RU2768031C1 - Способ выделения полидезоксирибонуклеотида высокой чистоты из семенников лосося - Google Patents

Способ выделения полидезоксирибонуклеотида высокой чистоты из семенников лосося Download PDF

Info

Publication number
RU2768031C1
RU2768031C1 RU2021125948A RU2021125948A RU2768031C1 RU 2768031 C1 RU2768031 C1 RU 2768031C1 RU 2021125948 A RU2021125948 A RU 2021125948A RU 2021125948 A RU2021125948 A RU 2021125948A RU 2768031 C1 RU2768031 C1 RU 2768031C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sperm
pdrn
testes
salmon
hcg
Prior art date
Application number
RU2021125948A
Other languages
English (en)
Inventor
О Нам КВОН
Тэ-хён КИМ
Сун-хи КИМ
Original Assignee
Био Меди фарм Ко. Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Био Меди фарм Ко. Лтд. filed Critical Био Меди фарм Ко. Лтд.
Application granted granted Critical
Publication of RU2768031C1 publication Critical patent/RU2768031C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/987—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of species other than mammals or birds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/31—Pituitary sex hormones, e.g. follicle-stimulating hormone [FSH], luteinising hormone [LH]; Chorionic gonadotropins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и биохимии. Предложен способ выделения полидезоксирибонуклеотида PDRN из семенников лосося, включающий выделение спермы и незрелых участков семенников лососевой рыбы, измельчение незрелых участков семенников с последующим разведением искусственной семенной плазмой, обработкой хорионическим гонадотропином человека hCG и центрифугированием, сбор потенциально подвижных спермиев и выделение PDRN из собранных спермиев. Изобретение обеспечивает получение PDRN более высокой чистоты из подвижных спермиев, полученных искусственным путем в семенниках свежей лососевой рыбы. 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл., 3 пр.

Description

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу выделения полидезоксирибонуклеотида (PDRN) высокой чистоты из семенников лосося, и, более конкретно, к способу выделения PDRN высокой чистоты путем гормональной обработки незрелых семенников, которые в настоящее время используют в других применениях.
2. ОПИСАНИЕ БЛИЖАЙШЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Полидезоксирибонуклеотид (PDRN) присутствует в активных веществах для регенерации ткани (анагенез) у живых организмов. PDRN представляет собой смесь образующих цепь дезоксирибонуклеотидных полимеров, состоящих из от 50 до 2000 пар оснований. PDRN является активатором клеточного роста, имеющим особые эффекты в отношении регенерации тканей в организме человека, таких как связки, сухожилия и кожа, и облегчения воспаления.
В человеческой плаценте присутствует только очень небольшое количество PDRN. С PDRN связаны этические вопросы, а его получение для фармацевтики сопряжено с трудностями. По этим причинам в качестве альтернативы человеческому PDRN был предложен PDRN рыб. Сперма и семенники форели и лосося богаты нуклеиновыми кислотами, однако более важное значение имеет их качественное превосходство. ДНК состоит из нуклеотидов, каждый из которых включает сахар пентозу, фосфатную группу и азотистое основание, такое как аденин, гуанин, тимин или цитозин. Соотношение в этой комбинации у форели и лосося на 96,5% идентично таковому у человека. Это сходство имеет большую важность, поскольку можно использовать все нуклеиновые кислоты без отбраковки.
PDRN был одобрен для применения в лечении ран и в области красоты в странах Европы и других странах. PDRN в основном получают путем сбора спермы от лосося или форели, выделения ДНК из спермы и фрагментирования ДНК. Выделение ДНК для получения PDRN было технически разработано и применяется у млекопитающих и других видов. Например, для выделения ДНК из тканей рыб используют фенол и хлороформ.
Полидезоксирибонуклеотид (PDRN) в виде фрагмента ДНК получают из спермы лососевых рыб, содержащей спермин, и применяют в терапии и косметике в качестве материала с превосходными фармакологическими активностями.
PDRN в виде фрагмента ДНК высокой чистоты применяют в фармакологических целях. В данном случае для получения PDRN спермальную жидкость (или семенную жидкость) центрифугируют, промывают буфером и экстрагируют смесью этанола или ацетата натрия и изопропанола. Этот процесс экстрагирования является основным принципом, применяемым во многих патентах и производителями.
В сперме из семенников содержится большое количество сперматид, сперматоцитов и сперматогониев, все из которых дифференцируются в спермин в ходе гаметогенеза. В частности, в сперме содержится большее количество сустентоцитов, чем этих половых клеток. Сустентоциты служат для обеспечения половых клеток питательными веществами.
Как показано на Фиг. 1, семенники рыбы созревают, будучи прикрепленными к дорсальной стенке целома. Рост половых клеток во время половой зрелости приводит к увеличению гонадо-соматического индекса (GSI). GSI увеличивается до 20-50% у самок рыб и до 1-5% у самцов рыб. Таким образом, число семенников, полученных от самцов рыб не является существенным.
С другой стороны, выделение PDRN обязательно включает центрифугирование спермы, обогащение спермиями (или сперматозоидами) и выделение спермиев с использованием органического растворителя. Спермий состоит из ДНК (то есть PDRN) в качестве генома, митохондрий, содержащих АТР (аденозинтрифосфат), вызывающих движение хвостика, и акросомы, позволяющей спермию проникать в оолемму. PDRN является целевым веществом по настоящему изобретению.
Количество PDRN в продуктах экстракции спермы органическим растворителем принципиально отличается от такового в семенниках. Из спермы можно получать PDRN большей чистоты. В отличие от этого, когда PDRN выделяют с использованием органического растворителя из семенников, содержащих сустентоциты, неизбежно экстрагируются различные вещества, растворимые в органическом растворителе.
В CN107287186A («патентный документ 1») PDRN получают из семенной жидкости, которая обозначена как сперма. В KR10-2018-0066331 («патентный документ 2»), получившем окончательное решение об отказе в выдаче патента в Корее, описано, что семенники лиофилизируют и экстрагируют органическим растворителем для получения PDRN. В заявке на Корейский патент признано, что чистота PDRN, полученного из спермы, отличается от чистоты PDRN, полученного из семенников, и раскрыто, что PDRN высокой чистоты может быть выделен с наибольшей эффективностью из спермиев (спермы).
Таким образом, в качестве основных методик выделения PDRN были признаны промывание и экстрагирование органическим растворителем. Так, в последнее время было выдано много патентов и опубликовано статей, касающихся применения PDRN, основанного на его фармакологической активности или косметических эффектах, а не способов выделения PDRN.
После образования спермиев в семенниках лососевых рыб сперму собирают. Затем брюшную полость вскрывают, незрелые семенники собирают с последующей обработкой, такой как лиофилизация. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что разведение семенников лососевых рыб семенной плазмой, в зависимости от степени зрелости семенников, и последующая обработка таким гормоном, как хорионический гонадотропин человека (hCG), приводит к получению намного большего количества спермиев (или спермы). Например, у одного вида лососевых можно получить в 100-200 раз большее количество спермы.
Состав семенной плазмы (NaCl, 40 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 20 мМ Tris-HCl) определен на основании информации о концентрации минералов в сперме, как описано в публикации "Rosengrave Р, Taylor Н, Montgomerie R, Metcalf V, McBride К and Gemmell NJ, 2008. Chemical composition of seminal and ovarian fluids of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and their effects on sperm motility traits. СВР A 152, 123-129" и информации об искусственной семенной жидкости, представленной в публикации "Bartlett MJ, Steeves ТЕ, Gemmell NJ and Rosengrave PC, 2017. Sperm competition risk drives rapid ejaculate adjustments mediated by seminal fluid. eLIFE 6:e28811".
Семенная жидкость, которая упоминается в качестве исходного материала для PDRN в патентном документе 1, представляет собой сперму лососевых рыб, а не экстракт из семенников.
В ЕР 0226254 В1 («патентный документ 3») изложен способ выделения PDRN из плаценты. Однако в этом патенте упомянуто только то, что способ можно также применять и для других тканей других животных, и не приведено ни одного случая. В отличие от этого, в настоящем изобретении предложен способ выделения PDRN из семенников лосося, начинающийся от сбора семенников у живого или свежего лосося и промывания семенников для удаления крови, и фундаментально отличающийся от способа получения PDRN из подвижных спермиев, образованных в семенниках, несмотря на использование того же источника PDRN (то есть семенников) в обоих способах.
Авторы настоящего изобретения предприняли попытку выделить PDRN из незрелых семенников вместо спермы или зрелых семенников, широко используемых в данной области техники, и в результате обнаружили, что обработка незрелых семенников подходящим гормоном, в частности, хорионическим гонадотропином человека (hCG), приводит к образованию зрелых спермиев, из которых можно выделить PDRN высокой чистоты. Настоящее изобретение основано на этом наблюдении.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
(Патентный документ 1) CN107287186A под названием "Polydeoxyribonucleotide for separate the method for polydeoxyribonucleotide from the seminal fluid of fish, obtaining by methods described and application thereof.
(Патентный документ 2) KR10-2018-0066331 под названием "Method for extracting PDRN from semen and testes of fish".
(Патентный документ 3) ЕР 0226254B1 под названием "Process for obtaining non informational substantially pure polydesoxyribonucleotides having biologic activities, and respective product".
НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
(Непатентный документ 1) (статья в журнале 1) Нуо Won KIM, Jeong Hyeon KIM, Dae Geun KIM, Min Hwan JEONG, Seung Chul JI, Sang Keun SANG, Cheol Min AHN, Jeong In MYEONG, Dae Jung KIM. 2018. Effect of artificially sexual maturation by hCG dose and injection interval in cultured male eel, Anguilla japonica. The Journal of the Korean Society for Fisheries and Marine Sciences Education, 30, 1578-1586.
(Непатентный документ 2) (статья в журнале 2) Ohta Н. and Tanaka Н., 1997. Relationship between serum levels of human chorionic gonadotropin (hCG) and 11-ketotestosterone after a single injection of hCG and induced maturity in the male Japanese ee1, Anguilla japonica. Aquaculture 153, 123-134.
(Непатентный документ 3) (отчет о программе 1) Dal Young KIM, Seong Gon KIM, Tong Soo KIM. 2016. A study on the acclimation of Korean mandarin fish to formulated feed - Test on the growth rate of 1-year-old individuals acclimated to formulated feed. Отчет по научно-практическому проекту 2016 г института морских исследований и рыболовства провинции Gyeonggi, Корея. 84-91.
(Непатентный документ 4) (отчет о программе 2) Университет Soonchunhyang, Корея, 2011. Artificial breeding manual of endangered freshwater fish. Министерство окружающей среды Кореи, с. 93.
КАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения спермиев искусственным путем посредством обработки семенников hCG для выделения большого количества PDRN из спермиев.
Способ выделения полидезоксирибонуклеотида (PDRN) высокой чистоты из семенников лосося по настоящему изобретению включает (1) выделение спермы и незрелых участков семенников из семенников лососевой рыбы, (2) осторожное измельчение незрелых участков семенников с последующим разведением искусственной семенной плазмой, (3) обработку разведения хорионическим гонадотропином человека (hCG) в заданной концентрации для индуцирования искусственного полового созревания клеток семенников в спермин, (4) центрифугирование разведения семенников по истечении заданного времени после обработки hCG и сбор потенциально подвижных спермиев и (5) выделение PDRN из собранных спермиев.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В способе по настоящему изобретению лососевая рыба предпочтительно представляет собой вид рыб, принадлежащий к подсемейству, выбранному из группы, состоящей из Salmoninae, Thymallinae и Coregoninae, и предпочтительно представляет собой речного лосося, пойманного в зоне, простирающейся на 10 км выше по течению от устья реки.
В способе по настоящему изобретению на стадии (1) незрелые участки семенников различаются по своей степени зрелости и имеют относительно высокие степени зрелости, представляющие собой подвижность спермиев по меньшей мере 0,7%, а на стадии (3) hCG используют в количестве от 25 до 200 IU (международных единиц) на грамм семенников.
В способе по настоящему изобретению на стадии (4) заданное время предпочтительно составляет от 10 минут до 1 часа, а незрелые участки семенников предпочтительно включают сперматогонии или сперматоциты. Предпочтительно, способ по настоящему изобретению дополнительно включает перед стадией (5) суспендирование спермиев и добавление к суспензии свежей воды для обеспечения истощения спермиями их АТР с получением PDRN высокой чистоты.
hCG - это аббревиатура для хорионического гонадотропина человека, обозначающая гормон, который можно выявить в моче беременных женщин.
Когда hCG инъецируют карпу, обыкновенному карасю или золотой рыбке, которых выращивали при температуре 12°С или ниже в течение года, оплодотворенные икринки можно получить в любое время. В частности, инъекция hCG в количестве 500 IU/кг или 500 IU/особь обеспечивает созревание гонад самок и самцов, в результате чего оплодотворенные икринки можно получить естественным путем через 12-18 часов после инъекции (от заката до утра следующих суток). Инъекция экстракта гипофиза лосося самкам угря приводит к половому созреванию гамет (икринок), тогда как еженедельные инъекции hCG в концентрации 500 IU/кг обеспечивают созревание спермиев через 3 месяца. При слиянии зрелых яйцеклеток самок и зрелых спермиев образуются оплодотворенные икринки.
В одном воплощении настоящего изобретения сперму и незрелые участки семенников, имеющие различные степени зрелости, выделяют из семенников лососевой рыбы, собирают незрелые участки семенников, имеющие высокие степени зрелости, собранные незрелые участки семенников осторожно измельчают и разводят искусственной семенной плазмой, разведение обрабатывают hCG в заданной концентрации, после обработки hCG разведенные семенники центрифугируют в течение 10-30 минут и собирают потенциально подвижные спермин и используют в качестве исходного материала для PDRN.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на получение PDRN высокой чистоты из подвижных спермиев, полученных искусственным путем в семенниках свежей лососевой рыбы. Степень зрелости свежих семенников варьирует в зависимости от участка, но чем ближе к половому отверстию, тем более зрелыми становятся сперматогонии. В результате созревания под действием hCG один сперматогоний проходит мейоз с образованием сперматид и клеток спермиев (до четырех), с достижением более высокого выхода, чем общая сырая масса использованных семенников, что в конечном итоге приводит к увеличению выхода PDRN. В разделе Примеры, приведенном ниже, обработка hCG увеличивала сухую массу (за исключением осадка) клеток спермиев, имеющих происхождение от сперматид, в 1,6 раза, и PDRN был выделен с итоговой чистотой по меньшей мере 82% в 2,3-3,9 раз большем количестве в группе, получавшей обработку hCG, по сравнению с группой, не получавшей обработку. Кроме того, получали PDRN высокой чистоты с выходом в среднем в 40,1 раз выше, из спермы, собранной единовременно у одного самца, и получали PDRN более высокой чистоты, когда зрелые спермин приводили в контакт с водой из окружающей среды для истощения в них АТР.
От одного самца лососевой рыбы получают приблизительно 30-50 мл спермы, но в настоящее время доступно только ограниченное количество (приблизительно 10-20 мл), поскольку в Южной Корее большую часть спермы используют для оплодотворения.
Способ по настоящему изобретению обеспечивает получение из 20 мл (максимум 50 мл) спермиев (спермы), полученных естественным путем и собранных единовременно у лососевой рыбы, исходного материала для PDRN с чистотой, повышенной в 100-200 раз. Таким образом, PDRN, полученный из семенников лососевой рыбы способом по настоящему изобретению, является более концентрированным и чистым по сравнению с тем, который получают из дорогой активной спермы. Согласно способу по настоящему изобретению, PDRN можно получать с высоким выходом из спермы и семенников форели или лосося. Кроме того, способ по настоящему изобретению обеспечивает более рентабельное и экономически выгодное выделение PDRN по сравнению с обычными способами других компаний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Эти и/или другие аспекты и преимущества изобретения станут очевидны и более понятны, исходя из приведенного ниже описания воплощений, взятого вместе с сопровождающими графическими материалами, в которых:
на Фиг. 1 показаны диаграммы поперечного и продольного среза, иллюстрирующие пространственное расположение незрелых гонад (общее для самцов и самок рыб) в целоме обычной рыбы;
Фиг. 2 представляет собой увеличенное изображение продольного среза, иллюстрирующее незрелую гонаду (общее для самцов и самок рыб) в целоме обычной рыбы;
на Фиг. 3 приведены диаграмма среза, иллюстрирующая структуру клетки спермия обычной рыбы (слева) и микрофотография, иллюстрирующая спермин в сперме обычной рыбы (справа); и
Фиг. 4 представляет собой схематичную диаграмму, иллюстрирующую расположение различных участков семенника зрелого самца лососевой рыбы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее будут описаны отдельные стадии способа по настоящему изобретению.
Стадия 1: Выделение спермы и незрелых участков семенников
Сперму и незрелые участки семенников выделяют из семенников лососевой рыбы. Сперму, вытекающую из участка D, показанного на Фиг. 4, собирают и используют в качестве исходного материала. После полного извлечения спермы из участка D, участок С отделяют от участка D путем разрезания в заданном положении.
Если обратиться к Фиг. 4, семенник подразделяется на участок D, откуда вытекает сперма, и незрелые участки семенника А, В и С. В частности, большая часть спермиев из участков семенников А и В являются неподвижными до обработки hCG и приблизительно 1% спермиев из участка семенников С являются подвижными. Спермин в зрелой сперме из участка семенников D обладают подвижностью 100%.
Стадия 2: Измельчение и разведение незрелых участков семенников
Незрелые участки семенников А, В и С измельчают и разводят искусственной семенной плазмой. Измельчение осуществляют согласно следующей процедуре. Вначале семенники нарезают на мелкие кусочки ножницами так, чтобы снять мембраны, окружающие сперматиды семенников. Затем обнажившиеся участки семенников А, В и С осторожно раздавливают руками в перчатках.
Семенная плазма имеет состав, включающий 80 мМ NaCl, 40 мМ KCl, 1 мМ CaCl2 и 20 мМ Tris-HCl, конкретно 159,26±8,84 мМ натрия (Na), 33,72±2,01 мМ калия (К), 133,04±5,96 мМ хлора (Cl), 1,68±0,2 мМ кальция (Са) и 0,988±0,13 мМ магния (Mg) (см. Hatef A, et. al., 2007. Aquaculture Research 38, 1175-1181). В качестве органических компонентов семенная плазма включает общий белок (0,75±0,14 мг/100 мл), холестерин (2,86±0,58 мг/л) и глюкозу (3,81±1,04 мМ/л).
Стадия 3: обработка hCG
hCG это аббревиатура для хорионического гонадотропина человека. Разведение обрабатывают hCG в концентрации 25-200 IU/г для индуцирования искусственного полового созревания клеток семенников в спермин. Конкретно, разведение обрабатывают заданным количеством hCG при медленном помешивании на лопастной мешалке с низкой скоростью. При этом следует соблюдать осторожность, поскольку высокая скорость мешалки вызывает разрушение клеток, повышая вероятность увеличения примесей.
Обработка hCG улучшает подвижность спермиев из участков семенников А до приблизительно 3%, тогда как подвижность спермиев из участков В и С она увеличивает до 35% и 89%, соответственно. В заключение, использование участков семенников С, на которые приходится 45% общей массы семенников, для получения зрелых спермиев будет приводить к получению PDRN высокой чистоты с малым количеством примесей (см. Фиг. 4 и Таблицу 1).
Стадия 4: Центрифугирование
Разведение семенников центрифугируют при 1000-10000 RCF (относительная сила центрифугирования) в течение по меньшей мере 20 минут и собирают потенциально подвижные спермин в виде осадка.
Стадия 5: Выделение PDRN
Из собранных спермиев выделяют полидезоксирибонуклеотид (PDRN). В данной области техники известны различные способы, которые можно применять для выделения PDRN, поэтому их описание в данном документе не приведено. Настоящее изобретение характеризуется скорее получением искусственной спермы, из которой можно выделить PDRN высокой чистоты, как описано выше, нежели выделением PDRN.
Например, PDRN можно выделять согласно следующей процедуре. Вначале спермин обрабатывают лизирующим буфером, замораживают и измельчают в порошок. Выделяют ДНК путем центрифугирования и очищают путем удаления белков. Затем осаждают ДНК путем центрифугирования и очищают путем промывания. Наконец, ДНК фрагментируют одним из следующих способов: (1) расщепление рестриктазами, (2) передача высокочастотной акустической энергии, (3) силы небулизации, (4) воздействие ультразвука и (5) разрезание с помощью иглы.
Далее настоящее изобретение будет объяснено более подробно с отсылкой к следующим Примерам. Однако эти примеры приведены для обеспечения лучшего понимания изобретения специалистами в области техники, могут быть изменены до нескольких других вариантов и не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения.
Пример 1. Подвижность (%) спермиев из различных участков семенников лосося до и после обработки hCG
Незрелые участки (за исключением участков D, из которых вытекает сперма, см. Фиг. 4) собирали путем отрезания семенников самца лосося. Подвижность спермиев из участков семенников А и В до обработки hCG практически равнялась нулю. Подвижность спермиев из участков семенников С составляла всего 1%, а подвижность спермиев в зрелой сперме составляла 100%. После обработки hCG подвижность спермиев из участков семенников А улучшалась приблизительно до 3%, тогда как подвижность спермиев из участков семенников В и С увеличивалась до 35% и 89%, соответственно. Эти результаты позволяют заключить, что использование участков семенников С, на которые приходится 45% общей массы семенников, для получения зрелых спермиев приведет к получению PDRN высокой чистоты с малым количеством примесей (см. Фиг. 4 и Табл. 1).
Figure 00000001
Figure 00000002
Участки С семенников самца лосося, пойманного в реке в октябре, обрабатывали тремя различными типами гормонов: hCG, рилизинг-фактором лютеинизирующего гормона (LhRH) и DHP (дигидропрогестероном). При обработке LHRH и DHP подвижность спермиев составляла всего 5 и 4%, соответственно. В отличие от этого, подвижность спермиев в экспериментальной группе, получившей обработку hCG, доходила до 80%, что позволяло получать сперму с малым количеством примесей (Таблица 2).
Figure 00000003
Подвижность спермиев лосося, пойманного в море, не увеличивалась даже после обработки hCG (Таблица 3). Участки С семенников лосося, вернувшегося в реку между сентябрем и декабрем, обрабатывали hCG. В результате существенных различий в подвижности спермиев не было, поскольку речной лосось был уже зрелым (Таблица 4). Сравнивали подвижность спермиев в зависимости от расстояния от плотины в устье реки. Подвижность спермиев самца лосося, пойманного у плотины в устье реки (расстояние=0 м) и в точке 1 км выше по течению от плотины в устье реки, составляла 65% и 85%, соответственно. В отличие от этого, подвижность спермиев самца лосося, пойманного в точках 2 км и 3 км выше по течению от плотины в устье реки, составляла 97% и 98%, соответственно (Таблица 5).
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Расстояние от устья реки означает расстояние от устья реки до места, куда лосось мигрировал выше по течению, прежде чем быть пойманным. hCG почти не оказывал влияния на морского лосося, тогда как hCG влиял на лосося, вернувшегося в реку, поскольку его половое созревание уже началось. Как свидетельствуют результаты, приведенные в Таблице 5, hCG лучше влиял на лосося, пойманного выше по течению реки, чем на лосося, пойманного вблизи моря.
Пример 2. Подвижность (%) спермиев из участков С семенников лосося при различных условиях обработки hCG
Участки С семенников самца речного лосося разводили буферным раствором и обрабатывали различными концентрациями hCG. Подвижность спермиев была очень низкой (2%), когда участки С не подвергались обработке, постепенно повышалась с увеличением концентрации hCG до 50 IU/г и составляла не менее 82% при обработке hCG в концентрациях 50-200 IU/г (Таблица 6).
Figure 00000008
Сравнивали подвижность спермиев с течением времени после обработки hCG в концентрациях, показанных в Таблице 6. В контроле, не получавшем обработку, подвижность спермиев не различалась даже с течением времени. Подвижность спермиев в группе, получавшей обработку 25 IU/г семенника, повышалась до максимального значения 73% через 1 ч после обработки и доходила до 85% через 10 мин после обработки. Подвижность спермиев в группе, получавшей обработку 50 IU/г семенника, составляла не менее 94% через 20-30 мин после обработки. Однако подвижность спермиев понижалась до 83% с 60 мин после обработки и резко понижалась до 32% с 60 мин после обработки. Подвижность спермиев в группах, получавших обработку 100 IU/г семенника и 200 IU/г семенника, начинала понижаться с 30 мин и 20 мин после обработки, соответственно. Таким образом, подвижность спермиев в группах, получавших обработку 50-200 IU/г семенника, понижалась с того момента, как время обработки превышало 20 мин (Таблица 7).
Figure 00000009
Пример 3. Выход выделенного PDRN (%) при обработке участков С семенников hCG в различных условиях
В данном примере использовали 10 г участков С семенников самца речного лосося. Для сравнения использовали 30 мл спермы, полученной у самца речного лосося обычным способом (Таблица 8). Участки семенников обрабатывали hCG в концентрациях 50 и 100 IU/г семенника. После обработки hCG собирали не менее 80% каждого верхнего слоя и обозначали как супернатант.
Сухая масса в группе, не получавшей обработку, составляла 5,10 г, что было меньше чем в группах, получавших обработку hCG, и больше, чем у спермы (2,89 г). Полагали, что сухая масса в группе, не получавшей обработку, превышавшая таковую спермы, была обусловлена присутствием более тяжелых сустентоцитов. Полагали, что сухая масса в группах, получавших обработку hCG, превышавшая таковую в группе, не получавшей обработку, была обусловлена тем, что обработка hCG стимулировала мейоз сперматогониев в сперматиды, что приводило к увеличению количества клеток. Полагали, что низкая сухая масса супернатантов после обработки hCG была обусловлена тем, что некоторые компоненты (приблизительно 20%), такие как сустентоциты, оставались не дифференцированными в сперматиды.
В группе, не получавшей обработку, и в участках семенников, обработанных hCG, достигалась эффективность выделения 10,2% и приблизительно 14,7%, соответственно. В супернатантах и сперме достигалась эффективность выделения 7,0-7,2% и 6,1%, соответственно. В группе, не получавшей обработку, и 10 г участков семенников, обработанных hCG, достигалось содержание PDRN (или чистота) 10% и 45-52%. В отличие от этого, в супернатантах и сперме достигалась чистота PDRN не менее 92%.
На основании этих результатов рассчитывали количество PDRN, выделенного у одного самца лосося. В результате из спермы одного самца лосося получали 0,26 г PDRN, а из необработанных участков семенников одного самца лосося получали 0,16 г PDRN. В отличие от этого, из участков семенников, обработанных hCG в концентрациях 50 и 100 IU/г семенника, получали 5,77 и 7,63 г PDRN, соответственно. Из супернатантов получали PDRN высокой чистоты (не менее 10,51 г) независимо от концентрации hCG. Выход PDRN в группе, не получавшей обработку, и в участках семенников, обработанных 50 IU hCG, был выше выхода PDRN из спермы в 0,6 раза и 21,8 раз, соответственно. В отличие от этого, выход PDRN в супернатантах после обработки hCG в концентрациях 50 и 100 IU/г семенника был выше выхода PDRN из спермы в 39,7 раза и 40,1 раз, соответственно.
Поскольку супернатанты представляли собой суспензии, содержащие высокую долю спермиев, при воздействии воды из окружающей среды (свежей воды) спермин становилась подвижными с истощением АТР в их митохондриях. Полагают, что этот эффект приводил к более высокой чистоте PDRN. Поскольку в ходе этого неподвижные спермин осаждались и удалялись, их следовало учитывать в отношении эффективности. Однако это учитывание не приводило к существенному улучшению эффективности, поскольку содержание PDRN, выделенного из спермиев, было высоким (не менее 92%).
Figure 00000010
Несмотря на то, что предпочтительные воплощения настоящего изобретения были объяснены подробно, объем настоящего изобретения не ограничен ими. Специалисту в области техники понятно, что возможны различные модификации без отступления от существа и объема изобретения.

Claims (7)

1. Способ выделения полидезоксирибонуклеотида (PDRN) высокой чистоты из семенников лосося, включающий (1) выделение спермы и незрелых участков семенников из семенников лососевой рыбы, (2) измельчение незрелых участков семенников с последующим разведением искусственной семенной плазмой, (3) обработку разведения хорионическим гонадотропином человека (hCG) в количестве от 25 до 200 IU (международных единиц) на грамм семенников для индуцирования искусственного полового созревания клеток семенников в спермии, (4) центрифугирование разведения семенников по истечении 10 минут - 2 часов после обработки hCG и сбор потенциально подвижных спермиев и (5) выделение PDRN из собранных спермиев.
2. Способ по п. 1, где лососевая рыба представляет собой вид рыб, относящихся к подсемейству, выбранному из группы, состоящей из Salmoninae, Thymallinae и Coregoninae.
3. Способ по п. 1, где лососевая рыба представляет собой речного лосося, пойманного в зоне, простирающейся на 10 км выше по течению от устья реки.
4. Способ по п. 1, где на стадии (1) незрелые участки семенников различаются по своей степени зрелости и имеют относительно высокие степени зрелости, представляющие собой подвижность спермиев по меньшей мере 0,7%.
5. Способ по п. 1, где на стадии (4) время после обработки hCG составляет от 10 минут до 1 часа.
6. Способ по п. 1, где незрелые участки семенников содержат сперматогонии или сперматоциты.
7. Способ по п. 1, дополнительно включающий перед стадией (5) суспендирование спермиев и добавление к суспензии свежей воды для обеспечения истощения спермиями их АТР (аденозинтрифосфат) с получением PDRN высокой чистоты.
RU2021125948A 2020-09-07 2021-09-02 Способ выделения полидезоксирибонуклеотида высокой чистоты из семенников лосося RU2768031C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200113706A KR102234367B1 (ko) 2020-09-07 2020-09-07 연어의 정소로부터 고순도 피디알엔의 추출 방법
KR10-2020-0113706 2020-09-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2768031C1 true RU2768031C1 (ru) 2022-03-23

Family

ID=75237989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021125948A RU2768031C1 (ru) 2020-09-07 2021-09-02 Способ выделения полидезоксирибонуклеотида высокой чистоты из семенников лосося

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11795447B2 (ru)
EP (1) EP3964577B1 (ru)
JP (1) JP7236760B2 (ru)
KR (1) KR102234367B1 (ru)
CN (1) CN114149963A (ru)
RU (1) RU2768031C1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116239668B (zh) * 2023-05-10 2023-07-28 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 一种hCGβ亚基突变体及其在PDRN提取中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0226254A2 (en) * 1985-12-12 1987-06-24 Farmigea S.P.A. Process for obtaining non informational substantially pure polydesoxyribonucleotides having biologic activities, and respective product
FR2676926A1 (fr) * 1991-05-30 1992-12-04 Flecchia Pierre Compositions pharmaceutiques a base de polydesoxyribonucleotides et leur procede de preparation.
RU2508115C2 (ru) * 2008-10-30 2014-02-27 Медевиче С.П.А. Инъекционная композиция полидезоксирибонуклеотидов для лечения костно-суставных заболеваний
CN107287186A (zh) * 2016-04-05 2017-10-24 达特珂贝怡股份有限公司 从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、由所述方法获得的多脱氧核糖核苷酸及其用途

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2605466B1 (fr) 1986-10-15 1991-08-16 Salmson Pompes Dispositif de surveillance de moteur electrique
US4929542A (en) * 1987-10-30 1990-05-29 Cornell Research Foundation, Inc. In vitro screening test for mutagenicity and genotoxicity during spermatogenesis
JP2976014B2 (ja) * 1996-01-19 1999-11-10 農林水産省水産庁養殖研究所長 精巣精子を用いたウナギの人工受精法
JP2004196701A (ja) 2002-12-18 2004-07-15 Nissan Chem Ind Ltd 細胞死抑制剤
JP2005245394A (ja) * 2004-03-08 2005-09-15 Nissei Bio Kk 魚類白子からの二本鎖ｄｎａの抽出・精製方法
KR101739409B1 (ko) * 2011-10-21 2017-05-25 주식회사 파마리서치프로덕트 어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물
KR101452313B1 (ko) 2012-08-06 2014-10-21 (주)비알뷰티플레볼루션 항염 및 피부 재생 효과를 갖는 화장료 조성물
JP2015146760A (ja) * 2014-02-06 2015-08-20 学校法人立命館 タモロコ属魚類精子の受精能の評価方法
KR20180066331A (ko) 2016-12-07 2018-06-19 경기대학교 산학협력단 중공사형 비소흡착제 제조방법 및 중공사 담체
CN107099501B (zh) 2017-05-27 2022-04-05 广东华农大资产经营有限公司 一种诱导幼龄灵长类动物获取性腺配子的方法和应用
KR102031152B1 (ko) * 2018-03-05 2019-10-15 한상철 연어 유래 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 갖는 코어쉘 나노캡슐을 함유하는 피부개선 기능성 화장료 조성물 및 그의 제조방법
KR20190139633A (ko) 2018-06-08 2019-12-18 (주) 비앤에프솔루션 어류 정액 및 정소에서 피디알엔을 추출하는 방법
CN109349271A (zh) * 2018-11-29 2019-02-19 江苏省农业科学院宿迁农科所 一种大鳞鲃精子保存液的使用方法
CN110747194A (zh) 2019-11-28 2020-02-04 王超云 一种小分子多聚脱氧核糖核苷酸及其制备与应用
CN110786321A (zh) * 2019-12-05 2020-02-14 广西壮族自治区水产科学研究院 一种金钱鱼精子冷冻保存方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0226254A2 (en) * 1985-12-12 1987-06-24 Farmigea S.P.A. Process for obtaining non informational substantially pure polydesoxyribonucleotides having biologic activities, and respective product
FR2676926A1 (fr) * 1991-05-30 1992-12-04 Flecchia Pierre Compositions pharmaceutiques a base de polydesoxyribonucleotides et leur procede de preparation.
RU2508115C2 (ru) * 2008-10-30 2014-02-27 Медевиче С.П.А. Инъекционная композиция полидезоксирибонуклеотидов для лечения костно-суставных заболеваний
CN107287186A (zh) * 2016-04-05 2017-10-24 达特珂贝怡股份有限公司 从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、由所述方法获得的多脱氧核糖核苷酸及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022044559A (ja) 2022-03-17
KR102234367B1 (ko) 2021-03-31
EP3964577A1 (en) 2022-03-09
US20220073553A1 (en) 2022-03-10
US11795447B2 (en) 2023-10-24
JP7236760B2 (ja) 2023-03-10
EP3964577B1 (en) 2023-08-09
CN114149963A (zh) 2022-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bauernfeind et al. The Mayflies of Europe (Ephemeroptera)
Hayssen Tamandua tetradactyla (Pilosa: Myrmecophagidae)
Hine A dictionary of biology
Martin et al. A dictionary of biology
Dick Species, and infraspecific variation
Flajšhans et al. Genetic studies of tench (Tinca tinca L.): induced triploidy and tetraploidy and first performance data
Alfaro-Montoya et al. Research frontiers in penaeid shrimp reproduction: Future trends to improve commercial production
Marancik et al. Disseminated fungal infection in two species of captive sharks
RU2768031C1 (ru) Способ выделения полидезоксирибонуклеотида высокой чистоты из семенников лосося
US20170042946A1 (en) Lobster hemolymph as a utility for the treatment of mammalian tissue lesions
EP0309483B1 (en) Production and use of anthelmintic agents and protective antigens
CN100497370C (zh) 一种法氏囊素的提取方法及其在疾病治疗和免疫中的应用
Linhart et al. Spermiation of common tench (Tinca tinca L.) stimulated with injection or implantation of GnRH analogues and injection of carp pituitary extract
Mercier et al. Perivisceral coelomic fluid as a mediator of spawning induction in tropical holothurians
Goel et al. Ovulatory response and embryo yield in Jakhrana goats following treatments with PMSG and FSH
Okada et al. Toxocara cati larval migration to mouse fetuses through transplacental infection
Zhang et al. Embryogenesis and development
Smyth Nematodes: other than Filarioidea
Houghton The immune response in carp, Cyprinus carpio L. to Ichthyophthirius multifiliis, Fouquet 1876
F Fahmy Improvement of spawning in Siganus rivulatus: the impact of different LHRHa doses, spawning methods and sex ratio on spawning performance and egg quality
KR20230109459A (ko) 애완동물의 근육조직 및 연골조직 수복용 조성물
CN105669854A (zh) 一种海马催产剂及其编码基因
CN106434684A (zh) 金钱鱼黄体生成素lh基因、金钱鱼lh重组蛋白及应用
Szabó et al. Delayed in vitro fertilization of African catfish (Clarias gariepinus) and Common carp (Cyprinus carpio) eggs in ovarian fluid of African catfish and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss)
Desnitskiy Volvox (Chlorophyta, Volvocales) as a model organism in developmental biology