JP2000500642A - ロバスタチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 微生物、アスペルギルス テラウス バル．アウレウス(Aspergillus terreusvar．aureus)の使用を伴なうロバスタチンの製造方法が記載され、該方法によって通常用いた微生物か阻害される条件下でさえロバスタチンを高収量で得る。

Description

【発明の詳細な説明】 ロバスタチンの製造方法 本発明はロバスタチン(lovastatin)及びその誘導体の製造方法に関し、特に特 定の微生物の使用を伴なうその製造方法に関する。 化学物質のロバスタチンは２種類の形状で存在し、即ち言わゆるラクトン形と 対応の酸形とで存在する。ラクトン形ロバスタチンの化学名は１，２，６，７， ８，８ａ−ヘキサハイドロ−β，δ−ジヒドロキシ−２，６−ジメチル−８−（ ２−メチル−１−オキソブトキシ）−１−ナフタレン−ヘプタン酸−δ−ラクト ン（化合物Ｉ）であり、酸形のロバスタチンの化学名は１，２，６，７，８，８ ａ−ヘキサハイドロ−β，δ−ジヒドロキシ−２，６−ジメチル−８−（２−メ チル−１−オキソブトキシ）−１−ナフタレン ヘプタン酸（化合物II）である 。構造式は次の通りである： 化合物Ｉ：ラクトン形のロバスタチン 化合物II：酸形のロバスタチン ロバスタチン並びに若干の類縁物質例えばコンパクチン、シムバスタチン及び プラバスタチンは、コレステロール生合成における鍵酵素である３−ヒドロキシ −３−メチルグルタリル−補酵素Ａ レダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）の 有効な阻害剤であることが知られている〔J.A.Tobert．G.Hitzenberzer，W.R.Ku hovatz,I.B.Holmes，K.H.Jones、アテローム性動脈硬化症 41,61〜65(1982)参 照〕。ロバスタチンは生内体でラクトン形（化合物Ｉ）から対応の酸形（化合物 II）に転化される。酸形はロバスタチンの活性形であると思われる。HMG-CoA レ タクターゼを阻害することによって、ロバスタチンはコレステロール生合成にお ける工程の１つであるメバロン酸の生合成における競合阻害剤として作用するも のである（G.Zubay,生化学、Addison Wesley出版社 584頁，1984参照）。この活 性により、ロバスタチンは過コレステロール血症を処置し且つ阻血性の心臓疾患 を防上する薬剤として用いられる。ロバスタチンは総ＬＤ Ｌ（低密度のリポタンパク質）及びVLDL（超低密度リポタンパク質）コレステロ ールの濃度を低下させることは文献に報告されている〔S.M.Grundy，G.L.Vegaの 脂質研究会報(Journal of Lipid Research)26，1464〜1475(1985)参照〕。 従来技術 ロバスタチンを製造する方法は従来技術で既知である。 独国特許出願公開(DE-A)第 3006216号（サンキヨウ）においては、カビ菌モナ スカス ルーバー(Monascusruber)の代謝物として単離することによりモナコリ ンＫと呼ばれる化合物の製造方法が開示されている。後にモナコリンＫとロバス タチンとは実際上同一の物質であると見出された。 欧州特許第 22478号はまたロバスタチンの製造方法を記載している。この方法 はアスペルギルス テラウス(Aspergillus terreus)の菌特にこの菌の寄託され た２種の菌株即ちアスペルギルス テラウス ATCC 20541 及びアスペルギルス テラウス ATCC 20542 の培養物を用いることである。 アスペルギルス テラウス ATCC 20542 の再単離物を用いることによりロバス タチンの改良した製造方法が達成されることはB.Bucklandらが医薬及び農薬用の 新規な微生物生成物(Novel Microbial Products for Medicine and Agriculture )Elsevier．Amsterdam．161〜169頁1989に報告している。然しながら、再単離物 を如何に製 造しうるかについては開示していない。 培養によりロバスタチン又は類縁の化合物が得られる別のカビ菌も従来技術で 開示されており、即ちペニシリウム ブレビコンパクツム(Penicillium brevico mpac-tum)、ピチウム ウルチマム(Pythium ultimum)、ハイミセス クリソスペ ルムス(Hymices chrysospermus)、パシロミセス種(Pacylomyces sp.,)、エウペ ニシリウム種(Eupenicillium sp.,)、トリコデルマ ロンジブラチアツム(Trich oderma longibrachiatum)、Ｔ．プソイドコニンギ(pseudokoningii)、ポーマ種( Phoma sp.)、ドラトミセス ナナス(Doratomyces nanus)、ジムノアスカス ア ンブリナス(Gymnoascus umbrinus)〔A.Endo.,K.Hasumi，A.Yamada，R.Shimoda， H.Takeshima，抗生物質誌(J.Antibiotic)49．1609〜10(1986)参照〕；アスペル ギルス オブスキュフス(Aspergillus obscurus)（ハンガリー特許公開第208997 号参照）、形質転換細胞のＡ．オリザエ(oryzae)／Ａ．テラウス(terreus)（米 国特許第 5,362,638号）並びにプルロタス オストレアタス(Pleurotus ostreat us)、プルロクス サカ(Pleurotus saca)及びプルロタス サピダス(Pleurotus sapidus)〔N.Gunde-Cimerman，FEMS Microbiology Let-ters 11，203〜 206(199 3)参照〕が開示されている。 技術的課題 種々形式の微生物の使用を伴なうロバスタチンの若干の製造方法が従来技術に 記載されているとしても、これらの既知方法は幾つかの欠点がある。先ず、これ らの方 法に用いられるロバスタチン生産微生物は満足な収率のロバスタチンを与えない 。更には微生物の培養中に、特に炭素源を選択しながら培養過程中の発酵(ferme nta-tion)混合物を給送するのが必要であることが多い。何故ならば炭素源の初 期高濃度はロバスタチンの生産率に負の作用を有する傾向があるからである。最 後に、発酵（培養）過程中に給送を用いる既知方法の必要性は培養液が汚染され てしまう危険を伴なう。 発明の記載 前記の欠点は本発明の方法によって克服される。次式 化合物Ｉ 化合物II によって定義される如きラクトン形（化合物Ｉ）及び酸形（化合物II）のロバス タチン又はこれの製薬上許容しうる塩又はアルキルエステルの本発明の製造方法 は、アスペルギルス テラウス 変種(var.)アウレウス(aure-us)の微生物と共 に栄養培地を発酵即ち培養させ、しかも所望の生成物を単離することから成る。 アスペルギルス テラウス バル．アウレウスの微生物を用いることにより高 濃度の炭素源が培養過程の開始時に培地中に存在するとしても優れた収率のロバ スタチンを達成し得ることが予期せぬことには見出された。それ故培養液の望ま しくない給送は必要としない。 本発明の方法で用いたアスペルギルス テラウス微生物をも包含するアスペル ギルス属はきわめて大きな且つ多相の分類範囲である。アスペルギルス属は亜属 及び節又は群及び特定の変種にさえ分割される。文献においては、アスペルギル ス テラウス菌の若干の変種例えばアスペルギルス テラウス バル．グロボサ ス(globosus)、アスペルギルス テラウス バル．テラウス、アスペルギルス テラウス バル．アウレウス、アスペルギルス テラウス バル．アフリカヌス (africanus)が記載されている〔K.B.Raper 及びD.Fenell；アスペルギルス属(Th e genus Aspergillus，Williams & Wilkins，ボルチモア，1965参照〕。更には 国際的な微生物保存機関では言わゆる「基準株」（“type strain”）が前記の 変種に利用できる。 今般見出された処によればアスペルギルス テラウス バル．アウレウスと決 定された特異カビ菌はきわめて有利なロバスタチン生産菌である。特に好ましい アスペルギルス テラウス バル．アウレウス微生物の培養菌株は受理番号MUCL 38997としてベルギーの微生物寄託機関(Coordinated Collections)−Mycothiqu e de 1'Universite Catholique de Louvainに寄託されている。 この微生物の分類同定には、ブタペスト条約により寄託機関に寄託された基準 培養菌株並びに標準参考書籍を用い、例えばK.B.Raper & Fenell；アスペルギル ス属(The genus Aspergillus)，Williams & Wilkins，ボルチモア，1965，R.R.M .Paterson & P.D.Bridge；糸状菌の生化学技術(Biochemical Technique for Fil amentous Fungi)．IMI Technical Handbooks，No.1 Cab Inter-national 1994 及びM.J．Carlile & S.C Watkinson；菌類(The Fungi)、アカデミック出版1994 を参考書籍として用いる。 ツァペック寒天(CZA)培地上で本発明の方法で用いた微生物を培養することは2 8℃で14日間実施した。得られたコロニーは直径５〜７cmであった。菌糸体は、 強い又は不十分な胞子形成を伴ないながら淡黄色である。分生子のヘッドは長く 、球状で緻密であり、長さ 110〜250μｍ、直径35〜60μｍであった。分生胞子 は多少とも湾曲しており、平滑で無色〜淡黄色であり、長さ 300〜400μｍ、直 径４〜７μｍであった。小胞は半球形で あった。一次梗子は長さ 5.5〜７μｍ、直径１〜２μｍであり、二次梗子は長さ ５〜７μｍ、直径 1.5〜２μｍであった。分生子は球状乃至わずかに楕円形で平 滑で直径 1.9〜2.4μｍであった。種々の基質上で成長させると、黄色〜緑褐色 の 色素 を培地中に放出した。 分類同定が示す処によれば、本発明で用いた微生物はそれぞれアスコマイセテ ス(Ascomycotes)高等カビ菌の網、エウロチアセアエ(Eurotiaceae)科、エウロチ ウム(Eurotium)属、及び分生子形のアスペルギルス、アスペルギルス テラウス バル．アウレウス種に属する。アスペルギルス テラウス ATCC 20542 はロバ スタチン生産菌として従来技術で挙げられるのが最も多い菌株であるので、本発 明の方法で用いた微生物をこの従来技術の微生物と比較するのが好ましい。形態 学的分析に基づいた広範囲の比較分析の結果、種々の栄養培地での成長の生理学 及び色素分析によって確認した処によると本発明のロバスタチン生産菌アスペル ギルス テラウス バル．アウレウス MUCL 38997 は菌株アスペルギルス テラ ウス ATCC 20542 とは実質的に相違する。比較目的のために、２種のカビ菌株の 幾つかの培養実験を暗所で30℃の温度で10〜12日間実施した。 これらの実験の結果を以下の表１及び表２に与える。 前記の表１及び表２に与えた結果から明らかな通り、２種の菌株はコロニーの 着色及び培地中への色素の浸透において顕著に異なるものである。 大抵の基質において、カビ菌 アスペルギルス テラウス バル．アウレウス MUCL 38997 の気菌糸は白色乃至淡黄色であり、基中菌糸は淡褐色である。炭素 源としてアラビノース又はラムノースを用いた時濃黄色の色素が見られた。同じ 条件下で、カビ菌 アスペルギルステラウス ATCC 20542 の色はさび茶色である 。コロニーの大きさに関しては、試験した大抵の炭素源即ちキシロース、サッカ ロース、マルトース、ラムノース、リボース、フラクトース及びアラビノール中 でアスペルギルス テラウス バル．アウレウス MUCL 38997 のコロニーは直径 ９cmであると見出された。同じ生育条件下でカビ菌株アスペルギルス テラウス ATCC 20542 を培養すると、この菌株のコロニーは大抵の場合に直径がわずか５ 〜８cmであった。 炭素源としてクエン酸ナトリウムを利用するとアスペルギルス テラウス バ ル．アウレウス MUCL 38977 の生育を阻害した。反対の作用はアスペルギルス テラウス ATCC 20542 の場合に見られ、その際12日間の培養後にはこの菌株のコ ロニーは多少とも不規則な形状で且つ褐色で且つビロード様構造で生育した。 アスパラギン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、Ｌ−イソロイシン、アルギ ニン、アラニン、チロシン、 NH₄Cl及び硝酸カルシウムの如き種々の窒素源を用いることにより、アスペルギ ルス テラウス バル．アウレウス MUCL 38997 のコロニー生育に促進効果が見 出された。気菌糸及び基中菌糸を十分に発達させた適切な形状のコロニーが得ら れた。アスペルギルス テラウスATCC 20542 の場合には、アスパラギン及びチ ロシンを窒素源として用いた時には反対の効果が見出され、即ち生育は阻害され ることが見出された。 更には、鏡検法によりバル．アウレウスには典型的である言わゆる「ヒューラ 細胞」（“hulla cells”）はアスペルギルス テラウス バル．アウレウス MU CL38997 の場合には見出されなかった。これとは対照的に、「ヒューラ細胞」は アスペルギルス テラウス ATCC20542 の場合には存在した。 即ち、前記の結果が示す処によれば本法で用いた如き MUCL 38997 及び ATCC 20542 は完全に異なる微生物である。 本発明の方法で用いた微生物の培養は水性培地中で行ない例えば他の培養生成 物の製造に用いられる水性培地中で行なう。培養は同化性の炭素源及び窒素源並 びに無機塩を含有する培地中で通常行ないしかも深部状態で且つ嫌気性の条件下 に好ましくは行なう。何故ならばかゝる条件下では微生物はきわめて迅速な生長 を示すからである。初期高濃度の選択した炭素源が培地に存在するのが特に好ま しく、これによって培養過程中に炭素減を別 量で供給する必要性は生じない。それ故初期濃度の炭素源は培地の通常＞６重量 ％、好ましくは＞９重量％、より好ましくは＞11重量％、最も好ましくは＞15重 量％である。 栄養培地の適当な成分例は例えば欧州特許第 22478号に記載されている。特に 好ましい炭素源はラクトース、グルコース、サッカロース、麦芽粉末であり、特 に好ましい窒素源はカゼイン−ペプトン、コーンスティープリーカー(CSL)、大 豆タンパク質、酵母エキス及びビール酵母である。培地に含有される特に好まし い塩はMgCl₂，K₂HPO₄，NaH₂PO₄，MnSO₄，(NH₄)₂HPO₄である。培地はまた消泡剤 の如き他の望ましい成分を含有できる。 培養法は20〜33℃の範囲の温度で特に約28℃で行なうのが好ましい。培地のｐ Ｈ値は通常6.0〜8.0の範囲にあり、特に5.8〜6.8の範囲にある。培養の完了には 通常約６日間要する。ロバスタチンは主として酸の形で生産され然るに培養液中 のラクトン形の濃度は全過程中でかなり低いまゝであることが見出された。ロバ スタチンは常法によって単離される。典型的には単離は有機溶剤での抽出、ラク トン化及び晶出によって行なう。単離したロバスタチンは幾つかの分析技術例え ばＩＲ−分光分析法及び質量分光分析法、ＮＭＲ及びＵＶ分光分析法によって特 徴付けられる。 酸形のロバスタチン（化合物II）は例えば欧州特許出願公開第351918号、欧州 特許第22478号又は国際特許第 94／29292号に記載される如く常法によって対応のラクトン形（化合物Ｉ）にラ クトン化し得る。得られたロバスタチンはまた欧州特許第 22478号に記載される 如き常法により対応の製薬上許容し得る塩又はアルキルエステルに転化させ得る 。 本発明の方法は従来技術の方法と比較するとより高収率のロバスタチンが得ら れるのが更に見出された。更には、用いた炭素源が初期高濃度でさえ、本法で用 いた微生物は高度の生産率を示し、従って過程中に別量の炭素源を添加する必要 性はなく、これによって培養液が汚染される危険を回避するものである。 本法の優秀性は次の実施例によっても示され、該実施例は本発明の範囲を限定 することなく本発明を例示するものである。実施例 実施例１ 一般的方法 この実施例については、受理番号 MUCL 38997 として寄託されたカビ菌 アス ペルギルス テラウス バル．アウレウスの１試料を用いた。ジャガイモ−デキ ストロース寒天(PDA)上での培養により得られたこのカビ菌の十分胞子形成した 培養物を用いて胞子懸濁物を調製し、この胞子懸濁物を用いて栄養期の生長に用 いた培地に接種する。この培地は6.4のｐＨを有し、コーンスティープリカー(CS L)と麦芽粉末とカゼイン−ペプトンとビール酵母と(NH₄)₂HPO₂と消泡剤と飲料水 とを含有する。胞 子懸濁物を接種する前に、培地は121℃で20分間殺菌し、続いて25〜35℃、好ま しくは28℃に冷却した。 接種した予備培養物は曝気及ひ攪拌を施しながら28℃で20〜35時間生長させた 。 十分に発育させた接種材料（１〜２容量％）は次いで無菌条件下で培地に移送 する。培地は炭素源及び窒素源並びに無機塩即ちMgCl₂，K₂HPO₂，NaH₂PO₄，MnSO₄ 及び水を含有する。溶解した酸素の濃度に応じて曝気及び混合を施用しながら 培養過程を28℃で操業した。培養中はｐＨを30％ H₂SO₄又は10％NaOH溶液の使用 により5.8〜6.８に維持した。 培養中に、培養液中のロバスタチン濃度はHPLCにより測定した。この測定目的 で、培養液の１試料を10％の水性HCl でpH４に酸性化し、メタノールで抽出し、 ウルトラ ツラックス(Ultra Turax)Ｔ25ホモジナイザー(Janke und Kunkel，IK A Labortechnik,ドイツ)で５分間均質化し、濾過した。濾液はHPLC（装置；Phar macia LKB system；カラム；Chrompack Chromspher C18，５μｍ；温度＋45℃； 溶離剤；アセトニトリル及び0.1％燐酸水溶液（48：52の容量比））；ＵＶ検出 器により分析用に用いた。 主として酸形のロバスタチンが生産され、然るに全培養過程中でラクトン濃度 はかなり低いまゝであることが見出された。 培養はほゞ６日間後に完了し、国際特許第94／29292 号に記載された方法によりロバスタチンを単離した。ＩＲ−分光分析法、質量分 光分析法並びにＮＭＲ及びＵＶ分光分析法によってロバスタチンが生成されたこ とを確認した。実施例２ カビ菌 アスペルギルス テラウス バル．アウレウス MUCL 38997 の菌糸体 を10〜14日間ジャガイモ−デキストロース寒天(PDA)上で生育させた。次いで菌 糸体を掻取り、これを用いて0.1容量％のツイーン(Tween)-80の水溶液中の胞子 懸濁物を調製した。200mlの濾過した胞子懸濁物を続いて用いて、次の組成を有 する栄養生長用の培地（栄養培地）30リットルに接種した。 栄養培地の組成： ＣＳＬ 5.0ｇ 麦芽粉末 15.0ｇ カゼインペプトン 5.0ｇ ビール酵母 1.2ｇ (NH₄)₂HPO₄ 0.015ｇ 飲料水 1000mlにするに必要な量 培地のｐＨは滅菌前に6.4に調節した。滅菌は121℃で20分間行なう。栄養液を 曝気及び混合しながら28℃で20〜35時間生長させた。得られた１容量％の栄養液 を、次の組成を有し且つ時として生産培地とも呼ばれる培地(100リットル)に無 菌下に移送した。培地の組成： ラクトース 60ｇ 有機窒素源 13.8ｇ ＣＳＬ 1.95ｇ MgCl₂ ・６H₂O 1.0ｇ NaH₂PO₄ 1.2ｇ K₂HPO₄ 0.5ｇ MnSO₄ ・H₂O 0.02ｇ 消泡剤 0.5ｇ 飲料水 1000mlにするに必要な量 接種前に、生産培地のｐＨ値を 6.4に調節し、これを滅菌した。滅菌は 121℃ で20分間行なった。 培養物を曝気及び混合しながら６日間28℃で生長させた。ロバスタチンの生産 はHPLCにより監視し、培養の完了後には、生産したロバスタチンを実施例１に記 載の如く単離した。培養物の１ml当り酸形のロバスタチンが500μｇ以上の収量 で得られた。実施例３ 栄養期の生長が完了する段階まで実施例２の方法を反復した。 次いでこうして得られた培養物２容量％を用いて次の組成を有する培地 100リ ットルに接種した： 培地の組成： ラクトース 90ｇ 有機窒素源 22.15ｇ ＣＳＬ 2.93ｇ MgCl₂ ・ ６H₂O 1.0ｇ NaH₂PO₄ 1.2ｇ K₂HPO₄ 0.5ｇ MnSO₄ ・H₂O 0.02ｇ 消泡剤 0.5ｇ 飲料水 1000mlにするに必要な量 接種前に、培地のｐＨ値を 6.4に調節し、これを滅菌した。滅菌は 121℃で20 分間行なった。 培養物は曝気及び混合しながら28℃の温度で６日間生長させた。次いで生産し たロバスタチンを実施例１に記載の如く回収した。収量は１ml当り 700μｍ以上 の酸形のロバスタチンである。実施例４ 栄養期の生長が完了する段階まで実施例２の方法を反復した。 次いでこうして得られた培養液２容量％を用いて、次の組成の培地に接種した ： 培地の組成： ラクトース 117ｇ 有機窒素源 28.8ｇ ＣＳＬ 3.81ｇ MgCl₂ ・６H₂O 1.0ｇ NaH₂PO₄ 1.2ｇ K₂HPO₄ 0.5ｇ MnSO₄ ・H₂O 0.02ｇ 消泡剤 0.5ｇ 飲料水 1000mlにするに必要な量 接種前に、培地のｐＨ値を6.4に調節し、これを滅菌した。滅菌は121℃で20分 間行なった。 曝気及び混合しながら培養物を28℃の温度で６日間生長させた。次いで生産し たロバスタチンを実施例１に記載の如く回収した。酸形のロバスタチン1000μg/ ml以上であった。実施例５ 栄養期の生長が完了する段階まで実施例２の方法を反復した。 次いでこうして得られた培養液２容量％を用いて次の組成の生産培地 100リッ トルに接種した： 生産培地の組成： ラクトース 150ｇ 有機窒素源 35.14ｇ ＣＳＬ 4.65ｇ MgCl₂ ・６H₂O 1.0ｇ NaH₂PO₄ 1.2ｇ K₂HPO₄ 0.5ｇ MnSO₄ ・H₂O 0.02ｇ 消泡剤 0.5ｇ 飲料水 1000mlとなるまでの量 接種前に、生産培地のｐＨを 6.4に調節し、これを滅 菌した。滅菌は 121℃で20分間行なった。 培養物は曝気及び混合しながら28℃の温度で６日間生長させた。次いで生産し たロバスタチンを実施例１に記載の如く回収した。収量は酸形のロバスタチン12 00μg/ml以上であった。実施例６（比較例） 菌株 Ａ．テラウス ATCC 20542 とＡ．テラウス バル．アウレウス MUCL 38 997 との生産率の比較 本発明の方法で好ましくは用いた微生物と従来技術の微生物Ａ．テラウス ATC C 20542 との生産率を対比するために、次の実験を実験室規模で行なった。 全ての実験において、栄養期の生長に用いた種培地の組成は実施例２に記載し たのと同じである。種々の濃度の炭素源を測定するために、実施例２，３及び４ の生産培地をそれぞれ用いた。これらの培地は６％（実施例２）、９％（実施例 ３）及び11.7％（実施例４）のラクトースを含有する。培地の滅菌は全ての実験 で 121℃で20分間行なった。 栄養期の生長用培地への接種は実施例２に記載の如く行なった。種フラスコは 222rpmの振とう器（５cmの行程）で28℃で培養した。続いて得られた培養液２容 量％はそれぞれの生産培地60mlを含有する 500mlのエルレンマイヤーフラスコに 無菌下に移送した。次いで接種されたフラスコを 140時間28℃（rpm=220,５cmの 行程）で培養した。ロバスタチンの生産はHPLCにより制御した。ロバス タチンのそれぞれの収量（μg/ml）を以下の表に示す。 前記の表に示した結果から、本発明の方法で用いた菌株は従来技術の試験菌株 よりもずっと高い生産率を示すことが明らかとなる。更には、本法で用いた菌株 は炭素源のきわめて高い初期濃度でさえ高収量のロバスタチンを生産し得るが、 然るに従来技術の菌株の生産率はかゝる高い炭素源濃度では抑制される。 それ故、これらの試験結果は本発明の方法で用いた微生物の驚くべき優秀性を 示している。実施例７（比較例） 菌株 Ａ．テラウス ATCC 20542 とＡ．テラウス バル．アウレウス MUCL 38 997 との生産率の比較 実験は欧州特許第 22478号、実施例５に記載された方法により実験室規模で行 なった。 菌株としてＡ．テラウス ATCC 20542 及びＡ．テラウス バル．アウレウス M UCL 38997 を用いた以外は前記欧州特許に記載した方法を反復した。これら２種 の菌株についてのロバスタチン生産率（μg/ml）を以下の表に示す。 前記のデータは、これらの条件下でも、本発明の方法で用いた菌株が従来技術 の菌株よりもずっと高い生産率を有することが判明することをまた示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フイリポビック，ブラニスラブ スロヴエニア共和国 8000 ノボ メス ト，セイドロヴア 30 (72)発明者 ズパンシック，シルヴィア クロアチア共和国 11430 サモボル，ミ ラナ ランガ 23 (72)発明者 ポコルニイ，ミロスラブ スロヴエニア共和国 8000 ノボ メス ト，カンカリエヴア 11 (72)発明者 テイヒイ，ヤロスラブ スロヴエニア共和国 8000 ノボ メス ト，カンデイスカ 47 (72)発明者 クラソヴエック，デュサン スロヴエニア共和国 8232 セントルペル ト，セントルペルト 82 (72)発明者 ズパンシック，マルチナ スロヴエニア共和国 8270 クルスコ，プ レセルノヴア 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．栄養培地で菌株アスペルギルス テラウス バル．アウレウス(Aspergill us terreus var．aureus)の微生物を培養し、所望の生成物を採取することから なる、次式： 化合物Ｉ 化合物II により定義される化合物Ｉ及び化合物II又はこれの製薬上許容し得る塩又はアル キルエステルの製造方法。 ２．受理番号 MUCL 38997 としてベルギーの微生物寄託機関(Belgian Coordin ated Collections of Micro- organisms)-Mycothique de 1'Universite Catholiquede Louvainに寄託された微 生物を用いる、請求項１記載の方法。 ３．＞６重量％、特に＞９重量％の炭素源を含有する栄養培地を用いる請求の 範囲１又は２記載の方法。 ４．＞11重量％、特に＞15重量％の炭素源を含有する栄養培地を用いる請求の 範囲３記載の方法。