CN105669854A - 一种海马催产剂及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海马催产剂及其编码基因。海马催产剂，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。线纹海马kiss2基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明从线纹海马中分离得到一种新的海马催产剂，其能激活垂体分泌促滤泡激素和促进性腺性类固醇激素的分泌，从而参与海马的生殖调控，为解决海马苗种繁育提供了条件，有利于海马养殖规模化的实现。

Description

一种海马催产剂及其编码基因
技术领域：
本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种海马催产剂及其编码基因。
背景技术：
脊椎动物的生殖活动主要由“脑/下丘脑-脑垂体-性腺”的生殖轴(brain-pituitary-gonadaxis,BPG轴)调控。脑/下丘脑分泌产生促性腺激素释放激素(gonadotropinreleasinghormone,GnRH)，刺激脑垂体促性腺激素(gonadotropin,GtH)，包括促黄体生成激素(LuteinizingHormone,LH)与促滤泡激素(Folliclestimulatinghormone,FSH)的合成与释放，促性腺激素作用于性腺，增加性腺性类固醇激素的生成与分泌，进而促进性腺发育成熟、配子生成与排放。而位于生殖轴(GnRH-GtH轴)上游的的基因——Kisspeptin，由kiss基因编码，经翻译后断裂修饰产生包括Kisspeptin-10的酰胺化短肽。研究已经证实：Kisspeptin通过激活GnRH神经元，刺激GtH分泌，对调控生殖的“脑/下丘脑-脑垂体-性腺”轴起着直接的刺激作用，这一发现被认为是近年来生殖生理学研究的一个主要突破。
目前，鱼类人工繁殖中常用的催产剂有三种：即绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体生成素释放激素类似物(LRH-A)和鱼类的脑下垂体(PG)。但这些传统的催产剂只对淡水鱼类催产效果较好，而对海水鱼类没有明显的效果，表明不同种类的亲鱼对不同催产剂的敏感性有很大差异。
海马是海龙科海马属(SyngnathidaeHippocampusspp.)所有鱼类的统称，是珍稀的海洋药源动物，在我国素有“南方人参”之称，具有极高的经济价值，是一种高档的中药材。由于过度捕捞和环境污染等因素，生态环境破坏严重，使得海马的自然资源急剧下降，目前已被列为海洋濒危动物。加强人工养殖是有效减缓海马自然资源被捕捞的压力和满足市场对海马的需求。目前，海马的人工养殖产业处于发展初期，还没能实现低成本大规模养殖以满足市场需求。解决苗种繁育是实现海马养殖规模化的关键，了解并掌握海马催产技术是人工育苗关键技术之一。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高效的海马催产剂及其编码基因。
本发明的海马催产剂，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明的海马催产剂的编码基因-线纹海马kiss2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其含有372bp碱基，编码123个氨基酸，N端前15aa为信号肽，且其N端第88个氨基酸为断裂位点(GKP)；线纹海马kiss2基因同样具有十分保守的核心十肽(图1阴影部分标注)，其序列为FNVNPFGLRF(图1)。过收集雌雄海马的脑、鳃、肝、肠、肾、肌肉、育儿袋、皮肤、精巢、卵巢等组织，提取RNA，运用荧光定量PCR检测线纹海马kiss2基因在各组织中的mRNA表达情况。如图4所示，线纹海马kiss2基因的mRNA表达极为广泛，在我们所收集的组织中均能检测到，在脑和卵巢中的表达丰度最高。通过人工合成线纹海马kiss2基因的核心十肽(FNVNPFGLRF，代号Kiss2-10)，以100ng/gbw的浓度对线纹海马进行腹腔注射，分别在3和6小时后收集下丘脑、垂体样品，提取RNA，用荧光定量PCR分别检测其配体GPR54、sGnRH和FSH的基因表达变化。如图5所示，100ng/gbw的kiss2-10处理3h和6h后，下丘脑GPR54和sGnRH的表达没有显著变化，而垂体促滤泡激素(FSH)的表达量在多肽刺激3h和6h后都显著的升高，表明kiss2-10肽能激活垂体促性腺激素(GtH)，参与海马的生殖调控。如图6所示：kiss2-10注射后3h，血清中睾酮的含量没有显著变化；注射后6h后，血清中睾酮的含量有个显著的升高，表明kiss2-10可以促进下游性腺性类固醇激素的分泌。
本发明还提供一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：FNVNPFGLRF。
本发明还提供一种激活垂体分泌促滤泡激素或促进性腺性类固醇激素的分泌的药物，其特征在于，含有上述海马催产剂或多肽，所述的多肽的氨基酸序列为：FNVNPFGLRF。
本发明从线纹海马中分离得到一种新的海马催产剂，其能激活垂体分泌促滤泡激素和促进性腺性类固醇激素的分泌，从而参与海马的生殖调控，为解决海马苗种繁育提供了条件，有利于海马养殖规模化的实现。
附图说明：
图1是线纹海马kiss2基因的cDNA序列和推导出的蛋白序列，信号肽部分用下划线标示，断裂位点用箭头表示，核心十肽区域用灰色阴影部分标注。
图2是硬骨鱼类kisspeptin的氨基酸多重比对，核心十肽用方框表示，断裂位点用箭头表示，其中kiss2_Seahorse代表本发明的海马催产剂(线纹海马KISS2)。
图3是Kisspeptin系统进化树。通过ClustalX2.0比对各物种kisspeptin氨基酸序列，并使用MEGA6.0软件中的邻近发构建进化树(Neighbor-Joining)，自展值(bootstrap)为1000。进化树中选取的相关物种及其基因在的GenBank的序列号为：Humankiss1(NP_002247.3)；Pigkiss1(ACH68409.1)；Mousekiss1(AAI17047.1)；Bovinekiss1(BAM28696.1)；Xenopuskiss1(ACJ50538.1)；Zebrafishkiss1(ABV03802.1)；Seabasskiss1(ACM07422.1)；Zebrafishkiss2(NP_001136057.1)；Medakakiss2(NP_001153913.1)；Takifugukiss2(BAJ15497.1)；Grouperkis2(ACT65993.1)；Seabasskiss2(ACM07423.1)，其中kiss2Seahorse代表本发明的海马催产剂(线纹海马KISS2)。
图4是线纹海马kiss2基因的mRNA在雌雄海马各组织中表达模式。
图5是kiss2-10肽腹腔注射3小时和6小时后对海马下丘脑GPR54和sGnRH以及垂体FSH的mRNA表达影响，*表示显著差异(p<0.05)，图中的Kiss-2代表kiss2-10肽，而对照组control代表不注射kiss2-10肽的空白对照。
图6是kiss2-10肽腹腔注射3小时和6小时后对海马血清中睾酮含量的影响，*表示显著差异(p<0.05)，图中的Kiss-2代表kiss2-10肽，而对照组control代表不注射kiss2-10肽的空白对照。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、线纹海马全脑总RNA的提取
取性成熟的线纹海马(Hippocampuserectus)，体长5～8cm，体重约8～10g，以20mg/LMS222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉约2min后，开始取样，分离出全脑组织，于液氮中速冻后，存放于-80℃冰箱备用。采用Trizol试剂法提取获得线纹海马全脑的总RNA，其OD260/280＝1.90。
2、kiss2cDNA的克隆
2.1、cDNA第一链的合成
取10μg线纹海马全脑的总RNA样品进行DNAaseI处理以去除基因组DNA的污染，与RNAOligodT混合，进行反转录PCR，所得的产物cDNA第一链置于-20℃保存备用。
2.2、线纹海马kiss2基因cDNA全序列的克隆和序列分析
根据海马转录组数据中的kiss2基因部分序列，在kiss2基因开放读码框两端设计引物上游序列如SEQIDNO:1(ATGAAGTTTGCAGTTGTAGTTATG)，下游引物序列如SEQIDNO:2(TCAGGTCAGCACCTCCAGTTGTCG)，以上述合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段大小为372bp。所得PCR产物上样跑1.5％琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pGEM/Teasy载体转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序，其序列如SEQIDNO.1所示，其含有372bp碱基，编码123个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，该基因命名为：线纹海马kiss2基因(其序列如SEQIDNO.1所示)，编码的蛋白命名为线纹海马KISS2(海马催产剂，其序列如SEQIDNO.2所示)，经分析表明，该海马催产剂的N端前15aa为信号肽，且其N端第88个氨基酸为断裂位点(GKP)。线纹海马kiss2基因同样具有十分保守的核心十肽(图1阴影部分标注)，其序列为FNVNPFGLRF(图1)。
2.3、硬骨鱼kiss2蛋白同源性比对
选取多种硬骨鱼kisspeptin蛋白序列，进行氨基酸的多重比对，结果显示：线纹海马KISS2的序列与其他鱼类相比保守性很低。但是，它们的核心十肽以及C末端的断裂位点(GKP)却相当保守。线纹海马KISS2(V3)十肽序列与其他硬骨鱼类相比较为特异，而斜带石斑鱼与海鲈的(F3)一致，斑马鱼与青鳉(Y3)一致，但他们之间都只有一个氨基酸的差异(图2)。
2.4、进化树分析
进化树分析表明，两种Kisspeptin形成明显的两大分支，线纹海马kiss2基因与各个物种的KISS2聚类于一支，各个物种的KISS1则单独聚类于另外一支；在进化树中，亲缘关系较近的物种，序列相似程度较高；线纹海马kiss2基因与斜带石斑鱼和鲈鱼的kiss2基因的距离最近(图3)，同时海龙目和鲈形目的亲缘关系较近，从进化的角度证明了克隆得到的线纹海马kiss2基因的正确性和可靠性。
2.5、线纹海马kiss2基因在组织中的表达模式
通过收集雌雄海马的脑、鳃、肝、肠、肾、肌肉、育儿袋、皮肤、精巢、卵巢等组织，提取RNA，运用荧光定量PCR检测线纹海马kiss2基因在各组织中的mRNA表达情况。如图4所示，线纹海马kiss2基因的mRNA表达极为广泛，在我们所收集的组织中均能检测到，在脑和卵巢中的表达丰度最高，有意思的是，我们在育儿袋中也检测到线纹海马kiss2基因的表达。
2.6、线纹海马KISS2的kiss2-10肽在体处理对生殖轴相关基因的表达影响和对血清睾酮含量的影响
通过人工合成线纹海马KISS2的核心十肽(kiss2-10肽，序列为：FNVNPFGLRF)，以100ng/gbw的浓度对线纹海马进行腹腔注射，分别在3和6小时后收集下丘脑、垂体样品，提取RNA，用荧光定量PCR分别检测其配体GPR54、sGnRH和FSH的基因表达变化。如图5所示，100ng/gbw的kiss2-10处理3h和6h后，下丘脑GPR54和sGnRH的表达没有显著变化，而垂体促滤泡激素(FSH)的表达量在多肽刺激3h和6h后都显著的升高，表明kiss2-10肽能激活垂体促性腺激素(GtH)，参与海马的生殖调控。
如图6所示：kiss2-10肽注射后3h，血清中睾酮的含量没有显著变化；注射后6h后，血清中睾酮的含量有个显著的升高，表明kiss2-10肽可以促进下游性腺性类固醇激素的分泌。即表明本发明的线纹海马KISS2可以促进下游性腺性类固醇激素的分泌。

Claims (4)

1.一种海马催产剂，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.一种线纹海马kiss2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：FNVNPFGLRF。
4.一种激活垂体分泌促滤泡激素或促进性腺性类固醇激素的分泌的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的海马催产剂或权利要求3所述的多肽。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114747515A (zh) * 2022-04-24 2022-07-15 广东聚石科技研究有限公司 一种促进海马交配的方法

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