SE439544B - Forfarande och anordning for bestemning av en bestandsdel i ett medium - Google Patents

Description

fvsoueso-o 10 15 20 D25 30 35 2. _ Föreliggande uppfinning syftar till att öka käns- ligheten hos.kromatografiska system genom att upphäva (el- iler kompensera) den av bärvätskan betingade ändringen av transmissiviteten. Denna kompensation kan åstadkommas ¿optiskt eller elektroniskt.

Uppfinningen avser en apparat och ett förfarande för bestämning av koncentrationen av en beståndsdel i ett prov. En optisk mätning görs med ljus, som går genom en kromatografisk kolonn och den fraktion av provet som in- nehåller den för mätning avsedda beståndsdelen. Den op- tiska mätningen kompenseras genom upphävande av de optiska effekter, som betingas av den i_kolonnen befintliga bär- vätskans brytningsindex. Kompensationen kan ernås på två sätt. 7 7 (a) Det ljus som skall mätas upptas i en föreskri- ven vinkel mot den riktade ljusstrålen, varvid denna vin- kel har samband med bärvätskans verkan på kolonnens effek- tiva brytningsindex. Denna föreskrivna vinkel kan bestäm- mas empiriskt, så att den ökade transmissiviteten kompen- seras (eller upphävs) av en skingrad (spridd) komponent av det genom kolonnen gående ljuset. I (b) Ljuset mäts på två ställen omkring kolonnen, så att man får två ljusmätvärdeni Den ena mätningen görs lämpligen längs den optiska axeln, och den andra mätning- en.görs lämpligen utanför den optiska axeln, t.ex. 900 från den optiska axeln, Den första mätningen inbegriper bärvätskans brytningsverkan, och den andra mätningen inbe- griper ett kvantum av det av kolonnen spridda ljuset. De 1 båda mätningarna förstärks på sådant sätt, att vid elek- tronisk summering det spridda ljuset upphäver bärvätskans brytningseffekt.

Uppfinningen syftar till att skapa en förbättrad apparat och ett förbättrat förfarande för bestämning av koncentrationen av en beståndsdel i ett prov. Uppfinning- en syftar också till att skapa ett förfarande och en apparat för ökning av ett optiskt mätsystems känslighet.

Uppfinningen syftar dessutom till att skapa ett förfarande 10 15 20 25 30 35 7904930-0 3 och en apparat för bestämning av spår av en beståndsdel i ett kromatografiskt system. Vidare syftar uppfinningen till att skapa en kromatografisk och optisk apparat för analys, i vilken av bärvätskan betingade förändringar av kolonnens brytningsindex kompenseras.

Uppfinningen beskrivs närmare i samband med bi- fogade ritningar.

Figur 1 är en schematisk planvy av en apparat en- ligt uppfinningen.

Figur 1a är en schematisk sidovy av en del av den i figur 1 visade apparaten.

Figur 2 är en schematisk planvy av en andra utfö- ringsform av apparaten enligt uppfinningen.

Figur 3 är ett diagram över elektriska mätningar och återger verkan av lösningsmedlet pä det genom kolonnen i figur 1 gående ljuset.

Figur 4 är ett diagram över absorptionen som funk- tion av koncentrationen av hemoglobin i en lösning.

Generellt avser uppfinningen en apparat och ett förfarande för bestämning av koncentrationen av en be- ståndsdel i ett prov, i synnerhet när denna beståndsdel föreligger endast i spårmängder.I figur la visas en kro- matografisk kolonn 10, vilken innehåller exempelvis ett gel 1Ûa med ett givet brytningsindex. Ett prov som skall analyseras införs i kolonnen 10, såsom visas med en pil 11. Provet fraktioneras i kolonnen 10, så.at flera band eller fraktioner 12 fördelas längs kolonnen. Provet bärs av ett lösningsmedel, som pumpas genom gelpelaren medelst en pump 13.En stråle 1% av ljus med känd våglängd riktas genom kolonnen 10 och en vald fraktion 12, och det genom- gående ljuset leds genom ett samlingslinssystem 18, ett optiskt filter 22 och en fältbländare 22a till en detektor 16. Detektorns utsignal anger koncentrationen av den spe- ciella beståndsdel som skall bestämmas, såsom beskrivs närmare i det följande.

Som visas i figur 1, riktas strålen 1% genom kolon- nen 10 enligt figur la. Strålen 14 avges av en väsentligen 10 15 20 25 30 35 7904930-om 4 _ kollimerad ljuskälla 15 och har ett rektangulärt tvärsnitt, som bestäms av en aperturbländare 15a. Två fotodetektorer 16 och 17 är anbragta vid kolonnen 10 för mätnínm av det genom kolonnen gående ljuset. Fotodutektorn 16 är an- bragt på den optiska axeln 25 för att detektera genomsläppt ljus, och fotodetektorn 17 är anbragt i rät vinkel mot den optiska axeln 25 för att detektera spritt ljus. De _ båda linserna 18 koncentrerar ljuset mot detektorn 16 ge- nom den rektangulära fältbländaren 22a, Fïltret 2? är vall så, att det släpper genom ljus_till detektorn 16 med en våglängd, som ger maximal absorbans för den speciella be- ståndsdel i fraktionen 12, som skall bestämmas. Detektorn 16 mäter transmissiviteten av det ljus, som går rätt ge- nom kolonnen 1D. Detektorns 16 utsignal leds till en för- stärkare 19 med förstärkningen kl. Detektorn 17 mäter det av kolonnen 10 spridda ljuset. En bländare 24 riktar lju- set mot ett filter 23, som är ägnat att genomsläppa ljus vid en våglängd med minimal absorbans hos den speciella fraktionen. Detta ger ett mått på det spridda ljuset, som är en funktion enbart av bärvätskan. Detektorns 17 ut- signal leds till en förstärkare 20 med förstärkningen k2.

Förstärkarens 19 och 20 utsignaler leds till en summer- ande förstärkare 21. I _ Enligt teknikens ståndpunkt använder man en enda detektor, såsom detektorn 16, föratt mäta den under analys varande fraktionens 12 ljusabsorbans. Föreliggande uppfin- ning bygger emellertid på insikten, att eluenten (bärvät- skan) i provet ändrar avläsningen av ljusabsorbansen, enär den framkallar en ändring av kolonnens 10 effektiva brytningsindex. Detta beror pä att eluenten förtränger gellösningen, vari gelpartiklarna är suspenderade. Kolon- nens effektiva brytningsindex betingas därför i själva verket av både gelmaterialet och provets bärvätska. En- ligt uppfinningen använder man därför i ell ullñwandv lvü detektorer 16 och 17 för att kompensera den av olucnten bo- tingade ändringen av ljusabsorbansen. Det har insetts, att varje av eluenten betingad ökning av ljusgenomgàngen genom 10 15 20 25 30 35 v9o49so~o 5 gelet även medför en motsvarande minskning av mängden spritt (diffust) ljus.

Genom att mäta både det genomgående ljuset och det spridda ljuset och summera signalerna elektroniskt kan man upphäva den av eluenten betingade ökningen av mängden genomgående ljus med hjälp av den likaledes av eluenten betingade minskningen av mängden spritt ljus. Sålunda kan man enligt uppfinningen omintetgöra de ljuseffekter som inverkar på bestämningen av koncentrationen av den ana- lyserade fraktionen 12. Metoden är användbar (med lämp- ligt val av filtren 22 och 23) för mätning av koncentra- tionen i vilken som helst av de separata fraktionerna 12 i kolonnen 10. Det inses, att filtren 22 och 23 kan utby- tas i fas med provfraktionernas passage genom kolonnen 10, så att valda beståndsdelar i en eller flera fraktioner kan bestämmas i följd.

Vid undersökning av exempelvis plasma för bestäm- ning av spârmängder av lyserat hemoglobin kan man som gelmaterial använda "Sepharose HBCL", suspenderad i fos- fatbuffrad saltlösning, tillverkad av Pharmacia, Plscata- way, New Jersey, U.S.A.

Graden av spridning och/eller genomsläppning av ljuset beror på förhållandet mellan gelmaterialets eller partiklarnas och provbärvätskans brytningsindex. Gelet i kolonnen består generellt av partiklar suspenderade i en vätska. För analys av helblod väljer man som vätska för "Sepharose“ normalt en buffrad 0,9-procentig saltlös- ning med brytningsindex 1,335. Blodplasmans brytningsin- dex är 1,3H9. Blodplasmans index varierar något för olika blodprov, men dessa variationer inverkar inte allvarligt på analysen. Plasman i blodprovet förtränger gelets salt- lösning, när provet vandrar genom kolonnen 10, ooh ändrar gelets effektiva brytningsindex.

Eftersom den totala mängden ljusenergi är konstant, innebär varje minskning av ljusspridningen, att mängden genom gelet gående ljus ökar. Figur 3 åskådliggör detta fenomen. Kurvan "a" återger utspänníngen från förstärkaren _., .ff-hawk _ _ svsoassu-o 10 15 20 25 30 35 5 19 och visar en ökning AVT av det genom plasman gående ljuset, mätt medelst detektorn 16 (figur 1). Kurvan-"b" återger utspänningen från förstärkaren 20 och visar en minskning AVS av mängden spritt ljus VS, mätt samtidigt med detektorn 17 (figur 1). _ Om man väljer förstärkarnas 19 och 20 förstärkningar ki och kg K 21 utspänning V0 lika med noll. Ytterligare ändringar i av- läsningarna beror helt och hållet på det i fraktionen 12 så, att AVT blir lika med AVG, blir summerarens förekommande hemoglobinet.

Det av bärvätskan (plasman) betingade bidraget till 'förändringarna av VT elimineras i huvudsak, så att små spårmängder hemoglobin i fraktionen 12 kan mätas.

Resultaten av denna kompensationsteknik belyses av diagrammet i figur 4. I det till grund för diagrammet lig- gande försöket användes en plasmasubstitut "Pluronic F-68" tillverkat av BASF Wyandotte, Wyandotte, Mich., U.S.A. för inställning av en saltlösnings brytningsindex till blodplasmans (1,349). Detta plasmasubstitut blandades med kända mängder hemoglobin, och blandningen leddes ge- rnom en kolonn 10 innehållande ovannämnda "Sepharose"-gel i saltlösning. Både kompenserade och okompenserade värden I upptogs- Dessutom blandades kända mängder hemoglobin med saltlösning för jämförelse av dessa hemoglobínavtäsningar É med de kompenserade hemoglobinavläsningarna. I -Som framgår av diagrammet i figur H, stämmer de kompenserade hemoglobinvärdena (övre heldragna linjen) väl överens, inom ramen för det statistiska fclli, med de för saltlösningen upptagna värdena (bruten linje).

Därav framgår, att den av bärvälskun (plasman) hfllingudn ändringen av kolonnens effektivn_hrytníngsindvx har upp- hävts.

Den undre heldragna linjen i figur H visar däremot lägre värden för hemoglobin, när ingen kompensation av de av plasmaeluenten betingade ändringarna av kolonnens effektiva brytningsindex har förekommit.

Ehuru uppfinningen ovan beslovivits: i nanlband med 10 15 20 25 30 790l+930~Û 7 en specifik beståndsdel av helblod, är de angivna princip- erna givetvis tillämpliga på många provmaterial, såväl fasta och flytande som gasformiga. Exempelvis kan den an- givna metoden tillämpas för bestämning av mängden fosfat i tvättmedel. Ett godtyckligt antal olika analyser på spårmängder av material i ett prov kan utföras med den ovan beskrivna metoden.

En andra utföringsform av uppfinningen visas i figur 2. För enkelhets skull används samma hänvisníngsbe- teckningar som i figur 1 för liknande element.

I apparaten enligt figur 2 ingår en enda detektor 16. I detta utförande annulleras ökningen AVT av ljus- genomgången och minskningen AVS av ljusspridningen på optisk väg. Detta ernås genom att det genom kolonnen 10 gående ljuset mäts i en föreskriven vinkel G mot den ingå- ende strålen 14. Denna vinkel 6 bestäms empiriskt för var- je kombination av bärvätska och gel, och i samband med plasma är den 1450. I denna vinkel blir AVT lika med AVS.

Vare sig ljustransmissionen kompenseras elektro- niskt, såsom enligt figur 1, eller optiskt, såsom enligt figur 2, är utspänningen V0 i varje system helt och hållet en funktion av koncentrationen av den avsedda bestândsdelen i fraktionen 12. Ljusgenomgången kan mätas såsom absorbans eller transmittans av det genomgående ljuset på välkänt sätt.

I vissa fall använder man inte en kromatografisk kolonn för fraktionering av provet, utan i stället andra medier, såsom skivgelselektrofores, diffusionsmntoder el- ler andra gelmetoder.

Claims (10)

79a49z@~ø å 10 20 25 30 ads ~beståndsdel i ett medium, k ä n n e t e c k n a L PAÉENTKRAV

1. Förfarande för bestämning av koncentrationen av en av att *man (a) leder ett medium innehållande en beståndsdel, som skall bestämmas, längs en kromatografisk kolonn med ett effektivt brytningsindex, varvid mediet ändrar Lwlonuuns effektiva brytningsindex när det gär genom den kvomato- grafiska kolonnen, (b) riktar en ljusstråle längs en op- tisk axel och genom det längs den kromatografiska kolon- nen gående mediet, (c) detekterar ljusstrålen för alstrinß av en utsignal, och (d) kompenserar utsignalen för änd- ringar i kolonnens effektiva brytningsindex, så att don kompenserade utsignalen indikerar koncentrationen av be- beståndsdelen i mediet.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k- n a t av att kompenseringen sker genom att ljusstrålen mäts i föreskriven vinkel mot den optiska axeln.

3. § Pörfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k- n a t av att kompenseringen sker genom attman detekterar iljusstrålen i två skilda positioner med avseende på den optiska axeln,så att manfår två skilda ljusmätningar och därmed två skilda utsignaler, samt summerar de båda ut- signalerna för att kompensera förändringar i kolonnens effektiva brytningsindex.

4. KFörfarande_enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k- n a t av att mediet innehåller flera beståndSdelar.och att man fraktionerar mediet för att få lera band, när mediet bringas att passera längs den kromatografiska kolonnen, 7 varvid banden i följd passerar genom den optiska axeln.

5. Pörfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e't e e k- n a t pav att den kromatografiska kolonnen innehåller ett opalescent gel för fraktionering av mediet.

6. Apparat för bestämning av koncentrationen av en beståndsdel i ett prov, k ä n n e t e c k n a t av en kromatografisk kolonn (10) med ett effektivt brytningsindex inrättad för fraktionering av provet för erhållande av en be- 10 15 20 25 30 7904930-*0 9 ståndsdelen innehållande fraktion, en optisk mätanordning (16, 17) för erhållande av ett mätt pä beständsdelens kon- centration som funktion av genom fraktionen gående ljus, en kompensationsanordning (19, 20, ?1) för kompensering av mättet för att i huvudsak upphäva varje inverkan på mät- ningen, som betingas av förändring av kolonnens effektiva brytningsindex under mätningen av koncentrationen av ne- ståndsdelen.

7. Apparat enligt patentkravet 6, k ä n n e t e 0 k- n a d av att den optiska mätanordningen innefattar en ljuskälla (15), organ (18) för att leda ljuset längs en optjxt axel (25) och genom den kromatografiska kolonnen (10), en första fotodetektor (16) anordnad för detekterinn av genom fraktionen gående ljus och en andra fotodetektor (17) anordnad i relation till den första fotodetektorn (16).

8. Apparat enligt patentkravet 7, k ä n n c t o c k- n a d av att den första fotodetektorn (16) är anordnad i huvudsak längs den optiska axeln (25) för detekteríng av genom kolonnen (10) gående ljus och den andra detektorn (17) är anordnad i huvudsak i rät vinkel mot den optiska axeln (?5) för detektering av ljus som sprids av kolonnen (10).

9. Apparat enligt patentkravet 8, k ä n n e t e c k- n a d av att kompenseringsanordningen innefattar en till den första fotodetektorn (16) ansluten förstärkare (19), en till den andra fotodetektorn (17) ansluten förstärkare (20) och en summerande förstärkare (21) för mottagning av ut- signaler från båda förstärkarna (19, 20), varvid åtminstone den ena av de båda förstärkarna (19, 20) har en förstärkning inställd för upphävande av verkan på mätningen.

10. n a d av att den optiska mätanordníngen innefattar en Apparat enligt patentkravot 6, k ä n n e L n c t- ljuskätla (15), organ (18) för ledande av ljus längs en oplj t axel (25) genom den kromatografiska kolonnen (10) och en fotodetektor (16) för detektering av genom kolonnen gående ljus och att kompenseringsanortlrlingen ínnvífal Inz- nu-dnl Išír- anbringando av fotodetektorn (16)í föreskriven vinkel mot den optiska axeln.