HRP20010206A2 - NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION - Google Patents

NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION Download PDF

Info

Publication number
HRP20010206A2
HRP20010206A2 HR20010206A HRP20010206A HRP20010206A2 HR P20010206 A2 HRP20010206 A2 HR P20010206A2 HR 20010206 A HR20010206 A HR 20010206A HR P20010206 A HRP20010206 A HR P20010206A HR P20010206 A2 HRP20010206 A2 HR P20010206A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
image
substituted
compound
unsubstituted alkyl
aryl
Prior art date
Application number
HR20010206A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Brian Anderson
Haresh N Vazir
David Robert Luthin
Genevieve Deguzman Paderes
Ved P. Pathak
Christie Christopher Lance
Hong Yufeng
Eileen Valenzuela Tompkins
Li Haitao
James Faust
Original Assignee
Agouron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agouron Pharma filed Critical Agouron Pharma
Publication of HRP20010206A2 publication Critical patent/HRP20010206A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A61P5/04—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin for decreasing, blocking or antagonising the activity of the hypothalamic hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/06—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C07D235/14—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/26—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/48—Two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/02—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D241/10—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D241/12—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/14—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Područje tehnike i industrijska primjenjivost izuma
Ovaj se izum općenito odnosi na spojeve koji utječu na djelovanje ljudskog gonadotropnog releasing hormona (GnRH). Točnije, odnosi se na nepeptidne antagoniste ili agoniste GnRH i na njihovu pripravu. Ova nepeptidna GnRH sredstva imaju povoljna fizikalna, kemijska i biološka svojstva i korisni su kao lijekovi za bolesti ili stanja koja su posredovana moduliranjem hipofizno-gonadne osovine. Spojevi izuma izbjegavaju probleme razgradnje i bioraspodjele peptidnih sredstava.
Stanje tehnike
Gonadotropni releasing hormon (GnRH), također poznat kao releasing hormon luteinizirajućeg hormona (LH-RH), igra središnju ulogu u biologiji reprodukcije. Velik broj analoga koristi se za sve veći broj kliničkih indikacija. GnRH dekapeptid (piro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ili p-EHWSYGLRPG-NH2) se proizvodi u neuronima medijalnog bazalnog hipotalamusa iz većeg prethodnika, enzimskom pregradnjom. Dekapeptid se otpušta pulsatilnim načinom u portalni krvotok hipofize gdje GnRH reagira s receptorima visokog afiniteta (7-transmembranski G-protein vezani receptori) u adenohipofizi koja je smještena na bazi mozga. U hipofizi, GnRH potiče oslobađanje dvaju gonadotropnih hormona (gonadotropina): luteinizirajućeg hormona (LH) i folikul-stimulirajućeg hormona (FSH). U sjemenicima i jajnicima, LH potiče proizvodnju testosterona, odnosno estradiola. FSH potiče rast folikula u žena, a stvaranje sjemeglavaca u muškaraca. Kada se odvija normalno, pulsno oslobađanje i razine koncentracija GnRH su kritične za održavanje gonadne steroidogeneze, kao i za normalnu funkciju reprodukcije povezanu s rastom i razvojem spola.
Hipofizni odgovor na GnRH značajno varira tijekom života. GnRH i gonadotropini se najprije javljaju u fetusu oko desetog tjedna gestacije. Osjetljivost na GnRH opada, nakon kratkog porasta tijekom prva tri mjeseca nakon poroda, do početka puberteta. Prije puberteta, FSH odgovor na GnRH je veći nego LH odgovor. S početkom puberteta povećava se osjetljivost na GnRH i javlja se pulsno otpuštanje LH. Kasnije u pubertetu i tijekom reprodukcijskih godina, pulsno otpuštanje GnRH događa se tijekom dana, s time da je odgovor LH veći od odgovora FSH. Pulsno oslobađanje GnRH dovodi do pulsnog oslobađanja LH i FSH i time do oslobađanja testosterona i estradiola iz gonada. Nakon menopauze, koncentracije FSH i LH rastu, a postmenopauzalne vrijednosti FSH su više od vrijednosti LH.
Kronična primjena agonista i antagonista GnRH na životinje ili na čovjeka dovodi do smanjenja razina LH i FSH u cirkulaciji. GnRH agonisti su spojevi koji oponašaju endogeni GnRH u njegovoj stimulaciji receptora u hipofizi, što dovodi do otpuštanja LH i FSH. Nakon prolaznog porasta gonadne proizvodnje hormona ili “skok” odgovora, kronična primjena GnRH agonista dovodi do silazne regulacije GnRH receptora. Silazna regulacija GnRH receptora i desenzitizacija hipofize dovodi do smanjenja razina LH i FSH. Unatoč hormonalnom skoku koji dovodi i do egzacerbacije simptoma, agonisti GnRH su lijek izbora za patofiziološka stanja ovisna o spolnim steroidima. Na primjer, agonisti GnRH koriste se za smanjivanje proizvodnje testosterona, reducirajući time volumen prostate u benignoj hiperplaziji prostate (BHP) i usporavajući tumorski rast kod karcinoma prostate. Ovi spojevi također se koriste za liječenje raka dojke i jajnika.
Nedavno su antagonisti GnRH postali dostupni kliničkoj procjeni. Antagonisti GnRH imaju brz učinak na hipofizu bez skoka zapaženog kod agonista GnRH. Uporaba antagonista GnRH (obično dekapeptidi) opisana je u literaturi za liječenje raka dojke, jajnika i prostate. Drugi načini uporabe antagonista, kao i agonista, uključuju endometriozu (uključujući i bolnu endometriozu), miome uterusa, cistične bolesti jajnika i dojke (uključujući policističnu bolest jajnika), hipertrofiju prostate, amenoreju (na pr. sekundarnu amenoreju) i prerani pubertet. Ovi spojevi također mogu biti korisni u simptomatskom ublažavanju premenstruacijskog sindroma (PMS). Nadalje, antagonisti mogu biti korisni za regulaciju sekrecije gonadotropina u muških sisavaca radi zaustavljanja spermatogeneze (na pr., kao muški kontraceptivi) i za liječenje muškaraca koji su počinili seksualni delikt. Važno je kako su GnRH antagonisti (i agonisti) našli svoju primjenu u slučajevima gdje se želi postići reverzibilna supresija hipofizno-gonadne osovine.
Nazočnost GnRH receptora na stanicama adenohipofize i nekolicine tipova tumorskih stanica pruža mogućnost razvoja lijekova koji bi djelovali putem tih receptora radi liječenja raka, kako hormonski ovisnih, tako i hormonski neovisnih vrsta.
Tijekom 50 godina, uklanjanje androgena bilo je najučinkovitije sustavno liječenje metastatskog karcinoma prostate. Načelo je jednostavno - prostati su androgeni potrebni za normalan rast, održavanje i funkciju. Rak prostate i benigna hiperplazija prostate su česta stanja u muškaraca koja se razvijaju u uvjetima trajne izloženosti androgenima. Prema tome, uporaba antagonista GnRH za prekidanje hipofizno-gonadne osovine smanjuje proizvodnju androgena i dovodi do modulacije tumorskog rasta. Nadalje, antagonisti GnRH mogu imati izravan učinak na rast tumora blokiranjem receptora na tumorskim stanicama. Kod onih vrsta raka koje izravno odgovaraju i na spolne hormone i na GnRH, antagonisti bi trebali biti učinkoviti za smanjenje tumorskog rasta putem dva mehanizma. Kako GnRH receptori postoje na mnogim stanicama raka prostate i dojke, u posljednje se vrijeme nagađa kako bi antagonisti GnRH mogli također biti učinkoviti pri liječenju hormonski neovisnih tumora. Primjeri iz novije literature upućuju na to kako su GnRH receptori nazočni na brojnim staničnim linijama raka, uključujući:
• rak prostate: agonisti GnRH pokazuju, i in vitro i in vivo, izravno inhibicijsko djelovanje na rast staničnih linija ljudskog raka prostate ovisnog o androgenima (LNCaP), kao i neovisnog o androgenima (DU 145). Montagnani i sur., Arch Ital Urol Androl, 1997, 69(4), 257-263. Antagonisti GnRH inhibiraju rast PC-3 raka prostate ovisnog o androgenima u golih miševa. Jungwirth i sur., Prostate, 1997, 32(3), 164-172.
• rak jajnika: postojanje GnRH receptora na ljudskom karcinomu jajnika jest temelj za uporabu terapijskih pristupa temeljenih na GnRH analozima u ovom malignomu. Srkalovic i sur., Int J Oncol, 1998, 12(3), 489-498.
• rak dojke: rak dojke je najčešća vrsta raka u žena u dobi iznad 40 i predstavlja vodeći uzrok smrti od raka u žena. Sustavna endokrina intervencija predstavlja glavni oblik liječenja u slučajevima uznapredovalog raka dojke, prvenstveno kod karcinoma ovisnih o estrogenu. Geni za GnRH i njegov receptor izraženi su u ljudskoj dojci s fibrocističnom bolešću i rakom. Kottler i sur., Int J Cancer, 1997, 71(4), 595-599.
Dosad su raspoloživi antagonisti GnRH bili primarno peptidni analozi GnRH. Vidi, na pr., međunarodnu objavu br. WO 93/03058. Peptidni antagonisti peptidnih hormona često su znatno potentni; međutim, uporaba peptidnih antagonista je tipično povezana s problemima, jer se peptidi razgrađuju fiziološkim enzimima i često se slabo raspodjeljuju unutar organizma koji se liječi. Prema tome, učinkovitost kao lijekova im je ograničena. Posljedično tome, danas postoji potreba za nepeptidnim antagonistima peptidnog hormona GnRH.
Izlaganje biti izuma
Svrha izuma je razvoj nepeptidnog GnRH male molekule koji koristi oba gore navedena mehanizma djelovanja. Nepeptidna GnRH sredstva imaju povoljna fizikalna, kemijska i biološka svojstva u usporedbi s peptidima, te će biti korisni lijekovi za liječenje bolesti posredovanih hipofizno-gonadnom osovinom i izravnim ciljanjem receptora na tumorskim stanicama. Postoji potreba za razvojem lijekova koji će djelovati putem tih receptora za liječenje karcinoma, hormonski ovisnih, kao i hormonski neovisnih.
Slijedeća svrha izuma je dobivanje nepeptidnih spojeva koji su GnRH sredstva (agonisti ili antagonisti) koji se vežu na GnRH receptore i time moduliraju aktivnost, osobito onih koji su moćni GnRH antagonisti. Slijedeća svrha izuma je dobivanje učinkovitih liječenja za pojedince koji imaju potrebu za terapijskom regulacijom GnRH i dobivanje postupaka za liječenje bolesti i stanja posredovanih GnRH regulacijom.
Ove su svrhe postignute nepeptidnim GnRH spojevima izuma, koji su korisni kao lijekovi za stanja posredovana regulacijom GnRH. Spojevi izuma farmaceutski imaju prednost ispred peptidnih spojeva jer omogućuju bolju bioraspodjelu i otpornost na razgradnju fiziološkim enzimima. Izum nadalje opisuje postupke za sintezu spojeva, kao i njihovih međuspojeva koji su korisni za pripravu spojeva.
Izum je posvećen spojevima opće Formule I:
[image]
pri čemu:
X je odabran između C=O, C=S, S=O i S(O)2;
[image] je peteročlani heterociklički prsten koji sadrži 1 do 4, preporučljivo 2 ili 3, heteroatoma odabranih između N, O i S, pri čemu prsten može biti zasićen, djelomično nezasićen ili potpuno nezasićen, a može biti i aromatski;
R1 i R2 su neovisno odabrani između H i niži alkil;
R3 je odabran između H, halogen, supstituirani i nesupstituirani alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikl, aril, heteroaril, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikl, aril i heteroaril, pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12;
R4 i R5 su neovisno odabrani između H, halogen, supstituirani i nesupstituirani alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikl, aril, heteroaril, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12;
R6 i R7 su neovisno odabrani između H, halogen, supstituirani i nesupstituirani alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikl, aril, heteroaril, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; ili R6 i R7 zajedno s atomima na koje su vezani tvore neobavezno supstituirani 5- do 6-eročlani prsten koji neobavezno ima do četiri heteroatoma odabranih između O, N i S;
R8 je lipofilni dio odabran između supstituirani i nesupstituirani alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikl, aril, heteroaril, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 6 do 20; a
R9 je odabran između H i supstituirani i nesupstituirani alkil, preporučljivo niži alkil.
U nekim oblicima, R1 ili R2 mogu biti -OH ili =O; i/ili R8 također može biti vodik;
i/ili R može biti COR ili vodik; i/ili R8 može imati bilo koji željeni broj ugljikovih atoma;
i/ili R8 i R9 mogu također tvoriti prsten; i/ili bilo koja susjedna R skupina, poput R5 i R6 ili R3 i R4 može tvoriti prsten, poput onoga koji je opisan za R6 i R7;
i/ili R6 može biti COR; i/ili (het) skupina može biti supstituirana ili nesupstituirana.
Također, u slijedećem obliku R8 i/ili R9 mogu biti odabrani između heterocikličkih skupina ili bilo kojeg spoja koji tvori amidnu vezu s dušikom Formule I. To jest, R8 i R9 mogu biti bilo koja skupina, počevši od ugljika vezanog na dušik opće Formule I.
Preporučeni spojevi izuma imaju opću formulu II:
[image]
pri čemu su varijable u formuli kao što su definirane gore.
Osobito preporučeni spojevi imaju formulu III:
[image]
pri čemu je R8 definiran gore. Preporučene R8 skupine uključuju: aril, -CH2-aril, -CH2-, heteroaril, -CH2-cikloalkil i -(CH2)n-O-aril, pri čemu je n cijeli broj od 1 do 4.
Preporučeni spojevi izuma uključuju:
[image] uključujući i cis- i trans-izomere na cikloheksil supstituentu;
[image]
[image]
[image]
Osim spojeva gornje formule, GnRH sredstva izuma uključuju farmaceutski prihvatljive soli, multimeričke oblike, prolijekove i aktivne metabolite ovih spojeva. Ova nepeptidna sredstva farmaceutski su prikladnija od peptidnih sredstava jer omogućuju bolju bioraspodjelu i otpornost na razgradnju fiziološkim enzimima.
Izum se također odnosi na farmaceutske pripravke koji sadrže terapijski učinkovitu količinu GnRH sredstva izuma u kombinaciji s farmaceutski prihvatljivim nosačem ili sredstvom za razrjeđivanje. Nadalje, izum se odnosi na postupke za reguliranje sekrecije gonadotropina u sisavaca, koji obuhvaćaju primjenu terapijski učinkovitih količina GnRH sredstava izuma.
Izum se također odnosi na postupke i međuspojeve korisne za pripravu spojeva Formule I.
Druga svojstva, svrhe i prednosti izuma postat će očiti iz slijedećeg opsežnog opisa izuma i njegovih preporučenih oblika.
Detaljan opis izuma i preporučenih oblika
Neki od spojeva izuma sadrže jedan ili više središta asimetrije, pa mogu tvoriti enantiomere, dijastereoizomere i druge stereoizomerijske oblike. Izum uključuje sve takve moguće stereoizomere, kao i njihove racemičke i optički čiste oblike. Kada ovdje opisani spojevi sadrže olefinske dvostruke veze, tada obuhvaćaju i E i Z geometrijske izomere.
Ovdje navedene kemijske formule mogu pokazivati fenomen tautomerije. Kako strukturne formule prikazane u ovoj specifikaciji prikazuju samo jedan od mogućih tautomerijskih oblika, treba uvidjeti kako izum, bez obzira na to, uključuje sve tautomerijske oblike.
Izraz “alkil” odnosi se na alkilne skupine nerazgranatog i razgranatog lanca koje imaju jedan do dvanaest ugljikovih atoma. Primjeri alkilnih skupina uključuju metil (Me), etil, n-propil, izopropil, butil, izobutil, sek-butil, terc-butil (tBu), pentil, izopentil, terc-pentil, heksil, izoheksil i slične. Izraz “niži alkil” označuje alkil koji ima od 1 do 8 ugljikovih atoma (C1-8 alkil). Prikladni supstituirani alkili uključuju fluorometil, difluorometil, trifluorometil, 2-fluoroetil, 3-fluoropropil, hidroksimetil, 2-hidroksietil, 3-hidroksipropil i slične.
Izraz “alkenil” odnosi se na alkenilne skupine nerazgranatog i razgranatog lanca koje imaju 2 do 12 ugljikovih atoma. Primjeri alkenilnih skupina uključuju prop-2-enil, but-2-enil, but-3-enil, 2-metilprop-2-enil, heks-2-enil i slične.
Izraz “alkinil” odnosi se na alkinilne skupine nerazgranatog i razgranatog lanca koje imaju 2 do 12 ugljikovih atoma. Primjeri alkinila uključuju prop-2-inil, 3-metilpent-4-inil, heks-2-inil i slične.
Izraz “karbocikl” odnosi se na monocikličku ili policikličku prstenastu strukturu ugljika (bez heteroatoma) koja ima 3 do 7 ugljikovih atoma u svakom prstenu, koji može biti zasićen, djelomično zasićen ili nezasićen. Primjeri karbocikla uključuju cikloalkile i arile.
Izraz “heterocikl” odnosi se na monocikličku ili policikličku prstenastu strukturu s jednim ili više heteroatoma odabranih između N, O i S, koja ima 3 do 7 atoma (ugljikovi atomi plus svaki heteroatom(i)) u svakom prstenu, koji može biti zasićen, djelomično zasićen ili nezasićen. Primjeri heterocikla uključuju tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, azetidinil, pirolidinil, piperidinil, piperazinil i slične.
Izraz “cikloalkili”,u ovdje korištenom značenju, odnosi se na zasićene karbocikle koji imaju 3 do 12 ugljika, uključujući bicikličke i tricikličke cikloalkilne strukture. Prikladni cikloalkili uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil i slične.
Izrazi “arili” i “heteroarili” odnose se na monocikličke i policikličke nezasićene ili aromatske prstenaste strukture, s time da se “aril” odnosi na one koji su karbocikli, a “heteroaril” na one koji su heterocikli. Primjeri aromatskih prstenastih struktura uključuju fenil, naftil, 1,2,3,4-tetrahidronaftil, furil, tienil, pirolil, piridil, piridinil, pirazolil, imidazolil, pirazinil, piridazinil, 1,2,3-triazinil, 1,2,4-oksadiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, 1-H-tetrazol-5-il, indolil, kvinolinil, benzofuranil, benzotiofenil (tianaftenil) i slične. Takvi spojevi mogu biti neobavezno supstituirani s jednim ili više prikladnih supstituenata, na primjer supstituent odabran između halogen (F, Cl, Br ili I); niži alkil; OH; NO2; CN; CO2H; O-niži alkil; aril; aril-niži alkil; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; OCF3; i slični. Takvi spojevi mogu također biti neobavezno supstituirani sa stopljenom prstenastom strukturom ili mostom, na primjer OCH2-O.
Izraz “aril-niži alkil” označuje niži alkil koji nosi aril. Primjeri uključuju benzil, fenetil, piridilmetil, naftilmetil i slične. Aril-niži alkil može biti neobavezno supstituiran.
Općenito, različiti spojevi ili funkcijske skupine varijabli Formule I mogu biti neobavezno supstituirane s jednim ili više prikladnih supstituenata. Primjeri supstituenata uključuju halogen (F, Cl, Br ili I), niži alkil, -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -O-niži alkil, -aril, -aril-niži alkil, -CO2CH3, -CONH2, -OCH2CONH2, -NH2, -SO2NH2, haloalkil (na pr. -CF3, -CH2CF3), -O-haloalkil (na pr. -OCF3, -OCHF2) i slični.
Pored spojeva Formule I, GnRH sredstva izuma uključuju farmaceutski prihvatljive soli, multimeričke oblike, prolijekove i aktivne metabolite spojeva Formule I. Takva nepeptidna sredstva su farmaceutski bolja od peptidnih sredstava jer imaju bolju bioraspodjelu i otpornost na razgradnju fiziološkim enzimima.
Osim toga, Formula I, pokriva, tamo gdje je to primjenjivo, otopinske, kao i neotopinske oblike spojeva. Prema tome, Formula I uključuje spojeve koji imaju naznačenu strukturu, uključujući hidrirane, kao i nehidrirane oblike.
Kao što je gore navedeno, GnRH sredstva ovog izuma također uključuju aktivne tautomeričke i stereoizomeričke oblike spojeva Formule I, koji se mogu lako dobiti tehnikama koje su poznate u struci. Na primjer, optički aktivni (R) i (S) izomeri mogu se pripraviti stereospecifičnom sintezom, na pr. korištenjem kiralnih sintona i kiralnih reagensa, ili se racemičke smjese mogu ponovno otopiti uobičajenim tehnikama.
GnRH sredstva nadalje uključuju multivalentne ili multimeričke oblike aktivnih oblika spojeva Formule I. Takvi “multimeri” mogu se pripraviti vezanjem ili smještanjem višestrukih kopija aktivnog spoja međusobno u neposrednu blizinu, na pr. pomoću konstrukcije koju tvori dio-nosač. Multimeri različitih dimenzija (tj., koji nose različit broj kopija aktivnog spoja) mogu se ispitati na stizanje multimera optimalne veličine u odnosu na vezanje receptora. Stvaranje ovakvih multivalentnih oblika aktivnih spojeva koji vežu receptore, s optimalnim razmacima između dijelova koji vežu receptor, može pospješiti vezanje receptora (vidi, na pr., Lee i sur., Biochem., 1984, 23:4255). Stručnjak može kontrolirati multivalentnost i razmak odabirom prikladnih dijelova-nosača ili veznih jedinica. Korisni dijelovi uključuju molekulske potpore koje sadrže brojne funkcijske skupine koje mogu reagirati s funkcijskim skupinama povezanima s aktivnim spojevima izuma. Različiti dijelovi-nosači mogu se koristiti u cilju izgradnje multimera visoke aktivnosti, uključujući proteine poput BSA (goveđi serumski albumin) ili HAS, peptide poput pentapeptida, dekapeptida, pentadekapeptida i sličnih, kao i nebiološke spojeve odabrane prema njihovim povoljnim učincima na apsorptivnost, prijenos i zadržavanje unutar ciljnog organizma. Funkcijske skupine na dijelu-nosaču, kao što su amino, sulfhidril, hidroksil i alkilamino skupine, mogu se odabrati tako da se dobiju stabilne veze sa spojevima izuma, optimalni razmaci između nepokretnih spojeva, kao i optimalna biološka svojstva.
Pored toga, GnRH sredstva izuma uključuju farmaceutski prihvatljive soli spojeva Formule I. Izraz “farmaceutski prihvatljiv” odnosi sa na oblike soli koji su farmakološki prihvatljivi i u osnovi neotrovni za osobu na koju se GnRH sredstvo primjenjuje. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju uobičajene kisele adicijske soli ili bazične adicijske soli dobivene iz prikladnih neotrovnih organskih ili neorganskih kiselina ili neorganskih baza. Primjeri kiselih adicijskih soli uključuju one dobivene od neorganskih kiselina poput kloridne kiseline, bromidne kiseline, jodidne kiseline, sulfatne kiseline, sulfamske kiseline, fosfatne kiseline i nitratne kiseline, kao i one dobivene od organskih kiselina poput p-toluensulfonske kiseline, metansulfonske kiseline, etandisulfonske kiseline, izetionske kiseline, oksalne kiseline, p-bromofenilsulfonske kiseline, karbonatne kiseline, sukcinilne kiseline, citratne kiseline, benzojeve kiseline, 2-acetoksibenzojeve kiseline, acetatne kiseline, fenilacetatne kiseline, propionske kiseline, glikolne kiseline, stearinske kiseline, laktatne kiseline, malične kiseline, tartaratne kiseline, askorbinske kiseline, maleinske kiseline, hidroksimaleinske kiseline, glutamske kiseline, salicilne kiseline, sulfanilne kiseline i fumarne kiseline. Primjeri baznih adicijskih soli uključuju one dobivene iz amonij hidroksida (na pr. kvatenarnog amonij hidroksida, kao što je tetrametilamonij hidroksid), one dobivene od neorganskih baza poput hidroksida alkalijskih ili zemnoalkalijskih metala (na pr. natrij, kalij, litij, kalcij ili magnezij), te one dobivene od organskih baza kao što su amini, benzilamini, piperidini i pirolidini.
Izraz “prolijek” odnosi se na metabolički prethodnik spoja Formule I (ili njegove soli) koji je farmaceutski prihvatljiv. Prolijek može biti neaktivan kada se primjenjuje na osobu, ali se in vivo prevodi u aktivni spoj Formule I. Izraz “aktivni metabolit” odnosi se na metabolički proizvod spoja Formule I koji je farmaceutski prihvatljiv i učinkovit. Prolijekovi i aktivni metaboliti spojeva Formule I mogu se odrediti tehnikama koje su poznate u struci.
Različiti se testovi i tehnike mogu koristiti za određivanje razine aktivnosti različitih oblika spojeva u GnRH sustavu. Testovi za vezanje liganada korišteni su za određivanje međudjelovanja s receptorom od interesa. Kada se promatra vezanje, može se koristiti obilježeni receptor, pri čemu je obilježivač fluorescens, enzim, radioizotop ili slično, koji očituje mjerljivu promjenu nakon vezanja receptora. Alternativno, stručnjak može pribaviti protutijelo na receptor, pri čemu je protutijelo obilježeno, što omogućuje pojačanje signala. Vezanje se također može određivati kompeticijskim istiskivanjem liganda vezanog na receptor, pri čemu je ligand obilježen obilježivačem kojeg je moguće otkriti. Kada se promatra aktivnost agonista i/ili antagonista, može se proučavati nedirnuti organizam ili stanica, a mogu se mjeriti promjene funkcije organizma ili stanice u odgovoru na vezanje promatranog spoja. Za otkrivanje staničnog odgovora na raspolaganju su različite naprave, poput mikrofiziometra koji je dostupan od Molecular-Devices, Redwood City, Kalifornija. In vitro i in vivo testovi korisni za mjerenje GnRH antagonističke aktivnosti poznati su u struci. Vidi, na pr., Bowers i sur., “LH suppression in cultured rat pituitary cells treated with 1 ng of LHRH”, Endocrinology, 1980, 106:675-683 (in vitro), te Corbin i sur., “Antiovulatory activity (AOA) in rats”, Endocr. Res. Commun. 1975, 2:1-23 (in vivo). Pojedini testni protokoli koji se mogu koristiti opisani su dolje.
Na primjer, antagonisti GnRH-receptora mogu se funkcijski procijeniti mjerenjem promjena brzine izvanstaničnog zakiseljavanja, na slijedeći način. Kao mjera antagonističke aktivnosti spoja in vitro određena je sposobnost spojeva da omete brzinu izvanstaničnog zakiseljavanja posredovanog s GnRH, u HEK 293 stanicama koje izražavaju ljudske GnRH receptore. Približno 100000 stanica po komorici imobilizirano je u agaroza suspenzijskom mediju (Molecular Devices) i perfundirano s nepuferiranim MEM medijem pomoću uređaja Cytosensor???? Microphysiometer (Molecular Devices). Stanice su ostavljene da postignu ravnotežu do postizanja stabilne bazalne brzine zakiseljavanja (približno jedan sat). Izrađene su kontrolne krivulje doza-odgovor na GnRH (10-11 M do 10-7 M). Spojevi su ostavljeni da se inkubiraju 15 minuta prije stimulacije s GnRH, i određena im je antagonistička aktivnost. Nakon inkubacije s ispitivanim spojevima, dobivene su ponovljene krivulje doza-odgovor na GnRH u prisutnosti ili odsutnosti različitih koncentracija ispitivanih spojeva. Na spojevima je provedena regresijska analiza prema Schildu, kako bi se ustanovilo antagoniziraju li spojevi GnRH-om posredovano ubrzanje izvanstaničnog zakiseljavanja putem kompeticijskog međudjelovanja s GnRH receptorom.
U drugom testu, nakupljanje ukupnih inozitol fosfata moguće je mjeriti ekstrahiranjem iz stanica pomoću mravlje kiseline, nakon čega slijedi razdvajanje fosfata na Dowex stupcima. Stanice se cijepaju tripsinom, na dvije ploče s po 12 jamica, te se unaprijed obilježavaju s 3H-mioinozitolom (0.5 Ci - 2 mCi/mL) tijekom 16-18 sati u mediju bez inozitola. Medij se potom aspirira, a stanice se ispiru s 1X HBSS, 20 mM HEPES (pH 7.5), ili sa bezserumskim DMEM, 1X HBSS, 20 mM HEPES (pH 7.5) koji sadrži agonist, zatim se doda 20 mM LiCl i stanice se inkubiraju tijekom željenog vremena. Medij se aspirira i reakcija se zaustavi dodavanjem 10 mM ledeno hladne mravlje kiseline, koja ujedno služi za ekstrakciju staničnih lipida. Inozitol fosfati se razdijele ion-izmjenjivačkom kromatografijom na Dowex stupcima, koji se zatim ispiru s 5 mL 10 mM mioinozitola i 10 mM mravlje kiseline. Stupci se potom ispiru s 10 mL 60 mM natrij formata i 5 mM boraksa, a ukupni inozitol fosfati se ispiru s 4.5 mL 1M amonij formata, 0.1 M mravlje kiseline.
Preporučena GnRH sredstva izuma uključuju ona koja imaju Ki vrijednost od oko 10 μM ili manju. Osobito se preporučuju GnRH sredstva čija je Ki vrijednost reda veličine nanomola.
Preporučeni spojevi izuma prikazani su na slijedećoj tablici:
[image]
[image]
[image]
Farmaceutski pripravci ovog izuma sadrže učinkovitu GnRH-suprimirajuću količinu najmanje jednog GnRH sredstva izuma, i inertni ili farmaceutski prihvatljivi nosač ili sredstvo za razrjeđivanje. Ovi pripravci se pripravljaju u oblicima jedinica za doziranje odgovarajućima za željeni put primjene, na pr. parenteralni ili peroralni.
U svrhu liječenja bolesti ili stanja posredovanih putem GnRH agonizma ili antagonizma, farmaceutski pripravak izuma primjenjuje se u prikladnoj formulaciji koja je pripravljena kombinacijom terapijski učinkovite količine (tj. GnRH-modulirajuća količina dostatna za postizanje terapijskog učinka) najmanje jednog GnRH sredstva izuma (kao aktivne tvari) s jednim ili više farmaceutski prikladnih nosača ili sredstva za razrjeđivanje. Ovakve se formulacije mogu pripraviti uobičajenim postupcima, na pr. odgovarajućim miješanjem, granuliranjem i stlačivanjem ili otapanjem sastojaka na poznate načine. Neobavezno, u farmaceutskom pripravku je moguće upotrijebiti jedan ili više različitih aktivnih sastojaka, kao što su različiti GnRH antagonisti.
Farmaceutski nosač može biti krut ili tekuć. Primjeri krutih nosača uključuju laktozu, saharozu, talk, želatinu, agar, pektin, akaciju, magnezij stearat, stearinsku kiselinu i slične. Primjeri tekućih nosača su sirup, ulje kikirikija, maslinovo ulje, vodu i slično. Slično tome, nosač ili sredstvo za razrjeđivanje može uključivati tvari s vremenskom odgodom ili postupnim otpuštanjem poznate u struci, poput gliceril monostearata ili gliceril distearata, samostalno ili u kombinaciji s voskom, etilcelulozom, hidroksipropilmetilcelulozom, metilmetakrilatom ili sličnima.
Mogu se koristiti različiti farmaceutski oblici. Na primjer, ako se koristi kruti nosač, pripravak može biti u obliku tablete, tvrde želatinske kapsule, praška, pelete, pastile ili pilule. Količina krutog nosača može varirati u širokom rasponu, na primjer u količini od oko 25 mg do oko 1 g. Ako se koristi tekući nosač, pripravak može biti u obliku sirupa, emulzije, meke želatinske kapsule, sterilne otopine za injiciranje ili suspenzije u ampuli ili fijali, ili pak ne-vodene tekuće suspenzije.
Da bi se dobio stablini oblik za doziranje topljiv u vodi, farmaceutski prihvatljiva sol spoja Formule I se može otopiti u vodenoj otopini organske ili neorganske kiseline, kao što je 0.3M otopina sukcinilne kiseline ili, preporučljivije, limunske kiseline. Ako oblik s topljivom soli nije dostupan, sredstvo se može otopiti u jednom ili više prikladnih suotapala. Primjeri prikladnih suotapala uključuju alkohol, propilen glikol, polietilen glikol 300, polisorbat 80, glicerin i slične, u koncentracijama u rasponu od 0% do 60% ukupnog volumena. U obliku danom radi primjera, spoj Formule I se otopi u DMSO i razrijedi vodom. Pripravak također može biti u obliku otopine ili obliku soli spoja Formule I u odgovarajućem vodenom nosaču, kao što je voda ili izotonična fiziološka otopina ili otopina dekstroze.
Farmaceutski pripravci ovog izuma mogu se izraditi uobičajenim tehnikama, na pr. postupcima miješanja, otapanja, granuliranja, izrade dražeja, mljevenja, emulgiranja, inkapsuliranja, oblaganja ili liofiliziranja. Farmaceutski pripravci mogu se formulirati na uobičajen način, uporabom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača koji sadrže ekscipijense ili pomoćna sredstva odabrana tako da pospješuju pretvaranje aktivnih spojeva u farmaceutske pripravke. Odgovarajuća formulacija odabire se ovisno o odabranom putu primjene.
Za izradu pripravaka za injiciranje, sredstva ovog izuma mogu se formulirati u vodenim otopinama, preporučljivo u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što su Hankova otopina, Ringerova otopina ili puferska fiziološka otopina. Za uporabu kroz sluznice, u formulaciji se koriste penetransi odgovarajući za branu koju treba prijeći, odabrani između poznatih u struci.
Za peroralnu primjenu, spojevi se mogu lako formulirati kombiniranjem aktivnog sastojka/aktivnih sastojaka s farmaceutski prihvatljivim nosačima poznatim u struci. Takvi nosači omogućuju spojevima izuma da budu formulirani kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tekućine, gelovi, sirupi, guste otopine, suspenzije i slično, namijenjene peroralnoj ingestiji od strane liječenog bolesnika. Farmaceutski pripravci za peroralnu uporabu mogu se dobiti kombiniranjem jednog ili više sredstava s krutim ekscipijensom, neobaveznim mljevenjem dobivene smjese u zrnca, te obradom smjese zrnaca nakon dodavanja prikladnih pomoćnih sredstava, ako se želi, da bi se dobile tablete ili jezgre dražeja. Prikladni ekscipijensi uključuju punila poput šećera, (na pr. laktoza, saharoza, manitol ili sorbitol) i preparate celuloze (na pr. kukuruzni škrob, pšenični škrob, rižin škrob, krumpirov škrob, želatina, guma, metil celuloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrij karboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon (PVP)). Ako se želi, mogu se dodati sredstva za dezintegriranje, poput križno vezanog PVP, agara ili alginske kiseline, ili njezinih soli poput natrij alginata.
Jezgre dražeja oblažu se prikladnim ovojima. U ovu se svrhu mogu koristiti koncentrirane otopine šećera koje neobavezno mogu sadržavati gumiarabiku, PVP, CarbopolTM gel, polietilen glikol, titan dioksid, otopine laka i/ili jedno ili više prikladnih organskih otapala. Boje ili pigmenti mogu se dodati ovojima tableta ili dražeja radi njihovog razlikovanja, ili da se označe različite kombinacije doza aktivnog spoja.
Farmaceutski oblici koji su prikladni za peroralnu primjenu uključuju push-fit kapsule napravljene od želatine, kao i meke zataljene kapsule napravljene od želatine i sredstva za oblikovanje, poput glicerola ili sorbitola. Push-fit kapsule mogu sadržavati aktivni sastojak/aktivne sastojke u smjesi s jednim ili više punila poput laktoze, veziva poput škrobova i/ili lubrikansa poput talka ili magnezij stearata, te, po želji, stabilizatora. U mekim kapsulama, aktivni spoj može biti otopljen ili suspendiran u prikladnoj tekućini, kao što je masno ulje, tekući parafin ili tekući polietilen glikol. Pored toga, mogu se dodati stabilizatori. Za bukalnu primjenu, pripravci mogu biti u obliku tableta ili pilula pripravljenih na uobičajeni način.
Za primjenu inhaliranjem, spojevi za uporabu prema ovom izumu mogu se prikladno dovesti u oblik aerosolnog spreja iz pakiranja pod tlakom ili raspršivača, uz uporabu prikladnog potisnog sredstva, na pr. diklorodifluorometana, triklorofluorometana, diklorotetrafluoroetana, ugljičnog dioksida ili drugog prikladnog plina. U slučaju stlačenog aerosola, jedinica za doziranje može se odrediti ugrađivanjem ventila za propuštanje odmjerene količine. Kapsule i patrone na pr. želatine za uporabu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulirati tako da sadrže smjesu sredstva u prahu i prikladnu praškastu osnovu poput laktoze ili škroba.
Spojevi se mogu formulirati za parenteralnu primjenu injiciranjem, na pr. bolus injekcijom ili trajnom infuzijom. Pripravci za injiciranje mogu biti u oblicima za pojedinačno doziranje, na pr. ampulama, ili u spremnicima za više doza, s dodanim konzervansom. Pripravci mogu biti u obliku suspenzija, otopina ili emulzija u uljnim ili vodenim nosačima, a mogu sadržavati i sredstva za formuliranje kao što su sredstva za suspendiranje, stabiliziranje i/ili dispergiranje.
Farmaceutski pripravci za parenteralnu primjenu uključuju vodene otopine aktivnih spojeva u vodotopljivom obliku. Pored toga, suspenzije aktivnih spojeva mogu se pripraviti kao odgovarajuće uljne suspenzije za injiciranje. Prikladna lipofilna otapala ili nosači uključuju masna ulja poput sezamovog ulja, ili estere sintetičkih masnih kiselina poput etil oleata ili triglicerida, ili liposome. Vodene suspenzije za injiciranje mogu sadržavati tvari koje povećavaju viskoznost suspenzije, poput natrij karboksimetil celuloze, sorbitola ili dekstrana. Neobavezno, suspenzija također može sadržavati prikladne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju topljivost spojeva, kako bi se omogućila priprava visoko koncentriranih otopina.
Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praška za miješanje s prikladnim nosačem, na pr. sterilnom apirogenom vodom, prije uporabe. Spojevi se također mogu formulirati u rektalne pripravke, kao što su supozitoriji ili retencijske klizme, na pr. sadržavajući uobičajene baze supozitorija poput kakao maslaca ili drugih glicerida.
Osim prethodno opisanih pripravaka, spojevi također mogu biti formulirani kao depo pripravci. Takvi dugodjelujući pripravci mogu se primijeniti implantiranjem (na primjer, potkožno ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Na primjer, spojevi se mogu formulirati s prikladnim polimerskim ili hidrofobnim tvarima (na primjer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili ionskim izmjenjivačkim smolama, ili kao slabo topljivi derivati, na primjer kao slabo topljive soli.
Primjer farmaceutskog nosača za hidrofobne spojeve izuma je sustav suotapala koji sadrži benzil alkohol, nepolarni surfaktant, organski polimer koji se može miješati s vodom, i vodenu fazu. Sustav suotapala može biti VPD sustav suotapala (VPD je otopina 3% mas/vol benzil alkohola, 8% mas/vol nepolarnog surfaktanta polisorbata 80 i 65% mas/vol polietilen glikola 300, dopunjeno apsolutnim etanolom do (konačnog) volumena). VPD sustav suotapala (VPD:5W) sastoji se od VPD razrijeđenog s 5%-tnom dekstrozom u vodenoj otopini, u omjeru 1:1. Ovaj sustav suotapala dobro otapa hidrofobne spojeve, a dobiveni pripravak ima nisku toksičnost pri sustavnoj primjeni. Razumljivo, udjeli prikladnog sustava suotapala mogu se mijenjati u smislu svojstava topljivosti i toksičnosti. Nadalje, mogu se mijenjati i vrste sastojaka suotapala: na primjer, umjesto polisorbata 80 mogu se koristiti drugi nepolarni surfaktanti niske toksičnosti; može se mijenjati veličina ulomaka polietilen glikola; može se dodati jedan ili više drugih biokompatibilnih polimera (na pr. PVP) ili se polietilen glikol može zamijeniti drugim biokompatibilnim polimerima; dekstroza se može zamijeniti drugim šećerima ili polisaharidima.
Alternativno, mogu se koristiti drugi sustavi dostave hidrofobnih farmaceutskih spojeva. Liposomi i emulzije su poznati primjeri vehikula ili nosača za dostavu hidrofobnih lijekova i mogu se koristiti za formuliranje prikladnih pripravaka. Neka organska otapala poput dimetilsulfoksida također se mogu koristiti, iako obično po cijenu veće toksičnosti. Pored toga, moguća je dostava sustavom za produljeno oslobađanje, kao što su polupropusni matriksi krutih hidrofobnih polimera koji sadrže terapijsko sredstvo. Postoje različite tvari sa produljenim otpuštanjem i kao takve su poznate stručnjacima. Kapsule za produljeno otpuštanje mogu, ovisno o svojoj kemijskoj prirodi, oslobađati spojeve tijekom razdoblja od nekoliko tjedana pa do 100 dana i više. Ovisno o kemijskoj prirodi i biološkoj stabilnosti terapijskog sredstva, mogu se uposliti dodatne tehnike za stabiliziranje proteina.
Farmaceutski pripravci također mogu sadržavati prikladne nosače ili ekscipijense u krutoj ili gel fazi. Primjeri ovih nosača ili ekscipijensa uključuju kalcij karbonat, kalcij fosfat, različite šećere, škrobove, derivate celuloze, želatinu i polimere poput polietilen glikola.
Neki od spojeva izuma mogu biti u obliku soli s farmaceutski kompatibilnim protuionima. Farmaceutski prikladne soli mogu se tvoriti s mnogim kiselinama, uključujući kloridnu, sulfatnu, octenu, laktatnu, tartaratnu, maličnu, sukcinilnu i druge kiseline. Soli su lakše topljive u vodi ili drugim protonskim otapalima od odgovarajućih slobodnih baznih oblika.
Treba uvidjeti kako stvarne doze sredstava koja su korištena u pripravcima ovog izuma mogu varirati ovisno o pojedinom kompleksu koji se koristi, pojedinom formuliranom pripravku, načinu primjene i pojedinom mjestu, kao i domaćinu i bolesti od koje se liječi. Optimalne doze za zadani skup uvjeta može odrediti stručnjak pomoću uobičajenih testova za određivanje doze, s obzirom na eksperimentalne podatke za pojedini spoj. Za peroralnu primjenu, primjer dnevne doze koja se općenito koristi je u rasponu od oko 0.001 do oko 1000 mg/kg tjelesne težine, s time da se ciklusi liječenja ponavljaju u odgovarajućim intervalima. Primjena prolijekova može se dozirati na težinskim razinama koje su kemijski ekvivalentne težinskim razinama potpuno aktivnih spojeva.
U nastavku slijede primjeri specifičnih farmaceutskih pripravaka prema ovom izumu.
Parenteralni pripravak: Za pripravu farmaceutskog pripravka ovog izuma prikladog za injekcijsku primjenu, 100 mg farmaceutski prihvatljive vodotopljive soli spoja Formule I se otopi u DMSO i potom miješa s 10 mL 0.9% sterilne fiziološke otopine. Dobivena smjesa se ugradi u oblik za pojedinačno doziranje prikladan za primjenu injiciranjem.
Peroralni pripravak: Za pripravu peroralno primjenjivog farmaceutskog pripravka, 100 mg spoja Formule I se pomiješa sa 750 mg laktoze. Dobivena smjesa se ugradi u oblik za pojedinačno doziranje prikladan za peroralnu primjenu, poput tvrde želatinske kapsule.
SINTEZA GnRH REAGENSA I SPOJEVA
A. Primjer gradbene jedinice
Gradbena jedinica koja se temelji na naftalenu: Korisno sredstvo za aciliranje pripravi se sekvencijalnim Friedel-Craftsovim alkiliranjima, što je prikazano dolje:
[image]
Spoj 2 se može pripraviti na slijedeći način:
2,5-dimetil-2,5-heksandiol (200 g, 1.37 mol) se doda u obliku krute tvari dio po dio u 3 litre koncentrirane kloridne kiseline u velikoj Erlenmeyerovoj tikvici. Diol se brzo otopi u kloridnoj kiselini i željeni proizvod 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksan se po nastajanju precipitira iz otopine. Reakcija se miješa na sobnoj temperaturi 4 sata. Doda se jedna litra 50%-tnog etil acetata na heksanima i organski sloj se izdvoji i ispire nekoliko puta s vodom (do neutralnosti prema pH papiru). Organska otapala se uklone in vacuo na sobnoj temperaturi. Sirovi 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksan se otopi u heksanima, propusti kroz jastučić silika gela (omjer 10:1) i ispire s heksanima. Ovaj konačni korak filtriranja daje bijelu krutu tvar nakon uklanjanja organskog otapala in vacuo. Obnova čistog 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksana je 230 g 92% prinosa. 1H NMR (CDCl3, delta): 1.96 (4H, s); 1.61 (12H, s).
Uporabom sličnog postupka 2,4-dimetil-2,4-pentandiol se prevede u 2,4- dikloro-2,4-dimetilpentan. 1H NMR (CDCl3, delta): 2.42 (2H, s); 1.73 (12H, s).
1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen 4: Otopini 2,5-dikloro-2,5-dimetilheksana 2 (10 g, 54.7 mmol) u toluenu (270 mL, 0.2 M) se polako doda aluminij triklorid (5.47 g, 41 mmol) u obliku krute tvari tijekom razdoblja od 15 minuta. Reakcija je dovršena nakon 10 minuta i ocijenjuje se pomoću TLC u heksanima. Nereagirani aluminij triklorid se polako gasi s vodom tijekom 10 minuta. Dodatni toluen (250 mL) se doda radi ekstrakcije proizvoda iz vodenog sloja. Organski sloj se propusti kroz jastučić silika gela (40 g) i ispire toluenom. Organski sloj se ispari in vacuo do suhoće, čime se dobije 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen 4 (11 g, 97% prinosa). NMR 1.29 (s, 6H), 1.28 (s, 6H), 1.69 (s, 4H), 2.32 (s, 3H), 7.22 (d, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.97 (dd, 1H).
Metil 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoat 6: Otopini koja sadrži 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen 4 (20 g, 99 mmol) i metil 5-(klorometil)-2-furoat 5 (17.28 g, 99 mmol) u metilen kloridu (500 mL, 0.2 M) se polako doda aluminij triklorid (16.46 g, 124 mmol) u obliku krute tvari na temperaturi refluksa metilen klorida. Otopina se drži u refluksu tijekom dodatna dva sata. Reakcija se prati pomoću TLC 10%-tnoj otopini etil acetat/heksana. Reakcija se hladi na sobnu temperaturu, a nereagirani aluminij triklorid se gasi s vodom tijekom 15 minuta. Sirovi proizvod se ekstrahira s metilen kloridom, propusti kroz silika gel (80 g) i ispire s metilen kloridom. Otapalo se ispari in vacuo do sirupa. Sirovi prizvod se pročisti sa silika gelom (300 g) pomoću stupca za filtriranje s jastučićem. Metil 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoat 6 se ispire s 2% etil acetat/heksanima, čime se dobije 15.4 g (46 % prinosa). NMR 1.25 (s, 6H), 1.28 (s, 6H), 1.67 (s, 4H), 2.23 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.97 (s, 2H), 5.95 (d, 1H), 7.09 (m, 3H).
5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoična kiselina 7: Otopini koja sadrži metil 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoat 6 (15.1 g, 44 mmol) u MeOH (175 mL) i vodi (175 mL) se doda otopina NaOH (3.53 g, 88.3 mmol) u vodi (29 mL). Reakcijska smjesa se miješa preko noći. Nakon dovršetka, što se prosudi pomoću TLC, otopina se zakiseli s 1M HCl do pH 2. Sirovi proizvod se ekstrahira u organski sloj pomoću etil acetata i koncentrira, čime se dobije 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoična kiselina 7 (15.0 g, 99% prinosa). NMR 1.26 (s, 6H), 1.28 (s, 6H), 1.68 (s, 4H), 2.24 (s, 3H), 4.00 (s, 2H), 6.01 (d, 1H), 7.10 (s, 2H), 7.23 (d, 1H).
5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoil klorid 8: Otopini koja sadrži 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoičnu kiselinu 7 (20.15 g, 61.77 mmol) u metilen kloridu (310 mL) se doda tionil klorid (45 mL, 617 mmol). Reakcija se drži u refluksu tijekom 5 sati, pa se doda još jedno punjenje tionil klorida (45 mL, 617 mmol). Reakcija se miješa preko noći na sobnoj temperaturi. Otopina se koncentrira do sirupa i propusti kroz jastučić silika gela (50 g), ispire s 3%-tnim heksanima i koncentrira in vacuo, čime se dobije 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoil klorid 8 (17 g, 80% prinosa). NMR 1.26 (s, 6H), 1.28 (s, 6H), 1.68 (s, 4H), 2.25 (s, 3H), 4.00 (s, 2H), 6.11 (d,1H), 7.10 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.41 (d, 1H).
U ovim reakcijskim uvjetima mogu se pripraviti dodatne gradbene jedinice koje sadrže različite funkcijske skupine sadržane u gore prikazanoj općoj formuli.
B. Primjeri aciliranja:
Slijedeća shema prikazuje nekoliko primjera koji mogu koristiti općeniti postupak sinteze za dolje prikazana aciliranja.
Primjeri reagensa koji se vežu s Y
[image]
Amini se otope ili suspendiraju u diklorometanu, dikloroetanu, etil acetatu, acetonitrilu ili sličnom (koncentracija 0.2 M), a zatim se doda kiseli kloridni reagens (1.00 mmol eq.). Smjesi se doda trietil amin (5.00 mmol eq.) i reakcija se miješa na sobnoj temperaturi 12-48 sati. Otapala se uklone in vacuo. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire s prikladnim otapalom za ispiranje (na pr., 3:1 heksani:etil acetat). Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije acilirani proizvod.
Alternativno, reakcijska smjesa se razrijedi s diklorometanom (peterostruka količina od upotrijebljenog diklorometana) i ispire sa zasićenim natrij bikarbonatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata i filtrira. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire odgovarajućim otapalom za ispiranje (na pr., 3:1 heksani:etil acetat). Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije acilirani proizvod.
Pomoću općeg reakcijskog postupnika, lako se mogu pripraviti brojni spojevi čija se aktivnost može ispitati u obliku čistih ili nečistih tvari. Reakcijski postupnik dobro djeluje za aniline, amine, benzil amine, hidrazine, hidrazide, alkohole i slične.
Slijede specifični primjeri različitih struktura aciliranih prema općem postupku:
[image]
[image]
[image]
C. Sinteza i aciliranje spojeva koji sadrže gvanidin:
[image]
Korak 1 - Priprava zaštićenog spoja 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometiliranjem: Alternativni koraci 1(A) i 1(B) koji slijede opisuju dva opća 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometilacijska postupka.
Korak 1(A): Otopini diamina (2.00 mmol eq.) u THF (0.7 M) se doda otopina 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidina) (1.00 mmol eq.) u THF (0.7M). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 3 sata (h) ili do prestanka daljnje pretvorbe prema TLC (tankoslojna kromatografija). Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, čime se dobije sirupasti ostatak, koji se prenese u etil acetat (~1.5 puta veći volumen THF-a od onog koji je korišten u reakciji ili volumen otapala potreban za otapanje količine ostatka koja se dobije) i ispire s vodom do neutralnog pH. Organski sloj se ispire otopinom soli, suši preko MgSO4 i koncentrira. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire s prikladnim otapalom za ispiranje (koje se može lako odrediti, na pr., pomoću 5% MeOH u diklorometanu kao početnom točkome). Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-vezani amin. Osim toga, moguća je uporaba drugih reagensa za smještanje zaštićenog N,N’-diBoc-gvanidinske jedinice na diamine, poput 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (CAS br. 107819-90-0). Alternativno, 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidin) se može dodati izravno u obliku krute tvari, radije nego otopina kako je gore opisano.
Korak 1 (B): Otopini diamina (1.00 mmol eq.) u THF (0.07M) se doda dio po dio u obliku krute tvari (tijekom razdoblja od 10 minuta) 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksi-karbonil)karboksamidin) (1.00 mmol eq.). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 0.5 h. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, čime se dobije sirupasti ostatak, koji se prenese u etil acetat (0.5 puta volumen THF-a koji je korišten u reakciji, ili volumen otapala potreban za otapanje količine ostatka koja se dobije) i ispire dvaput s vodom. Slojevi se razdijele, a proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire sa 100%-tnim etil acetatom, kako bi se uklonila sva nepolarna onečišćenja, potom s 100%-tnim izopropilnim alkoholom, čime se dobije čisti proizvod. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije željeni proizvod. Tipični TLC uvjeti su 15:85:0.1 metanol/kloroform/octena kiselina. Tipični prinosi su u rasponu od 40% do 44% željenog zaštićenog spoja.
Korak 2 - Reduktivna aminacija (neobavezno): Reduktivna aminacija može se postići na prikladan način. Za reduktivnu aminaciju aldehida i ketona s natrij triacetoksiborohidridom, vidi općenito: Abdel-Magid i sur., J. Org. Chem., 1996, 61:3849. Dva alternativna postupka reduktivne aminacije opisana su u nastavku.
Korak 2(A): 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naft-aldehid (1.00 mmol eq.) i 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-vezani amin (1.00 mmol eq.) se otope u metanolu (0.09 M). Potom se dodaju 1%-tna ledena octena kiselina u otopini metanola (10% volumena korištenog metanola) i NaCNBH3 (1.00 mmol eq.), i sadržaj reakcije se miješa preko noći. Reakcija se ispita pomoću TLC kako bi se otkrila tri sastojka (aldehid, željeni proizvod i početni gvanidinski derivat). Reakcija se okonča dodavanjem vode (50% volumena korištenog metanola), ekstrahira s diklorometanom (deseterostruki volumen korištenog metanola) i ispire sa zasićenim natrij bikarbonatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata, filtrira i koncentrira. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire s odgovarajućim otapalom za ispiranje (na pr., 3:1 etil acetat u heksanima kako bi se uklonio nereagirani aldehid, nakon čega slijedi ispiranje s 1:1 etil acetatom u heksanima), čime se dobije željeni proizvod reduktivne aminacije. U nekim slučajevima, zagrijavanje do refluksa tijekom 2 h pospješit će reakciju stvaranja imina. Vidi također, Abdel-Magid i sur., J. Org. Chem., 1996, 61 :3849, gdje je opisana reduktivna aminacija aldehida i ketona s natrij triacetoksiborohidridom.
Korak 2(B): 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naft-aldehid (1.00 mmol eq.) i 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-vezani amin (1.00 mmol eq.) se otope u metanolu (0.09 M). Potom se doda NaBH4 (1.00 mmol eq.) (u etanol, dolje opisanim dodatnim postupcima za mali red veličine ili oprezno u obliku krute tvari) i sadržaj reakcije se miješa preko noći. Reakcija se ispita pomoću TLC kako bi se otkrila tri sastojka (aldehid, željeni proizvod i početni gvanidinski derivat). Reakcija se okonča dodavanjem vode (50% volumena korištenog metanola), ekstrahira s diklorometanom (deseterostruki volumen korištenog metanola) i ispire sa zasićenim natrij bikarbonatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata, filtrira i koncentrira. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire s prikladnim otapalom za ispiranje (koje lako može odrediti upućeni stručnjak, ili, na primjer, s 3:1 etil acetatom u heksanima, kako bi se uklonio nereagirani aldehid, nakon čega slijedi ispiranje s 1:1 etil acetatom u heksanima), čime se dobije željeni proizvod reduktivne aminacije. U nekim slučajevima, grijanje do refluksa tijekom 2 sata olakšat će reakciju stvaranja imina.
Korak 3 - Aciliranje: Proizvodi reduktivne aminacije (1.00 mmol eq.) se otope u diklorometanu (~0.2 do 0.05 M, ovisno o topljivosti supstrata), potom slijedi dodavanje trietilamina (2.00 mmol eq.) i 2-furoil kloridnog reagensa 8 (1.00 mmol eq.). Sadržaj reakcije se miješa preko noći na sobnoj temperaturi (s.t.). Reakcijska smjesa se razrijedi s diklorometanom (peterostruka količina korištenog diklorometana) i ispire sa zasićenim natrij bikarbonatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata i filtrira. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire s prikladnim otapalom za ispiranje (na pr., 3:1 heksani:etil acetat). Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije acilirani proizvod.
Korak 4 - Deprotekcija bazične skupine: Proizvod koraka acilacije (1.00 mmol eq.) se otopi u otopini 25-50%-tne TFA u diklorometanu (0.02 M) i sadržaj reakcije se miješa na sobnoj temperaturi (15-20 minuta; otopina postaje blago crvenkastonarančasta). Sadržaj reakcije se miješa dodatnih 1 h i 20 minuta ili do završetka BOC deprotekcije. Reakcija se okonča koncentriranjem in vacuo, a potom slijedi dodavanje voda/acetonitrila (0.006 M) i liofilizacija preko noći. Konačni spoj se pročisti metodom visokotlačne tekućinske kromatografije (HPLC). Otapala se uklone in vacuo (raspon prinosa od 30% do 50%), čime se dobije proizvod.
Alternativni postupak za uklanjanje N,N’-bis-BOC gvanidina pomoću kositar tetraklorida, koji može dati odgovarajuće gvanidinij kloridne soli, opisan je u Miel i sur., Tetrahedron Letters, 1997, 38:7865-7866.
Spoj 9 može se pripraviti gore prikazanim koracima, s iznimkom koraka #2, kao što je prikazano na slijedećoj shemi:
[image]
Priprava reagensa: Reagensi korisni za sintetiziranje spojeva mogu se dobiti ili pripraviti tehnikama koje su poznate u struci. Na primjer, priprava slobodnih amina iz uobičajenih oblika soli i matičnih otopina reagensa može biti korisna za reakcije manjeg reda veličine. Vidi također Abdel-Magid i sur., "Reductive amination of aldehydes and ketones with sodium triacetoxyborohydride", J. Org. Chem., 1996, 61:3849.
Metanolske otopine slobodnih baza mogu se pripraviti od hidroklorida, dihidroklorida, hidrobromida ili drugih soli kada je slobodna baza topljiva u metanolu. U ovom postupku, jednom kada se doda natrij metoksid, treba paziti da se spriječi izlaganje zraku, jer aminske slobodne baze, osobito primarni amini, apsorbiraju ugljični dioksid iz zraka i tvore soli. Količina od 10 mL 0.1 M otopine slobodne baze u metanolu može se pripraviti kako slijedi. Odvaži 1.0 mmol monohidrokloridne soli u tariranu Erlenmeyerovu tikvicu koja sadrži šipku za miješanje i dodaj 7 mL metanola. Miješanoj gustoj otopini dodaj 229 mL (1.0 mmol, 1 eq.) natrij metoksida u metanolu (25 mas%, 4.37M), začepi tikvicu i energično miješaj smjesu tijekom 2 h. Gusta otopina ponekad može izmijeniti izgled zbog oblikovanja finog, mliječnog precipitata natrij klorida. Filtriraj gustu otopinu kroz stakleni lijevak od srednje frite od 15 mL, isperi filterski kolač s 1-2 mL metanola, prenesi filtrat u bočicu od 20 mL i razrijedi metanolom do 10 mL. Teorijski prinos natrij klorida je blizu 59 mg, ali obnova obično nije kvantitativna radi manje topljivosti u metanolu. Za dihidrokloridnu sol, potreban je drugi ekvivalent natrij metoksida (458 mL).
0.5 M otopina natrij borohidrida u etanolu može se pripraviti na slijedeći način. Natrij borohidrid (520 mg, 13.8 mmol) se miješa u čistom (ne-denaturiranom) bezvodnom etanolu (25 mL) tijekom ~2-3 minute. Suspenzija se filtrira kroz stakleni lijevak od srednje frite, kako bi se uklonila mala količina neotopljene krute tvari (tipično oko 5% ukupne mase borohidrida, odnosno 25 mg). Filtrat izgleda kao bezbojna otopina koja razvija malo vodika. Ova se otopina treba odmah koristiti, jer se tijekom nekoliko sati značajno razgradi, stvarajući želatinski precipitat. Natrij borohidrid je higroskopan, pa treba izbjeći izlaganje zraku tako što se otopina pripravi tak nakon vaganja krute tvari. Natrij borohidrid ima topljivost od oko 4% u etanolu na sobnoj temperaturi. Ovo odgovara vrijednosti od nešto iznad 0.8 M. Međutim, ponekad mali postotak krute tvari ostaje neotopljen bez obzira na koncentraciju koja se pripravi, čak i nakon miješanja od 5 minuta ili dulje.
Za izvođenje sinteze spojeva Formule I u malom redu veličine, dolje opisane reakcije mogu se provesti tako da se priprave različiti reaktanti korisni u gore opisanoj reakcijskoj shemi. Kao i u ostalom dijelu specifikacije, sve su temperature u slijedećim opisima izražene u Celzijevim stupnjevima, a svi dijelovi i postoci su maseni, ukoliko nije drugačije naznačeno.
Različite početne tvari i drugi reagensi mogu se kupiti od proizvođača na tržištu, kao što su Aldrich Chemical Company ili Lancaster Synthesis Ltd., i koriste se bez daljnjeg pročišćavanja, ukoliko nije drugačije naznačeno. Tetrahidrofuran (THF) i N,N-dimetilformamid (DMF) kupljeni su od tvrtke Aldrich u SureSeal® bocama i korišteni u početnom obliku. Sva su otapala pročišćena pomoću uobičajenih postupaka u struci, ukoliko nije drugačije naznačeno.
Dolje prikazane reakcije provedene su pri pozitivnom tlaku dušika ili sa cijevi za sušenje, na temperaturi okoline (ukoliko nije drugačije naznačeno), u bezvodnim otapalima, a reakcijske tikvice opremljene su gumenim pregradama za uvođenje supstrata i reagensa putem štrcaljke. Stakleni pribor je sušen u peći i/ili toplinom. Analitička tankoslojna kromatografija (TLC) provedena je na 60°F 254 pločama od silika gela sa staklenom pozadinom (Analtech (0.25 mm)), a ispiranje s odgovarajućim omjerima otapala (vol/vol). Reakcije su ispitane pomoću TLC i okončane prema prosudbi o potrošenosti početne tvari.
Ispražnjene ploče su vizualizirane pomoću p-anisaldehidnog reagensa u spreju ili fosfomolibdičnog kiselog reagensa (Aldrich Chemical, 20 mas% u etanolu) aktivirane toplinom. Obrade su tipično vršene udvostručavanjem reakcijskog volumena reakcijskim otapalom ili ekstrakcijskim otapalom, a potom ispiranjem s naznačenim vodenim otopinama, uporabom 25 vol%-tnog ekstrakcijskog volumena (ukoliko nije drugačije naznačeno). Otopine proizvoda sušene su preko bezvodnog Na2SO4 prije filtriranja, a isparavanje otapala bilo je pri smanjenom tlaku na kružnom isparivaču, a označene su kao otapala uklonjena in vacuo. Flash kromatografija na stupcu (Still i sur., A J Org Chem 1978, 43:2923) provedena je pomoću Baker-grade flash silika gela (47-61 mm) i omjera silika gel:sirova tvar od oko 20:1 do 50:1, ukoliko nije drugačije naznačeno. Hidrogenoliza je provedena pri tlaku koji je naznačen ili pri tlaku okoline.
1H NMR spektri zabilježeni su na Brukerovom uređaju koji radi pri 300 MHz, a 13C NMR spektri pri 75 Hz. NMR spektri dobiveni su kao CDCl3 otopine (izraženo u ppm), koristeći kloroform kao referentni standard (7.25 ppm i 77.00 ppm) ili CD3OD (3.4 i 4.8 ppm i 49.3 ppm) ili interni tetrametilsilanski standard (0.00 ppm) kada je to bilo prikladno. Druga su NMR otapala korištena po potrebi. Kada su navedene višestrukosti vrhova, korištene su slijedeće kratice: s=singlet, d=dublet, t=triplet, m=multiplet, br=prošireni, dd=dublet dubleta, dt=dublet tripleta. Konstante spajanja, kada su izražene, dane su u hercima.
Infracrveni spektri zabilježeni su na Perkin-Elmer FT-IR spektrometru kao čista ulja, kao KBr pelete ili kao CDCl3 otopine, a kada su izraženi, dani su u valnim brojevima (cm-1). Maseni spektri su dobiveni pomoću LSIMS ili elekrospreja. Sve su točke tališta nekorigirane.
Priprava gradbene jedinice 1-H-pirazol-1-karboksamidina:
[image]
1-H-pirazol-1-karboksamidin se pripravi prema Bernatowiczu i sur., J. Org. Chem., 1992, 57:2497-2502 (i referencama tog rada), i zaštiti s di-terc-butildikarbonatom, čime se dobije 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidin) prema Drake-u i sur., Synth., 1994, 579-582.
Priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-4-aminometilcikloheksana:
[image]
Otopini 1,4-bis-aminometil-cikloheksana 22 (20 g, 0.14 mol) u THF (200 mL) se doda otopina 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidina) 21 (22.0 g, 0.07 mol) u THF (100 mL). (Treba primijetiti kako 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidin) ne mora biti otopljen u THF; radije se može dodati u postupak u obliku čiste krute tvari.). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 3 sata. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, čime se dobije sirupasti ostatak, koji se prenese u etil acetat (500 mL) i ispire vodom do postizanja neutralnog pH. Organski sloj se ispire otopinom soli, suši preko MgSO4 i koncentrira. Proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire s 5%-tnim MeOH u diklorometanu. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije 11.6 g (43% prinosa) 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-4-aminometil cikloheksana (Spoj 23). 1H NMR (CDCl3) δ 11.5 (br s, 1H), 8.35 (br s, 1H), 3.26 (dt, 2H), 2.52 (dd, 2H), 1.82-0.97 (m, 28H, sa singletom na 1.5).
Alternativna priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilcikloheksana slijedi. Otopini cis/trans 1,4-bis-aminometil-cikloheksana (9.0 g, 63.3 mmol) u THF (903 mL, 0.07M) se doda 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidin) (19.6 g, 63.3 mmol), dio po dio u obliku krute tvari (tijekom 10 minuta). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 0.5 h. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, čime se dobije sirupasti ostatak, koji se prenese u etil acetat (500 mL) i ispire dvaput s vodom. Slojevi se razdijele, a proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire sa 100%-tnim etil acetatom, kako bi se uklonila sva nepolarna onečišćenja, poslije čega slijedi ispiranje sa 100%-tnim izopropilnim alkoholom, čime se dobije čisti proizvod. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije 10.2 g (42% prinosa) 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-4-aminometilcikloheksana. 1H NMR (CDCl3) δ 11.5 (br s, 1H), 8.35 (br s, 1H), 3.26 (dt, 2H), 2.52 (dd, 2H), 1.82-0.97 (m, 28H, sa singletom na 1.5).
Reduktivna aminacija:
[image]
3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naft-aldehid (0.2021 g, 0.88 mmol) i 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-4-aminometilcikloheksan (Spoj 23, 0.337 g, 0.88 mmol) se otope u metanolu (10 mL). Zatim se doda otopina 1%-tne ledene octene kiseline u metanolu (100 μL), potom NaCNBH3 (55.4 mg, 0.88 mmol, 1.0 eq.), i sadržaj reakcije se miješa preko noći. Reakcija se ispita pomoću TLC kako bi se otkrila tri sastojka (aldehid, željeni proizvod i početni gvanidinski derivat). Reakcija se okonča dodavanjem vode (~5 mL), ekstrahira s diklorometanom (~100 mL) i ispire zasićenim natrij bikarbonatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata, filtrira, koncentrira i izloži kromatografiji na stupcu uz ispiranje s 3:1 etil acetat u heksanima kako bi se uklonio nereagirani aldehid, nakon čega slijedi ispiranje s 1:1 etil acetatom u heksanima, čime se dobije željeni proizvod (Spoj 25, cikloheksil, cis/trans smjesa). Otapala se uklone in vacuo (tipični opći raspon prinosa od 50 do 80%).
Priprava aciliranog derivata i potom deprotekcija gvanidina:
[image]
Proizvod reduktivne aminacije 25 (1.0 eq.) se otopi u diklorometanu (10-15 mL), slijedi dodavanje trietilamina (2 eq.) i 2-furoil kloridnog reagensa (1.0 eq.). Sadržaj reakcije se miješa preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija se razrijedi diklorometanom (50 mL) i ispire zasićenim natrij bikarbonatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata, filtrira i pročisti kromatografijom na stupcu uz ispiranje s 3:1 heksanima u etil acetatu. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije Spoj 26.
Proizvod 26 iz reakcije aciliranja (1.0 eq.) se otopi u otopini 50%-tnog TFA u diklorometanu (20-25 mL) i sadržaj reakcije se miješa na sobnoj temperaturi (15-20 minuta; otopina postaje lagano crvenkastonarančasta). Sadržaj reakcije se miješa dodatnih 1 h i 20 minuta do završetka deprotekcije. Reakcija se okonča koncentriranjem in vacuo, a potom slijedi dodavanje voda/acetonitrila (~50 mL) i liofilizacija preko noći. Konačni spoj se pročisti pomoću postupaka HPLC. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije Spoj 27.
Slijedeća rasprava odnosi se na pripravu primjera Spojeva (e)-(k). Spojevi (e)-(k) mogu se koristiti na gore opisani način u svrhu dobivanja odgovarajućih nezaštićenih (slobodni gvanidinil) spojeva, hidrolizom u kiselim uvjetima.
Priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilcikloheksana:
[image]
Otopini cis/trans-1,3-bis-aminometilcikloheksana (7.5 g, 52.8 mmol) u THF (30 mL) se doda otopina 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (7.65 g, 26.3 mmol) u THF (40 mL) unutar 0.5 h. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 5 sati. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku i proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela pomoću smjese metilen klorid/metanola kao sredstva za ispiranje, čime se dobije 2.2 g (22% prinosa) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilcikloheksana (Spoj (e)). 1H NMR (CDCl3) δ 11.53 (br s, 1H), 8.40 (br s, 1H), 3.28-3.30 (m, 2H), 2.54-2.61 (m, 2H), 1.81 (br s, 2H), 1.27-1.58 (m, 26H), 0.89 (m, 1H), 0.65 (m, 1H).
Alternativno, Spoj (e) može se pripraviti na slijedeći način. Otopini cis/trans 1,3-bis-aminometilcikloheksana (10.0 g, 70.3 mmol) u THF (1000 mL, 0.07M) se doda 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidin) (21.8 g, 70.3 mmol) u obliku krute tvari, dio po dio (tijekom 10 minuta). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 0.5 h. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, čime se dobije sirupasti ostatak, koji se prenese u etil acetat (500 mL) i dvaput ispire vodom. Slojevi se razdijele, proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire sa 100%-tnim etil acetatom kako bi se uklonila sva nepolarna onečišćenja, nakon čega slijedi ispiranje sa 100%-tnim izopropil alkoholom, čime se dobije čisti proizvod. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije 11.4 g (41% prinosa) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilcikloheksana. 1H NMR (CDCl3) δ 11.53 (br s, 1H), 8.40 (br s, 1H), 3.28-3.30 (m, 2H), 2.54-2.61 (m, 2H), 1.81 (br s, 2H), 1.27-1.58 (m, 26H), 0.89 (m, 1H), 0.65 (m, 1H).
Priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-4-aminometilbenzena:
[image]
Otopini p-ksililendiamina (6.44 g, 47.4 mmol) u THF (30 mL) se doda otopina 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (6.63 g, 22.9 mmol) u THF (40 mL) unutar 0.5 h. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 5 sati. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela pomoću smjese metilen klorid/metanola kao sredstva za ispiranje, čime se dobije 8.0 g (92% prinosa) 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-4-aminometil benzena (Spoj (f)). 1H NMR (CDCl3) δ 11.54 (br s, 1H), 8.56 (br s, 1H), 7.29 (s, 4H), 4.60 (d, 2H), 3.86 (s, 2H), 1.64 (br s, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.48 (s, 9H).
Priprava 1-(N,N'-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilbenzena:
[image]
Otopini m-ksililendiamina (7.14 g, 52.5 mmol) u THF (30 mL) se doda otopina 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (7.57 g, 26.1 mmol) u THF (40 mL) unutar 0.5 h. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 5 sati. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela pomoću smjese metilen klorid/metanola kao sredstva za ispiranje, čime se dobije 7.9 g (80% prinosa) 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometilbenzena (Spoj (g)). 1H NMR (CDCl3) δ 11.54 (br s, 1H), 8.58 (br s, 1H), 7.19-7.34 (m, 4H), 4.62 (d, 2H), 3.86 (s, 2H), 1.83 (br s, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.48 (s, 9H).
Priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidin-4-aminobutana:
[image]
Otopini 1,4-diaminobutana (4.15 g, 47.1 mmol) u THF (30 mL) se doda otopina 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (6.83 g, 23.6 mmol) u THF (40 mL) unutar 0.5 h. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 5 sati. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela pomoću smjese metilen klorid/metanola kao sredstva za ispiranje, čime se dobije 3.0 g (40% prinosa) 1-(N,N’-diBoc)-gvanidino-4-aminobutana (Spoj (h)). 1H NMR (CDCl3) δ 11.49 (br s, 1H), 8.35 (br s, 1H), 3.42-3.47 (m, 2H), 2.72-2.76 (t, 2H), 0.86-1.65 (m, 24H).
Alternativni postupak za pripravu Spoja (h) je slijedeći. Otopini 1,4-diaminobutana (6.0 g, 68.1 mmol) u THF (972 mL, 0.07M) se doda 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoksikarbonil)karboksamidin) (21.5 g, 68.1 mmol) u obliku krute tvari, dio po dio (tijekom 10 minuta). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 0.5 h. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, čime se dobije sirupasti ostatak, koji se prenese u etil acetat (500 mL) i dvaput ispire vodom. Slojevi se razdijele, proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela i ispire sa 100%-tnim etil acetatom kako bi se uklonila sva nepolarna onečišćenja, nakon čega slijedi ispiranje sa 100%-tnim izopropil alkoholom, čime se dobije čisti proizvod. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije 10.0 g (44% prinosa) 1-(N,N'-diBoc)-gvanidino-4-aminobutana. 1H NMR (CDCl3) δ 11.49 (br s, 1H), 8.35 (br s, 1H), 3.42-3.47 (m, 2H), 2.72-2.76 (t, 2H), 0.86-1.65 (m, 24H).
Priprava 1-N,N-dimetilaminometil-4-aminometilbenzena:
[image]
Otopini 1-N,N-dimetil aminometil-4-karbonitril benzena (4.8 g, 30 mmol) u THF se doda otopina 1 M bor tetrahidrofuranskog kompleksa (90 mL). Smjesa se grije na temperaturi refluksa tijekom 16 sati, u dušiku. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, doda se 1M otopina HCl u metanolu (100 mL). Reakcijska smjesa se grije uz refluks 3 sata. Proizvod, koji precipitira, se prikupi filtriranjem, ispire s dietil eterom i suši in vacuo, čime se dobije 5.9 g (83% prinosa) proizvoda u obliku hidrokloridne soli (Spoj (i)): 1H NMR (DMSO-d6) δ 8.65 (br s, 3H), 7.55 (dd, 4H), 4.25 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 2.62 (s, 6H).
Priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-2-aminometilbenzena:
[image]
Otopini o-ksililendiamina (7.14 g, 52.5 mmol) u THF (30 mL) se doda otopina 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (7.57 g, 26.1 mmol) u THF (40 mL) unutar 0.5 h. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 5 sati. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, a proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela pomoću smjese metilen klorid/metanola kao sredstva za ispiranje, čime se dobije 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-3-aminometil benzen (Spoj (j)).
Alternativno, Spoj (j) se može pripraviti na način analogan alternativnoj pripravi gore opisanoj za Spoj (e).
Priprava 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-2-aminometilcikloheksana:
[image]
Otopini cis/trans-1,2-bis-aminometilcikloheksana (7.5 g, 52.8 mmol) u THF (30 mL) se doda otopina 1,3-bis(terc-butoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureje (7.65 g, 26.3 mmol) u THF (40 mL) unutar 0.5 h. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 5 h. Otapalo se ukloni pri smanjenom tlaku, a proizvod se pročisti kromatografijom na stupcu silika gela pomoću smjese metilen klorid/metanola kao sredstva za ispiranje, čime se dobije 1-(N,N’-diBoc)-gvanidinometil-2-aminometilcikloheksan (Spoj (k)).
Alternativno, Spoj (k) se može pripraviti na način analogan alternativnoj pripravi gore opisanoj za Spoj (e).
D. Pirimidinski spojevi
Pirimidini se mogu koristiti u slijedećim postupcima:
[image]
Slijedi opći postupak za pripravu spojeva koji sadrže pirimidin. Otopini 1,3-diamina 29 u THF se doda 28 i sadržaj se drži u refluksu 12 sati. Otapala se uklone in vacuo, a željeni adukt se pročisti kromatografijom na stupcu. Čisti 31 se acilira gore opisanim općim postupkom, čime se dobije 11.
Kao što će iskusan stručnjak uvidjeti, temeljem ovog izlaganja se mogu pripraviti različiti spojevi ovog izuma. Gore opisane kemijske reakcije imaju opću primjenu na pripravu GnRH sredstava izuma. Prema tome, i druga GnRH sredstva se na sličan način mogu pripraviti prikladnim modifikacijama, što će iskusan stručnjak lako uočiti, na pr. zaštitom interferirajućih skupina, prilagodbom za uporabu s drugim uobičajenim reagensima i/ili rutinskim modifikacijama reakcijskih uvjeta.
IN VITRO FARMAKOLOGIJA VEZANJA RADIOLIGANDA
Stanične membrane pripravljene od stanica ljudskog embrijskog bubrega 293 stabilno transficiranih s cDNA za ljudski GnRH receptor suspendirane su u puferu za test vezanja koji sadrži: 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 2.5 mM MgCl2 i 0.1% goveđeg serumskog albumina. Membrane (5-50 μg ukupnih proteina po jamici koja sadrži približno 10-100 fmol GnRH receptora) su inkubirane u duplikatu na pločama s 96 jamica u 200 μL ukupnog volumena s 125I-GnRH-A (približno 0.05 nM) i ispitivanim spojem, jedan sat, na sobnoj temperaturi. Svi spojevi su razrijeđeni u 1% DMSO (konačna testna koncentracija) u puferu za test vezanja. Nespecifično vezanje određeno je u nazočnosti 100 nM GnRH. Reakcije su prekidane brzim filtriranjem na Packard GF/C filterima s 96 jamica natopljenima s 0.1%-tnim polietileniminom. Filteri se ispiru tri puta s PBS puferom, suše i broje na Packard Topcount uređaju tekućim scintilacijskim brojenjem.
Uvjeti testa bili su jednaki i za procjenu aktivnosti spoja u drugim vrstama. Sličan broj GnRH receptora korišten je za ispitivanje svake vrste. Za vezanje GnRH receptora u štakora, membrane su pripravljene iz štakorske hipofize i korišteno je približno 25-30 μg/jamici ukupnih membranskih proteina. Za vezanje GnRH receptora u goveda, membrane su pripravljene iz goveđe hipofize, a korištene su pri 40-50 μg/jamici. Za vezanje GnRH receptora u miša, membrane su pripravljene iz 293 stanica sa stabilnim izražajem mišjih GnRH receptora, a korištene su kod približno 25-30 μg/jamici. IC50 vrijednosti za kontrolne peptide i ispitivane spojeve izračunate su pomoću GraphPad PrismTM softvera. Ishod pokusa vezanja radioliganda prikazan je na Slici 1. Tablica 1 prikazuje srednje vrijednosti višestrukih pokusa afiniteta različitih peptidnih i nepeptidnih spojeva za GnRH receptore kod četiriju vrsta.
Slika 1. Učinci spojeva na vezanje 125I-GnRH-A na hGnRH receptore izražene u HEK-293 stanicama. Ispitivana je sposobnost GnRH (kvadrati) i 9 (trokuti) za istiskivanje 125I-GnRH-A (približno 0.05 nM) vezanja na hGnRH receptore. Prikazane su vrijednosti jednog reprezentativnog pokusa provedenog u duplikatu.
Različiti spojevi Formule I sintetizirani su prema općoj reakcijskoj shemi koja je općenito opisana gore. Sirovi spojevi ispitani su pomoću gore opisanog kompeticijskog testa vezanja radioliganda. Rezultati testa kompeticijskog vezanja GnRH prikazani su na tablici (svaki spoj je ispitan pri 1 ili 10 μM).
Tablica 1.
[image]
Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SE za najmanje tri pokusa provedena u duplikatu.
NO= nije određeno
MJERENJE UKUPNOG INOZITOL FOSFATA
Za procjenu aktivnosti spojeva kao agonista ili antagonista poslužio je test mjerenja nakupljanja ukupnog inozitol fosfata. 293 stanice koje sadrže hGnRH receptor nasađene su na ploče s 24 jamice (približno 200000 stanica/jamici) pomoću DMEM medija. Slijedećeg dana, stanice su punjene s [3H]mioinozitolom (0.5 Ci/mL) tijekom 16-18 h u mediju bez inozitola. Medij se aspirira, a stanice se ispiru s DMEM bez seruma. Medij se aspirira, a stanice se potom obrade s ispitivanim spojem ili nosačem tijekom 30 minuta na 37°C. Potom se stanicama doda polovica maksimalne koncentracije GnRH (1 nM) ili nosača i ostavi se 45 minuta na 37°C da se uspostavi ravnoteža. Medij se zamijeni s ledenohladnom 10 mM mravljom kiselinom, koja zaustavlja reakciju, a također služi i za ekstrahiranje staničnih lipida. Inozitol fosfati se razdijele ionskom izmjenjivačkom kromatografijom na Dowex stupcima, koji se ispiru s 2.5 mL 10 mM mioinozitola i 10 mM mravlje kiseline. Stupci se zatim ispiru s 5 mL 60 mM natrij formata i 5 mM boraksa, a ukupni inozitol fosfati se ispiru s 5 mL 1M amonij formata, 0.1 M mravlje kiseline. Ispirci sa stupaca se dodaju u tekuće scintilacijske bočice koje sadrže 15 mL scintilacijskog koktela i broje se tekućim scintilacijskim brojenjem. Slika 2 prikazuje rezultat tipičnog pokusa.
Slika 2. Učinci spojeva na nakupljanje ukupnog inozitol fosfata potaknuto s GnRH u HEK-293 stanicama koje izražavaju hGnRH receptor. Ispitana je sposobnost peptidnog antagonista, Antida, i nepeptidnog spoja 9 da blokiraju porast [3H]inozitol fosfata potaknut s GnRH. Niti jedan spoj nije samostalno potaknuo porast ukupnog [3H]inozitol fosfata (nije prikazano), ali su oba spoja bila sposobna inhibirti poticanje posredovano s polovicom maksimalne koncentracije GnRH peptida. Sam GnRH je uzorovao o dozi ovisan porast nakupljanja [3H]inozitol fosfata, s EC50 od otprilike 0.8 nM. U prikazanom pokusu, Kb vrijednosti Antida i spoja 9 su određene postupkom prema Chengu i Prusoffu (Biochem Pharmacol 22:3099-3108, 1973). Prikazane su vrijednosti jednog pokusa provedenog u duplikatu.
IN VIVO FARMAKOLOGIJA ISPITIVANJA UČINKA U ŽIVOTINJA
Protokol pokusa: Muški Sprague-Dawley (225-250 g) štakori se kastriraju i ostave radi oporavka 10 dana nakon operacije. Deset dana nakon kastracije životinjama su uvedeni trajni kateteri u femoralnu venu i arteriju, kako bi se olakšalo davanje infuzije i uzimanje uzoraka krvi. Na dan pokusa, životinje se priviknu na prostoriju za provedbu pokusa u svojim matičnim kavezima. Od svih se životinja uzmu bazalni uzorci krvi. Nakon uzimanja bazalnih uzoraka, intravenski se primijeni nosač (10% DMSO, 10% kremofor/fiziološka otopina), Antid (1.0 μg) ili spoj 11 (10 mg/kg). Uzorci krvi uzmu se 10, 60, 90, 120, 180 i 240 minuta nakon injekcija. Krv se centrifugira, serum se prikupi i pohrani u zamrzivaču na -70°C do ispitivanja. Uzorci seruma su analizirani pomoću kita za imunoradiometrijski test DSL-4600 ACTIVE s LH-obloženim epruvetama tvrtke Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Rezultati i rasprava: Uklanjanje gonada eliminira negativnu povratnu vezu testosterona na hipotalamus, što dovodi do porasta GnRH i posljedičnog porasta LH. Slika 3 prikazuje razine LH i testosterona u plazmi kontrolnih i kastriranih štakora 10 dana nakon kirurškog zahvata. U ovih štakora očekuje se da će antagonist GnRH smanjiti porast razine LH posredovan s GnRH. Antid, peptidni antagonist GnRH, smanjuje LH u modelu kastriranih štakora (Slika 4). Spoj 11, GnRH antagonist male molekule, također snižava LH u modelu kastriranih štakora (Slika 4).
FARMAKOKINETIČKA ISPITIVANJA
Protokol pokusa: Štakori se pripreme uvođenjem intravenskih katetera u gornju šuplju venu kroz rez na desnoj vanjskoj jugularnoj veni, nakon čega se ostave da se oporave. Lijekovi se otope u smjesi 10% DMSO, 10% kremafora i 80% fiziološke otopine i primijene se i.v. u dozi od 10 mg/kg. Uzorci krvi se uzmu u naznačena vremena i spojevi se ekstrahiraju iz 0.2 mL plazme s butil kloridom koji sadrži interni standard. Uzorci se analiziraju pomoću HPLC na Beta-Basic C18 stupcu od 4x50 mm uz gradijent od 40-80% acetonitrila u 10 mM amonij fosfatnog pufera, pri brzini protoka od 1 mL/min. Određivanje uzoraka vrši se uz UV apsorbanciju na 260 nm.
Rezultati i rasprava: Spoj 11, koji ima izvrstan afinitet za štakorski GnRH receptor, ima poluživot u štakorskoj plazmi približno tri sata, a koncentraciju u plazmi 100-200 nM četiri sata nakon i.v. injekcije (Slika 5).
Vezanje referentnih peptida na štakorske, mišje, goveđe i ljudske GnRH receptore dobro se poklapa s navodima iz literature. Nepeptidni spojevi izuma pokazuju značajne razlike u profilu vezanja između pojedinih vrsta. Neki od tih spojeva pokazuju velik afinitet (<100 nM) za ljudski GnRH receptor. Funkcijski, svi ovi nepeptidni spojevi čija se aktivnost na inozitol fosfatnom testu procjenjuje djeluju kao antagonisti nakupljanja ukupnog inozitol fosfata potaknutog s GnRH u stanicama koje sadrže rekombinantne ljudske GnRH receptore. Intravenska primjena spoja 11 smanjuje razine LH u plazmi muških kastriranih štakora, koji predstavljaju model kronično povišenih razina LH u plazmi. Ovi spojevi imaju poluživot od tri sata, a koncentracija u plazmi korelira s učinkom. U cjelini, ovi podaci ukazuju na to da bi ovi nepeptidni spojevi mogli imati primjenu kao antagonisti GnRH receptora.
Peptidni agonisti i antagonisti korišteni kao referentni spojevi:
[image]
[image]
[D-ALA6, DES-GLY10]-LH-RH ETILAMID
Podaci o ovim spojevima dobiveni su na slijedeći način:
Kultura stanica
GH3 stanice stabilno transficirane sa štakorskim GnRH receptorom (GGH3) dobivene su od Dr. Williama China (Harvard Medical School, Boston, MA). Ove su stanice ranije opsežno opisane (Kaiser i sur., 1997). Ove stanice uzgoje se na Eagleovom mediju s malo glukoze modificiranom prema Dulbeccou (DMEM), koji sadrži: 100 U/mL penicilin/streptomicina, 0.6 g/L G418 i 10% fetalnog toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS).
cDNA za ljudski GnRH receptor kloniran je u plazmidni ekspresijski vektor, pcDNA 3 (In Vitrogen) i stabilno transficira u HEK 293 stanice (hGnRH-R/293). Ova stanična linija nabavljena je od Dr. Stuarta Sealfona, Mount Sinai Medical School, New York, NY. Ove se stanice uzgoje u DMEM obogaćenom s 0.2 g/L G418 100 U/mL penicilin/streptomicina i 10% FBS. Obje vrste stanica, GGH3 i hGnRH-R/293, korištene su i za mjerenje ukupnog inozitol fosfata i za mikrofiziometrijsku procjenu učinkovitosti spoja.
Priprava radioliganda
Radiojodirani agonistički analog GnRH, [des-Gly10,D-Ala6]GnRH etilamid (125I-GnRH-A), korišten je kao radioligand. Jedan μg GnRH-A razrijeđenog u 0.1 M octene kiseline se doda u borosilikatne staklene epruvete obložene Iodogen????-om (Pierce) koje sadrže 35 μL 0.05 M fosfatnog pufera (pH 7.4-7.6) i 1 mCi Na[125I]. Reakcijska smjesa se kružno miješa i inkubira 1 minutu na sobnoj temperaturi. Nakon jedne minute, smjesa se kružno miješa i ostavi inkubirati daljnju minutu. U reakcijsku epruvetu se doda 2 mL 0.5 M octene kiseline/1% BSA i smjesa se doda u C18 Sep-Pak uložak. Uložak se uzastopno ispire s 5 mL H2O i 5 mL 0.5 M octene kiseline, a potom se ispire s 5 x 1 mL 60%CH3CN/40%0.5M octenom kiselinom. Ispirak se razrijedi s trostrukim volumenom HPLC pufera A (0.1%TFA u H2O) i puni na C18 stupac. Jodirani proizvod se ispire 20-25 min. s gradijentom od 25-100% CH3CN koji sadrži 0.1%TFA. Radioaktivni ulomci (750 μL/ulomku) se prikupe u čiste polipropilenske epruvete koje sadrže 100 μL 10% BSA. Vrši se procjena biološke aktivnosti ulomaka pomoću vezanja radioliganda. Specifična aktivnost radioliganda bila je približno 2200 Ci/mmol.
Mikrofiziometrija
Cytosensor®Microphysiometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) je neinvazivni, neradioaktivni sustav u realnom vremenu temeljen na poluvodiču, za praćenje staničnih odgovora na različite podražaje. Temelji se na silikonskom senzoru koji zamjećuje pH, svjetlosni potenciometrijski senzor koji čini dio mikrovolumne protočne komore u kojoj se imobiliziraju kultivirane stanice (Pitchford i sur., 1995; Parce i sur, 1989; Owicki i sur, 1994).
Dodatne reference
Owicki, JC, LJ Bousse, DG Hafeman, GL Kirk, JD Olson, HG Wada i JW Parce. The light-addressable potentiometric sensor; principles and biological applications. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23:87-113, 1994.
Parce JW, JC Owicki, KM Kercso, GB Sigal, HG Wada, VC Muir, LJ Bousse, KL Ross, BI Sikic, HM McConnell. Detection of cell-affecting agents with a silicon biosensor. Science 246:243-247, 1989.
Pitchford S, K DeMoor, BS Glaeser. Nerve growth factor stimulates rapid metabolic responses in PC12 cells. Am. J. Physiol. 268(Cell Physiol. 37): C936-C943, 1995.
GGH3 stanice se nasade na minimalni esencijalni medij s malo pufera (MEM, Sigma) koji sadrži 25 mM NaCl i 0.1% BSA gustoćom od 500000 stanica/čahuri na polikarbonatnu membranu (pore od 3 μm) čašica za stanične čahure (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Čašice za čahure se prenesu u senzorske komore u kojima se stanice drže u neposrednoj blizini silikonskog senzora unutar senzorske komore, koja mjeri male promjene pH u mikrovolumenu senzorske komore. Medij s malo pufera se trajno pumpa preko stanica, brzinom od približno 100 μL/min, iz jednog od dvaju spremnika tekućine. Selekcijski ventil određuje koji će spremnik kojom tekućinom perfundirati stanice.
Cytosensor®Microphysiometer stvara strujni signal, koji je linearna funkcija pH, svake sekunde. U svrhu mjerenja brzine zakiseljavanja, protok do senzorske komore koja sadrži stanice se periodički prekida, omogućujući da se izlučeni kiseli metaboliti nakupe u izvanstaničnoj tekućini stanica. U ovim pokusima, stanice se održavaju na 37°C na dvominutnom ciklusu protoka, pri čemu se stanice perfundiraju s medijem 80 sekundi, nakon čega slijedi 40 sekundi u kojima je protok medija zaustavljen. Tijekom ovog razdoblja od 40 sekundi, mjere se brzine zakiseljavanja za razdoblje od 30 sekundi. Na ovaj način, pojedinačna brzina zakiseljavanja se izračuna svake dvije minute. Cytosensor®Microphysiometer sadrži osam takvih senzorskih jedinica, što omogućuje istodobno provođenje osam pokusa. Svaka se jedinica pojedinačno programira pomoću računala vezanog na sustav.
GGH3 stanice se na početku uravnoteže u MEM mediju s malo pufera tijekom razdoblja od 30-60 minuta, u kojima se prate bazalne brzine zakiseljavanja (mjerene kao μV/s), u odsutnosti bilo kakvog podražaja. Kada promjena bazalne brzine zakiseljavanja bude manja od 10% u razdoblju od 20 minuta, započinju se pokusi. Vremenski tijek pokusa zadan je tako da se odredi optimalno vrijeme za izlaganje agonistu prije mjerenja brzine zakiseljavanja i trajanje izlaganja potrebno za postizanje vršnog odgovora zakiseljavanja na različite agoniste. Iz ovih pokusa s vremenskim tijekom, određeno je da se stanice trebaju izložiti peptidnim agonistima GnRH najmanje jednu minutu prije prikupljanja podataka o brzini zakiseljavanja. Vršne brzine zakiseljavanja obično se jave u prvom dvominutnom ciklusu izlaganja. Kako bi se zabilježio vršni odgovor na GnRH, stanice se izlože agonistu na ukupno četiri minute. Stanice se izlože spojevima tijekom 20-60 minuta prije četverominutne stimulacije s GnRH (1.0 nM - 10 μM) pojedinačno ili u kombinaciji s različitim ispitivanim koncentracijama svakog spoja. Svi se spojevi ispituju u konačnoj koncentraciji od 1% DMSO u MEM mediju s malo pufera, kako je gore opisano.
Profil selektivnosti
U svrhu određivanja specifičnosti vezanja spojeva na GnRH receptore, aktivnost spojeva je ispitivana različitim testovima vezanja i funkcijskim testovima. Na slijedećoj Tablici 2 prikazana je aktivnost Spoja 20 u drugim testovima.
Tablica 2. Afinitet vezanja ili funkcijska procjena Spoja 20 u različitim testovima
[image] [image] [image] *EC50 za test bazalnog otpuštanja histamina
Slika 6 prikazuje učinak Spoja 136 na povećanje brzine izvanstaničnog zakiseljavanja u GGH3 stanicama potaknuto GnRH-om. GnRH dovodi do porasta brzine izvanstaničnog zakiseljavanja GGH3 stanica, ovisno o dozi. Spoj 136 uzrokuje desni pomak na krivulji doza-odgovor na GnRH, bez smanjenja maksimalnog odgovora na GnRH. Ovo upućuje na to da je ovaj spoj kompeticijski receptorski antagonist GnRH na ovom receptoru. Prikazane su vrijednosti jednog pokusa.
Slijedi primjer postupaka za pripravu spojeva ovog izuma:
[image]
4-(3-metilfenoksi)-2-butanon:
[image]
U m-krezol (4.0 g, 37 mmol), metil vinil keton (3.2 mL, 37 mmol) u kloroformu (25 mL) se doda diizopropil etil amin. Smjesa se grije uz refluks 16 h, ostavi se ohladiti na sobnu temperaturu i ispari. Ostatak sadrži 50% proizvoda i 50% početne tvari. Početna tvar se izdvoji u obliku t-butildimetil silil etera. Proizvod se izolira filtriranjem kroz jastučić. Prinos 4.5 g (68%).
2-metil-4-(3-metilfenoksi)-2-butanol:
[image]
Otopini metil magnezij bromida u eteru (50 mL), pripravljenoj iz Mg (572 mg, 23.56 mmol) i MeI (3.34 g, 23.56 mmol), se doda 4-(3-metilfenoksi)-2-butanon (2.1 g, 11.78 mmol) u 10 mL etera. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 30 minuta, nakon čega se gasi vodom i razrij. kloridnom kiselinom. Organski sloj se izdvoji, suši preko natrij sulfata i filtrira kroz jastučić silike. Bezbojni sirup 1.91 g (83%).
4,4,7-trimetil kroman:
[image]
U aluminij klorid (1.3 g, 9.79 mmol) u 40 mL karbon disulfida se doda 2-metil-4-(3-metilfenoksi)-2-butanol (1.9 g, 9.79 mmol) u 10 mL ugljik disulfida. Smjesa se grije uz refluks 2 h. Otapalo se ispari, ostatak se razrijedi s 50 mL etil acetata i 10 mL vode. Organski sloj se izdvoji, suši preko natrij sulfata i pročisti kroz brzi stupac. Svjetložuti sirup 1.5 g (87%).
Etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]-2-furoat i etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furoat:
[image]
U cink klorid (950 mg, 6.97 mmol) u nitrometanu (20 mL) se doda smjesa 4,4,7-trimetil kromana (1.23 g, 6.97 mmol) i etil-5-klorometil-2-furoata (656 mg, 3.48 mmol) u nitrometanu (15 mL). Smjesa se miješa na sobnoj temperaturi 16 h. Ispari se do suhoće i usitni s etil acetat-vodom (1:1, 100 mL). Organski sloj, nakon uobičajene obrade i filtriranja kroz jastučić pomoću heksan:etil acetata (9:1), daje smjesu ovih dvaju spojeva. 1.34 g (46% prema kromanu).
N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5-[(4,4.7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]-2-furamid i N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furamid:
[image]
Smjesi etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]-2-furoata i etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furoata (1.34 g, 3.74 mmol) u THF-MeOH-H2O (7:5:5, 20 mL) se doda litij hidroksid monohidrid (784 mg, 18.7 mmol). Smjesa se miješa 4 h na sobnoj temperaturi. Smjesa se ispari do suhoće, razrijedi s 30 mL etil acetata i 50 mL vode. Nakon zakiseljavanja s razrijeđenom HCI, etil acetatni sloj se izdvoji, osuši i ispari, čime se dobije smjesa odgovarajućih kiselina, 1.03 g (kvantitativno). Kiseline se ne bi mogle izdvojiti kromatografijom na stupcu ili kristaliziranjem.
Smjesi kiselina (200 mg, 0.66 mmol) u diklorometanu (30 mL) se doda tionil klorid (392 mg, 3.3 mmol). Smjesa se drži u refluksu tijekom 1 h i ispari. Ostatak se otopi u heksan-etil acatatu (9:1, 20 mL) i filtrira kroz jastučić silika gela (0.5 cm x 1.0 cm).
Ostatku u 10 mL etil acetata se doda 2,4,6-trimetoksifenil amin hidroklorid (145 mg, 0.66 mmol), potom diizopropil etil amin (256 mg, 1.98 mmol). Smjesa se miješa na sobnoj temperaturi 16 h. Reakcija se prekida s vodom (10 mL), etil acetatni sloj se izdvoji. Kombinacija pročišćavanja na stupcu i HPLC daje 15 mg, odnosno 21 mg dvaju sastojaka (12%).
Bioraspoloživost spojeva izuma prikazana je na slijedećoj Tablici.
In vivo farmakologija nekih spojeva izuma ispitana je na slijedeće načine:
In vivo pokusi: općenito
Odrasli muški Sprague-Dawley štakori kupljeni su od Harlan Sprague Dawley (San Diego). Životinje su smještene po dvije u kavez i držane u sobi s kontroliranom temperaturom (22±2°C) uz svjetlosni ciklus 12 h svjetlo/12 h mrak (paljenje svjetla u 6.00 h). Hrana za štakore (Teklad štakorska hrana) i voda iz napajalice bili su ponuđeni po želji.
Životinjski modeli za procjenu aktivnosti GnRH antagonista
Model kastriranog muškog štakora
Temeljna načela:
Kirurško odstranjivanje gonada uklanja cirkulirajući testosteron i eliminira negativnu povratnu vezu testosterona na hipotalamus. Rezultat toga jest porast GnRH i posljedični porast LH (Slika #1). Za očekivati je da antagonist GnRH smanji porast razine LH posredovan GnRH-om. Antid, peptidni GnRH antagonist smanjuje razinu LH u kastriranih štakora (Slika #8). Ovaj model izgleda prikladan za procjenu GnRH antagonista male molekule.
Protokol:
Muški Sprague-Dawley (200-225 g) štakori se kastriraju skrotalnim pristupom u halotanskoj anesteziji. Životinje se prije ispitivanja ostave 14 dana radi poslijeoperacijskog oporavka. Trinaest dana nakon kastracije, životinje se anesteziraju halotanom i uvede im se trajna kanila u jugularnu venu. Pojedinosti o postupku kaniliranja opisani su prethodno (Harms i Ojeda, 1974).
Na dan ispitivanja, životinje se priviknu na prostoriju za provedbu pokusa u svojim matičnim kavezima. Od svih se životinja uzmu bazalni uzorci krvi. Odmah nakon uzimanja bazalnih uzoraka, nosač ili ispitivani spojevi se primijene različitim putevima. Korišteni su slijedeći putevi primjene: intavenski (iv), intramuskularni (im), intraperitonejski (ip), potkožni (sc) i peroralni (po). Uzorci krvi se prikupe u heparinizirane epruvete, u višestrukim vremenskim razdobljima nakon primjene. Krv se odmah centrifugira, plazma se prikupi i pohrani u zamrzivač na -20°C do ispitivanja. Uzorci plazme se analiziraju pomoću imunoradiometrijskog kita DSL-4600 ACTIVE s LH-obloženim epruvetama tvrtke Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Formulacije spojeva:
Formulacija #1 (označena brojem 1 u superskriptu): 10% DMSO, 10% kremofora EL i 80% fiziološke otopine.
Formulacija #2 (označena brojem 2 u superskriptu): 10% kremofora EL i 90% fiziološke otopine.
Rezultati
Vidi Slike 9-11 i Tablicu.
Nedirnuti muški štakor
Temeljna načela:
Testosteron je hormon reguliran osovinom hipotalamus-hipofiza-gonade. GnRH se pulsno secernira iz hipotalamusa i potiče adenohipofizu na otpuštanje gonadotropnih hormona LH i FSH. Testosteron se proizvodi kada LH potakne testise. Količina izlučenog testosterona raste približno izravno proporcionalno s količinom dostupnog LH (Guyton, 1986). Očekuje se da antagonist GnRH smanjuje razinu testosterona inhibiranjem LH.
Protokol 1:
Muški Sprague-Dawley (250-275 g) štakori se smjeste u nastambe po jedan i ostave tjedan dana uoči ispitivanja da se priviknu. Na dan ispitivanja nosač ili ispitivani spoj se primijene na životinje različitim putevima, uključujući ip, sc i po.
Uzorci krvi od pojedinih životinja se dobiju punkcijom srca u halotanskoj anesteziji, u unaprijed određenim vremenskim razdobljima nakon primjene. Uzorci krvi se prikupe u heparinizirane epruvete. Krv se odmah centrifugira, plazma se prikupi i pohrani u zamrzivač na -20°C do ispitivanja. Uzorci plazme se analiziraju pomoću kita radioimunoeseja DSL-4600 ACTIVE s testosteronom obloženim epruvetama tvrtke Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Protokol 2:
Muški Sprague-Dawley (250-275 g) štakori se smjeste u nastambe po jedan i ostave tjedan dana uoči pokusa da se priviknu. Razvili smo tehniku za dobivanje opetovanih uzoraka iz jugularne vene uporabom mikrorenatanskih (MRE) katetera usađenih 7 dana prije ispitivanja. Pojedinosti kirurškog postupka opisane su prethodno (Harms i Ojeda, 1974). Na dan ispitivanja, životinje se ostave da se priviknu na prostoriju za ispitivanje boravkom u matičnom kavezu. Od svih se životinja uzmu bazalni uzorci krvi. Neposredno nakon uzimanja bazalnih uzoraka, nosač ili ispitivani spojevi se primijene različitim putevima. Korišteni su intravenski (iv), intramuskularni (im) i peroralni (po) put primjene. Uzorci krvi se prikupe u heparinizirane epruvete, u višestrukim vremenskim razdobljima nakon primjene. Krv se odmah centrifugira, plazma se prikupi i pohrani u zamrzivaču na -20°C do ispitivanja. Uzorci plazme se analiziraju pomoću kita radioimunoeseja DSL-4600 ACTIVE s testosteronom obloženim epruvetama tvrtke Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Protokol 3: opetovano doziranje ispitivanog spoja br. 134
Muški Sprague-Dawley (250-275 g) štakori se smjeste u nastambe po dva i ostave da se prilagode tjedan dana uoči ispitivanja. Dnevne primjene nosača provedene su im, sc ili po putem, između 8.00 i 9.00 h ujutro, tijekom sedam dana. Osmog dana između 8.00 i 9.00 h ujutro se uzmu uzorci krvi, punkcijom srca u halotanskoj anesteziji. Ovaj se postupak dovrši u 45-60 sekundi. Tijekom slijedećih 7 dana, jedna skupina životinja nastavila je primati nosač, dok druga skupina životinja nije primala ništa. Uzorci su prikupljeni na gore opisani način nakon 7. dana ovakvog režima doziranja. Razine testosterona nisu se razlikovale između životinja koje su primale, odnosno koje nisu primale nosač.
Dnevno im doziranje Spoja 134 (100 mg/kg) ili nosača provedeno je između 8.00 h i 9.00 h ujutro, sedam dana. Uzorci su prikupljeni na gore opisani način nakon 7. dana.
Svi uzorci krvi se prikupe u heparinizirane epruvete. Krv se odmah centrifugira, plazma se prikupi i pohrani u zamrzivač na -20°C do određivanja slijedećeg dana. Uzorci plazme se analiziraju pomoću kita radioimunoeseja DSL-4000 ACTIVE s testosteronom obloženim epruvetama tvrtke Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Rezultati
Vidi Tablicu 2 i Slike 12-14.
Opis slika
Slika 7: Grafikon sa stupcima prikazuje bazalne razine LH i testosterona u kastriranih (CX) i nedirnutih štakora. LH je povišen u CX štakora. Testosterona nema u CX štakora.
Slika 8: Krivulja prikazuje LH vrijednosti izražene kao postotak bazalnog LH u životinja kojima je davan nosač, odnosno Antid. Antid (2.0 i 20 ug; sc) snižava LH u CX štakora.
Slika 9: Krivulja prikazuje LH vrijednosti izražene kao postotak bazalnog LH u životinja kojima je davan nosač, odnosno spoj. Spoj 134 (1.0, 5.0 & 10 mg/kg; iv) uzrokuje o dozi ovisno snižavanje LH u CX štakora.
Slika 10: Krivulja prikazuje LH vrijednosti izražene kao postotak bazalnog LH u životinja kojima je davan nosač, odnosno spoj. Spoj 134 (20 ili 100 mg/kg; ip) snižava LH u CX štakora.
Slika 11: Krivulja prikazuje LH vrijednosti izražene kao postotak bazalnog LH u životinja kojima je davan nosač, odnosno spoj. Spoj 134 (20 mg/kg; im) snižava LH u CX štakora.
Tablica 1. GnRH spojevi u modelu kastriranih štakora
[image] [image] [image]
NS = nema snižavanja
NO = nije određeno
Opis slika
Prikaz Protokola 1:
Slika 12: Grafikon sa stupcima prikazuje razine testosterona u životinja kojima je davan nosač, odnosno spoj, 6 sati nakon ip injekcije. Spoj 136 snižava razine testosterona u poredbi sa životinjama kojima je davan nosač *=p<0.05, t-test.
Prikaz Protokola 2:
Slika 13: Krivulja prikazuje razine testosterona tijekom razdoblja od 12 h i nakon 24 h u štakora kojima je davan nosač, odnosno spoj 134. Nosač i spoj 134 davani su peroralno. Najviša doza spoja 134 potisnula je testosteron tijekom razdoblja ispitivanja.
Prikaz Protokola 3:
Slika 14: Grafikon sa stupcima prikazuje razine testosterona u životinja kojima je davan nosač, odnosno spoj 134, kao životinja kontrolne skupine. Stupci s okvirom (“prazni”) predstavljaju razine testosterona uoči primjene, a ispunjeni stupci predstavljaju razine testosterona nakon 7 dana opetovane primjene. Spoj 134 značajno potiskuje razine testosterona u poredbi s vremenom uoči primjene, i to u životinja kojima je davan nosač, kao i u životinjama kontrolne skupine. *=p<0.05, t-test.
Tablica 2. GnRH spojevi u nedirnutih muških štakora
[image]
NS = nema snižavanja
NO = nije određeno
Bilješke o postupcima
Dokumentirano je kako neki postupci koji se često koriste u endokrinološkim ispitivanjima na životinjama, kao što su anestezija, gladovanje ili kirurški zahvat, mogu utjecati na razine hormona koji se promatraju (BE Howland i sur., Experentia, 1974). Luteinizirajući hormon i testosteron su osjetljivi na stresore. Brojni izvještaji su proturječni u pogledu učinaka stresora na HPG osovinu, čak i kada se koriste iste vrste i stresori. Na primjer, opisano je kako muški štakori koji se podvrgnu zatvaranju ili ograničavanju pokretnosti imaju niske (Kruhlich i sur., 1974; DuRuisseau i sur., 1978), normalne (Tache i sur., 1980; Charpenet i sur., 1982; Collu i sur., 1984), odnosno povišene (Briski i sur., 1984) koncentracije LH. Slično tome, opisano je kako se razine testosterona u plazmi mijenjaju nakon izlaganja stresnim situacijama, no i ovdje su podaci proturječni i stoga teški za interpretiranje. Na primjer, opisano je kako tijekom intenzivne fizičke aktivnosti razine testosterona u plazmi rastu (Dessypris i sur., 1976), padaju (Sutton i sur., 1973), odnosno ostaju nepromijenjene (Lamb, 1975). Učinci ograničavanja pokretnosti na koncentracije testosterona konzistentniji su u većini istraživanja, upućujući na snižavanje cirkulirajućih vrijednosti (Tache i sur., 1980; Charpenet i sur., 1982; Collu i sur., 1984). Prihvaćeno je, međutim, da stresori izazivaju promjene u cirkulirajućem testosteronu i da vrsta stresa koji se koristi, trajanje i težina uzrokuju različite stresom izazvane promjene u koncentracijama testosterona. Razmatrajući podložnost LH i testosterona stresu, optimizirali smo protokole za procjenu LH i testosterona u uvjetima koji minimiziraju stres.
Spojevi prema izumu koji su pripravljeni prikazani su na Tablicama u privitku.
Sopjevi se mogu pripraviti ranije opisanim općenitim eksperimentalnim postupcima. Slijede specifični primjeri.
Spojevi koji sadrže pirimidin
[image]
Priprava 2-kloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-4-pirimidinamina 1 i
4-kloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2-pirimidinamina 2
U tikvicu okruglog dna od 250 mL se stavi 2,4-dikloropirimidin (5.0g, 33.56 mmol) i 200 mL THF. Ovoj otopini se doda trietilamin (14.0 mL, 100.68 mmol) i [R]-tetrahidrofurfurilamin. Otopina se miješa preko noći. Reakcijska smjesa se ulije u vodu i ekstrahira s metilen kloridom. Razdvojeni organski slojevi se ispiru otopinom soli, suše preko magnezij sulfata i koncentriraju na kružnom isparivaču. Sirovi spoj se pročisti kromatografijom na silika gelu s heksan/etil acetatom (4:1 vol/vol do 1:1 vol/vol), čime se dobiju 2 (1.3 g) i 1 (3.98 g).
Priprava N-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3
U otopinu m-ksilen diamina (28.76 g, 211.15 mmol) u THF (300 mL,.7 M) se kap po kap doda otopina etil trifluoroacetata (10g, 70.38 mmol) u THF (50 mL, 1.4M). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija se prati pomoću TLC. Otapalo se koncentrira, a ostatak se zakiseli do pH 2 s 4N HCl, otopi u vodi i ispire s etil acetatom. Izdvojeni vodeni sloj se zaluži do pH 11 pomoću NH4OH i spoj se ekstrahira diklorometanom. Izdvojeni organski sloj se ispire vodom/otopinom soli, suši preko magnezij sulfata i koncentrira, čime se dobije 3 (8.71 g, 53% prinosa).
Sinteza 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamida 9
[image]
[image]
Priprava etil 3-(aminometil)benzilkarbamata 5
U otopinu N-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3 (10.6 g, 43.1 mmol) se doda etil kloroformat (1 eq.), a potom trietilamin. Reakcija se miješa na sobnoj temperaturi 30 min. Sirovi proizvod se ekstrahira s metilen kloridom i koncentrira, čime se dobije etil 3-{[(trifluoroacetil)amino]metil}benzilkarbamat 4. Ovaj sirovi proizvod se otopi u metanolu (100 mL) i 2N K2CO3 (100 mL) i miješa preko noći. Reakcijska smjesa se zaluži do pH 14 s 20% NaOH, ekstrahira s metilen kloridom, ispire otopinom soli i suši preko magnezij sulfata, čime se dobije 5 (5.2 g).
Priprava etil 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzilkarbamata 6
U otopinu etil 3-(aminometil)benzilkarbamata 5 se doda prinos 4-kloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2-pirimidinamin 2 u klorobenzenu se doda trietilamin. Reakcijska smjesa se drži u refluksu preko noći. Otopina se hladi na sobnu temperaturu, nanosi na stupac silika gela i ispire s heksan/etil acetatom (1:1 vol/vol), čime se dobije etil 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinail)amino]metil}benzilkarbamat 6 (73% prinosa).
Etil 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinail)amino]metil}benzilkarbamat 6 se otopi u etilen glikolu i kalij hidroksidu (1:1 vol/vol). Otopina se grije do 100°C preko noći. Smjesa se hladi na sobnu temperaturu i ekstrahira s kloroformom, ispire otopinom soli i suši preko magnezij sulfata, čime se dobije N4-[3-(aminometil)benzil]-N2-[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4-pirimidindiamin 7 (82% prinosa).
Priprava 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2
-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamida 9
Etil 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinail)amino]metil}benzilkarbamat 6 se otopi u etilen glikolu i kalij hidroksidu (1:1 vol/vol). Otopina se grije do 100°C preko noći. Smjesa se hladi na sobnu temperaturu i ekstrahira s kloroformom, ispire otopinom soli i suši preko magnezij sulfata, čime se dobije N4-[3-(aminometil0benzil]-N2-[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4-pirimidindiamin 7 (82% prinosa). Ovaj proizvod, 7, (182 mg, .580 mmol) i 2-furoil kloridni reagens 8 se otope u diklorometanu, potom u trietilaminu. Reakcija se miješa na sobnoj temperaturi preko noći. Sirovi spoj se pročisti na stupcu silika gela i razrijedi etil acetat/heksanom (4:1 vol/vol), čime se dobije 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamid 9 (159.1 mg). 1H NMR ( CDCl3): δ 1.19 (s, 6H), 1.26 (s, 6H), 1.65 (m, 5H), 1.92 (m, 3H), 2.23 (s, 3H), 3.45 (m, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.7 (m, 1H), 3.9 (m, 3H), 4.05 (m, 1H), 4.50 (d, 2H), 4.58 (d, 2H), 5.01 (brd, 1H), 5.30 (brd, 1H), 5.71 (d, 1H), 6.03 (d, 1H), 6.61 (t, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.28 (m, 4H), 7.80 (d, 1H). MS: 622.4 (M+1).
Sinteza 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenzil)metil]-N-(3-[[(4-{[(2S)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamida 12
[image]
Priprava N-[3-(aminometil) benzil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamida 11
U otopinu N-[3-(aminometil)benzil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3 i 2-furoil kloridnog reagensa 8 se doda trietilamin. Reakcijska smjesa se miješa na sobnoj temperaturi 1 sat. Sirova smjesa se pročisti kromatografijom na silika gelu, uz ispiranje s heksan/etil acetatom (4:1 vol/vol), čime se dobije 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(trifluoroacetil)amino]metil}benzil)-2-furamid 10. Pročišćeni spoj se otopi u metanolu (100 mL) i kalij karbonatu u vodi (2M, 100 mL). Reakcija se grije do 70°C preko noći. Otopina se hladi na sobnu temperaturu, zaluži s 20% NaOH do pH 14, ekstrahira s metilen kloridom, ispire otopinom soli i suši preko magnezij sulfata, čime se dobije N-[3-(aminometil)benzil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamid 11 (4.97 g, 85.1% prinosa).
Priprava 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2naftalenzil)metil]-N-(3-[[(4-{[(2S)-tetrahidro-2furanilmetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamid 12
U otopinu N-[3-(aminometil)benzil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamida 11 u klorobenzenu se doda 2-kloro-N-[(2S)-tetrahidro-2-furanmetil]-4-pirimidinamin i trietilamin. Reakcijska smjesa se drži u refluksu preko noći. Hlađena smjesa se potom pročisti kromatografijom na silika gelu, poslije čega slijedi HPLC, čime nastaje 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenzil)metil]-N-(3-[[(4-{[(2S)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}benzil)-2-furamid 12. 1H NMR (CDCl3): δ 1.01 (s, 6H), 1.25 (s, 6H), 1.43 (m, 1H), 1.56 (s, 4H), 1.70-1.98 (m, 3H), 2.13 (s, 3H), 3.24 (m, 1H), 3.61 (m, 1H), 3.63-3.80 (m, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.87-4.06 (m, 1H), 4.37-4.60 4.37 (d, 2H), 4.60 (d, 2H), 5.73 (d, 1 H), 5.92 (d, 1H), 6.3 (brd, 1H), 6.75 (brd, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.98 (d, 1H), 7.0 (s, 1H), 7.09-7.26 (m, 4H), 7.4 (s, 1H), 9.5 (brd, 1H). MS (APCI): 622.3 (M+1).
Primjeri spojeva koji sadrže heterocikle
[image]
4-(3-metilfenoksi)-2-butanon
[image]
U m-krezol (4.0 g, 37 mmol) i metil vinil keton (3.2 mL, 37 mmol) u kloroformu (25 mL) se doda diizopropil etil amin. Smjesa se grije uz refluks 16 h, ostavi se hladiti na sobnu temperaturu i ispari se. Ostatak čini 50% proizvoda i 50% početne tvari. Početna tvar se izdvoji kao t-butildimetil silil eter. Proizvod se izolira filtracijom kroz jastučić, pomoću silika gel 50%-tnog heksan/etil acetata. Prinos je 4.5 g (68%). Kao alternativni postupak pročišćavanja, sirova reakcijska smjesa se ispari, otopi u DMF (0.2 M) i doda se 0.5 ekvivalenata imidazola i 0.5 ekvivalenata tBDMSCl. Reakcija se miješa 3 h na sobnoj temperaturi, zatim se otapala uklone in vacuo. U ostatak se doda 75 mL etil acetata i 75 mL vode (omjer 1/1). Etil acetatni sloj se izdvoji i suši preko Na2SO4. Otapala se uklone in vacuo. Sirova tvar se smjesti na jastučić silika gela i sililirani m-krezol se ukloni s heksanima. Proizvod se dobije ispiranjem s 5-10% etil acetata u heksanima. Otapala se uklone in vacuo, čime se dobije željeni proizvod. 1H (CDCl3): 7.15 (t, 1H), 6.65-6.80 (m, 2H), 4.25 (t, 2H), 2.75 (t, 2H), 2.25 i 2.35 (2s, 3H svaki).
2-Metil-4-(3-metilfenoksi)-2-butanol
[image]
U otopinu metil magnezij bromida u eteru (50 mL), pripravljenu iz Mg (572 mg, 23.56 mmol) i MeI (3.34 g, 23.56 mmol), se doda 4-(3-metilfenoksi)-2-butanon (2.1 g, 11.78 mmol) u 10 mL etera. Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 30 minuta, nakon čega se prekida vodom i razrijeđenom kloridnom kiselinom. Organski sloj se izdvoji, suši preko natrij sulfata, filtrira kroz jastučić silike, čime se dobije bezbojni sirup 1.91 g (83%) masena spektralna analiza pomoću APCI +ve 177 (M+-OH).
4,4,7-trimetil kroman
[image]
U aluminij klorid (1.3 g, 9.79 mmol) u 40 mL ugljičnog disulfida se doda 2-metil-4-(3-metilfenoksi)-2-butanol (1.9 g, 9.79 mmol) u 10 mL ugljičnog disulfida. Smjesa se grije uz refluks tijekom 2 h. Otapalo se ispari, ostatak se razrijedi s 50 mL etil acetata i 10 mL vode. Organski sloj se izdvoji, suši preko natrij sulfata i pročisti kromatografijom na stupcu, čime se dobije svjetložuti sirup 1.5 g (87%). 1H(CDCl3): 7.05 (br d, 1H), 6.87 (dd, 1H), 6.69 (d, 1H), 4.20 (t, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.80 (t, 2H), 1.40 (s, 6H).
Etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]-2-furoat i etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furoat
[image]
U cinkov klorid (950 mg, 6.97 mmol) u nitrometanu (20 mL) se doda smjesa 4,4,7-trimetil kromana (1.23 g, 6.97 mmol) i etil-5-klorometil-2-furoata (656 mg, 3.48 mmol) u nitrometanu (15 mL). Smjesa se miješa na sobnoj temperaturi 16 h. Reakcija se ispari do suhoće i usitni s etil acetat-vodom (1:1, 100 mL). Organski sloj, uobičajenom obradom i filtracijom kroz jastučić pomoću heksana u etil acetatu (9:1), daje smjesu ovih dvaju spojeva. 1.34 g (46% temeljeno na kromanu).
N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]-2-furamid i
N-(2,4,6-trimetoksifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furamid
[image]
Smjesi etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-6-il)metil]-2-furoata i etil-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-kromen-8-il)metil]-2-furoata (1.34 g, 3.74 mmol) u THF-MeOH-H2O (7:5:5, 20 mL) se doda litij hidroksid monohidrat (784 mg, 18.7 mmol). Smjesa se miješa 4 h na sobnoj temperaturi. Smjesa se ispari do suhoće, razrijedi s 30 mL etil acetata i 50 mL vode. Nakon zakiseljavanja s razrijeđenom HCI, etil acetatni sloj se izdvoji, suši i ispari in vacuo, čime se dobije smjesa odgovarajućih kiselina, 1.03 g (kvantitativno). Ove se kiseline ne mogu izdvojiti pomoću tipične kromatografije na stupcu ili kristalizacije. U smjesu kiselina (200 mg, 0.66 mmol) u diklorometanu (30 mL) se doda tionil klorid (392 mg, 3.3 mmol). Smjesa se drži u refluksu 1 h i ispari. Ostatak se otopi u heksan-etil acetatu (9:1, 20 mL) i filtrira kroz jastučić silika gela (0.5 cm x 1.0 cm). Ostatku u 10 mL etil acetata se doda 2,4,6-trimetoksifenil amin hidroklorid (145 mg, 0.66 mmol), potom diizopropil etil amin (256 mg, 1.98 mmol). Smjesa se miješa na sobnoj temperaturi 16 h. Reakcija se prekida vodom (10 mL), etil acetatni sloj se izdvoji. Kombinacija pročišćavanja na stupcu i HPLC pročišćavanja daje 15 mg i 21 mg dvaju sastojaka (12%). Izomeri se razdvoje pomoću HPLC kromatografije obrnute faze. Linijski izomer: 1H (CDCl3): 7.46 (br s, 1H), 7.23 (br s, 1H), 7.14 (br s, 1H), 7.02 (s, 2H), 6.63 (s, 1H), 6.15 (s, 2H), 6.0 (d, 1H), 4.17 (t, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.81, 3.80 (2s, 3H svaki), 2.21 (s, 3H), 1.81 (t, 2H), 1.29 (s, 6H). M+ na 466.2. Kutni izomer: AXC07302: 7.25 (br s, 1H), 6.91 (d, 1H), 6.88 (d, skriveni, 1H), 6.53 (d, 1H), 5.95 (s, 2H), 5.72 (d, 1H), 3.96 (t, 2H), 3.8 (s, 3H), 3.6 (s, 6H), 2.07 (s, 3H), 1.59 (t, 2H), 1.11 (s, 6H). M+ na 466.1
Primjeri aromatskih spojeva
[image]
Spoj 183
Timol (1.0 eq, 33.3 mmol) i metil 5-(klorometil)-2-furoat (1.0 eq, 33.3 mmol) se otope u nitrometanu (120 mL, 0.2 M). Gornjoj otopini se u dušiku doda aluminij triklorid (1.0 eq, 33.3 mmol) otopljen u 25 mL nitrometana i grije se do polakog refluksa tijekom 10 min. Toplina se isključi i ostavi se stajati u dušiku preko noći. Reakcija se prekida sa 100 mL vode i ekstrahira s diklorometanom. Sirova smjesa se ispari do suhoće i nanosi na jastučić stupca za kromatografiju (omjer 1g sirovog /100 g silika gela). Stupac se ispire sa 7 i 11%-tnim etil acetat/heksanima, čime se dobije željeni proizvod (2.9 g, 30%). Ester se hidrolizira do kiseline litijevim hidroksidom u THF/MeOH/H2O (35/25/25).
U otopinu koja sadrži 5-(4-hidroksi-5-izopropil-2-metilbenzil)-2-furoičnu kiselinu (1.0 eq, 3.6 mmol, 0.5M) i 2,6-dimetoksianilin (1.0 eq, 3.6mmol) se otope u DMF. Ovoj se smjesi dodaju HATU (1.0 eq, 3.6 mmol) i di-izopropil etil amin (1.0 eq, 3.6 mmol) i miješa se preko noći. Smjesa se grije 10 min. na 45°C. Otopina se smjesti u etil acetat (3x volumena) i ispire vodom. Organski sloj se ispari do sirupa i ispire na jastučiću kromatografijom na stupcu (1:100 g sirovog/g silika gela) s 30 i 50%-tnim etil acetat/heksanom, čime se dobije: N-(2,6-dimetoksifenil)-5-(4-hidroksi-5-izopropil-2-metilbenzil)-2-furamid (820 mg, 55% prinosa). 1H NMR (CDCl3) 7.22 ppm (1H, t, J=8.68 Hz), 7.08 ppm (1H, d, J=3.40 Hz), 6.99 ppm (1H, s), 6.64 ppm (2H, d, J=8.68 Hz), 6.61 ppm (1 H, s), 5.97 ppm (1H, d, J=3.40 Hz), 3.95 ppm, (2H, s), 3.85 ppm, (6H,s), 3.17 ppm, (1H, pentet, J=6.8 Hz) 2.23 ppm, (3H,s), 1.25 ppm (3H,s) i 1.23 ppm (3H, s).
Kalij t-butoksid se otopi (1.05 eq, 0.128 mmol) u MeOH (24 μL). U otopinu gornjeg furamida (1.0 eq, 0.122 mmol, 1M) u DMF se doda otopina t-butoksida i miješa se 30 min. Doda se 2-bromoetil metil eter (1.0 eq, 0.122 mmol) (20%MeOH/DMF, 1M) i miješa se na sobnoj temperaturi 48 sati i pročisti pomoću HPLC obrnute faze (postupak: 35-75% 90 min. acetonitril u 0.1% vodenoj TFA), čime se dobije (8.5 mg, 15% prinosa). 1H NMR (CDCl3): 7.04 ppm (1H, J=8.31 Hz, t), 6.85 ppm (1H, J=3.40, d), 6.80 ppm (1H, s), 6.53 ppm (1H, s), 6.48 (2H, J=8.31 Hz, d), 5.76 (1H, J=3.40 Hz, d), 3.88 (2H, J=3.40/4.53 Hz, dd), 3.78 (2H, s), 3.58 (6H, s), 3.54 (2H, J=3.40/4.54 Hz, dd), 3.20 (3H, s), 3.07 (1H, J=7.2 Hz, pentet), 2.04 (3H, s), 0.97 (3H, s), 0.95 (3H, s).
Spoj A
1,1,6-trimetil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen se sintetizira prema navodima iz John J. Parlow Tetrahedron vol. 49 (13) 2577. Potom se poveže s metil 5-(klorometil)-2-furoatom pomoću reakcije prema Friedles-Crafts-u, kao što je ranije navedeno, čime se dobiju dva glavna regio-izomera. Željeni izomer se razdijeli nakon hidrolize koristeći tri do pet uzastopnih rekristalizacija iz sustava 10% aceton/heptana (1g/10 mL). Kiselina se potom prevede u kiseli klorid s tionil kloridom, kako je ranije navedeno.
U otopinu 5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoil klorida (1.0 eq, 0.32 mmol, 0.2M) u 2mL etil acetata se doda 2,4,6 trimetoksi anilin mono HCl sol (1.0 eq, 0.32 mmol). Doda se trietil amin (suvišak) i miješa se preko noći. Sirovi proizvod se suši u vakuumu i pročisti kroz jastučić kromatografije na stupcu (1:100 omjer sirove mase/silika gela) uz ispiranje s 20 i 30 postotnom otopinom etil acetat/heksana. U nekim slučajevima, regio-izomeri se razdijele rekristalizacijom u dvadesetpetpostotnom etil acetat/heksanima (1g/75mL spoj/volumen), čime se dobije N-(2,4,6-trimetoksilfenil)-5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamid (120 mg, 82% prinosa). 1H NMR (CDCl3) 7.28 ppm (1H, široki), 7.12 (1H, s), 7.08 (1H, J=3.40 Hz, d), 6.89 (1H, s), 6.19 (2H, s), 6.00 (1H, J=3.40 Hz, d), 3.97 (2H, s), 3.83 (3H, s), 3.82 (6H, s) 2.73 (2H, J=6.05 Hz, t), 2.25 (3H, s), 1.84-1.76 (2H, multiplet), 1.69-1.63 (2H, multiplet), 1.59 (3H, s), 1.26 (6H,s) elementalno: očekivano C (72.55), H (7.18), N (3.02); stvarno C (72.67), H (7.22), N (2.98).
Spoj 228
[image]
Spoj II. U otopinu 3,5-dimetoksianilina (Spoj I, 1.53 g, 10 mmol) u DCM (20 mL) se doda metansulfonil klorid (0.88 mL, 10 mmol). TEA (1.40 mL, 10 mmol) se doda kap po kap. Reakcijska smjesa se miješa na sobnoj temp. 15 h. Sirovi proizvod se osuši i pročisti flash kromatografijom (30% etil acetat/heksani), što daje spoj II (2.10 g, 91%) u obliku bijele krute tvari. 1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 2.96 (s, 3H), 3. 71 (s, 6H), 6.20 (d, 1H, J=3Hz), 6.34 (d, 2H, J=3Hz), 6.76 (s, 1H). APCI-MS m/z 232 (M+H)+.
Spoj III. U otopinu (CH3)4NNO3 (1.12 g, 7.89 mmol) u DCM (10 mL) se kap po kap doda triflički anhidrid. Reakcijska smjesa se miješa na 0°C 1.5 h. U lijevak za kapanje se stavi spoj II (1.75 g, 7.51 mmol) u 10 mL DCM i otopina se doda reakcijskoj smjesi nitronij triflata na -78°C. Reakcijska smjesa se drži na -78°C 30 min, pa se postupno grije na sobnu temp. Miješa se 15 h. Reakcija se prekida s 5% NaHCO3 (50 mL) i smjesa se miješa 30 min. Vodeni sloj se ekstrahira s DCM (3 x 20 mL). Pomiješani DCM sloj se suši preko Na2SO4. Sirovi proizvod se pročisti pomoću HPLC, čime se dobije spoj III (250 mg, 11%) u obliku bijele krute tvari. 1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 3.03 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 6.32 (d, 1H, J=3Hz), 6.88 (d, 1H, J=3Hz), 8.31 (s, 1H). APCI-MS m/z 275 (M-H)-.
Spoj IV U otopinu spoja III (106 mg, 0.38 mmol) u EtOH (2 mL) se doda 20 mg Pd/C i NH2NH2 (1 mL). Reakcijska smjesa se drži u refluksu 9 h. Reakcijska smjesa se propusti kroz jastučić celita. Otopina se osuši, čime se dobije spoj IV u obliku smeđe krute tvari (90 mg, 95%). Ovaj spoj se koristi izravno u slijedećem koraku.
Spoj 228
U otopinu spoja IV (39 mg, 0.16 mmol), 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil]-2-furoil klorida (60 mg, 0.174 mmol) u DCM (1mL) se doda TEA (44 μL, 0.31 mmol). Reakcijska smjesa se miješa na sobnoj temp. preko noći. Flash kromatografijom (30% etil acetat/heksani) se dobije Spoj 228 (65 mg, 74%) u obliku bijele krute tvari. 1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 1.04 (m, 12H), 1.45 (m, 4H), 2.09 (s, 3H), 2.71 (s, 3H), 3.60 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.78 (s, 2H), 5.89 (d, 1H, J=3Hz), 6.17 (d, 1H, J=3Hz), 6.58 (d, 1H, J=3Hz), 6.85 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.96 (d, 1H, J=3Hz), 7.90 (s, 1H), 8.24 (s, 1H). APCI-MS m/z 556 (M+H)+.
Dodatni primjeri (NMR) nekih spojeva prikazani su u nastavku
Spoj 20
1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 1.26 (m, 12H), 1.66 (m, 4H), 2.28 (s, 3H), 3.82 (s, 6H), 3.96 (s, 2H), 6.04 (d, 1H, J=6Hz), 6.60 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 7.05 (m, 3H), 7.23 (t, 1H, J=6Hz), 7.44 (s, 1H). APCI-MS m/z 462 (M+H)+.
Spoj 126
1H NMR δ (300 Hz, DMSO) 2.20 (s, 3H), 2.27 (s, 6H), 3.71 (s, 6H), 3.98 (s, 2H), 5.93 (d, 1H, J=3Hz), 6.68 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.86 (d, 2H, J=3Hz), 7.10 (d, 1H, J=3Hz), 7.23 (t, 1H, J=7Hz), 9.04 (s, 1H). APCI-MS m/z 379 (M+H)+.
Spoj 140
1H NMR δ (300 Hz, DMSO) 2.28 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 3.72 (s, 6H), 4.10 (s, 2H), 6.00 (d, 1H, J=3Hz), 6.60 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.24 (t, 1H, J=6Hz), 9.04 (s, 1H). APCI-MS m/z 458 (M+H)+.
Spoj 211
1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 3.76-3.83 (m, 15H), 4.07 (s, 2H), 5.95 (d, 1H, J=3Hz), 6.60 (s, 1H), 6.57-6.62 (m, 3H), 6.78 (d, 1 H, J=9Hz), 7.03 (d, 1H, J=3Hz), 7.19 (t, 1 H, J=6Hz), 7.46 (s, 1H). APCI-MS m/z 428 (M+H)+.
Spoj 220
1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 3.72-3.77 (m, 15H), 3.90 (s, 2H), 5.78 (d, 1H, J=3Hz), 6.08 (s, 2H), 6.52-6.55 (m, 2H), 6.94 (d, 1H, J=9Hz), 7.12 (t, 1H, J=9Hz), 7.39 (s, 1H). APCI-MS m/z 428 (M+H)+.
Spoj 226
1H NMR δ (300 Hz, CD3OD) 2.33-2.48 (m, 12H), 3.84 (s, 6H), 4.19 (s, 2H), 5.81 (d, 1H, J=3Hz), 6.73 (d, 2H, J=9Hz), 7.06 (d, 1H, J=3Hz), 7.29 (t, 1H, J=9Hz). APCI-MS m/z 472 (M+H)+.
Spoj 231
1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 0.67 (t, 3H, J=6Hz), 1.27 (m, 6H), 1.70 (m, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.80-3.83 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 6.02 (d, 1H, J=3Hz), 6.60 (d, 2H, J=9Hz), 6.83 (d, 1H, J=3Hz), 7.07-7.19 (m, 4H), 7.43 (s, 1H). APCI-MS m/z 438 (M+H)+.
Spoj 232
1H NMR δ (300 Hz, CDCl3) 0.66 (t, 3H, J=6Hz), 1.23 (m, 6H), 1.54-1.62 (m, 2H), 3.80-3.81 (m, 12H), 4.01 (s, 2H), 6.00 (d, 1H, J=3Hz), 6.81 (d, 2H, J=9Hz), 6.82 (d, 1H, J=3Hz), 7.06-7.28 (m, 4H). APCI-MS m/z 468 (M+H)+.
Primjeri drugih spojeva koji sadrže aromatski dio
[image]
SInteza 5-(5-cikloheksil-2-metilbenzil)-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida.
Smjesi spoja 1 (5.0 g, 20.3 mmol) i metil furoata (3.5 g, 20.3 mmol) u 100 mL nitrometana se doda otopina AlCl3 (5.4 g, 40.6 mmol) u CH3NO2 (50 mL) na sobnoj temperaturi. Otopina se grije do 70 ~ 75°C preko noći. Tamnosmeđa smjesa se hladi na sobnu temperaturu i sporo ulije u 300 mL ledene vode. Smjesa se ekstrahira s etilacetatom. Koncentrirani organski sloj se pročisti kromatografijom na silika gelu i ispire s heksan/etil acetatom (15:1 do 9:1 vol/vol), čime se dobije 920 mg spoja 2, koji se potom hidrolizira i spoji s trimetoksianilinom prema općenitom postupku, čime se dobije spoj u dobrom prinosu. 1H NMR (CDCl3): σ 1.23-1.48 (m, 5H), 1.73-1.86 (m, 5H), 2.31 (s, 3H), 2.51 (m, 1H), 3.83 (s, 1H), 4.02 (s, 2H), 6.03 (s, 1H), 7.44 (s, 1H) MS (APCI): 464.2 (M+1)
[image]
Sinteza 5-(5-acetil-2,4-dimetilbenzil)-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
Smjesa spoja 3 (14 g, 94.4 mmol), metil furoata (16.4 g, 94.4 mmol) i AlCl3 (25 g, 189 mmol) u 200 mL nitrometana se miješa i grije na 80°C preko noći. Smjesa se obradi i pročisti na stupcu silika gela, ispire s heksan/etil acetatom (9:1 vol/vol), čime se dobije smjesa 4 i 5 (3:1, ukupno 16.2 g). Smjesa 4 i 5 (2.0 g) se hidrolizira u 2N NaOH/MeOH (1:1 vol/vol) na sobnoj temperaturi, čime se dobije smjesa 6 i 7, koja se rekristalizira u acetonu i heptanu, čime se dobije 6 (460 mg).
Spoj 6 (150 mg,.55 mmol) se izlaže tionil kloridu i veže s trimetoksi anilinom, čime se dobije AXC07485 (124 mg). 1H NMR (CDCl3): σ 2.31 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.54 (s, 3H), 3.80 (s, 9H), 4.02 (s, 2H), 6.00 (d, 1H), 6.16 (s, 2H), 7.08 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), MS (APCI): 438.7 (M+1)
Sinteza 5-(5-izopropenil-2,4-dimetilbenzil)-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
[image]
U otopinu spoja 6 (250 mg, .92 mmol) u 5 mL suhog THF na 0°C u N2 se doda metil litij (1.4M u heksanima, 3 eq.). Otopina se miješa na 0°C tijekom 3 sata, prekida s vodom i ekstrahira s etil acetatom. Organski sloj se suši preko magnezij sulfata i koncentrira pri smanjenom tlaku. Sirovi spoj se obradi s SOCI2 i spoji s trimetoksi anilinom, čime se dobije AXC 07499 (36 mg). 1H NMR (CDCl3): σ 1.80 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 3.59 (s, 9H), 3.75 (s, 2H), 4.60 (d, 1H), 4.95 (d, 1H), 5.81 (d, 1H), 5.95 (s, 2H), 6.71 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.89 (d, 1H), 7.18 (s, 1H). MS (APCI): 436.2 (M+1).
Sinteza 5-[(4,6-dimetil[1,1’-bifenil]-3-il)metil]-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
[image]
Friedal Crafts-ova reakcija spoja 9 (10 g, 57.3 mmol), metil furoata (12.7 g, 68.7 mmol) i AlCl3 (9.1 g, 68.7 mmol) se provede u nitrometanu na 80°C tijekom 2 sata. Otopina se ulije u 200 mL ledene vode i ekstrahira s etil acetatom. Organski sloj se koncentrira i pročisti na stupcu silika gela, ispire s heksan/etil acetatom (9:1 vol/vol), čime se dobije smjesa regioizomera 10 i 11 (15.5 g) u omjeru 2:1.
Smjesa se hidrolizira u 2N NaOH/MeOH (1:1 vol/vol), čime se dobije smjesa kiselinskih analoga.
Kisela smjesa (2.3 g, 7.4 mmol), benzen borna kiselina (1.1 g, 8.9 mmol), [P(Ph)3]4Pd i kalij karbonat (2N, 11 mL) u DMF (20 mL) se griju na 80°C preko noći. Nakon vodene obrade, ostatak se propusti kroz stupac silika gela i ispire smjesom otapala heksan/etil acetat/octena kiselina (7:3:1 vol/vol/vol), čime se dobije smjesa 2 regioizomera, koja se rekristalizira u heksanu i etil acetatu, čime se dobije 12 (610 mg). Spoj 12 se spaja s trimetoksianilinom uobičajenim postupkom, čime se dobije AXC07468 u dobrom prinosu. 1H NMR (CDCl3): σ 2.24 (d, 3H), 2.33 (d, 3H), 3.82 (s, 6H), 3.84 (s, 3H), 4.02 (s, 2H), 6.03 (d, 1H), 6.18 (s, 2H), 7.06 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 7.29-7.40 (m, 5H). MS (APCI): 472.1 (M+1).
Sinteza 5-[5-(2,2-dimetilpropanoil)-2,4-dimetoksibenzil]-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
[image]
Spoj 15 se pripravi u dva koraka Friedal Crafts-ovom reakcijom (vidi opći postupak) iz spoja 13 uz umjereni prinos, s dobrom regioselektivnošću. Spoj 15 se hidrolizira i spaja s trimetoksianilinom, čime se dobije spoj. 1H NMR (CDCl3): σ 1.18 (s, 9H), 3.79 (s, 3H), 3.81 (s, 6H), 3.85 (s, 6H), 3.93 (s, 2H), 6.03 (d, 1H), 6.15 (s, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.40 (s, 1H). Ms (APCI) 512.1 (M+1).
Sinteza 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)karbonil]-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida i 5-[hidroksi-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamida
[image]
Smjesa spoja 19 (9.0 g, 27.5 mmol) i MnO4 (8.2 g, 82.7 mmol) u smjesi otapala kloroforma i dikloroetana se grije do 70°C preko noći. Nakon obrade vodom, spoj 20 se pročisti na stupcu silika gela i ispire s heksan/etil acetat/octenom kiselinom (90:10:1 vol/vol/vol). AXC07042 se dobije općenitim postupkom za stvaranje amidne veze. 1H NMR (CDCl3): σ 1.26-1.31 (2s, 12H), 1.70 (s, 4H), 3.81 (s, 6H), 3.83 (s, 3H), 6.18 (s, 2H), 7.05 (d, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.29 (d, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.68 (s, 1H). MS (APCI): 506.2 (M+1).
Spoj (50 mg) se obradi s NaBH4, (1.5 eq) u etanolu (2 mL) i dietil eteru (0.5 mL). Otopina se miješa na sobnoj temperaturi 1.5 h, prekida s vodom i ekstrahira s etil acetatom. Organski sloj se koncentrira, čime se dobije spoj u obliku bijele krute tvari. 1H NMR (CDCl3): σ 1.24, 1.28, 1.29 (3s, 12H), 1.66, 1.67 (2s, 4H), 2.29 (s, 3H), 2.55 (d, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.82 (s, 3H), 5.98 (d, 1H), 6.17 (s, 2H), 7.08, 7.10 (2s, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.41 (s, 1H). MS (APCI): 508.2 (M+1).
Sinteza 5-(5-{1-[(etilamino)karbonil]ciklopropil}-2-metilbenzil)-N-(2,4,6-trimetoksifenil)-2-furamide
[image]
Otopina 22 (2.0 g, 11.3 mmol) u tionil kloridu (8 mL) se grije do refluksa tijekom 3 minute. Nereagirani tionil klorid se ukloni kružnim isparivačem. Koncentrirani ostatak se otopi u CH2Cl2. Ovoj se otopini doda etilamin (u suvišku), čime se dobije spoj 23 (1.3 g). Spoj se prevede u AXC07555 u 3 koraka (Friedal Crafts-ova reakcija, hidroliza i stvaranje amidne veze), kako je opisano u općenitim postupcima. 1H NMR (CDCl3): σ 0.94-1.02 (m, 5H), 1.59 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 3.17 (q, 2H), 3.80, 3.81 (2s, 9H), 4.01 (s, 2H), 5.39 (brd, 1H), 6.01 (d, 1H), 6.17 (9s, 2H), 7.11 (d, 1H), 7.21 (m, 2H), 7.31 (9s, 1H). MS (APCI): 493.2 (M+1).
Dodatni primjeri
[image]
Koristan međuspoj može se pripraviti na slijedeći način:
Priprava metil-5-(klorometil)-2-furoata
[image]
Potrebne tvari
[image]
Postupnik za količinu reda veličine 2.88 mol metil 5-(kloro-metil)-2-furoata (2)
- tikvica okruglog dna (o.d.) od 12 L s tri grla se opremi dodatnim lijevkom; miješalom s gornje strane; termoelementom; i ledenom kupkom. (preporučuje se dušikov pokrivač, ali nije nužno potreban)
- u o.d. se napuni 2.2 L DCM, potom 2.2 L konc. HCl (ne opaža se značajnija egzotermna reakcija; oblikuju se dva sloja)
- započne se miješanje (osigurati odgovarajuće miješanje obaju faza)
- napuni se 1.1 L H2SO4 u lijevak za dodavanje kako prostor dopušta; reaktor se ohladi na 0-10°C. Započne se dodavanje sulfatne kiseline na početku kap po kap, do jenjavanja egzotermne reakcije (približno 1/2 dodavanja) i zatim se brzina dodavanja ubrza na lagani mlaz. (uz održavanje temperature ispod 20°C iz sigurnosnih razloga)
- kupka za hlađenje se zamijeni vodom na sobnoj temperaturi (ovo će djelovati kao snižavanje temperature kod naknadnog dodavanja bez značajnijeg usporavanja brzine reakcije)
- 0.371 kg metil 2-furoata se odjednom napuni u o.d. (ne opaža se egzotermna reakcija, zelenosmeđa otopina)
- 0.520 kg ZnCl2 se puni u više dijelova (nešto razvijanja mjehurića - sumnja na plinoviti HCl; egzotermna reakcija kontrolira se vodenom kupkom)
- 0.371 L formaldehida se puni u ispirani dodatni lijevak; dodavanje u reaktor tijekom 2.5 - 3.5 h (temperatura se održava na razini sobne temperature vodenom kupkom ; polagano dodavanje dovodi do slabije reakcije polimerizacije između “slobodnog” formaldehida)
- miješa se preko noći na sobnoj temperaturi
- kada je reakcija dovršena prema TLC (vidi u nastavku) vodeni sloj se ispusti; organski sloj se filtrira kroz jastučić silike od 0.550 kg (suho pakiranje, pribl. debljina 10 cm); ispire se s približno 4 L DCM do prestanka daljnjeg izlaženja proizvoda, sindicirano pomoću TLC (osigurati provođenje ovog koraka uz odgovarajuću ventilaciju, jer je nešto para kiseline i dalje prisutno, čak i u filtratu)
- koncentrira se do dobivanja ulja čija je boja u rasponu od žute do smeđe (približno 0.5 L)
- napuni se jednaka količina DCM, oko 0.5 L; ispire se s 2 x 0.2 L destilirane vode; potom se ispire organski sloj, s 0.05 L zasić. NaHCO3 u 0.15 L destilirane vode (osigurati pH 7-10, bez značajnijih gubitaka proizvoda u vodenom sloju)
- vodeni sloj se ispusti, a organski se suši s Na2SO4; filtrira se kroz 0.05 kg silike (oko 5 cm debljine); ispire se s DCM do prestanka izlaženja daljnjeg proizvoda
- koncentrira se kružnim isparivačem pomoću kućnog vakuuma; potom se ulje stavi na crpku s visokim vakuumom preko noći (žuto do svjetlosmeđe ulje) raspon prinosa: 95-100% raspon čistoće: 95-98% (HPLC A%)
Daljnji komentari
Vizualni: nakon reakcije slijedi TLC (254 nm) pomoću 30% EtOAc/heksani (r.f. početne tvari - 0.52; r.f. proizvoda - 0.40)
HPLC: TFA postupak (postupak i pridruženi spektri). R.t. početne tvari = 12.67 min., r.t. proizvoda = 17.37 min.
NMR: 1H (CDCl3) (pridruženi spektri) 3.93 (s, 3H), 4.63 (s, 2H), 6.52 (d, 1H), 7.18 (d, 1H).
Ukoliko reakcija nije dovršena, 10% izvornog volumena formaldehida se može dodati svaka 4 sata. Učinci temperature nisu detaljnije proučavani, no prikladno je održati temperature u posudi u raponu specificiranom za svaki korak. Kiselinske pare prisutne u organskom sloju i nakon filtriranja čine rukovanje izvan digestora problematičnim; stoga, treba biti pažljiv prilikom prijenosa vari izvan digestora dok pH ne postane neutralan. Ako se brzina dodavanja formaldehida poveća, stvaranje polimera spriječit će dovršenje reakcije potrošnjom formaldehida. Prije početka ovog procesa treba obaviti dogovore s odjelom sigurnosti, tako da se mogu vršiti dogovori za osiguravanje smještaja većih volumena kiseline koja se otpušta u vodeni sloj. Neutralizacija vodenog kiselog sloja zahtijeva velik volumen baze, proizvodi značajnu egzotermnost i zahtijeva produljeno razdoblje dodavanja, pa se stoga ne preporučuje. Konačni proizvod se treba održavati hladnim, s obzirom da nisu dostupni podaci o stabilnosti ovog proizvoda. Držanje proizvoda u Nalgene spremniku na -20°C uzrokuje kristalizaciju proizvoda uz lagano tamnjenje tvari, no čini se kako nema učinka na kasnije reakcije s tom tvari.
Spojevi ovog izuma trebali bi biti korisni pri liječenju:
1. hormonski ovisnih karcinoma/tumora
2. hormonski neovisnih karcinoma/tumora izravnim međudjelovanjem
3. uporaba u drugim mehanizmima djelovanja
Vjeruje se kako ovaj izum prijavitelja uključuje mnoge druge oblike koji ovdje nisu specifično opisani, te se stoga ne smije shvatiti da je ovaj opis ograničen na prethodne primjere ili preporučene oblike.
Slijedeći su spojevi pripravljeni na način koji je ranije komentiran. Također su mjerena pojedina svojstva nekih spojeva, ranije korištenim tehnikama. S%R znači preostali supstrat. Što je S%R bliži nuli, bliža je 100%-tna inhibicija.
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
Ova tablica prikazuje bioraspoloživost spoja prema izumu. Svojstva su određena prethodno opisanim postupcima.
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
Slijedeći spojevi pripravljeni su i ispitani prethodno prikazanim postupcima. Podaci su u dva dijela, a prikazuju vezanje spoja na receptor.
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]

Claims (12)

1. Spoj, naznačen time, što ima formulu odabranu iz skupine koja se sastoji od: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
2. Spoj, naznačen time, što ima formulu odabranu iz skupine koja se sastoji od: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
3. Spoj, naznačen time, što ima formulu: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
4. Spoj, naznačen time, što ima formulu odabranu iz skupine koja se sastoji od: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
5. Spoj, naznačen time, što ima formulu: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
6. Spoj, naznačen time, što ima formulu odabranu iz skupine koja se sastoji od: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
7. Farmaceutski pripravak, naznačen time, što sadrži: terapijski učinkovitu količinu spoja, farmaceutski prihvatljivu sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit definiran kao u bilo kojem od zahtjeva 1-6; i farmaceutski prihvatljiv nosač ili sredstvo za razrjeđivanje.
8. Postupak za reguliranje izlučivanja gonadotropina u sisavaca, naznačen time, što obuhvaća primjenu terapijski učinkovite količine spoja, njegove farmaceutski prihvatljive soli, multimera, prolijeka ili aktivnog metabolita, definiranog kao u bilo kojem od zahtjeva 1-6.
9. Spoj Formule I, naznačen time, što: [image] X je odabran između C=O, C=S, S=O i S(O)2; [image] je peteročlani heterociklički prsten koji sadrži 1 do 4 heteroatoma odabranih između N, O i S, pri čemu prsten može biti zasićen, djelomično nezasićen ili potpuno nezasićen, a može biti i aromatski; R1 i R2 su neovisno odabrani između H i nižeg alkila; R3 je odabran između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila i heteroarila, pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R4 i R5 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R6 i R7 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; ili R6 i R7 zajedno s atomima na koje su vezani tvore neobavezno supstituirani 5- do 6-eročlani prsten koji neobavezno ima do četiri heteroatoma odabranih između O, N i S; pri čemu je najmanje jedan od R3, R4, R5, R6 i R7 različit od vodika; R8 je lipofilni dio odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 6 do 20; a R9 je odabran između H i supstituiranog i nesupstituiranog alkila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
10. Spoj Formule I, naznačen time, što: [image] X je odabran između C=O, C=S, S=O i S(O)2; [image] je peteročlani heterociklički prsten koji sadrži 1 do 4 heteroatoma odabranih između N, O i S, pri čemu prsten može biti zasićen, djelomično nezasićen ili potpuno nezasićen, a može biti i aromatski; R1 i R2 su neovisno odabrani između H i nižeg alkila; R3 je odabran između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila i heteroarila, pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R4 i R5 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R6 i R7 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; ili R6 i R7 zajedno s atomima na koje su vezani tvore neobavezno supstituirani 5- do 6-eročlani prsten koji neobavezno ima do četiri heteroatoma odabranih između O, N i S; pri čemu je najmanje jedan od R3, R4, R5, R6 i R7 različit od vodika; R8 je lipofilni dio odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 6 do 20; a R9 je odabran između H i supstituiranog i nesupstituiranog alkila; ili R1 ili R2 mogu biti -OH ili =O; i/ili R8 također može biti vodik; i/ili R može biti COR ili vodik; i/ili R8 može imati bilo koji željeni broj ugljikovih atoma; i/ili R8 i R9 mogu također tvoriti prsten; i/ili bilo koja susjedna R skupina, poput R5 i R6 ili R3 i R4 može tvoriti prsten, poput onoga koji je opisan za R6 i R7; i/ili R6 može biti COR; i/ili (het) skupina može biti supstituirana ili nesupstituirana; ili R8 i/ili R9 mogu biti odabrani između heterocikličkih skupina ili bilo kojeg spoja koji tvori amidnu vezu s dušikom Formule I; ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, multimer, prolijek ili aktivni metabolit.
11. Farmaceutski pripravak, naznačen time, što sadrži: (a) terapijski učinkovitu količinu spoja Formule I: [image] pri čemu je X odabran između C=O, C=S, S=O i S(O)2; [image] je peteročlani heterociklički prsten koji sadrži 1 do 4 heteroatoma odabranih između N, O i S, pri čemu prsten može biti zasićen, djelomično nezasićen ili potpuno nezasićen, a može biti i aromatski; R1 i R2 su neovisno odabrani između H i nižeg alkila; R3 je odabran između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, aril, heteroaril, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila i heteroarila, pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R4 i R5 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R6 i R7 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; ili R6 i R7 zajedno s atomima na koje su vezani tvore neobavezno supstituirani 5- do 6-eročlani prsten koji neobavezno ima do četiri heteroatoma odabranih između O, N i S; R8 je lipofilni dio odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 6 do 20; R9 je odabran između H i supstituiranog i nesupstituiranog alkila; ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, multimera, prolijeka ili aktivnog metabolita; i (b) farmaceutski prihvatljivi nosač ili sredstvo za razrjeđivanje.
12. Postupak za reguliranje izlučivanja gonadotropina u sisavaca, naznačen time, što obuhvaća primjenu na sisavca, kojemu je takva regulacija potrebna, terapijski učinkovite količine spoja Formule I: [image] pri čemu je X odabran između C=O, C=S, S=O i S(O)2; [image] je peteročlani heterociklički prsten koji sadrži 1 do 4 heteroatoma odabranih između N, O i S, pri čemu prsten može biti zasićen, djelomično nezasićen ili potpuno nezasićen, a može biti i aromatski; R1 i R2 su neovisno odabrani između H i nižeg alkila; R3 je odabran između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila i heteroarila, pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R4 i R5 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; R6 i R7 su neovisno odabrani između H, halogena, supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 1 do 12; ili R6 i R7 zajedno s atomima na koje su vezani tvore neobavezno supstituirani 5- do 6-eročlani prsten koji neobavezno ima do četiri heteroatoma odabranih između O, N i S; R8 je lipofilni dio odabran između supstituiranog i nesupstituiranog alkila, alkenila, alkinila, cikloalkila, heterocikla, arila, heteroarila, CH2OR, OR i C(O)OR, pri čemu je R definiran kao gore, i pri čemu je ukupni broj prisutnih ugljikovih atoma (ne uključujući niti jedan neobavezni supstituent) u rasponu od 6 do 20; R9 je odabran između H i supstituiranog i nesupstituiranog alkila; ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, multimera, prolijeka ili aktivnog metabolita.
HR20010206A 1998-08-20 2001-03-20 NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION HRP20010206A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9752098P 1998-08-20 1998-08-20
PCT/US1999/018790 WO2000020358A2 (en) 1998-08-20 1999-08-20 NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20010206A2 true HRP20010206A2 (en) 2004-02-29

Family

ID=22263796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20010206A HRP20010206A2 (en) 1998-08-20 2001-03-20 NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION

Country Status (33)

Country Link
EP (1) EP1105120B1 (hr)
JP (1) JP2002535244A (hr)
KR (1) KR20010085402A (hr)
CN (1) CN1379666A (hr)
AP (1) AP2001002053A0 (hr)
AT (1) ATE291423T1 (hr)
AU (1) AU759310B2 (hr)
BG (1) BG105362A (hr)
BR (1) BR9913374A (hr)
CA (1) CA2341346A1 (hr)
CZ (1) CZ2001523A3 (hr)
DE (1) DE69924387D1 (hr)
EA (1) EA200100255A1 (hr)
EE (1) EE200100102A (hr)
ES (1) ES2237966T3 (hr)
GE (1) GEP20043315B (hr)
HR (1) HRP20010206A2 (hr)
HU (1) HUP0103622A3 (hr)
ID (1) ID29244A (hr)
IL (1) IL141396A0 (hr)
IS (1) IS5846A (hr)
LT (1) LT4904B (hr)
LV (1) LV12732B (hr)
NO (1) NO20010309L (hr)
NZ (1) NZ509252A (hr)
OA (1) OA11599A (hr)
PL (1) PL356984A1 (hr)
SI (1) SI20746A (hr)
SK (1) SK2262001A3 (hr)
TR (1) TR200100631T2 (hr)
WO (1) WO2000020358A2 (hr)
YU (1) YU13701A (hr)
ZA (1) ZA200100831B (hr)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0983992B1 (en) * 1992-04-22 2005-10-26 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Compounds having selectivity for retinoid x receptors
CA2368047A1 (en) * 1999-03-24 2000-09-28 Anormed Inc. Chemokine receptor binding heterocyclic compounds
AR024158A1 (es) * 1999-06-01 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp Compuestos antibacterianos
TWI243164B (en) 2001-02-13 2005-11-11 Aventis Pharma Gmbh Acylated indanyl amines and their use as pharmaceuticals
AU2002312348A1 (en) * 2001-06-06 2002-12-16 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Non-peptide gnrh agents, pharmaceutical compositions and methods for their uses, and processes for preparing them
PT1401825E (pt) 2001-06-11 2009-10-23 Virochem Pharma Inc Compostos e métodos para o tratamento ou para a prevenção de infecções com flavivírus
US7132438B2 (en) 2001-10-09 2006-11-07 Amgen Inc. Benzimidazole derivatives
GB0126292D0 (en) * 2001-11-01 2002-01-02 Smithkline Beecham Plc Compounds
JP2005170790A (ja) * 2002-01-09 2005-06-30 Ajinomoto Co Inc Ｎ−アルキルスルフォニル置換アミド誘導体
US6521395B1 (en) * 2002-01-30 2003-02-18 Eastman Kodak Company Infrared couplers for incorporating and recovering metadata
WO2003068769A1 (en) * 2002-02-12 2003-08-21 Pfizer Inc. Non-peptide compounds affecting the action of gonadotropin-releasing hormone (gnrh)
TW200304820A (en) * 2002-03-25 2003-10-16 Avanir Pharmaceuticals Use of benzimidazole analogs in the treatment of cell proliferation
MXPA04012566A (es) * 2002-06-13 2005-04-19 Pfizer Agentes no peptidicos reguladores de la gnrh, composiciones farmaceuticas y procedimientos para su uso.
JP2006510725A (ja) * 2002-11-20 2006-03-30 パラダイム・セラピューティクス・リミテッド 複素環式ケイ素化合物、ならびにＧｎＲＨ（ゴナドトロピン放出ホルモン）と関係のある疾患または状態の治療におけるその使用
CN101475528A (zh) * 2003-03-31 2009-07-08 大正制药株式会社 新的喹啉、四氢喹唑啉和嘧啶衍生物以及与其应用有关的治疗方法
EP1464335A3 (en) * 2003-03-31 2007-05-09 Taisho Pharmaceutical Co. Ltd. Quinoline, tetrahydroquinoline and pyrimidine derivatives as mch antagonist
US7427683B2 (en) * 2003-04-25 2008-09-23 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. c-fms kinase inhibitors
CA2536964A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. C-fms kinase inhibitors
EP1628661A2 (en) * 2003-06-05 2006-03-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modulators of vr1 receptor
DK1648906T3 (da) * 2003-07-09 2008-02-04 Takeda Cambridge Ltd Organo-silicium-forbindelser og deres anvendelse
US7407649B2 (en) 2003-07-10 2008-08-05 Paradigm Therapeutics Ltd Silicon compounds and their use
WO2005039564A1 (en) * 2003-10-02 2005-05-06 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Phthalimide compounds useful as protein kinase inhibitors
US20090291915A1 (en) * 2004-12-17 2009-11-26 Graham Andrew Showell Silicon Compounds and Their Use
CN101218224B (zh) 2005-05-13 2013-05-08 Viro化学制药公司 治疗或预防黄病毒感染的组合物和方法
US8193206B2 (en) 2005-06-14 2012-06-05 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Pyrimidine compounds
NZ564222A (en) 2005-06-14 2011-10-28 Taigen Biotechnology Co Ltd Pyrimidine compounds
CA2613162A1 (en) * 2005-06-28 2007-01-04 Takeda Cambridge Limited Heterocyclic non-peptide gnrh antagonists
DK1910384T3 (da) * 2005-08-04 2012-12-17 Sirtris Pharmaceuticals Inc Imidazo [2,1-b] thiazol-derivater som sirtuinmodulerende forbindelser
CN101437519A (zh) 2006-03-31 2009-05-20 艾博特公司 吲唑化合物
WO2007131996A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 Genmedica Therapeutics Sl Meta-xylylenediamine vanadate salts
CL2008001822A1 (es) 2007-06-20 2009-03-13 Sirtris Pharmaceuticals Inc Compuestos derivados de tiazolo[5,4-b]piridina; composicion farmaceutica que comprende a dichos compuestos; y uso del compuesto en el tratamiento de la resistencia a la insulina, sindrome metabolico, diabetes, entre otras.
NZ584475A (en) * 2007-10-11 2012-07-27 Vertex Pharma Heteroaryl amides useful as inhibitors of voltage-gated sodium channels
CN101888991A (zh) 2007-10-31 2010-11-17 财团法人乙卯研究所 类视色素前体药物化合物
EA019289B1 (ru) 2008-04-21 2014-02-28 Тайджен Байотекнолоджи Ко., Лтд. Производные аминопиридина, аминопиримидина и амино-1,3,5-триазина
UY31984A (es) * 2008-07-16 2010-02-26 Boehringer Ingelheim Int DERIVADOS DE 1-(3,4-difluorobencil)-6-oxo-1,6-dihidropirimidin-5-carboxamidas N-sustituidas y de 2-(3,4-difluorobencil)-3-oxo-2,3-dihidro-1H-pirazol-4-carboxamidas N-sustituidas.
TW201021855A (en) 2008-11-13 2010-06-16 Taigen Biotechnology Co Ltd Lyophilization formulation
WO2012018668A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Amgen Inc. Benzimidazole and azabenzimidazole compounds that inhibit anaplastic lymphoma kinase
CN102050823A (zh) * 2010-10-27 2011-05-11 华东理工大学 新型光稳定剂-鸟嘌呤类似物的合成及表征
WO2012112567A1 (en) * 2011-02-15 2012-08-23 Georgetown University Small molecule inhibitors of agbl2
CA2836311A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Bionomics Limited Amine derivatives as potassium channel blockers
CN103827097B (zh) * 2011-07-26 2016-03-16 赛诺菲 3-杂芳酰基氨基-丙酸衍生物及其作为药物的用途
WO2013067578A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 The University Of Queensland Modulators of c3a receptors
AU2013333657B2 (en) * 2012-10-17 2018-04-26 Exonate Limited Compounds useful for treating ocular neovasculan
GB201300304D0 (en) * 2013-01-08 2013-02-20 Kalvista Pharmaceuticals Ltd Benzylamine derivatives
WO2017070235A1 (en) * 2015-10-19 2017-04-27 Attenua, Inc. Antitussive compositions and methods
EP3679027A1 (en) 2017-09-04 2020-07-15 C4 Therapeutics, Inc. Dihydrobenzimidazolones
EP3935050A4 (en) 2019-03-06 2023-01-04 C4 Therapeutics, Inc. HETEROCYCLIC COMPOUNDS FOR MEDICAL TREATMENT

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3499002A (en) * 1968-06-20 1970-03-03 Robins Co Inc A H 1-carbamoyl-3-aroylpyrrolidines
NL6913261A (hr) * 1968-09-09 1970-03-11
US3932444A (en) * 1972-04-28 1976-01-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. 4-Imidazolylsulfonylimidazoles
US4013647A (en) * 1976-03-23 1977-03-22 American Home Products Corporation Morpholine containing tetrazole-5-carboxamide derivatives
GB1491776A (en) * 1976-09-08 1977-11-16 Pfizer Ltd Thiadiazoles
US4096153A (en) * 1977-01-21 1978-06-20 American Home Products Corporation Arylene-bis-tetrazole-5-carboxamides
US5236928A (en) * 1991-03-19 1993-08-17 Merck & Co., Inc. Imidazole derivatives bearing acidic functional groups at the 5-position, their compositions and methods of use as angiotensin II antagonists
JPH06509075A (ja) 1991-07-01 1994-10-13 ユニヴァーシティ　テクノロジーズ　インターナショナル　インコーポレイテッド ＧｎＲＨ及び他の生物学的に活性なリガンドの非感度低下性類縁体
WO1993013083A1 (en) * 1991-12-31 1993-07-08 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Oxadiazole derivatives having acetylcholinesterase-inhibitory and muscarinic agonist activity
ATE243204T1 (de) * 1995-08-24 2003-07-15 Basf Ag Isoxazole- und isothiazole-5-carboxamid derivate, deren herstellung und deren verwendung als herbizide
JP3092946B2 (ja) * 1995-12-14 2000-09-25 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド ゴナドトロピン放出ホルモン拮抗剤
CA2254769A1 (en) * 1996-05-20 1997-11-27 Merck & Co., Inc. Antagonists of gonadotropin releasing hormone
US5878393A (en) * 1996-09-09 1999-03-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. High quality concatenative reading system

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000020358B1 (en) 2001-01-04
DE69924387D1 (de) 2005-04-28
WO2000020358A3 (en) 2000-11-16
LV12732A (en) 2001-10-20
EP1105120B1 (en) 2005-03-23
ATE291423T1 (de) 2005-04-15
NZ509252A (en) 2004-05-28
LV12732B (en) 2002-03-20
ES2237966T3 (es) 2005-08-01
IL141396A0 (en) 2002-03-10
HUP0103622A2 (hu) 2002-04-29
EA200100255A1 (ru) 2002-02-28
NO20010309D0 (no) 2001-01-19
YU13701A (sh) 2005-06-10
ID29244A (id) 2001-08-16
LT4904B (lt) 2002-04-25
SK2262001A3 (en) 2002-12-03
JP2002535244A (ja) 2002-10-22
GEP20043315B (en) 2004-02-10
BR9913374A (pt) 2001-05-15
AU759310B2 (en) 2003-04-10
CN1379666A (zh) 2002-11-13
EE200100102A (et) 2002-06-17
CA2341346A1 (en) 2000-04-13
NO20010309L (no) 2001-04-11
BG105362A (en) 2001-12-31
KR20010085402A (ko) 2001-09-07
TR200100631T2 (tr) 2002-08-21
CZ2001523A3 (cs) 2002-05-15
AP2001002053A0 (en) 2001-03-31
SI20746A (sl) 2002-06-30
LT2001024A (en) 2001-11-26
ZA200100831B (en) 2002-08-22
IS5846A (is) 2001-02-16
WO2000020358A2 (en) 2000-04-13
HUP0103622A3 (en) 2003-01-28
PL356984A1 (en) 2004-07-12
EP1105120A4 (en) 2001-12-19
OA11599A (en) 2004-08-23
AU2470900A (en) 2000-04-26
EP1105120A2 (en) 2001-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20010206A2 (en) NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION
US7101878B1 (en) Non-peptide GNRH agents, methods and intermediates for their preparation
JP5376956B2 (ja) デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療
CN100368411C (zh) 作为c-Jun N-末端激酶抑制剂用于治疗神经变性疾病的7-氮杂吲哚类化合物
US6218426B1 (en) Non-peptide GnRH agents
US6833372B2 (en) Non-peptide GnRH agents, Pharmaceutical compositions, and methods for their use
US20050250846A1 (en) Non-peptide GnRH agents, pharmaceutical compositions and methods for their use
JP5897566B2 (ja) 環式ｎ，ｎ’−ジアリールチオ尿素及びｎ，ｎ’−ジアリール尿素−アンドロゲン受容体アンタゴニスト、抗癌剤、その調製のための方法及び使用
ZA200101626B (en) Adenosine A3 receptor modulators.
US6358964B1 (en) Adenosine, A3 receptor modulators
US20040010033A1 (en) Non-peptide GnRH agents, methods and intermediates for their preparation
WO2021063347A1 (zh) 化合物及其制备方法和用途
US20150307548A1 (en) Fpr1 antagonist derivatives and use thereof
MXPA01001834A (en) NON-PEPTIDE GnRH AGENTS, METHODS AND INTERMEDIATES FOR THEIR PREPARATION
MXPA00008537A (en) NON-PEPTIDE GnRH AGENTS

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
ODBC Application rejected