CN105585626A - 马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1及其应用 - Google Patents

马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1及其应用 Download PDF

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朱家萍
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1及其应用。马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示；马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:2或3所示。而且本发明的马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用，具有良好的应用前景。

Description

马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1及其应用。
背景技术
马氏珠母贝（Pinctadamartensii）是我国人工海水育珠的主要珍珠贝之一，近年来因沿海水质的日趋恶化，各种病害也频繁发生，导致马氏珠母贝因病害发生大量死亡，对我国珍珠产业造成了巨大的经济损失。因此，了解马氏珠母贝免疫机制并在此基础上提高马氏珠母贝抗胁迫能力是目前亟需解决的问题。
无脊椎动物，不具备高等动物的特异性免疫系统，所以对于天然免疫分子凝集素（Lectin）在体内发挥免疫功能十分重要。凝集素普遍存在于生物体中，有糖基结合位点，是一种专一性很强的糖蛋白或是结合糖的蛋白，能够结合游离在溶液中的糖或是蛋白的某部分，因具有凝聚血红蛋白的功能，故而命名为凝集素。动物凝集素按照凝集素序列特征和生物学功能特点主要分为C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素和五聚体凝集素这五大类。其中，C-型凝集素是指活性必须依赖于Ca2+才能发挥作用，存在于所有后生动物中。C-型凝集素的分布比较广泛，在动物、植物、微生物，甚至病毒中都有发现C-型凝集素的CRD结构域的蛋白。具有糖结合位点使得C-型凝集素在生物学上发挥了很多重要作用，如细胞粘附、内吞作用以及免疫识别等功能。目前，关于马氏珠母贝凝集素的研究比较少，胡钰婷从马氏珠母贝中克隆得到PoLEC-1和PoLEC-2共2个C-型凝集素基因，但是凝集素在马氏珠母贝免疫系统中的作用还未见深入报道。研究马氏珠母贝的凝集素不仅可以了解马氏珠母贝的免疫机制，做到疾病防治，还间接对人类的生活有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1。
本发明的另一个目的是提供一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因。
本发明的另一个目的是提供马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2或3所示。SEQIDNO:2所示序列为凝集素PmCLEC-1基因的DNA全长序列，全长636bp，包含39bp的5'UTR，147bp的3'UTR。SEQIDNO:3所示序列为凝集素PmCLEC-1基因的开放阅读框序列，开放阅读框450bp，编码149个氨基酸。
本发明还提供所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1在抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长中的用途。
另外，本发明设计了一对检测如上所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因的荧光定量引物，用于分析马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因在各组织中的表达情况，因此本发明要求保护一对检测如上所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因的荧光定量引物，引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4~5所示。
本发明还保护包含SEQIDNO:2或3所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因的重组载体。本发明还保护包含如上所述重组载体的重组菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以马氏珠母贝为研究对象，运用高效液相色谱仪对其血清进行分离纯化，筛选出具有抑菌活性的蛋白，所获得马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1能明显抑制大肠杆菌和藤黄微球菌的生长，通过质谱测序，采用RACE技术克隆cDNA全长，获得编码马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示；马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因cDNA全长636bp，包含39bp的5'UTR，147bp的3'UTR。SEQIDNO:3所示序列为凝集素PmCLEC-1基因的开放阅读框序列，开放阅读框450bp，编码149个氨基酸。
研究细菌刺激之后凝集素的mRNA在血淋巴中的时序表达，发现经过细菌刺激之后，PmCLEC-1处于12h在血淋巴中表达含量最高，与其它时期具有显著差异。之后下调，到24h又上调一些，其它时间段都没有什么变化。与马氏珠母贝PoLEC1相比，它的变化明显。说明了PmCLEC-1参与了免疫作用，与免疫相关，本发明的马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。
附图说明
图1为马氏珠母贝血清用SunfireTM半制备型C18柱分离所得色谱图，收集有抑菌活性的目的峰用“**”标注。
图2为目的峰用分析型VydacC18柱进一步分离纯化，收集有抑菌活性的峰用C2标示对应的洗脱液做结构分析。
图3为为马氏珠母贝血清分离组分对藤黄微球菌和大肠杆菌生长抑制图。
图4为PmCLEC-1肽段的质谱图，图A、B、C和D分别代表不同的肽段的氨基酸序列。
图5为PmCLEC-1基因RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳，M代表Marker，5A中的1为3'RACE产物，5B中的2为5'RACE产物。
图6为PmCLEC-1的cDNA序列及氨基酸序列，图中的开放阅读框（ORF）区域用大写字母表示，5’UTR和3’UTR用小写字母表示，PmCLEC-1的保守结构域用黑框表示，双横线代表多聚A加尾信号，粗横线的代表测序得到的氨基酸。
图7为SMART在线分析PmCLEC-1序列结构域结果图。
图8为PmCLEC-1中保守的半胱氨基酸以及组合方式。
图9为PmCLEC-1、PoLEC-1和PoLEC-2的CRD的空间结构。
图10为PmCLEC-1的氨基酸序列与其它物种的C-typelectin的氨基酸序列的比对分析。
图11为以NJ法构建的C-typelectin家族成员氨基酸序列系统进化树。
图12为PmCLEC-1表达定量分析，纵坐标为五次重复所得平均值±标准偏差。
图13为细菌刺激后PmCLEC-1基因在马氏珠母贝血淋巴不同时间的表达0.01<P<0.05用一个星号，P<0.01用两个星标示，纵坐标为平均值±标准偏差(n=3)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、马氏珠母贝的诱导与血清的收集：马氏珠母贝饲养三天后，将灭活大肠杆菌和藤黄微球菌注入马氏珠母贝的闭壳肌内进行诱导，每只注射10μL灭活大肠杆菌和20μL灭活藤黄微球菌，重新放入海水中饲养12h后用无菌的注射器从马氏珠母贝的闭壳肌处收集血淋巴，4℃，3000rpm离心15min，取上清，冷冻干燥得马氏珠母贝的血清干粉。
2、马氏珠母贝血清的分离纯化：用SunFireTM半制备型C18柱分离纯化马氏珠母贝血清，得到结果如图1所示，本轮洗脱共四个浓度梯度（5%乙腈、18%乙腈、40%乙腈和60%乙腈），经抑菌检测发现第Ⅲ梯度（即40%乙腈）洗脱的物质具有抗菌活性（图1中星号**表示），将该组分收集起来。该组分经分析型反相色谱柱C18分离，从20～45%乙腈洗脱成分中分离出C2（图2）。
采用酶标仪法，对照组去离子水，实验组为上述经HPLC分离后的组分，样品浓度为100μg/mL。以马氏珠母贝血清组分C2对藤黄微球菌和大肠杆菌的抑制作用为例，结果如图3所示。A图为藤黄微球菌在加入样品后0和12小时所测得的OD值，由图3A可见，加入C2组分后，藤黄微球菌的生长受到明显抑制（p<0.05）；同时，C2组分对大肠杆菌的生长液产生明显抑制作用（P<0.05）（图3B）。抑菌试验证明组分C2对藤黄微球菌和大肠杆菌具有抑制作用。
3、马氏珠母贝血清抗菌活性蛋白的质谱分析：将步骤2分离获得的抑菌活性成分C2运用MALDI-TOF/TOF5800质谱仪进行活性蛋白的分子量鉴定；采用二级质谱结合Denovo测序技术分析蛋白经胰蛋白酶酶解后的片段的氨基酸序列。经过质谱测序得到的C2组分的质谱图见图4。序列为NEPVHFWI、RFEEWR、IEFFDFYK、SELEWIYQR。然后在dbEST中tblatn模板下搜索得到一条同源序列。根据该序列进行克隆，得到C2成分的中间片段，然后根据中间片段设计5’RACE和3’RACE扩增引物。扩增引物序列如表1所示。
4、提取马氏珠母贝血细胞总RNA，利用RT-PCR方法得到C2组分基因的中间片段，再根据中间片段的基因设计3'RACE和5'RACE的特异性引物（表1），通过RACE技术获得325bp的3'端核苷酸序列（图5中的A）和280bp的5'端核苷酸序列（图5中的B）。最终获得C2组分基因的cDNA序列全长，总长为636bp。根据该cDNA所编码的蛋白质氨基酸序列与质谱测的的肽段进行比对，最终确定该活性组分的全部氨基酸序列。通过序列分析，发现C2为凝集素，命名为凝集素PmCLEC-1。凝集素PmCLEC-1基因的DNA全长为636bp(序列如SEQIDNO：2所示)，包含39bp的5'UTR，147bp的3'UTR，ORF为450bp(序列如SEQIDNO：3所示)，编码149个氨基酸(序列如SEQIDNO：1所示)。
5、马氏珠母贝PmCLEC-1的cDNA序列及氨基酸序列功能位点预测结果见图6。PmCLEC-1的分子量为17885Da，pI为7.61；在N-末端有19个AA的信号肽；功能位点预测有2个N-糖基化位点，1个酪氨酸磷酸激酶位点，2个CAXX盒，3个微体C-末端定位信号序列，1个PCK磷酸位点，1个N-肉豆蔻酰化位点和2个酪蛋白激酶磷酸位点。其中氨基酸序列含有1个典型的C型凝集素结构域序列为：C-[LIVMFYATG]-x(5,12)-[WL]-x-[DNSR]-x(2)-C-x(5,6)-[FYWLIVSTA]-[LIVMSTA]-，而马氏珠母贝PmCLEC-1氨基酸所含的特征序列是：CIALWHPFKYDWADEPCTSSYGYIC。根据半胱氨酸的分布，可知道PmCLEC-1的结构为典型的标准长型，在N端还含有两个半胱氨基酸（C0、C0）。
从SMART在线得到PmCLEC-1蛋白结构，如图7所示，只含有一个糖识别位点(图中CLECT)。PmCLEC-1基因的开放阅读框编码了生成149个氨基酸，其中有19个氨基酸是信号肽，有130个氨基酸是成熟肽，这个成熟肽刚好满足CRD的第二种结构，即含有6个半胱氨酸，除了4个构成基本骨架的半胱氨酸外，在N端还有2个半胱氨酸，根据它的结构特征，绘制了PmCLEC-1的结构简式如图8所示，预测马氏珠母贝PmCLEC-1的空间结构都是由α螺旋和β折叠构成的（图9）。
6、运用CluxtalX软件进行同源比对，PmCLEC-1成熟肽中典型的4个半胱氨酸残基和其他物种的一样，高度保守，都形成了两个环，即C1和C4相连，C2和C3相连。智人的4个半胱氨酸没有和其他物种一一对应，但是它也含有六个半胱氨酸。用于比对的序列有马氏珠母贝（P.martensiiKP689431）、太平洋牡蛎（C.gigas，XP_011456272.1）、斑马鱼（D.rerioNP_001104712.1）、大肠杆菌（E.coilKDY36275.1）、智人（H.sapiens，CAA65480.1）以及紫贻贝（MgallprovincialisAJQ21497.1）。
利用MEGA6.0软件（Neighbor-Joing法）建立进化树，从进化树上可以看出，大肠杆菌单独在一个分支上；智人也单独一个分支上，马氏珠母贝和太平洋牡蛎处于同一个亚支上，说明两者之间的亲缘关系比较接近（图10和图11）。
实施例2
1、马氏珠母贝PmCLEC-1的全组织差异表达分析
本实验是以GAPDH为内参基因，结果显示（图12），在外套膜中的表达含量最高，约为血淋巴的128倍，差异具有统计学意义（P<0.01），表现为极显著差异；其次是肝胰腺，约为血淋巴的111倍；在血淋巴中的表达含量却是最低的；闭壳肌约为血淋巴的11倍（P<0.05）；鳃和性腺分别是血淋巴的5.9（P<0.05）倍和10倍（P<0.05），荧光定量引物如表2。
2、细菌刺激之后凝集素的mRNA在血淋巴中的时序表达
取暂养3天的健康马氏珠母贝140只，分2组：细菌刺激组、PBS对照组，每组60只贝。采用从闭壳肌注射的方法，以灭活的大肠杆菌和藤黄微球菌进行诱导，每只注射10μL灭活的大肠杆菌和20μL灭活的藤黄微球菌，实验期间，不投喂饵料，整个实验过程未引起死亡。注射后的0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h，各组分别取5只贝作为各时间点样品。每个时间点中的5只贝分别取等量的血液，取好的血清800g离心5min后，去上清，加1mLTrizol，用枪吸打使其重新悬浮，提取总RNA并反转录成cDNA，用于荧光定量分析。荧光定量分析的引物同表2。
经细菌诱导处理之后，凝集素的mRNA在血淋巴细胞中含量表达情况如图13所示。与对照组比较之后，发现诱导组中的凝集素在血细胞中的含量是在诱导12h后表达量最高，约为对照组的12.1倍，极显著差异（P<0.01）；其次是24h之后，约为对照组的4倍（P<0.05）；而其它时间段变化不是很大。
SEQUENCELISTING
<110>广东海洋大学
<120>马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1及其应用
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<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>149
<212>PRT
<213>凝集素PmCLEC-1氨基酸序列
<400>1
MetThrMetPheTyrIleLeuValPheThrValPheValGlyAsnIle
151015
TyrAlaValGluArgValCysProLeuGlyTrpMetSerHisLysAsn
202530
HisCysTyrMetIleValSerLysProThrGlnSerTrpPheAsnAla
354045
AsnIleGlnCysGluAsnGlnAsnSerThrLeuAlaLysLeuAspSer
505560
ArgSerGluLeuGluTrpIleTyrGlnArgLeuLeuAlaArgAsnGlu
65707580
ProValHisPheTrpIleGlyGlyAsnArgLeuLysArgPheGluGlu
859095
TrpArgTrpValSerAspGlyGlnArgIleGluPhePheAspPheTyr
100105110
LysThrGlnProAsnGlnAsnThrSerLeuCysIleAlaLeuTrpHis
115120125
ProPheLysTyrAspTrpAlaAspGluProCysThrSerSerTyrGly
130135140
TyrIleCysLysIle
145
<210>2
<211>636
<212>DNA
<213>编码凝集素PmCLEC-1的cDNA全长
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gtgtttacagtcttcgtaggaaatatatacgcagtagaacgggtttgtccccttggatgg120
atgtcgcacaagaatcattgttacatgattgtgtccaagcctacacaatcttggtttaac180
gcaaatattcagtgtgaaaaccagaattccacactggcgaagctggacagtcgttctgag240
ttggagtggatatatcaacgtcttctggctcgaaacgaaccagttcacttctggatcgga300
ggaaaccgactgaaacgttttgaggagtggagatgggtatcagacggtcagaggattgag360
ttctttgacttctataaaactcagcctaaccagaatacgtccctgtgtatcgccctgtgg420
catccatttaagtacgactgggcggatgaaccttgtacatcctcttatggttacatatgt480
aaaatataagacgggcaatttcctctcagtgtttgcaggttgaaaaataaccgcgtgtat540
tgtaaaaaaatatgtactatacatactctgttataaacaatatgggaagtcattaaatga600
tatcatcaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa636
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atgacgatgttctatatcctggtgtttacagtcttcgtaggaaatatatacgcagtagaa60
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cctacacaatcttggtttaacgcaaatattcagtgtgaaaaccagaattccacactggcg180
aagctggacagtcgttctgagttggagtggatatatcaacgtcttctggctcgaaacgaa240
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<212>DNA
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<400>5
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Claims (6)

1.一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.一种马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2或3所示。
3.权利要求1所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1在抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长中的用途。
4.一对检测权利要求2所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因的荧光定量引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:4~5所示。
5.包含权利要求2所述马氏珠母贝凝集素PmCLEC-1基因的重组载体。
6.含有权利要求5所述重组载体的重组菌。
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