DE69631425T2

DE69631425T2 - Prozess für die präparation von lovastatin

Info

Publication number: DE69631425T2
Application number: DE69631425T
Authority: DE
Inventors: Ivan Radez; Neda Benicki; Branislav Filipovic; Silvia Zupancic; Miroslav Pokorny; Jaroslav Tihi; Dusan Krasovec; Martina Zupancic
Original assignee: KRKA Tovarna Zdravil dd
Current assignee: KRKA dd
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1996-07-16
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2016-07-17
Also published as: DE69631425D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Lovastatin und Derivaten von Lovastatin, und insbesondere auf ein Verfahren, an dem die Verwendung eines bestimmten Mikroorganismus beteiligt ist.
Die chemische Substanz Lovastatin existiert in zwei Formen, nämlich der sogenannten Lakton-Form und der entsprechenden Säure-Form. Der chemische Name der Lakton-Form ist 1,2,6,7,8,8a-Hexahydro-β,δ-dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(2-methyl-1-oxobutoxy)-1-naphthalen-heptansäure δ-lakton (Verbindung I) und der Name der Säure-Form ist 1,2,6,7,8,8a-Hexahydro-β,δ-dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(2-methyl-1-oxobutoxy)-1-naphthalen-heptansäure (Verbindung II). Die Strukturformeln sind wie folgt:
Verbindung I: Lovastatin in der Lakton-Form
Verbindung II: Lovastatin in der Säure-Form
Es ist bekannt, dass Lovastatin und auch einige verwandte Substanzen, z. B. Compactin, Simvastatin und Pravastatin, effektive Inhibitoren der 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym A-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) sind, welches das Schlüsselenzym in der Cholesterolbiosynthese ist (siehe J. A. Tobert, G. Hitzenberger, W. R. Kuhovatz, I. B. Holmes, K. H. Jones, Atherosclerozis 41, 61–65(1982)). Lovastatin wird in vivo aus der Lakton-Form (Verbindung I) in die entsprechende Säure-Form (Verbindung II) umgewandelt. Man vermutet, dass die letztere die aktive Form von Lovastatin ist. Durch die Inhibition der HMG-CoA-Reduktase wirkt es als kompetitiver Inhibitor in der Biosynthese von Mevalonsäure, was einer der Schritte in der Cholesterolbiosynthese ist (siehe G. Zubay, Biochemistry, Addison Wesley Publishing Company, Seite 584, 1984). Wegen dieser Aktivität wird Lovastatin als Wirkstoff benutzt, um Hypercholesterinämie zu behandeln und ischämische Herzkrankheit zu verhindern. Es wurde in der Literatur berichtet, dass Lovastatin die Konzentration an Gesamt-LDL (Low Density Lipoprotein, Lipoprotein geringer Dichte) und VLDL (Very Low Density Lipoprotein, Lipoprotein sehr geringer Dichte)-Cholesterol verringert (siehe S. M. Grundy, G. L. Vega, Journal of Lipid Research 26, 1464–1475(1985)).
STAND DER TECHNIK
Verfahren für das Herstellen von Lovastatin sind im Stand der Technik bekannt.
In DE-A-30 06 216 (Sankyo) wird die Herstellung einer Verbindung, die Monacolin K genannt wird, offenbart, indem es als Stoffwechselprodukt des Pilzes Monascus ruber isoliert wird. Später wurde herausgefunden, dass Monacolin K und Lovastatin tatsächliche identische Substanzen sind.
EP-B-22 478 beschreibt auch ein Verfahren zum Herstellen von Lovastatin. Dieses verfahren nutzt die Kultivierung eines Pilzes der Spezies Aspergillus terreus, insbesondere von zwei hinterlegten Stämmen dieses Pilzes, nämlich Aspergillus terreus ATCC 20541 und Aspergillus terreus ATCC 20542.
B. Buckland et al. berichteten in Novel Microbial Products for Medicine and Agriculture, Elsevier, Amsterdam, Seiten 161–169, 1989, dass durch die Benutzung eines Reisolats von Aspergillus terreus ATCC 20542 ein verbessertes Verfahren zur Produktion von Lovastatin erreicht wird. Es wird jedoch nicht offenbart, wie das Reisolat hergestellt werden kann.
Andere Pilze, die bei ihrer Kultivierung auch zu Lovastatin oder verwandten Verbindungen führen können, sind auch in der Technik offenbart, nämlich Penicillium brevicompactum, Pythium ultimum, Hymices chrysospermus, Pacylomyces sp., Eupenicillium sp., Trichoderma longibrachiatum, T. pseudokoningii, Phoma sp., Doratomyces nanus, Gymnoascus umbrinus (siehe A. Endo, K. Hasumi, A. Yamada, R. Shimoda, H. Takeshima, J. Antibiot. 49, 1609–10(1986)); Aspergillus obscurus (siehe HU-A-208 997), Transformant A. Oryzae/A. terreus (US-A-5,362,638), sowie Pleurotus ostreatus, Pleurotus saca und Pleurotus sapidus (siehe N. Gunde-Cimerman, FEMS Microbiology Letters 11, 203–206(1993)).
TECHNISCHES PROBLEM
Obwohl mehrere Verfahren zur Herstellung von Lovastatin im Stand der Technik beschrieben worden sind, an denen die Verwendung von verschiedenen Arten von Mikroorganismen beteiligt ist, haben diese bekannten Verfahren mehrere Nachteile. Erstens ergeben die in diesen Verfahren verwendeten Lovastatin produzierenden Mikroorganismen keine befriedigenden Ausbeuten von Lovastatin. Weiterhin ist es während des Verfahrens bei ihrer Kultivierung oft notwendig, die Fermentierungsmischung zu ergänzen, insbesondere mit der ausgewählten Kohlenstoffquelle, da eine hohe anfängliche Konzentration der Kohlenstoffquelle dazu tendiert, einen negativen Effekt auf die Herstellungsrate von Lovastatin zu haben. Schließlich ist mit der Notwendigkeit in bekannten Verfahren, während des Fermentationsverfahrens zu ergänzen, das Risiko verbunden, dass die Kul- turbrühe kontaminiert werden kann.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorgenannten Nachteile werden durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung überwunden. Dieses Verfahren für die Herstellung von Lovastatin in der Lakton-Form (Verbindung I) und in der Säure-Form (Verbindung II), wie durch die folgenden Formeln definiert
Verbindung I
Verbindung II oder von pharmazeutisch akzeptablen Salzen oder Alkylestern davon, umfaßt das Fermentieren eines Nährmediums mit einem Mikroorganismus der Art Aspergillus terreus var. aureus und das Isolieren des erwünschten Produktes.
Es wurde unerwarteterweise gefunden, dass bei der Benutzung eines Mikroorganismus der Art Aspergillus terreus var. Aureus hervorragende Ausbeuten an Lovastatin sogar erreicht werden können, wenn zu Beginn des Fermentationsprozesses eine hohe Konzentration von Kohlenstoffquelle in dem Medium anwesend ist. Daher ist das unerwünschte Ergänzen der Fermentationsbrühe nicht notwendig.
Die Gattung Aspergillus, die auch den Aspergillus terreus Mikroorganismus einschließt, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist eine sehr große und heterogene taxonomische Kategorie. Sie ist aufgespalten in Unter-Gattungen, Sektionen oder Gruppen und sogar spezifische Arten. In der Literatur sind verschiedene Arten des Pilzes Aspergillus terreus, so wie Aspergillus terreus var. globosus, Aspergillus terreus var. terreus, Aspergillus terreus var. aureus, Aspergillus terreus var. africanus beschrieben (siehe K. B. Raper und D. Fenell: The genus Aspergillus, Williams und Wilkins, Baltimore, 1965). Weiterhin sind in den Internationalen mikrobiologischen Sammlungen sogenannte „Typus-Stämme" für die er wähnten Arten verfügbar.
Es wurde nun gefunden, dass ein bestimmter Pilz, der als Aspergillus terreus var. aureus bestimmt wurde, ein sehr vorteilhafter Lovastatin produzierender Mikroorganismus ist. Eine Kultur von besonders bevorzugtem Aspergillus terrues var. aureus Mikroorganismus ist bei der Belgischen Koordinierten Sammlung von Mikroorganismen – Mycotheque l'Universite Catholique de Louvain unter der Zugangsnummer MUCL 38997 hinterlegt.
Für die taxonomische Identifizierung dieses Mikroorganismus wurden Typus-Stämme benutzt, die in den Kultursammlungen gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt waren, genau wie Standardreferenzbücher, z. B. K. B. Raper und D. Fenell: The genus Aspergillus, Williams und Wilkins, Baltimore, 1965, R. R. M. Paterson und P. D. Bridge: Biochemical Technique for Filamentous Fungi, IMI Techniucal Handbooks, No. 1, Cab International 1994 und M. J. Carlile und S. C. Watkinson: The Fungi, Acdemic Press 1994.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren benutzte Kultivierung der Mikroorganismen wurde auf einem Czapek-Agar (CZA) bei 28°C für 14 Tage ausgeführt. Die erhaltenen Kolonien waren 5 bis 7 cm im Durchmesser. Das Mycel war hellgelb, mit intensiver oder schlechter Sporolation. Die Konidienköpfe waren lang, kugelförmig, kompakt, 110 bis 250 μm lang und 35 bis 60 μm im Durchmesser. Die Konidiophoren waren mehr oder weniger gebogen, glatt, farblos bis hellgelb, 300 bis 400 μm lang und 4 bis 7 μm im Durchmesser. Die Vesikel waren halbkugelförmig. Primäre Sterigmen waren 5,5 bis 7 μm lang und 1 bis 2 μm im Durchmesser, und sekundäre Sterigmen waren 5 bis 7 μm lang und 1,5 bis 2 μm im Durchmesser. Die Konidien waren kugelförmig bis leicht elliptisch, glatt und 1,9 bis 2,4 μm im Durchmesser. Bei dem Wachstum auf verschiedenen Substraten wurde Pigment einer gelben bis grünbraunen Farbe in das Kulturmedium abgegeben.
Die taxonomische Identifizierung zeigte, dass die in der vorliegenden Erfindung benutzten Mikroorganismen der Klasse der Ascomyceten angehörten – jeweils höhere Fungi, Familie Eurotiaceae, Gattung Eurotium, und Konidienform Aspergillus, Spezies Aspergillus terreus var. aureus. Da Aspergillus terreus ATCC 20542 der Stamm ist, der im Stand der Technik am häufigsten als Lovastatin-Produzent erwähnt wurde, wurde der in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt benutzte Mikroorganismus auch mit diesem Mikroorganismus aus dem Stand der Technik verglichen. Das Ergebnis einer ausführlichen vergleichenden Analyse, basierend auf einer morphologischen Analyse, der Physiologie des Wachstums in verschiedenen Nährmedien und der Pigmentanalyse bestätigte, dass der erfindungsgemäße Lovastatin- Produzent Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 wesentlich verschieden von dem Stamm Aspergillus terreus ATCC 20542 ist. Zu diesem Zweck wurden mehrere Kultivierungsexperimente von beiden Pilzstämmen bei einer Temperatur von 30°C für 10 bis 12 Tage im Dunklen durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 angegeben.
TABELLE 1 Makromorphologischer Vergleich der Pilzstämme Aspergillus terreus var. aureus MUC 38997 und Aspergillus terreus ATCC 20542, Lovastatin-Produzenten, gewachsen auf synthetischem, festen Kulturmedium, das verschiedene Kohlenstoffquellen enthielt.
TABELLE 2 Makromorphologischer Vergleich der Pilzstämme Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 und Aspergillus terreus ATCC 20542, Lovastatin-Produzenten, gewachsen auf synthetischem festen Kulturmedium, das verschiedene Stickstoffquellen enthält.
Wie aus den in den obigen Tabellen 1 und 2 dargestellten Ergebnissen klar wird, unterscheiden sich die Stämme deutlich in der Färbung der Kolonien und der Penetration von Pigment in das Kultumedium.
Bei den meisten Substraten ist das Luftmycel des Pilzes Aspergillus terreus var. aureus MUCL 38997 weiß bis blaß-gelb und das Substratmycel ist blaß-braun. Intensives gelbes Pigment wurde beobachtet, wenn Arabinose oder Rhamnose als Kohlenstoffquellen verwendet wurden. Unter den gleichen Bedingungen ist die Farbe des Mikroorganismus Aspergillus terrus ATCC 20542 rostbraun. In Beziehung auf die Größen der Kolonien wurde gefunden, dass bei den meisten getesteten Kohlenstoffquellen, nämlich Xylose, Saccharose, Maltose, Rhamnose, Ribose, Fruktose und Arabinose, die Kolonien von Aspergillus terrus MUCL 38997 einen Durchmesser von 9 cm hatten. Bei Kultivierung des Pilzstammes Aspergillus terrus ATCC 20542 unter den gleichen Wachstumsbedingungen hatten die Kolonien in den meisten Fällen nur einen Durchmesser von 5 bis 8 cm.
Die Verwendung von Natriumcitrat als Kohlenstoffquelle hemmte das Wachstum von Aspergillus terrus var. aureus MUCL 38997. Der gegenteilige Effekt wurde in dem Fall von Aspergil-1us terrus ATCC 20542 beobachtet, wo nach 12 Tagen der Kultivierung die Kolonien dieses Stammes in mehr oder weniger unregelmäßiger Form, brauner Farbe und samtiger Struktur wuchsen.
Bei der Verwendung von verschiedenen Stickstoffquellen, sowie Asparagin, Glutaminsäure, Valin, Leucin, L-Isoleucin, Arginin, Alanin, Tyrosin, NH₄Cl und Calciumnitrat wurde ein stimulierender Effekt auf das Wachstum von Kolonien des Aspergillus terrus var, aureus MUCL 38997 Stammes beobachtet. Es wurden Kolonien der richtigen Form mit gut entwickeltem Luftund Substratmycel erhalten. In dem Fall von Aspergillus terrus ATCC 20542 wurde der gegenteilige Effekt beobachtet, wenn Asparagin und Tyrosin als Stickstoffquellen verwendet wurden, das Wachstum wurde nämlich inhibiert.
Weiterhin wurden mikroskopisch die sogenannten „Hulla-Zellen" in dem Fall von Aspergillus terrus var, aureus MUCL 38997 nicht beobachtet, die typisch für var, aureus sind. Im Gegensatz dazu waren „Hulla-Zellen" in dem Fall von Aspergil-1us terrus ATCC 20542 anwesend.
Die obigen Ergebnisse zeigen damit, dass MUCL 38997, wie in dem vorliegenden Verfahren genutzt, und ATCC 20542 gänzlich verschiedene Mikroorganismen sind.
Die Kultivierung der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen wird in wässrigen Medien durchgeführt, z. B. in denen, die für die Herstellung anderer Fermentationsprodukte verwendet werden. Die Fermentation wird normalerweise in Medien durchgeführt, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, und wird bevorzugt in Submerskultur und unter aeroben Bedingungen durchgeführt, da die Mikroorganismen unter solchen Bedingungen ein sehr schnelles Wachstum zeigen. Es ist besonders bevorzugt, dass hohe Anfangskonzentrationen der ausgewählten Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium anwesend sind, wodurch der Bedarf für weiteres Ergänzen von Kohlenstoffquelle während des Fermentationsprozesses nicht entsteht. Anfangskonzentrationen der Kohlenstoffquelle sind daher normalerweise 6 Gew.-%, bevorzugt ≥ 9 Gew.-%, besonders bevorzugt 11 Gew.-% und am meisten bevorzugt ≥ 15 Gew.-% des Mediums.
Beispiele von geeigneten Komponenten der Nährmedien sind z. B. beschrieben in EP-B-22 478. Besonders bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Laktose, Glucose, Saccharose, Malzmehl, und besonders bevorzugte Stickstoffquellen sind Kasein-Pepton, Getreide-Einweichflüssigkeit (corn steep liquor, CSL), Sojaprotein, Hefeextrakt und Bierhefe. In dem Nährmedium vorhandene besonders bevorzugte Salze sind MgCl₂, K₂HPO₄, NaH₂PO₄, MnSO₄, (NH₄)₂HPO₄. Das Nährmedium kann auch andere erwünschte Komponenten enthalten, wie Antischaummittel.
Das Fermentationsverfahren wird bevorzugt bei Temperaturen in dem Bereich von 20 bis 33°C ausgeführt, insbesondere bei etwa 28°C. Der pH-Wert des Nährmediums wird normalerweise in dem Bereich von 6,0 bis 8,0 sein, und insbesondere 5,8 bis 6,8. Der Abschluss der Fermentierung benötigt normalerweise etwa 6 Tage. Es wurde herausgefunden, dass Lovastatin hauptsächlich in der Säure-Form hergestellt wurde, während die Konzentration der Lakton-Form in der Fermentationsbrühe während des ganzen Prozesses relativ niedrig blieb. Lovastatin wurde mit konventionellen Verfahren isoliert. Typischerweise wird die Isolation durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Laktonisierung und Kristallisierung durchgeführt. Das isolierte Lovastatin wurde mit mehreren analytischen Techniken charakterisiert, z. B. IR-Spektrometrie und Massenspektrometrie, NMR- und UV-Spektrometrie.
Die Säure-Form von Lovastatin (Verbindung II) kann zu der entsprechenden Lakton-Form (Verbindung I) durch konventionelle Verfahren laktonisiert werden, wie sie z. B. in EP-A-351 918, EP-B-22 478 oder WO 94/29292 beschrieben sind. Das erhaltene Lovastatin kann auch in die entsprechenden pharmazeutisch annehmbaren Salze oder Alkylester überführt werden, durch konventionelle Methoden wie die in EP-B-22 478 beschriebenen.
Es wurde weiterhin entdeckt, dass das erfindungsgemäße Verfahren, verglichen mit Verfahren aus dem Stand der Technik, zu höheren Ausbeuten an Lovastatin führte. Weiterhin zeigten die in dem vorliegenden Verfahren benutzten Mikroorganismen sogar bei den benutzten hohen anfänglichen Konzentrationen der Kohlenstoffquelle eine hohe Produktivität, und demgemäß war es nicht notwendig, während des Verfahrens weitere Kohlenstoffquelle hinzuzufügen, wodurch das Risiko der Kontamination der Fermentationsbrühe vermieden wurde.
Die Überlegenheit des vorliegenden Verfahrens wird auch durch die folgenden Beispiele gezeigt, die die Erfindung erläutern, ohne den Umfang der Erfindung zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Allgemeines Verfahren
Für dieses Beispiel wird eine Probe des Pilzes Aspergillus terrus var, aureus, die unter der Zugangsnummer MUCL 38997 hinterlegt ist, verwendet. Eine durch Kultivierung auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) erhaltene, gut sporenbildende Kultur dieses Pilzes wurde verwendet, um eine Sporensuspension herzustellen, und diese Sporensuspension wurde für die Inokulation des Mediums benutzt, das für das Wachstum der vegetativen Phase verwendet wurde. Dieses Medium hatte einen pH von 6,4 und enthielt Getreide-Einweichflüssigkeit (CSL), Malzmehl, Kasein-Pepton, Bierhefe, (NH₄)₂HPO₄, ein Antischaummittel und Trinkwasser. Vor der Inokulation mit der Sporensuspension wurde das Medium bei 121°C für 20 Minuten sterilisiert und anschließend auf 25 bis 35°C, bevorzugt 28°C, abgekühlt.
Die inokulierte Prä-Fermentationskultur wurde unter Anwendung von Belüftung und Schütteln bei 28°C für 20 bis 35 Stunden wachsen gelassen.
Gut entwickeltes Inokulum (1 bis 2% Volumen) wurde dann unter sterilen Bedingungen in das Fermentationsmedium transferiert. Das Fermentationsmedium enthielt Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, genau wie Mineralsalze, nämlich MgCl₂, K₂HPO₄, NaH₂PO₄, MnSO₄ und Wasser. Das Fermentationsverfahren wurde bei 28°C gefahren, wobei Belüftung und Mischung abhängig von der Konzentration gelösten Sauerstoffes angewendet wurden. Während der Fermentation wurde der pH zwischen 5,8 und 6,8 gehalten, indem 30% H₂SO₄- oder 10% NaOH-Lösung verwendet wurde.
Während der Fermentation wurde die Lovastatin-Konzentration in der Kulturbrühe mit HPLC gemessen. Zu diesem Zweck wurde eine Probe der Brühe mit 10% wässrigem HCl auf einen pH-Wert von 4 angesäuert, mit Methanol extrahiert, mit dem Ultra Turax T25 Homogenisator (Janke und Kunkel, IKA Labortechnik, Deutschland) für 5 Minuten homogenisiert und filtriert. Das Filtrat wurde für die Analyse durch HPLC benutzt (Apparat: Pharmacia LKB-System; Säule: Chrompack Chromspher C18, 5 μm; Temperatur +45°C; Eluent: Acetonitril und 0,1% wässrige Phosphorsäure (Volumenverhältnis 48 : 52); UV-Detektor.
Es wurde gefunden, dass hauptsächlich Lovastatin in der Säure-Form produziert wurde, während die Lakton-Konzentration im Verlauf des ganzen Fermentationsprozesses bemerkenswert niedrig blieb.
Die Fermentation war nach etwa 6 Tagen abgeschlossen, und Lovastatin wurde gemäß der in WO 94/29292 offenbarten Methode isoliert. IR-Spektroskopie, Massenspektroskopie genau wie NMRund UV-Spetroskopie bestätigten, dass Lovastatin gebildet wurde.
Beispiel 2
Mycel des Pilzes Aspergillus terrus var. aureus MUCL 38997 wurde auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) 10 bis 14 Tage wachsen gelassen. Das Mycel wurde dann abgeschabt und benutzt, um eine Sporensuspension in einer wässrigen 0,1 Volumen-% Tween-80-Lösung herzustellen. 200 ml der filtrierten Sporensuspension wurden in der Folge benutzt, um 30 l des Mediums für das vegetative Wachstum (vegetatives Medium) zu inokulieren, das die folgende Zusammensetzung hatte.
Zusammensetzung des vegetativen Mediums:

CSL 5,0 g

Malzmehl 15,0 g

Kasein-Pepton 5,0 g

Bierhefe 1,2 g

(NH₄)₂HPO₄ 0,015 g

Trinkwasser ad 1000 ml
Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisierung auf 6,4 eingestellt. Die Sterilisierung wurde bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt. Die vegetative Brühe wurde mit Belüftung und Mischung bei 28°C für 20 bis 35 Stunden wachsen gelassen. 1 Volumen-% der erhaltenen Brühe wurde aseptisch in das Fermentationsmedium, manchmal auch Produktionsmedium genannt, transferiert (100 l), mit der folgenden Zusammensetzung: Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

Laktose 60 g

Organische Stickstoffquelle 13,8 g

CSL 1, 95 g

MgCl₂.6H₂O 1, 0 g

NaH₂Po₄ 1, 2 g

K₂HPO₄ 0, 5 g

MnSO₄.H₂O 0, 02 g

Antischaummittel 0, 5 g

Trinkwasser ad 1000 ml
Vor der Inokulation wurde der pH-Wert des Produktionsmediums auf 6,4 eingestellt, und es wurde sterilisiert. Die Sterilisierung wurde bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt.
Die Kultur wurde bei 28°C unter Belüftung und Mischung für 6 Tage wachsen gelassen. Die Produktion von Lovastatin wurde mit HPLC überwacht und nach der Beendigung der Fermentation wurde das hergestellte Lovastatin isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurde eine Ausbeute von mehr als 500 μg Lovastatin in der Säure-Form pro ml Kulturbrühe erhalten.
Beispiel 3
Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wurde bis zu dem Stadium wiederholt, in dem das Wachstum der vegetativen Phase abgeschlossen war.
2 Volumen-% der so erhaltenen Kulturbrühe wurden dann benutzt, um 100 1 eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren: Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

Laktose 90 g

Organische Stickstoffquelle 22,15 g

CSL 2, 93 g

MgCl₂.6H₂O 1, 0 g

NaH₂Po₄ 1,2 g

K₂HPO₄ 0, 5 g

MnSO₄. H₂O 0, 02 g

Antischaummittel 0, 5 g

Trinkwasser ad 1000 ml
Vor der Inokulation wurde der pH-Wert des Fermentationsmediums auf 6,4 eingestellt, und es wurde sterilisiert. Die Sterilisierung wurde bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt.
Die Kultur wurde mit Belüftung und Mischung bei einer Temperatur von 28°C 6 Tage wachsen gelassen. Das hergestellte Lovastatin wurde dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die Ausbeute betrug mehr als 700 μg/ml Lovastatin in der Säure-Form.
Beispiel 4
Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wurde bis zu dem Stadium wiederholt, in dem das Wachstum der vegetativen Phase beendet war.
2 Volumen-% der so erhaltenen Kulturbrühe wurden dann benutzt, um 100 l eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren: Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

Laktose 117 g

Organische Stickstoffquelle 28,8 g

CSL 3,81 g

MgCl₂.6 H₂O 1, 0 g

NaH₂Po₄ 1,2 g

K₂HPO₄ 0, 5 g

MnSO₄.H₄O 0, 02 g

Antischaummittel 0, 5 g

Trinkwasser ad 1000 ml
Vor der Inokulation wurde der pH-Wert des Fermentationsmediums auf 6,4 eingestellt, und es wurde sterilisiert. Die Sterilisierung wurde bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt.
Die Kultur wurde mit Belüftung und Mischung bei einer Temperatur von 28°C 6 Tage wachsen gelassen. Das hergestellte Lovastatin wurde dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die Ausbeute war mehr als 1000 μg/ml Lovastatin in der Säure-Form.
Beispiel 5
Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wurde bis zu dem Stadium wiederholt, in dem das Wachstum der vegetativen Phase abgeschlossen war.
2 Volumen-% der so erhaltenen Kulturbrühe wurden dann benutzt, um 100 l eines Produktionsmediums mit der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren: Zusammensetzung des Produktionsmediums:

Laktose 150 g

Organische Stickstoffquelle 35,14 g

CSL 4,65 g

MgCl₂.6H₂O 1,0 g

NaH₂Po₉ 1,2 g

K₂HPO₄ 0,5 g

MnSO₄.H₂O 0,02 g

Antischaummittel 0,5 g

Trinkwasser ad 1000 ml
Vor der Inokulation wurde der pH-Wert des Produktionsmediums auf 6,4 eingestellt, und es wurde sterilisiert. Die Sterilisierung wurde bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt.
Die Kultur wurde unter Belüftung und Mischung bei einer Temperatur von 28°C für 6 Tage wachsen gelassen. Das hergestellte Lovastatin wurde dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die Ausbeute betrug mehr als 1200 μg/ml Lovastatin in der Säure-Form.
Beispiel 6 (vergleichend)
Vergleich der Produktivität der Stämme A. terreus ATCC 20542 und A. terreus var. Aureus MUCL 38997
Um die Produktivität der in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt genutzten Mikroorganismen mit dem Mikroorganismus aus dem Stand der Technik, A. terreus ATCC 20542, zu vergleichen, wurden die folgenden Experimente im Labormaßstab durchgeführt.
Bei allen Experimenten war das für das Wachstum der vegetativen Phase benutzte Impfmedium das gleiche wie in Beispiel 2 beschrieben. Um den Einfluss von verschiedenen Konzentrationen der Kohlenstoffquelle zu bestimmen, wurden die Produktionsmedien jeweils gemäß Beispielen 2, 3 und 4 benutzt. Diese Medien enthalten 6% (Beispiel 2), 9% (Beispiel 3) und 11,7 (Beispiel 4) Laktose. Die Sterilisation des Mediums wurde in allen Experimenten bei 121°C für 20 Minuten durchgeführt.
Die Inokulation des Mediums für das Wachstum der vegetativen Phase wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Impf-Flaschen wurden bei 28°C auf einem 220 rpm-Schüttler (5 cm Schwingweite) inkubiert. Anschließend wurden 2 Volumen-% der erhaltenen Kulturbrühe aseptisch in 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, die 60 ml des jeweiligen Produktionsmediums enthielten. Inokulierte Kolben wurden dann bei 28°C (rpm = 220,5 cm Schwingweite) 140 Stunden inkubiert. Die Produktion von Lovastatin wurde mit HPLC kontrolliert. Die jeweiligen Ausbeuten an Lovastatin (μg/ml) sind in der Tabelle unten angegeben.
(20542 bezieht sich auf ATCC 20542 38997 bezieht sich auf MUCL 38997)
Aus den in der obigen Tabelle dargestellten Ergebnissen wird klar, dass der in dem erfindungsgemäßen Verfahren benutzte Stamm eine viel höhere Produktivität zeigt als der getestete Stamm aus dem Stand der Technik. Weiterhin ist der in dem vorliegenden Verfahren benutzte Stamm in der Lage, selbst bei sehr hohen anfänglichen Konzentrationen von Kohlenstoffquelle hoher Ausbeuten an Lovastatin zu produzieren, während die Produktivität des Stammes aus dem Stand der Technik durch solche Konzentrationen inkubiert wird.
Daher zeigen diese Testergebnisse die überraschende Überlegenheit des in dem erfindungsgemäßen Verfahren benutzten Mikroorganismus.
Beispiel 7 (vergleichend)
Vergleich der Produktivität der Stämme A terreus ATCC 20542 und A. terreus var. aureus MUCL 38997
Die Experimente wurden im Labormaßstab in Übereinstimmung mit den in EP-B-22 478, Beispiel 5, beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Stämme A. terreus ATCC 20542 und A. terreus var. aureus MUCL 38997 als Stämme benutzt wurden. Die Ausbeuten an Lovastatin (μg/ml) für diese zwei Stämme sind in der Tabelle unten angegeben.
(20542 bezieht sich auf ATCC 20542 38997 bezieht sich auf MUCL 38997)
Die obigen Daten zeigen auch, dass auch unter diesen Bedingungen der in dem erfindungsgemäßen Verfahren benutzte Stamm unter Beweis stellt, dass er eine viel höhere Produktivität als der Stamm aus dem Stand der Technik aufweist.
BELGISCHE KOORDINIERTE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN BCCM MUCL-SAMMLUNG
Seite 1 des Formulars BCCM/MUCL/BP/4/ MUCL 38997 Beleg für den Fall einer Originalhinterlegung
Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren
Beleg für den Fall einer Originalhinterlegung, herausgegeben gemäß Regel 71 durch die Internationale Hinterlegungsbehörde BCCM/MUCL, unten auf der nächsten Seite identifiziert Internationales Formular BCCM/MUCL/BP/4/ MUCL 38997

An Name des Hinterlegers: Milan Bezeg, KRKA, p. o. Novo Mesto, Biochemie Abteilung

Adresse Smarjeska ul. 6. 68000 Novo mesto, Slowenien
I. Identifizierung des Mikroorganismus: I.1 Durch den Hinterleger angegebene Identifikationsreferenz
I.2 Durch die Internationale Hinterlegungsbehörde vergebene Zugangsnummer
BELGISCHE KOORDINIERTE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN BCCM MUCL-SAMMLUNG
Seite 2 des Formulars BCCM/MUCL/BP/4/ MUCL 38997 Beleg für den Fall einer Originalhinterlegung
II. Wissenschaftliche Beschreibung und/oder vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung
Der unter I oben identifizierte Mikroorganismus wurde begleitet durch
(passende (s) Kästchen ankreuzen)

– eine wissenschaftliche Beschreibung
– eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung

III. Beleg und Akzeptanz
Diese Internationale Hinterlegungsbehörde akzeptiert den oben unter I identifizierten Mikroorganismus, der von ihr am 28. November 1991 erhalten wurde (Originalhinterlegung)
IV. Internationale Hinterlegungsbehörde
Belgische Koordinierte Sammlung von Mikroorganismen (BCCM) Mycotheque l'Universite Catholique de Louvain (MUCL)
Place Croix du Sud 3
B-1348 Louvain-la-Neuve
Belgien
Unterschrift(en) der Person(en) mit der Berechtigung, die Internationale Hinterlegungsbehörde zu repräsentieren oder von Bevollmächtigten Amtsperson(en) Datum

Claims

Verfahren zur Herstellung von Verbindung I und Verbindung II, definiert durch die folgenden Formeln
Verbindung I
Verbindung II oder pharmazeutisch akzeptabler Salze oder Alkylester davon, bei dem man eine Nährlösung mit einem Mikroorganismus der Art Aspergillus terreus var. aureus fermentiert und man das gewünschte Produkt gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man den Mikroorganismus verwendet, der bei der belgischen Koordinierten Sammlung von Mikroorganismen – Mycothèque l'Universite catolique de Louvain unter der Zugangsnummer MUCL 38997 hinterlegt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man eine Nährlösung verwendet, die ≥ 6 Gew.-%, insbesondere ≥ 9 Gew.-% einer Kohlenstoffquelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem man eine Nährlösung verwendet, die ≥ 11 Gew.-%, insbesondere ≥ 15 Gew.-% einer Kohlenstoffquelle enthält.