JPS5815946A - 新規ヘプタデカペプタイド - Google Patents
新規ヘプタデカペプタイドInfo
- Publication number
- JPS5815946A JPS5815946A JP56112950A JP11295081A JPS5815946A JP S5815946 A JPS5815946 A JP S5815946A JP 56112950 A JP56112950 A JP 56112950A JP 11295081 A JP11295081 A JP 11295081A JP S5815946 A JPS5815946 A JP S5815946A
- Authority
- JP
- Japan
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- morphine
- heptadecapeptide
- column
- substance
- amino acid
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/675—Beta-endorphins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は鎮痛作用を有する新規なヘフタテ力ベブタイド
に関する。さらに詳しくは、フタ十二指腸より得られる
ｖａ＠ｏａｃｔｉｖ １ｎｔｓｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔ
ｉｄｅ（ＶＩＰと略記）分剰中に存在し１モルヒネ様活
性を有するヘブタテカペブタイドに関する。
に関する。さらに詳しくは、フタ十二指腸より得られる
ｖａ＠ｏａｃｔｉｖ １ｎｔｓｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔ
ｉｄｅ（ＶＩＰと略記）分剰中に存在し１モルヒネ様活
性を有するヘブタテカペブタイドに関する。
本発明者はかねてより、ブタ十二指腸を原料としてセク
レチン、コレシストキニンパンクレオザイミン、バソア
ク千ブづンテスチナルペグタイド等の消化管ホルモンの
抽出精製およびこれらの利用について検討をおこなって
来たが、たまたまＶＩＰ分劃中側モルヒネ様活性を有す
る物質の存在することを知った。そこでさらに該物質を
抽出精製し１分析をおこなったところ、該物質は新規な
一次構造式によって示されるペグタイドでありかつモル
ヒネに比較して数ｄ倍の強さのモルヒネ様活性を有する
ものであることを知るに至り９本発明を完成した。
レチン、コレシストキニンパンクレオザイミン、バソア
ク千ブづンテスチナルペグタイド等の消化管ホルモンの
抽出精製およびこれらの利用について検討をおこなって
来たが、たまたまＶＩＰ分劃中側モルヒネ様活性を有す
る物質の存在することを知った。そこでさらに該物質を
抽出精製し１分析をおこなったところ、該物質は新規な
一次構造式によって示されるペグタイドでありかつモル
ヒネに比較して数ｄ倍の強さのモルヒネ様活性を有する
ものであることを知るに至り９本発明を完成した。
そもそも、内因性モルヒネ様物質としてエンケファリン
およびエンドルフィンが脳内に存在しており、痛覚をは
じめ種々の生体感覚や精神作用を調節していると考えら
れている。エンケフーリ７にはメチオニンエンケファリ
ンとロイン／エンケファリンの２穫類のペンタペプタイ
ドがあり１両者は別々の生理作用を示すものと考えらｔ
シて〜・る。
およびエンドルフィンが脳内に存在しており、痛覚をは
じめ種々の生体感覚や精神作用を調節していると考えら
れている。エンケフーリ７にはメチオニンエンケファリ
ンとロイン／エンケファリンの２穫類のペンタペプタイ
ドがあり１両者は別々の生理作用を示すものと考えらｔ
シて〜・る。
また、エンドルフィンにはα、μ、γ、δ等の類似体か
あることが知られており、３１個のアミノ酸ハ・らなる
β−エンドルフィンが最も強い鎮痛作用を下すと言われ
巧いる。以下に下す文献はエンドルフィンに関する従来
知見を総説しまたものであり参考のために列挙する。
あることが知られており、３１個のアミノ酸ハ・らなる
β−エンドルフィンが最も強い鎮痛作用を下すと言われ
巧いる。以下に下す文献はエンドルフィンに関する従来
知見を総説しまたものであり参考のために列挙する。
んＢｅａｕｍｎｎｔ、 Ｊ、Ｈｕｇｈｅｓ ： Ａｎｎ
、 Ｒｅｖ、 Ｐｂａｒｍａｃｏｌ。
、 Ｒｅｖ、 Ｐｂａｒｍａｃｏｌ。
Ｔｏｘｉｃｏｌ、 １９２４５ （１９７９）屋山カ
ニ診断と治療６８ ８２５ （１９８０）蛋白質、核酸
、酵素２６２号（１９８１） オヒ万イドペグチド特
集号 さて、最近内因性モルヒネ様物質は脳内だけではなく、
身体の他の部位にも存在することが示唆されるようにな
り、ｌＩ実、副腎髄質からはエンケファリンの前駆体と
考えら第１る一１玉のベブタイドが単離されるに至った
。腸管にお（・でも同様に従来から螢光抗体法、ラジオ
イムノアッセイ法等の免疫学的り法およびインビトロの
生物検定法によりモルヒネ様物質の存在は示唆されてい
たうしかし、その抽出精製法、物質の構造、薬理活性等
の詳細についてはまったく知られていない。
ニ診断と治療６８ ８２５ （１９８０）蛋白質、核酸
、酵素２６２号（１９８１） オヒ万イドペグチド特
集号 さて、最近内因性モルヒネ様物質は脳内だけではなく、
身体の他の部位にも存在することが示唆されるようにな
り、ｌＩ実、副腎髄質からはエンケファリンの前駆体と
考えら第１る一１玉のベブタイドが単離されるに至った
。腸管にお（・でも同様に従来から螢光抗体法、ラジオ
イムノアッセイ法等の免疫学的り法およびインビトロの
生物検定法によりモルヒネ様物質の存在は示唆されてい
たうしかし、その抽出精製法、物質の構造、薬理活性等
の詳細についてはまったく知られていない。
本発明者か本発明において提示する物質は詳細の知られ
ていない腸管からの抽出精製物であり。
ていない腸管からの抽出精製物であり。
エンケファリン、エンドルフィン等の従来公知である前
記内因性モルヒネ様物質とは異な ておりしが〆、従来
知見から予想されるよりもはるかに強いモルヒネり活性
を示すもので卆、ることか明らかとな−た 従って本発
明は新規であり、かつ進歩性ある本のと認められる６ 以下に本発明の詳細な説明する、 本発明物質は次に示すごとき一次構造式をもったヘベタ
デカベプタイドである− Ｔｙｒ Ｇｌｖ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ−Ｐｒｏ ＬｙＳＬｅｕ Ｌｙｓ
Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｉｎ（式中Ａｓｐはアス
パラギン酸、 Ａｓｎは７７〕・ラギン、 ＱＩｎはグ
ルタミンを意味する１この一次構造式は後期実施例にお
いて示されるように本発明物質についてのアミノ酸組成
分析。
記内因性モルヒネ様物質とは異な ておりしが〆、従来
知見から予想されるよりもはるかに強いモルヒネり活性
を示すもので卆、ることか明らかとな−た 従って本発
明は新規であり、かつ進歩性ある本のと認められる６ 以下に本発明の詳細な説明する、 本発明物質は次に示すごとき一次構造式をもったヘベタ
デカベプタイドである− Ｔｙｒ Ｇｌｖ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ−Ｐｒｏ ＬｙＳＬｅｕ Ｌｙｓ
Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｉｎ（式中Ａｓｐはアス
パラギン酸、 Ａｓｎは７７〕・ラギン、 ＱＩｎはグ
ルタミンを意味する１この一次構造式は後期実施例にお
いて示されるように本発明物質についてのアミノ酸組成
分析。
ダンンル化法によるＮ末端アミノ酸の同定および本発明
物質をトリ１フフ分解して得し）れく）ンソグメ＞ ト
ｆＣついてのアミノ酸組成分析、Ｎ末端アミノ酸の同定
、エドマン分解によるアばノ酸配列の決定、さらには本
発明物質なｎルボキンベブナダセ分解（、て遊離される
アミノ酸を経時的に足置する等をおこない、こｈらにお
ける結果を総合し一ζ−確定さねた− 医に本発明物質は、フタ十二指腸より抽出精製−ｌナレ
）れる。抽出精製は、従来一般に公知の方法を準用して
おこな愛はよいが１例えば以）のことさ概要の方法を示
゛ｆことができる。ます、ブタ十二指腸よりＶＩＰ分劇
物を用意する。ＶＩＰ分劃物側フタ十二指腸より得るた
めには９例えは、鈴木。
物質をトリ１フフ分解して得し）れく）ンソグメ＞ ト
ｆＣついてのアミノ酸組成分析、Ｎ末端アミノ酸の同定
、エドマン分解によるアばノ酸配列の決定、さらには本
発明物質なｎルボキンベブナダセ分解（、て遊離される
アミノ酸を経時的に足置する等をおこない、こｈらにお
ける結果を総合し一ζ−確定さねた− 医に本発明物質は、フタ十二指腸より抽出精製−ｌナレ
）れる。抽出精製は、従来一般に公知の方法を準用して
おこな愛はよいが１例えば以）のことさ概要の方法を示
゛ｆことができる。ます、ブタ十二指腸よりＶＩＰ分劇
物を用意する。ＶＩＰ分劃物側フタ十二指腸より得るた
めには９例えは、鈴木。
荒木、橘゛薬学雑藺 ９９巻 １７２頁（１９７９）に
記載の方法を使用することかでとる。次にＶＴｐ分剰物
ヲｃＭ−セルコーズカラムクロマトグフフィー。
記載の方法を使用することかでとる。次にＶＴｐ分剰物
ヲｃＭ−セルコーズカラムクロマトグフフィー。
セファデックスＧ２５ゲルト過、およびＣＭ セフｒ
テックスカラムクロマトグラフィーの各精製処理により
濃ｓ″ｔ′ろ なお、この間における活性側分の追跡は
９モルモノ）［Ｉ’ｌ腸縦走筋を用いる生物検定法（後
記実験例の（２）方法の項の（Ａ）に記載の方法）を用
しておこなう、次に活性側分を集め、塩析し、 Ｂｉ
ｏＧｅｌ Ｐ６を用いて再びゲルｆ過をおこな仁当該ゲ
ルｆ過は最初に弱アルカリ性条件で続いて弱酸性条件で
おこなうのが好ましく、これによって比活性を著しく上
昇せしめろことができる、ここで一旦凍結乾燥し２７次
にヌクレオンルを含有するアセトニトリル水溶液を使用
し、がつアセトニトリルの濃度について１０％から４０
％に至る濃度勾配を与えるとよい。凍結乾燥と上記迎相
高速液体クロマトグラフィーを繰返した後、最後にヌク
レオジルフェニルを用いて逆相高速液体クロマトグラフ
ィーをおこなえば、単一な本発明ペプタイドが得られる 本発明物質が鎮痛作用を有する有用な物質であることを
以下の実験例をもって示す。
テックスカラムクロマトグラフィーの各精製処理により
濃ｓ″ｔ′ろ なお、この間における活性側分の追跡は
９モルモノ）［Ｉ’ｌ腸縦走筋を用いる生物検定法（後
記実験例の（２）方法の項の（Ａ）に記載の方法）を用
しておこなう、次に活性側分を集め、塩析し、 Ｂｉ
ｏＧｅｌ Ｐ６を用いて再びゲルｆ過をおこな仁当該ゲ
ルｆ過は最初に弱アルカリ性条件で続いて弱酸性条件で
おこなうのが好ましく、これによって比活性を著しく上
昇せしめろことができる、ここで一旦凍結乾燥し２７次
にヌクレオンルを含有するアセトニトリル水溶液を使用
し、がつアセトニトリルの濃度について１０％から４０
％に至る濃度勾配を与えるとよい。凍結乾燥と上記迎相
高速液体クロマトグラフィーを繰返した後、最後にヌク
レオジルフェニルを用いて逆相高速液体クロマトグラフ
ィーをおこなえば、単一な本発明ペプタイドが得られる 本発明物質が鎮痛作用を有する有用な物質であることを
以下の実験例をもって示す。
実験例
（１）試料
実施例１記載の方法によって得られた本発明物質を検体
試料とした。なお、対照試料としてモルヒネを使用した
。
試料とした。なお、対照試料としてモルヒネを使用した
。
（２）方法
以下に記載する（４）および（Ｂ）の２種類の方法をお
こな−た。
こな−た。
（４） モルモット回腸縦走筋を使用する検定方法Ｈ，
Ｗ、 Ｋｏｓｔｅｒｌ ｉｔｚらの方法を準用した。す
なわち、成熟したモルモットの頚静脈を切断ｔ。
Ｗ、 Ｋｏｓｔｅｒｌ ｉｔｚらの方法を準用した。す
なわち、成熟したモルモットの頚静脈を切断ｔ。
放血化させ、開腹し直ちに回腸を回盲部より１５〜２０
ｃＩＬ離れた場所より４０〜５０Ｑｌｌだけ取り出した
。直ちにリンゲル徹中に入れ、１０ｃＩＩＬずつ切断し
、それぞれの腸断片よりメスと綿棒を利用して縦走筋を
剥離した。これをリング状に糸で結び内容量６ｄの恒温
ガラスセルに入れ、上下につるした 白金電極をＬ下に
設置し、０．１Ｈｚ。
ｃＩＬ離れた場所より４０〜５０Ｑｌｌだけ取り出した
。直ちにリンゲル徹中に入れ、１０ｃＩＩＬずつ切断し
、それぞれの腸断片よりメスと綿棒を利用して縦走筋を
剥離した。これをリング状に糸で結び内容量６ｄの恒温
ガラスセルに入れ、上下につるした 白金電極をＬ下に
設置し、０．１Ｈｚ。
０．５ｍｓ、 ８０〜９０Ｖｏｌｔの電気刺激を与え、
これＫよって生ずる収縮をトランスデユーサ−を通じて
記録した。セル中に試料を入れると１、用量に応じて収
縮の高さが抑制されるので、これを利用してモルヒネ様
活性を測定した、 本方法の参考文献を次に示す。
これＫよって生ずる収縮をトランスデユーサ−を通じて
記録した。セル中に試料を入れると１、用量に応じて収
縮の高さが抑制されるので、これを利用してモルヒネ様
活性を測定した、 本方法の参考文献を次に示す。
Ｈ，Ｗ、 Ｋｎｓｔｅｒ ｌ ｉｔｚ、 Ａ、 Ａ、
Ｗａｔｅｒｆ ｊｅｌｄ 、 Ａｎｎｕ。
Ｗａｔｅｒｆ ｊｅｌｄ 、 Ａｎｎｕ。
Ｒｅｖ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 １５．２９ （１９
７５）（Ｂｌ マウス輸精管を用いる方法 ）１ｕｇｈｅ’ｓらの方法を準用した。すなわち、成熟
した雄マウスを断頭、放血死させ、直ちに開腹し左右輸
精管をとり出した、リンゲル液中で管内につま−ている
精液をビンセットで押し出し。
７５）（Ｂｌ マウス輸精管を用いる方法 ）１ｕｇｈｅ’ｓらの方法を準用した。すなわち、成熟
した雄マウスを断頭、放血死させ、直ちに開腹し左右輸
精管をとり出した、リンゲル液中で管内につま−ている
精液をビンセットで押し出し。
左右両輪精管の両端を糸で結び輪状にした これを前記
（Ａ）におけると同様の電気刺激装置に入れ電気刺激し
た。その条件は、 ０．１Ｈｚ、 １ｍｓ。
（Ａ）におけると同様の電気刺激装置に入れ電気刺激し
た。その条件は、 ０．１Ｈｚ、 １ｍｓ。
９０Ｖｏｌｔである、モルモット回腸縦走筋の場合とｒ
＝様、電気刺激による収縮は試料の用量に応じて阻害さ
れるので、′これを利用してモルヒネ様活性を測定した
。
＝様、電気刺激による収縮は試料の用量に応じて阻害さ
れるので、′これを利用してモルヒネ様活性を測定した
。
本方法の参考文献を次に示す〜
Ｈｕｇｈｅｓ ）ＬＷ、 ＫｏｓｔｅｒＨｔｚ ＨＷ、
Ｌｅｉｌｉｐ Ｆ、Ｍ：Ｒｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍｌｉｒ
ｎｌ、５３ ３７１ （１９７５）なＥ モルヒネ様活
性の力価は１電気刺激によって生ずる収縮を５０％に減
少させるのに要−（るｓ［Ｉｃｑ。１ナノ−Ｅ２・−琢
１って衣Ｔされるσ）で、 （Ａ）、 （Ｂ１両方法に
おいてもＴ Ｃｓａを求めた（３）結果 結果を表１に示イ。
Ｌｅｉｌｉｐ Ｆ、Ｍ：Ｒｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍｌｉｒ
ｎｌ、５３ ３７１ （１９７５）なＥ モルヒネ様活
性の力価は１電気刺激によって生ずる収縮を５０％に減
少させるのに要−（るｓ［Ｉｃｑ。１ナノ−Ｅ２・−琢
１って衣Ｔされるσ）で、 （Ａ）、 （Ｂ１両方法に
おいてもＴ Ｃｓａを求めた（３）結果 結果を表１に示イ。
と １
表中、数値はＩＣ’、、（ナノモル）を示り、、０内は
例数を示す。
例数を示す。
表１より本発明物知は軍勢的刺激に対するモルモット回
腸縦走筋の収縮を抑制し、その強さはモルヒネの約１５
０倍である。また９本発明物質は油気的刺激に対するマ
ウスの輸精管の収縮を抑制（−９その強さ＆ｊ、モ１【
ヒ不の約３０倍であることが判明する、 以下に記載する実施例をもって本発明をさらに詳細に説
明する。
腸縦走筋の収縮を抑制し、その強さはモルヒネの約１５
０倍である。また９本発明物質は油気的刺激に対するマ
ウスの輸精管の収縮を抑制（−９その強さ＆ｊ、モ１【
ヒ不の約３０倍であることが判明する、 以下に記載する実施例をもって本発明をさらに詳細に説
明する。
実施例１
２０万頼分のブタ十二指腸から得られたＶＩＰ分劇物１
ゆをＣＭ−セルロースカラム（直径３゜ｃＩＩＬＸ長さ
７０ ｃｐｎ ）にかけ、２０ｍＭリン酸緩衝液で十分
に洗滌（４ｌＡｒ ）後、 ２０ ｍＭ、 ｐＨ１０
（１，４０１）から１００ｍＭ、ｐＨ１２（１４０１）
Ｋ至る直線濃度勾配をも−たリン酸ナトリウム溶液を展
開剤として溶出せしめ、前記実験例の方法の項の（Ａ）
Ｋ記載の生物検定法によって追跡しながら。
ゆをＣＭ−セルロースカラム（直径３゜ｃＩＩＬＸ長さ
７０ ｃｐｎ ）にかけ、２０ｍＭリン酸緩衝液で十分
に洗滌（４ｌＡｒ ）後、 ２０ ｍＭ、 ｐＨ１０
（１，４０１）から１００ｍＭ、ｐＨ１２（１４０１）
Ｋ至る直線濃度勾配をも−たリン酸ナトリウム溶液を展
開剤として溶出せしめ、前記実験例の方法の項の（Ａ）
Ｋ記載の生物検定法によって追跡しながら。
活性割分を集めた。
図１は、当該発側の分割プロフィルを示す図であり、ム
・ムはモルヒネ換算値によって、また。
・ムはモルヒネ換算値によって、また。
・−・はＯＤ、、。ｎｎ＋によって追跡したものを示す
、次に活性割分を食塩飽和にて塩析シフ、２回に分けて
セファデックスＧ２５カラム（２１，５ＣＩＩＬ＼８１
ｃｘ）を用いて脱塩し、凍結乾燥した（７８９）。
、次に活性割分を食塩飽和にて塩析シフ、２回に分けて
セファデックスＧ２５カラム（２１，５ＣＩＩＬ＼８１
ｃｘ）を用いて脱塩し、凍結乾燥した（７８９）。
次にあらかじめ２０ ｍＭ、 ｐＨ１０リン酸緩街液で
十分に緩衝化したＣＭ−セファデノクスヵラム（３，５
ｃｙ Ｘ ９０ｃＩＬ）にかけ、同緩衝液で洗滌後。
十分に緩衝化したＣＭ−セファデノクスヵラム（３，５
ｃｙ Ｘ ９０ｃＩＬ）にかけ、同緩衝液で洗滌後。
２０ｍＭ、ｐＨ１０（：ｌりから１００ｍＭ、ｐＨ１２
（３Ａり忙中る直線濃度や勾配をもったリン酸す） Ｉ
Ｊウム溶液を展開剤として溶出（１０７ｍ／ｈｒ、 ］
５Ｖｆｒ ）せ［−７めた。活性を前記生物検定法に
より追跡しながら、活性部分を集め２食塩で塩析した（
２０ｇ）、。
（３Ａり忙中る直線濃度や勾配をもったリン酸す） Ｉ
Ｊウム溶液を展開剤として溶出（１０７ｍ／ｈｒ、 ］
５Ｖｆｒ ）せ［−７めた。活性を前記生物検定法に
より追跡しながら、活性部分を集め２食塩で塩析した（
２０ｇ）、。
塩析物を４回に分けて、 Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ６カラ
ム（３Ｃ１Ｋ”１００ｃＩＬ）にかけた、まず１００ｍ
Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液で溶出し、その活性部分を
凍結乾燥した後、四じ（Ｂｏｏ Ｇｅｌ Ｐ ６カラム
（２，４ｃｓｔＸ ８７ｃＲ）を用いて１００ ｍＭ酢
酸溶液で流出させた。活性部分は１００ ｍＭ炭酸アン
モニウム溶液では塩ビーヘクに電なって流出し、１００
ｍＭ酢酸溶液では塩ビーりの後にそれと分れて流出した
。図２はＢｉｏ Ｇｅｌ Ｐ６カラムにかけ１００ｍＭ
炭酸水素ナトリウムで分割１−たときの分割プロフィル
を示す図であり、・・・線はモルフイン換算値によって
、また−線はＯＤ！８゜ｎｍによって追跡したものを示
す。図３はＢｉ。
ム（３Ｃ１Ｋ”１００ｃＩＬ）にかけた、まず１００ｍ
Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液で溶出し、その活性部分を
凍結乾燥した後、四じ（Ｂｏｏ Ｇｅｌ Ｐ ６カラム
（２，４ｃｓｔＸ ８７ｃＲ）を用いて１００ ｍＭ酢
酸溶液で流出させた。活性部分は１００ ｍＭ炭酸アン
モニウム溶液では塩ビーヘクに電なって流出し、１００
ｍＭ酢酸溶液では塩ビーりの後にそれと分れて流出した
。図２はＢｉｏ Ｇｅｌ Ｐ６カラムにかけ１００ｍＭ
炭酸水素ナトリウムで分割１−たときの分割プロフィル
を示す図であり、・・・線はモルフイン換算値によって
、また−線はＯＤ！８゜ｎｍによって追跡したものを示
す。図３はＢｉ。
Ｇｅ１Ｐ６ カラムにかけ１００ｍＭ酢酸溶液で分割し
たときの分割プロフィルを示す図であり、・・・線は０
Ｄ２２６ ｎｍによって、また−線はＯＤ２１６ ｎｍ
によって追跡したものを示す。図中斜線部分は活性部分
を示す。
たときの分割プロフィルを示す図であり、・・・線は０
Ｄ２２６ ｎｍによって、また−線はＯＤ２１６ ｎｍ
によって追跡したものを示す。図中斜線部分は活性部分
を示す。
分かれた活性部分を凍結乾燥した後、アセトニトリル水
混合液（１：９）にトリフルオロ酢酸を０．０６５＊Ｖ
／Ｖ含有せしめた溶液１ｄに溶解し。
混合液（１：９）にトリフルオロ酢酸を０．０６５＊Ｖ
／Ｖ含有せしめた溶液１ｄに溶解し。
ヌクレオジルＣ１８カラム（４，６ｍ Ｘ ５００ｗｇ
）を使用する逆相高速液体クロマトグラフィーをおこ
なった。なお、展開条件はアセトニトリル水混合液にト
リフルオロ酢酸を０．０６５ Ｓ Ｖ／Ｖ含有せしめた
溶液であって、アセトニトリルの濃度について２０％か
ら４０％までの濃度勾配をかけたものを２ ｗｉｌ／ｍ
ｉ ｎの速度で流出させた。
）を使用する逆相高速液体クロマトグラフィーをおこ
なった。なお、展開条件はアセトニトリル水混合液にト
リフルオロ酢酸を０．０６５ Ｓ Ｖ／Ｖ含有せしめた
溶液であって、アセトニトリルの濃度について２０％か
ら４０％までの濃度勾配をかけたものを２ ｗｉｌ／ｍ
ｉ ｎの速度で流出させた。
図４は、当該クロマトグラフィーの結果を示す図であり
１点線はアセトニ） ＩＪルの濃度変化を示す。図中斜
線部分は活性部分を示す。図４に示されるごとく、活性
部分はアセトニトリルの濃度が３０％となるフラクショ
ンの附近において濃縮されて流出した。これを凍結乾燥
し、ＩＷ！−条件の高速液体クロマトグラフィー精製を
更に１回おこない、最後にヌクレオジルフェニルカラム
（４，６１ｍＸ２５０ｔｐｘ）を使用する逆相高速液体
クロマトグラフィーをおこなった。なお、展開剤は３０
チアセトニトリル水溶液にトリフルオロ酢酸を０．０６
５＊Ｖ／Ｖ含有せしめた溶液を用い、１ｔａｌ／ｍｉｎ
の速度で流出さセた、活性部分は２８０ ｎｍおよび２
２５ｎｍの吸光値ヒ〜りと一致し、かつ左右対称に流出
した。
１点線はアセトニ） ＩＪルの濃度変化を示す。図中斜
線部分は活性部分を示す。図４に示されるごとく、活性
部分はアセトニトリルの濃度が３０％となるフラクショ
ンの附近において濃縮されて流出した。これを凍結乾燥
し、ＩＷ！−条件の高速液体クロマトグラフィー精製を
更に１回おこない、最後にヌクレオジルフェニルカラム
（４，６１ｍＸ２５０ｔｐｘ）を使用する逆相高速液体
クロマトグラフィーをおこなった。なお、展開剤は３０
チアセトニトリル水溶液にトリフルオロ酢酸を０．０６
５＊Ｖ／Ｖ含有せしめた溶液を用い、１ｔａｌ／ｍｉｎ
の速度で流出さセた、活性部分は２８０ ｎｍおよび２
２５ｎｍの吸光値ヒ〜りと一致し、かつ左右対称に流出
した。
図５は、当該クロマトグラフィーの結果を示す図である
。、得られた物質につき常法によハダンシル誘導体に導
き、単一性を確［また。収量１５ｎｍｏｌｅａ ｌｉ
）られた物質の構造決定を以下（１）〜（４）Ｋ記載す
る分析によっておこなった。
。、得られた物質につき常法によハダンシル誘導体に導
き、単一性を確［また。収量１５ｎｍｏｌｅａ ｌｉ
）られた物質の構造決定を以下（１）〜（４）Ｋ記載す
る分析によっておこなった。
（１） アミノ酸組成
２ナノモル相当ペプチドを３規定メルカプトエタンスル
ホン酸２０μｌ中で１１０℃２４時間加水分解し１日立
８３５型アミノ酸分析計により構成アミノ酸を分析した
。その結果、 Ａｓｐ２． Ｇｌｕｌ、 Ｇｌｙ２゜Ｐ
ｒｎ１． ｌ１ｅｕｌ、 Ｌｅｕ２． Ｐｈｅｌ、 Ｔ
ｙｒｌ、 Ｌｙｓ２． Ａｒｇ３゜Ｔｒｐｌ、の計１７
個アミノ酸からできていることが判った。
ホン酸２０μｌ中で１１０℃２４時間加水分解し１日立
８３５型アミノ酸分析計により構成アミノ酸を分析した
。その結果、 Ａｓｐ２． Ｇｌｕｌ、 Ｇｌｙ２゜Ｐ
ｒｎ１． ｌ１ｅｕｌ、 Ｌｅｕ２． Ｐｈｅｌ、 Ｔ
ｙｒｌ、 Ｌｙｓ２． Ａｒｇ３゜Ｔｒｐｌ、の計１７
個アミノ酸からできていることが判った。
（２）Ｎ末端アミノ酸の同定
１ナノモル相当ペプチドを０．５規定重炭酸ソーダ５０
μノに溶かし、ダンジルクロライド１■鷹アセ°トン溶
液５０μｌを加え室温−夜装置した。
μノに溶かし、ダンジルクロライド１■鷹アセ°トン溶
液５０μｌを加え室温−夜装置した。
ダンシル化ペプチドは、シリカゲル薄層クロマトグラフ
！ （ＴＬＣ）、 ｎ−ＢｕＯＨ，ＡｃＯＨ：Ｈ，Ｏ
−＝ ４ ：１゛５ 上層にて展開した。Ｒｆ ０．３
〜０．４のダンシルペプチドのスポットをかきとり、Ｍ
ｓＯＨ：Ａｃ０ＨＰｙｒｉｄｉｎｅ ：Ｈ１０＝１川：
ｌ：１ 混合液で溶出した。加水分解管で濃縮乾固後、
６Ｎ塩酸１００μｌ。
！ （ＴＬＣ）、 ｎ−ＢｕＯＨ，ＡｃＯＨ：Ｈ，Ｏ
−＝ ４ ：１゛５ 上層にて展開した。Ｒｆ ０．３
〜０．４のダンシルペプチドのスポットをかきとり、Ｍ
ｓＯＨ：Ａｃ０ＨＰｙｒｉｄｉｎｅ ：Ｈ１０＝１川：
ｌ：１ 混合液で溶出した。加水分解管で濃縮乾固後、
６Ｎ塩酸１００μｌ。
１０５℃１６時間加水分解した。塩酸な留去後、水飽和
酢酸エチル１００μｌにて抽出。不溶物を遠沈除去し、
上澄液をＨＰＬＣ（ウオタ ズ）ＮｕｅｌｅｏａｉｌＣ
１８カラム（４，６ｍｘ２５０ｓｍ）にて分析し、ε−
ＤＮＳ−−リジン及びＯ，Ｎ −ｄｉ ＤＮＳ−チロシ
ンを同定したー従って、Ｎ端はチロシンであると推定さ
れた。
酢酸エチル１００μｌにて抽出。不溶物を遠沈除去し、
上澄液をＨＰＬＣ（ウオタ ズ）ＮｕｅｌｅｏａｉｌＣ
１８カラム（４，６ｍｘ２５０ｓｍ）にて分析し、ε−
ＤＮＳ−−リジン及びＯ，Ｎ −ｄｉ ＤＮＳ−チロシ
ンを同定したー従って、Ｎ端はチロシンであると推定さ
れた。
（３）トリプシン分解物の構造確認
５ナノモル相当ペプチドを１００μｌ蒸留水に溶解し、
これにトリプシン（シグマ−社）１０μ９７Ｉｌｌ Ｏ
，Ｉ Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，６，１５μノを添加し、
３７℃を１０チから６０チまで直線濃度勾配で増加させ
る条件にて分離し、５個のフラグメントを分離した。各
７ラグメントのアミノ啼分析、Ｎ末端アミ／酸ノＩｔ’
Ｊ定ｌ エドマン分解によるアミノ酸配列の決定を行っ
た。その結果、各フラグメントのアミノ酸配列は。
これにトリプシン（シグマ−社）１０μ９７Ｉｌｌ Ｏ
，Ｉ Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，６，１５μノを添加し、
３７℃を１０チから６０チまで直線濃度勾配で増加させ
る条件にて分離し、５個のフラグメントを分離した。各
７ラグメントのアミノ啼分析、Ｎ末端アミ／酸ノＩｔ’
Ｊ定ｌ エドマン分解によるアミノ酸配列の決定を行っ
た。その結果、各フラグメントのアミノ酸配列は。
Ｆｒａｇ ｊ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ ＬｙｓＦｒ
ａｇ ｌ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｆｒａｇ ｌｉ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ａｓｐ
（Ａｍｘ Ｇｌｘ ）ＦｒａｇｌＶ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ ＡｒｇＦｒａｇ
Ｖ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅａ ｋｒ
ｇと推定された。Ｆｒａｇ Ｌ Ｉｌｔ Ｒａｔ Ｖの
各７ラグメントの構造は標品との同定により確認した。
ａｇ ｌ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｆｒａｇ ｌｉ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ａｓｐ
（Ａｍｘ Ｇｌｘ ）ＦｒａｇｌＶ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ ＡｒｇＦｒａｇ
Ｖ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅａ ｋｒ
ｇと推定された。Ｆｒａｇ Ｌ Ｉｌｔ Ｒａｔ Ｖの
各７ラグメントの構造は標品との同定により確認した。
なお。
エドマン分解については下記文献を参考のために示す。
Ｍｅ＋ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ、 ＸＬ■、Ｐａｒｔ Ｅ。
ｌ、 ＸＬ■、Ｐａｒｔ Ｅ。
３３５ベー・ン Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃ，［ν／、１
（ｉｔｓ 亀ｎｄ ８．Ｎ。
（ｉｔｓ 亀ｎｄ ８．Ｎ。
’ｌ”ｉｍａｓｈｓｆｆ、 １９７７年、 Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｖＹｏｒｋ。
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｖＹｏｒｋ。
（４）Ｃ端部アミノ酸配列の決定
１ナノ七ル相当ペプチドをカルボキシペプチダーゼＡ（
シグマ−）１μｇと共ＫＯ，１Ｍ酢酸アンモ／緩衝液ｐ
Ｈ８，０，１５０μｌ中３３℃でインキユベートシ分解
した。２時間及び１６時間後各５０μｊを１日立８３５
型アミノ酸分析計生体液カラムにて遊離したアミノ酸を
測定した。更に残液５０μｌにカルボキシペプチダーゼ
Ａ１μｇを追加し、２４時間分解した。２４時間後全量
を７ミノ酸分析計にかけ、遊離アミノ酸を定量し、たつ
その結果Ｃ端は、 Ｇｌｎであり、七〇前２ヶのアミノ
酸はｔ Ａ”ＴＩ又は＾Ｆｎと考えられた。即ちＣ端
部は、 −Ａｓｐ−Ａｓｎ Ｇｌｎ又は−Ａｓｎ Ａｓ
ｐ Ｇｌｎと推定された。しかし、トリプシン分解フラ
グメントＩのエドマン分解により、Ｃ端から３．番目は
Ａｓｐと推定されるので、Ｃ４部のアミノ酸配列として
は−Ａ＠Ｐ Ａｓｎ−Ｇｌｎが決定された。
シグマ−）１μｇと共ＫＯ，１Ｍ酢酸アンモ／緩衝液ｐ
Ｈ８，０，１５０μｌ中３３℃でインキユベートシ分解
した。２時間及び１６時間後各５０μｊを１日立８３５
型アミノ酸分析計生体液カラムにて遊離したアミノ酸を
測定した。更に残液５０μｌにカルボキシペプチダーゼ
Ａ１μｇを追加し、２４時間分解した。２４時間後全量
を７ミノ酸分析計にかけ、遊離アミノ酸を定量し、たつ
その結果Ｃ端は、 Ｇｌｎであり、七〇前２ヶのアミノ
酸はｔ Ａ”ＴＩ又は＾Ｆｎと考えられた。即ちＣ端
部は、 −Ａｓｐ−Ａｓｎ Ｇｌｎ又は−Ａｓｎ Ａｓ
ｐ Ｇｌｎと推定された。しかし、トリプシン分解フラ
グメントＩのエドマン分解により、Ｃ端から３．番目は
Ａｓｐと推定されるので、Ｃ４部のアミノ酸配列として
は−Ａ＠Ｐ Ａｓｎ−Ｇｌｎが決定された。
以上（１）〜（４）の分析結果を総合し、得られたベプ
メイドのアミノ酸配例は以下のごとく決定された。
メイドのアミノ酸配例は以下のごとく決定された。
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇａｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ ＩＩｓ Ａｒｇ −Ｐｒｏ Ｌｙ＠ＩＪｏ Ｌｙ
ｓ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇ１ｎ
ｒｇ ＩＩｓ Ａｒｇ −Ｐｒｏ Ｌｙ＠ＩＪｏ Ｌｙ
ｓ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇ１ｎ
図１は実施例１記載中の図１であり、ＣＭ−セルロース
カラムによる分劃プロフィルを示す図面である。図２は
実施例１記載中の図２であり。 Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ ６カラムを使用して炭酸水素ナト
リウム溶液で分劃したときの分割プロフィ・Ｌを示す図
面である一図３は実施例１記載中の図３であり。 ＢｉｏＧｅｌＰ６カラムを使用して酢酸溶液で分劃した
ときの分劃プロフィルを示す図面である。図４は実施例
１記載中の図４であり、ヌクレオジルＣ１、カラムを使
用する逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図
面である。図５は実施例１記載中の図５であり、ヌクレ
オジルフェニルカラムを使用する逆相高速液体クロマト
グラフィーの結果を示す図面である５
カラムによる分劃プロフィルを示す図面である。図２は
実施例１記載中の図２であり。 Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ ６カラムを使用して炭酸水素ナト
リウム溶液で分劃したときの分割プロフィ・Ｌを示す図
面である一図３は実施例１記載中の図３であり。 ＢｉｏＧｅｌＰ６カラムを使用して酢酸溶液で分劃した
ときの分劃プロフィルを示す図面である。図４は実施例
１記載中の図４であり、ヌクレオジルＣ１、カラムを使
用する逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図
面である。図５は実施例１記載中の図５であり、ヌクレ
オジルフェニルカラムを使用する逆相高速液体クロマト
グラフィーの結果を示す図面である５
Claims (1)
- （１）−次構造式 ％式％ によって示される＊現なヘブタデヵペプタイド（２）
ブタ十二指腸より抽出精製されることを特徴とする特
許−求の範−→第１項記載の新規なヘブタデ力ベプタイ
ド
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56112950A JPS5815946A (ja) | 1981-07-21 | 1981-07-21 | 新規ヘプタデカペプタイド |
| HU822352A HU186955B (en) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | Process for preparing new heptadecapeptida |
| DK326082A DK171680B1 (da) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | Fremgangsmåde til fremstilling af et heptadecapeptid |
| CA000407628A CA1234565A (en) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | Heptadecapeptide |
| EP82106574A EP0070569B1 (en) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Novel heptadecapeptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the same |
| DE8282106574T DE3264768D1 (en) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Novel heptadecapeptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the same |
| US06/400,324 US4481138A (en) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Heptadecapeptide |
| CS825579A CS236487B2 (en) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Method of heptadecapeptide preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56112950A JPS5815946A (ja) | 1981-07-21 | 1981-07-21 | 新規ヘプタデカペプタイド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5815946A true JPS5815946A (ja) | 1983-01-29 |
| JPH032880B2 JPH032880B2 (ja) | 1991-01-17 |
Family
ID=14599576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0070569B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5815946A (ja) |
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| DE (1) | DE3264768D1 (ja) |
| DK (1) | DK171680B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4481191A (en) * | 1983-03-30 | 1984-11-06 | The Regents Of The University Of California | Method for controlling blood pressure |
| US5340802A (en) * | 1989-06-30 | 1994-08-23 | Abbott Laboratories | Peptide analog type-B CCK receptor ligands |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| FR1605434A (ja) * | 1967-12-19 | 1975-10-17 | ||
| DE2628006C2 (de) * | 1976-06-23 | 1986-11-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Tridecapeptid, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
| HU175152B (hu) * | 1976-12-30 | 1980-05-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Sposob poluchenija peptidov s gastrin-aktivnost'ju, soderzhahhikh amino-oksi-kisloty |
| JPS6040412B2 (ja) * | 1977-02-10 | 1985-09-11 | エーザイ株式会社 | 消化管ホルモンの製造方法 |
-
1981
- 1981-07-21 JP JP56112950A patent/JPS5815946A/ja active Granted
-
1982
- 1982-07-20 HU HU822352A patent/HU186955B/hu not_active IP Right Cessation
- 1982-07-20 CA CA000407628A patent/CA1234565A/en not_active Expired
- 1982-07-20 DK DK326082A patent/DK171680B1/da active
- 1982-07-21 CS CS825579A patent/CS236487B2/cs unknown
- 1982-07-21 US US06/400,324 patent/US4481138A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-21 EP EP82106574A patent/EP0070569B1/en not_active Expired
- 1982-07-21 DE DE8282106574T patent/DE3264768D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1234565A (en) | 1988-03-29 |
| US4481138A (en) | 1984-11-06 |
| DK326082A (da) | 1983-01-22 |
| CS236487B2 (en) | 1985-05-15 |
| EP0070569A1 (en) | 1983-01-26 |
| EP0070569B1 (en) | 1985-07-17 |
| JPH032880B2 (ja) | 1991-01-17 |
| DK171680B1 (da) | 1997-03-10 |
| DE3264768D1 (en) | 1985-08-22 |
| HU186955B (en) | 1985-10-28 |
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