SE443088B - Forfarande for framstellning av sekretin genom extraktion av tunntarm - Google Patents

Description

7801535-1 Man använder företrädesvis den övre delen av tunntarmen, inklusive tolvfingertarmen, från svin eller nötkreatur, eftersom denna del är lättillgänglig och innehåller hög halt av sekretín.

Saltet i den använda vattenlösningen kan t ex vara natriumkloríd, kaliumklorid, kalciumacetat, kalciumklorid och magnesíumacetat. Man föredrager särskilt att använda natriumklo- rid.

Upphettningen av tunntarmen genomföres under sådana be- tingelser, att enzymerna i tunntarmen inaktiveras. Om upphett- ningstemperaturen är ca 90-TOOOC, erhålles erforderliga resultat när upphettningen genomföres under 5-10 minuter.

Sedan tunntarmen har behandlats med en varm vattenlös- ning innehållande ett salt, kan tunntarmen användas omedelbart såsom utgångsmaterial för extraktion av sekretin. Eventuellt kan tunntarmen förvaras i ett kylrum utan att nämnvärd sänkning av hormonhalten äger rum.

För rening av sekretínet kan man använda olika konventio- nella metoder. Sekretinet kan extraheras och renas genom en lämp- lig kombination av de nedan angivna metoderna. Hormonet kan ex- traheras med etanol, metanol, isopropanol, utspädd saltsyra eller utspädd ättiksyra och sedan adsorberas på ett adsorberande ma- terial, såsom karboximetylcellulosa, trietylaminoetylcellulosa eller QAE-Sephadexè . Hormonet kan renas effektivt antingen ge- nom ett fraktioneringsförfarande med användning av ett organiskt lösningsmedel såsom aceton eller genom ett gelfiltreringsförfa- rande. Utvinningen av sekretinet ur det använda lösningsmedlet sker med hjälp av utsaltning med användning av natriumklorid eller ammoniumsulfat.

Vid förfarandet enligt uppfinningen förhindras enzyma- tisk sönderdelníng av sekretinet. Vidare är förlusterna av sekre- .tin i en vattenlösníng av natriumklorid mycket mindre än sekre- tinförlusten i rent vatten. Enligt uppfinningen kan man sålunda i höga utbyten utvinna sekretín från matsmältningskanalen hos däggdjur. -_ _A»PGQ%P=.QÉEÅL1TY 7801535-1 Uppfinníngen illustreras genom följande exempel. hxempel l.

Till 49 1 av en kokande vattenlösning innehållande 0,9 É na- triumklorid sattes 10 kg av den övre delen av tunntarmar från ca 100 svin (man använde ca 2 m av den del av tunntarmen som är belägen när- mast magporten). Tunntarmsstyckena uppsamlades så snabbt som möjligt efter slakten, och de kokades i natriumkloridlösningen under 5 minu- ter. De kokade tunntarmsstyckena uppsamlades i en metalltràdskorg och tvättades med tillräckligt med varmt vatten för att fettet skulle av- lägsnas. De resulterande tunntarmsstyckena finhackades, och det er- hållna materialet hälldes i 40 l av en O,lN ättiksyralösning, vilken i förväg hade värmts till en temperatur av 90-9500. Man omrörde bland- ningen vid samma temperatur under 10 minuter för att fullständig ex- traktion av de gastrointestinala hormonerna skulle äga rum. Blandningen fick därefter svalna till rumstemperatur, varpå den hölls över natten vid 4%. Till blandningen sattes därefter 1+oo g celite, een de fasta ämnena avskildes genom filtrering med användning av filterpapper. De fasta ämnena tvättades med 3 l av en O,lN ättiksyralösning, och tvätt- lösningen förenades med filtratet. Till den resulterande svagt orange- gula genomskinliga lösningen sattes 1,2 kg (torrvikt = 400g) karboxi- metylcellulosa, som i förväg hade aktiverats. Den resulterande bland- ningen omrördes under 30 minuter vid rumstemperatur, varefter den fick stå vid 400. över natten. Karboximetylcellulosan avskildes genom fil- trering, tvättades med 3 l kallt vatten och suspenderades i 5 l O,lN saltsyra. Den härvid erhållna blandningen omrördesvflirumstemperatur under 30 minuter så att de adsorberade substanserna eluerades från karboximetylcellulosan. Karboximetylcellulosan avskildes därefter genom sugfiltrering och tvättades med l liter O,lN saltsyra. Tvättlös- ningen förenades med filtratet, och till den resulterande lösningen sattes 0,1 kg natriumklcrid. Blandningen omrördes vid rumstemperatur PooR QUALITY ”Yöüläšå-*l 4 under 2 timmar och fick sedan stå vid 400 över natten. Den bildade fällningen avskildes genom filtrering och löstes på nytt i 2 liter destillerat vatten. De olösliga ämnena avlägsnades genom filtrering.

I filtratet löstes 600 g natriumklorid, varpå lösningen fick stå vid 400 över natten. Den bildade fällningen avskildes genom filtrering, varpå den erhållna svagt gulaktiga filterkakan löstes i vatten och lyofiliserades. Den biologiska aktiviteten (mätt i enheter enligt Crick, Harper och Raper eller i Ivy Dog-enheter) av de orena gastro- intestinala hormonerna, nämligen sekretin och cholecystokinin-pankreo- zymin, bestämdes enligt de metoder som beskrives i J. Physiol., 110, p. 396, 1950 resp. J. Physiol., 95, p. 55, 1930.

Vid det ovan beskrivna försöket upphettades tunntarmen under 5 minu- ter i en 0,9 ßig vattenlösning av natriumklorid. Man genomförde även ett antal liknande försök, varvid man varierade typen av salt, saltkon- centrationen och upphettningstiden.

För Jämförelse upphettades tunntarm i kokande vatten, varefter de följande stegen genomfördes på samma sätt som har beskrivits ovan (kontroll l). Vid ett ytterligare jämförande försök finhackades tunn- tarm direkt och extraherades med varm ättiksyra, varefter de följande stegen genomfördes på samma sätt som har beskrivits ovan (kontroll 2).

De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 1. 7801535-1 Gfläwn nomnxflmmflflcflxoumæomaoflo >m umufi>fiux< #9.. x *J m6 i: :A 1 I 4oHxm.@ wofl x n“H m.o #oHU~o.: | | :oHxw.w 5 äofl x m.m o.H #Q~xm.w .. - _23 wwá | - »oflfiflš :ofl x æ.H m.o $oHu~o.> :aa w n.m >.o àofl xfl.~ Anmumflflmq flws nwuwnflm um» hm nmßfl>Hp&m Hßuofi |H>%uxm xfihfiommm N vwM%fiM& :Ed HNQOB Gfiumhxww >d vmvH>flp&< må mdw m; 3% må ämm Éw »Jm m.m mqzm o.m n~mH oqm ø~mm o~N oqmfi wâ mån \nwpmncwv vmvH>fivxm Sfimwommm ~mw muhnud lcosnom H Hflwnmß N Hfiofipcox OH nwunm> mwcæxox m um»»m> møcmxox a flflomunom m umuwomëßflmwcwms R>~o m uwumomšnflämx Ræ.o OA Uflfiøfiäëflflflmfi RmH~H Ofl : = &m~O m = : Rw~H m Uflhoflflëßflhußfl Rmqo EU flflfiflfih .D ß HHGm nwusflfiä Ufluxow c«nwmHcwuum> >m H nwmawwflfiuwnmfloflpxmmßww PÛOR QUALITY 78015354 Av försöksresultaten i tabell 1 framgår, att man vid för- farandet enligt uppfinningen erhåller mycket bättre aktivitetsutby~ ten av sekretin än vid de förut kända förfarandena. Vid försöken enligt uppfinningen erhålles sekretin med mycket hög specifik aktivitet.

Exemgel 2.

Till HO liter av en kokande vattenlösning innehållande 0,9% natriumklorid sattes 10 kg av den övre delen av färska tunntarmar från ca 100 svin (man använde ca 2 meter av den del av tunntarmen som är be- lägen närmast magporten). Tunntarmarna uppsamlades så snart som möjligt efter slakten av svinen, och tunntarmsstyckena kokades i natriumklorid- lösningen under 5 minuter. De kokade tunntarmsstyckena uppsamlades i en metalltràdskorg och tvättades med varmt vatten för avlägsnande av fett. Tunntarmsstyckena finhackades därefter, och den erhållna massan hälldes i 40 l av en 0,lN ättiksyralösning, som i förväg hade upphettats till 90-9500. Man omrörde blandningen vid samma temperatur under 10 mi- nuter för åstadkommande av fullständig extraktion av de gastrointestina- la hormonerna. Blandningen fick därefter svalna till rumstemperatur, varpå den fick stå över natten vid 400. Till blandningen sattes sedan #00 g Celite, och de fasta ämnena avskildes genom filtrering med an- vändning av filterpapper. De fasta ämnena tvättades med 3 liter 0,lN ättiksyralösning, och tvättlösningarna förenades med filtratet. Till den resulterande svagt orangegula, genomskinliga lösningen sattes 1,2 kg (torrvikt = 400 g) karboximetylcellulosa, som hade aktiverats iförväg.

Den resulterande blandningen omrördes under 30 minuter vid rumstempera- tur och fick sedan stå vid 400 över natten. Karboximetylcellulosan av- skildes sedan genom filtrering, tvättades med 3 liter kallt vatten och suspenderades i 5 liter 0,lN saltsyra. Den erhållna suspensionen om- rördes vid rumstemperatur under 30 minuter för att de adsorberade sub- stanserna skulle elueras från karboximetylcellulosan. Karboximetyl- cellulosan avskildes därefter genom sugfiltrering och tvättades med l liter O,lN saltsyra. Tvättlösningen förenades med filtratet, och till den därvid erhållna lösningen sattes 0,8 kg natriumklorid. Den er- hållna blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar och fick sedan stå vid 4°C över natten. Den bildade fällningen avskildes genom filtrering och löstes sedan i 2 liter destillerat vatten. De olösliga substanserna avlägsnades genom filtrering. Till filtratet sattes 600 g natriumklorid, och den erhållna lösningen fick stå vid 400 över natten.

Den härvid bildade fällningen avskildes genom filtrering, och den er- hållna svagt gulaktiga filterkakan löstes i 130 ml destillerat vatten, 7801535-1 7 varefter den resulterande lösningen pH-värde inställdes på 3,0 med lN natriumhydroxidlösning. Man satte därefter 2 liter isopropanol till lösningen, och den erhållna blandningen omrördes vid 30-3500 under 2 timmar för extraktion av sekretin. Därefter tillsattes 20 g Celite, och de olösliga substanserna avskildes genom sugfiltrering. De olös- ligs substanserna suspenderades i 2 liter metanol, och den resulterande suspensionen omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar för att full- ständig extraktion skulle äga rum. De olösliga fasta ämnena avlägsna- des därefter genom sugfiltrering, och filtratet förenades med isopropa- nolskiktet. Den härvid erhållna blandningen indunstades under förminskat tryck vid en temperatur av 5000. återstoden löstes i 300 ml destillerat vatten, och lösningens pH-värde inställdes på 7,0 genom tillsättning av lN natriumhydroxidlösning. Den utfällda olösliga substansen avlägsna- des genom filtrering med hjälp av filterpapper, och filtratets pH-värde inställdes på 3,0 genom tillsättning av 2N saltsyra. Man åstadkom där- Aefter utsaltning genom tillsättning av l0O g natriumklorid till den to- tala volymen lösning (330 ml). Blandningen fick stå vid 400 över natten, varefter den bildade fällningen avskildes genom sugfiltrering. Man lös- te därefter fällningen i 50 ml destillerat vatten och lyofiliserade lösningen. Det sålunda erhållna sekretinets biologiska aktivitet be- stämdes på samma sätt som beskrivits i exempel 1.

Vid det ovan beskrivna försöket kokades tunntarmstycken under 5 minuter i en 0,97-ig vattenlösning av natriumklorid. Man genomförde dessutom ett antal liknande försök enligt uppfinningen, varvid man va- rierade typen av salt, saltkoncentrationen och upphettningstiden. vid ett jämförande försök upphettades tunntarm i kokande vat- ten, varefter de följande stegen genomfördes på samma sätt som har be- skrivits ovan(kontroll l). Vid ett annat jämförande försök finhackades tunntarm direkt och extraherades med varm ättiksyra, varefter de följ- ande stegen genomfördes på samma sätt som har beskrivits ovan (kontroll 2). De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 2.

POOR QUALITY 7801535-1 OA X « __ w H Fä mmoæ _ N Hflonuflmz OH X Fqm a o.mH omo.m m nmupmš wøumxox roa x @.n o.om am _ ..fi Hflomuøoz A . roa N m~n øqom m w. m uflvwoßëßwmmflwmë &>~O i: x ïm _ ww H m ___ S N i o .å Små __ _. .ÉHÅ 1 4 flqom ~ m = 2w~fl :OH N On: MQ Nwfi N m = B 3 mïñm m __ __ _. “_36 Ufifiøfixëäflävwfl &®«O w ä .SÉFH s p .Em uw»H>flpxm Hmpoæ uwufl>H%xfi\nwuuscmv ßwv . . flfiufiowmm maänßäflfiumnxwm NMMWMWMÉM øfluxox mcflcmmflnmppm> >æ aha. nwmfiwwnfiuwnmfloflvxmnuxm m Hflwßmß

Claims (5)

7801535-1 Av försöksresultaten i tabell 2 framgår, att försöken en- ligt uppfinningen gav en mycket högre total sekretinaktivitet och en mycket högre specifik sekretinaktivitet än jämförelseförsöken. P a t e n t k r a v

1. Förfarande för framställning av sekretin, k ä n n e - t e c k n a t a v att tunntarm från däggdjur upphettas under 5-10 minuter vid 90-100OC i en vattenlösning innehållande 0,5- 5 vikt-% av ett tillsatt salt, som är ett alkalimetallsalt av en oorganisk eller organisk syra eller ett jordalkalimetallsalt av en oorganisk eller organisk syra, varefter sekretinet extraheras och renas på i och för sig känt sätt.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att det använda saltet är natriumklorid, kaliumklorid, kalcium- acetat, kalciumklorid eller magnesiumacetat.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att det använda saltet är natriumklorid.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att man använder tunntarm från svin.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att man använder tunntarm frän nötkreatur. PÛOR QUALITY