SI9500238A - Procedure for the production of lovastatin - Google Patents

Procedure for the production of lovastatin Download PDF

Info

Publication number
SI9500238A
SI9500238A SI9500238A SI9500238A SI9500238A SI 9500238 A SI9500238 A SI 9500238A SI 9500238 A SI9500238 A SI 9500238A SI 9500238 A SI9500238 A SI 9500238A SI 9500238 A SI9500238 A SI 9500238A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
lovastatin
medium
aspergillus terreus
diameter
aureus
Prior art date
Application number
SI9500238A
Other languages
English (en)
Inventor
Ivan Radez
Neda Benicki
Branislav Filipovic
Silvia Zupancic
Miroslav Pokorny
Jaroslav Tihi
Dusan Krasovec
Martina Zupancic
Original Assignee
Krka Tovarna Zdravil
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Krka Tovarna Zdravil filed Critical Krka Tovarna Zdravil
Priority to SI9500238A priority Critical patent/SI9500238A/sl
Priority to AU63263/96A priority patent/AU6326396A/en
Priority to EP96922367A priority patent/EP0842290B1/en
Priority to JP50753097A priority patent/JP3689429B2/ja
Priority to PCT/SI1996/000016 priority patent/WO1997005269A1/en
Priority to HR960357A priority patent/HRP960357B1/xx
Publication of SI9500238A publication Critical patent/SI9500238A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D309/28—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/30—Oxygen atoms, e.g. delta-lactones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

POSTOPEK ZA PRIDOBIVANJE LOVASTATINA
PODROČJE TEHNIKE, V KATERO SPADA IZUM
Izum se nanaša na postopek za pridobivanje lovastatina in njegovih derivatov, oziroma predvsem na postopek, ki vključuje uporabo specifičnega mikroorganizma.
Kemijska spojina lovastatin obstaja v 2 oblikah, kot tako imenovana laktonska in odgovarjajoča kislinska oblika. Kemijsko ime laktonske oblike je: 1 )2,6,7,8,8a,-heksahidro-3,8-dihidroksi-2,6-dimetil-8-(2-metil-1 -oksobutoksi)-1 naftalenheptanojska kislina-8-lakton (Spojina I) in ime kislinske oblike je: 1,2,6,7,8,8a-heksahidro-p-8-dihidroksi-2,6-dimetil-8-(2-metil-1 -oksobutoksi)-1 naftalenheptanojska kislina (Spojina II). Strukturne formule so kot sledi:
Spojina I: Strukturna formula lovastatina v obliki laktona
Spojina II: Strukturna formula lovastatina v obliki kisline
Lovastatin, kot tudi nekatere druge sorodne spojine, npr. kompaktin, simvastatin in pravastatin so poznane kot močni inhibitorji 3-hidroksi-3metilglutaril - koencim A reduktaze (HMG-CoA reduktaze), ključnega encima biosinteze holesterola (J.A. Tobert, G. Hitzenberger, W.R. Kuhovatz, I.B. Holmes, K.H. Jones, Atherosclerozis 41. 61 - 65, 1982).
In vivo, lovastatin prehaja iz oblike laktona (spojina I) v obliko odgovarjajoče kisline (spojina II), ki je aktivna oblika lovastatina. Z inhibicijo HMG-CoA reduktaze deluje kot kompetitivni inhibitor v biosintezi mevalonske kisline, ki je ena od stopenj v biosintezi holesterola (G. Zubay, Biochemistry, Addison Wesley Publishing Company 584, 1984).
Lovastatin se uporablja kot zdravilo za hiperholesterolemijo in preprečevanje ishemične srčne bolezni. Iz literature je poznano, da lovastatin v organizmu zmanjšuje koncentracijo celotnega LDL (lipoprotein nizke gostote) in VLDL (lipoprotein zelo nizke gostote) holesterola (S.M. Grundy, G.L. Vega, Journal of Lipid Research 26, 1464 - 1475, 1985).
STANJE TEHNIKE
Postopki za pripravo lovastatina so poznani v stanju tehnike.
V DE-A-30 06 216 (Sankyo) je opisana priprava učinkovine, ki je metabolit glive Monascus ruber in je imenovana kot monacolin K. Kmalu za tem so ugotovili, da sta monacolin K in lovastatin po strukturi identični spojini.
EP-B-22 478 tudi opisuje postopek za pripravo lovastatina. V tem postopku je opisana kultivacija glive vrste Aspergillus terreus, oziroma dveh sevov te glive deponiranih kot Aspergillus terreus ATCC 20541 in Aspergillus terreus ATCC 20542.
B. Buckland in ostali so objavili v Novel Microbial Products for Medicine and Agriculture, Elsevier, Amsterdam, str. 161-169, 1989, izboljšani postopek produkcije lovastatina z reizolatom Aspergillus terreus ATCC 20542. Vendar postopek priprave reizolata ni opisan.
Kot producenti lovastatina in ostalih sorodnih spojin so opisane tudi nekatere druge glive: Penicilium brevicompactum, Pythium ultimum, Hymices chrysospermus, Pacylomyces sp., Eupenicillium sp., Trichoderma longibrachiatum, T. pseudokoningii, Phoma sp., Doratomyces nart us, Gymnoascus umbrinus (A. Endo, K. Hasumi, A. Yamada, R. Shimoda, H. Takeshima, J. Antibiot. 49, 1609-10 (1986)); Aspergillus obscurus (HU-A-208 997), transformant A. oryzae/A. terreus (US-A-5,362,638), Pleurotus ostreatus, Pleurotus saca in Pleurotus sapidus (N. Gunde-Cimerman, FEMS Microbiology Letters H, 203-206 (1993)).
TEHNIČNI PROBLEM
Večina postopkov priprave lovastatina z uporabo različnih mikroorganizmov opisanih v stanju tehnike, ima določene pomankljivosti. Kot prvo, ti mikroorganizmi ne dajejo zadovoljive prinose lovastatina. Poleg tega, je med kultivacijo pogosto potrebno dohranjevanje z izbranimi viri oglika, ker ima visoka začetna koncentracija vira ogljika v gojišču negativen vpliv na produkcijo lovastatina. Nenazadnje je dohranjevanje med procesom fermentacije lahko vzrok kontaminacije fermentacijske brozge.
OPIS REŠITVE V SMISLU IZUMA
S tem izumom smo se izognili vsem zgoraj naštetim pomankljivostim. Izum se nanaša na postopek za pripravo lovastatina v laktonski obliki (spojina I) in kislinski obliki (spojina II) definiranih z naslednjima formulama:
Spojina I
Spojina II ali njunih farmacevtsko sprejemljivih soli ali alkilnih estrov pridobljenih s kultivacijo mikroorganizma vrste Aspergillus terreus var. aureus v odgovarjajočem hranljivem mediju in izolacijo dobljenih produktov.
Z uporabo Aspergillus terreus var. aureus so pridobljeni presenetljivo visoki prinosi lovastatina, tudi če je na začetku fermentacijskega procesa v mediju zelo visoka koncentracija virov ogljika. Tekom procesa zato ni potrebno dohranjevanje.
Rod Aspergillus, ki vključuje tudi vrsto Aspergillus terreus ki je uporabljena v izumu, je zelo velika in heterogena taksonomska kategorija. Dodatno se deli na podrodove, sekcije ali skupine in specifične varietete. V literaturi je poznanih več varietet glive Aspergillus terreus kot so: A.terreus var. globosus, A.terreus var. terreus, A.terreus var. aureus, A.terreus var. africanus, (B.K. Raper and D. Fenell: The genus Aspergillus, VVilliams and VVilkins Batimore, 1965) idr. V mednarodnih zbirkah mikroorganizmov obstajajo t.im. tipski sevi (“type strains”) za vse naštete varietete.
Ugotovili smo, da je gliva, determinirana kot Aspergillus terreus var. aureus, zelo potenten producent lovastatina. Gliva je deponirana v Belgijski zbirki mikroorganizmov Mycotheque de TUniversite Catholique de Louvain (MUCL) pod imenom Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997.
V postopku taksonomske identifikacije mikroorganizma uporabljenega v predloženem izumu so uporabljeni tipski sevi, deponirani v zbirkah, ki delujejo v skladu z budimpeštansko konvencijo, kot tudi razpoložljiva literatura, med drugim: B.K. Raper and D. Fenell: The genus Aspergillus,
VVilliams and VVilkins Batimore, (1965), R.R.M. Paterson and P. D. Bridge: Biochemical Techniques for Filamentous Fungi, IMI Technical Handbooks, No. 1, Cab International (1994) in M.J. Carlile and S.C. Watkinson: The Fungi, Academic Press, (1994).
Gojenje mikroorganizma, uporabljenega v predloženem izumu, na minimalnem trdnem gojišču Czapek agar (CZA) traja 14 dni pri temperaturi 28°C. Po štirinajstih dneh so kolonije premera 5 - 7 cm, micelij je bledo rumen z intenzivno ali slabo sporulacijo. Glave konidioforov so dolge, okrogle, kompaktne, dolžine 110 - 250 pm in premera 35 - 60 pm. Konidiofori so več ali manj izkrivljeni, gladki, brezbarvni do bledo rumeni, dolžine 300 400 pm, premera 4 - 7 pm. Vezikule so hemisferične. Sterigme so v dveh vrstah: primarne dolžine 5,5 - 7 pm, premera 1 - 2 pm in sekundarne dolžine 5 - 7 pm, premera 1,5-2 pm. Konidije so okrogle do blago eliptične, gladke, premera 1,9 - 2,4 pm. Pri gojenju na različnih substratih, prihaja do sproščanja pigmenta v gojišče. Dobljeni pigment je rumene do zeleno-rjave barve.
V fazi taksonomske identifikacije smo ugotovili, da sodi gliva v razred Ascomycetes - višje glive, družina Eurotiaceae, rod Eurotium, oziroma konidijsko obliko Aspergillus, vrsto Aspergillus terreus var. aureus.
Glede na to, da je kot producent lovastatina najpogosteje navajan sev Aspergillus terreus ATCC 20542, smo naš sev, poleg že opisane identifikacije, dodatno primerjali s tem mikroorganizmom. Rezultati obsežne primerjalne analize, ki temelji na morfološki analizi, fiziologiji rasti na različnih gojiščih, analizi pigmentov, nedvomno potrjujejo, da je naš sev, producent lovastatina Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 bistveno drugačen od seva Aspergillus terreus ATCC 20542. Vsi primerjalni poskusi gojenja obeh sevov na trdnih gojiščih so potekali pri temperaturi 30°C, 10 do 12 dni v temi.
Pregled rezultatov primerjave je podan v tabeli 1 in tabeli 2.
TABELA 1
Makromorfološka primerjava sevov Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 in Aspergillus terreus ATCC 20542, producentov lovastatina na različnih sintetskih, trdnih gojiščih z različnimi viri ogljika.
Medij Aspergillus terreus Aspergillus terreus
vir ogljika var. aureus MUCL 38997 ATCC 20542
(izum) (stanje tehnike)
Ksiloza Kolonija pravilne oblike, Kolonija pravilne oblike,
premera 9,5 cm, z rumenimi premera 8 cm, svetlo
madeži po celi površini. rjave barve z belim robom.
Aeralni micelij vataste Aeralni micelij prahaste
strukture bele do bledo strukture, topni pigment
rumene barve. Submerzni micelij dobro razvit, topnega pigmenta ni. rumen.
Saharoza Kolonija več ali manj Kolonija nepravilne oblike, z utori
pravilne oblike, premera premera 6 cm, s 4 območji:
8 cm, svetle oker barve. 1) notranje - bledo rumene barve
Aeralni micelij vataste 2) belo, vatasto
strukture, bledo rumene barve; 3) svetlo rjavo z radialnimi
substratni micelij srednje gubami
razvit; topnega pigmenta ni. 4) zunanji rob blede oker barve. Topni pigment rumeno-rjave barve
Medij vir ogljika Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 Aspergillus terreus ATCC 20542
Ramnoza Kolonija pravilne oblike, premera 9 cm, močne rumeno oker barve. Topni pigment rumen. Kolonija blago nepravilne oblike, premera 5 cm, z 2 območjema: 1) notranje - premera 3 cm, rjave barve 2) zunanje oker barve. Topnega pigmenta ni.
Riboza Kolonija pravilne oblike, premera 9 cm, bledo rumene barve, z intermedialnim obročem rumene barve. Topnega pigmenta ni. Kolonija pravilne oblike, premera 8 cm z 2 območjema: 1) notranje oker barve premera 3 cm, z gubami 2) zunanje bledorumene barve z belim robom Topnega pigmenta ni.
Maltoza Kolonija pravilne oblike, premera 9 cm, z 2 območjema: 1) notranje gladko, premera 7 cm, svetlo oker barve z rumenim središčem 2) zunanje vatasto, svetlo oker barve. Topnega pigmenta ni. Kolonija nepravilne oblike, premera 7 - 8 cm, oker barve, 4 območja 1) srednje - premer 3 cm, belkaste barve 2) premer 0,5 cm, vataste strukture, svetlo oker barve 3) premer 1,5 cm, rjave barve,
Medij vir ogljika Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 Aspergillus terreus ATCC 20542
žametne strukture 4) zunanji rob svetlo oker barve Topnega pigmenta ni.
Fruktoza Kolonija pravilne oblike, premera 9 cm, rumeno bele barve. Topnega pigmenta ni. Kolonija več ali manj pravilne oblike, premera 8 cm, 3 območja: 1) notranji premer 5 cm, svetlo oker barve, nagubana struktura 2) premer 1 cm, svetlo rjave barve, žametna struktura 3) zunanji rob svetlo oker barve. Topni pigment rumen.
Arabinoza Kolonija pravilne oblike, svetlo oker barve, premera 10 cm. Topni pigment oranžno - rumen. Kolonija pravilne oblike, premera 10 cm, oker barve. Topni pigment rjav.
TABELA 2
Makromorfološka primerjava sevov Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 in Aspergillus terreus ATCC 20542, producentov lovastatina, vzgojenih na različnih sintetičnih, trdnih gojiščih z različnimi viri dušika.
Medij Aspergillus tereus Aspergillus terreus
vir dušika var. aureus MUCL 38997 (izum) ATCC 20542 (stanje tehnike)
Glicerol Kolonija pravilne oblike, Kolonija nepravilne oblike,
in alanin premera 9 cm, svetle oker barve. Zunanji rob premera 1 cm, oker barve. Topni pigment rumen. premera 8 cm. Osrednje območje premera 3 cm, svetle oker barve, ostali del kolonije temne oker barve. Topni pigment rjav.
Glicerol Kolonija pravilne oblike, Kolonija nepravilne oblike,
in premera 9 cm, bele barve. premera 8 cm, jasno
-L-izoleucin Topnega pigmenta ni. izražena 3 območja: 1) osrednje premera 4 cm, svetle bež barve z belimi madeži 2) premer 1 cm, oker barve 3) zunanji rob premera 1 cm, svetle oker barve. Topni pigment rjav.
Kot je razvidno iz rezultatov gojenja (Tabela 1 in 2), se seva razlikujeta v obarvanosti kolonij in prodiranju nastalega pigmenta v gojišče.
Pri večini substratov je aeralni micelij glive Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 bele do svetlo rumene barve, substratni micelij pa je bledo rjav. Intenzivno rumeni pigment pa je opazen, če kot vir ogljika uporabimo arabinozo ali ramnozo. Pri istih pogojih je obarvanost mikroorganizma Aspergillus tereus ATCC 20542 rjasto rjava. Pri spremljanju velikosti kolonij v odvisnosti od izvora ogljika, je pri večini testiranih virov ogljika (ksiloza, saharoza, maltoza, ramnoza, riboza, fruktoza, arabinoza) velikost kolonij glive Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 premera 9 cm. Pri sevu Aspergillus terreus ATCC 20542 so pri istih pogojih gojenja kolonije v večini primerov premera 5 do 8 cm.
Uporaba natrijevega citrata kot vira ogljika zavira rast seva Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997. Nasproten vpliv natrijevega citrata je pri sevu Aspergillus terreus ATCC 20542, kjer stimulira rast in po 12 dneh gojenja zrastejo kolonije v več ali manj nepravilne oblike, rjave barve, žametne strukture.
Stimulativen vpliv na rast kolonij Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 je opažen pri uporabi različnih virov dušika in sicer: asparagin, glutaminska kislina, valin, leucin, L-izoleucin, arginin, alanin, tirozin, NH4CI, kalcijev nitrat Kolonije so pravilne oblike, z dobro razvitim aeralnim in substratnim micelijem. V primeru Aspergillus terreus ATCC 20542, ob uporabi asparagina in tirozina kot vira dušika, prihaja do zaviranja rasti.
Nadalje, pri mikroorganizmu Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 z mikroskopiranjem ni opaziti tako imenovanih “hulla” celic, kar je tipično za varietet aureus. Obenem so “hulla” celice prisotne v primeru Aspergillus terreus ATCC 20542.
Iz navedenih rezultatov je razvidno, da sta MUCL 38997, uporabljen v izumu, in ATCC 20542 popolnoma različna mikroorganizma.
Mikroorganizem, ki je predmet tega izuma, gojimo v vodnem mediju, kot v primeru pridobivanja drugih fermentacijskih produktov. Biosinteza poteka v gojišču, ki vsebuje razgradljive vire ogljika in dušika ter mineralne snovi. Običajno je to submerzen proces, pod aerobnimi pogoji gojenja, pri katerih je rast mikroorganizma intenzivna. Posebno je potrebno poudariti, da izbrani mikroorganizem prenaša zelo visoke začetne koncentracije ogljika v produkcijskem mediju, s čimer se izognemo potrebnemu dohranjevanju med fermentacijo (fed-batch). Začetne koncentracije virov ogljika v produkcijskem mediju so običajno > 6%, prednostno > 9 %, boljše >11 % in najboljše pri > 15 % (utežni).
Primeri sprejemljivih sestavin hranljivega medija so opisani npr. v patentu EP-B-22 478. Prednostni viri ogljika so laktoza, glukoza, saharoza, sladna moka in prednostni viri dušika kot so: kazein-pepton, namakalna tekočina (CSL-corn steep liquor), soja-protein, kvasni ekstrakt in pivski kvas.
Od mineralnih snovi je zaželjena prisotnost MgCI2, K2HPO4, NaH2PO4, MnSO4, (NH4)2HPO4. Hranilno gojišče lahko vsebuje tudi druge potrebne komponente, kot je antipenilec.
Biosinteza poteka običajno v temperaturnem območju od 20 do 33°C, prednostno pri 28°C. pH medija vzdržujemo v območju 6,0 do 8,0, prednostno 5,8 do 6,8. Fermentacija običajno traja 6 dni. Med procesom biosinteze z opisanim postopkom nastaja lovastatin predvsem v kislinski obliki, medtem ko je koncentracija laktona v fermentacijski brozgi ves čas fermentacije bistveno nižja. Lovastatin izoliramo po že znanih metodah. Tipična izolacija obsega ekstrakcijo z organskimi topili, laktonizacijo in kristalizacijo. Dobljeno substanco analiziramo in okarakteriziramo z ustreznimi analiznimi tehnikami kot so: IR-spektroskopija, masna spektroskopija, NMR in UV spektroskopija.
Kislinsko obliko lovastatina (spojina II) laktoniziramo v odgovarajočo laktonsko obliko (spojina I) po znanih metodah kot so opisane npr. v EP-A351 918, EP-B-22 478 ali WO-94/29292. Izolirani lovastatin lahko pretvorimo v farmacevtsko sprejemljive soli ali alkilne estre po znanih metodah, kot so opisane v patentu EP-B-22 478.
Ugotovljeno je, da je po postopku, ki je opisan v izumu, pridobljena višja produkcija lovastatina v primerjavi s postopki opisanimi v stanju tehnike. Tudi ko so začetne koncentracije virov ogljika zelo visoke, mikroorganizem, opisan v tem izumu, kaže višjo produktivnost. S tem izvedbo samega postopka poenostavimo, saj le-ta tudi v industrijskem merilu lahko poteka brez dohranjevanja med fermentacijo. Hkrati se tako izognemo povečani nevarnosti kontaminacije procesa.
Prednost izuma pojasnjujemo z naslednjimi izvedbenimi primeri, ki pa ga ne omejujejo.
PRIMERI
Primer 1 - splošni postopek
Uporabljena je gliva Aspergillus terreus var. aureus, ki je deponirana pod št. MUCL 38997 v obliki žive kulture na poševnem agarju (krompirjev dekstrozni agar - PDA). Dobro sporulirano kulturo vzgojeno na PDA agarju uporabimo za pripravo suspenzije spor, s katero nacepimo vegetativno fazo. Gojišče za vegetativno fazo vsebuje namakalno tekočino (corn steep liquor-CSL), sladno moko, kazein pepton, pivski kvas, (ΝΗ4)2ΗΡΟ4, antipenilec in pitno vodo. pH gojišča je 6,4. Pred inokulacijo s suspenzijo spor steriliziramo gojišče 20 minut pri 121°C, nato ohladimo na 25 do 35°C, prednostno na 28°C.
Razvoj predfermentorske (vegetativne) faze traja 20 do 35 ur pri temperaturi 28°C in ustreznem pretoku zraka in mešanju.
Dobro razviti inokulum (1 - 2 vol. %) sterilno prenesemo v produkcijsko gojišče. Produkcijsko gojišče je sestavljeno iz virov ogljika in kompleksnih virov dušika ter mineralnih snovi (MgCI2, Κ2ΗΡΟ4, NaH2PO4, MnSO4) in vode. Pogoji gojenja so: temperatura 28°C, pretok zraka, število obratov pa je odvisno od koncentracije raztopljenega kisika. Med procesom vzdržujemo pH v območju 5,8 - 6,8. Za korekcijo pH uporabljamo 30 % H2SO4 in 10 % NaOH.
Koncentracijo lovastatina v fermentacijski brozgi spremljamo med procesom biosinteze s HPLC metodo. Vzorec fermentacijske brozge zakisamo na pH 4 z 10 % HCI, ekstrahiramo z metanolom, homogeniziramo 5 minut na homogenizatorju Ultra Turax T25 (Janke und Kunkel, IKA Labortechnik), odfiltriramo in filtrat uporabimo za HPLC analizo (aparat Pharmacia LKB sistem), kolona: Chrompack Chromspher C 18, 5 pm, temperatura 45°C; mobilna faza: acetonitril in 0,1% vodna raztopina fosforne kisline (vol. razmerje 48:52); UV detekcija.
Med procesom biosinteze z opisanim postopkom se tvori predvsem kislinska oblika lovastatina, medtem ko je koncentracija laktona v fermentacijski brozgi ves čas fermentacije bistveno nižja.
Proces biosinteze traja okoli 6 dni in po končani fermentaciji izoliramo lovastatin po postopku opisanem v WO 94/29292. Izolirani lovastatin identificiramo z IR-spektrometrijo, masno spektrometrijo, NMR, UV spektroskopijo in drugimi metodami.
Primer 2
Suspenzijo spor pripravimo v 0,1 vol. % raztopini Tween 80. V ta namen postrgamo 10 - 14 dni star micelij glive Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 vzgojen na krompirjevem dekstroznem agarju (PDA-agar). Z 200 ml prefiltrirane suspenzije spor inokuliramo 30 I vegetativnega gojišča naslednje sestave:
Sestava vegetativnega gojišča:
CSL 5,0 g sladna moka 15,0 g kazein pepton 5,0 g kvas pivski 1,2 g (NH4)2HPO4 teh. 0,015 g pitna voda do 1000 ml pH podloge pred sterilizacijo korigiramo na pH 6,4. Sterilizacija traja 20 minut pri 121°C. Razvoj vegetativne faze traja ob mešanju in prezračevanju 20 - 35 ur, pri temperaturi 28°C.
Razvit vegetativni inokulum v količini 1 vol. % sterilno prenesemo v fermentacijsko gojišče (100 I), včasih imenovano tudi produkcijsko gojišče, naslednje sestave:
Sestava fermentacijskega gojišča:
laktoza g
vir organskega dušika 13,8 g
CSL 1,95 g
MgCI2-6 H2O 1,0 g
NaH2PO4 1,2 g
K2HPO4 0,5 g
MnSO4H2O 0,02 g
antipenilec 0,5 g
pitna voda do 1000
ml pH produkcijskega medija pred sterilizacijo korigiramo na vrednost 6,4. Sterilizacija traja 20 minut pri 121°C. Proces biosinteze poteka 6 dni pri 28°C, med mešanjem in prezračevanjem. Produkcijo aktivne komponente (lovastatin) spremljamo s HPLC metodo. Po končani fermentaciji, pridobljeni lovastatin izoliramo kot je opisano v primeru 1. Koncentracija lovastatina ob koncu fermentacije je nad 500 pg/ml v obliki kisline.
Primer 3
Ponovimo postopek opisan v primeru 2 do stopnje zaključka rasti vegetativne faze.
Z 2 vol. % tako dobljene vegetativne brozge inokuliramo 100 I fermentacijskega gojišča naslednje sestave:
Sestava fermentaciiskega gojišča:
laktoza vir organskega dušika CSL
MgCI2-6 H2O
NaH2PO4
K2HPO4
MnSO4H2O antipenilec pitna voda g 22,15 g 2,93 g 1,0 g 1,2 g 0,5 g 0,02 g 0,5 g do 1000 ml pH gojišča korigiramo pred sterilizacijo na vrednost 6,4. Sterilizacija traja 20 minut pri 121°C.
Glivo gojimo na temperaturi 28°C, ob mešanju in prezračevanju. Fermentacija je končana v 6-ih dneh. Po končani fermentaciji, pridobljeni lovastatin izoliramo kot je opisano v primeru 1. Koncentracija lovastatina ob koncu fermentacije je nad 700 pg/ml v obliki kisline.
Primer 4
Ponovimo postopek opisan v primeru 2 do stopnje zaključka rasti vegetativne faze.
Z 2 vol. % tako dobljene vegetativne brozge inokuliramo 100 I fermentacijskega gojišča naslednje sestave:
Sestava fermentacijskega gojišča:
laktoza vir organskega dušika CSL
MgCI2-6 H2O
NaH2PO4
K2HPO4
MnSO4-H2O antipenilec pitna voda
117 g 28,8 g 3,81 g
1,0 g 1,2 g 0,5 g 0,02 g 0,5 g do 1000 ml pH gojišča korigiramo pred sterilizacijo na vrednost 6,4. Sterilizacija traja 20 minut pri 121°C.
Glivo gojimo na temperaturi 28°C, ob mešanju in prezračevanju. Fermentacija je končana v 6-ih dneh. Po končani fermentaciji, pridobljeni lovastatin izoliramo, kot je opisano v primeru 1. Koncentracija lovastatina ob koncu fermentacije je nad 1000 gg/ml v obliki kisline.
Primer 5
Ponovimo postopek opisan v primeru 2 do stopnje zaključka rasti vegetativne faze.
Z 2 vol. % tako dobljene vegetativne brozge inokuliramo 100 I fermentacijskega gojišča naslednje sestave:
Sestava fermentaciiskega gojišča:
laktoza 150 g
vir organskega dušika 35,14 g
CSL 4,65 g
MgCI2-6 H2O 1,0 g
NaH2PO4 k2hpo4 MnSO4H2O 1,2 g 0,5 g 0,02 g
antipenilec 0,5 g
pitna voda do 1000 ml
pH podloge korigiramo na 6,4 pred sterilizacijo. Sterilizacija traja 20 min. pri 121°C.
Glivo gojimo na temperaturi 28°C, ob mešanju in prezračevanju. Fermentacija je končana v 6-ih dneh. Po končani fermentaciji, pridobljeni lovastatin izoliramo, kot je opisano v primeru 1. Koncentracija lovastatina ob koncu fermentacije je nad 1200 pg/ml v obliki kisline.
Primer 6 (primerjava)
Primerjava produktivnosti sevov Aspergilus terreus ATCC 20542 in Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997
Primerjava sevov je narejena z izbranim mikroorganizmom po postopku, ki je predmet te prijave in mikroorganizmom, ki je opisan v stanju tehnike Aspergillus terreus ATCC 20542 v laboratorijskem merilu.
Pri vseh poskusih je sestava vegetativnega gojišča enaka kot v primeru 2. Da bi ugotovili vpliv različne koncentracije virov ogljika, je bila uporabljena sestava produkcijskega medija kot je opisana v primeru 2, 3 in 4. Mediji vsebujejo 6 % (primer 2), 9 % (primer 3) in 11,7 % (primer 4) laktoze. Sterilizacija gojišča je trajala 20 minut pri 120°C. Inokulacija vegetativne faze je narejena kot je opisano v primeru 2. Razvoj vegetativne faze je potekal na stresalniku pri temperaturi 28°C in RPM 220 (ekscenter 5 cm). 2 vol. % razvitega inokuluma sterilno prenesemo v 500 ml erlenmajer steklenice z 60 ml produkcijskega medija. Biosinteza poteka 140 ur pri temperaturi 28°C, RPM= 220 (ekscenter 5 cm). Produkcija lovastatina je merjena s HPLC metodo. Pridobljeni prinosi lovastatina (gg/ml) so podani v tabeli.
6% laktoze 9% laktoze 11.7% laktoze
čas [h] 20542 38997 20542 38997 20542 38997
96 298 1228 176 1242 94 1156
140 318 1320 200 1804 126 1378
(20542 se nanaša na ATCC 20542
38997 se nanaša na MUCL 38997)
Dobljeni rezultati nazorno kažejo pri istih pogojih gojenja višjo produktivnost seva, ki je predmet te prijave, kot mikroorganizem opisan v stanju tehnike. Dodatno, uporabljeni sev producira višje koncentracije lovastatina tudi v primeru, ko so začetne koncentracije ogljika zelo visoke, medtem ko je produkcija s sevom, opisanim v stanju tehnike, inhibirana s povišanimi začetnimi koncentracijami ogljika v gojišču.
Rezultat testa nazorno kaže presenetljivo prednost mikroorganizma, ki je predmet tega izuma.
Primer 7 (primerjava)
Primerjava produktivnosti sevov Aspergilus terreus ATCC 20542 in Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997
Eksperiment je izveden v laboratorijskem merilu, po postopku opisanem v patentu EP-B-22478, primer 5.
Kot testni mikroorganizmi so uporabljeni Aspergillus terreus ATCC 20542 in Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997, ostali pogoji gojenja so enaki kot v omenjenem patentu. Prinosi lovastatina (gg/ml) so podani v tabeli.
Sestava vegetativne in produkcijske podloge je
enaka kot v primeri 5 EP-B-22 478
čas [h] sev ATCC 20542 sev MUCL 38997
120 114 184
144 172 222
168 150 214
Zgornji rezultati kažejo, da tudi v primeru teh pogojev gojenja, sev, ki je predmet izuma, potrjuje večjo produktivnost od seva opisanega v stanju tehnike. .

Claims (4)

1. Postopek za pripravo spojine I in spojine II definiranih z naslednjima formulama:
Spojina I
Spojina II ali njunih farmacevtsko sprejemljivih soli ali alkilnih estrov, označen s tem, da gojimo mikroorganizem vrste Aspergillus terreus var. aureus v hranljivem mediju in izoliramo željeni produkt.
2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da je uporabljen mikroorganizem Aspergillus terreus var. aureus deponiran v Belgijski zbirki mikroorganizmov Mycotheque de TUniversite Catholique de Louvain, s številko MUCL 38997.
3. Postopek po zahtevkih 1 in 2, o z n a č e n s t e m , da je koncentracija virov ogljika v gojišču > 6 % in prednostno > 9 % (utežni).
4. Postopek po zahtevku 3, označen s tem, da je koncentracija virov ogljika v gojišču >11 % in prednostno > 15 % (utežni).
SI9500238A 1995-07-27 1995-07-27 Procedure for the production of lovastatin SI9500238A (en)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI9500238A SI9500238A (en) 1995-07-27 1995-07-27 Procedure for the production of lovastatin
AU63263/96A AU6326396A (en) 1995-07-27 1996-07-16 Process for the preparation of lovastatin
EP96922367A EP0842290B1 (en) 1995-07-27 1996-07-16 Process for the preparation of lovastatin
JP50753097A JP3689429B2 (ja) 1995-07-27 1996-07-16 ロバスタチンの製造方法
PCT/SI1996/000016 WO1997005269A1 (en) 1995-07-27 1996-07-16 Process for the preparation of lovastatin
HR960357A HRP960357B1 (en) 1995-07-27 1996-07-25 Process for the preparation of lovastatin

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI9500238A SI9500238A (en) 1995-07-27 1995-07-27 Procedure for the production of lovastatin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9500238A true SI9500238A (en) 1997-02-28

Family

ID=20431662

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9500238A SI9500238A (en) 1995-07-27 1995-07-27 Procedure for the production of lovastatin

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0842290B1 (sl)
JP (1) JP3689429B2 (sl)
AU (1) AU6326396A (sl)
HR (1) HRP960357B1 (sl)
SI (1) SI9500238A (sl)
WO (1) WO1997005269A1 (sl)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2256211A3 (en) * 1997-02-20 2011-02-16 DSM IP Assets B.V. Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
KR100234976B1 (ko) * 1997-08-01 1999-12-15 김충환 세룰레닌 및 엘-메치오닌 유사체에 동시 내성을 갖는 아스퍼질 러스속 미생물 및 그를 이용한 메비놀린산의 제조방법
SK281320B6 (sk) * 1997-10-13 2001-02-12 Biotika, A. S. Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom
SI9800057A (sl) 1998-02-26 1999-08-31 Krka, Tovarna Zdravil, D.D. Postopek za pripravo simvastatina in njegovih derivatov
JP2001527424A (ja) * 1998-03-20 2001-12-25 ビオガル・ジョージィセルジャール・エル・テー ロバスタチンヒドロキシ酸を製造するための代謝コントロール発酵操作
HU226966B1 (en) * 1998-03-20 2010-03-29 Teva Gyogyszergyar Zartkoeruee Fermentation process
CN102621238A (zh) * 2011-02-01 2012-08-01 北京北大维信生物科技有限公司 一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法
CN114958625B (zh) * 2022-07-07 2023-12-19 福安药业集团烟台只楚药业有限公司 一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342767A (en) * 1980-01-23 1982-08-03 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products
US5250435A (en) * 1991-06-04 1993-10-05 Merck & Co., Inc. Mutant strains of Aspergillus terreus for producing 7-[1,2,6,7,8,8a(R)-hexa-hydro-2(S),6(R)-dimethyl-8(S)-hydroxy-1(S)-naphthyl]-3(R),5(R)-dihydroxyheptanoic acid (triol acid),I)
HU208997B (en) * 1992-06-17 1994-02-28 Gyogyszerkutato Intezet Microbiological method for producing mevinoline

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997005269A1 (en) 1997-02-13
EP0842290A1 (en) 1998-05-20
HRP960357B1 (en) 2004-10-31
AU6326396A (en) 1997-02-26
JP3689429B2 (ja) 2005-08-31
JP2000500642A (ja) 2000-01-25
HRP960357A2 (en) 1998-04-30
EP0842290B1 (en) 2004-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100333017B1 (ko) 폴리사이클릭구충제,이의제조방법,이의제조용균주및이를포함하는조성물
Onaka et al. Goadsporin, a chemical substance which promotes secondary metabolism and morphogenesis in Streptomycetes I. purification and characterization
Omura et al. Herquline, a New Alkaloid Produced by Penicillium Herquei Fermentation, Isolation and Properties
SI9500238A (en) Procedure for the production of lovastatin
FAUTH et al. Galbonolides A and B-two non-glycosidic antifungal macrolides
US3060104A (en) Process for obtaining new alkaloid derivatives of lysergic acids
US5641804A (en) Fungicidal compound comprising a cyclic polylactone
CN113396214B (zh) 从链霉菌属sp.mcc 0151生产尼日利亚菌素的方法
KR100186758B1 (ko) 프라바스타틴(pravastatin)전구체의제조방법
US5596015A (en) Fungicidally active compounds
DE69631425T2 (de) Prozess für die präparation von lovastatin
EP1033370B1 (en) Novel substance ft-0554 and process for producing the same
US5112858A (en) Antibiotic, aranorosin, a microbiological process for the preparation thereof, and the use thereof as a pharmaceutical
STABLER et al. Lachnumon and lachnumol A, new metabolites with nematicidal and antimicrobial activities from the ascomycete Lachnum papyraceum (Karst.) Karst. I. Producing organism, fermentation, isolation and biological activities
EP0001287A1 (en) Antibiotic No. 2-200, process for its production and pharmaceutical compositions containing Antibiotic No. 2-200
SI9300047A (en) Microbiological method for preparation of lovostatin and/or mevinoline acid
US4861796A (en) Gentisic acid derivatives having antibiotic activity
HU203582B (en) Process for producing amicin, amicin derivatives and pharmaceutical compositions containing them, and fungicide compositions containing them
ElKichaoui Strain improvement of Aspergillus niger to increase lovastatin production
US3162640A (en) Alkaloid derivatives of lysergic acids
BG108752A (bg) Ферментационен метод за получаване на компактин
US6838083B2 (en) Process for the preparation of β-keto aliphatic acid ester
SI9800144A (sl) Nov biotehnološki postopek pridobivanja 3-hidroksi-ML-236B derivatov poznanih kot M-4 in M-4'
Birnbacher et al. Isolation and biological activity of new norhirsutanes from Creolophus cirrhatus
BG64840B1 (bg) Метод за получаване на плеуромутилин

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the prs date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20050831