CS236487B2

CS236487B2 - Method of heptadecapeptide preparation

Info

Publication number: CS236487B2
Application number: CS825579A
Authority: CS
Inventors: Shinro Tachibana; Kengo Araki; Shizuko Ohya; Seiji Yoshida
Original assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1981-07-21
Filing date: 1982-07-21
Publication date: 1985-05-15
Also published as: JPS5815946A; HU186955B; EP0070569B1; CA1234565A; EP0070569A1; DE3264768D1; US4481138A; JPH032880B2; DK171680B1; DK326082A

Description

Vynález ве týká způsobu přípravy nového heptadekapeptidu, který má farmaceutické

Heptadakapeptid podle vynálezu mé analgetickou účinnost a zvláště opiátovou účinnost spočívající ve vasoaktivní intestinální peptidové frakci. Heptadakapeptid se podle vynálezu připravuje ze dvanáctníku a zvláště ze dvanáctníku vepře·

Vynálezu předcházely dlouhodobé studie extrakce gastrointestinálních hormonů, jako jsou sekretin, oholecystokinin, pankreozymin a vasoaktivní intestinální peptidy z materiálů, jako je dvanáotník vepřů, přičemž se в překvapením zjistilo, že látky mají opiátovou účinnost ve vasoaktivní intestinální peptidové frakci· Proto byly prováděny další extrakce, čisticí způsoby a analýzy těchto látek a zjistilo se, že účinnou látkou je peptid nové primární struktury, přičemž jeho opiátová účinnost je stonásobně vyšší než morfinu. Vyná|ez je založen na tomto poznatku·

Enkefalin a endorfin se jakožto endogenní opiátová látky vyskytují v mozku a předpokládá se, že řídí různé tělesné vjemy, včetně pocitu bolesti a mentální činnosti· Enkefalin zahrnuje dva typy pentapeptidů, a to methioninenkefalin a leucinenkefalin a podle domněnky mají tyto dva peptidy různé fyziologické působení· Je rovněž známo, že endorfin vykazuje molekulární heterogenitu, to znamená, že je ve formě d, beta, gama, delta atd·, a Že beta-endorfin sestává z 31 aminokyselin a má nejsilnější análgetickou účinnost· Endorfinu se například týká následující literatura: A. Beaumont, J. Huges: Ann· Rev. Pharmacol· Toxicol· 15. str· 245 /1979/; Chikara Oyama: Shindan to Chiryo /Diagnos!s and Therapy/ 6g, str· 825 /1980/; Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Proteine, Nucleic acids, and Enzymes) 26, Čís· 2 /1981/, zvláštní svazek o opiátových peptidech·

Nejnověji se uvádí, že opiátová endogenní látky jsou obsaženy nejen v mozku, ale také v jiných částech těla a ve skutečnosti se zjistilo, že několik peptidů, které lze považovat za prekursory enkefalinu, lze izolovat z adrenální dřeně· Přítomnost opiátových látek v intestinálňím traktu byla již také zjištěna imunologickými způsoby, jako jsou imunohistochemie a radioimunologické zkoušky a biologické zkoušky prováděné in vitro.

Nejsou však známy žádné podrobnosti týkající se jejich extrakce a Čištění, jejich struktury, jejich farmakologické účinnosti a podobných charakteristik·

Tento vynález se tedy týká extraktu z inestinálního traktu, který není podrobně znám· Je jasné, že látka připravovaná podle vynálezu, je odlišná od shora uvedených endogenních opiátových látek, jako jsou enkefalin nebo endorfin a že má silnější opiátové působení než by se dalo očekávat na základě současných poznatků· Na tom je založena novost vynálezu·

Látkou, připravovanou podle vynálezu je heptadakapeptid primární struktury: ^Ťyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-tys-Leu-tys-Trp-Asp-Asn-Gln, přičemž Авр znamená asparagovou kyselinu, Aan znamená asparagin a Gin znamená glutamin·

Tato primární struktura je stanovena analytickými způsoby, uvedenými v příkladech, to znamená stanovením aminokyselinového složení, a identifikací tosylací N-koncové aminokyseliny sloučenin podle vynálezu: analýzou aminokyselinového složení, identifikací

N-koncoké aminokyseliny a sledu aminokyselin Edmanovým odbouráním fragmentů získaných trypsinqfou hydrolýzou látky, připravené způsobem podle vynálezu; a stanovením změn množství -_tan4 no kyselin uvolněných s časem karboxypeptidázovou hydrolýzou sloučenin připravených'

>e

Způsob přípravy heptadekapeptidu s výš© uvedenou primární strukturou s účinností endogenních opiátových látek podle vynálusu spočívá v tom, žu uu extrahuje dvwiáátník a získaný extrakt se čistí. Extrakt se čistí chrornatooraaií ne karbotymUhylcululos;® a/nebo gelovou filtrací na zesítěném drztrinu s nízkým stupněm zesítění a/nebo na etheru uvedeného dextrinu. Dále se čistí vydolováním účinné frakce, gu-lovou filtrací za . použití polyakrylmiclového gelu. Popřípadě se ještě čistí opakovanou lyofilizaeí účinné frakce a vysokotlakou kapalinovou chrommtograaií a reverzní fáaf_:

Díle se bude používat pro karboxyinethylcelulozu označení CJSc-cUulózu., pro zesítěný deetrin s nízkým stupněm zesítění Sephadtx G 25, pro karboxynethylether tohoto dextrinu označení a pro polyakry!amidový gel označení Bio Gel P 6_e . Látka podlt vynálezu st může extrahovat z dvanáátníku vepře. Extrakce a čistění se m.žt provádět o sobt známými způsoby a tyto způsoby jsou objasněny v náslctujjícXa -pířří--. kladech. V prvním stupni, se připravují v».tc«ativní intestinálaí peptldové frakce ? dvísnáetniku vepře způsobem který popsal, například Suzuui, Araki a Tachivent v Yataugaku-Zasshi, svazek 99? ·str. 172 /1979/. Pak se vasooakivní intestináLní paptidové fakcu konc^ntin^urí · způsoby čištění zahrnnuícími CMcc.Pulozovou sloupcovou chromátografiU, Stphadtx G 25 gelovou ϋΐ^τβοί a CIMSsphadexovou chrommtoorafíi. Stanovení účinné frakce st provádí biologickou zkouškou za podélných řezů svalu Hua morčete /víz tept 2, Pak se účinná frakce oúdděl, vysolí st a opět sp · podrobí gelové filtraci za pcouii.í Bic Gelu P 6.

Tato gelová filtaaeí, se s výhodou provádí nejdříve za slabě tóLkaUidých podmínek a pak slabě kyselých podmínek, čímž se značně zvyšuje relativní účinnost. Foto® pa účinná frakce suší vymražováním a podrobuje se vysokotlaké kap?aLinové chromátoogfii a reverzní fází za p^K^uit^ií Nucceooilu C 18 (s.ilkkagPL s oktaderylovými skupinami na svém povrchu). Jakožto vyvíjucího činidla se používá vodného roztoku acattoitrilu··obгs8aujíeího tгifluoooc'tovou kyselinu, přičemž je výhodný acetonn-trHový koneeptrační gradient- 10 až 40 %., Peptid podlt vynálezu se získá opakováním vywazovaeího sušen a vysokotlaké kapánnové chtomaatugtчfit s · reverzní fází a nakonec vysokotlaké kapalinové uhromato» graflé s reverzní fází ze pou^žit,:£ Ν^ίβο^ΐ! Fetnylu (silkkegPL 8 fenylovými skupinami na svém povrchu). ...

HeptiadePaaeutid, připravený způsobem podle -vynálezu, je použitelný jako účinné složka přípravků vedle farmaceuticky vhodných nosičů a/nebo ředidel.

Užitečnost látky, připravené způsobem podLe vynálezu, jakožto Ρ’Ιβ^θΟ.ΙΙι ju ·doložena následujícími testy.

Testy ,1. Vzorek ,

Jako zkušebního vzorku'se použije látky připravené způsobem popsaným v příkladu 1. Moofinu použito.jako kontrolního vzorku.

2, Způsob ,

Používá · su dvou způsobů? A a B

A Zkouška za použití podélného svalového přípravku il©a moo^eev·

Použije · se způsobu, který poptsa H· W. Ksteelitz a kol· Dospělé morče se nechá vykrvácet podříznutím jugulární iíly a bezprostředně po laparotomii se ileum, 40 až cm dlouhý řez, · vyřízne v mstě 15 až 20 cm vzdáleném od ileocekúlní oblaasi, bezprostředně se vloií do R.ingerova roztoku a rozřeže se na 10 cm segmenty a ze segmentů se chirurgickým nožem a aplikétorem sloupnou podélné svaly. Tyto svaly se sváží nití za vzniku prstence a svisle se iza\'ěsí do skleněného elektrolyzéru o obsahu 6 o konstantní teplotě. Prostřednictvím platinových elektrod na dně a v horní části se působí elektrickými stimuly 0,1 Hz, 0,5 ms a 80 až 90 V a vzniklé kontrakce se zaznamenávají přes měnič. Po umístění vzorku do elektrolyzéru se stupen kontrakce kontroluje jako odezva na množství použitého vzorku. Této kontroly kontrakce se používá pro stanovení opiátové aktivity.

Způsob popsal H. W. Koaterlitz, A. A. Waterfield v Annu. Rev. Pharmacol. 15, 29 /1975/

В/ Způsob, při kterém se používá myší semenovodné cévy

Dospělý sameček myši se nechá vykrvácet useknutím hlavičky a bezprostředně po laparotomii se vyjme semenovodná céva. Sperma vyplňující semenovodnou cévou se vytlačí pinser tou a pravý i levý konec semenovodné cévy se sváže nití za vzniku prstence. Tento prstenec se vloží do elektrostimuločního aparátu podobného jako pro zkoušku А/ a elektricky se stimuluje za podmínky 0,1 Hz, 1 ms a 90 V. Podobně jako v případě podélného řezu svalu ilea morčete se řídí kontrakce elektrickým stimulem v míře odpovídající množství použitého vzorku. Toto řízení kontrakce se používá ke stanovení opiátové účinnosti.

Tento zkušební způsob je popsán H. W. Hughesem, H, W. Kosterlitzem a F. M. Lesliem v Sr. J. Pharmacol. 53_. 371 /1975/.

Možná opiátová účinnost se může vyjadřovat jako IC^q /nmol/, což je koncentrace nutná ke snížení kontrakce elektrickým stimulem na 50 % a tedy se při způsobech А/ а В/ stanovuje IC^_Q.

3/ Výsledky

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1

T a b u 1 к a 1

Způsob vzorek	A	В
Morfin	105 - 25 /15/'	220 - 40 /9/
Látka podle vynálezu	0,55 - 0,15 /6/	6,6 - 2,4 /6/

V tabulce 1 znamenají čísla hodnoty ΙΟ^θ /nmol/ a čísla v závorkách znamenají počet vzorků.

Tabulka 1 dokládá, že látky podle vynálezu inhibují kontrakci podélných svalů ilea morčete navozené elektrickým stimulem, přičemž je jejich účinnost přibližně 15Okřát vyšší než moťfinu a že látka podle vynálezu inhibuje kontrakci myší semenovodné cévy navozenou elektrickým stimulem, přičemž je její účinek přibližně 30krát vyšší než morfinu.

Vynález blíže objasňuje příklad praktického provedení:

Vesoaktivní integtinální peptidová frokce, získaná z dvanáctníku vepře /v možství 1 kg získaná z 20 000 vepřů/ ' se vede . CM^celulozovou kolonou o průměru 30 cm . a dál.ce 70 cm, dostatečně se promne /4 l/h/20 sskl roztokem fosfátového pufru. a eluuje se roztokem natriumfosfátového pufru .majícím gradient od 20 sM, hodnoty pH 10/140 1/ do

I⁰⁰ mM, ^hodnoty pH ^12/140 1,/. Aktivní ^frakce se shromažďují . za an^yzov^ní biologickou zkouškou podle způsobu A.

Potom se účinná frakce vysolí . nasycením solí a po rozdělení na dva podíly se provede odsolení průchodem. Uephadex G 25 kolonou /21,5 cm x 8¹ cm/ a provede se sušení vymřažováoím /58 g/.

Pak se účinná frakce CIMSuphadexovou kolonou /3,5 cm x 90 cm^ předem dostatečně pufrovanou 20 mM roztokem fosfátového pufru o hodnotě pH 10, promyje se týmž·pufrovacím roztokem a pIuuJp se /107 ml/h, 15 g/frakce/ roztokem na tri umí fosfátového pufru - o· lineárním koncentračním · gradientu od ·20 mM, hodnota pH 10/3 1/ do 100 mM, hodnota pH 12 /3 1/. Za · sledování změn, účionooti shora uvedenou biologickou zkouškou se účinná frakce shromáždí a vysolí se solí /20 g/. Vysolená frakce se rozdělí na čtyři podíly a· každý podíl se vede kolonou Bio Gelu P6 /3 . cm x 100 cm/· První frakce se eluuje 100 mM roztokem hydrogennhličitanu sodného a účinná frakce se získá vymrazovacím sušením a potom se podobně vede Bio Gel P 6 kolonou /2,4 cm x 87 cm^/ za pouustí 100 tsM roztoku kyseliny octové; ?00 mM roztokem hydrogθnnhliδitanu amonného se el^je účinná frakce majjcí svůj pík překrytý pikem soli, zatímco 100 mM roztokem kyseliny octové se eluuje účinná látka odděleně od píku soli.

Oddálená účinná frakce se suší vymrazováoím a rozpuutí se v ¹ tó. roztoku, připraveného smíšením směsi acetoontrilu a vody v poměru 1:9 s 0,065% (objem/objcc) trill^L^oroctové kyseliny a Čistí se vysokotlakou kapalinovou chromatoggaaií β reverzní fází za pouužtí Nuuceesil 0 18 kolony /4,6 mm x 500 mm V tomto případě se jako rozpouutě(d.ováho systému použije roztoku připraveného smíšením směsi acetonnírilu a vody s 0,065% (objem/objem) trifunoroctové kyseliny. Tento roztok má acetonitrilový koncentrační gradient · od 20 do 40 % a vede se sloupcem rychLos-trí 2 ml/min.

Účinná frakce se koncentruje a vyluhuje v blízkost! frakce odpooídaáící acetorOtrilové koncentraci 30 % Frakce se suší vymrazováoím, podrobuje se vysokotlaké kapalinové chrornaaooraafi s reverzní fází za stejných podmínek a nakonec se podrobuje vysokotlaké kapalinové chromatooraffi a reverzní fází za pomstí Niull^c^os.iL FenyXového sloupce /4,6 mm x 250 Jakožto íyvíjplílo roso<o^;ιhtědla se p^v^S^ž.je roztoku připraveného smíšením 30% vodného acetonitrioového roztoku s 0,065% (objem/objem) Ori:Lhuoroltoíé kyseliny a tento roztok se vede sloupcem ryHostí 1 mX/mio. Účinný podíl odpooídajjcí píku . optické absorpce p^i 280 nm a 225 nm se Huuje symeeгilky·

Produkovaná látka ae převádí na odpooídaaící dao plovaný derivát běžným způsobem k potvrzení její čistoty. Výtěžek je 15 orno... Utruktura získané látky se stanoví anályti^ými způsoby p^ooaanými v . oá81eduhílílh odstavcích ¹ až 4.

¹. Amincly salinové složení

Peptid ^/2 omooy/ se tydrolyzuje při ¹¹⁰ °C ^po dobu ^{24 h}o^dio v 20 /u! ^^-meřkaptoeOhaoshlfoooíé kyseliny a· zkoumá se jeho amino0tзaPinové složení aoáLyzáto»em ' ' pro km.i00kβaPinУ· Zjištěno, že peptid sestává ze 17 almio0k8aein, a to 2 Asp, ¹ Glu, ' 2 Gly, 1 ProX, 1 Не, 2 Leu, ¹ Иге, 1 Tyr, 2 lys, 3 Arg a 1 Trp. '

2. Stanovení N-koncových aminokyselin

Peptid /1. ornao/ se rozpuusí v 50 yil 0,5 N roztoku . hydrogenohllδitaou sodného, smísí se a 50yiX acetonového roztoku, obsah^ícího ¹ mg/m. . daneylchXoridu a neché se stát přes noc. Den sylováný peptid se vyvine «liageOvou Ciroraat.ografií v tenké vrstvě za pooŽVtí. systému n-BnOH-AcOH-voda v poměru 4:1:5. Skvrna dansylovsného peptidu /ψ=0,3 až 0,4/ · . se ·vyřadí a eluuje se směsí Fmthhiaikohol.u, AcOjH, pyridinu a vody v poměru ' 11:1:1. Po /koncentrování a odpiaření k suchu se v hydrolytické trubce pepi^ hydrolyzuje •použitím ¹0°/u3L ⁶ N cKLorovoďíkOvó’kysel!n^y p*i teplotě Ю5 °^{C p}o dobu 16 hodin. ^po oddestilování chlorovodíkové kyseliny se hydrolyzát -extrahuje 1 00/ul vodou nasyceného ethylacetátu.' Nerozpustný ^podíl se odstřs^ďí a kapt&ini* n&^d Oiístředěným .podílem se analyzujte v^ys^okotlukou kapalinovou c^^iroram^oo^^g^-^ífíi.- Za použití NíuccosSI C 18 sloupce /4,6 mm x 250 mim Jako výsledek se tďsntifilшjs r -.DNSlysirt a Ο_эΝ1ďl“DNSt^yгltt.t; N-Koncovou sm.nok^y8sSLtnou je tedy tyr^osln.

3. Potvrzení struktury trypsinového hydrolyzátů .

Peopid /5 nrnolu/ se rozpust,! ve 100/ul ·děstii^ované vody Do roztoku se přidá 10 yil/OL trypsinu a 1 !> /л1 0,1 M roztoku fosfátového pufru, hodnota pH 7,6 a vzniklý roztok se podrobí enzymaHcká hydrolýze při teplotě .37 °C po ^1,5 hodin. Hádolyzát se pak podrobí separování za puožití vysokotlaké kapalinové chromaltlgr:lie za použití Nucleoosi· C 18 sloupce /4,6 mm x 250 mm/’ a 0,065$ vodného roztoku triCoolcclové kyseliny lb8alhCílí l¢lSolitril v konceetraci lineárně vzrйstalílí od · 10 ·do 60 %, čímž se získá 5 fragmentů. Provádí sa arnaLýza každého fragmentu se zřetelem na aminnlkУsSiny, stanovení N-koncových amintky8tSin a stanovení sledu alllínolkяsein Edmanovým odbouráním. Ve fngmentech zjištěn tento sled amino0yзs:sin:

Fragment !·

Fragment. II:

Fragment III:

Fragment IV:

Fragment V:

II e-A-cg-Pro-Lys

Arg-Ile-Arg-Pro-Lys

LeueLy s- Trp-iAsp- AA^x Glx/ lýn-Clyr- C-H^pPIis—T-eui Arg-Arg Lyr- Oly-Gly-Pha-Leu- Arg.

Struktury fragmentů I, II, IV a V jsou potvrzeny jejich tdsntifikllí podle jejich syntetických standardních vzorků. Edí-maiovo odbourání je například ·popsáno v pu^ikni Met-hods in Enzyrnooogy, svazek XLVI, Sást E, str. · 335, vydané · C. H. W Hrsem a S, N. Τ^ι31ή*1^/, 1977, Academie Press, New York. '

4. Stanovení sekvence C-koneových . aminokyselin

Peptid /1 nmóo/. spolu a 1 jag karbo:xypeptidázy A ee inkubuje v 150/ul · 0,1 M roztoku amiot.umicctátkvého pufru, hodnota pH 8,0, při teplotě 33 °C У odbourání peptidu. Po dvou a .. 16 hodinách . se odejme u ·50 /Ш. .vzorky a analyzují se zřetelem oa uvolněné Сйипоку seli ny analyzátorem pro á^ii^c^oyy€^]^:iny za použití biologického fluidního sloupce. ·Do zbylého /50 /uX/ roztoku se přidá 1 /ug karbooxrppptidázy k ukončení . odbourání a hydr>lyzuje se dále po dobu 24 Jodin· Po 24 hodinách se veěkerý roztok vstřikuje do analyzátoru »iino0yselln a kvantitativně se stěnové’ volné aiint0·kselioy. Zjištěno, že C-koncovou aminoky8elinou je Gin . a že předposlední alninokkзelinou je Asp nebo Asn, to znamená · že C-»koncové Část jeAsp-Asn-Gln nebo -Asn-Asp-Gln· Z výsledků Edrngďiova odbourání fragmentu III hydrolyzovaného trypsinem. vyplývá, že třetí aminokyselioou od · C-konce je Asp. . Proto a^ir^c^ok^fl^c^li^nový sled C-koncové části, fragmentu III je .-Asp-Asn-Gln.

Z. výsledků enalýz 1 až 4 vyplývá tento sled amintkyyelin peptidu: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Il-AA.rg-Pro-Ly--Leu-Ly--Trp-Aep-Asn-Gln. .

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

V· Způsob přípravy heptadekapeptidu primární struktury Týr-Gly-Giy-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln s účinností endogenních opiátových látek, vyznačený tím, že se extrahuje dvanáctník a získaný extrakt se čistí·
2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se extrahuje dvanáctník vepře·
3· Způsob podle bodu 1 až 2, vyznačený tím, že se extrakt čistí chromatografií na karboxymethylcelulóze a/hebo gelovou filtrací na zesítěném dextrinu s nízkým stupněm zesítění a/nebo na karboxymethyletheru uvedeného dextrinu, dále se čistí vysolováním účinné frakce, gelovou filtrací za použití polyakrylamidového gelu a popřípadě se čistí opakovanou lyofilizací účinné frakce, a vysokotlakou kapalinovou chromatografií s reverzní fází.