SI20746A - Nepeptidni GnRH agensi ter metode in vmesne spojine za njihovo pripravo - Google Patents

Nepeptidni GnRH agensi ter metode in vmesne spojine za njihovo pripravo Download PDF

Info

Publication number
SI20746A
SI20746A SI9920076A SI9920076A SI20746A SI 20746 A SI20746 A SI 20746A SI 9920076 A SI9920076 A SI 9920076A SI 9920076 A SI9920076 A SI 9920076A SI 20746 A SI20746 A SI 20746A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
compound
substituted
gnrh
unsubstituted alkyl
aryl
Prior art date
Application number
SI9920076A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Brian Anderson
Haresh N. Vazir
David Robert Luthin
Genevieve Deguzman Paderes
Ved P. Pathak
Lance Christopher Christie
Yufeng Hong
Eileen Valenzuela Tompkins
Haitao Li
James Faust
Original Assignee
Agouron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agouron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Agouron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of SI20746A publication Critical patent/SI20746A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A61P5/04—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin for decreasing, blocking or antagonising the activity of the hypothalamic hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C07D235/14—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/26—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/48—Two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/02—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D241/10—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D241/12—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/14—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Opisani so nepeptidni GnRH agnesi, ki lahko zavirajo učinek gonadotropin-sproščajočega hormona. Tovrstne spojine in njihove farmacetsko sprejemljive soli, multimeri, predzdravila in aktivni metaboliti so primerni za zdravljenje sesalskih reproduktivnih motenj in od steroidnih hormonov odvisnih tumorjev, pa tudi za uravnavanje plodnosti, ko je indicirano zaviranje sproščanja gonadotropina. Opisane so tudi metode za sintetiziranje spojin ter vmesne spojine, ki so za to uporabne.ŕ

Description

Nepeptidni GnRH agensi ter metode in vmesne spojine za njihovo pripravo
Tehnično področje in industrijska uporabnost izuma
Splošni predmet tega izuma so spojine, ki vplivajo na delovanje človeškega gonadotropin-sproščajočega hormona (GnRH). Natančneje, predmet tega izuma so nepeptidni GnRH antagonisti in agonisti ter njihova priprava. Ti nepeptidni GnRH agensi imajo ugodne fizikalne, kemične in biološke lastnosti ter so uporabni za zdravljenje bolezni oz. okvar, posredovanih z modulacijo hipofizno-gonadne osi. S spojinami po izumu se izognemo degradacijskim in biodistribucijskim problemom peptidnih agensov.
Ozadje izuma
Gonadotropin-sproščajoči hormon (GnRH), poznan tudi kot sproščajoči hormon luteinizirajočega hormona (LH-RH), ima v biologiji razmnoževanja osrednjo vlogo. V rabi je široka paleta analogov za čedalje več kliničnih indikacij. GnRH dekapeptid (piro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ali pEHWSYGLRPG-NH2) se tvori z encimatskimi procesi iz večjega prekurzorja v nevronih medialno bazalnega hipotalamusa. Dekapeptid se pulzirajoče sprošča v hipofizni portalni obtok, kjer pride do interakcije med GnRH-jem in visokoafinitetnimi receptorji (7-transmembranski ' G-proteinški sklopljeni receptorji) v prednjem režnju hipofize, ki se nahaja na dnu možganov. V hipofizi GnRH sproži sproščanje dveh gonadotropnih hormonov (gonadotropinov): luteinizirajočega hormona (LH) in folikle-spodbujajočega hormona (FSH). LH spodbuja tvorbo testosterona v testisih oz. estradiola v ovarijih. FSH spodbuja rast foliklov pri ženski in tvorbo sperme pri moškem. Ob pravilnem delovanju sta pulzirajoče, časovno usklajeno sproščanje GnRH-ja in nivo njegove koncentracije kritična za vzdrževanje gonadne steroidogeneze in za normalne plodilne funkcije, vezane na rast in spolni razvoj.
Odziv hipofize na GnRH se tekom življenja močno spreminja. Prvič se GnRH in gonadotropini pojavijo v fetusu približno v desetem tednu nosečnosti. Po kratkotrajnem porastu v prvih treh mesecih po rojstvu občutljivost na GnRH upada vse do nastopa pubertete. Pred puberteto je odziv FSH-ja na GnRH izrazitejši kot odziv LH-ja. Z začetkom pubertete občutljivost na GnRH naraste, zato pride do pulzirajočega sproščanja LH-ja. Kasneje v puberteti in skozi vsa plodna leta se GnRH pulzirajoče sprošča tekom celega dne, pri čemer je odzivnost LH-ja večja od odzivnosti FSH-ja. Zaradi pulzirajočega sproščanja GnRH-ja pride do pulzirajočega sproščanja LH-ja in FSH-ja, kar povzroči, da se iz gonad sproščata testosteron oz. estradiol. Po menopavzi koncentracija FSH-ja in LH-ja naraste, pri čemer je postmenopavzni nivo FSH-ja večji kot nivo LH-ja.
Kronično prejemanje GnRH agonistov in antagonistov pri živalih oz. človeku privede do upada cirkulacijske ravni tako LH-ja kot FSH-ja. GnRH agonisti so spojine, ki posnemajo endogeni GnRH in tako spodbujajo receptorje na hipofizi, s čimer povzročijo sproščanje LH-ja in FSH-ja. Kronično jemanje GnRH agonistov pripelje po prehodnem porastu oz. »izbruhu« v tvorbi gonadnega hormona do znižane nastavitve GnRH receptorjev. Znižana nastavitev GnRH receptorjev in desenzibilizacija hipofize privedeta do upada cirkulacijske ravni LH-ja in FSH-ja. Kljub opaženemu hormonalnemu izbruhu, ki simptome zaostri, so GnRH agonisti predstavljali najboljšo izbiro pri zdravljenju od spolnih steroidov odvisnih patofiziologij. Tako so GnRH uporabljali npr. za zaviranje tvorbe testosterona, s čimer so zmanjšali prostornino prostate pri -benigni hipe'rplazij i prostate (BPH) in upočasnili rast tumorja pri raku prostate. Te spojine so uporabljali tudi pri zdravljenju raka na dojki in raka na jajčnikih.
V zadnjem času so na voljo za klinično evaluacijo tudi GnRH antagonisti. GnRH antagonisti imajo takojšen učinek na hipofizo, ne da bi prihajalo do izbruha, kakršen je bil opažen pri agonistih. V literaturi obstajajo poročila o uporabi GnRH antagonistov (običajno dekapeptidov) v zdravljenju rakov dojke, jajčnikov in prostate. Siceršnje področje uporabe antagonistov, kakor tudi agonistov, zajema endometriozo (vključno z endometriozo, ki jo spremljajo bolečine), miom uterusa, cistične bolezni jajčnikov in dojk (vključno s policistično boleznijo jajčnikov), hipertrofijo prostate, amenorejo (npr. sekundarno amenorejo) in prezgodnjo puberteto. Te spojine lahko pomagajo tudi pri simptomatičnem blaženju premenstruacijskega sindroma (PMS). Poleg tega lahko antagonisti pomagajo uravnavati izločanje gonadotropinov pri sesalcih moškega spola ter na ta način služijo za zaustavitev spermatogeneze (se pravi kot kontracepcijsko sredstvo za moške) in za zdravljenje moških spolnih prestopnikov. Pomembno je, da so se GnRH antagonisti (in agonisti) izkazali za uporabne v terapijah, pri katerih je zaželena reverzibilna supresija hipofizno-gonadne osi.
Zaradi navzočnosti GnRH receptorjev na celicah prednjega režnja hipofize in na nekaterih tipih tumorskih celic je mogoče zasnovati medikamente, ki na te receptorje učinkujejo, ter jih uporabiti za zdravljenje tako od hormonov odvisnih kot od hormonov neodvisnih oblik raka.
Več kot 50 let je bila najučinkovitejša sistematična terapija v zdravljenju metastaznega karcinoma prostate deprivacija androgenov. Logična osnova tega pristopa je preprosta - za svojo pravilno rast, vzdrževanje in delovanje potrebuje prostata androgene. Vendar pa sta rak oz. benigna hiperplazija prostate pri moških pogosta, razvijeta pa se v okolju kontinuirane izpostavljenosti androgenom. Zato prekinitev hipofizno-gonadne osi s pomočjo GnRH antagonista zmanjša tvorbo androgenov, rezultat tega pa je modulacija rasti tumorja. Poleg tega lahko GnRH antagonisti neposredno učinkujejo na rast tumorja, s tem ko blokirajo receptorje na tumoiskih celicah. Za tiste vrste raka, ki se neposredno odzivajo tako na spolne hormone kot na GnRH, bi morali antagonisti učinkovito zavirati rast tumorjev po dveh poteh oz. mehanizmih. Ker so GnRH receptorji navzoči na številnih celicah raka prostate in dojke, je bila nedavno postavljena teza, da so GnRH antagonisti nemara učinkoviti tudi pri zdravljenju od hormonov neodvisnih tumorjev. Novejši primeri v literaturi navajajo, da so GnRH receptorji prisotni na številnih celičnih linijah raka, vključno z:
• Rakom prostate: GnRH antagonisti kažejo tako in vitro kot in vivo neposredni inhibitorni učinek na rast tako od androgenov odvisnih (LNCaP) kot od androgenov neodvisnih (DU 145) celičnih linij človeškega raka prostate. (Montagnani in sodelavci, Arch. Ital. Urol.
Androl. 1997, 69(4), 257-263. GnRH antagonisti inhibirajo rast od androgenov neodvisnega raka prostate PC-3 pri golih miših. Jungwirth in sodelavci, Prostate 1997, 32(3), 164-172.
• Rakom jajčnikov: dokazanost GnRH receptorjev v človeških rakih jajčnikov utemeljuje oz. upravičuje uporabo na analogih GnRH-ja temelječih terapij za zdravljenje tovrstnih malignih tvorb. Srkalovic in sodelavci, Int. J. Oncol. 1998, 12(3), 489-498.
• Rakom na dojki: rak na dojki je najpogostejši tip raka pri ženskah po 40. letu starosti in zavzema prvo mesto med vzroki smrti zaradi raka pri ženskah. Sistematična endokrina intervencija predstavlja pomembno terapevtsko možnost pri napredovalem raku dojke, zlasti pri od estrogena odvisnih vrstah raka. Geni za gonadotropinsproščajoči hormon in njegov receptor so izraženi v človeški dojki s fibrocistično boleznijo in rakom. Kottler in sodelavci, Int. J. Cancer 1997, 71(4), 595599.
Doslej so bili kot GnRH antagonisti na razpolago predvsem peptidni analogi GnRH-ja. Glej npr. mednarodno objavo WO 93/03058. Peptidni antagonisti peptidnih hormonov so pogosto zelo močni; vendar pa pri rabi peptidnih antagonistov tipično naletimo na probleme, ker fiziološki encimi peptide degradirajo, poleg tega pa se peptidi znotraj zdravijenega, organizma slabo distribuirajo. Zato so kot zdravila le omejeno učinkoviti. Spričo tega je v današnjem času občutiti potrebo po nepeptidnih antagonistih peptidnega hormona GnRH.
Povzetek izuma
Predmet in cilj izuma je podati nepeptidne GnRH antagoniste z majhnimi molekulami, ki izrabljajo oba zgoraj opisana mehanizma delovanja. Nepeptidni GnRH agensi imajo v primerjavi s peptidi primernejše fizikalne, kemične in biološke lastnosti ter bodo uporabni kot medikamenti pri boleznih, posredovanih z modulacijo hipofizno-gonadne osi, in z neposrednim ciljanjem receptorja na tumorskih celicah. Obstaja potreba po razvitju zdravil, ki bi na te receptorje učinkovala in bila uporabna za zdravljenje tako od hormonov odvisnih kot od hormonov neodvisnih vrst raka.
Nadaljnji predmet in cilj izuma je podati nepeptidne spojine, ki so GnRH agensi (agonisti ali antagonisti), ki se vežejo na GnRH receptorje ter na ta način modulirajo aktivnost, in sicer predvsem take, ki so močni GnRH antagonisti. Nadaljnji predmet in cilj izuma je podati učinkovite terapije za ljudi, ki potrebujejo terapevtsko uravnavanje GnRH-ja, ter podati metode za zdravljenje bolezni in okvar, posredovanih z GnRH uravnavanj em.
Ti cilji so doseženi z nepeptidnimi GnRH spojinami po izumu; te so uporabne kot zdravila pri indikacijah, posredovanih z GnRH uravnavanjem. Spojine po izumu so farmacevtsko primernejše od peptidnih spojin, ker zagotavljajo boljšo biodistribucijo in toleranco na degradacijo s fiziološkimi encimi. Izum nadalje podaja metode sinteze navedenih spojin ter vmesne spojine, ki so uporabne za izdelavo navedenih spojin.
je X izbran izmed C=O, C=S, S=0 in S(O)2; 1 \Chetjy je \ / 5-členi heterociklični obroč, ki vsebuje med i in 4, prednostno 2 aii 3 heteroatome, izbrane izmed N, O in S, pri čemer je lahko obroč nasičen, delno nenasičen ali popolnoma nenasičen ter je lahko aromatski;
sta R1 in R1 neodvisno izbrana izmed H in nižjega alkila; je R3 izbran izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila in heteroarila, in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
sta R+ in R5 neodvisno izbrana izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila,
-6β cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C (O) OR, kjer je R določen tako kot zgoraj; in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
sta R6 in R7 neodvisno izbrana izmed H, halogena in' substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C (O) OR; kjer je R določen tako kot zgoraj; in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12; ali pa R6 in R7, vzeta skupaj z atomi, na katere sta vezana, tvorita fakultativno substituiran 5- ali 6-členi obroč, ki ima fakultativno do štiri heteroatome, izbrane izmed 0, N in S;
je R8 lipofilni del, izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 6 in 20; in kjer je R9 izbran izmed H in substituiranega in nesubstituiranega alkila, prednostno nižjega alkila.
V nekaterih izvedbah sta R1 ali R2 lahko -OH ali =0; in/ali je R8 lahko tudi vodik;
in/ali je R lahko COR ali vodik; in/ali ima R8 lahko poljubno število ogljikovih atomov;· in/ali R8 in R9 lahko tudi tvorita obroč; in/ali lahko poljubni sosednji R skupini, kot sta npr. R5 in R6 ali R3 in R4, tvorita obroč, kakršen je opisan za R6 in R7;
in/ali je R6 lahko COR; in/ali je (het) skupina lahko substituirana ali nesubstituirana.
V nadaljnji izvedbi sta R8 in/ali R9 lahko izbrana izmed heterocikličnih skupin ali poljubne spojine, ki tvori amidno vez z dušikom v formuli I. Se pravi, R8 in R9 sta lahko poljubni skupini, ki se začneta z ogljikom, vezanim na dušik v splošni formuli I.
Prednostne spojine po izumu imajo splošno formulo II:
-7Ί
II kjer so spremenljivke v formuli definirane tako kot zgoraj. Posebno prednostne spojine imajo formulo III:
III kjer je R8 definiran tako kot zgoraj. Prednostne R8 skupine vključujejo: aril, -CHz-aril, -CH2-heteroaril,
-CH2-cikloalkil in - (CH2) n-O-aril, kjer je n celo število med 1 in 4.
Prednostne spojine po izumu vključujejo:
,NH,
Y
NHjkjer substituent cikloheksila vključuje tako cis- kot transizomere;
NH .N
Poleg spojin po zgornjih formulah vključujejo GnRH agensi po izumu tudi farmacevtsko sprejemljive soli, multimerne oblike, predzdravila in aktivne metabolite teh spojin. Taki nepeptidni agensi so farmacevtsko primernejši od peptičnih agensov, ker zagotavljajo boljšo biodistribucijo in toleranco na degradacijo s fiziološkimi encimi.
Predmet izuma so tudi farmacevtske zmesi, ki vključujejo terapevtsko učinkovit odmerek GnRH agensa po izumu, kombiniran s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem ali topilom. Poleg tega so predmet izuma tudi metode za uravnavanje izločanja gonadotropinov pri sesalcih, ki vključujejo prejemanje terapevtsko učinkovitih odmerkov GnRH agensov po izumu.
Predmet izuma so tudi metode in vmesne spojine, uporabne za izdelavo spojin po formuli I.
Druge lastnosti, predmeti in prednosti izuma bodo razvidne iz podrobnega opisa izuma in njegovih prednostnih izvedb, ki sledijo v nadaljevanju.
Podrobni opis in prednostne izvedbe izuma
Nekatere spojine po izumu vsebujejo enega ali več središč asimetrije in lahko zaradi tega obstajajo kot enantiomeri, diastereoizomeri oz. druge stereoizomerne oblike. Mišljeno je, da izum vključuje vse take možne stereoizomere, pa tudi njihove racemne in optično čiste oblike. Če katere izmed tukaj opisanih spojin vsebujejo olefinske dvojne vezi, je mišljeno, da vključujejo tako E kot Z geometrijske izomere.
Pri tukaj navedenih kemičnih formulah lahko pride do pojava tavtomerije. Četudi v pričujoči specifikaciji navedene strukturne formule prikazujejo le po eno od možnih tavtomernih oblik, je mišljeno, da izum kljub temu vključuje vse tavtomerne oblike.
Izraz »alkil« označuje alkilne skupine v nerazvejenih in razvejenih verigah, ki vsebujejo od enega do dvanajstih ogljikovih atomov. Primeri alkilnih skupin vključujejo metil (Me) , etil, n-propil, izopropil, butil, izobutil, sek-butil, terc-butil (tBu), pentil, izopentil, terc-pentil, heksil, izoheksil in podobne. Izraz »nižji alkil« označuje alkil, ki vsebuje od 1 do 8 ogljikovih atomov (Ci_8-alkil) . Primerni
-1010 substituirani alkili vključujejo fluorometil, difluorometil, trifluorometil, 2-fluoroetil, 3-fluoropropil, hidroksimetil, 2hidroksietil, 3-hidroksipropil in podobne.
Izraz »alkenil« označuje alkenilne skupine v nerazvejenih in razvejenih verigah, ki vsebujejo od 2 do 12 ogljikovih atomov. Primeri alkenilnih skupin vključujejo prop-2-enil, but2-enil, but-3-enil, 2-metilprop-2-enil, heks-2-enil in podobne.
Izraz »alkinil« označuje alkinilne skupine v nerazvejenih in razvejenih verigah, ki vsebujejo od 2 do 12 ogljikovih atomov. Primeri alkinilnih skupin vključujejo prop-2-inil, 3metilpent-4-inil, heks-2-inil in podobne.
Izraz »karbocikel« označuje monociklično ali policiklično strukturo iz ogljikovih obročev (brez heteroatomov), ki vsebuje od 3 do 7 ogljikovih atomov v vsakem obroču, ki je lahko nasičen, delno nasičen ali nenasičen. Primeri karbociklov vključujejo cikloalkile in arile.
Izraz »heterocikel« označuje monociklično ali policiklično obročasto strukturo z enim ali več heteroatomi, izbranimi izmed N, O in S, ki vsebuje od 3 do 7 atomov (ogljikovih atomov in morebitnega/ih heteroatoma/ov) v vsakem obroču, nasičen, delno nasičen ali nenasičen. Primeri vključujejo tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, acetidinil, pirolidinil, piperidinil, piperazinil in podobne.
Izraz »cikloalkili« tukaj označuje nasičene karbocikle, ki vsebujejo od 3 do 12 ogljikov, 'vključno z ' bicikličnimi in tricikličnimi cikloaikilnimi strukturami. Primerni cikloalkili vključujejo ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil in podobne.
Izraza »arili« in »heteroarili« označujeta monociklične in policiklične nenasičene ali aromatske obročaste strukture, pri čemer »aril« označuje tiste, ki so karbocikli, »heteroaril« pa tiste, ki so heterocikli. Primeri aromatskih obročastih struktur vključujejo fenil, naftil, 1,2,3,4-tetrahidronaftil, furil, tienil, pirolil, piridil, piridinil, pirazolil, imidazolil, pirazinil, piridazinil, 1,2,3-triazinil, 1,2,4-oksadiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, l-H-tetrazol-5-il, indolil, kinolinil, benzofuranil, benzotiofenil (tianaftenil) in podobne. Te skupine lahko po želji substituira eden ali več primernih substituentov, ki je lahko heterociklov
-1111 npr. substituent, izbran izmed halogena (F, Cl, Br ali I); nižjega alkila; OH; N02; CN; CO2H; O-nižjega alkila; arila; arilnižjega alkila; CO2CH3; CONH,; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; OCF3 in podobnih. Tovrstne skupine lahko po želji substituirata struktura kondenziranega obroča ali mostu, npr. OCH2-O.
Izraz »aril-nižji alkil« označuje nižji alkil, na katerega je vezan aril. Primeri vključujejo benzil, fenetil, piridilmetil, naftilmetil in podobne. Aril-nižji alkil je po želji lahko substituiran.
Na splošno lahko različne skupine ali funkcionalne skupine za spremenljivke v formuli I po želji substituira eden ali več primernih substituentov. Primeri substituentov vključujejo halogen (F, Cl, Br ali I), nižji alkil, -OH, -N02, -CN, -CO2H, O-nižji alkil, -aril, -aril-nižji alkil, -CO2CH3, -C0NH2, OCH2CONH2, -NH2, SO2NH2, haloalkil (npr. -CF3, -CH2ČF3) , -0haloalkil (npr. -0CF3, -0CHF2) in podobne.
Poleg spojin po formuli I vključujejo GnRH agensi po izumu tudi farmacevtsko sprejemljive soli, multimerne oblike, predzdravila in aktivne metabolite spojin po formuli I. Taki nepeptidni agensi so farmacevtsko primernejši od peptičnih agensov, ker zagotavljajo boljšo biodistribucijo in toleranco na degradacijo s fiziološkimi encimi.
Nadalje je mišljeno, da formula I, kjer to pride v poštev, pokriva tako solvatirane kot nesolvatirane oblike spojin. Tako formula I vključuje spojine, ki imajo opisano strukturo, vključujoč tako hidratirane kot nehidratirane oblike.
Kot povedano zgoraj, GnRH agensi po izumu vključujejo tudi aktivne tavtomerne in stereoizomerne oblike spojin po formuli I, ki jih je moč brez težav pridobiti z v stroki poznanimi postopki. Tako je moč npr. optično aktivne (R) in (S) izomere pripraviti s stereospecifično sintezo, se pravi z uporabo kiralnih sintonov in kiralnih reagentov ali pa lahko racemne strukture razcepimo s poznanimi postopki.
Nadalje GnRH agensi vključujejo multivalentne ali multimerne oblike aktivnih oblik spojin po formuli I. Take »multimere« je moč izdelati z vezanjem ali postavljanjem več primerkov aktivne spojine zelo tesno skupaj, npr. s pomočjo ogrodja, ki ga nudi nosilna podenota. Preizkusiti je moč
-1212 uravnava podenote multimere različnih dimenzij (se pravi, ki vsebujejo različno število primerkov aktivne spojine) , dokler se ne odkrije multimer, katerega velikost je glede na vezavo receptorjev optimalna. Priprava takih multivalentnih oblik aktivnih spojin, ki vežejo receptorje, z optimalnim razmikom med podenotami, ki vežejo receptorje, lahko izboljša vezanje receptorjev (gl. npr. Lee in sodelavci, Biochem., 1984, 23:4255). Tehnik lahko multivalenco in razmik z izbiro primerne nosilne oz. veznih enot. Uporabne podenote vključujejo molekulske nosilce, ki vsebujejo več funkcionalnih skupin, ki lahko reagirajo s funkcionalnimi skupinami, ki jih vsebujejo aktivne spojine po izumu. Uporabiti je moč različne nosilne podenote za izdelavo visoko aktivnih multimerov, vključno s proteini, kot sta BSA (albumin govejega seruma) ali HAS, peptidi, kot so pentapeptidi, dekapeptidi, pentadekapeptidi in podobni, in vključno z nebiološkimi spojinami, izbranimi zaradi pozitivnega vpliva na absorpcijo, transport in perzistenco v ciljnem organizmu. Funkcionalne skupine na nosilni podenoti, kot so amino, sulfhidrilne, hidroksilne in alkilaminske skupine, so lahko izbrane tako, da dosežemo stabilne vezave na spojine po izumu, optimalni razmik med imobiliziranimi spojinami in optimalne biološke lastnosti.
Nadalje GnRH agensi po izumu vključujejo farmacevtsko soli spojin po formuli I. Izraz »farmacevtsko označuje oblike soli, ki so farmakološko sprejemljive in v bistvu netoksične za pacienta, ki prejema GnRH agens. Farmacevtsko sprejemljive soli vključujejo običajne soli, ki se z adicijo kisline oz. baze pridobijo iz ustreznih netoksičnih organskih ali anorganskih kislin oz. anorganskih baz. Primeri soli, pridobljenih z adicijo kisline, vključujejo soli, dobljene iz anorganskih kislin, kot so solna kislina, bromovodikova kislina, jodovodikova kislina, žveplova kislina, sulfaminska kislina (sulfamic acid), fosforna kislina in dušikova kislina, ter soli, dobljene iz organskih kislin, kot so p-toluensulfonska kislina, metansulfonska kislina, etandisulfonska kislina, isetionska kislina, oksalna kislina, pbromfenilsulfonska kislina, ogljikova kislina, sprejemljive sprej emlj iv« jantarjeva kislina, citronova kislina, benzojska kislina,
2-1313 acetoksibenzojska kislina, ocetna kislina, fenilocetna kislina, propionska kislina, glikolova kislina, stearinova kislina, mlečna kislina, jabolčna kislina, vinska kislina, askorbinska kislina, maleinska kislina, hidroksimaleinska kislina, glutaminska kislina, salicilna kislina, sulfanilna kislina in fumarna kislina. Primeri soli, pridobljenih z adicijo baze, vključujejo soli, dobljene iz amonijevih hidroksidov (npr. iz kvaternih amonijevih hidroksidov, kot je npr. tetrametilamonijev hidroksid), zatem soli, dobljene iz anorganskih baz, kot so npr. alkalije ali hidroksidi alkalijskih kovin in zemeljskih alkalij (npr. natrijev, kalijev, litijev, kalcijev in magnezijev hidroksid), ter nazadnje soli, pridobljene iz organskih baz, kot so npr. amini, benzilamini, piperidini in pirolidini.
Izraz »predzdravilo« označuje farmacevtsko sprejemljiv presnovni prekurzor spojine po formuli I (ali njene soli) . Predzdravilo je lahko neaktivno v trenutku, ko ga pacient prejme, vendar se in vivo spremeni v aktivno spojino po formuli I. Izraz »aktivni metabolit« označuje farmacevtsko sprejemljiv in učinkovit presnovni produkt spojine po formuli I. Predzdravila in aktivni metaboliti spojin po formuli I se lahko določijo z v stroki poznanimi postopki.
Za ugotavljanje nivoja aktivnosti različnih oblik spojin v GnRH sistemu se lahko uporabijo razni poznani preizkusi in postopki. Preizkusi vezanja ligandov se uporabljajo za ugotavljanje interakcije z receptorjem, ki nas zanima. Ko nas zanima vezanje, se lahko uporabi označen (markiran) receptor, pri čemer je označevalec fluorescentna snov, encim, radioaktivni izotop ali podobno, ki ob vezanju receptorja izrazi spremembo, ki jo je moč zaslediti. Alternativno lahko tehnik uporabi protitelo za receptor, pri čemer je protitelo označeno, kar lahko omogoči ojačitev signala. Vezanje se lahko ugotavlja tudi s konkurenčno substitucijo na receptor vezanega liganda, pri čemer je ligand označen z označevalcem, ki ga je moč zaslediti. Ko nas zanima agonistična oz. antagonistična aktivnost, lahko opazujemo nedotaknjeno celico ali organizem ter merimo spremembo v funkcioniranju organizma ali celice, do katere pride zaradi vezanja spojine, ki nas zanima. Za ugotavljanje celične reakcije so na razpolago različne naprave, npr. mikrofiziometer, ki ga
-1414 dobavlja podjetje Molecular Devices, Redwood City, zvezna država Kalifornija. In vitro oz. in vivo preizkusi, ki so uporabni za merjenje aktivnosti GnRH antagonistov, so poznani v stroki. Glej npr.: Bowers in sodelavci, »LH suppression in cultured rat pituituary celiš treated with 1 ng of LHRH«, Endocrinology, 1980, 106:675-683 (in vitro) ter Corbin in sodelavci, »Antiovulatory activity (AOA) in rats«, Endocr. Res. Comaun. 1975, 2:1-23 (in vivo). Konkretne preizkusne protokole, ki se lahko pri tem uporabijo, opisujemo v nadaljevanju.
Antagoniste GnRH receptorjev se da npr. funkcionalno ugotoviti z merjenjem spremembe hitrosti zunaj celičnega kisanja po naslednjem postopku. Sposobnost spojin, da blokirajo zunajcelično hitrost z GnRH-jem posredovanega kisanja v celicah HEK 293, ki izražajo človeške GnRH receptorje, je opredeljena kot mera antagonistične aktivnosti spojine in vitro. Približno 100.000 celic/komoro se imobilizira v agaroznem suspenzijskem sredstvu (podjetja Molecular Devices) in namoči z MEM sredstvi brez pufra s pomočjo mikrofiziometra Cytosensor®, ki ga izdeluje Molecular Devices. Počakamo, da celice dosežejo ravnotežje in se bazalna hitrost kisanja stabilizira (približno eno uro). Odčitajo se kontrolne krivulje reagiranja na odmerek GnRH-ja (10_11M do 10'7M) . Spojine pustimo inkubirati 15 minut pred spodbujanjem z GnRH-jem in preverimo njihovo antagonistično aktivnost. Po inkubaciji s testnimi spojinami dobimo ponovne krivulje reagiranja na odmerek ;GnRH-ja v prisotnosti, ali odsotnosti raznih koncentracij testnih spojin. Nad spojinami se opravi Schildova regresijska analiza, da se ugotovi, ali spojine antagonizirajo z GnRH-jem posredovane poraste hitrosti izvenceličnega kisanja s pomočjo konkurenčne interakcije z GnRH receptorjem.
V nadaljnjem preizkusu se lahko z ekstrakcijo mravljinčne kisline iz celic in zatem z ločbo fosfatov po Dowexovih kolonah izmeri skupna akumulacija inozitol fosfatov. Celice se s pomočjo tripsina porazdelijo v dva pladnja s po 12 predelki in vnaprej označijo s 3H-mioinozitolom (0,5 Ci - 2 mCi na ml) za 16-18 ur v brezinozitolnem sredstvu. Zatem sredstvo aspiriramo in celice izperemo bodisi z IX HBSS, 20mM HEPES (pH 7,5) ali z brezserumskim DMEM, IX HBSS, 20 mM HEPES (pH 7,5), ki vsebuje
-1515 agonista, nakar dodamo 20 mM Lici ter celice inkubiramo za želeni čas. Sredstvo aspiriramo in reakcijo ustavimo, tako da dodamo ledeno mrzlo 10 mM mravljinčno kislino, ki služi tudi za ekstrakcijo celičnih lipidov. Inozitol fosfate ločimo s pomočjo ionsko-izmenjevalne kromatografije po Dowexovih kolonah, ki se zatem eluirajo s 5 ml 10 mM mioinozitola in 10 mM mravljinčne kisline. Kolone se nato izpere jo z 10 ml 60 mM natrijevega formiata in 5 mM boraksa, skupni inozitol fosfati pa se izperejo s 4,5 ml IM amonijevega formiata, 0,1 M mravljinčne kisline.
Prednostni GnRH agensi po izumu vključujejo agense, katerih Ki ima vrednost okrog 10 μΜ ali manj. Posebno prednostni GnRH agensi pa so tisti, katerih Kj se nahaja v nanomolskem območju.
Prednostne spojine po izumu so prikazane v naslednji tabeli:
SPOJINA ŠT.
STRUKTURNA FORMULA
mol. masa 492.704
492.704
627.869
465.63
431.577
429.6
475.625
-1616
443.627
443.627
443.584
461.599
446.631
Farmacevtske spojine po izumu vključujejo najmanj en GnRH agens po izumu v količini, ki je učinkovita za supresijo GnRHja, ter inerten ali farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali topilo. Te spojine se lahko pripravijo v obliki enkratnih odmerkov, primernih za načrtovani način uporabe, tj. parenteralni ali oralni.
Za zdravljenje bolezni ali okvar, posredovanih z GnRH agonizmom oz. antagonizmom, se farmacevtska spojina po izumu uporablja v primerni formulaciji, pripravljeni s kombiniranjem terapevtsko učinkovite količine (tj. GnRH-moduliraj oče količine, ki zagotavlja dosego terapevtskega učinka) najmanj enega GnRH agensa po izumu (kot aktivne sestavine) z enim ali več farmacevtsko ustreznimi nosilci ali topili. Take formulacije je možno pripraviti s tradicionalnimi postopki, npr. tako, da sestavine na ustrezen način zmešamo, granuliramo in komprimiramo ali raztopimo na poznane načine. Po želji je moč v farmacevtskem pripravku uporabiti eno ali več različnih aktivnih sestavin, npr. različne GnRH antagoniste.
-1717
Farmacevtski nosilec je lahko trden ali tekoč. Primeri trdnih nosilcev vključujejo laktozo, saharozo, talk, želatino, agar, pektin, gumiarabikum, magnezijev stearat, stearinovo kislino in podobno. Primeri tekočih nosilcev so sladkorni sirup, arašidovo olje, olivno olje, voda ipd. Podobno lahko nosilec ali topilo vsebuje v stroki poznane materiale z zakasnelim ali počasnim sproščanjem, kot sta npr. gliceril monostearat ali gliceril distearat, bodisi samostojno ali pa v kombinaciji z voskom, etilcelulozo, hidroksipropilmetilcelulozo, metilmetakrilatom in podobnim.
Izberemo lahko različne farmacevtske oblike. Če npr. uporabimo nosilec v trdni obliki, ima lahko preparat obliko tablete, trdne želatinske kapsule, praška, kroglice, pilule ali pastile. Količina trdnega nosilca je lahko zelo različna, npr. nekje med 25 mg in 1 g. Če za nosilec uporabimo tekočino, ima lahko preparat obliko sirupa, emulzije, mehke želatinske kapsule, sterilne injekcijske raztopine, suspenzije v ampuli oz. fioli ali pa brezvodne tekoče suspenzije.
Stabilno, vodotopno obliko doziranja lahko pripravimo tako, da farmacevtsko sprejemljivo sol spojine po formuli I raztopimo v vodni raztopini organske ali anorganske kisline, kot je npr. 0,3 M raztopina jantarjeve kisline, bolj prednostno pa citronske kisline. Če ni na voljo topljiva solna oblika, lahko agens raztopimo v enem ali več ustreznih sotopilih. Primeri ustreznih sotopil vključujejo alkohol, propilenglikol, * polietilenglikol 300, polisorbat 80, glicerin in podobno v koncentracijah, ki se gibljejo med 0% in 60% skupnega volumna. V prednostni izvedbi se spojina po formuli I raztopi v DMSO-ju (dimetil sulfoksidu) in razredči z vodo. Pripravek se lahko nahaja tudi v obliki raztopine solne oblike spojine po formuli I v primernem vodnem topilu, npr. vodi ali izotonični solni oz. dekstrozni raztopini.
Farmacevtski pripravki po pričujočem izumu so lahko postopki, kot so npr. mešanje, izdelovanje dražejev, drobljenje, v kapsule, imobilizacija ali Farmacevtski pripravki so lahko formulirani na način z uporabo enega ali več fiziološko sprejemljivih nosilcev, ki vsebujejo inertne ali pomožne snovi, izdelani s tradicionalnimi raztapljanje, granuliranje, emulgiranje, stiskanje liofilizacija.
tradicionalni
-1818 agense po fiziološko raztopina, soli. Za uporabijo je treba raztopina formulaciji skozi katero pronicanje penetranti, izmed v stroki poznanih izbrane tako, da olajšajo procesiranje aktivnih spojin v farmacevtske pripravke. Primerna formulacija se izbere na podlagi predvidenega načina (poti) uporabe.
Za pripravo injekcijskih preparatov se lahko izumu formulira v vodnih raztopinah, prednostno v kompatibilnih pufrih, kakršni so npr. Hanksova Ringerjeva raztopina ali fiziološka po sluzničnih poteh se v primerni za pregrado, prodreti, ti pa se lahko izberejo penetrantov.
Za peroralni vnos se agensi zlahka formulirajo s kombiniranjem aktivnih/e sestavin/e in v stroki poznanih farmacevtsko sprejemljivih nosilcev. Taki nosilci omogočajo, da se spojine po izumu formulirajo v obliki tablet, pilul, dražejev, kapsul, tekočin, gelov, sirupov, židkih snovi, suspenzij in podobnega, kar bo ciljni pacient zaužil po oralni poti. Farmacevtski pripravki za oralno uporabo se lahko izdelajo s kombiniranjem enega ali več agensov in trdne inertne snovi, pri čemer se dobljeno zmes zdrobi v granule, tej zmesi granul pa se po želji dodajo ustrezna pomožna sredstva, nakar se zmes granul procesira, da se dobijo tablete ali jedra za dražeje. Primerne inertne snovi vključujejo polnila, kot so sladkorji (npr. laktoza, saharoza, manitol ali sorbitol) in celulozni preparati (npr. koruzni škrob, pšenični škrob, rižev škrob, krompirjev škrob, želatina, gumi, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijeva karboksimetilceluloza in/ali polivinilpirolidon (PVP)). Po želji se lahko dodajo še dezintegracijska sredstva, kot so npr. zamreženi PVP, agar ali alginova kislina oz. njena sol, npr. natrijev alginat.
Jedra dražejev se prevlečejo s primernimi oblivi. V ta namen se lahko uporabijo koncentrirane raztopine sladkorja, ki lahko po želji vsebujejo tudi gumiarabikum, PVP, Carbopol™ gel, polietilenglikol, titanov dioksid, glazurne raztopine in/ali eno ali več primernih organskih topil. Tabletam ali prelivom za dražeje se lahko dodajo barvila ali pigmenti, ki služijo za identifikacijo ali za označevanje različnih razmerij med deleži aktivnih spojin.
-1919
Farmacevtske oblike, primerne za peroralno uporabo, vključujejo »push-fit« kapsule, izdelane iz želatine, ter mehke, zapečatene kapsule, izdelane iz želatine in plastifikatorja, ki je lahko npr. glicerol ali sorbitol. »Push-fit« kapsule lahko vsebujejo aktivno/e sestavino/e zmešano/e z enim ali več polnili, kot so laktoza, z vezivi, kot so škrobi, in/ali mazivi, kot sta talk ali magnezijev stearat, po želji pa tudi s stabilizatorji. V mehkih kapsulah je lahko aktivna spojina raztopljena ali vmešana kot suspenzija v primerni tekočini, kot so maščobno olje, tekoči parafin ali tekoči polietilenglikol. Poleg tega se lahko doda tudi stabilizatorje. Za peroralno jemanje lahko imajo pripravki obliko tablet ali pilul, formuliranih na tradicionalni način.
Za inhalacijsko rabo se lahko spojine za uporabo po pričujočem izumu prikladno pripravijo v obliki spreja oz. aerosola bodisi v dozi pod pritiskom ali z razpršilcem, primerni potisni plini pa vključujejo diklorodifluorometan, triklorofluorometan, diklorotetrafluoroetan, ogljikov dioksid ali drug ustrezni plin. V primeru aerosola pod pritiskom se lahko za doziranje vgradi primeren ventil, ki odmerja fiksno količino razpršila. Za uporabo z inhalatorji in insuflatorji je moč formulirati npr. želatinske kapsule ali doze, v katerih se nahaja praškasta mešanica agensa in primerne praškaste podlage, kot sta npr. škrob ali laktoza.
Agense je moč formulirati' za parenteralni vnos z injiciranjem, npr. v obliki enkratnih injekcij ali pa kot trajno infuzijo. Formulacije za injiciranje se lahko pripravljajo v obliki enkratnih doz, npr. v ampulah, ali pa v večji embalaži, ki vsebuje več odmerkov in ji je dodano sredstvo za konserviranje. Pripravki lahko imajo obliko suspenzije, raztopine ali emulzije v oljni ali vodni osnovi ter lahko vsebujejo formulacijska sredstva, kot so suspenzijska sredstva, stabilizatorji in/ali disperzijska sredstva.
Farmacevtske formulacije za parenteralno rabo vključujejo vodne raztopine aktivnih spojin v vodotopni obliki. Nadalje je moč suspenzije aktivnih spojin pripraviti v obliki za injiciranje primernih oljnih suspenzij. Primerna lipofilna topila oz. osnove vključujejo maščobna olja, kot je sezamovo
-2020 olje, ali sintetične estre maščobnih kislin, kot so etil oleat ali trigliceridi, ali liposome. Vodne suspenzije za injiciranje lahko vsebujejo snovi za povečanje viskoznosti suspenzije, kot so natrijeva karboksimetil celuloza, sorbitol ali dekstran. Po želji lahko suspenzija vsebuje tudi primerne stabilizatorje ali sredstva za povečanje topnosti spojin, s čimer se omogoči priprava visoko koncentriranih raztopin.
Alternativno je lahko aktivna sestavina v obliki praška in se ji pred uporabo doda primerna osnova, npr. sterilna voda brez pirogena. Spojine se lahko formulirajo tudi v obliki rektalnih preparatov, kot so supozitoriji ali odvajalni klistirji, ki npr. vsebujejo običajne supozitorijske podlage, kot so kakavovo maslo ali drugi gliceridi.
Poleg zgoraj opisanih formulacij je možno spojine formulirati kot uskladiščene preparate. Tovrstne formulacije z dolgim časom delovanja se lahko uporabljajo z implantacijo (npr. subkutano ali intramuskularno) ali z intramuskularno injekcijo. Tako je npr. mogoče formulirati spojine s primernimi polimernimi ali hidrofobnimi materiali (npr. kot emulzijo v sprejemljivem olju) ali ionsko izmenjevalnimi smolami ali zmerno topnimi derivati, npr. v obliki zmerno topne soli.
Primeren farmacevtski nosilec za hidrofobne spojine po izumu je sistem sotopil, ki vključuje benzilalkohol, nepolarno površinsko aktivno snov, organski polimer, ki se meša z vodo, ter vodno fazo. Sistem sotopil je; lahko sistem sotopil z VPD (VPD je raztopina 3% m/v benzilalkohola, 8% m/v nepolarne površinsko aktivne snovi polisorbata 80 ter 65% m/v polietilenglikola 300, preostanek volumna pa odpade na čisti etanol). Sistem sotopil z VPD (VPD:5W) sestoji iz VPD, ki je razredčen s 5-odstotno vodno raztopino dekstroze v razmerju 1:1. Ta sistem sotopil dobro topi hidrofobne spojine, toksičnost dobljene formulacije pa je pri sistemskem dajanju nizka. Jasno je, da lahko razmerja v primernem sistemu sotopil spreminjamo v skladu z želeno topnostjo in toksičnostjo. Možno je celo zamenjati sestavine sistema sotopil: namesto polisorbata 80 lahko npr. uporabimo druge nizko toksične nepolarne površinsko aktivne snovi; frakcijsko razmerje polietilenglikola lahko spreminjamo; dodamo lahko enega ali več biokompatibilnih
-2121 polimerov (npr. PVP) ali pa z njimi nadomestimo polietilenglikol v celoti; in namesto dekstroze lahko uporabimo druge sladkorje ali polisaharide.
Alternativno se lahko uporabijo drugi sistemi vnosa za hidrofobne farmacevtske spojine. Liposomi in emulzije so znani primeri vnosnih sredstev ali nosilcev za hidrofobne medikamente in lahko jih uporabimo za formulacijo ustreznih preparatov. Lahko se uporabijo tudi določena organska topila kot dimetilsulfoksid, kar pa utegne povečati toksičnost. Nadalje lahko za vnos uporabimo sistem s počasnim sproščanjem, kot so npr. polprepustne rešetke trdnih hidrofobnih polimerov, ki vsebujejo terapevtski agens. Izvedencem v stroki so na razpolago in poznani razni materiali s počasnim sproščanjem. Kapsule s počasnim sproščanjem lahko, odvisno od svoje kemične narave, sproščajo spojine v obdobju od nekaj tednov pa do 100 dni ali več. V odvisnosti od kemične narave in biološke stabilnosti terapevtskega agensa je možno z lahkoto uporabiti dodatne postopke za stabilizacijo proteinov.
Farmacevtske zmesi lahko vključujejo tudi primerne nosilce ali inertne snovi v trdni fazi ali v obliki gela. Primeri tovrstnih nosilcev ali inertnih snovi vključujejo kalcijev karbonat, kalcijev fosfat, sladkorje, škrobe, celulozne derivate, želatino in polimere, kot so npr. polietilen glikoli.
Nekatere spojine po izumu je možno pripraviti kot soli s farmacevtsko sprejemljivimi ionskimi dvojicami. Farmacevtsko sprejemljive so lahko soli številnih kislin, vključno s solno, žvepleno, ocetno, mlečno, vinsko, jabolčno, jantarjevo kislino in podobnimi. Sol je praviloma bolj topna v vodnih in drugih protonskih topilih kot pa ustrezne oblike s prostimi hidroksilnimi skupinami.
Razume se, da so konkretni deleži agensov, uporabljenih v zmeseh po pričujočem izumu, spremenljivi in odvisni od konkretnega uporabljenega kompleksa, konkretne formulirane zmesi, načrtovanega načina uporabe ter od konkretnega mesta na telesu, pacienta in bolezni, ki jo zdravimo. Izvedenci v stroki lahko določijo optimalno doziranje za dano kombinacijo pogojev s pomočjo tradicionalnih preizkusov za določanje doziranja na podlagi eksperimentalnih podatkov za dano spojino. Pri peroralni
-2222 uporabi bo recimo dnevni odmerek znašal okvirno nekje med 0,001 in 1000 mg/kg telesne teže, pri čemer si bodo cikli zdravljenja sledili v primernih intervalih. Prejemanje predzdravil se lahso dozira z utežnimi nivoji, ki so kemično enakovredni utež n L; nivojem polno aktivnih spojin.
V nadaljevanju so podani primeri konkretnih farmacevtskih pripravkov po izumu.
Parenteralna zmes: za pripravo za injiciranje primerne farmacevtske zmesi po pričujočem izumu se 100 mg farmacevtsko sprejemljive vodotopne soli spojine po formuli I raztopi v DMSOju, nakar se zmeša z 10 ml 0,9-odstotne sterilne raztopine vode in soli. Z dobljeno zmesjo se napolni dozirna oblika za enkratni odmerek, primerna za injiciranje.
Oralna zmes: za pripravo peroralno uporabne farmacevtske zmesi se 100 mg spojine po formuli I zmeša s 750 mg laktoze. Z dobljeno zmesjo se napolni dozirna oblika za enkratni odmerek, primerna za oralno uporabo, npr. kapsula iz trde želatine.
Sinteza GnRH reagentov in spojin
A. primer gradnika
B. gradniki na osnovi naftalena: z večkratnim zaporednim
Friedel-Craftsovim alkiliranjem se pripravi uporaben acilacijski agens, kot je prikazano spodaj:
Spojina 2 se lahko pripravi na naslednji način:
2,5-dimetil-2,5-heksandiol (200 g, 1,37 mol) smo dodali kot trdni delež 3 litrom koncentrirane solne kisline v veliki erlenmayerici. Diol se je hitro raztopil v solni kislini in iz raztopine se je po nastanku oboril želeni produkt 2,5-dikIoro-2323
2,5-dimetilheksan. Reakcijo smo 4 ure mešali pri sobni temperaturi. Dodali smo 1 liter 50-odstotnega etilacetata v heksanih, nakar smo organski del ločili in večkrat izprali z vodo (dokler ni postal nevtralen na preizkus z lakmusovim papirjem). Organska topila smo odstranili v vakuumu pri sobni temperaturi. Surovi 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksan smo raztopili v heksanih in iztisnili skozi polnilo iz silikagela (v razmerju 10:1) ter izprali s heksani. S tem zadnjim filtracijskim korakom in ko v vakuumu odstranimo organsko topilo, dobimo belo trdno snov. Pridobljenega čistega 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksana je bilo 230 g, izkoristek znaša torej 92%. }H NMR (CDC13, delta): 1,96 (4H, s); 1,61 (12H, s).
S podobnim postopkom smo 2,4-dimetil-2,4-pentandiol pretvorili v 2,4-dikloro-2,4-dimetilpentan. XH NMR (CDC13, delta): 2,42 (2H, s); 1,73 (12H, s).
1,1,4,4,6-pentametil-l,2,3,4-tetrahidronaftalen 4A: Raztopini 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksana 2A (10 g, 54,7 mmol) v toluenu (270 ml, 0,2 M) se v 15-minutnem obdobju postopoma dodaja aluminijev triklorid (5,47 g, 41 mmol) v trdnem agregatnem stanju. Reakcija je zaključena po 10 minutah, kar potrdi preizkus s tankoplastno kromatografijo v heksanih. Preostali aluminijev triklorid počasi 10 minut gasimo z vodo. Dodamo še 250 ml toluena, da ekstrahiramo produkt iz vodne plasti. Organsko plast potisnemo skozi polnilo iz silikagela (40 g) in izperemo s toluenom. Organsko plast v vakuumu odparimo do suhega, da dobimo 1,1,4,4,6-pentametil-l,2,3,4tetrahidronaftalen 4A (11 g, 97-odstotni izkoristek). NMR 1,29 (s, 6H) , 1,28 (s, 6H), 1,69 (s, 4H), 2,32 (s, 3H), 7,22 (d, IH), 7,12 (s, IH), 6,97 (dd, IH).
Metil 5- [ (3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2-furoat 6A: Raztopini 1,1,4,4,6-pentametil1,2,3,4-tetrahidronaftalena 4A (20 g, 99 mmol) in metil 5(klormetil)-2-furoata 5A (17,28 g, 99 mmol) v metilenkloridu (500 ml, 0,2 M) počasi dodajamo aluminijev triklorid (16, 46 g, 124 mmol) kot trdno snov pri vreliščni temperaturi metilenklorida. Raztopino zatem kuhamo še dve uri. Reakcijo preverjamo s tankoplastno kromatografijo v 10-odstotni raztopini etilacetata in heksanov. Reakcijo ohladimo na sobno temperaturo
-2424 in preostali aluminijev triklorid gasimo z vodo v 15-minutnem obdobju. Surovi produkt se ekstrahira z metilenkloridom in iztisne skozi silikagel (80 g) ter izpere z metilenkloridom. Topilo se v vakuumu odpari v sirup. Surovi produkt se prečisti s silikagelom (300 g) v filtracijski koloni s polnilom. Metil 5[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil)-2furoat 6A se izpere z 2-odstotnim etilacetatom v heksanih, s čimer dobimo 15,4 g (46-odstotni izkoristek). NMR 1,25 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,67 (s, 4H), 2,23 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,97 (s, 2H), 5,95 (d, IH), 7,09 (m, 3H).
5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2-furoinska kislina 7A: Raztopini metil 5[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2furoata 6A (15,1 g, 44 mmol) v MeOH (175 ml) in vodi (175 ml) se doda raztopina NaOH (3,53 g, 88,3 mmol) v vodi (29 ml). Reakcijska zmes se meša čez noč. Ko s tankoplastno kromatografijo ugotovimo, da je reakcija končana, raztopino nakisamo z 1 M HCI do pH 2. Surovi produkt se z etilacetatom ekstrahira v organsko plast ter skoncentrira, tako da dobimo 5[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2furoinsko kislino 7A (15,0 g, 99-odstotni izkoristek). NMR 1,26 (s, 6H) , 1,28 (s, 6H) , 1,68 (s, 4H), 2,24 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,01 (d, IH), 7,10 (s, 2H), 7,23 (d, IH).
5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2-furoilklorid 8A: Raztopini 5-[ (3,5,5,8,8pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoinske kisline 7A (20,15 g, 61,77 mmol) v metilenkloridu (310 ml) se doda tionilklorid (45 ml, 617 mmol). Reakcijo kuhamo 5 ur, nakar se zopet doda enaka količina tionilklorida (45 ml, 617 mmol). Reakcijo mešamo čez noč pri sobni temperaturi. Raztopino skoncentriramo v sirup in iztisnemo skozi polnilo iz silikagela (50 g), izperemo s 3-odstotnimi heksani ter skoncentriramo v vakuumu, kar nam da 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro2-naftalenil)metil]-2-furoil klorid 8A (17 g, 80-odstotni izkoristek). NMR 1,26 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,68 (s, 4H), 2,25 (s, 3H) , 4,00 (s, 2H), 6,11 (d, IH), 7,10 (s, IH), 7,11 (s, IH), 7,41 (d, IH).
-2525
V teh reakcijskih pogojih je moč pripraviti še nadaljnje gradnike, ki vsebujejo različne funkcionalne skupine, zajete v zgoraj navedeni splošni formuli.
C. Primeri aciliranja:
Spodnja shema prikazuje različne primere, v katerih se lahko uporabi spodaj navedeni splošni sintetični postopek za
Amini se raztopijo ali vmešajo kot suspenzija v diklormetan, dikloretan, etilacetat, acetonitril ali podobno (s koncentracijo 0,2 M), nakar se doda kisli kloridni reagent (1,00 mmol ekvivalent). Mešanici se 'doda trietilamin (5,00. mmol ekvivalentov), nakar se 12-48 ur meša pri sobni temperaturi. Topila se odstrani v vakuumu. Produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s primernim elucijskim topilom (npr. s heksani in etilacetatom v razmerju 3:1). Topila se v vakuumu odstranijo in dobi se acilirani produkt.
Alternativno se lahko reakcijska mešanica razredči z diklormetanom (petkratna količina uporabljenega diklormetana) in izpere z nasičenim natrijevim bikarbonatom. Organska plast se suši z magnezijevim sulfatom in prefiltrira. Produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s primernim elucijskim topilom (npr. s heksani in etilacetatom v razmerju 3:1). Topila se v vakuumu odstranijo, da dobimo acilirani produkt.
Z uporabo splošnega reakcijskega postopka je možno zlahka izdelati veliko število spojin in preizkusiti njihovo
-2626 reaktivnost bodisi kot čistih ali nečistih materialov. Reakcijski postopek se dobro obnese za aniline, amine, benzilamine, hidrazine, hidrazide, alkohole in podobno.
Spodaj so prikazani konkretni primeri različnih struktur, aciliranih po splošnem postopku:
SPOJINA ST.
STRUKTURA mol. masa
CH
475.625
446.631
492.704
492.704
627.869
465.63
431.577
429.6
-2727
443.627
443.627
443.584
461.599
-2828
C. Sinteza in aciliranje spojin, ki vsebujejo gvanidin
Korak 1 - priprava zaščitene spojine z l-(N,N'-diBoc)~ gvanidinmet Hiranjem: alternativna koraka 1 (A) in 1(B) podajata dva splošna postopka 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinmetiliranja.
Korak 1 (A) : Raztopini diamina (2,00 mmol ekvivalenta) v THF-ju (0,7 M) se doda raztopina 1-H-pirazol-l-(N,N-bis(tertbutoksikarbonil)karboksamidina) (1,00 mmol ekvivalent) v THF-ju (0,7 M). Raztopino mešamo pri sobni temperaturi 3 ure, ali pa dokler s tankoplastno kromatografijo ni več zaznati nobene transformacije. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku, s čimer dobimo sirupast ostanek, katerega razredčimo z etilacetatom (~l,5-kratni volumen THF-ja, uporabljenega v reakciji, ali pa volumen topila, ki je potreben, da se raztopi dobljeni ostanek) ter izpiramo z vodo do nevtralnega pH. Organska plast se izpere s slanico, suši z MgSO4 in skoncentrira. Produkt prečistimo s
-2929 kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s primernim elucijskim topilom (ki ga zlahka določimo npr. tako, da za izhodišče vzamemo 5-odstotno raztopino MeOH v diklormetanu). Topila v vakuumu odstranimo, da dobimo 1-(N,N'-diBoc)gvanidinometil-vezan-amin. Za pripajanje zaščitene N,N'-diBocgvanidinske enote na diamine se lahko nadalje uporabijo tudi drugi reagenti, denimo 1,3-bis(tert-butoksikarbonil)-2-metil-2tiopsevdourea (CAS št. 107819-90-0). Alternativno se lahko 1-Hpirazol-1-(Ν,Ν-bis(tert-butoksikarbonil)karboksamidin) doda direktno v trdni obliki, ne pa v obliki raztopine, kot je bilo opisano zgoraj.
Korak 1(B): Raztopini diamina (1,00 mmol ekvivalent) v THFju (0,07 M) se v 10-minutnem obdobju postopoma dodaja 1-Hpirazol-1-(Ν,Ν-bis(tert-butoksi-karbonil)karboksamidin) (1,00 mmol ekvivalent). Raztopino mešamo 0,5 ure pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku, s čimer dobimo sirupast ostanek, ki ga razredčimo z etilacetatom (0,5kratni volumen THF-ja, uporabljenega v reakciji, ali pa volumen topila, ki je potreben, da se raztopi dobljeni ostanek) ter dvakrat izperemo z vodo. Plasti ločimo in produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu ter izperemo s 100odstotnim etilacetatom, da odstranimo vse nepolarne nečistoče, zatem pa s 100-odstotnim izopropilnim alkoholom, da dobimo čisti produkt. Topila v vakuumu odstranimo, da dobimo želeni produkt. Tipična razmerja tankoplastne kromatografije so 15:85:0,1 metanol/kloroform/ocetna kislina. Tipični izkoristek se giblje med 40% in 44% želenega zaščitenega produkta.
Korak 2 - redukcijsko aminiranje (fakultativno): Lahko se opravi redukcijsko aminiranje na ustrezen način. O redukcijskem aminiranju aldehidov in ketonov z natrijevim triacetoksiborhidridom na splošno pišejo Abdel-Magid in sodelavci, J. Org. Chem., 1996, 61:3849. V nadaljevanju opisujemo dva alternativna postopka za redukcijsko aminiranje.
Korak 2(A): 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftaldehid (1 mmol ekvivalent) in 1-(N,N'-diBoc)gvanidinometil-vezan-amin (1,00 mmol ekvivalent) se raztopita v metanolu (0,09 M). Zatem se doda 1-odstotni ledocet, raztopljen v metanolu (10% volumna uporabljenega metanola), nato pa še
-3030
NaCNBH3 (1,00 mmol ekvivalent), vsebina reakcije pa se meša čez noč. Reakcijo preizkusimo s tankoplastno kromatografijo, da odkrijemo tri komponente (aldehid, želeni produkt in začetni gvanidinov derivat). Reakcijo ustavimo z dodajanjem vode (50% volumna uporabljenega metanola), ekstrahiramo z diklormetanom (z 10-kratnim volumnom uporabljenega metanola) ter izperemo z nasičenim natrijevim bikarbonatom. Organska plast se osuši z magnezijevim sulfatom, prefiltrira in skoncentrira. Produkt se prečisti s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izpere z ustreznim elucijskim topilom (npr. z etilacetatom v heksanih v razmerju 3:1, da se odstrani preostali aldehid, nakar se izpere z etilacetatom v heksanih v razmerju 1:1), s čimer se dobi želeni produkt redukcijskega aminiranja. V nekaterih primerih lahko z 2-urnim segrevanjem do vrelišča pospešimo reakcijo tvorjenja imina. Prim. tudi Abdel-Magid in sodelavci, J. Org. Chem., 1996, 61:3849, kjer je opisano redukcijsko aminiranje aldehidov in ketonov z natrijevim triacetoksiborhidridom.
Korak 2 (B) : 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftaldehid (1,00 mmol ekvivalent) in 1-(N,N'-diBoc)gvanidinometil-vezan-amin (1,00 mmol ekvivalent) se raztopita v metanolu (0,09 M). Zatem se doda NaBH4 (1,00 mmol ekvivalent) (bodisi v etanolu po dodatnih postopkih v majhnem merilu, ki so podani v nadaljevanju, ali pa previdno kot trdno snov), vsebina reakcije pa se meša čez noč. Reakcijo preizkusimo s tankoplastno kromatografijo, da odkrijemo tri -komponente ' (aldehid, želeni produkt in začetni gvanidinov derivat) . Reakcijo ustavimo z dodajanjem vode (50% volumna uporabljenega metanola), ekstrahiramo z diklormetanom (z 10-kratnim volumnom uporabljenega metanola) ter izperemo z nasičenim natrijevim bikarbonatom. Organska plast se suši z magnezijevim sulfatom, prefiltrira in skoncentrira. Produkt se prečisti s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izpere z ustreznim elucijskim topilom (ki ga bo znal izbrati vsak izvedenec v stroki, ali pa npr. z etilacetatom v heksanih v razmerju 3:1, da se odstrani preostali aldehid, nakar se izpere z etilacetatom v heksanih v razmerju 1:1), s čimer se dobi želeni produkt redukcijskega aminiranja. V nekaterih primerih lahko z 2-urnim segrevanjem do vrelišča pospešimo reakcijo tvorjenja imina.
-3131
Korak 3 - aciliranje: Produkti redukcijskega aminiranja (1,00 mmol ekvivalent) se raztopijo v diklormetanu (~0,2 do 0,05 M, odvisno od topnosti substratov), nakar se doda trietilamin (2,00 mmol ekvivalenta) in reagent 2-furoilklorid 8 (1,00 mmol ekvivalent) . Vsebina reakcije se meša čez noč pri sobni temperaturi (ST). Reakcijska mešanica se razredči z diklormetanom (5-kratno količino uporabljenega diklormetana) in izpere z nasičenim natrijevim bikarbonatom. Organska plast se suši z magnezijevim sulfatom in prefiltrira. Produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s primernim elucijskim topilom (npr. s heksani in etilacetatom 3:1). Topila se v vakuumu odstranijo in dobimo acilirani produkt.
Korak 4 - odstranjevanje zaščite z bazne skupine: Produkt acilacijskega koraka (1,00 mmol ekvivalent) se raztopi v 25- do 50-odstotni raztopini TFA v diklormetanu (0,02 M), vsebina reakcije pa se meša pri sobni temperaturi (15-20 minut; raztopina postane rahlo rdečkasto-oranžna). Vsebina reakcije se zatem meša še 1 h 20 min. oziroma do takrat, ko je odstranjevanje zaščite z BOC končano. Reakcijo ustavimo s koncentriranjem v vakuumu, nakar dodamo vodo/acetonitril (0,006 M) in liofiliziramo čez noč. Končni produkt prečistimo s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Topila odstranimo v vakuumu (izkoristek med 30 in 50%) , nakar dobimo produkt.
Alternativni postopek za odstranjevanj e Ν,Ν'-bis-BOC gvanidinov z uporabo kositrovega tetraklorida, s katerim se lahko dobijo ustrezne soli, gvanidinovi kloridi, je opisan v Miel in sodelavci, Tetrahedron Letters, 1997, 38:7865-7866.
Spojino 9 lahko pripravimo z zgoraj opisanimi koraki, če preskočimo korak 2, kot prikazuje shema:
-3232
ο ο
24Α 2
Priprava reagentov: Za sintezo spojin primerne reagente lahko dobimo ali pripravimo s postopki, ki so poznani v stroki. Za reakcije v majhnem merilu se npr. obnese priprava prostih aminov iz običajnih oblik soli ih široko dostopnih reagenčnin raztopin. Glej tudi Abdel-Magid in sodelavci, »Reductive amination of aldehydes and ketones with sodium triacetoxyborohydride,« J. Org. Chem., 1996, 61:3849.
Raztopine prostih baz v metanolu se lahko pripravijo iz hidroklorida, dihidroklorida, hidrobromida ali drugih soli, če je prosta baza topna v metanolu. Pri tem postopku je treba po dodajanju natrijevega metoksida paziti, da ne pride do stika z zrakom, kajti aminske proste baze in še zlasti primarni amini vežejo ogljikov dioksid iz zraka in tvorijo soli. 10 ml 0,1 M raztopine proste baze v metanolu lahko pripravimo na sledeči način. Natehtamo 1,0 mmol monohidrokloridne soli v tarirano erlenmayerico, opremljeno z mešalno palico, ter dodamo 7 ml metanola. Med mešanjem dodamo v brozgo 229 ml (1,00 mmol, 1
-3333 ekvivalent) natrijevega metoksida v metanolu (utežno 25%, 4,37 M), zamašimo erlenmayerico in mešanico energično mešamo 2 uri. Videz brozge se bo postopoma spreminjal, ker bo nastajala finejša, mlečna oborina natrijevega klorida. Brozgo prefiltriramo skozi 15-ml srednje velik glaziran steklen lijak, izperemo filtrsko ohišje z 1-2 ml metanola, pretočimo filtrat v 20-mililitrsko fiolo in z metanolom razredčimo na 10 ml. Teoretično dobimo skoraj 59 mg natrijevega klorida, vendar zaradi slabe topnosti v metanolu izkoristek ponavadi ni količinsko relevanten. Za dihidrokloridno sol je potrebno dodati še en ekvivalent natrijevega metoksida (458 ml).
Raztopina 0,5 M natrijevega borohidrida v etanolu se lahko pripravi na sledeči način. Natrijev borohidrid (520 mg, 13,8 mmol) se meša ~2-3 minute v čistem (nedenaturiranem) brezvodnem etanolu (25 ml). Suspenzijo prefiltriramo skozi srednje velik glaziran steklen lijak, da odstranimo malo količino neraztopljene trdnine (tipično okrog 5% skupne mase borohidrida oziroma 25 mg) . Filtrat mora imeti videz brezbarvne raztopine, ki sprošča le malo vodika. To raztopino je treba nemudoma uporabiti, ker se že v nekaj urah bistveno razkroji, tako da nastane želatinasta oborina. Natrijev borohidrid je higroskopen, zato ga ne smete izpostavljati zraku, kar dosežete tako, da naredite raztopino takoj po tehtanju trdnine. Topnost natrijevega borohidrida v etanolu je pri sobni temperaturi 4odstotna. To ustreza nekaj več kot 0,8 M. Vendar pa včasih manjša količina trdnine ostane neraztopljena ne glede na pripravljeno koncentracijo, in to celo po > 5-minutnem mešanju.
Za sintezo spojin po formuli I v majhnem merilu se lahko z reakcijami, ki so opisane v nadaljevanju, pripravijo različni reaktanti, uporabni za zgoraj opisano reakcijsko shemo. Tako kot v celotni specifikaciji, so tudi v naslednjih opisih vse temperature podane v stopinjah Celzija, vsi deleži in odstotki pa so utežni, razen če je navedeno drugače.
Različne izhodiščne materiale in druge reagente je moč kupiti pri komercialnih dobaviteljih, kot sta Aldrich Chemical Company ali Lancaster Synthesis Ltd., in jih uporabiti brez dodatnega prečiščevanja, razen če je navedeno drugače. Tetrahidrofuran (THF) in N,N-dimetilformamid (DMF) sta bila
-3434 nabavljena pri družbi Aldrich v steklenicah SureSeal® in uporabljena neposredno v dobavljeni obliki. Vsa topila se prečistijo s standardnimi metodami stroke, razen če je navedeno drugače.
V nadaljevanju opisane reakcije se opravijo pod pozitivnim tlakom oziroma s sušilno cevjo in pri sobni temperaturi (razen če je navedeno drugače), v brezvodnih topilih, reakcijske posode pa so opremljene z gumijastimi čepi, da je omogočeno injektiranje substratov in reagentov. Steklena oprema se suši v peči in/ali na toploti. Analitična tankoplastna kromatografija se opravi na silikagelu na steklenih pladnjih 60°F 254 (Analtech (0,25 mm)), ki se izperejo z ustreznimi razmerji topil (V/V). Reakcije se preizkusijo s tankoplastno kromatografijo in ustavijo na osnovi porabljenega izhodiščnega materiala.
Pladnji s šobami se vizualizirajo s p-anizaldehidnim reagentom v spreju ali fosfomolibdenskim kislim reagentom (Aldrich Chemical, 20 utežnih odstotkov v etanolu) in aktivirajo s toploto. Preizkuse tipično opravimo tako, da volumen reakcije podvojimo z reakcijskim ali ekstrakcijskim topilom, nakar izperemo z navedenimi vodnimi raztopinami, in sicer s 25 volumskimi odstotki ekstrakcijskega volumna (če ni navedeno drugače). Raztopine produktov se sušijo z brezvodnim Na2SO4, nakar se prefiltrirajo, medtem ko se izparevanje topil izvrši pri zmanjšanem tlaku v rotacijskem evaporatorju kot navedeno, topila pa se odstranijo v vakuumu. Hitra kolonska kromatografija (Stili in sodelavci, A. J. Org. Chem., 1978, 43:2923) se izvaja s hitrim silikagelom Bakerjeve stopnje (47-61 mm) in z razmerjem med silikagelom in surovim materialom okoli 20:1 do 50:1, razen če je navedeno drugače. Hidrogenoliza se izvaja pri navedenem tlaku ali pri atmosferskem tlaku.
^H-NMR spektri se beležijo z Brukerjevo napravo, ki deluje na 300 MHz, medtem ko se 13C-NMR spektri beležijo ob delovanju na 75 MHz. NMR spektri se pridobijo kot raztopine CDC13 (navedene v delih na milijon), pri čemer se kot referenčni standard uporabi kloroform (7,25 delov na milijon in 77,00 delov na milijon) ali CD3OD (3,4 in 4,8 delov na milijon ter 49,3 delov na milijon) ali pa interni tetrametilsilanov standard (0,00 delov na milijon) , kjer je to primerno. Po potrebi se uporabljajo tudi
-3535 druga NMR topila. Ko se navajajo multiple konice, so rabljene naslednje okrajšave: s=singlet, d=dublet, t=triplet, m=multiplet, br=razširjen, dd=dublet dubletov, dt=dublet tripletov. Če so podane sklopitvene konstante, so te navedene v hercih.
Infrardeči spektri se beležijo na Perkin-Elmerjevem FT-IR spektrometru kot čista olja, kroglice KBr ali raztopine CDC13; če so podane, so navedene v valovnih številih (cm-1) . Masni spektri so dobljeni z uporabo LSIMS ali elektrospreja. Vsa tališča so nekorigirana.
Priprava gradnika 1-H-pirazol-l-karboksamidina:
l-H-pirazol-l-karboksamidin se pripravi po postopku Bernatowitza in sodelavcev, J. Org. Chem., 1992, 57:2497-2502 (in tam navedenih referencah) ter zaščiti z di-tertbutildikarbonatom, da se dobi 1-H-pirazol-l-(N,N-bis(tertbutoksikarbonil)karboksamidin), kot opisujejo Drake in sodelavci, Synth.r 1994, 579-582.
Priprava_1- (N, N' -diBoc) -gvanidinometil-4aminometilcikloheksana:
Raztopini 1,4-bis-aminometil-cikloheksana 22A (20 g, 0,14 mol) v THF-ju (200 ml) se doda raztopina 1-H-pirazol-l-(N,Nbis(tert-butoksikarbonil)karboksamidina) 21A (22,0 g, 0,07 mol) v THF-ju (100 ml) . (Pripomniti velja, da ni potrebno, da bi bil
-3636 l-H-pirazol-l-N,N-bis(tert-butoksikarbonil)karboksamidin) raztopljen v THF-ju; v proces se lahko doda čist kot trdna snov.) Raztopino mešamo 3 ure pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku, da se dobi sirupast ostanek, ki se razredči z etilacetatom (500 ml) ter izpira z vodo do nevtralnega pH. Organska plast se izpere s slanico, osuši z MgSO4 ter skoncentrira. Produkt se prečisti s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izpere s 5-odstotnim MeOH v diklormetanu. Topila se odstranijo v vakuumu in dobi se 11,6 g (43-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-4aminometilcikloheksana (spojina 23A). XH NMR (CDC13) δ 11,5 (br s, IH), 8,35 (br s, IH), 3,26 (dt, 2H), 2,52 (dd, 2H), 1,82-0,97 (m, 28H, s singletom pri 1,5).
Alternativno je moč 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3aminometilcikloheksan pripraviti na sledeči način. Raztopini cis/trans 1,4-bis-aminometil-cikloheksana (9,0 g, 63,3 mmol) v THF-ju (903 ml, 0,07 M) se postopoma (skozi 10-minutno obdobje) dodaja 1-H-pirazoi-l-l(N,N-bis(tertbutoksikarbonil) karboksamidin) v trdni obliki (19,6 g, 63,3 mmol). Raztopina se meša 0,5 ure pri sobni temperaturi. Topilo se odstrani pri zmanjšanem tlaku, da dobimo sirupast ostanek, ki ga razredčimo z etilacetatom (500 ml) in dvakrat izperemo z vodo. Plasti ločimo, produkt pa prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s 100-odstotnim etilacetatom, da se odstranijo morebitne nepolarne nečistoče, nakar sledi izpiranje s 100-odstotnim izopropilnim alkoholom, da dobimo čisti produkt. Topila se odstranijo v vakuumu in dobimo 10,2 g (42-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-4aminometilcikloheksana. 4H NMR (CDC13) δ 11,5 (br s, IH), 8,35 (br s, IH), 3,26 (dt, 2H), 2,52 (dd, 2H), 1,82-0,97 (m, 28H, s singletom pri 1,5) .
Redukcijsko aminiranje:
-37- 37 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaldehid (0,2021 g, 0,88 mmol) in 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-4aminometilcikloheksan (spojina 23A, 0,337 g, 0,88 mmol) se raztopita v metanolu (10 ml) . Doda se 1-odstotna raztopina ledocta v metanolu (100 μΐ) , zatem pa še NaCNbH3 (55,4 mg, 0,88 mmol, 1,0 ekvivalent), nakar se vsebina reakcije meša čez noč. Reakcijo preizkusimo s tankoplastno kromatografijo, da odkrijemo tri komponente (aldehid, želeni produkt in začetni gvanidinov derivat). Reakcijo ustavimo z dodajanjem vode (~5 ml), ekstrahiramo z diklormetanom (~100 ml) ter izperemo z nasičenim natrijevim bikarbonatom. Organska plast se osuši z magnezijevim sulfatom, prefiltrira, skoncentrira in izpere s kolonsko kromatografijo z etilacetatom in heksani v razmerju 3:1, da se odstrani preostali aldehid, nakar se izpere z etilacetatom v heksanih v razmerju 1:1, kar nam da želeni produkt (spojino 25A, cikloheksil, mešanico cis/trans). Topila odstranimo v vakuumu (tipični izkoristki se gibljejo nekje med 50 in 80%).
Priprava aciliranega derivata in naknadno odstranjevanje zaščite z gvanidina:
25A
50%
TFACRCl.
--K
2SA
o
K0AAK4
Produkt redukcijskega aminiranja 25A (1,0 ekvivalent) se raztopi v diklormetanu (10-15 ml) , nakar se doda trietilamin (2 ekvivalenta) in reagent 2-furoilklorid (1,00 ekvivalent).
-3838
Vsebina reakcije se meša čez noč pri sobni temperaturi. Reakcijo se razredči z diklormetanom (50 ml) in izpere z nasičenim natrijevim bikarbonatom. Organska plast se osuši z magnezijevim sulfatom, prefiltrira, prečisti s kolonsko kromatografijo ter izpere s heksani in etilacetatom v razmerju 3:1. Topila se v vakuumu odstranijo in dobimo spojino 26A.
Produkt acilacijske reakcije 26A (1,0 ekvivalent) se raztopi v 50-odstotni raztopini TFA v diklormetanu (10-25 ml) , vsebina reakcije pa se meša pri sobni temperaturi (15-20 minut; raztopina postane rahlo rdečkasto-oranžna). Vsebina reakcije se zatem meša še 1 h 20 min., da se dovrši odstranjevanje zaščite. Reakcijo se ustavi s koncentriranjem v vakuumu, nakar se doda voda/acetonitril (~50 ml) in liofilizira čez noč. Končni produkt prečistimo s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Topila odstranimo v vakuumu, s čimer dobimo spojino 27A.
V nadaljevanju opisani postopki se nanašajo na pripravo primerov spojin (e)-(k). Spojine (e)-(k) se lahko na zgoraj opisane načine uporabijo za pridobivanje ustreznih nezaščitenih (tj. s prostim gvanidinilom) spojin s pomočjo hidrolize v kislih pogojih.
Priprava_1- (N, N' -diBoc) -gvanidinometil-3aminometilcikloheksana:
(e)
Raztopini cis/trans-1,3-bis-aminometilcikloheksana (7,5 g, 52,8 mmol) v THF-ju (30 ml) se v roku 0,5 ure dodaja raztopina 1,3-bis(tert-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopsevdouree (7,65 g, 26,3 mmol) v THF-ju (40 ml). Raztopino mešamo 5 ur pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku in produkt
-3939 prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu z uporabo mešanice metilenklorida in metanola kot elucijskega sredstva, kar nam da 2,2 g (22-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)gvanidinometil-3-aminometilcikloheksana (spojine (e) ) . ^-H NMR (CDClj) δ 11,53 (br s, IH), 8,40 (br s, IH), 3,28-3,30 (m, 2H), 2,54-2,61 (m, 2H) , 1,81 (brs, 2H), 1,27-1,58 (m, 26H), 0,89 (m, IH), 0,65 (m, IH).
Alternativno se lahko spojina (e) pripravi na sledeči način. Raztopini cis/tra.ns 1,3-bis-aminometilcikloheksana (10,0 g, 70,3 mmol) v THF-ju (1000 ml, 0,07 M) se postopoma (v obdobju 10 minut) dodaja 1-H-pirazol-l-(N,N-bis(tertbutoksikarbonil)karboksamidin) v trdni obliki (21,8 g, 70,3 mmol). Raztopina se pri sobni temperaturi meša 0,5 ure. Topilo se odstrani pri zmanjšanem tlaku, da dobimo sirupast ostanek, ki ga razredčimo z etilacetatom (500 ml) in dvakrat izperemo z vodo. Plasti ločimo, produkt pa prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s 100-odstotnim etilacetatom, da odstranimo morebitne nepolarne nečistoče, nakar ga izperemo s 100-odstotnim izopropilnim alkoholom, kar nam da čisti produkt. Topila se odstranijo v vakuumu, da dobimo 11,4 g (41-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3aminometilcikloheksana. XH NMR (CDCI3) δ 11,53 (br s, IH), 8,40 (br s, IH), 3, 28-3,30 (m, 2H) , 2,54-2,61 (m, 2H) , 1,81 (br s,
2H), 1,27-1,58 (m, 26H), 0,89 (m, IH), 0,65 (m,,IH).
Priprava 1- (N, N' -diBoc) -gvanidinometil^-aminometilbenzena:
(30 ml) se v obdobju 0,5 ure dodaja raztopina 1,3-bis(tertbutoksikarbonil)-2-metil-2-tiopsevdouree (6,63 g, 22,9 mmol) v
-4040
THF-ju (40 ml). Raztopino mešamo 5 ur pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku in produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu z uporabo mešanice metilenklorida in metanola kot eluenta, s čimer dobimo 8,0 g (92-odstotni izkoristek) 1-(N,N' -diBoc)-gvanidinometil-4aminometilbenzena (spojine (f)). 1H NMR (CDCl3) δ 11,54 (br s, IH), 8,56 (br s, IH), 7,29 (s, 4H) , 4,60 (d, 2H), 3,86 (s, 2H) , 1,64 (br s, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,48 (s, 9H).
Priprava 1-(N,N' -diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilbenzena:
(g)
V raztopino m-ksililendiamina (7,14 g, 52,2 mmol) v THF-ju (30 ml) se tekom 0,5 ure dodaja raztopina 1,3-bis(tertbutoksikarbonil)-2-metil-2-tiopsevdouree (7,57 g, 26,1 mmol) v THF-ju (40 ml). Raztopino mešamo 5 ur pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku in produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu z uporabo mešanice metilenklorida in metanola kot eluenta, s čimer dobimo 7,9 g (80-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3aminometilbenzena (spojine (g)). NMR (CDC13) δ 11,54 (br s, IH), 8,58 (br s, IH), 7,19-7,34 (m, 4H), 4,62 (d, 2H), 3,86 (s, 2H), 1,83 (br s, 2H), 1,52 (s, 9H) , 1,48 (s, 9H) .
Priprava 1-(N,N'-diBoc)-gvanidin-4-aminobutana:
-4141
V raztopino 1,4-diaminobutana (4,15 g, 47,1 mmol) v THF-ju (30 ml) se tekom 0,5 ure dodaja raztopina 1,3-bis(tertbutoksikarbonil) -2-metil-2-tiopsevdouree (6,83 g, 23,6 mmol) v THF-ju (40 ml). Raztopino mešamo 5 ur pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku in produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu z uporabo mešanice metilenklorida in metanola kot eluenta, s čimer dobimo 3,0 g (40-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidino-4-aminobutana (spojine (h)). ΧΗ NMR (CDCl3) δ 11,49 (br s, IH), 8,35 (br s, IH), 3,42-3,47 (m, 2H), 2,72-2,76 (t, 2H), 0,86-1,65 (m, 24H).
Alternativni postopek za pripravo spojine (h) je sledeč. Raztopini 1,4-diaminobutana (6,0 g, 68,1 mmol) v THF-ju (972 ml, 0,07 M) se tekom 10 minut postopoma dodaja 1-H-pirazol-l-(N,Nbis(tert-butoksikarbonil)karboksamidin) v trdni obliki (21,5 g, 68,1 mmol). Raztopina se meša 0,5 ure pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku, da dobimo sirupast ostanek, ki ga razredčimo z etilacetatom (500 ml) in dvakrat izperemo z vodo. Plasti ločimo, produkt pa prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu in izperemo s 100-odstotnim etilacetatom, da odstranimo morebitne nepolarne nečistoče, nakar ga izperemo s 100-odstotnim izopropilnim alkoholom, kar nam da čisti produkt. Topila se odstranijo v vakuumu, da dobimo 10,0 g (4 4-odstotni izkoristek) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidino-4-aminobutana. XH NMR (CDC13) δ 11,49 (br s, IH), 8,35 (br s, IH), 3,42-3,47 (m, 2H), 2,72-2,76 (t, 2H), 0,86-1,65 (m, 24H).
-4242
Priprava l-N,N-dimetilaminometil-4-aminometilbenzena:
N,
CN
Bocu-THF
(i)
V raztopino 1-N,N-dimetilaminometil-4-karbonitrilbenzena (4,8 g, 30 mmol) v THF-ju se doda 1 M .· raztopina borantetrahidrofuran kompleksa (90 ml). Raztopino segrevamo v dušikovi atmosferi pri vreliščni temperaturi 16 ur. Ko se ohladi na sobno temperaturo, ji dodamo 1 M raztopino HCI v metanolu (100 ml). Reakcijsko mešanico segrevamo pri vrelišču 3 ure. Produkt, ki se usede, zberemo s filtriranjem, izperemo z dietiletrom in sušimo v vakuumu, kar nam da 5,9 g (83-odstotni izkoristek) produkta v obliki hidrokloridne soli (spojine (i)): NMR (DMSO-d6) δ 8,65 (br s, 3H) , 7,55 (dd, 4H) , 4,25 (s, 2H) ,
3,98 (s, 2H), 2,62 (s, 6H).
Priprava 1-(N,N' -diBoc)-gvanidinometil-2-aminometilbenzena:
(j) _
Raztopini o-ksililendiamina (7,14 g, 52,5 mmol) v THF-ju (30 ml) se tekom 0,5 ure dodaja raztopina 1,3-bis(tertbutoksikarbonil)-2-metil-2-tiopsevdouree (7,57 g, 26,1 mmol) v
-4343
THF-ju (40 ml) . Raztopino mešamo 5 ur pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku in produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu z uporabo mešanice metilenklorida in metanola kot elucijskega sredstva, s čimer dobimo 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilbenzen (spojino (j))
Alternativno se lahko spojina (j) pripravi po vzoru alternativnega postopka, opisanega pri spojini (e).
Priprava_1- (N,N' -diBoc) -gvanidinometil-2aminometilcikloheksana:
(k)
Raztopini cis/trans-1,2-bis-aminometilcikloheksana (7,5 g, 52,8 mmol) v THF-ju (30 ml) se v roku 0,5 ure dodaja raztopina 1,3-bis(tert-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopsevdouree (7,65 g, 26,3 mmol) v THF-ju (40 ml). Raztopino mešamo 5 ur pri sobni temperaturi. Topilo odstranimo pri zmanjšanem tlaku in produkt prečistimo s kolonsko kromatografijo na silikagelu z uporabo mešanice metilenklorida in metanola kot elucijskega sredstva, s čimer dobimo 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-2aminometilcikloheksan (spojino (k)).
Alternativno se lahko spojina (k) pripravi po vzoru alternativnega postopka, opisanega pri spojini (e).
D. pirimidinske spojine
Pirimidini se lahko uporabijo po sledečih postopkih:
-4444
Splošni postopek za pripravo spojin, ki vsebujejo pirimidin, je sledeči. Raztopini 1,3 diamina 29A v THF-ju se doda 28A, nakar se vsebina 12 ur segreva pri vreliščni temperaturi. Topila se odstranijo v vakuumu, želeni adukt pa se prečisti s kolonsko kromatografijo. Čisti 31A se acilira po splošnem postopku, kot je podan zgoraj za pridobivanje 11.
Izvedencu v stroki bo jasno, da je možno na podlagi zgoraj navedenih navodil pripraviti celo vrsto spojin po izumu. Doslej opisane kemične reakcije so splošno uporabne 'za pripravo GnRH agensov po izumu. Tako si bo izvedenec v stroki zlahka zamislil, kakšne spremembe bi bile potrebne, da se na podoben način pripravijo še drugi GnRH agensi; take spremembe so npr.: zaščita skupin, ki interferirajo, ali prilagoditev za uporabo drugih reagentov in/ali rutinske spremembe reakcijskih pogojev.
IN VITRO FARMAKOLOŠKO VEZANJE LIGANDOV
Celične opne, pripravljene iz človeških embrionalnih ledvičnih celic 293, stabilno transficiranih s cDNA za človeški GnRH receptor, smo suspendirali v pufru za preizkus vezanja, ki je vseboval: 50 mM HEPES-a, 1 mM EDTA-ja, 2,5 mM MgCl2 m 0,1% albumina govejega seruma. Membrane (skupno 5-50 gg proteinov na predelek, vsebujoč okoli 10-100 fmol GnRH receptorja) smo .eno uro inkubirali v duplikatu v pladnjih s 96 predelki s skupnim
-4545 volumnom 200 μΐ pri sobni temperaturi skupaj s 125I-GnRH-A (okrog 0,05 nM) in testnimi spojinami. Vse spojine so bile raztopljene v 1-odstotnem DMSO-ju (končna preizkusna koncentracija) v pufru za preizkus vezanja. V prisotnosti 100 nM GnRH-ja je bilo ugotovljeno nespecifično vezanje. Reakcije smo ustavili s hitrim filtriranjem na Packardovih GF/C filtrih s 96 predelki, namočenih v 0,1-odstotnem polietileniminu. Filtre smo trikrat izprali s PBS pufrom, posušili in prešteli s tekočinsko scintilacijo na Packardovem Topcountu.
Aktivnosti spojin pri drugih vrstah smo ugotavljali pod identičnimi preizkusnimi pogoji. Za preizkus vsake izmed vrst smo uporabili podobno število GnRH receptorjev. Za vezanje podganjega GnRH receptorja smo membrane pripravili iz podganje hipofize, pri čemer smo uporabili skupno okrog 25-30 pg/predelek membranskega proteina. Za vezanje govejega GnRH receptorja smo membrane pripravili iz goveje hipofize, pri čemer smo uporabili 40-50 pg/predelek. Za vezanje mišjega GnRH receptorja smo membrane pripravili iz celic 293 s stabilnim izražanjem mišjih GnRH receptorjev, pri čemer smo uporabili okrog 25-30 pg/predelek. IC5o vrednosti za kontrolne peptide in testne spojine smo izračunali s programom GraphPad Prism™. Rezultat poskusa z vezanjem radioaktivnih ligandov je prikazan na sliki 1. Tabela 1 prikazuje povprečne vrednosti večkratnih poskusov afinitete različnih peptidnih in nepeptidnih spojin na GnRH receptorje štirih različnih vrst.
Slika 1. Učinki spojin na vezavo 125I-GnRH-A-ja na hGnRH receptorje, izražene v celicah HEK-293. Preučevali smo zmožnost GnRH-ja (kvadrati) in spojine 9 (trikotniki), da substituirata vezavo 125I-GnRH-A-ja (okrog 0,05 nM) na hGnRH receptorje. Prikazane vrednosti so iz enega reprezentativnega poskusa, opravljenega v duplikatu.
Različne spojine po formuli I smo sintetizirali v skladu s splošno reakcijsko shemo, ki je v splošnih črtah opisana zgoraj. Surove spojine smo testirali z uporabo zgoraj opisanega preizkusa konkurenčne vezave radioaktivnih ligandov. Rezultate preizkusa konkurenčne vezave GnRH-ja prikazuje tabela 1 (vsaka spojina je bila testirana pri 1 ali 10 μΜ).
-4646
Tabela 1
Spoj ina Človeški IC50 (nM) Goveji IC50 (nM) Podganji IC50 (nM) Mišji IC50 (nM)
GnRH 7,2+1,5 13+2 33+1,9 11+2
GnRH-A 0,34+0,06 0,3+0,05 0,49+0,1 0,22+0,03
Ant id 0,67±0,09 0,15+0,02 0,19+0,04 0,25+0,05
9 220+33 3800+220 680+120 2300+460
10 130+24 1500+480 390+10 1400+440
11 190+40 320+10 9,0+0,3 50+10
12 230+37 10400+3000 3080+630 7130+1350
13 110+20 530+100 60+8 120+20
14 80+4 1050+30 60+15 290+70
15 100+17 1000+240 70+16 •220+50
16 30+6 4380+510 560+50 1290+210
17 80+20 670+120 30+4 80+20
18 55+11 460+90 40+3 115+25
19 50+3 ND ND ND
20 8,0+0,9 ND ND ND
Vrednosti so povprečja ± SE najmanj treh poskusov, opravljenih v duplikatu. ND=ni določeno.
MERITEV SKUPNIH INOZITOL FOSFATOV
Aktivnost spojin kot agonistov in antagonistov smo preizkusili tako, da smo izmerili skupno akumulacijo inozitol fosfatov. Celice 293, vsebujoče hGnRH receptor, smo nanesli na pladnje s po 24 predelki (okrog 200,000 celic na predelek) z uporabo sredstev DMEM. Naslednjega dne smo celice za 16-18 ur izpostavili [3H]mioinozitolu (0,5 Ci/ml) v brezinozitolnem sredstvu. Po aspiraciji sredstva smo celice obdelali s testnimi spojinami ali nosilcem za 30 minut pri 37°C. Nato smo celicam dodali polovično maksimalno koncentracijo GnRH-ja (1 nM) ali nosilca ter jih pustili 45 minut pri 37°C, da dosežejo ravnotežje. Sredstvo smo zamenjali z ledeno hladno 10 mM mravljinčno kislino, ki je ustavila reakcijo in služila tudi za ekstrahiranje celičnih lipidov. Inozitol fosfate smo ločili z ionsko-izmenjevalno kromatografijo po Dowexovih kolonah, ki smo
-4747 jih izprali z 2,5 ml 10 mM mioinozitola in 10 mM mravljinčne kisline. Kolone smo zatem izprali s 5 ml 60 mM natrijevega formiata in 5 mM boraksa, skupne inozitol fosfate pa smo izprali s 5 ml 1 M amonijevega formiata in 0,1 M mravljinčne kisline. Kolonske eluate smo dodali v fiole za tekočinsko scintilacijo, ki so vsebovale 15 ml scintilacijskega koktejla, ter jih prešteli s tekočinsko scintilacijo. Rezultat tipičnega poskusa je prikazan na sliki 2.
Slika 2. Učinki spojin na z GnRH-jem spodbujeno skupno akumulacijo inozitol fosfata v celicah HEK-293, ki izražajo hGnRH receptor. Proučili smo zmožnost peptičnega antagonista antida oz. nepeptidne spojine 9, da blokirata z GnRH-jem spodbujena zvišanja [3H]inozitol fosfatov. Nobena od obeh spojin samostojno ni spodbudila skupnega porasta [3H]inozitol fosfatov (ni prikazano), obe spojini skupaj pa sta lahko inhibirali spodbujanje, posredovano s polovično maksimalno koncentracijo GnRH peptida. GnRH je samostojno zvišal akumulacijo [3H]inozitol fosfatov v odvisnosti od odmerka, pri čemer je bil EC30 okrog 0,8 ηΜ. V prikazanem poskusu smo vrednosti Kb za antid in spojino 9 določili z metodo Chenga in Prusoffa (Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108, 1973). Prikazane vrednosti so iz enega, v duplikatu opravljenega poskusa.
IN VIVO FARMAKOLOŠKE RAZISKAVE UČINKOVITOSTI NA ŽIVALIH
Poskusni protokol: samci Sprague-Dawleyjevih podgan (225250 g) so bili skopljeni, nakar smo jih pustili 10 dni, da postoperativno okrevajo. Deset dni po skopljenju smo živalim vstavili femuralne venske in arterijske katetre, da smo olajšali infuzijo in jemanje krvnih vzorcev na daljavo. Na dan poskusa smo živalim pustili, da se privadijo na laboratorijski prostor, pri čemer so ostale v svoji domači kletki. Vsem živalim smo vzeli bazalne vzorce krvi. Po bazalnem odvzemu vzorcev smo jim intravenozno dali bodisi nosilec (10% DMSO-ja, 10% kremoforja/slanice), antid (1,0 pg) ali spojino 11 (10 mg/kg). Vzeli smo jim krvne vzorce 10, 60, 90, 120, 180 in 240 minut po injektiranju. Kri smo scentrifugirali, vzeli serum in ga do preizkusa shranili v zmrzovalniku pri -70°C. Vzorce seruma smo analizirali z imunoradiometrično preizkusno opremo s prevlečeno
-4848 cevjo DSL-4600 ACTIVE LH, ki jo izdeluje Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Rezultati in diskusija: z odstranitvijo gonad se eliminira negativna povratna zveza testosterona na hipotalamus, kar privede do povišanja GnRH-ja in posledično do povišanja LH-ja. Slika 3 prikazuje nivoje plazme LH-ja oz. testosterona pri kontrolnih in skopljenih podganah 10 dni po operaciji. Pričakovali bi, da pri teh podganah GnRH antagonist zmanjša z GnRH-jem posredovane poraste nivoja LH-ja. Peptidni GnRH antagonist antid zniža LH pri vzorčnih skopljenih podganah (slika 4) . Spojina 11, GnRH antagonist z majhno molekulo, prav tako zavira LH pri vzorčnih skopljenih podganah (slika 4).
FARMAKOKINETIČNE RAZISKAVE
Vzorce smo analizirali s ločljivosti na koloni Betapufra z gradientom 40-80%
Poskusni protokol: podgane smo pripravili tako, da smo jim vstavili intravenozne katetre v zgornjo zbiralno veno skozi zarezo v desni zunanji jugularki, nakar smo jih pustili, da okrevajo. Medikamente smo raztopili v mešanici 10% DMSO-ja, 10% kremoforja in 80% slanice ter jih vbrizgali intravenozno v odmerku 10 mg/kg. V navedenih razdobjih smo vzeli krvne vzorce in ekstrahirali spojine iz 0,2 ml plazme z butilkloridom, vsebujočim notranji standard.
tekočinsko kromatografijo visoke Basic C18 4*50 mm z uporabo acetonitrila v 10 mM amonijevega fosfata in pretokom 1 ml/min. Detekcija vzorcev je bila opravljena z UV absorpcijo pri 260 nm.
Rezultat in diskusija: spojina 11, ki ima izredno afiniteto za podganji GnRH receptor, je imela v podganji plazmi razpolovno dobo okrog treh ur, njena koncentracija v plazmi pa je štiri ure po intravenoznem injektiranju znašala 100-200 nM (slika 5).
Vezanje referenčnih peptidov na podganje, mišje, goveje in človeške GnRH receptorje se ujema z navedbami, ki jih najdemo v literaturi. Nepeptidne spojine po izumu kažejo v svojem vezalnem profilu velike razlike med posameznimi živalskimi vrstami. Nekatere od teh spojin kažejo visoko afiniteto (<100 nM) za človeški inozitol delujejo
GnRH receptor fosfatom vse kot antagonisti
Pri preizkusu aktivnosti v poskusu z te nepeptidne spojine funkcionalno z GnRH-jem spodbujene skupne
-4949 akumulacije inozitol fosfata v celicah, ki vsebujejo rekombinantne človeške GnRH receptorje. Intravenozno vbrizgana spojina 11 je zmanjšala nivoje LH-ja v plazmi pri skopljenih podganjih samcih, ki so vzorčni za kronično povišani nivo LH-ja v plazmi. Razpolovna doba te spojine znaša tri ure, koncentracija v plazmi pa je korelirala z učinkovitostjo. Po vseh teh podatkih sodeč naj bi bile te nepeptidne spojine uporabne kot antagonisti GnRH receptorjev.
Peptidni agonisti in antagonisti, ki smo jih uporabili kot referenčne spojine:
-5050
Človeški GnRH
[D-ALA6,DES-GLI10]-LH-RH ETILAMID
Podatke o spojinah, ki sledijo, smo pridobili na naslednji način:
Celična kultura
Celice GH3, stabilno transficirane s podganjim GnRH receptorjem (GGH3) , smo dobili od dr. Williama China s Harvard Medical School v Bostonu, zvezna država Massachusetts. Te celice so bile predhodno izčrpno karakterizirane (Kaiser in sodelavci, 1997). Te celice so bile vzgojene v Dulbeccovem modificiranem Eaglovem sredstvu (DMEM) z nizko vsebnostjo glukoze, ki je vsebovalo: 100 U/ml penicilina/streptomicina, 0,6 g/1 G418 in 10% toplotno inaktiviranega seruma govejih zarodkov (FBS).
cDNA za človeški GnRH receptor je bila klonirana v sistem za izražanje plazmidov pcDNA 3 (v Vitrogenu) ter stabilno
-5151 transficirana v celice HEK 293 (hGnRH-R/293) . To celično linijo smo dobili od dr. Stuarta Sealfona z Mount Sinai Medical School v New Yorku, zvezna država New York. Te celice so bile vzgojene v DMEM z dodatkom 0,2 g/1 G418, 100 ϋ/ml penicilina/streptomicina ter 10% FBS. Tako celice GGH3 kot celice hGnRH-R/293 smo uporabili za merjenje skupnega inozitol fosfata in za mikrofiziometrično ugotavljanje učinkovitosti spojin.
Priprava radioaktivnih ligandov
Kot radioaktivni ligand smo uporabili [des-Gly10, D-Ala6] GnRH etilamid (125I-GnRH-A) , z radioaktivnim jodom obogaten agonistični analog GnRH-ja. En pg GnRH-A-ja, razredčenega v 0,1 M ocetni kislini smo dodali v z Iodogenom® prevlečeno borosilikatno stekleno epruveto (Pierce), ki je vsebovala 35 μΐ 0,05 M fosfatnega pufra (pH 7,4-7,6) in 1 mCi Na[125I]. Inkubacijsko mešanico smo zvrtinčili in 1 minuto inkubirali pri sobni temperaturi. Po eni minuti smo mešanico zvrtinčili in jo pustili inkubirati še eno minuto. V reakcijsko epruveto smo dodali 2 ml 0,5 M ocetne kisline in 1% BSA, mešanico pa dodali v kapsulo C18 Sep-Pak. Kapsulo smo zaporedoma izprali s 5 ml H2O in 5 ml 0,5 M ocetne kisline, nato pa jo izprali s 5x1 ml 60% CH3CN/40% 0,5 M ocetne kisline. Eluat smo razredčili s 3-kratnim volumnom HPLC pufra A (0,1% TFA-ja' v H2O) in nanesli na kolono C18. Jodirani produkt smo 20-25 minut izpirali z gradientom 25100% CH3CN, vsebujočim 0,1% TFA-ja. Radioaktivne frakcije (750 μΙ/frakcijo) smo prestregli v čiste polipropilenske epruvete, vsebujoče 100 μΐ 10% BSA-ja. Biološko aktivnost frakcij smo preverili z vezanjem radioaktivnega liganda. Specifična aktivnost radioaktivnega liganda je znašala okrog 2200 Ci/mmol.
Mikrofiziometrija
Cytosensor®Microphysiometer (Molecular Devices, Sunnyvale, zvezna država Kalifornija) je neinvaziven, neradioaktiven polprevodniški sistem za nadziranje celičnih odzivov na razne dražljaje v realnem času. Temelji na silikonskem, za pH
-5252 občutljivem potenciometrskem svetlobno-naslovljivem senzorju, ki je sestavni del mikrovolumske pretočne komore, v kateri se kultivirane celice imobilizirajo (Pitchford in sodelavci, 1995; Parce in sodelavci, 1989; Owicki in sodelavci, 1994).
Dodatne reference:
J. C. Owicki, L. J. Bousse, D. G. Hafeman, G. L. Kirk, J. D. Olson, H. G. Wada in J. W. Parce: The light-addressable potentiometric sensor: principles and biological applications. Ann. Rev. Biophys, Štruc. 23:87-113, 1994.
J. W. Parce, J. C. Owicki, K. M. Kercso, G. B. Sigal, H. G. Wada, V. C. Muir, L. J. Bousse, K. L. Ross, B. I. Sikic in H. M. McConnell: Detection of cell-affecting agents with a Silicon biosensor. Science 246:243-247, 1989.
S. Pitchford, K. DeMoor in B. S. Glaeser: Nerve growth factor stimulates rapid metabolic responses in PC12 celiš. Am. J. Physiol. 268 (Celi Physiol. 37):C936-C943, 1995.
Celice GGH3 smo zasejali v nizkopufrskem minimalnem esencialnem sredstvu (MEM, Sigma), vsebujočem 25 mM NaCI in 0,1% BSA z gostoto 500.000 celic/kapsulo na polikarbonatno membrano (poroznosti 3 pm) skledic celičnih kapsul (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornija). Skledice kapsul smo prenesli v senzorske komore, kjer so se celice tesno dotikale silikonskega senzorja znotraj senzorske komore, ki meri majhne spremembe pHja v mikrovolumnu senzorske komore. Nizkopufrsko sredstvo iz enega od obeh tekočinskih rezervoarjev je nenehno oblivalo celice s pretokom okrog 100 μΐ/min. Od preklopnega ventila je bilo odvisno, katera tekočina iz katerega izmed obeh rezervoarjev obliva celice.
Cytosensor®Microphysiometer vsako sekundo generira napetostni signal, ki je linearna funkcija pH-ja. Da smo lahko izmerili hitrost kisanja, smo periodično pretrgali pretok v senzorsko komoro s celicami, s čimer smo omogočili, da se izločeni kisli metaboliti naberejo v zunajcelični tekočini kulture. Pri teh poskusih smo celice vzdrževali na temperaturi 37°C, pretočni cikel pa je trajal 2 minuti, pri čemer je
-5353 sredstvo 80 sekund oblivalo celice, nakar je bil njegov tok za 40 sekund prekinjen. Znotraj tega 40-sekundnega intervala smo v 30-sekundnem intervalu merili hitrost kisanja. Na ta način je bila vsaki dve minuti opravljena ločena meritev hitrosti kisanja. Naprava Cytosensor®Microphysiometer vsebuje osem takih senzorskih enot, tako da omogoča sočasno izvedbo osmih eksperimentov. Vsaka enota je bila programirana individualno s pomočjo na sistem priključenega računalnika.
Celice GGH3 smo najprej uravnotežili v nizkopufrskem MEM sredstvu v razdobju 30-60 minut, v katerem smo nadzirali bazalne hitrosti kisanja (merjene v μν/sek.) v popolni odsotnosti dražljajev. Ko se je bazalna hitrost kisanja v 20 minutah spremenila za manj kot 10 odstotkov, smo začeli s poskusom. Opravili smo poskuse časovnega poteka, da ugotovimo, koliko časa je primerno celice izpostavljati agonistu, preden začnemo meriti hitrost kisanja, in kako dolgo izpostavljanje posameznemu agonistu je potrebno, da dobimo pri kisanju najvišji odziv. Na podlagi teh poskusov časovnega poteka smo ugotovili, da je treba celice izpostaviti delovanju GnRH peptidnih agonistov za najmanj eno minuto, preden začnemo beležiti podatke o hitrosti kisanja. Hitrost kisanja je ponavadi dosegla višek v prvem dvominutnem ciklu izpostavljenosti. Da bi ujeli najvišji odziv na GnRH, smo celice izpostavili delovanju agonista vsega skupaj štiri minute. Celice smo izpostavili delovanju spojin za 20-60 minut, preden smo začeli s štiriminutnim spodbujanjem bodisi s samostojnim GnRH-jem (1,0 nM - 10 μΜ) , bodisi kombinirano z različnimi poskusnimi koncentracijami vsake izmed spojin. Vse spojine smo testirali v končni koncentraciji 1% DMSO-j a v zgoraj opisanem nizkopufrskem MEM sredstvu.
Selektivnostni profil
Da bi ugotovili specifičnost vezanja spojin na GnRH receptorje, smo aktivnost spojin testirali v različnih preizkusih vezave in funkcionalnosti. Spodnja tabela 2 prikazuje aktivnost spojine 20 v raznih preizkusih.
-5454
Tabela 2. Vezalna afiniteta ali ocena funkcionalnosti spojine 20 v različnih preizkusih
Preizkus Ki (nM) *
Adenozin (neselektivna) >1000
Alfal adrenergik (neselektivna) >1000
Alfa2 adrenergik (neselektivna) >1000
Beta adrenergik (neselektivna) >1000
Dopamin (neselektivna) >1000
D2 dopamin >3200
Hi histamin >1000
H2 histamin «1000
H3 histamin >1000
M2 muskarinik >1000
Muskarinik (neselektivna) periferno >1000
Opiat (neselektivna) >1000
Serotonin transporter >1000
Serotonin (neselektivna) >1000
5-HT2a 2350
5-HT7 >4400
Estrogen >1000
Testosteron >1000
L-tip Ca2+ kanal >1000
N-tip Ca2+ kanal >1000
ATP-senz. K+ kanal >1000
Ca2+-aktivirani K+ kanal >1000
Na+ kanal (mesto 1) >1000
Na+ kanal (mesto 2) >1000
LTB4 >1000
LTD4 >1000
ΤΧΑ2 >1000
PAF «3000-5000
TRH >1000
Oksitocin >1000
ATI angiotenzin «3000-5000
Bradikinin 2 >1000
-5555
CCKA >1000
ET-A >1000
Galanin >1000
NK1 >1000
NK2 >1000
NK3 «=3000-5000
VIP (neselektivna) >1000
AchE >1000
Holin acetiltransferaza >1000
MAO-A >1000
MAO-B >1000
IL8RA (CXCR-1) >10000
GLP-1 >10000
Glukagon 6700
ΝΡΥ Y1 >10000
CYP3A4 citokrom P450IC50 1700
Bazalno izločanje histamina (podganje mastocite) EC50 >10000
RARy retinoid >10000
RXRa retinoid >10000
Vazopresin 1 >1000
*EC5o za preizkus bazalnega izločanja histamina
Slika 6 prikazuje učinek spojine 136' na z GnRH-jem spodbujene poraste zunajcelične hitrosti kisanja v celicah GGH3. GnRH je povzročil od odmerka odvisen porast hitrosti zunaj celičnega kisanja celic GGH3. Spojina 136 je povzročila, da so se krivulje odziva na odmerek GnRH-ja pomaknile v desno, ne da bi znižala maksimalni odziv na GnRH. Po tem bi lahko sklepali, da je ta spojina konkurenčni receptorski antagonist GnRH-ja pri tem receptorju. Prikazane vrednosti so iz enega poskusa.
Primer metode za pripravljanje spojin po izumu:
-5656
MetllvimlUetoh kloroform , dipea
CH3Mgl
AICI3l CSz. vrelišče.
->
CI
AICI3 Nitrometan *-
1) lioh hidrat
2) SOCI2
DIPEA
M-krezolu (4,0 g, 37 mmol) in metilvinilketonu (3,2 ml, 37 mmol) v kloroformu (25 ml) dodamo diizopropiletilamin. Mešanico smo 16 h segrevali pri vreliščni temperaturi, jo pustili, da se ohladi na sobno temperaturo, ter jo odparili. Ostanek ima 50% produkta in 50% izhodiščne snovi. Izhodiščno snov smo ločili kot t-butil dimetil silil eter. Produkt smo osamili s pomočjo filtriranja skozi polnilo. Izkoristek 4,5 g (68%).
-572-metil-4(3-metilfenoksi)-2-butanol:
V raztopino metil magnezij bromida v etru (50 ml), pripravljeno iz Mg (572 mg, 23,56 mmol) in Mel (3,34 g, 23,56 mmol) smo dodali 4-(3-metilfenoksi)-2-butanon (2,1 g, 11,78 mmol) v 10 ml etra. Raztopino smo 30 minut mešali pri sobni temperaturi, nakar smo jo gasili z vodo in razredčeno solno kislino. Organsko plast smo ločili, sušili z . natrijevim fosfatom, prefiltrirali skozi polnilo iz silikagela. Brezbarven sirup 1,91 g (83%) .
4,4,7-trimetilkroman:
Aluminijevemu kloridu (1,3 g, 9,79 mmol) v 40 ml ogljikovega disulfida smo dodali 2-metil-4(3-metilfenoksi)-2butanol (1,9 g, 9,79 mmol) v 10 ml ogljikovega disulfida. Mešanico smo 2 uri segrevali pri vreliščni temperaturi. Topilo smo odparili, ostanek razredčili s 50 ml etilacetata in 10 ml vode. Organsko plast smo ločili, posušili z natrijevim sulfatom in prečistili skozi hitro kolono. Svetlorumen sirup 1,5 g (87%).
Etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]2-furoat in etil-5-[ (4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8il)metil]-2-furoat:
-5858
Cinkovemu kloridu (950 mg, 6,97 mmol) v nitrometanu (20 ml) smo dodali mešanico 4,4,7-trimetilkromana (1,23 g, 6,97 mmol) in etil-5-klormetil-2-furoata (656 mg, 3,48 mmol) v nitrometanu (15 ml). Mešanico smo 16 h mešali pri sobni temperaturi. Odparili smo jo do suhega in zdrobili v etilacetatu in vodi (1:1, 100 ml) . Z običajno obdelavo organske plasti in filtriranjem skozi polnilo z uporabo heksana in etilacetata (9:1) smo dobili mešanico obeh spojin. 1,34 g (46% izhajajoč iz kromana).
N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5-((4,4,7-trimetil-3,4-dihidro2H-kromen-6-il)metil]-2-furamid in N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furamid:
Mešanici etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6il)metil]-2-furoata in etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2Hkromen-8-il)metil)-2-furoata (1,34 g, 3,74 mmol) v THF-MeOH-H2O (7:5:5, 20 ml) smo dodali litijev hidroksid monohidrid (784 mg, 18,7 mmol). Mešanico smo mešali 4 h pri sobni temperaturi. Odparili smo jo do suhega, razredčili s 30 ml etilacetata in 50 ml vode. Po nakisanju z razredčeno HCI smo etilacetatno plast ločili, jo osušili in odparili, s čimer smo dobili mešanico ustreznih kislin v količini 1,03 g. Kislin ni bilo mogoče ločiti s pomočjo kolonske kromatografije ali kristalizacije.
-5959
Mešanici kislin (200 mg, 0,66 mmol) v diklormetanu (30 ml) smo dodali tionilklorid (392 mg, 3,3 mmol). Mešanico smo kuhali 1 h in jo uparili. Ostanek smo raztopili v heksanu in etilacetatu (9:1, 20 ml) ter prefiltrirali skozi polnilo iz silikagela (0,5 cm χ 1 cm).
Ostanku v 10 ml etilacetata smo dodali 2,4,6trimetoksifenil amin hidroklorid (145 mg, 0,66 mmol) in zatem še diizopropil etilamin (256 mg, 1,98 mmol). Mešanico smo mešali 16 h pri sobni temperaturi. Reakcijo smo gasili z vodo (10 ml), etilacetatno plast smo ločili. S kombiniranjem ter s kolonskim in HPLC prečiščevanjem smo dobili 15 mg oz. 21 mg obeh komponent (12%) .
In vivo farmakologijo nekaterih spojin po izumu smo testirali na sledeči način:
Poskusi in vivo: splošno.
Odrasle samce Sprague-Dawleyjevih podgan nam je dobavilo podjetje Harlan Sprague Dawley iz San Diega. Živali smo nastanili po dvoje na kletko v prostoru z uravnavano temperaturo (22±2°C) s svetlobno periodo 12 h svetlobe/12 h teme (luči smo prižigali ob 06:00 h). Podganja krma (podganja dieta Teklad) in voda iz vodovoda sta bili stalno na razpolago.
Vzorčne živali za ugotavljanje aktivnosti GnRH antagonistov:
Vzorčni skopljeni podganji samec
Logična osnova:
S kirurško odstranitvijo gonad se ukine obtok testosterona in odstrani negativna povratna zveza testosterona na hipotalamus. Zaradi tega se zviša GnRH in posledično tudi LH (slika 1) . Pričakovali bi, da bo GnRH antagonist zmanjšal z GnRH-jem posredovane poraste nivoja LH-ja. Peptidni GnRH antagonist antid zmanjša nivoje LH-ja pri skopljenih podganah (slika 8). Vse kaže, da je ta vzorec primeren za evaluacijo GnRH antagonistov z majhnimi molekulami.
-6060
Protokol:
Samce Sprague-Dawleyjevih podgan (200-225 g) smo skrotalno skopili pod halotansko anestezijo. Pred raziskavo smo počakali 10 dni, da živali postoperativno okrevajo. Trinajst dni po skopitvi smo živali anestezirali s halotanom in jim vstavili jugularne kanule. Postopek vstavljanja kanule sta podrobno opisala Harms in Ojeda, 1974. Na dan poskusa smo živalim pustili, da se privadijo na laboratorijski prostor, pri čemer so ostale v svoji domači kletki. Vsem živalim smo vzeli bazalne vzorce krvi. Po bazalnem odvzemu vzorcev so po različnih poteh prejele bodisi nosilec bodisi testno spojino. Uporabili smo naslednje poti: intravenozno (iv), intramuskularno (im), intraperitonealno (ip), subkutano (sc) in peroralno (po). Po tem postopku smo jim v več časovnih intervalih vzeli krvne vzorce v epruvete s heparinom. Kri smo takoj scentrifugirali, vzeli plazmo in jo do preizkusa shranili v zmrzovalniku pri -20°C. Vzorce plazme smo analizirali z imunoradiometrično preizkusno opremo s prevlečeno cevjo DSL-4600 ACTIVE LH, ki jo izdeluje Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Formulacije spojin:
Formulacija 1 (označena nadpisano 1): 10% DMSO-ja, 10% kremoforja EL in 80% fiziološke slanice.
Formulacija 2 (označena nadpisano 2): 10% kremoforja EL in 90% fiziološke slanice.
Rezultati
Glej slike 9-11 in tabelo 3.
Nedotaknjen podganji samec
Logična osnova:
Testosteron je hormon, ki ga uravnava hipotalamusnohipofizno-gonadna os. GnRH se pulzirajoče izloča iz hipotalamusa in spodbuja prednji reženj hipofize, da izloča gonadotropna hormona LH in FSH. Testosteron se tvori, ko LH spodbuja testise. Količina izločenega testosterona raste v približno premem sorazmerju z razpoložljivo količino LH-ja (Guyton, 1986). Od GnRH antagonista bi pričakovali, da bo inhibiral LH in s tem zmanjšal nivo testosterona.
-6161
Protokol 1:
Samce Sprague-Dawleyjevih podgan (250-275 g) smo dali vsakega v svojo kletko in pred poskusom počakali 1 teden, da se privadijo. Na dan poskusa so živali prejele odmerek nosilca ali testne spojine po različnih poteh, vključno z ip, sc in po. Po tem postopku smo posameznim živalim v določenih časovnih intervalih vzeli krvne vzorce s punkcijo srca pod halotansko anestezijo. Krvne vzorce smo prestregli v epruvete s heparinom. Kri smo takoj scentrifugirali, vzeli plazmo in jo do preizkusa shranili v zmrzovalniku pri -20°C. Vzorce plazme smo analizirali z radioimunsko preizkusno opremo s prevlečeno cevjo DSL-4600 ACTIVE Testosterone, ki jo izdeluje Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Protokol 2:
Samce Sprague-Dawleyjevih podgan (250-275 g) smo dali vsakega v svojo kletko in pred poskusom počakali 1 teden, da se privadijo. Za redno jemanje vzorcev iz jugularke smo razvili posebno tehniko z uporabo katetrov microrenathane (MRE), ki smo jih vsadili 7 dni pred poskusom. Kirurški postopek podrobneje opisujeta Harms in Ojeda, 1974. Na dan poskusa smo živalim pustili, da se privadijo na laboratorijski prostor, pri čemer so ostale v svoji domači kletki. Vsem živalim smo vzeli bazalne vzorce krvi. Po bazalnem odvzemu vzorcev so po različnih poteh prejele bodisi nosilec bodisi testno spojino. Uporabili smo naslednje poti: intravenozno (iv), intramuskularno (im) in peroralno (po) . Po tem postopku smo jim v več časovnih intervalih vzeli krvne vzorce v epruvete s heparinom. Kri smo takoj scentrifugirali, vzeli plazmo in jo do preizkusa shranili v zmrzovalniku pri -20°C. Vzorce plazme smo analizirali z radioimunsko preizkusno opremo s prevlečeno cevjo DSL-4600 ACTIVE LH, ki jo izdeluje Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Protokol 3: raziskava dolgotrajnega doziranja spojine št.
134
Samce Sprague-Dawleyjevih podgan (250-275 g) smo dali v kletke po dva in dva ter pred poskusom počakali 1 teden, da se privadijo. Sedem dni so prejemali dnevne odmerke nosilca po im,
-6262 sc ali po poti med 8:00 in 9:00 uro zjutraj. Osmi dan med 8:00 in 9:00 uro zjutraj smo jim vzeli krvne vzorce s punkcijo srca pod halotansko anestezijo. Postopek je bil zaključen v 45-60 sekundah. Naslednjih 7 dni je ena skupina živali še naprej prejemala nosilec, druga skupina živali pa ni prejemala ničesar. Po 7. dnevu tega režima smo jim vzeli vzorce po zgoraj opisanem postopku. Nivoji testosterona med živalmi, ki so prejemale nosilec, in živalmi, ki ga niso prejemale, se niso razlikovali.
Dnevni im odmerek spojine 134 (100 mg/kg) oz. nosilca so
prejemale med 8 : 00 in 9:00 uro zjutraj, in sicer sedem dni. Po
7. dnevu tega režima smo jim vzeli vzorce po zgoraj opisanem
postopku.
Vse krvne vzorce smo dali v epruvete s heparinom. Kri smo
takoj scentrifugirali, vzeli plazmo in jo do preizkusa naslednji dan shranili v zmrzovalniku pri -20°C. Vzorce plazme smo analizirali z radioimunsko preizkusno opremo s prevlečeno cevjo DSL-4600 ACTIVE Testosterone, ki jo izdeluje Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Rezultati
Glej tabelo 4 in slike 12-14.
Pojasnila k slikam
Slika 7: stolpčni diagram prikazuje bazalne nivoje LH-ja in testosterona pri skopljenih (CX) in nedotaknjenih podganah. LH je visok pri CX podganah. Testosteron pri ' CX podganah ni prisoten.
Slika 8: krivulja prikazuje nivoje LH-ja, izražene kot odstotni delež bazalnega LH-ja pri živalih, ki so prejemale nosilec oz. antid. Antid (2,0 in 20 pg; sc) zavira LH pri CX podganah.
Slika 9: krivulja prikazuje nivoje LH-ja, izražene kot odstotni delež bazalnega LH-ja pri živalih, ki so prejemale nosilec oz. spojino. Spojina 134 (1,0, 5,0 in 10 mg/kg; iv) povzroči od odmerka odvisno zmanjšanje LH-ja pri CX podganah.
-6363
Slika 10: krivulja prikazuje nivoje LH-ja, izražene kot odstotni delež bazalnega LH-ja pri živalih, ki so prejemale nosilec oz. spojino. Spojina 134 (20 ali 100 mg/kg; ip) zavira LH pri CX podganah.
Slika 11: krivulja prikazuje nivoje LH-ja, izražene kot odstotni delež bazalnega LH-ja pri živalih, ki so prejemale nosilec oz. spojino. Spojina 134 (20 mg/kg; im) zavira LH pri CX podganah.
Tabela 3: GnRH spojine pri vzorčni skopljeni podgani
Spoj ina Odmerek v mg/kg in pot Max zaviranje LH-ja v % Trajanje zaviranja £50% Območje konc. plazme μΜ
Št. 9 1,0/iv 40 po 0,5 h NS ND
Št. 11 10/iv 10/ip 20/po 85 po 0,75 h 50 po 0,5 h NS 3 h < 1 h NS ND
Št. 13 20/iv 63 po 0,5 h < 1 h ND
Št. 48 10/iv 20/iv 75 po 0,5 h 51 po 1 h < 1 h 1 h 35,7-3,49
Št. 20 10/iv 20/iv 50/im 50/po 100/po 78 po 0,5 h 72 po 1 h 65 po 1 h 59 po 1 h 43 po 2 h 0,5 h 1,0 h 2 h 2 h NS ND
Št. 136 5,0/iv 48 po 1 h 1,0 h 3,0-0,3
10/iv 74 po 2 h 6 h 3,7-0,28
20/iv 20/ip 98 po 4 h £ 6 h 8,9-0,7
20/po NS NS 0,29
40/po NS NS 0,72
Št. 134 1,0/iv 5,0/iv 24 po 0,5 h 70 po 0,5 h 0,53-0,20 3,2-0,11
10/iv 100 po 0,5 h 2 h 4,8-0,16
20/po 62 po 4 h 4 h 0,94-0,3
100/po 84 po 4 h 8 h 1,27-0,7
20/ip 80 po 2 h 4 h 1,7-0,45
-6464
100/ip 98 po 4 h 8 h 1,7-0,32
20/sc 53 po 8 h samo po 8 h 0,6-0,3
100/sc 80 po 6 h 8 h 0,39-1,5
20/im 73 po 2 h 8h 1,3-0,12
100/im 98 po 2-24 h 24 h 10,8-0,5
Št. 119 5,0/iv 63 po 1 h 1 h 3,1-0,8
10/iv 61 po 1 h 1 h 8,13-0,35
20/po 63 po 2 h 2 h 0,1
20/ip 79 po 2 h 2 h 0,6-0,1
20/sc NS NS 0,2
Št. 183 10/iv 92 po 1 h 8 h 1,5-0,89
50/po 60 po 2 h 8 h 0,65-,13
10/im 58 po 2 h NS 0,18-,08
Št. 206 10/iv 51 po 1 h NS 0,2-0,06
20/po NS NS 0,1-0,05
NS=ni zaviranja ND=ni določeno
Pojasnila k slikam
Prikaz protokola 1:
Slika 12: stolpčni diagram prikazuje nivoje testosterona pri živalih, ki so prejemale nosilec oz. spojino, in sicer 6 ur po ip injektiranju. Spojina 136 zavira nivoje testosterona v primerjavi z živalmi, ki so prejemale nosilec. *=p<0,05, t-test.
Prikaz protokola 2:
Slika 13: krivulja prikazuje nivoje testosterona v obdobju 12 ur ter v točki 24 ur pri podganah, ki so prejemale nosilec in spojino 134. Nosilec in spojino 134 so prejemale' oralno z vlivanjem. Najvišji odmerek spojine 134 je zaviral testosteron skozi celotni potek raziskave.
-6565
Prikaz protokola 3:
Slika 14: stolpčni diagram prikazuje nivoje testosterona pri živalih, ki so prejemale nosilec oz. spojino 134 oz. pri kontrolnih živalih. Beli stolpci prikazujejo nivoje testosterona pred postopkom, šrafirani pa nivoje testosterona po 7 dneh rednega postopka. Spojina 134 je znatno zmanjšala nivoje testosterona v primerjavi z živalmi pred postopkom, živalmi, ki so prejemale nosilec, in kontrolnimi živalmi. *=p<0,05, t-test.
Tabela 4. GnRH spojine pri nedotaknjenih podganjih samcih
Spoj ina Odmerek v mg/kg in pot Zaviranje testosterona v % Trajanje zaviranja Območje konc. Plazme pM
Št. 134 20/ip 36 po 4 h 4 h 0,2
100/sc 60 po 24 h 24 h 0,13
20/po NS po 2 ali 4 h NS 0,15 po 2 h 0,17 po 4 h
100/im*7 dni 80 po 12 h 12 h 1/3
20/po NS NS 1,1 po 1 h
50/po 75 po 4 h 8 h 2,5-0,22
100/po 80 po 6 h 12 h 2,4-0,25
Št. 136 20/ip 72 po 6 h' 6 h' 0,4
40/po 46 po 4 h 4 h 0,34
NS=ni zaviranja ND=ni določeno
Opombe k postopku
Dokumentirano je, da lahko nekateri postopki, ki se običajno uporabljajo pri endokrinih raziskavah na živalih, kot so npr. anestezija, stradanje in kirurški posegi, vplivajo na nivoje proučevanih hormonov (B. E. Howland in sodelavci, Experentia, 1974). Luteinizirajoči hormon in testosteron sta občutljiva na stresne dejavnike. A glede samih učinkov stresnih dejavnikov na HPG os si številna poročila nasprotujejo, in to
-6666 celo tedaj, ko gre za iste stresne dejavnike in isto živalsko vrsto. Tako npr. o podganjih samcih, ki so jim omejili gibanje ali jih imobilizirali, poročajo, da imajo nizko (Kruhlich in sodelavci, 1974; DuRuisseau in sodelavci, 1978), normalno (Tache in sodelavci, 1980; Charpenet in sodelavci, 1982; Collu in sodelavci, 1984) oziroma visoko koncentracijo LH-ja (Briški in sodelavci, 1984). Prav tako imamo poročila, da se nivoji testosterona v plazmi spremenijo po izpostavljenosti stresni situaciji, vendar se zdijo sami podatki zopet protislovni in jih je zato težko tolmačiti. Obstajajo na primer poročila, da se med intenzivnim telesnim naporom nivoji testosterona v plazmi povečajo (Dessypris in sodelavci, 1976), zmanjšajo (Sutton in sodelavci, 1973) oziroma ostanejo nespremenjeni (Lamb, 1975). Učinki imobilizacije na koncentracijo testosterona niso videti tako protislovni, saj raziskave pretežno poročajo o zmanjšanju vrednosti v obtoku (Tache in sodelavci, 1980; Charpenet in sodelavci, 1982; Collu in sodelavci, 1984). Vendar je obveljal nazor, da se zaradi stresnih dejavnikov spremeni količina testosterona v obtoku, pri čemer pa se s stresom povzročene spremembe v njegovi koncentraciji razlikujejo in so odvisne od vrste, trajanja ter intenzivnosti stresa. Zavedajoč se občutljivosti LH-ja in testosterona za stres, smo protokole optimizirali za oceno LH-ja in testosterona v takih pogojih, ki minimalizirajo stres.
Spojine po izumu, ki smo jih pripravili, so prikazane v priloženi tabeli 5.
Spojine se lahko pripravijo z zgoraj navedeno splošno poskusno opremo. V nadaljevanju so podani konkretni primeri.
-6767
Pirimidin vsebujoče spojine
Priprava 2-kloro-N- [ (2R) -tetrahidro-2-furanmetil] -4piridinamina in 4-kloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2piridinamina 2B:
V 250-mililitrsko steklenico z okroglim dnom smo dali 2,4dikloropirimidin (5,0 g, 33,56 mmol) in 200 ml THF-ja. Tej raztopini smo dodali trietilamin (14,0 ml, 100,68 mmol) in [R] — tetrahidrofurfurilamin. Raztopino smo čez noč mešali. Reakcijsko mešanico smo izlili v vodo in ekstrahirali z metilenkloridom. Ločeno organsko plast smo izprali s slanico, posušili z magnezijevim sulfatom in skoncentrirali z rotacijskim evaporatorjem. Surovo spojino smo prečistili s kromatografijo na silikagelu s heksanom/etilacetatom (v razmerju od 4:1 V/V do 1:1 V/V) ter dobili 2B (1,3 g) in IB (3,98 g).
-6868
Priprava M-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoroacetamida
3B.
Raztopini m-ksilendiamina (28,76 g, 211,15 mmol) v THF-ju (300 ml, 0,7 M) smo po kapljicah dodali raztopino etiltrifluoroacetata (10 g, 70,38 mmol) v THF-ju (50 ml, 1,4 M). Raztopino smo pri sobni temperaturi mešali čez noč. Reakcijo smo preverjali s tankoplastno kromatografijo (TLC). Topilo smo skoncentrirali in ostanek nakisali s 4N HCI do pH 2, raztopili v vodi ter izprali z etilacetatom. Ločeno vodno plast smo naalkalili z NH4OH do pH 11 ter ekstrahirali spojino z diklormetanom. Ločeno organsko plast smo izprali z vodo/slanico, osušili z magnezijevim sulfatom in skoncentrirali, tako da smo dobili 3B (8,71 g, 53-odstotni izkoristek).
Sinteza 5-[ (3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2furanilmetil] amino}-4-pirimidinil) amino]metil}benzil) -2-furamida 9B.
-KjCO3
4B
-6969
Priprava etil 3-(aminometil)benzilkarbamata 5B.
Raztopini N-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3B (10,6 g, 43,1 mmol) smo dodali etilkloroformat (1 ekvivalent) in zatem še trietilamin. Reakcijo smo mešali 30 minut pri sobni temperaturi. Surovi produkt smo ekstrahirali z metilenkloridom in ga skoncentrirali, s čimer smo dobili etil 3{[(trifluoroacetil)amino]metil}benzilkarbamat 4B. Ta surovi produkt smo raztopili v metanolu (100 ml) in 2N K2CO3 (100 ml) ter mešali čez noč. Reakcijsko mešanico smo z 20-odstotnim NaOH naalkalili do pH 14, ekstrahirali z metilenkloridom, izprali s slanico in posušili z magnezijevim sulfatom, tako da smo dobili 5B (5,2 g).
-70ΊΟ
Priprava etil 3-{[(2—{[(2R) -tetrahidro-2furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzilkarbamata
6B.
Raztopini pridobljenega etil 3-(aminometil)benzilkarbamata 5B in 4-kloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2-pirimidinamina 2B v klorbenzenu smo dodali trietilamin. Reakcijsko mešanico smo kuhali čez noč. Raztopino smo ohladili na sobno temperaturo in nanesli na kolono silikagela ter izprali s heksanom/etilacetatom (1:1 V/V), s čimer smo dobili etil 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzilkarbamat 6B (73-odstotni izkoristek).
Etil 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4pirimidinil)amino]metilJbenzilkarbamat 6B smo raztopili v etilenglikolu in kalijevem hidroksidu (1:1 V/V). Raztopino smo čez noč segrevali pri 100°C. Raztopino smo ohladili na sobno temperaturo in ekstrahirali s kloroformom, izprali s slanico in sušili z magnezijevim sulfatom, s čimer smo dobili N4-[3(aminometil)benzil]-N2-[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4pirimidindiamin 7B (82-odstotni izkoristek).
Priprava 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-N-(3-{[(2—{[(2R)-tetrahidro-2furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamida
9B.
Etil 3-{[(2—{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4pirimidinil)amino]metilJbenzilkarbamat 6B smo raztopili v etilenglikolu in kalijevem hidroksidu (1:1 V/V). Raztopino smo čez noč segrevali pri 100°C. Zatem smo jo ohladili na sobno temperaturo in ekstrahirali s kloroformom, izprali s slanico in osušili z magnezijevim sulfatom, s čimer smo dobili N4-[3(aminometil)benzil]-N2-[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4pirimidindiamin 7B (82-odstotni izkoristek). Navedeni produkt 7B (182 mg, 0,580 mmol) in reagent 8B 2-furoil klorid smo razredčili z diklormetanom in zatem še s trietilaminom. Reakcijo smo čez noč mešali pri sobni temperaturi. Surovo spojino smo prečistili na koloni iz silikagela in izprali z etilacetatom/heksani (4:1 V/V), s čimer smo dobili 5-7171 [(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamid 9B (159,1 mg). XH NMR (CDC13) : δ 1,19 (s, 6H) , 1,26 (s, 6H) , 1,65 (m, 5H) , 1,92 (m, 3H) , 2,23 (s, 3H) , 3,45 (m, IH), 3,5 (m, IH), 3,7 (m, IH), 3,9 (m, 3H) , 4,05 (m, IH), 4,50 (d, 2H) , 4,58 (d, 2H) , 5,01 (brd, IH), 5,30 (brd, IH), 5,71 (d, IH), 6,03 (d, IH), 6,61 (t, IH), 6,99 (s, IH), 7,06 (s, IH), 7,07 (s, IH), 7,28 (m, 4H), 7,80 (d, IH). MS: 622,4 (M+l).
Sinteza 5-((3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro2naftalenil)metil]-N-(3-[[<4—{[(2S)-tetrahidro2furaniImetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2furamida 12B.
Kžco3
MeOH
O
Cl
ne»
-7272
Priprava N-[3- (aminometil)benzil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2-furamida 11B.
Raztopini N-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3B in 2-furoil klorida (reagenta 8B) smo dodali trietilamin. Reakcijsko mešanico smo 1 uro mešali pri sobni temperaturi. Surovo mešanico smo prečistili s kromatografijo na silikagelu in izprali s heksani/etilacetatom (4:1 V/V), s čimer smo dobili 5[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N(3—{ [ (trifluoroacetil)amino]metil}benzil)-2-furamid 10B.
Prečiščeno spojino smo raztopili v metanolu (100 ml) in kalijevem karbonatu v vodi (2 M, 100 ml) . Reakcijo smo čez noč segrevali pri 70°C. Raztopino smo ohladili na sobno temperaturo, jo z 20-odstotnim NaOH naalkalili na pH 14, ekstrahirali z metilenkloridom, izprali s slanico ter posušili z magnezijevim sulfatom, s čimer smo dobili N-[3-(aminometil)benzil]-5[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2furamid 11B (4,97 g, 85,1-odstotni izkoristek).
Priprava 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro2naftalenil)metil]-N-(3[[(4-{[(2S)-tetrahidro2furanilmetil] amino}-2-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2furamida 12B.
Raztopini N-[3-(aminometil)benzil]-5-[(3,5,5,8,8pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2-furamida 11B v klorbenzenu smo dodali 2-kloro-N-[(2S)-tetrahidro-2furanmetil]-4-pirimidinamin in trietilamin. Reakcijsko mešanico smo kuhali čez noč. Ohlajeno mešanico smo zatem prečistili s kromatografijo na silikagelu in nato s HPLC. Tako smo dobili 5[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-N(3 [ [ (4-{[(2S)-tetrahidro-2furanilmetil]amino}-2pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamid 12B. 7H NMR (CDC13) : δ 1,01 (s, 6H), 1,25 (s, 6H) , 1,43 (m, IH), 1,56 (s, 4H) , 1,ΙΟΙ,98 (m, 3H) , 2,13 (s, 3H) , 3,24 (m, IH) , 3,61 (m, IH), 3,633,80 (m, 2H), 3,82 (s, 2H) , 3,87-4,06 (m, IH), 4,37-4,60 4,37 (d, 2H), 4,60 (d, 2H) , 5,73 (d, IH), 5,92 (d, IH), 6,3 (brd,
IH), 6,75 (brd, IH), 6,92 (s, IH), 6,98 (d, IH), 7,0 (s, IH), 7,09-7,26 (m, 4H), 7,4 (s, IH), 9,5 (brd, IH). MS (APCI): 622,3 (M+l).
-73- 73 Primeri heterocikle vsebujočih spojin
MetiGtntlkeion -►KLoro|orw, DIPEA
CHaMgl
Aicjj, cSz, vrelišče
, —►
AlCb Nitrometan
4-(3-metilfenoksi)-2-butanon:
Raztopini m-krezola (4,0 g, 37 mmol) in metil vinil ketona (3,2 ml, 37 mmol) v kloroformu (25 ml) smo dodali diizopropil etilamin. Mešanico smo 16 h segrevali pri temperaturi vrelišča, počakali, da se ohladi na sobno temperaturo, ter jo odparili. Ostanek vsebuje 50% produkta in 50% izhodiščnega materiala. Izhodiščni material smo ločili kot t-butil dimetil silil eter.
-7474
Produkt smo osamili s filtriranjem skozi polnilo iz silikagela v 50-odstotnem heksanu/etilacetatu. Izkoristek 4,5 g (68%). Alternativni postopek prečiščevanja: surovo reakcijsko mešanico smo izparili, raztopili v DMF-ju (0,2 M) ter dodali 0,5 ekvivalenta imidazola in 0,5 ekvivalenta tBDMSCl. Reakcijo smo 3 h mešali pri sobni temperaturi, nakar smo v vakuumu odstranili topila. Ostanku smo dodali 75 ml etilacetata in 75 ml vode (razmerje 1:1). Etilacetatno plast smo ločili in sušili z Na2SO4. Topila smo odstranili v vakuumu. Surovi material smo nanesli na podlago iz silikagela in s heksani odstranili sililirani mkrezol. Po izpiranju s 5-10-odstotnim etilacetatom v heksanih smo dobili produkt. Topila smo odstranili v vakuumu, kar nam je dalo želeni produkt. 1H(CDC13): 7,15 (t, IH), 6,65-6,80 (m, 2H), 4,25 (t, 2H), 2,75 (t, 2H), 2,25 in 2,35 (2s, oboje 3H).
2-metil-4(3-metilfenoksi)-2-butanol:
Raztopini metilnega magnezijevega bromida v etru (50 ml), pripravljeni iz Mg (572 mg, 23,56 mmol) in Mel (3,34 g, 23,56 mmol), smo dodali 4-(3-metilferioksi)-2-butanon (2,1 g, 11,78 mmol) v 10 ml etra. Raztopino smo 30 minut mešali pri sobni temperaturi, nakar smo jo gasili z vodo in razredčeno solno kislino. Organsko plast smo ločili, sušili z natrijevim sulfatom, prefiltrirali skozi polnilo iz silikagela in dobili brezbarven sirup 1,91 g (83%) z masno spektralno analizo z uporabo APCI +ve 177 (M+-OH).
4,4,7-trimetilkroman:
-7575
Aluminijevemu kloridu (1,3 g, 9,79 mmol) v 40 ml ogljikovega disulfida smo dodali 2-metil-4(3-metilfenoksi)-2butanol (1,9 g, 9,79 mmol) v 10 ml ogljikovega disulfida. Mešanico smo 2 h segrevali pri temperaturi vrelišča. Topilo smo odparili, ostanek pa razredčili s 50 ml etilacetata in 10 ml vode. Organsko plast smo ločili, posušili z natrijevim sulfatom ter prečistili s kolonsko kromatografijo, s čimer smo dobili svetlorumen sirup 1,5 g (87%). *H (CDC13) : 7,05 (br d, IH), 6,87 (dd, IH), 6,69 (d, IH), 4,20 (t, 2H) , 2,35 (s, 3H) , 1,80 (t,
2H), 1,40 (s, 6H).
Etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]2-furoat in etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8il,metil]-2-furoat:
Cinkovemu kloridu (950 mg, 6,97 mmol) v nitrometanu (20 ml) smo dodali mešanico 4,4,7-trimetilkromana (1,23 g, 6,97 mmol) in etil-5-klormetil-2-furoata (656 mg, 3,48 mmol) v nitrometanu (15 ml). Mešanico smo 16 h mešali pri sobni temperaturi. Reakcijo smo uparili do suhega in zdrobili v etilacetatu/vodi (1:1, 100 ml) . Po običajni obdelavi organske plasti in filtriranju skozi polnilo z uporabo heksanov in etilacetata (9:1) smo dobili mešanico teh dveh spojin. 1,34 g (46% izhajajoč iz kromana).
N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro2H-kromen-6-il)metil]-2-furamid in N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-fur amid:
-7676
Mešanici etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6il)metil]-2-furoata in etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2Hkromen-8-il)metil]-2-furoata (1,34 g, 3,74 mmol) v THF-MeOH-H2O (7:5:5, 20 ml) smo dodali litijev hidroksid monohidrat (784 mg, 18,7 mmol). Mešanico smo 4 h mešali pri sobni temperaturi. Mešanico smo uparili do suhega, nakar smo jo razredčili s 30 ml etilacetata in 50 ml vode. Po nakisanju z razredčeno HCI smo ločili etilacetatno plast, jo sušili in v vakuumu odparili, s čimer smo dobili mešanico ustreznih kislin (količinsko 1,03 g). Z običajno kolonsko kromatografijo ali kristalizacijo ni bilo mogoče ločiti teh kislin. Mešanici kislin (200 mg, 0,66 mmol) v diklormetanu (30 ml) smo dodali tionilklorid (392 mg, 3,3 mmol). Mešanico smo kuhali 1 h ter jo uparili. Ostanek smo raztopili v heksanu/etilacetatu (9:1, 20 ml) in prefiltrirali skozi polnilo iz silikagela (0,5 cm χ 1,0 cm). Ostanku v 10 ml etilacetata smo dodali 2,4,6-trimetoksifenil amin hidroklorid (145 mg, 0,66 mmol), zatem pa še diizopropil etilamin (256 mg, 1,98 mmol). Mešanico smo 16 h mešali pri sobni temperaturi. Reakcijo smo gasili z vodo (10 ml) in ločili etilacetatno plast. S kombiniranjem in kolonskim ter HPLC prečiščenjem smo dobili 15 mg in 21 mg obeh komponent (12%) . Izomere smo ločili s pomočjo HPLC kromatografije z reverzno fazo. Linearni izomer: IH (CDC13): 7,46 (br s, IH), 7,23 (br s, IH), 7,14 (br s, IH), 7,02 (s, 2H) , 6,63 (s, IH), 6,15 (s, 2H), 6,0 (d, IH), 4,17 (t, 2H),
3,93 (s, 3H) , 3,81, 3,80 (2s, 3H vsak), 2,21 (s, 3H), 1,81 (t,
2H) , 1,29 (s, 6H) . M+ pri 466,2. Kotni izomer: AXC07302: 7,25 (br s, IH), 6,91 (d, IH), 6,88 (d, skrit, IH) , 6,53 (d, IH),
5,95 (s, 2H) , 5,72 (d, IH), 3,96 (t, 2H) , 3,8 (s, 3H) , 3,6 (s,
6H), 2,07 (s, 3H), 1,59 (t, 2H), 1,11 (s, 6H). M+ pri 466,1.
-77ΊΊ
Primeri aromatskih spojin Spojina A
a. Etilacetat, trietilamin, čez noč
Spojina B
3. HATU, diizopropil etilamin, DMF, 24 h
b. kalijev t-butoksid v 20% MeOH/DMF, 30 min
c. bromidni reagent, 20% MeOH/DMF, 48 h
Spojina 183
Timol (1,0 ekvivalent, 33,3 mmol) in metil 5-(klormetil)-2furoat (1,0 ekvivalent, 33,3 mmol) smo raztopili v nitrometanu (120 ml, 0,2 M). Tej raztopini smo v dušikovi atmosferi dodali aluminijev triklorid (1,0 ekvivalent, 33,3 mmol), raztopljen v 25 ml nitrometana, ter ga 10 minut segrevali do počasnega vrenja. Grelnik smo izklopili in pustili čez noč v dušikovi atmosferi. Reakcijo smo gasili s 100 ml vode in ekstrahirali z diklormetanom. Surovo mešanico smo uparili do suhega in nanesli na polnilo za kolonsko kromatografijo (razmerje: 1 g surove mešanice/100 g silikagela). Kolono smo izprali s 7 in 11% etilacetata/heksanov, s čimer smo dobili želeni produkt (2,9 g, 30%) . Ester smo z litijevim hidroksidom v THF/MeOH/H23 (35/25/25) hidrolizirali v kislino.
-78- 78 Raztopino 5-(4-hidroksi-5-izopropii-2-metilbenzil)-2furoinske kisline (1,0 ekvivalent, 3,6 mmol, 0,5 M) in 2,6dimetoksianilina (1,0 ekvivalent, 3,6 mmol) smo raztopili v DMFju. Tej mešanici smo dodali HATU (1,0 ekvivalent, 3,6 mmol) in diizopropil etilamin (1,0 ekvivalent, 3,6 mmol) ter mešali čez noč. Mešanico smo 10 minut segrevali pri 45°C. Raztopino smo dali v etilacetat (3-kratni volumen) in izprali z vodo. Organsko plast smo uparili v sirup in izprali s kolonsko kromatografijo (1:100 g surove spojine/g silikagela) s 30 in 50% etilacetatom/heksanom, pri čemer smo dobili: N-(2,6dimetoksifenil)-5-(4-hidroksi-5-izopropil-2-metilbenzil)2furamid (820 mg, 55-odstotni izkoristek).XH NMR (CDC13) 7,22 ppm (IH, t, J=8,68 Hz), 7,08 ppm (IH, d, J=3,40 Hz), 6,99 ppm (IH, s), 6,64 ppm (2H, d, J=8,68 Hz), 6,61 ppm (IH, s), 5,97 ppm (IH, d, J=3,40 Hz), 3,95 ppm (2H, s), 3,85 ppm (6H, s), 3,17 ppm (IH, pentet, J=6,8 Hz), 2,23 ppm (3H, s), 1,25 ppm (3H, s) in 1,23 ppm (3H, s).
Kalijev t-butoksid (1,05 ekvivalenta, 0,128 mmol) smo raztopili v MeOH (24 μΐ) . Raztopini zgoraj navedenega furamida (1,0 ekvivalent, 0,122 mmol, 1 M) v DMF-ju smo dodali raztopino t-butoksida in mešali 30 minut. Zatem smo dodali 2-bromoetil metil eter (1,0 ekvivalent, 0,122 mmol) (20% MeOH/DMF, 1 M) ter mešali 48 ur pri sobni temperaturi, nato prečistili s HPLC z reverzno fazo (metoda: 35-75% 90 min acetonitrila v 0,1% vodni TFA), s čimer smo dobili 8,5 mg (15-odstotni izkoristek). ΧΗ NMR (CDC13) : 7,04 ppm (IH, J=8,31 Hz, t) , 6,85 ppm (IH, J=3,40, d), 6,80 ppm (IH, s), 6,53 (IH, s), 6,48 (2H, J=8,31 Hz, d), 5,76 (IH, J=3,40 Hz, d), 3,88 (2H, J=3,40/4,53 Hz, dd), 3,78 (2H, s), 3,58 (6H, s), 3,54 (2H, J=3,40/4,54 Hz, dd), 3,20 (3H, s), 3,07 (IH, J=7,2 Hz, pentet), 2,04 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,95 (3H,
s) .
Spojina A
1,1,6-trimetil-l,2,3,4-tetrahidronaftalen smo sintetizirali po viru: John J. Parlow, Tetrahedron, vol. 49 (13), 2577. Zatem smo ga vezali z metil 5-(klormetil)-2-furoatom s FriedelCraftsovo reakcijo, kot je navedeno zgoraj, in dobili dva glavna
-79Ί9 regioizomera. Želeni izomer smo ločili po hidrolizi s tremi do petimi zaporednimi prekristalizacijami iz sistema 10% acetona/heptana (lg/10 ml) . Kislino smo nato s tionilkloridom pretvorili v njen klorid, kot je bilo navedeno zgoraj.
Raztopini 5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)metil]-2-furoilklorida (1,0 ekvivalent, 0,32 mmol, 0,2 M) v 2 ml etilacetata smo dodali 2,4,6 trimetoksi anilin mono HCI sol (1,0 ekvivalent, 0,32 mmol). Prebitni trietilamin smo dodali tej mešanici in mešali čez noč. Surovi produkt smo sušili v vakuumu in prečistili s kolonsko kromatografijo (surova masa/silikagel v razmerju 1:100) z izpiranjem s 30- in 40odstotno raztopino etilacetata/heksana. V nekaterih primerih smo regioizomere ločili s prekristalizacijo v 25-odstotnem etilacetatu/heksanih (1 g/75 ml spojine/volumsko), s čimer smo dobili N-(2,4,6-trimetoksilfenil)-5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamid (120 mg, 82-odstotni izkoristek). XH NMR (CDC13) 7,28 ppm (IH, širok), 7,12 (IH, s), 7,08 (IH, J=3, 40 Hz, d), 6,89 (IH, s), 6,19 (2H, s), 6,00 (IH, J=3,40 Hz, d), 3,97 (2H, s), 3,83 (3H, s), 3,82 (6H, s), 2,73 (2H, J=6,05 Hz, t), 2,25 (3H, s), 1,84-1,76 (2H, multiplet), 1,69-1,63 (2H, multiplet), 1,59 (3H, s), 1,26 (6H, s), po elementih: pričakovano C (72,55), H (7,18), N (3,02); dejansko C (72,67), H (7,22), N (2,98).
Spojina 228
-8080
Spojina II. Raztopini 3,5-dimetoksianilina (spojina I, 1,53 g, 10 mmol) v DCM-ju (20 ml) smo dodali metansulfonilklorid (0,88 ml, 10 mmol). Po kapljicah smo dodali TEA (1,40 ml, 10 mmol). Reakcijsko mešanico smo 15 h mešali pri ST. Surovi produkt smo sušili do suhega in prečistili s hitro (flash) kromatografijo (30% etilacetat/heksani) , kar nam je dalo spojino II (2,10 g, 91%) v obliki bele trdnine. 1H NMR δ (300 Hz, CDC13) 2,96 (s, 3H) , 3,71 (s, 6H) , 6,20 (d, IH, J=3 Hz), 6,34 (d, 2H, J=3 Hz), 6,76 (s, IH). APCI-MS m/z 232 (M+H)+.
Spojina III. Raztopini (CH3)4NNO3 (1,12 g, 7,89 mmol) v DCMju (10 ml) smo po kapljicah dodali anhidrid trifluormetansulfonske kisline [triflic anhydride]. Reakcijsko mešanico smo 1,5 h mešali pri 0°C. V kapalni lijak smo' dali spojino II (1,75 g, 7,51 mmol) v 10 ml DCM-ja in raztopino dodajali reakcijski mešanici nitronijevega trifluormetansulfonata [nitronium triflate] pri -78°C. Reakcijsko mešanico smo 30 minut ohranjali pri -78°C, zatem pa jo postopoma segreli na ST. Mešali smo jo 15 h. Reakcijo smo gasili s 5-odstotnim NaHCO3 (50 ml) in mešanico mešali 30 minut. Vodno plast smo ekstrahirali z DCM-jem (3*20 ml) . Kombinirano DCM plast smo posušili z Na2SO4. Surovi produkt smo prečistili s HPLC, kar nam je dalo spojino III (250 mg, 11%) v obliki bele trdnine. XH NMR δ (300 Hz, CDC13) 3,03 (s, 3H) , 3,87 (s, 3H) , 3,90 (s, 3H) , 6,32 (d, IH, J=3 Hz), 6,88 (d, IH, J=3 Hz), 8,31 (s, IH). APCI-MS m/z 275 (M-H).
Spojina IV. Raztopini spojine III (106 mg, 0,38 mmol) v EtOH (2 ml) smo dodali 20 mg Pd/C in NH2NH2 (1 ml) . Reakcijska mešanica gre skozi polnilo iz diatomita. Raztopino smo sušili do suhega, kar je dalo spojino IV v obliki rjave trdnine (90 mg, 95%). To spojino smo neposredno uporabili v naslednjem koraku.
Spojina 228
Raztopini spojine IV (39 mg, 0,16 mmol) in 5-[(3,5,5,8,8pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil]-2-furoilklorida (60 mg, 0,174 mmol) v DCM-ju (1 ml) smo dodali TEA (44 μΐ, 0,31 mmol) . Reakcijsko mešanico smo čez noč mešali pri ST. S hitro
-8181 kromatografijo (30% etilacetat/heksani) dobimo spojino 228 (65 mg, 74%) v obliki bele trdnine. 1H NMR δ (300 Hz, CDC13) 1,04 (m, 12H) , 1,45 (m, 4H) , 2,09 (s, 3H) , 2,71 (s, 3H) , 3,60 (s, 3H) , 3,63 (s, 3H) , 3,78 (s, 2H) , 5,89 (d, IH, J=3 Hz), 6,17 (d, IH, J=3 Hz), 6,58 (d, IH, J=3 Hz), 6,85 (s, IH), 6,90 (s, IH), 6,96 (d, IH, J=3 Hz), 7,90 (s, IH), 8,24 (s, IH). APCI-MS m/z 556 (M+H)+.
Sledijo dodatni izvedbeni primeri (NMR) nekaterih spojin:
Spojina 20
ςΗ NMR δ (300 Hz, CDC13) 1, 26 (m, 12H) l, 1,66 (m, 4H) , 2,28
(s, 3H), 3,82 (s, 6H), 3,96 (s, 2H) , 6,04 (d, IH, J=6 Hz) , 6,60
(s, IH) , 6, 62 (s, IH), 7,05 (m, 3H) , 7,23 (t, IH, J=6 Hz) , 7,44
(s, IH) . APCI- -MS m/z 462 (M+H)+.
Spojina 126
XH NMR δ (300 Hz, DMSO) 2,20 (s, 3H) , 2,27 (s, 6H) , 3,71
(s, 6H), 3,98 (s, 2H) , 5,93 (d, IH, J=3 Hz), 6,68 (s, IH) , 6,69
(s, IH), 6,86 (d, 2H, J=3 Hz), 7,10 (d, IH, J=3 Hz) , 7,23 (t,
IH, J=7 Hz), 9 ,04 (s, IH). APCI-MS m/z 379 (M+H)+.
Spojina 140 XH NMR δ (300 Hz, DMSO) 2,28 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H) , 2,42 (s, 3H), 3,72 (s, 6H) , 4,10 (s, 2H) , 6,00 (d, IH, J=3 Hz), 6,60 (s, IH), 6,68 (s, IH), 6,71 (s, IH), 7,10 (m, 2H) , 7,24 (t, IH,
J=6 Hz), 9,04 (s, IH). APCI-MS m/z 458 (M+H)+.
Spojina 211 XH NMR δ (300 Hz, CDC13) 3,76-3,83 (m, 15H) , 4,07 (s, 2H) , 5,95 (d, IH, J=3 Hz), 6,60 (s, IH), 6,57-6,62 (m, 3H), 6,78 (d, IH, J=9 Hz), 7,03 (d, IH, J=3 Hz), 7,19 (t, IH, J=6 Hz), 7,46 (s, IH). APCI-MS m/z 428 (M+H)+.
Spojina 220 XH NMR δ (300 Hz, CDC13) 3,72-3,77 (m, 15H) , 3,90 (s, 2H) , 5,78 (d, IH, J=3 Hz), 6,08 (s, 2H), 6,52-6,55 (m, 2H), 6,94 (d, IH, J=9 Hz), 7,12 (t, IH, J=9 Hz), 7,39 (s, IH). APCI-MS m/z 428 (M+H)+.
-8282
Spojina 226 XH NMR δ (300 Hz, CD3OD) 2,23-2,48 (m, 12H), 3,84 (s, 6H) , 4,19 (s, 2H), 5,81 (d, IH, J=3 Hz), 6,73 (d, 2H, J=9 Hz), 7,06 (d, IH, J=3 Hz), 7,29 (t, IH, J=9 Hz). APCI-MS m/z 472 (M+H)+.
Spojina 231
2H NMR δ (300 Hz, CDC13) 0,67 (t, 3H, J=6 Hz), 1,27 (m,
6H), 1,70 (m, 2H) , 3,62 (s, 3H) , 3,80-3,83 (m, 6H), 4,02 (s,
2H), 6,02 (d, IH, J=3 Hz), 6,60 (d, 2H, J=9 Hz), 6,83 (d, IH,
J=3 Hz) , 7,07 -7,19 (m, 4H), 7,43 (s, IH). , APCI-MS m/z 438
(M+H)+.
Spojina 232
2H NMR δ (300 Hz, CDC13) 0,66 (t, 3H, J=6 Hz),' 1,23 (m,
6H), 1,54-1, 62 (m, 2H) , 3,80-3,81 (m, 12H), 4,01 (s, 2H), 6,00
(d, IH, J=3 Hz), 6,81 (d, 2H, J=9 Hz), 6,82 (d, IH, J=3 Hz),
7,06-7,28 (m, 4H). APCI-MS m/z 468 (M+H)+.
-8383
Primeri drugih aromatske spojine vsebujočih spojin
Sinteza 5-(5-cikloheksil-2-metilbenzil)-N-(2,4,6trimetoksifenil)-2-furamida.
Mešanici spojine 1C (5,0 g, 20,3 mmol) in metil furoata (3,5 g, 20,3 mmol) v 100 ml nitrometana smo dodali raztopino A1C13 (5,4 g, 40,6 mmol) v CH3NO2 (50 ml) pri sobni temperaturi. Raztopino smo čez noč segrevali na 70~75°C. Temnorjavo mešanico smo ohladili na sobno temperaturo in polagoma prelili v 300 ml ledene vode. Mešanico smo ekstrahirali z etilacetatom. Koncentrirano organsko plast smo prečistili s kromatografijo na silikagelu in izprali s heksanom/etilacetatom (15:1 do 9:1 V/V), kar nam je dalo 920 mg spojine 2C, ki smo jo zatem po splošnem postopku hidrolizirali in spojili s trimetoksianilinom, s čimer smo dobili spojino z dobrim izkoristkom. 1H NMR (CDC13) : σ 1,231,48 (m, 5H) , 1,73-1,86 (m, 5H) , 2,31 (s, 3H) , 2,51 (m, IH), 3,83 (s, IH), 4,02 (s, 2H) , 6,03 (s, IH), 7,44 (s, IH) MS (APCI): 464,2 (M+l)
-8484
-8585
Sinteza 5-(5-acetil-2,4-dimetilbenzil)-N-(2,4,6trimetoksifenil)-2-furamida.
Mešanico spojine 3C (14 g, 94,4 mmol), metilfuroata (16,4 g, 94,4 mmol) in A1C13 (25 g, 189 mmol) v 200 ml nitrometana smo čez noč mešali in segrevali,pri 80°C. Mešanico smo obdelali in prečistili s kolono silikagela ter izprali s heksanom/etilacetatom (9:1 v/v), s čimer smo dobili mešanico spojin 4C in 5C (3:1, skupno 16,2 g).
Mešanico spojin 4C in 5C (2,0 g) smo hidrolizirali v 2N NaOH/MeOH (1:1 V/V) pri sobni temperaturi, s čimer smo dobili mešanico spojin 6C in 7C, ki smo jo prekristalizirali v acetonu in heptanu, tako da smo dobili 6C (460 mg).
Spojino 6C (150 mg, 0,55 mmol) smo obdelali s tionilkloridom in spojili s trimetoksi anilinom, s čimer smo dobili AXC07485 (124 mg). ΧΗ NMR (CDC13) : σ 2,31 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 3,80 (s, 9H), 4,02 (s, 2H), 6,00 (d, lh), 6,16 (s, 2h) , 7,08 (s, IH), 7,35 (s, IH), 7,52 (s, IH), MS (APCI): 438,7 (M+l)
Sinteza 5-(5-izopropenil-2,4-dimetilbenzil)-N-(2,4,6trimetoksifenil) -2-furamida
-8686
Raztopini spojine 6C (250 mg, 0,92 mmol) v 5 ml suhega THFja pri 0eC pod N2 smo dodali metillitij (1,4 M v heksanih, 3 ekvivalenti) . Raztopino smo 3 ure mešali pri 0°C, jo gasili z vodo in ekstrahirali z etilacetatom. Organsko plast smo sušili z magnezijevim sulfatom in jo skoncentrirali pri zmanjšanem tlaku. Surovo spojino smo obdelali s SOC12 in spojili s trimetoksi anilinom, da smo dobili ΑΧ007499 (36 mg). XH NMR (CDC13) : σ 1,80 (s, 3H), 2,06 (s, 3h), 2,11 (s, 3h), 3,59 (s, 9H), 3,75 (s, 2H), 4,60 (d, IH), 4,95 (d, IH), 5,81 (d, IH) , 5,95 (s, 2H) , 6,71 (s, IH), 6,79 (s, IH), 6,89 (d, IH), 7,18 (s, IH). MS (APCI):
436,2 (M+l)
Sinteza 5-[(4,6-dimetil[1,1'-bifenil]-3-il)metil]-N-(2,4,6 trimetoksifenil)-2-furamida.
-8787
Friedel-Craftsovo reakcijo spojine 9C (10 g, 57,3 mmol), metilfuroata (12,7 g, 68,7 mmol) in A1C13 (9,1 g, 68,7 mmol) smo izvajali v nitrometanu 2 uri pri 80°C. Raztopino smo prelili v 200 ml ledene vode in jo ekstrahirali z etilacetatom. Organsko plast smo skoncentrirali in prečistili s kolono silikagela ter izprali s heksanom/etilacetatom (9:1 V/V), s čimer smo dobili mešanico regioizomerov 10C in 11C (15,5 g) v razmerju 2:1.
Mešanico smo hidrolizirali v 2N NaOH/MeOH (1:1 V/V), da smo dobili mešanico kislinskih analogov.
Mešanico kislin (2,3 g, 7,4 mmol), benzenborove kisline [benzene boronic acid] (1,1 g, 8,9 mmol), [P(Ph)3]4Pd in kalijevega karbonata (2N, 11 ml) v DMF-ju (20 ml) smo čez noč segrevali na 80°C. Po obdelavi z vodo smo ostanek spustili skozi kolono silikagela in ga izprali z mešanico topil heksan/etilacetat/ocetna kislina (7:3:1 V/V/V), kar nam je dalo mešanico 2 regioizomerov, ki smo jo prekristalizirali v heksanu in etilacetatu, s čimer smo dobili spojino 12C (610 mg). Spojino 12C smo po standardnem postopku spojili s trimetoksianilinom, da smo dobili AXC07468 z dobrim izkoristkom. 1H NMR (CDC13) : σ 2,24 (d, 3H), 2,33 (d, 3H), 3,82 (s, 6H), 3,84 (s, 3H), 4,02 (s, 2H), 6,03 (d, IH), 6,18 (s, 2H) , 7,06 (s, 2H) , 7,12 (s, IH) , 7,297,40 (m, 5H). MS (APCI): 472,1 (M+l).
-8888
Sinteza 5-[5-(2,2-dimetilpropanoil)-2,4-dimetoksibenzil] -N(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
Spojino 15C smo pripravili v dveh korakih Friedel-Craftsove reakcije (glej splošni postopek) iz spojine 13C s solidnim izkoristkom in dobro regioselektivnostjo. Spojino 15C smo hidrolizirali in spojili s trimetoksianilinom, s čimer smo dobili spojino. 1H NMR (CDC13) : o 1,18 (s, 9H) , 3,79 (s, 3H) ,
3,81 (s, 6H), 3,85 (s, 6H), 3,93 (s, 2H), 6,03 (d, IH), 6,15 (s, 2H) , 6,45 (s, IH), 6,86 (s, IH), 7,11 (s, IH), 7,40 (s, IH) . MS (APCI) 512,1 (M+l).
-8989
Sinteza 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenil)karbonil]-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida in 5[hidroksi(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro2naftalenil)metil]-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
Mešanico spojine 19B (9,0 g, 27,5 mmol) in MnO4 (8,2 g,
82,7 mmol) v mešanici topil kloroforma in dikloretana smo čez noč segrevali na 70°C. Po obdelavi z vodo smo spojino 20B prečistili s kolono silikagela in izprali s heksanom/etilacetatom/ocetno kislino (90:10:1 V/V/V). AXC07042 smo dobili s splošnim postopkom za tvorbo amidne vezi. XH NMR (CDC13) : 0 1,26-1,31 (2s, 12H), 1,70 (s, 4H), 3,81 (s, 6H), 3,83 (s, 3H), 6,18 (s, 2H), 7,05 (d, IH), 7,22 (s, IH), 7,29 (d, IH), 7,52 (s, IH), 7,68 (s, IH). MS (APCI): 506,2 (M+l).
-9090
Spojino (50 mg) smo obdelali z NaBH4 (1,5 ekvivalenta) v etanolu (2 ml) in dietiletru (0,5 ml). Raztopino smo 1,5 ure mešali pri sobni temperaturi, gasili z vodo in ekstrahirali z etilacetatom. Organsko plast smo skoncentrirali in dobili spojino v obliki bele trdnine. XH NMR (CDCI3) : σ 1,24, 1,28, 1,29 (3s, 12H) , 1,66, 1,67 (2s, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,55 (d, IH), 3,80 (s, 6H) , 3,82 (s, 3H) , 5,98 (d, IH) , 6,17 (s, 2H) , 7,08, 7,10 (2s, 2H) , 7,38 (s, IH), 7,41 (s, IH). MS (APCI) : 508,2 (M+l) .
Sinteza 5-(5-{l-[(etilamino)karbonil]ciklopropil}-2metilbenzil)-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-furamida
Raztopino spojine 22B (2,0 g, 11,3 mmol) v tionilkloridu (8 ml) smo 3 minute segrevali do vreliščne temperature. Neizrabljeni tionilklorid smo odstranili z rotacijskim evaporatorjem. Koncentrirani ostanek smo raztopili v CH2C12. Tej raztopini smo dodali etilamin (prebitek) in dobili spojino 23B (1,3 g). Spojino smo pretvorili v AXC07555 v 3 korakih (FriedelCraftsova reakcija, hidroliza, tvorba amidne vezi), kot je
-9191 opisano med splošnimi postopki. XH NMR (CDC13) : σ 0, 94-1,02 (m,
5H), 1,59 (m, 2H), 2,34 (s, 3H), 3,17 (q, 2H), 3,80, 3,81 (2s, 9H), 4,01 (s, 2H), 5,39 (brd, IH), 6,01 (d, IH), 6,17 (9s, 2H), 7,11 (d, IH), 7,21 (m, 2H) , 7,31 (9s, IH). MS (APCI) : 493,2 (M+l)·
Dodatne izvedbe:
MeOH
H^SO«
NaOH
THF
-9292
Uporabna vmesna spojina se lahko pripravi na naslednji način:
Priprava metil-5-(klormatil)-2-furoata
Potreben material
Material Koncent racija Mol. masa Količin a Število molov Število ekvival entov Gostota CAS
Metil 2- furoat 97 126,11 0,371 kg 2,88 1 1,179 [611-13-2]
Formaldehid(aq i 37% 30, 03 0,371 1 4,95 1,72 1,083 [50-00-0] !
HCl 37% 36,46 2,2 1 22,3 7,74 1,19 [7547-01- oj
h2so4 95-96% 98,08 1,1 1 11 3,82 1,84 [7664-93- 91
Diklormetan Reagent 84,93 2,2 1 - - 1, 325 [75-09-2]
ZnCl2 98% 136,28 0, 520 kg 3,7 1,3 - [7646-85- 7]
Diklormetan Reagent 84,93 vir ★ ★ ★ ★ ★ J- - - 1,325 [75-09-2]
NaHCO3 (4q) Nasičen - •k ★ ★ ★ ★ - - - [144-55-8]
Silikagel - - 0, 600 kg - - - -
Na2SO4 98% - Po potrebi - - - [7757-82-
-9393
Postopek za pripravo 2,88-molske šarže metil 5-(klormetil)2-furoata (2D) po točkah s 3 vratovi in okroglim dnom lijakom; zgoraj je nameščeno termoelement; ledena kopel.
pa ni nujno
12-litrsko steklenico opremimo z dodatnim električno mešalo;
(Priporočljiva je dušikova odeja, ki potrebna)
V steklenico z okroglim dnom damo 2,2 1 DCM-ja, nato pa še 2,2 1 koncentrirane HCI. (Kake znatnejše eksotermne reakcije ni opaziti; naredita se dve plasti).
Pričnemo z mešanjem. (Zagotoviti je treba ustrezno mešanje obeh faz).
V lijak za dolivanje dodamo 1,1 1 H2SO4 glede na razpoložljivi prostor. Reakcijsko posodo ohladimo na 0 do 10°C, nakar pričnemo vanjo dovajati žveplovo kislino; sprva po kapljicah, dokler se eksotermna reakcija ne umiri (približno polovico količine), nakar dovajanje pospešimo do tankega curka. (Temperaturo iz varnostnih razlogov vzdržujemo pod 20°C)
Hladilno kopel zamenjamo z vodo pri sobni temperaturi. (Tako zagotovimo zadostno odvajanje toplote pri sledečih dolivanjih, ne da bi bistveno zmanjšali reakcijske hitrosti)
V steklenico z okroglim dnom dodamo naenkrat 0,371 kg metil 2-furoata. (Ni opazne eksotermne reakcije, zelenorjava raztopina)
Dodamo 0,520 kg ZnCl2 v več etapah. (Nekaj brbotanja sklepamo na HCI v plinski obliki; eksotermno reakcijo uravnava vodna kopel)
V izprani lijak za dolivanje nalijemo 0,371 1 formaldehida. V reakcijsko posodo ga spuščamo tekom 2,53,5 ur. (Vodna kopel vzdržuje temperaturo na sobni temperaturi; s počasnim dodajanjem dosežemo, da med »prostimi« formaldehidi poteče manj polimerizacijskih reakcij)
Mešamo čez noč pri sobni temperaturi.
Ko tankoplastna kromatografija pokaže, da je reakcija zaključena (glej dalje), vodno plast odtočimo. Organsko
-9494 plast prefiltriramo skozi 0,550-kilogramsko polnilo iz silikagela (suho pakirano, debelo okrog 10 cm) . Izperemo s približno 4 1 DCM-ja, dokler tankoplastna kromatografija ne pokaže, da v izpirku ni več produkta. (Poskrbite, da se ta korak izvaja ob zadostni ventilaciji, saj so še vedno prisotne določene kislinske izparine, celo v filtratu)
Skoncentriramo, tako da dobimo olje, katerega barva je nekje med rumeno in rjavo (okrog 0,5 1)
Dodamo enako količino DCM-ja, t.j. okrog 0,5 1. Izperemo z 2*0,2 1 destilirane vode. Zatem izperemo organsko plast z 0,05 1 nasičenega NaHCO3 v 0,15 1 destilirane vode. (S tem dosežemo, da je pH med 7 in 10, v vodni plasti se ne izgubi znatnejša količina produkta)
Odtočimo vodno plast, organsko plast pa sušimo z Na2SO4. Prefiltriramo skozi 0,05 kg silikagela (debelega okrog 5 cm). Izpiramo z DCM-jem, dokler v izpirku ni več produkta.
Skoncentriramo z rotovapom z uporabo hišnega sesalnika. Zatem damo olje čez noč v visokotlačno vakuumsko črpalko. (Rumeno do svetlorjavo olje).
Izkoristek je v območju 95-100%.
Čistost je v območju 95-98% (HPLC A%).
Dodatne pripombe
Vizualno: reakciji sledimo s tankoplastno kromatografijo (254 nm) z uporabo 30% EtOAc/heksanov (r. f. izhodiščnega materiala - 0,52, r. f. produkta - 0,40).
HPLC: metoda TFA (metoda in spektri priloženi). Rt izhodiščnega materiala=12,67 min., rt produkta=17,37 min.
NMR: XH (CDC13) (spektri priloženi) 3,93 (s, 3H) , 4,63 (s, 2H), 6,52 (d, IH), 7,18 (d, IH).
-9595
Če se reakcija ni zaključila, lahko vsake 4 ure dodamo 10% prvotnega volumna formaldehida. Temperaturnih učinkov nismo izčrpno raziskali, vendar se je izkazalo za primerno, da se temperatura v posodi vzdržuje znotraj obsega, navedenega za vsak posamezni korak. Zaradi kislih izparin, prisotnih v organski plasti celo po filtraciji, je rokovanje zunaj lovilca izparin (fume hood) problematično, zato moramo biti previdni, ko material prenašamo izven lovilca izparin, preden je pH nevtraliziran. Če povečamo hitrost dodajanja formaldehida, se bo formaldehid porabljal za nastajanje polimerov, s čimer bo preprečeno, da bi se reakcija končala. Pred začetkom tega postopka se moramo dogovoriti z varnostno službo, ker je treba odvesti velike količine kisline, ki se sprošča z vodno plastjo. Nevtralizacija vodne kisle plasti zahteva veliko količino baze, sprošča precej toplote in zahteva daljši čas dodajanja, zato ni priporočljiva. Končni produkt je treba držati na hladnem, ker podatkov o njegovi stabilnosti ni na voljo. Če ga skladiščimo v posodi iz Nalgena pri temperaturi -20°C, produkt kristalizira in material rahlo potemni, kar pa nima opaznih učinkov na kasnejše reakcije, v katerih ta material uporabimo.
Spojine po pričujočem izumu bi morale biti uporabne za zdravljenje:
1. od hormonov odvisnih oblik raka/tumorjev
2. od hormonov neodvisnih oblik raka/tumorjev potom neposrednih interakcij
3. uporaba v drugih mehanizmih delovanja.
Mišljeno je, da vlagateljev patent zajema še številne druge izvedbe, ki v pričujočem besedilu niso izrecno opisane, zato tega izuma ne gre razumeti, kot da je omejen na gornje primere oziroma prednostne izvedbe.
V nadaljevanju navedene spojine so bile pripravljene tako, kot je bilo povedano zgoraj. Določene lastnosti nekaterih izmed
-9696 spojin so bile izmerjene s postopki, ki so bili prav tako zgoraj opisani. S%R je preostali substrat. Čim bliže vrednosti nič se S%R nahaja, bliže je 100-odstotni inhibiciji.
-9797
-9898
Antagonist
950 O co h-
260 3080
940 10400
Ο 1010 ! 0000K OOOOK 1420 1350 5030 O 230 (210*)
f l-J—' rJ O 1 T c?
in CM 26 r*. CM 28 29 30 in o CO CM
-9999
C o
σ>
m c
<
c o
ω c
<
2100
-100100
-101101
-102102
-103103
o co in 't- o co
o co o o co
029 460 S09
830 205 096 4200 o co in m O m o co h-
5 s
5 P Szi Os:/ Ž3 O= e z 2^4 C 8 4: o=/
K? X M &
r- m CO 'in O) in o co r* co V“ O) T“ CO
-104104
Antagonist (podg.)
Ο 04 NJ- ΓΟ 1010
ΙΛ ο CO Ο ο
V 00
Ο ο
CO
CO 500 125 Ο ο ο 06
04 C0
Ο §
ο
Λ
Ά_ Ο
8 .ρ ? φ ο=/ ο= #> <r ο 4=
>& >8< /“ >8< \/.
04 <Ο ο 04 CO CO tJ- <£> to CO CO CO Ν- CO co co
-105105
-? & ω ‘c ο Ο) Έ <
CD ΙΌ C0 2940 ο Ν·
Ο C0 2140 Ο ’Τ 5300
<ο 1440
' 1410 ο ιό 0002 Ο C0 ο C0 ΙΌ Ο CO ν~ ΙΌ Τ“ Τ 2 Ο C0 ω
f b> e o=^2j
05 (Ο ο r* τ- h- C4 r- co r» Μ b» ΙΌ h- <0 h-
-106106
8450 1300 O rs. co 5610 0808 9200 1740 770
οοοο 0 >1000 (<10000) o m Csl ZC 'W 10000 12000 1 10000 O CM ω . o t o=^_ 8000
Cl o=^ .... J ^4 Z OsK
h- h- az I I 6Z o co co 28 co co 84
-107107
ο σ> h*
>10000 510 2050 3310 2340 2730 1260 0S6
12000 0008 2570 270 Ο ο ο ν- Ά Ο ΙΟ CM άχΑ^ιχ,» A 1 560 Ο CN Τ“ S-/ 7
0 ' ' 8
85 98 86.5 Ν. CO 88 89 Ο σ> τ— ο
-108108
CM •st 1300 CM 130
N- CM 5470 1490 1580 I 4830 09 06 1690
08 8000 ID CO O o o co e 0, >1000 (<10000) co 40 1700
& J U _x
92 93 94 94.2 94.5 95 96 97
-109109
84 105 Ο ο 04
220 00 ο 0009 >10000 026 3460 1260 Ο ΙΟ OJ
08 56 585 >10000 Ο G0 Ο ω C0 σ 4 I Ο ο ο ο V ο ο ο U. Λ 04 04
Ο— 1 ΙΓ ο=/ ο 1
98 99 001 Τ- Ο 102 103 104 105
-110110
O
510 >10000 O N. CM I 140 >10000 1740 7780 300
2000 0000 K 1000 to r*. 12000 O co CD 12000 O co z
oaJ 0 O=^. -i» f o=^—j
106 107 108 109 o t*· CM co
-m111
-112112
-113113
Antagonist Antagonist
CO 8.6 360
06S CQ N- 'T O o
A 3000 009 640 490 co 1440 T σ> A 2 o o 200
0 > ' L % I I A
130 131 132 133 5 135 136 zet-
-114114
-115115
in co co r— 5.2 CN CD CO
co CD CO CN v— 22
09 CN O o in o O O
co N» CN m V“
5
iral
ιοοοκ J<C 5 's—z C *O i (J ε C1 •5 o .—( ε k s 5 ?
A S p, λ-C
ί O«/ o«/“ k” O-/
& & i X Ja >& & y~ C
146 h- 2 co O- 149 150 £ 152 153 154
-116116
O o ''T CD
o K. Osi LO fi
Ο Osi O O LO O o
Osi CD O co co
o
e < „ o o Λ*
*<= o 4x o=^ 5 \~o
c t
°S o Ο·$η Οβζ >=i >=l
>a & >& & a & & >§<
LO CD LO N- co O> o *P- Osi
r— ί CD CD ·*“
-117117
-118118
Antagonist
o CO
LO
tn CO h-
co in
Ο O O o in
CM CO GO CM LN CM m h-* co
(kiral) co (kiral)
« s L> S >10001 Chlra °p n Š «a
. c k
\d- <5 P V
Jv O= o- s k -i § </ A- Osa/ d
& <7 & & δ &.
N- CM h-. co in co r*- 00
It T-
-119119
Antagonist
N- CM O h- CM
ΙΩ CM 250
Ο 05 τ— O m co o 05 T“ 430 6.8 1 560 120 7310
i O V' F '“ii . '^° i — i jrS O^—-J ΟΟγίΡΟδ 0 3¾° -T
179 180 181 CM CO 183 Ϊ84 uo co 186
-120120
-121121
Antagonist
Si- ID r~ CO
35 CD co
σ> CN
co o O CN CN o
o h- O o ^J- CO CN
2 r—
□ 3
co CO
A. Λ
O. cL
o *a>
o o Λ 2
32 č? b- °c?
Č° o -oxjv Vm ° o <4 1 1 —o TV
c K V/ p Po-
\==/ v S /Zn/
v λΖ' S/ SZ —C3— \/ . \=/ °-ς
X\— z x—' x r\ ΧΖΧ <
LO
sr σ> 95 CD O b- σ> s o σ> o o o 0
L·- — T- T“ CN CN
-122122
OJ co cO co
co m co OJ
380 1425 o CO «r- o o. OJ v· >10000 OJ m o o OJ 8620
o—/ I 0 o o=/ \/ ,1 \
201 OJ O OJ co o OJ ^J· o OJ LO O OJ co o OJ o- o OJ co o OJ
-123123
<Μ C0
CM τ-
4380 12000 1320 Ο CO Ζ ο >10000 >10000 0082 4400
-O ο—Z —°\ ο·Ζ Ο—<κ\—ο ζ \ \ Ο··Ζ 0—#-^_0 ' ζ \ 8-ο< 8-δ <*ι>
209 210 211 212 213 214 215 216
-124124
Τ— CM Ο) 65
τ— CM ν- Τ“ 78
29 6460 875 630 ΙΟ Τ” Ο 1660 0000 Κ
/ °~· S—^2$ jOl ©-ζ oJ^S Λ _h·'
217 218 219 220 221 222 223 224
-125125
Ο ΙΩ CO Ο CM b- Tj- CM 03
Ο 130 r- m S r-
CM
174 240 - 00001 b* CM 250 08S ΙΛ 03
Λ
— J </ 2”\ v O'*'
-θ' 4-·' 3γ· o«^ ^•e*'
o °— \ /
f- -f / -/V- o Z \ \7 o=< \ f V7
225 226 227 228 229 230 231 232
-126126
89 SOI CO
m 290
09 >10000 ‘ O CM N- CO 903 0000 K 0G9Z O co CM CO
I 400¼ Cl -^XXo- V Q==^^/ xo o Cl V 0^ ©-.<> 0 0 l
233 234 m co CM 236 237 238 299 300
-127127
co o
co t—
v-
220 008
CM
45 co O CM CO o o O
CO co M- O
CM
o o
o o
o o
o o
T-
Λ Λ
1
0=/ K—O J/č G~/ 'it o_£ o f
o H o o 5$-δ </ t* νξ-/
>o< cP -o o >o<
tO o o
1 tn m
o co O co
h* co n. b»
o o o
T— CM co O o o o
o CO 30 oe 30 š š $ $
-128-

Claims (8)

  1. Patentni zahtevki
    1. Spojina s formulo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz:
    ali farmacevtsko sprejemljiva sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine.
  2. 2. Spojina s formulo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz:
    -129129 ali farmacevtsko sprejemljiva sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine.
  3. 3. Spojina s formulo:
    ali farmacevtsko sprejemljiva sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine.
  4. 4. Spojina s formulo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz:
    in
    -130130 ali farmacevtsko sprejemljiva sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine.
  5. 5. Spojina s formulo:
    ali farmacevtsko sprejemljiva sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine.
  6. 6. Spojina s formulo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz:
    ali farmacevtsko sprejemljiva sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine.
  7. 7. Farmacevtska zmes, ki vsebuje: terapevtsko učinkovit odmerek spojine, njene farmacevtsko sprejemljive soli, multimera, predzdravila oziroma aktivnega metabolita po katerem koli izmed zahtevkov 1 do 6; ter farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali topilo.
  8. 8. Uporaba terapevtsko učinkovitega odmerka spojine, njene farmacevtsko sprejemljive soli, multimera, predzdravila oziroma aktivnega metabolita po katerem koli izmed zahtevkov 1 do 6 za izdelavo medikamenta za uravnavanje izločanja gonadotropinov pri sesalcih.
    -131131 kjer je R3 izbran izmed vodika, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R izbran izmed vodika, COR, in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila in heteroarila, in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
    sta R4 in R5 neodvisno izbrana izmed vodika, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj; in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
    je R6 izbran izmed vodika, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, COR, CH2OR, OR in C(O)OR; kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12, pri čemer R3, R4, R5 in R6 niso vsi vodik;
    je R7 izbran izmed vodika, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR; kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12; ali pa R6 in R7, vzeta skupaj z atomi, na katere sta vezana, tvorita fakultativno substituiran 5- ali 6-členi obroč, ki ima fakultativno do štiri heteroatome, izbrane izmed 0, N in S;
    -132132 je R8 lipofilni del, izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 6 in 20;
    R9 pa je izbran izmed vodika in substituiranega in nesubstituiranega alkila.
    1θ· Farmacevtska zmes, ki vključuje:
    (a) terapevtsko učinkovit odmerek spojine s formulo I:
    R5 R1 R2 kjer je X izbran izmed C=O, C=S, S=O in S(O)2;
    5-členi heterociklični obroč, vsebujoč med 1 in 4, prednostno 2 ali 3 heteroatome, izbrane izmed N, 0 in S, pri čemer je lahko obroč nasičen, delno nenasičen ali popolnoma nenasičen ter je lahko aromatski;
    sta R1 in R2 neodvisno izbrana izmed H in nižjega alkila;
    je R3 izbran izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila in heteroarila, in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
    sta R4 in R5 neodvisno izbrana izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj; in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
    -133133 sta R6 in R7 neodvisno izbrana izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR; kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12; ali pa R6 in R7, vzeta skupaj z atomi, na katere sta vezana, tvorita fakultativno substituiran 5- ali 6-členi obroč, ki ima fakultativno do štiri heteroatome, izbrane izmed 0, N in S;
    je R8 lipofilni del, izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 6 in 20;
    je R9 izbran izmed H in substituiranega in nesubstituiranega alkila; ali farmacevtsko sprejemljivo sol, multimer, predzdravilo oziroma aktivni metabolit navedene spojine; ter (b) farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali topilo.
    H_ Uporaba terapevtsko učinkovitega odmerka spojine s formulo I:
    C=0,
    C=S, kjer je X izbran izmed
    S=O in S(0)2;
    je sta
    5-členi heterociklični obroč, vsebujoč med 1 in 4, prednostno 2 ali 3 heteroatome, izbrane izmed N, 0 in S, pri čemer je lahko obroč nasičen, delno nenasičen ali popolnoma nenasičen ter je lahko aromatski;
    R1 in R2 neodvisno izbrana izmed H in nižjega alkila;
    -134134 je R3 izbran izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila in heteroarila, in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
    sta R4 in R5 neodvisno izbrana izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj; in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12;
    sta R6 in R7 neodvisno izbrana izmed H, halogena in substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR in C(O)OR; kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 1 in 12; ali pa R6 in R7, vzeta skupaj z atomi, na katere sta vezana, tvorita fakultativno substituiran 5- ali 6-členi obroč, ki ima fakultativno do štiri heteroatome, izbrane izmed 0, N in S;
    je R8 lipofilni del, izbran izmed substituiranega in nesubstituiranega alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH20R, OR in C(O)OR, kjer je R določen tako kot zgoraj in kjer je skupno število vseh navzočih ogljikovih atomov (ne upoštevajoč morebitnih substituentov) med 6 in 20;
    R9 pa je izbran izmed H in substituiranega in nesubstituiranega alkila;
    ali uporaba farmacevtsko sprejemljive soli, multimera, predzdravila oziroma aktivnega metabolita navedene spojine za izdelavo medikamenta za uravnavanje izločanja gonadotropinov pri sesalcih, ki tako uravnavanje potrebujejo.
SI9920076A 1998-08-20 1999-08-20 Nepeptidni GnRH agensi ter metode in vmesne spojine za njihovo pripravo SI20746A (sl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9752098P 1998-08-20 1998-08-20
PCT/US1999/018790 WO2000020358A2 (en) 1998-08-20 1999-08-20 NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI20746A true SI20746A (sl) 2002-06-30

Family

ID=22263796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9920076A SI20746A (sl) 1998-08-20 1999-08-20 Nepeptidni GnRH agensi ter metode in vmesne spojine za njihovo pripravo

Country Status (33)

Country Link
EP (1) EP1105120B1 (sl)
JP (1) JP2002535244A (sl)
KR (1) KR20010085402A (sl)
CN (1) CN1379666A (sl)
AP (1) AP2001002053A0 (sl)
AT (1) ATE291423T1 (sl)
AU (1) AU759310B2 (sl)
BG (1) BG105362A (sl)
BR (1) BR9913374A (sl)
CA (1) CA2341346A1 (sl)
CZ (1) CZ2001523A3 (sl)
DE (1) DE69924387D1 (sl)
EA (1) EA200100255A1 (sl)
EE (1) EE200100102A (sl)
ES (1) ES2237966T3 (sl)
GE (1) GEP20043315B (sl)
HR (1) HRP20010206A2 (sl)
HU (1) HUP0103622A3 (sl)
ID (1) ID29244A (sl)
IL (1) IL141396A0 (sl)
IS (1) IS5846A (sl)
LT (1) LT4904B (sl)
LV (1) LV12732B (sl)
NO (1) NO20010309L (sl)
NZ (1) NZ509252A (sl)
OA (1) OA11599A (sl)
PL (1) PL356984A1 (sl)
SI (1) SI20746A (sl)
SK (1) SK2262001A3 (sl)
TR (1) TR200100631T2 (sl)
WO (1) WO2000020358A2 (sl)
YU (1) YU13701A (sl)
ZA (1) ZA200100831B (sl)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2133587C (en) * 1992-04-22 2008-11-18 Marcus F. Boehm Compounds having selectivity for retinoid x receptors
IL145401A0 (en) * 1999-03-24 2002-06-30 Anormed Inc Chemokine receptor binding heterocyclic compounds
CO5370679A1 (es) * 1999-06-01 2004-02-27 Smithkline Beecham Corp Inhibidores fab 1
TWI243164B (en) 2001-02-13 2005-11-11 Aventis Pharma Gmbh Acylated indanyl amines and their use as pharmaceuticals
BR0210191A (pt) * 2001-06-06 2004-04-06 Agouron Pharma Agentes não peptìdicos da gnrh, composições farmacêuticas e métodos para o seu uso, e processos para os preparar e aos seus intermediários
JP4544857B2 (ja) * 2001-06-11 2010-09-15 ヴァイロケム ファーマ インコーポレイテッド Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ感染の治療または予防のための化合物および方法
CA2458533C (en) 2001-10-09 2011-01-04 Tularik Inc. Imidazole derivates as anti-inflammatory agents
GB0126292D0 (en) * 2001-11-01 2002-01-02 Smithkline Beecham Plc Compounds
JP2005170790A (ja) * 2002-01-09 2005-06-30 Ajinomoto Co Inc Ｎ−アルキルスルフォニル置換アミド誘導体
US6521395B1 (en) * 2002-01-30 2003-02-18 Eastman Kodak Company Infrared couplers for incorporating and recovering metadata
AU2003202115A1 (en) * 2002-02-12 2003-09-04 Pfizer Inc. Non-peptide compounds affecting the action of gonadotropin-releasing hormone (gnrh)
TW200304820A (en) * 2002-03-25 2003-10-16 Avanir Pharmaceuticals Use of benzimidazole analogs in the treatment of cell proliferation
BR0312123A (pt) 2002-06-13 2005-03-29 Pfizer Agentes de gnrh não peptìdicos, composições farmacêuticas e métodos para o seu uso
ATE334687T1 (de) * 2002-11-20 2006-08-15 Paradigm Therapeutics Ltd Heterozyklische siliziumverbindungen und deren verwendung zur behandlung von krankheiten oder zuständen, die mit gonadotropin-freisetzenden hormon assoziiert sind
CN100451004C (zh) * 2003-03-31 2009-01-14 大正制药株式会社 嘧啶衍生物
EP1464335A3 (en) * 2003-03-31 2007-05-09 Taisho Pharmaceutical Co. Ltd. Quinoline, tetrahydroquinoline and pyrimidine derivatives as mch antagonist
US7427683B2 (en) * 2003-04-25 2008-09-23 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. c-fms kinase inhibitors
EP1631560A2 (en) * 2003-04-25 2006-03-08 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. C-fms kinase inhibitors
EP1628661A2 (en) * 2003-06-05 2006-03-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modulators of vr1 receptor
JP2007516192A (ja) * 2003-07-09 2007-06-21 パラダイム・セラピューティクス・リミテッド 有機ケイ素化合物およびその使用
RU2303595C2 (ru) 2003-07-10 2007-07-27 Пэредайм Терапьютикс Лтд. Силиконовые соединения и их применение (варианты)
US20050182061A1 (en) * 2003-10-02 2005-08-18 Jeremy Green Phthalimide compounds useful as protein kinase inhibitors
US20090291915A1 (en) * 2004-12-17 2009-11-26 Graham Andrew Showell Silicon Compounds and Their Use
KR20080016597A (ko) 2005-05-13 2008-02-21 바이로켐 파마 인코포레이티드 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료용 화합물 및 그의예방 또는 치료 방법
US8193206B2 (en) 2005-06-14 2012-06-05 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Pyrimidine compounds
EP1890703B1 (en) 2005-06-14 2016-05-11 Taigen Biotechnology Pyrimidine compounds as chemokine receptors inhibitors
JP2008543965A (ja) * 2005-06-28 2008-12-04 タケダ・ケンブリッジ・リミテッド 複素環式非ペプチドｇｎｒｈ拮抗薬
DK1910384T3 (da) * 2005-08-04 2012-12-17 Sirtris Pharmaceuticals Inc Imidazo [2,1-b] thiazol-derivater som sirtuinmodulerende forbindelser
EP2001480A4 (en) 2006-03-31 2011-06-15 Abbott Lab Indazole CONNECTIONS
US20080070987A1 (en) * 2006-05-12 2008-03-20 Francesc Yraola Font Meta-xylylenediamine vanadate salts
CL2008001822A1 (es) 2007-06-20 2009-03-13 Sirtris Pharmaceuticals Inc Compuestos derivados de tiazolo[5,4-b]piridina; composicion farmaceutica que comprende a dichos compuestos; y uso del compuesto en el tratamiento de la resistencia a la insulina, sindrome metabolico, diabetes, entre otras.
CA2701946A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl amides useful as inhibitors of voltage-gated sodium channels
AU2007360907A1 (en) 2007-10-31 2009-05-07 Research Foundation Itsuu Laboratory Retinoid prodrug compound
US8372849B2 (en) 2008-04-21 2013-02-12 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Heterocyclic compounds
UY31984A (es) * 2008-07-16 2010-02-26 Boehringer Ingelheim Int DERIVADOS DE 1-(3,4-difluorobencil)-6-oxo-1,6-dihidropirimidin-5-carboxamidas N-sustituidas y de 2-(3,4-difluorobencil)-3-oxo-2,3-dihidro-1H-pirazol-4-carboxamidas N-sustituidas.
WO2010056847A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Lyophilization formulation
RU2013109143A (ru) 2010-08-05 2014-09-10 Амджен Инк. Бензимидазол- и азабензимидазолсодержащие соединения, которые ингибируют киназу анапластической лимфомы
CN102050823A (zh) * 2010-10-27 2011-05-11 华东理工大学 新型光稳定剂-鸟嘌呤类似物的合成及表征
US9199918B2 (en) * 2011-02-15 2015-12-01 Georgetown University Small molecule inhibitors of AGBL2
WO2012155199A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Bionomics Limited Amine derivatives as potassium channel blockers
CN105646362B (zh) 2011-07-26 2019-07-05 赛诺菲 3-杂芳酰基氨基-丙酸衍生物及其作为药物的用途
US9586914B2 (en) 2011-11-07 2017-03-07 The University Of Queensland Modulators of C3a receptors
IN2015DN03969A (sl) 2012-10-17 2015-10-02 Univ Bristol
GB201300304D0 (en) * 2013-01-08 2013-02-20 Kalvista Pharmaceuticals Ltd Benzylamine derivatives
WO2017070235A1 (en) * 2015-10-19 2017-04-27 Attenua, Inc. Antitussive compositions and methods
EP3679027A1 (en) 2017-09-04 2020-07-15 C4 Therapeutics, Inc. Dihydrobenzimidazolones
WO2020181232A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 C4 Therapeutics, Inc. Heterocyclic compounds for medical treatment

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3499002A (en) * 1968-06-20 1970-03-03 Robins Co Inc A H 1-carbamoyl-3-aroylpyrrolidines
NL6913261A (sl) * 1968-09-09 1970-03-11
US3932444A (en) * 1972-04-28 1976-01-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. 4-Imidazolylsulfonylimidazoles
US4013647A (en) * 1976-03-23 1977-03-22 American Home Products Corporation Morpholine containing tetrazole-5-carboxamide derivatives
GB1491776A (en) * 1976-09-08 1977-11-16 Pfizer Ltd Thiadiazoles
US4076718A (en) * 1977-01-21 1978-02-28 American Home Products Corporation 2,6-Pyridinediyl-bis-tetrazol-5-carboxamides
US5236928A (en) * 1991-03-19 1993-08-17 Merck & Co., Inc. Imidazole derivatives bearing acidic functional groups at the 5-position, their compositions and methods of use as angiotensin II antagonists
CA2112566A1 (en) 1991-07-01 1993-02-18 Graham J. Moore Non-desensitizing analogs of gnrh and other biologically active ligands
CA2126976A1 (en) * 1991-12-31 1993-07-08 Hisashi Takasugi Oxadiazole derivatives having acetylcholinesterase-inhibitory and muscarinic agonist activity
ATE243204T1 (de) * 1995-08-24 2003-07-15 Basf Ag Isoxazole- und isothiazole-5-carboxamid derivate, deren herstellung und deren verwendung als herbizide
NZ325060A (en) * 1995-12-14 2000-02-28 Merck & Co Inc Non peptide indole derivative and their use as antagonists of gonadotropin releasing hormone
WO1997044339A1 (en) * 1996-05-20 1997-11-27 Merck & Co., Inc. Antagonists of gonadotropin releasing hormone
US5878393A (en) * 1996-09-09 1999-03-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. High quality concatenative reading system

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002535244A (ja) 2002-10-22
BR9913374A (pt) 2001-05-15
HRP20010206A2 (en) 2004-02-29
NZ509252A (en) 2004-05-28
WO2000020358A2 (en) 2000-04-13
EA200100255A1 (ru) 2002-02-28
ZA200100831B (en) 2002-08-22
WO2000020358B1 (en) 2001-01-04
LV12732A (en) 2001-10-20
LT2001024A (en) 2001-11-26
NO20010309D0 (no) 2001-01-19
LV12732B (en) 2002-03-20
SK2262001A3 (en) 2002-12-03
CZ2001523A3 (cs) 2002-05-15
IS5846A (is) 2001-02-16
HUP0103622A3 (en) 2003-01-28
KR20010085402A (ko) 2001-09-07
BG105362A (en) 2001-12-31
CN1379666A (zh) 2002-11-13
YU13701A (sh) 2005-06-10
NO20010309L (no) 2001-04-11
WO2000020358A3 (en) 2000-11-16
AU2470900A (en) 2000-04-26
GEP20043315B (en) 2004-02-10
LT4904B (lt) 2002-04-25
CA2341346A1 (en) 2000-04-13
AU759310B2 (en) 2003-04-10
PL356984A1 (en) 2004-07-12
ID29244A (id) 2001-08-16
EP1105120A4 (en) 2001-12-19
TR200100631T2 (tr) 2002-08-21
EP1105120A2 (en) 2001-06-13
AP2001002053A0 (en) 2001-03-31
ATE291423T1 (de) 2005-04-15
HUP0103622A2 (hu) 2002-04-29
ES2237966T3 (es) 2005-08-01
IL141396A0 (en) 2002-03-10
EE200100102A (et) 2002-06-17
OA11599A (en) 2004-08-23
EP1105120B1 (en) 2005-03-23
DE69924387D1 (de) 2005-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI20746A (sl) Nepeptidni GnRH agensi ter metode in vmesne spojine za njihovo pripravo
US9174942B2 (en) IDO inhibitors
US7101878B1 (en) Non-peptide GNRH agents, methods and intermediates for their preparation
JP6557331B2 (ja) Ｆｓｈｒのモジュレータとしてのピラゾール化合物およびその使用
JP5805672B2 (ja) 脂肪酸合成酵素阻害剤としてのトリアゾロン類
KR20010041656A (ko) 비-펩타이드 성선자극호르몬-방출 호르몬 제제
US20050250846A1 (en) Non-peptide GnRH agents, pharmaceutical compositions and methods for their use
ES2796774T3 (es) Dihidropirazoles, composiciones farmacéuticas de los mismos y su uso para el tratamiento de trastornos de fertilidad
JP6523267B2 (ja) Ｆｓｈｒの調節剤としてのイミダゾール化合物及びその使用
US20040010033A1 (en) Non-peptide GnRH agents, methods and intermediates for their preparation
MXPA01001834A (en) NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION
MXPA00008537A (en) NON-PEPTIDE GnRH AGENTS

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20060413