RU95114530A

RU95114530A - Природный или синтетический ингибитор тромбина, днк, вектор, клетка, способ получения протеинов, способ очистки, лекарственное средство, фармацевтическая композиция, способ получения лекарственного средства

Info

Publication number: RU95114530A
Application number: RU95114530/13A
Authority: RU
Inventors: Неске-Юнгблут Кристиане; Шлойнинг Вольф-Дитер; Алагон Алехандро; Поссани Лоуриваль; Куэвас-Агирре Делиа; Доннер Петер; Хэндлер Бернард; Хехлер Ульрике
Original assignee: Шеринг Аг
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1993-12-03
Publication date: 1997-07-20

Claims

1. Природный или синтетический протеин-ингибитор тромбина, выделяемый из слюны кровесосущих млекопитающих, а) который в качестве активного протеина содержит следующую N-концевую последовательность: Ala-Gln-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Len-Gln-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-G- ln-Gln-Phe-Phe-; или б) который в качестве активного протеина имеет аллельные модификации указанной в а) N-концевой аминокислотной последовательности, причем одна или две аминокислоты N-концевой аминокислотной последовательности замещены, подвергнуты делеции или инсерции, не влияя при этом существенно на активность активного протеина; или в) который в качестве активного протеина включает посттрансляционные модификации N-концевых последовательностей по а) и б), которые существенно не влияют на активность активного протеина.

2. Протеин, который является ингибитором тромбина и г) который в качестве зрелого протеина имеет одну из следующих последовательсностей: I) идентифицированная последовательность N 1 (последовательность Протокола N 1), II) идентифицированная последовательность N 2 (последовательность Протокола N 2), Ш) идентифицированная последовательность N 3 (последовательность Протокола N 3) и IV)идентифицированная последовательность N 4 (последовательность Протокола N 4); или д) который в качестве активного зрелого протеина имеет аллельные модификации одной из указанных в г) аминокислотных последовательностей, причем по крайней мере одна аминокислота аминокислотной последовательности замещена, подвергнута делеции или инсерции, не влияя при этом существенно на активность активного протеина или е) который в качестве активного зрелого протеина включает посттрансляционные модификации одной из последовательностей по г) и д), которые существенно не влияют на активность активного протеина.

3. Протеин, состоящий из сигнальной последовательности и зрелого протеина по любому из пп. 1 и 2, ж) причем протеин включает одну из следующих последовательностей: I) идентифицированная последовательность N 5 (последовательность Протокола N 5) II) идентифицированная последовательность N 6 (последовательность Протокола N 6), III) идентифицированная последовательность N 7 (последовательность Протокола N 7) и IV) идентифицированная последовательность N 8 (последовательность Протокола N 8); или з) причем протеин включает аллельные модификации одной из указанных в ж) аминокислотных последовательностей, причем по крайней мере одна аминокислота аминокислотной последовательности замещена, подвергнута делеции или инсерции, существенно не влияя при этом на активность зрелого активного протеина, или и) причем протеин включает посттрансляционные модификации одной из последовательностей ж) и з), которые существенно не влияют на активность активного зрелого протеина.

4. Протеин по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что протеином является рекомбинантный протеин.

5. Протеин по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что он гликозилирован.

6. кДНК или ДНК, которая кодирует зрелый ингибитор тромбина, аа) причем кДНК или ДНК кодирует одну из следующих аминокислотных последовательностей: I) идентифицированная последовательность N 1 (последовательность Протокола N 1), II) идентифицированная последовательность N 2 (последовательность Протокола N 2), III) идентифицированная последовательность N 3 (последовательность Протокола N 3) и IV) идентифицированная последовательность N 4 (последовательность Протокола N 4); или бб) причем кДНК или ДНК кодирует аллельные модификации одной из аминокислотных последовательностей аа), причем по крайней мере одна аминокислота аминокислотной последовательности замещена, подвергнута делеции или инсерции, не влияя при этом существенно на активность активного протеина.

7. кДНК или ДНК, которая кодирует ингибитор тромбина, вв) причем кДНК или ДНК содержит одну из следующих нуклеотидных последовательностей: I) идентифицированная последовательность N 9 (последовательность Протокола N 9), II) идентифицированная последовательность N 10 (последовательность Протокола N 10), III) идентифицированная последовательность N 11 (последовательность Протокола N 11), и IV) идентифицированная последовательность N 12 (последовательность Протокола N 12); или гг) причем кДНК или ДНК включает аллельную модификацию одной из нуклеотидных последовательностей вв), причем по крайней мере один нуклеотид замещен, подвергнут делеции или инсерции, не влияя при этом существенно на активность протеина, который кодируется аллельной модификацией нуклеотидной последовательности вв).

8. кДНК или ДНК, которая кодирует ингибитор тромбина с сигнальной последовательностью, дд) причем кДНК или ДНК содержит одну из следующих нуклеоидных последовательностей: I) идентифицированная последовательность N 13 (последовательность Протокола N 13), II) идентифицированная последовательность N 14 (последовательность Протокола N 14) , III) идентифицированная последовательность N 15 (последовательность Протокола N 15), и IV) идентифицированная последовательность N 16 (последовательность Протокола N 16); или ее) причем кДНК или ДНК содержит аллельную модификацию одной из нуклеотидных последовательностей дд)., причем по крайней мере один нуклеотид замещен, подвергнут делеции или инсерции, существенно не влияя при этом на активность зрелого протеина, который, включая его сигнальную последовательность, кодируется аллельной модификацией нуклеотидной последовательности дд).

9. Вектор, который содержит кДНК или ДНК по любому из пп. 6 - 8, далее, пригодный промотор и в случае необходимости пригодный энхангер.

10. Эукариотная или прокариотная клетка-хозяин, которая трансформирована с помощью вектора по п. 9.

11. Способ получения протеинов по любому из пп. 1 - 5, включающий следующие стадии: культивирование клетки-хозяина, которая трансформирована с помощью вектора, который содержит кДНК или ДНК по любому из пп. 6 - 8, и протеины выделяют и очищают.

12. Способ очистки протеинов по любому из пп 1 - 5, отличающийся тем, что протеины выделяют, очищают по крайней мере с помощью одной колонки и затем концентрируют.

13. Способ очистки протеинов по любому из пп. 1 - 5 и 11 - 12, отличающийся тем, что он состоит из следующих стадий: нанесение слюны на "Snperose 12 HR-колонку" и элюирование, новое нанесение на содержащуюся в колонке СН-активированную сефарозу, с которой ранее соединяют тромбин, и элюирование.

14. Один из протеинов или их смесь по любому из пп 1 - 5 и 11 - 13 в качестве фармацевтического биологически активного вещества.

15. Лекарственное средство, которое содержит один из протеинов или их смесь по любому из пп. 1 - 5 и 11 - 13.

16. Фармацевтическая композиция, которая содержит один из протеинов или их смесь по любому из пп. 1 - 5 или 11 - 13, в присутствии фармацевтически совместимых и приемлемых соединений и носителей.

17. Способ получения лекарственного средства для лечения тромбозов, или нестабильной ангины, или артериосклероза, или для предохранения от повторной закупорки сосудов после РТСА/РТА, или для предотвращения свертывания крови при гемодиализе, отличающийся тем, что применяют один из протеинов или их смеси по пп. 1 - 5 и 11 - 13.