyhnutná na zníženie toxicity. Preto behom hydratácie filmu fosfolipidov sa na dosiahnutie hladkej homogenizácie použila vodná fáza bez obsahu akéhokoľvek chloridu sodného a tiež na zabezpečenie ľahkej filtrácie cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10³ mm (2 mikróny). Chlorid sodný sa pridá do roztoku až po homogenizácii. Prídavok chloridu sodného do kompozície podľa vynálezu je nevyhnutný na zníženie toxicity amfotericínu B. Napriek tomu, že s prídavkom 0.1 hmot./obj. % chloridu sodného bol LD50 80 mg/kg, toto LD50 je o hodne vyššie

-Ί než pri bežných prípravkoch amfotericínu B obsahujúcich dezoxycholát sodný, pri ktorých sa udáva okolo hodnoty 4 mg/kg.

Po rade ďalších pokusov sme zistili, že zmenšenie priemernej veľkosti častíc amfotericínu B pod 10’ mm (10 mikrónov) pomocou mikronizácie pomohlo pri prekonaní problému agregácie/zhlukovania behom homogenizácie. Analýza veľkosti častíc amfotericínu B pred a po mikronizácii sa uskutočňovala na detektore veľkosti častíc Sympatie HELIOS. Mikronizácia amfotericínu B pomohla tiež pri prekonaní problému filtrácie, ktorý sa spojil s prítomnosťou chloridu sodného v homogenizovanej vodnej suspenzii obsahujúcej ne-mikronizovaný amfotericín B a fosfolipid.

Filtrácia homogenizovaného objemu pripraveného s použitím mikronizovaného amfotericínu B je ľahká a môžu sa použiť bežne používané filtre; v skorších postupoch používaných v obore, ako napr. v USA patente č. 5 616 334 (1997), se vykonáva filtrácia HDLC komplikovanou cestou alebo priamo cez membránový filter, ako je polykarbonátový filter.

V jednom uskutočnení podľa vynálezu je možné prekonať problém zhlukovania a filtrácie použitím ne-mikronizovaného amfotericínu B vynechaním prídavku chloridu sodného do vodnej fáze. Nič na tom, bolo zistené, že prídavok chloridu sodného aspoň v minimálnej koncentrácii 0,1 hmot./obj. % je nevyhnutný na zníženie toxicity vodnej kompozície amfotericínu B. Pokiaľ je v kompozícii obsiahnutý chlorid sodný, vyrieši sa problém zhlukovania a filtrácie tým, že sa s pridaním chloridu sodného počká až po kroku homogenizácie.

Preto v prvom uskutočnení podľa vynálezu, v spôsobe prípravy sterilnej vodnej kompozície amfotericínu B s nízkou toxicitou obsahujúcou aspoň 0,1 hmot./obj. % chloridu sodného, sa ako vodná fáza na rozptýlenie ne-mikronizovaného amfotericínu B použije voda alebo fosfátový pufer, ktoré neobsahujú chlorid sodný. Chlorid sodný sa pridá presne po homogenizácii vodnej suspenzie obsahujúcej ne-mikronizovaný amfotericín B a fosfolipidy.

V druhom uskutočnení podľa vynálezu sa problém agregácie/zhlukovania a filtrácie suspenzie fosfolipidu a vodnej fáze obsahujúcej amfotericín B vyrieši použitím mikronizovaného amfotericínu B.

V kombinácii týchto dvoch uskutočnení vynálezu, pokiaľ sa použije amfotericín B mikronizovaný a suspenduje sa vo vodnej fáze neobsahujúcej chlorid sodný, chlorid sodný sa pridá do vodnej fáze pred, behom alebo po kroku homogenizácie.

Príklady uskutočnenia vy nálezu

Vynález te:az predstavíme pomocou príkladov. Príklady sú iba ilustratívne a v žiadnom prípade neobmedzujú rozsah vynálezu.

-8Sú opísané štyri skupiny príkladov tak, ako je uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Skupina	Čísla príkladov	Amfotericín B	Vodná fáza použitá na rozptýlenie amfotericínu B	Prídavok soli	Uskutočne nie vynálezu
A	I-II	Ne-mikronizovaný	Neobsahuje soľ	Po kroku homogenizácie	Prvý
B	III-VI} VIII-IX} VII*	Mikronizovaný Mikronizovaný	Obsahuje soľ Obsahuje soľ		Druhý Druhý
C	X-XII	Mikronizovaný	Neobsahuje soľ	Behom/po kroku homogenizácie	Prvý & Druhý
D	XIII	Mikronizovaný	Neobsahuje soľ		Nepatrí do vynálezu
XIV	Ne-mikronizovaný

* Rozpúšťadlom použitým na rozpustenie fosfolipidov je iba etanol.

Všetky suroviny použité v týchto príkladoch patrili do parenterálnej triedy. Použilo sa bežné vybavenie. Celé spracovanie prebiehalo v prostredí s riadenými podmienkami, ktoré sa požaduje na výrobu sterilných produktov.

Amfotericín B použitý v príkladoch patril do parenterálnej triedy získanej od Alpharma, ktorá vyhovuje USP špecifikáciám. Mikronizovaný amfotericín B, pokiaľ sa použil v týchto príkladoch, sa vždy pripravil mikronizáciou amfotericínu B s použitím vzduchového prúdového mlyna na veľkosť častíc menšiu než 10'² mm (10 mikrónov).

Fosfolipidy DMPC a DMPG použité v príkladoch patrili do parenterálnej triedy a boli získané od firmy Avanti Polar Lipids.

Fosfolipid vaječný fosfatidylcholín použitý v príkladoch patril do parenterálnej triedy a bol získaný od firmy Lipoids.

Organické rozpúšťadlá po’ žité v príkladoch mali kvalitu AR (analytický prípravok).

Fosfátový pufer použitý v príkladoch sa pripravil presne podľa Indián Pharmacopoeia.

Soľný, fosfátový pufer pH 7,4 so soľou, použitý v príkladoch, sa pripravil rozpustením 1,19 g hydrogenfosforečnanu disodného (Na2HPO4.2H2O), 0,095 g dihydrogenfosforečnanu

-9draselného (KH9PO4) a 4 g chloridu sodného (NaCl) v 400 ml vody. Voda sa pridala na konečný objem 500 ml.

SKUPINA A : Príklady I & II

Zložky použité v týchto príkladoch sú uvedené v tabuľke 3:

Tabuľka 3

		Príklad I	Príklad II
a)	Amfotericín B	1,00 g	1,00 g
b)	DMPC	0,68 g	0,68 g
c)	DMPG	0,30 g	0,30 g
d)	Etanol’	200 ml	200 ml
e)	Trichlormetán’	10 ml	10 ml
f)	pH - pri dispergovaní pred homogenizáciou	6,95” 6,80”	7,2 7,2
g)	Chlorid sodný	1,80 g	1,80 g
h)	Deionizovaná voda (q.s.to)	200 ml	—
i)	Fosfátový pufer pH 7,2 (q.s.to)	—	200 ml

* nezostáva v konečnom produkte * upravené použitím 0,1 M roztoku hydroxidu sodného

Postup:

V príklade I sa amfotericín B rozsuspendoval v 150 ml vody miešaním a prebublávaním dusíkom. Pomocou 0,1 M roztoku hydroxidu sodného sa pH upravilo na 6,95.

V príklade II sa amfotericín B rozsuspenduje v 150 ml fosfátovom pufri s pH 7,2 miešaním a prebublávaním dusíkom.

Fosfolipidy DMPC a DMPG sa rozpustili v chloroforme v banke v rotačnej odparke. Po úplnom rozpustení fosfolipidov sa pridá etanol a zmes sa zmieša otáčaním banky pri malej rýchlosti premývaním dusíkom. Tento alkoholový roztok sa rotačné odparí pri zníženom tlaku až do sucha. Dusík sa vháňal 30 minút po odstránení rozpúšťadiel.

Suchý film lipidov sa hydratuje v banke do rotačnej odparky s vodnou suspenziou amfotericínu B, ktorá sa pripravila podľa opisu, pri plynulom otáčaní banky a pri stálom premývaní dusíkom. Na úpravu pH lipidovej suspenzie amfotericínu B získanej v príklade I na hodnotu približne 6,80 sa použil roztok hydroxidu sodného. Obsah banky sa sonikoval v kúpele

- 10sonikátora po dobu 1 hodiny. Objem sa upravil na 180 ml pridaním vody v príklade I a pomocou fosfátového pufra pH 7,2 v príklade II.

Lipidová suspenzia amfotericínu B sa homogenizovala pomocou APV vysokotlakového homogenizátora až šlo homogenizovaný produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10‘³ mm (2μ).

V príklade I sa chlorid sodný rozpustil vo vode a zriedil vodou na 20 ml. V príklade II sa chlorid sodný rozpustil a zriedil na 20 ml fosfátovým pufrom pH 7,2. Tento roztok chloridu sodného sa pridal k homogenizovanej suspenzii amfotericínu B s lipidom miešaním malou rýchlosťou a premývaním dusíkom. Tento produkt sa preniesol späť do homogenizátora a znovu sa podrobil cyklu po dobu 5 minút bez použitia tlaku. Potom sa filtroval cez filter zo sklenených

T vlákien s veľkosťou pórov 2x10' mm (2μ) a pod atmosférou dusíka naplnil do sklenených nádob, nádoby sa utesnili a autoklavovali 40 minút pri 110 °C. V príklade II sa autoklavovanie uskutočnilo po dobu 40 minút pri 110°C pomocou cyklu rýchleho zahriatia a rýchleho ochladenia.

SKUPINA B :

1) Príklady III až VI

Zložky použité v týchto príkladoch sú uvedené v tabuľke 4 a postup je uvedený ďalej, množstvo pridaného chloridu sodného se menilo od 1,8 g po 0,2 g.

Tabuľka 4

	Príklady
III	IV	V	VI
a)	Amfotericín B mikronizovaný	1,00 g	1,00 g	1,00 g	1,00 g
b)	DMPC	0,68 g	0,68 g	0,68 g	0,68 g
c)	DMPG	0,30 g	0,30 g	0,30 g	0,30 g
d)	Chlorid sodný	1,80 g	1,40 g	0,80 g	0,20 g
e)	Etanol*	200 ml	200 ml	200 ml	200 ml
f)	Chloroform’	10 ml	10 ml	10 ml	10 ml
g)	PH - pri dispergovaní pred homogenizáciou	7,20 7,00**	7,15” 7,10	7,05*’ 7,15	7,20 7 no
h)	Deionizovaná voda (q.s.to)	200 ml	200 ml	200 ml	200 ml

- 11 * nezostáva v konečnom produktu ** upravené použitím 0,1 M roztoku hydroxidu sodného

Postup :

Fosfolipidy DMPC a DMPG sa rozpustili v trichlormetáne v banke v rotačnej odparke. Po úplnom rozpustení fosfolipidov sa pridá etanol a zmes se nechá miešať v banke pri malej rýchlosti premývaním dusíkom. Tento alkoholový roztok sa pri zníženom tlaku rotačné odparí až do sucha. Dusíkom sa premýva 30 minút po odstránení rozpúšťadiel.

Chlorid sodný sa rozpustil v 175 ml vody. Dusík sa prebublával do tohto roztoku 15 minút. Mikronizovaný amfotericín B sa potom rozsuspenduje v roztoku chloridu sodného miešaním a prebublávaním dusíkom. Pridaním 0,1 M hydroxidu sodného sa pH upravilo na hodnoty uvedené v Tabuľke 4 pre každý príklad.

Suchý film lipidov sa hydratuje v rotačnej banke vodnou suspenziou amfotericínu B, ktorá sa pripravila podľa uvedeného opisu, bánka se neustále otáčala a sa neustále premývala dusíkom. V tabuľke 4 je uvedené upravené pH takto získaného lipidového komplexu amfotericínu B. Obsah banky sa sonikoval v kúpele sonikátora po dobu 1 hodiny.

Objem sa vodou doplnil na 200 ml.

Lipidová suspenzia amfotericínu B sa homogenizovala pomocou vysokotlakového homogenizačného mlyna až šlo produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2μ).

Homogenizovaná lipidová suspenzia amfotericínu B sa filtrovala cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2 μ) a naplnila do sklenených nádob v dusíkovej atmosfére, nádoby sa uzavreli a autoklavovali 40 minút pri 110°C pomocou cyklu rýchleho zahriatia a rýchleho ochladenia.

Stanovenie toxicity u myší pre produkty príkladov III, IV a V pri dávke 80 mg/kg telesnej hmotnosti neukázala žiadnu úmrtnosť, zatiaľ čo produkt podľa príkladu VI vykázal 50 % úmrtnosť.

SKUPINA B pokračovanie :

2) Príklady VII až IX

Zložky použité v týchto príkladoch sú uvedené v tabuľke 5 a postup je uvedený ďalej.

- 12 Tabuľka 5

Príklady
		VII	VIII	IX
a)	Amfotericín B (mikronizovaný)	1,00 g	1,00 g	1,00 g
b)	DMPC	0,68 g	—	0,68 g
c)	DMPG	0,30 g	—	0,30 g
d)	vaječný fosfatidylcholín	—	0,90 g	--
e)	Chlorid sodný	1,80 g	1,80 g	***
f)	Etanol’	300 ml	200 ml	200 ml
g)	Trichlórmetán* ^{ *}	—	15 ml	10 ml
h)	PH - pri dispergovaní Pred homogenizáciou	7,15 7,05	7,15 6,95	7,40 7,40
i)	Deionizovaná voda (q.s.to)	200 ml	200 ml
j)	Fosfátový pufer (q.s.to)	—	—	200 ml

* nezostáva v konečnom produktu ** upravené použitím 0,1 M roztoku hydroxidu sodného *** ~ 2 g od PBS Postup :

V príklade VII sa fosfolipidy DMPC a DMPG rozpustili v etanole v banke do rotačnej odparky pri pomalom otáčaní premývaním dusíkom.

V príklade VIII sa fosfolipid vaječný fosfatidylcholín rozpustil v trichlormetáne v banke do rotačnej odparky a v príklade IX sa fosfolipidy DMPC & DMPG rozpustili v trichlormetáne v banke do rotačnej odparky. Po úplnom rozpustení fosfolipidov v trichlormetáne sa pridá etanol a zmes se nechá miešať pomalým otáčaním banky premývaním dusíkom.

V týchto príkladoch sa získaný fosfolipidový roztok rotačné odparí pri zníženom tlaku až do sucha. Po úplnom odstránení rozpúšťadiel sa dusíkom premýva ešte 30 minút.

V príkladoch VII & VIII sa chlorid sodný rozpustil v 175 ml vody. Dusík sa nechal prebublávať do tohoto roztoku po dobu 15 minút. Mikronizovaný amfotericín B sa potom rozsuspenduje v roztoku chloridu sodného miešaním a prebublávaním dusíkom, pH sa upraví na približne 7,15 prídavkom 0,1 M roztoku hydroxidu sodného.

- 13 V príklade IX sa mikronizovaný amfotericín B rozsuspenduje miešaním v 175 ml soľnom fosfátovom kufri (PBS) pH 7,4. Dusík sa prebublával 15 minút. PBS prispieva zhruba 2 g chloridu sodného.

Suchý film lipidov sa hydratuje v rotačnej banke s vodnou suspenziou mikronizovaného amfotericínu B pripraveného podľa tohoto postupu pri stálom otáčaní bankou a pri stálom premývaní dusíkom. V príklade VII sa pH získanej lipidovej suspenzie amfotericínu B upravili na 7,05 a v príklade VIII na 6,95 prídavkom 0,1 M roztoku hydroxidu sodného.

Objem sa v príkladoch VII & VIII doplnil vodou na 200 ml.

V príklade IX sa objem doplnil PBS pH 7,4 na 200 ml.

Lipidová suspenzia amfotericínu B sa potom homogenenizovala použitím APV vysokotlakového homogenizačného mlyna až šlo produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10‘³ mm (2μ).

Homogenizovaná lipidová suspenzia amfotericínu B sa filtrovala cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10’³ mm (2 μ) do sklenených nádob v dusíkovej atmosfére, nádoby sa uzavreli a autoklavovali 20 minút pri 121 °C v príklade IX a 40 minút pri 110 °C v príkladoch VII & VIII.

Sterilná vodná kompozícia amfotericínu B získaná v príklade VII sa podrobila stanoveniu toxicity u myší a uskutočnilo sa určenie stability/stálosti. Výsledky určenia toxicity sú uvedené v tabuľke 6 a výsledky určenia stability/stálosti sú uvedené v tabuľke 7.

Analýza veľkosti častíc:

Veľkosť častíc vodnej kompozície amfotericín B získaného v príklade VII sa určila na Modely 770 Accusazer v systéme meraní veľkosti častíc, Inc., USA. Veľkosť 95 % častíc sa nachádzala pod hodnotou 1,63x10'³ mm (1,63 μ) a 90 % častíc malo veľkosť menšiu než 1,28x10³ mm (1,28 μ).

Stanovenie toxicity u myší:

Stanovenie toxicity vodnej kompozície amfotericínu B získanej v príklade VII sa uskutočňovalo na myšiach spolu s bežným produktom amfotericínu B, ktorý obsahuje dezoxycholát sodný. Výsledky sú nasledujúce.

- 14Tabuľka 6

Stanovenie akútnej toxicity u myší

LD50 (intravenózne) Amfotericín B bežný produkt	3,5 mg/kg telesnej hmotnosti
Amfotericín B vodná kompozícia podľa
príkladu VII	> 80 mg/kg telesnej hmotnosti

Hodnota LD50 vodnej kompozície amfotericínu B pripravenej v tomto laboratóriu po jedinej injekcii bola u myší > 80 mg/kg. Táto hodnota bola viac než 20 krát vyššia než LD50 po jedinej injekcii bežného produktu amfotericínu B, ktorý obsahuje dezoxycholát sodný.

Tabuľka 7

Údaje pre stabilitu vodnej kompozície amfotericínu B podľa príkladu VII pri odporúčanom spôsobe skladovania pri teplote 2 °C až 8 °C

Doba	Vzhľad	Obsah amfotericínu B
Začiatok	Žlto sfarbená suspenzia s usadeninou pri stáni, ktorá sa pri miernom pretrepaní rovnomerne rozptýli	100,6%
6 mesiacov	Žlto sfarbená suspenzia s usadeninou pri stáni, ktorá sa pri miernom pretrepaní rovnomerne rozptýli	100,3 %
1 rok	Žlto sfarbená suspenzia s usadeninou pri stáni, ktorá sa pri miernom pretrepaní rovnomerne rozptýli	99,8 %
18 mesiacov	Žlto sfarbená suspenzia s usadeninou pri stáni, ktorá sa pri miernom pretrepaní rovnomerne rozptýli	98,3 %
2 roky	Žlto sfarbená suspenzia s usadeninou pri stáni, ktorá sa pri miernom pretrepaní rovnomerne rozptýli	96,5 %

Tento príklad jasne ukazuje, že parenterálna vodná kompozícia amfotericínu B, ktorá neobsahuje žiadne stopy DMSO alebo chlórovaných uhľovodíkov, pokiaľ sa pripravila podľa zdokonaleného postupu tohto vynálezu, kue nie sú vôbec použité tieto rozpúšťadlá, vyhovuje všeobecným požiadavkám na dobre predajný produkt vo forme suspenzie na injekčné podanie. Nová vodná kompozícia pripravená podľa postupu v príklade VII neobsahuje akékoľvek škodlivé rozpúšťadlá, ako sú DMSO a chlórované uhľovodíky.

- 15 SKUPINA C : Príklady X až XII

Zložky použité v týchto príkladoch sú uvedené v tabuľke 8 a postup je uvedený ďalej.

Tabuľka 8

Príklady
		X	XI	XII
a)	Amfotericín B (mikronizovaný)	1,00 g	1,00 g	1,00 g
b)	DMPC	0,68 g	0,68 g	0,68 g
c)	DMPG	0,30 g	0,30 g	0,30 g
d)	Chlorid sodný	1,80 g	1,80 g	1,80 g
e)	Etanol’	200 ml	200 ml	200 ml
f)	Trichlormetán* ^**	10 ml	10 ml	10 ml
g)	pH - pri dispergovaní pred homogenizáciou	7,15” 6,90”	7,30 7,00”	7,20 7,20
h)	Deionizovaná voda (q.s.to)	200 ml	200 ml
i)	Fosfátový pufer o pH 7,2 (q.s.to)			200 ml

* Nezostáva v konečnom produktu.

** Upravené použitím 0,1 M roztoku hydroxidu sodného.

Postup :

Fosfolipidy DMPC a DMPG sa rozpustili v trichlormetáne v banke do rotačnej odparky. Etanol sa pridal po rozpustení fosfolipidov a zmes se nechala miešať pomalým otáčaním banky premývaním dusíkom. Tento alkoholový roztok sa pri zníženom tlaku rotačné odparí do sucha. Po úplnom odstránení rozpúšťadiel sa premýva dusíkom ešte 30 minút.

Mikronizovaný amfotericín B sa v príkladoch X a XI rozsuspenduje v 150 ml vody a v príklade XII v 150 ml PBS pH 7,2 miešaním a prebublávaním dusíkom. Pridaním 0,1 M hydroxidu sodného sa pH upravili na hodnoty uvedené v Tabuľke 8 pre príklady X & XI.

Suchý film lip’dov sa hydratuje v banke rotačnej odparky so suspenziou mikronizovaného amfotericínu B pripraveného podľa uvedeného opisu použitím rotačnej odparky s neustálym

- 16premývaním dusíkom. Pomocou roztoku 0,1 M hydroxidu sodného sa upravilo pH získanej lipidovej suspenzie amfotericínu B tak, ako je uvedené v Tabuľke 8. V príkladoch X a XI sa objem doplnil vodou na 180 ml, zatiaľ čo v príklade XII sa objem doplnil na 180 ml PBS pH 7,2.

V príklade XI sa obsah banky sonikoval 1 hodinu v kúpele sonikátora.

V príkladoch X & XII sa lipidová suspenzia amfotericínu B homogenizovala pomocou APV vysokotlakového homogenizačného mlyna až šlo produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10‘³ mm (2 μ).

Chlorid sodný sa v príklade X rozpustil vo vode a zriedil vodou na objem 20 ml.

V príklade XII sa chlorid sodný rozpustil v PBS pH 7,2 a zriedil PBS pH 7,2 na 20 ml. Tento roztok chloridu sodného sa pridal k homogenizovanej lipidovej suspenzii pri pomalom miešaní a pri premývaní dusíkom. Tento produkt sa preniesol späť do homogenizátora a podrobil sa znova cyklu po dobu 5 minút bez použitia tlaku.

V príklade XI sa lipidová suspenzia amfotericínu B po sonikácii (vystavení ultrazvuku) ponecháva prejsť trikrát homogenizáciou pri zvýšenom tlaku v APV vysokotlakovom homogenizátore. Chlorid sodný sa rozpustil vo vode a vodou zriedil na 20 ml. Tento roztok chloridu sodného sa pri pomalom miešaním pridal k lipidovej suspenzii amfotericínu B získanej po troch homogenizačných cykloch. Tento produkt sa preniesol späť do homogenizátora a podrobil sa znova cyklu po dobu 5 minút bez zvýšenia tlaku. Potom sa znovu homogenizoval pri zvýšenom tlaku až šlo produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10' ³ mm (2μ).

Produkt sa potom filtroval cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10' mm (2μ). Prefiltrovaný produkt sa naplnil do sklenených nádob v dusíkovej atmosfére, nádoby sa uzavreli a autoklavovali 40 minút pri 110°C pomocou cyklu rýchleho zahriatia a rýchleho ochladenia.

SKUPINA D : Príklady XIII až XIV

Zložky použité v týchto príkladoch sú uvedené v tabuľke 9 a postup je uvedený ďalej.

Tabuľka 9

		Príklad XIII	Príklad XIV
a)	Amfotericín B (mikronizovaný)	1,00 g	—
b)	Amfotericín B (ne-mikronizovaný)	—	1,00 g
c)	DMPC	0,68 g	0,68 g
d)	DMPG	0,30 g	0,30 g

e)	Etanol’	200 ml	200 ml
0	Trichlormetán’	10 ml	10 ml
g)	Deionizovaná voda (q.s.to)	200 ml	200 ml
h)	pH - pri dispergovaní pred homogenizáciou	7,25” 7,15**	7,20 7,10”

* Nezostáva v konečnom produktu.

** Upravené použitím 0,1 M roztoku hydroxidu sodného.

Postup :

Fosfolipidy DMPC a DMPG sa rozpustili v trichlormetáne v banke do rotačnej odparky. Etanol sa pridal po úplnom rozpustení fosfolipidov a zmes se nechala miešať pomalým otáčaním banky premývaním dusíkom. Tento alkoholový roztok sa pri zníženom tlaku rotačné odparil do sucha. Po úplnom odstránení rozpúšťadiel sa premýval dusíkom ešte 30 minút.

V príklade XIII sa mikronizovaný amfotericín B rozsuspenduje vo vode miešaním a prebublávaním dusíkom. V príklade XIV sa ne-mikronizovaný amfotericín B suspenduje vo vode miešaním a prebublávaním dusíkom. V tabuľke 9 je uvedené pH upravené pridaním 0,1 M hydroxidu sodného.

Suchý film lipidov sa hydratuje v banke do rotačnej odparky so suspenziou amfotericínu B pripravenou podľa uvedeného opisu použitím rotačného odparovača s neustálym premývaním dusíkom. V tabuľke 9 je uvedené pH upravené pridaním 0,1 M hydroxidu sodného. V príklade XIV sa obsah banky sonikoval 1 hodinu. Objem sa doplnil vodou na 200 ml.

Lipidová suspenzia amfotericínu B sa homogenizovala pomocou APV vysokotlakového homogenizačného mlyna až šlo homogenizovaný produkt filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2 μ).

Homogenizovaná lipidová suspenzia amfotericínu B sa filtrovala cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2 μ). Prefiltrovaný produkt sa naplnil do sklenených nádob pod dusíkom, nádoby uzavreli a autoklavovali. Autoklávovanie prebehlo 20 minút pri 121 °C.

- 18 Stanovenie toxicity u myší:

Stanovenie toxicity vodnej kompozície amfotericínu B (bez chloridu sodného) získanej v príkladoch XIII a XIV sa uskutočňovalo na myšiach spolu s vodnou kompozíciou amfotericínu

B, ktorá obsahuje chlorid sodný, podľa príkladu III. Výsledky sú nasledujúce.

Tabuľka 10

Stanovenie akútnej toxicity u myší

LD50 (intravenózne) Amfotericín B vodná kompozícia (s	> 80 mg/kg telesnej hmotnosti
chloridom sodným) podľa príkladu III Amfotericín B vodná kompozícia (bez
chloridu sodného) podľa príkladov XIII & XIV	40 mg/kg telesnejhmotnosti

Hodnota LD50 vodnej kompozície amfotericínu B pripravenej bez chloridu sodného podľa príkladov XIII a XIV po podaní jednotlivej injekcie bola u myší 40 mg/kg telesnej hmotnosti v porovnaní s hodnotou >80 mg/kg pre vodnú kompozíciu amfotericínu B pripravenou s chloridom sodným podľa príkladu III. Toto dokazuje nevyhnutnosť chloridu sodného na vytvorenie vodnej kompozície amfotericínu B s nízkou toxicitou.

Výhody vynálezu:

Výhod\ vy nálezu sú nasledujúce:

i) Podľa vynálezu sa vodná kompozícia amfotericínu B pripravila bez použitia DMSO, v ktorej sa preukázala hepatotoxicita.

ii) V dôsledku nízkej rozpustnosti amfotericínu B v organických rozpúšťadlách prijateľných na parenterálne podanie (0,1 mg/ml v metanole) je potreba veľkých objemov organických rozpúšťadiel, z čoho pramení zdĺhavý a namáhavý proces výroby a zlé komerčné využitie. Spôsob podľa vynálezu nevyžaduje na rozpustenie amfotericínu B žiadne organické rozpúšťadlá.

iii) Postupy doterajších technológií vyžadujú špeciálne spôsoby filtrácie, ako je tangenciálna prietoková filtrácia alebo pretlačovanie. V spôsob? podľa vynálezu sa použili bežné filtračné postupy.

iv) Produkt pripravený spôsobom podľa vynálezu je stabilný pri sterilizácii autoklávovaním, a preto je vhodný na intravenózne použitie.

- 19Spôsob podľa vynálezu je jednoduchý a účinný a predstavuje zdokonalenie doterajšieho stavu techniky. Najdôležitejšími rysmi spôsobu podľa vynálezu je väčšia čistota získaného produktu bez rizika zostatku stôp škodlivých rozpúšťadiel, pretože tieto rozpúšťadlá nie sú v spôsobe výroby vôbec použité.

Claims

1. Spôsob prípravy vodnej kompozície s nízkou toxicitou na parenterálne podanie bez dimetysulfoxidu obsahujúcej amfotericín B, chlorid sodný a fosfolipidy, vyznačujúci sa tým, že

i) sa rozpustil jeden alebo viac fosfolipidov v jednom alebo viac parenterálne prijateľných organických rozpúšťadlách, na čo sa rozpúšťadlá odstránia odparením pri zníženom tlaku vznikom suchého filmu jedného alebo zmiešaných fosfolipidov;

ii) sa rozsuspenduje amfotericín B vo vodnej fáze prijateľnej na parenterálne podanie, ktorá neobsahuje chlorid sodný alebo sa rozsuspenduje mikronizovaný amfotericín B vo vodnej fáze prijateľnej na parenterálne podanie, ktorá môže obsahovať chlorid sodný;

iii) na čo sa pridá vodná fáza, ktorá je výsledkom kroku (ii), obsahujúca rozsuspendovaný amfotericín B k filmu fosfolipidov, ktorý je výsledkom kroku (i), súčasným miešaním vznikne suspenzia amfotericínu B s fosfolipidmi vo vodnej fáze;

iv) potom sa upraví pH suspenzie, ktorá je výsledkom kroku (iii), na 6,0 až 8,0 a následne sa homogenizuje až možno suspenziu filtrovať cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10'³ mm (2μ);

v) na čo sa pridá dostatočné množstvo roztoku chloridu sodného vo vode na konci kroku (iv) tak, aby obsah chloridu sodného v konečnom produktu bol aspoň 0,1 hmot./obj. %.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej homogenizovaná suspenzia, ktorá je výsledkom kroku (v), filtruje cez filter zo sklenených vlákien s veľkosťou pórov 2x10³ mm (2 μ) a filtrát sa naplní do ampuliek pod atmosférou dusíka, ampulky sa uzavrú a sterilizujú autoklávovaním, čo dá konečný produkt vhodný na parenterálne podanie.

-21

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo nároku 2, vyznačujúci sa tým, že fosfolipidy sú vybrané z vaječného fosfatidylcholínu alebo zmesi dimyristoylfosfatidylcholínu a sodnej soli dimyristoylfosfatidylglycerolu.

4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že organické rozpúšťadlo je vybrané z alkoholových rozpúšťadiel, chlórovaných uhľovodíkov a ich zmesí.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že organické rozpúšťadlo je vybrané z metanolu, etanolu, izopropylalkoholu, trichlórmetánu, tetrrachlórmetánu a dichlórmetánu.

6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že organické rozpúšťadlo je etanol.

7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsah amfotericínu B je od 0,1 hmot./obj. % až 1 hmot./obj. % kompozície.

8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že obsah amfotericínu B je 0,5 hmot./obj. % kompozície.

9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsah chloridu sodného je medzi 0,1 hmot./obj. % až 0,9 hmot./obj. % kompozície.

10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že obsah chloridu sodného je medzi 0,4 hmot./obj. % až 0,9 hmot./obj. % kompozície.

11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsah fosfolipidov je od 0,1 hmot./obj. % až 1 hmot./obj. % kompozície.

12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsah fosfolipidov je od 0,4 hmot./obj. % až 0,6 hmot./obj. % kompozície.

-22

13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že hmotnostný pomer amfotericínu B ku fosfolipidom je od 1 : 0,8 do 1 : 1,2.

14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že fosfolipidy sú dimyristoylfosfatidylcholín a dimyristoylfosfatidylglycerol, pričom ich hmotnostný pomer je od 7 : 1 do 7 : 15.

15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že hmotnostný pomer dimyristoylfosfatidylcholínu a dimyristoylfosfatidylglycerolu je 7 : 3.

16. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa použije nemikronizovaný amfotericín B a parenterálne prijateľnou vodnou fázou, ktorá sa použije v kroku (ii) podľa nároku 1, je voda alebo fosfátový pufer.

17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že sa použije mikronizovaný amfotericín B a parenterálne prijateľnou vodnou fázou, ktorá se použije v kroku (ii) podľa nároku 1, je voda alebo fosfátový pufer, soľný roztok alebo soľný, fosfátový pufer.

18. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pH vodnej fáze, ktorá sa použije na rozsuspendovanie amfotericínu B v kroku (ii) se upraví na 6,0 až 8,0.

19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sterilizácia zhomogenizovanej, sfiltrovanej suspenzie sa urobí bežným autoklávovaním.

20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že teplota sterilizácie je 110 °C.

21. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nároku v 1 až 18 a 20, vyznačujúci sa tým, že sa sterilizácia urobí špeciálnym spôsobom autoklávovania, pri ktorom je značne skrátený čas zahrievania a ochladzovania pomocou cyklu rýchleho zahriatia a ochladenia.

-23

22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15 a 17 až 21, vyznačujúci sa tým, že pokiaľ sa použije mikronizovaný amfotericín B, chlorid sodný sa pridá v ktoromkoľvek z krokov (ii) až (iv) tak, že obsah chloridu sodného v konečnom produkte je aspoň 0,1 hmot./obj. %.

23. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že konečný produkt vodnej kompozície je celkom bez akéhokoľvek chlórovaného uhľovodíka.

24. Vodná kompozícia s nízkou toxicitou na podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.

25. Vodná kompozícia s nízkou toxicitou na parenterálne podanie bez dimetysulfoxidu obsahujúca amfotericín B, chlorid sodný a fosfolipidy podľa nároku 24 vyznačujúca sa tým, že v podstate je pripravená tak, ako je opísaná v ktoromkoľvek z príkladov I až XII.

26. Spôsob prípravy vodnej kompozície s nízkou toxicitou na parenterálne podanie bez dimetysulfoxidu obsahujúcej amfotericín B, chlorid sodný a fosfolipidy podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že v podstate je pripravená tak, ako je opísaná v ktoromkoľvek z príkladov I až XII.