RU2710551C2 - Способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде - Google Patents
Способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде Download PDFInfo
- Publication number
- RU2710551C2 RU2710551C2 RU2016141568A RU2016141568A RU2710551C2 RU 2710551 C2 RU2710551 C2 RU 2710551C2 RU 2016141568 A RU2016141568 A RU 2016141568A RU 2016141568 A RU2016141568 A RU 2016141568A RU 2710551 C2 RU2710551 C2 RU 2710551C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- poloxamer
- minutes
- cell
- cell culture
- heated
- Prior art date
Links
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 title claims abstract description 642
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 630
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 title claims abstract description 613
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 129
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 120
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 16
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 14
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 149
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 133
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 76
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 63
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 62
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 62
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 claims description 15
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 claims description 14
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 12
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 8
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 6
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 74
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 68
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- -1 polyoxypropylene chain Polymers 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000000371 solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000009021 linear effect Effects 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 5
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002511 Poloxamer 237 Polymers 0.000 description 2
- 229920002517 Poloxamer 338 Polymers 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 2
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102400000113 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241001340526 Chrysoclista linneella Species 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000481961 Lachancea thermotolerans Species 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219828 Medicago truncatula Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102400000834 Relaxin A chain Human genes 0.000 description 1
- 101800000074 Relaxin A chain Proteins 0.000 description 1
- 102400000610 Relaxin B chain Human genes 0.000 description 1
- 101710109558 Relaxin B chain Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003452 antibody preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000007905 drug manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940066294 lung surfactant Drugs 0.000 description 1
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 108010087851 prorelaxin Proteins 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108010042974 transforming growth factor beta4 Proteins 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/30—Post-polymerisation treatment, e.g. recovery, purification, drying
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
- C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G2650/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G2650/28—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type
- C08G2650/50—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type containing nitrogen, e.g. polyetheramines or Jeffamines(r)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G2650/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G2650/28—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type
- C08G2650/58—Ethylene oxide or propylene oxide copolymers, e.g. pluronics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения полоксамера для применения в клеточной культуральной среде. Твердый полоксамер нагревают до 60-185°C до образования жидкого полоксамера. Жидкий полоксамер охлаждают до температуры ниже 50°C с образованием твердого термообработанного полоксамера. Охлаждение не проводят в устройстве для приллирования или измельчения. Полоксамер содержит сополимер оксид этилена и оксид пропилена, где полоксамер имеет формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, в которой n равно 60-150 и m равно 25-60. Технический результат - снижение вариабельности полоксамера и улучшение свойств полоксамера. 25 з.п. ф-лы, 11 ил., 17 табл., 11 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США № 61/970281, поданной 25 марта 2014 года, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к способам приготовления полоксамера (например, для применения в клеточной культуральной среде), клеточным культуральным средам, содержащим полоксамер, приготовленный, как описано в настоящем документе, а также способам применения клеточных культуральных сред, описанных в настоящем документе для культивирования клеток и продуцирования полипептидов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Технология производства клеточной культуры широко используется в производстве терапевтических средств на основе белков, таких как антитела, для применения в фармацевтических препаратах. Коммерческое производство продуктов на основе белка, таких как препараты антител, требует оптимизации параметров культивирования клеток для того, чтобы клетки производили большое количество продукта на основе белка для удовлетворения требований производства. Когда продукты на основе белка производятся в промышленных масштабах, такие факторы, как эффективность производства белков и стоимость сырья (например, компонентов в клеточной культуральной среде) имеют исключительно важное значение.
[0004] Полоксамер представляет собой компонент клеточной культуральной среды, которая широко используется в промышленном производстве белков. Его добавляли к клеточной культуральной среде для повышения жизнеспособности культивируемых клеток. Одна из его многочисленных функций состоит в том, чтобы действовать в качестве поверхностно-активного вещества, уменьшая силу прилипания между клетками и пузырьками газа в клеточной культуральной среде и защищая клетки от повреждений, в то время как лопаются пузырьки. Он также может повысить прочность клеточных мембран, улучшить дренаж клеток из вспененного слоя культуры, и изменить частоту и скорость образования пузырьков.
[0005] К сожалению, от партии к партии в свойствах полоксамера наблюдали значительную вариабельность. Применение в клеточной культуральной среде партии неэффективного полоксамера может привести к снижению жизнеспособности клеток и скорости роста клеток. Снижение жизнеспособности клеток приводит к снижению продуцирования белка. При культивировании, осуществляемом в промышленных масштабах, это снижение производства может привести к серьезным финансовым потерям.
[0006] Таким образом, существует потребность в простом, недорогом решении для снижения вариабельности полоксамера и улучшении свойств полоксамера, в частности, для некачественных партий.
[0007] Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем документе, включаются в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Настоящее изобретение, представленное в данном документе, раскрывает, в частности, способы приготовления полоксамера (например, для применения в клеточной культуральной среде). Также предложены полоксамеры, полученные способами, описанными в настоящем документе. Дополнительно описанные в данном документе композиции клеточных культуральных сред, содержащих полоксамер, приготовленный способами, описанными в настоящем документе. Дополнительно описанные в настоящем документе способы приготовления полипептида в культуре клеток путем культивирования клетки, которая продуцирует полипептид в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер, полученный способами, описанными в настоящем документе.
[0009] Соответственно, в одном аспекте, в настоящем документе предлагаются способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде, включающие следующие стадии: (а) нагревание твердого полоксамера по меньшей мере до температуры около 60°С с образованием жидкого полоксамера; и (б) охлаждение жидкого полоксамера до температуры ниже около 50°С с образованием твердого термообработанного полоксамера, причем охлаждение не проводят в устройстве для приллирования или измельчения, и причем полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер увеличивается по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер перед стадией (а). В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) нагревали в диапазоне от около 60°С до около 185°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а), нагревали в диапазоне от около 157°C до около 185°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 157°C до около 185°С в течение не менее 1 минуты. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 157°C до около 185°С в течение от 1 минуты до около 250 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а), нагревали в диапазоне от около 134°C до около 157°C. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 134°C до около 157°C в течение не менее 1 минуты. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 134°C до около 157°C в течение от 1 минуты до примерно 250 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) нагревали в диапазоне от около 120°С до около 134°C. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 120°С до около 134°C в течение по меньшей мере около 62 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 120°C до около 134°C в течение от около 62 минут и до около 250 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) нагревали в диапазоне от около 100°C до около 120°C. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 100°C до около 120°C в течение по меньшей мере около 98 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящего изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 100°С до около 120°C в течение от около 98 минут до около 250 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) нагревали в диапазоне от около 80°С и до около 100°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 80°С и до около 100°С в течение по меньшей мере около 122 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 80°С и до около 100°С в течение от около 122 минут до около 250 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) нагревали в диапазоне от около 60°С и до около 80°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 60°С и до около 80°С в течение по меньшей мере около 143 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 60°С и до около 80°С в течение от около 143 минут до около 250 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер, увеличивается по меньшей мере на 10% по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер перед стадией (а). В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток увеличивается по меньшей мере на около 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток увеличивается по меньшей мере на около 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер до стадии (а), составляла ниже около 80% после около 3 часов культивирования клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения жидкий полоксамер на стадии (б) охлаждали при температуре окружающей среды от около 2°С до около 8°C или ниже 0°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в вакууме. В некоторых вариантах реализации изобретения жидкий полоксамер охлаждали в течение по меньшей мере около 20 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения термообработанный полоксамер, полученный на стадии (б), добавляли в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах реализации изобретения стадии (а) и (б) повторяли по меньшей мере один раз перед добавлением термообработанного полоксамера в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер обрабатывали с помощью грануляционного процесса перед стадией (а). В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер имеет формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, где n составляет от около 60 до около 150 и m составляет от около 25 до около 60. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер имеет температуру плавления около 55°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер имеет среднюю молекулярную массу от около 6000 до около 18000 Дальтон. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер, имеющий формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, с n, имеющим значение около 80, и с m, имеющим значение около 27, и полоксамер имеет в среднем молекулярную массу от около 7680 до около 9510 г/моль. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой полоксамер 188. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка продуцирует полипептид.
[0010] В другом аспекте в настоящем документе предлагается полоксамер, приготовленный любым из способов, описанных выше и в данном документе.
[0011] В дополнительном аспекте изобретения в настоящем документе предлагается клеточная культуральная среда, содержащая полоксамер, приготовленный любым из способов, описанным выше и в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 3 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 3 г/л до около 10 г/л.
[0012] В еще одном дополнительном аспекте изобретения в настоящем документе предлагаются способы получения полипептида в культуре клеток, включающие стадию культивирования клетки, которая продуцирует полипептид в клеточной культуральной среде в условиях пригодных для продуцирования полипептида, причем клеточная культуральная среда содержит полоксамер, полученный любым из способов, описанных выше и в данном документе. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). В некоторых вариантах о реализации изобретения клетка представляет собой клетку насекомого. В некоторых вариантах реализации клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 3 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения культуральная клеточная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 3 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
[0013] Соответственно, в одном аспекте изобретения в данном документе предлагаются способы приготовления полоксамера (например, для применения в клеточной культуральной среде), включающий следующие стадии: (а) нагревание очищенного полоксамера до температуры около 80°С или выше (например, от около 80°С до около 100°С) с образованием жидкого полоксамера, и (б) охлаждение жидкого полоксамера до температуры около 50°С или ниже с образованием твердого термообработанного полоксамера, причем охлаждение не проводится в устройстве для приллирования или измельчения. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена, имеющего формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, где n равняется от около 60 до около 150 и m равняется от около 25 до около 60. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер увеличивается по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер перед стадией (а). В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой очищенный полоксамер. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер представляет собой композицию полоксамера, которая не содержит другого терапевтического или фармацевтического соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) не содержит другого терапевтического или фармацевтического соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер на стадии (а) нагревали в диапазоне от около 85°C до около 91°C. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе полоксамер нагревали от около 10 до около 15 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе жидкий полоксамер на стадии (б) охлаждали при температуре окружающей среды в диапазоне от около 2°С до около 8°C или ниже 0°С. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе жидкий полоксамер охлаждали в течение по меньшей мере около 20 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе термообработанный полоксамер, полученный на стадии (б) добавляли в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах вариантах реализации изобретения в данном документе стадии (а) и (б) повторяли по меньшей мере один раз перед добавлением термообработанного полоксамера в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе жизнеспособность клеток увеличивается по меньшей мере на около 10%. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе жизнеспособность клеток увеличивается по меньшей мере на около 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер до стадии (а), составляет менее 80%. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе полоксамер обрабатывали с помощью грануляционного процесса перед стадией (а). В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе полоксамер имеет температуру плавления в интервале от около 45°С до около 60°С. В некоторых реализации изобретения в настоящем документе полоксамер имеет среднюю молекулярную массу от около 6000 до около 18000 Дальтон. В некоторых вариантах реализации изобретения в настоящем документе полоксамер представляет собой полоксамер 188. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер, имеющий формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH с n, имеющим значение около 80, с m, имеющим значение около 27, и полоксамер имеет среднюю молекулярную массу от около 7680 до около 9510 г/моль. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе полоксамер представляет собой полоксамер 237. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер, имеющий формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, с n, имеющим значение около 64, и с m, имеющим значение около 37. В некоторых вариантах реализации в данном документе полоксамер представляет собой полоксамер 338. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер, имеющий формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH с n, имеющим значение от около 141 и с m, имеющим значение около 44. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе полоксамер представляет собой полоксамер 407. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер, имеющий формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, с n, имеющим значение около 101, и с m, имеющим значение около 56. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе клетка может быть клеткой млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка может быть клеткой яичника китайского хомячка (СНО). В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе клетка может быть клетка насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе клетка продуцирует полипептид. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В другом аспекте изобретения в данном документе предлагается полоксамер, полученный любым из способов, описанных выше и в данном документе.
[0014] В другом аспекте изобретения в данном документе предлагаются клеточные культуральные среды, содержащие полоксамер, полученный любым из способов, описанных выше и в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 3 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 3 г/л до около 10 г/л.
[0015] В другом аспекте изобретения в данном документе предлагаются способы получения полипептида в культуре клеток, включающие стадию культивирования клетки, которая продуцирует полипептид в клеточной культуральной среде в условиях, пригодных для продуцирования полипептида, причем клеточная культуральная среда содержит полоксамер, полученный любым из способов, описанных выше и в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная клетка содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 3 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда содержит термообработанный полоксамер в концентрации от около 3 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид, продуцируемый клеткой, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
[0016] Следует понимать, что один, несколько или все свойства различных вариантов реализации изобретения, описанные в данном документе, могут быть объединены с образованием других вариантов реализации настоящего изобретения. Данные и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными для специалиста в данной области техники.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0017] На фиг. 1 показано, что термическая обработка полоксамера улучшает его влияние на жизнеспособность клеток в культуре. Ромбовидная схема демонстрирует среднее (по центральной линии) и верхний/нижний доверительный интервал при доверительной вероятности 0,95 (точки схемы в виде ромба), а также значения жизнеспособности клеток (точки) для каждого экспериментального условия. В каждом эксперименте сравнивают необработанный и термообработанный (ТО) полоксамер по сравнению с полоксамером качественной или некачественной («предполагаемой») партии, как указано на оси х. Стрелки указывают на улучшение жизнеспособности клеток после термической обработки некачественных партий. Следует отметить, что термическая обработка также улучшила жизнеспособность клеток в качественной партии, в среднем от около 85% до около 95%.
[0018] На фиг. 2 показана жизнеспособность клеток (%) в тесте модели с большим сдвиговым усилием к встряхиваемой колбе (HSSF) для необработанных и термообработанных (_ТО) образцов полоксамера A, B, и C (см. также таблицу 2).
[0019] На фиг. 3 показан план эксперимента на поверхности отклика условий, тестируемых в печах. Каждое условие обозначено в формате «время, температура». В условиях, отмеченных '♦', тестировали в HSSF. В условиях, отмеченных «◊», готовили в сушильном шкафу, но не тестировали в HSSF. Температура (в °С) представляет собой заданную температуру сушильного шкафа, а время (в мин) представляет собой время нахождения образца полоксамера в сушильном шкафу.
[0020] На фиг. 4 показано повышение жизнеспособности клеток (%) (Vf (обработанный)-Vf (необработанный)) для образцов C полоксамера, термически обработанных в сушильном шкафу при указанных условиях, по сравнению с положительной («качественная партия») и отрицательной («необработанная некачественная партия») контрольными группами (D и C, соответственно). Планки погрешностей изображают одно стандартное отклонение.
[0021] На фиг. 5 показан контурный график из полного планирования экспериментов (ПЭ) по изучению влияния различных условий термообработки на свойства полоксамера в клеточной культуре. В тесте HSSF продемонстрировано повышение жизнеспособности (Vf (обработанный)-Vf (необработанный)) в зависимости от времени и температуры. Точками обозначены условия испытуемого образца.
[0022] На фиг. 6 показано повышение жизнеспособности клеток (%) (Vf (обработанный)-Vf (необработанный)) в тесте HSSF дляобразцов полоксамера из трех некачественных партий (H, F и G) и одной качественной партии (E), термически обработанной при указанных условиях.
На фиг.7 показано сравнение повышения жизнеспособности клеток (%) (Vf (обработанный)-Vf (необработанный)) для полоксамера некачественных партий (H и G), подвергаемых обработке при низких температурах (60-80°С) в течение длительного времени (120 мин). * Модель HSSF выполняли в двух повторностях.
[0023] На фиг.8 показано повышение жизнеспособности клеток (%) (Vf (обработанный)-Vf (необработанный)) в тесте HSSF образцов полоксамера (Н и G), термически обработанных в условиях вакуума, по сравнению с необработанными.
[0024] На фиг. 9 показаны профили нагревания и охлаждения полоксамера в печах. Были протестированы три температуры: 140°C, 155°C и 170°С. После того, как показания температуры начали стабилизироваться, вещество извлекали из сушильного шкафа и охлаждали при комнатной температуре. Профили стабилизировались при 40°C, вблизи точки плавления полоксамера.
[0025] На фиг. 10 показаны результаты теста Стьюдента для каждой партии термообработанного полоксамера по сравнению с положительным контролем (D) и необработанным веществом. Средние ромбовидные схемы иллюстрируют доверительный интервал при доверительной вероятности 0,95 (верхние и нижние точки) и средние (центральная линия) для каждого массива данных.
[0026] На фиг. 11 показан контурный график для данных с экспериментов для поверхности отклика и полного ПЭ эксперимента, иллюстрирующие большой рабочий диапазон условий термической обработки полоксамера. Изменение жизнеспособности клеток (%) для каждой стадия испытаний продемонстрировано. В тесте HSSF показано повышение жизнеспособности (Vf (обработанный)-Vf (необработанный)) в зависимости от времени и температуры. Поверхность отклика отражает данные времени инкубации и температуры с поправкой на время, необходимое для достижения заданной температуры. Точками обозначены тестируемые условия для образца.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0027] Авторы данной заявки показали, что термическая обработка полоксамера улучшает свойства полоксамера в поддержании жизнеспособности в культуре клеток. Данные, приведенные в данной заявке, демонстрируют, что использование клеточной культуральной среды с термообработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток, по сравнению с использованием клеточной культуральной среды без термообработанного полоксамера. Авторы настоящего изобретения показали, что различные партии полоксамера при добавлении в клеточную культуральную среду, имеют существенно различное воздействие на жизнеспособность клеток, и также то, что термическая обработка, описанная в данном документе, усиливает влияние качественных и некачественных партий полоксамера на жизнеспособность клеток.
[0028] В одном аспекте изобретения в данном документе предлагаются способы приготовления полоксамера путем нагревания полоксамера и охлаждения полоксамера, причем охлаждение не проводят в устройстве для приллирования или измельчения. В некоторых вариантах реализации изобретения способы включают получение полоксамера нагреванием полоксамера до температуры около 80°С или выше (например, до около 100°С) с получением жидкого полоксамера и охлаждение жидкого полоксамера до температуры ниже около 50°С с образованием твердого термообработанного полоксамера, причем охлаждение не проводится в устройстве для приллирования или измельчения, и при этом полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена, имеющего формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, где n равняется от около 60 до около 150 и m равняется от около 25 до около 60. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой твердый полоксамер перед процессом нагревания и охлаждения. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой жидкий полоксамер жидкость при комнатной температуре перед процессом нагревания и охлаждения. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой твердый полоксамер, растворенный в жидком или водном растворе, перед процессом нагревания и охлаждения. Например, способы, представленные в данном документе, могут быть использованы в приготовлении полоксамера для применения в культуре клеток или клеточной культуральной среде.
[0029] В другом аспекте изобретения в данном документе предлагаются композиции для культивирования клеток, включая термообработанной полоксамер. В другом аспекте изобретения в данном документе предлагаются композиции для клеточной культуры, содержащие термообработанный полоксамер в клеточной культуральной среде.
[0030] В другом аспекте изобретения в данном документе предлагаются способы приготовления полипептида в культуре клеток путем культивирования клетки, которая продуцирует полипептид в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер в условиях, подходящих для продуцирования полипептида.
I. Термины
[0031] Перед описанием изобретения в деталях, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными композициями или биологическими системами, которые могут, конечно, варьироваться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, нацелена на описание конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения изобретения.
[0032] Используемые в данном описании изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если в содержании явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «молекулу» необязательно включает комбинацию двух или более таких молекул, и тому подобное.
[0033] Термин «около», используемый в данном документе, относится к обычному диапазону значений ошибок для соответствующего значения хорошо известному специалисту в данной области техники. Ссылка на «около» значение или параметр в данном документе включает (и описывает) варианты реализации изобретения, которые направлены к этому значению или параметру как таковому.
[0034] Следует понимать, что аспекты и варианты реализации изобретения, описанные в данном документе, включают «включающий», «состоящий» и «состоящий по существу из» аспектов и вариантов реализации изобретения.
[0035] Термин «полоксамер» относится к блок-сополимеру, полученному из цепочки полиоксипропилена (термин «оксид пропилена» может быть использован в настоящем документе взаимозаменяемо) между двух цепей полиоксиэтилена (термин «оксид этилена» может быть использован в настоящем документе взаимозаменяемо). Полоксамеры могут продаваться под торговыми названиями, включая PLURONIC® (BASF), KOLLIPHOR® (BASF), LUTROL® (BASF) и SYNPERONIC® (Croda International). Если не указан конкретный вид полоксамера, ссылки на «полоксамер» могут, в общем, относится к нескольким видам полоксамера.
[0036] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой очищенный полоксамер. Термин «очищенный полоксамер» относится к композиции полоксамера, которая по существу свободна от других соединений. Очищенный полоксамер может включать, например, коммерчески доступный полоксамер, имеющей техническую степень чистоты или выше. Примеры технической степени чистоты или выше могут включать техническую чистоту, чистую степень, степень чистоты по Н.Ф. (Национальный формуляр Соединенных Штатов), степень фармацевтической чистоты (согласно Фармакопеи США), высокую степень чистоты и максимальную степень чистоты, соответствующую стандарту ACS (Американское общество химиков). Очищенный полоксамер относится к тому, который не смешан с другим соединением. Например, очищенный полоксамер может относиться к полоксамеру, который не смешан с терапевтическим или фармацевтическим соединением, например, как часть лекарственного препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер представляет собой тот, который по существу свободен от или не смешан с, не вступает в реакцию с реагентами, катализаторами или другими продуктами, полученными в процессе синтеза или реакции полоксамера.
[0037] Термин «термообработанный полоксамер» относится к полоксамеру, термически обработанному по меньшей мере один раз с помощью способов, предложенных в данном документе.
[0038] Термины «питательная среда» и «клеточная культуральная среда» относится к источнику питательных веществ, используемому для выращивания или поддержания клеток. Как понятно специалисту в данной области техники, источник питательных веществ может содержать компоненты, необходимые клетке для роста и/или выживаемости или могут содержать компоненты, которые помогают в росте и/или выживаемости клеток. Витамины, заменимые или незаменимые аминокислоты, микроэлементы и поверхностно-активные вещества (например, полоксамеры) представляют собой примеры компонентов питательной среды. Любые питательные среды, предложенные в данном документе, могут быть также дополнены любым одним или более из инсулина, растительных гидролизатов и животных гидролизатов.
[0039] Термин «культивирование» клетки относится к контактированию клетки с клеточной культуральной средой в условиях, подходящих для обеспечения жизнеспособности и/или роста и/или пролиферации клетки.
[0040] Термин «периодическая культура» относится к культуре, в которой все компоненты для культивирования клеток (включая клетки и все питательные вещества и компоненты культуры), добавляют в культуральный сосуд, в начале процесса культивирования.
[0041] Термин «клеточная культура с подпиткой», используемый в данном документе, относится к периодической культуре, в которой клетки и культуральную среду добавляют в культуральный сосуд на начальном этапе, а также культуру непрерывно или дискретно подпитывают дополнительными питательными веществами в процессе культивирования с или без периодического сбора клеток и/или продукта до прекращения культивирования.
[0042] Термин «проточная культура» представляет собой культуру, в которой клетки удерживаются в культуре путем, например, фильтрации, инкапсуляции, закреплением на микроносителях и т.д., и культуральную среду непрерывно или периодически вводят и извлекают из культурального сосуда.
[0043] Термин «культуральный сосуд» относится к емкости, используемой для культивирования клетки. Культуральный сосуд может быть любого размера, при условии, что это полезно для культивирования клеток.
[0044] Термины «полипептид» и «белок», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может быть разделен не аминокислотами. Термины также включают полимер аминокислоты, который был изменен естественным образом или путем вмешательства; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием, или любыми другими манипуляциями или модификациями, такими как конъюгация с мечением компонента. Также термин включает, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включающие, например, неприродные аминокислоты, и т.д.), а также другие модификации известные в данной области техники. Примеры полипептидов, охватываемые термином в настоящем документе, включают белки млекопитающих, такие как, например, ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и бычий гормон роста; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1 антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; противосвертывающие факторы крови, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или человеческая моча или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли-альфа и -бета; энкефалиназы; цитокин А5 (хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации); человеческий макрофагальный белок воспаления (МБВ-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКазы; IgE; антиген цитотоксического Т-лимфоцита (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидный фактор; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейротропин-3, -4, -5, -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервной ткани, такой как NGF-б; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такие как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (ЭФР); трансформирующий фактор роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IИФР-I и ИФР-II); дез (1-3) -ИФР-I (мозговой ИФР-I), белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста (БСИФР); CD-белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSFs), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (ИЛ), например, от ИЛ-1 до ИЛ-10; супероксиддисмутаза; рецепторы Т-клеток; поверхностные мембранные белки; фактор ускорения распада; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки вируса ВИЧ; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; аддрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, с ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолеассоциированный антиген, такой как CA125 (антиген карциномы яичников) или рецепторы HER2, HER3 или HER4; иммуноадгезины; и фрагменты и/или варианты любого из вышеперечисленных белков, а также антитела, в том числе фрагменты антител, связывающиеся с белком, в том числе, например, любой из перечисленных выше белков.
[0045] Термин «титр», используемый в данном документе, относится к общему количеству рекомбинантно экспрессируемого антитела, продуцируемого клеточной культурой, деленного на заданную величину объема питательной среды. Титр, как правило, выражается в единицах: миллиграммы антитела на миллилитр питательной среды. Титр могут быть выражен или оценен с точки зрения относительного измерения, например, процентного увеличения титра по сравнению с получением белкового продукта в различных условиях культивирования.
[0046] Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, до тех пор, пока они проявляют необходимую биологическая активность. Антитело может быть человеческим, гуманизированным и/или с созревшей аффинностью.
[0047] Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «нормальное антитело», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к антителу в его по существу интактной форме, а не к фрагментам антител, как это определено ниже. Термины в частности относятся к антителу с тяжелыми цепями, которые содержат Fc-область.
[0048] «Фрагменты антитела» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащие его антигенсвязывающую область (может использоваться взаимозаменяемо с термином «антигенсвязывающий фрагмент»). Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab ', F (аb') 2 и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
II. Способы приготовления полоксамера
[0049] В данном документе предлагаются способы приготовления полоксамера, например, для применения в клеточной культуральной среде.
Нагревание
[0050] В некоторых аспектах изобретения способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде, предложенные в данном документе, включают нагревание полоксамера (например, очищенного полоксамера) с образованием жидкого полоксамера. Например, очищенный полоксамер в твердом состоянии можно нагревать до плавления, вследствие чего образуется жидкий полоксамер. Температура, до которой нагревается полоксамер, может корректироваться на основании температуры плавления конкретного используемого вида полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер имеет температуру плавления в интервале от около 45°С до около 60°С. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер имеет температуру плавления в интервале от около 50°С до около 55°С.
[0051] В некоторых вариантах реализации изобретения способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде, предложенной в данном документе, включают нагревание твердого полоксамера до температуры по меньшей мере около 60°С с получением жидкого полоксамера и охлаждением жидкого полоксамера до температуры ниже около 50°С с образованием твердого термообработанного полоксамера, причем охлаждение не проводят в устройстве для приллирования или измельчения, и полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер представляет собой очищенный полоксамер. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер представляет собой композицию полоксамера, которая не содержит другого терапевтического или фармацевтического соединения.
[0052] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали до температуры по меньшей мере примерно одной из следующих температур (в °С): 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180 или 185. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в течение не менее 1 минуты. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в течение по меньшей мере около 1 минуты, по меньшей мере около 2 минут, по меньшей мере около 3 минут, по меньшей мере около 4 минут, по меньшей мере около 5 минут, по меньшей мере около 6 минут, по меньшей мере около 7 минут, по меньшей мере около 8 минут, по меньшей мере около 9 минут, по меньшей мере около 10 минут, по меньшей мере около 15 минут, по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 25 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 35 минут, при меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 45 минут, по меньшей мере около 50 минут, по меньшей мере около 55 минут, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 65 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере около 75 минут, по меньшей мере около 80 минут, по меньшей мере около 85 минут, по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут или по меньшей мере около 240 минут.
[0053] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в диапазоне от около 60°С до около 185°С. Следует отметить, что любой из диапазонов температур, описанных в данном документе, предусматривают включение, если явно не указано иное. Например, диапазон температур от около 60°C до около 185°С включает около 60°С и около 185°С, как находящиеся в указанном диапазоне. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °С): 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70 или 65. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая из следующих температур (в °С): 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 или 180. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел в 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70 или 65 и независимо может быть выбран нижний предел в 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 или 180, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в диапазоне от около 60°С до 185°С в течение не менее 1 мин. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в течение по меньшей мере около 1 минуты, по меньшей мере около 2 минут, по меньшей мере около 3 минут, по меньшей мере около 4 минут, по меньшей мере около 5 минут, по меньшей мере около 6 минут, по меньшей мере около 7 минут, по меньшей мере около 8 минут, по меньшей мере около 9 минут, по меньшей мере около 10 минут, по меньшей мере около 15 минут, по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 25 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 35 минут, при меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 45 минут, по меньшей мере около 50 минут, по меньшей мере около 55 минут, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 65 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере около 75 минут, по меньшей мере около 80 минут, по меньшей мере около 85 минут, по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по крайней мере, около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут, или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 60°C до около 185°С в течение от около 1 минуты до около 250 минут. Следует отметить, что любой из временных диапазонов, описанных в данном документе, предусматривают включение, если явно не указано иное. Например, диапазон времени от около 1 минуты до около 250 минут, включает около 1 минуты и около 250 минут, как находящиеся в указанном диапазоне. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в течение менее около любого из следующих интервалов (в минутах): 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в течение более чем около любого из следующих интервалов (в минутах): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230 или 240. То есть, полоксамер может быть нагрет в течение времени в интервале, имеющем верхний предел в 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 и независимо может быть выбран нижний предел в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230 или 240, причем нижний предел меньше, чем верхний предел.
[0054] В некоторых вариантах реализации полоксамер (например, очищенный полоксамер), нагревали в диапазоне от около 157°C до около 185°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °C): 185, 180, 175, 170, 165 или 160. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая из следующих температур (в °C): 157, 160, 165, 170, 175 или 180. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел 185, 180, 175, 170, 165 или 160 и независимо может быть выбран нижний предел 157, 160, 165, 170, 170 или 180, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 157°C до около 185°С в течение по меньшей мере около 1 минуты, по меньшей мере около 2 минут, по меньшей мере около 3 минут, по меньшей мере около 4 минут, по меньшей мере около 5 минут, по меньшей мере около 6 минут, по меньшей мере около 7 минут, по меньшей мере около 8 минут, по меньшей мере около 9 минут, по меньшей мере около 10 минут, по меньшей мере около 15 минут, по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 25 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 35 минут, по меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 45 минут, по меньшей мере около 50 минут, по меньшей мере около 55 минут, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 65 минут, по меньшей мере около 70 минут, по крайней мере, около 75 минут, по меньшей мере около 80 минут, по меньшей мере около 85 минут, по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут, или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 157°C до около 185°С в течение 250 минут или менее.
[0055] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер), нагревали в диапазоне от около 134°C до около 157°C. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °C): 157, 155, 150, 145, 140 или 135. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая из следующих температур (в °С): 134, 135, 140, 145, 150 или 155. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел 157, 155, 150, 145, 140 или 135 и независимо может быть выбран нижний предел 134, 135, 140, 145, 150 или 155, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 134°C до около 157°С в течение по меньшей мере около 1 минуты, по меньшей мере около 2 минут, по меньшей мере около 3 минут, по меньшей мере около 4 минут, по меньшей мере около 5 минут, по меньшей мере около 6 минут, по меньшей мере около 7 минут, по меньшей мере около 8 минут, по меньшей мере около 9 минут, по меньшей мере около 10 минут, по меньшей мере около 15 минут, по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 25 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 35 минут, по меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 45 минут, по меньшей мере около 50 минут, по меньшей мере около 55 минут, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 65 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере, около 75 минут, по меньшей мере около 80 минут, по меньшей мере около 85 минут, по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут, или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 134°C до около 157°С в течение 250 минут или менее.
[0056] В некоторых вариантах реализации полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в диапазоне от около 120°С до около 134°C. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °С): 134, 130 или 125. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая из следующих температур (в °С): 120, 125 или 130. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел 134, 130 или 125 и независимо может быть выбран нижний предел в 120, 125 или 130, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 120°С до около 134°С в течение по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 50 минут, или по меньшей мере около 60 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 120°С до около 134°С в течение по меньшей мере около 62 минут, по меньшей мере около 65 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере около 75 минут, по меньшей мере около 80 минут, по меньшей мере около 85 минут, по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере приблизительно 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 120°С до около 134°С в течение 250 минут или менее.
[0057] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в диапазоне от около 100°C до около 120°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °С): 120, 115, 110 или 105. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры выше около любой из следующих температур (в °С): 100, 105, 110 или 115. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел в 120, 115, 110, или 105, и независимо может быть выбран нижний предел в 100, 105, 110, или 115, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 100°C до около 120°С в течение по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 50 минут, или, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере около 80 минут или по меньшей мере около 90 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 100°C до около 120°С в течение по меньшей мере около 98 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут, или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 100°C до около 120°С в течение 250 минут или менее.
[0058] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в диапазоне от около 80°С до около 100°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °С): 100, 95, 90 или 85. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер, нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая из следующих температур (в °С): 80, 85, 90 или 95. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел 100, 95, 90 или 85 и независимо может быть выбран нижний предел 80, 85, 90 или 95, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 80°С до около 100°С в течение по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 50 минут, или, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере около 80 минут, или по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, или по меньшей мере около 120 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 80°С до около 100°С в течение по меньшей мере около 122 минут, по меньшей мере около 130 минут, по меньшей мере около 140 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут, или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 80°С до около 100°С в течение 250 минут или менее.
[0059] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер (например, очищенный полоксамер) нагревали в диапазоне от около 60°С до около 80°С. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры менее чем примерно любая из следующих температур (°С): 80, 75, 70 или 65. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая из следующих температур (в °С): 60, 65, 70, или 75. То есть, полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел 80, 75, 70 или 65 и независимо может быть выбран нижний предел 60, 65, 70 или 75, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 60°C до около 80°С в течение по меньшей мере около 20 минут, по меньшей мере около 30 минут, по меньшей мере около 40 минут, по меньшей мере около 50 минут, или, по меньшей мере около 60 минут, по меньшей мере около 70 минут, по меньшей мере около 80 минут, или по меньшей мере около 90 минут, по меньшей мере около 100 минут, по меньшей мере около 110 минут, по меньшей мере около 120 минут, по меньшей мере 130 минут или по меньшей мере 140 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 60°C до около 80°С в течение по меньшей мере около 143 минут, по меньшей мере около 150 минут, по меньшей мере около 160 минут, по меньшей мере около 170 минут, по меньшей мере около 180 минут, по меньшей мере около 190 минут, по меньшей мере около 200 минут, по меньшей мере около 210 минут, по меньшей мере около 220 минут, по меньшей мере около 230 минут или по меньшей мере около 240 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в диапазоне от около 60°С до около 80°С в течение 250 минут или менее.
[0060] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер нагревали в вакууме. Например, полоксамер могут нагревать в вакуумном сушильном шкафе под воздействием вакуума. Как описано ниже, было непредвиденно установлено, что при нагревании полоксамера при температурах, описанных в данном документе, при применении вакуума, улучшаются свойства полоксамера (см., например, пример 7). Иначе говоря, воздействие вакуума на полоксамер в процессе нагрева, не отменяет положительное влияние на свойства полоксамера, являющиеся результатом нагрева, например, в клеточной культуре.
[0061] В других вариантах реализации изобретения нагрев полоксамера до заданной температуры в течение определенного периода времени может относиться к тому времени, в течение которого полоксамер находится на определенной температуре. То есть, время=0 может указывать на время, при котором полоксамер достиг заданной температуры. Например, нагревание полоксамера до 140°C в течение 5 минут, может указывать на то, что полоксамер нагревали в течение 5 минут после достижения температуры 140°С. Например, нагревание полоксамера (например, очищенный полоксамер) в диапазоне от около 60°C до около 185°С в течение по меньшей мере 1 минуты указывает на то, что полоксамер достиг заданной температуры (например, от около 60°С до около 185°С) в течение не менее 1 минуты.
[0062] В некоторых вариантах реализации изобретения температура очищенного полоксамера во время процесса нагревания не превышала около 120°C. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер может быть растворен в жидком или водном растворе перед процессом нагревания. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер, растворенный в жидком или водном растворе, может быть нагрет до более высокой температуры, чем можно было бы использовать для твердого полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер представляет собой твердый полоксамер перед процессом нагревания. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер представляет собой жидкость полоксамера при комнатной температуре перед процессом нагревания.
[0063] В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали в диапазоне от около 80°С до около 100°С. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали в диапазоне от около 85°C до около 91°C. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из следующих температур (в °С): 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82 или 81. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали до температуры примерно более высокой, чем любая следующих температур (в °С): 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99. То есть, очищенный полоксамер может быть нагрет до температуры в диапазоне температур, имеющих верхний предел в 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, или 81 и независимо может быть выбран нижний предел в 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99, причем нижний предел меньше, чем верхний предел. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали до температуры менее около 120°С. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали до температуры примерно более низкой, чем любая из температур в 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C, 116°C, 117°C, 118°C и 119°C.
[0064] Очищенный полоксамер может быть нагрет в течение любого необходимого периода времени. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали в течение от около 10 до около 15 минут. Время нагревания может относиться к общему времени, в течение которого тепло применяли к полоксамеру, так что время нагрева не ограничено временем, в течение которого полоксамер достигает нужной температуры. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный полоксамер нагревали в течение общего периода времени от около 10 до около 15 минут, и прекращали нагревание, когда полоксамер достигал желаемой максимальной температуры, например, от около 80°С до около 100°С.
[0065] Любой подходящий нагревательный прибор, известный в данной области техники, может быть использован для нагревания очищенного полоксамера. В качестве не ограничивающего примера, твердый полоксамер можно нагревать в стеклянной таре (например, химический стакан, колба или другой открытый сосуд PYREX®), которую нагревают на стандартной лабораторной нагревательной плите (например, мешалке с подогревом, продаваемой Corning®, Costar® или Thermo Scientific®). В качестве альтернативы, полоксамер можно нагревать в вакуумном сушильном шкафу.
[0066] Любое подходящее устройство для измерения температуры, известное в данной области техники, может быть использовано для измерения температуры полоксамера во время/после термической обработки, при условии, что устройство для измерения температуры используется таким образом, что точное измерение температуры полоксамера может быть выполнено (например, в соответствии с инструкциями изготовителя по эксплуатации). Не ограничивающие примеры подходящих устройств для измерения температуры включают, без ограничений, термометры (например, стеклянные жидкостные термометры), термопары (например, как описано ниже), резистивные датчики температуры (терморезисторы), и/или термисторы. В некоторых вариантах реализации изобретения устройства для измерения температуры может быть встроено в оборудование, используемое для нагревания.
Охлаждение
[0067] В некоторых аспектах изобретения способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде, описанной в данном документе, включают охлаждение нагретого, очищенного полоксамера с образованием твердого термообработанного полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения жидкий полоксамер охлаждали до температуры ниже около 50°С. Температура до которой жидкий полоксамер охлаждается может быть любой температурой ниже температуры отвердевания, которая может варьироваться в зависимости от конкретного используемого полоксамера. Например, полоксамер 188 имеет температуру отвердевания около 52°C, так что полоксамер может быть охлажден до любой температуры ниже около 52°C с образованием твердого термообработанного полоксамера.
[0068] Нагретый жидкий полоксамер может быть охлажден при любой температуре, достаточной для отвердевания полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения нагретый жидкий полоксамер охлаждают при температуре окружающей среды. В некоторых вариантах реализации изобретения нагретый жидкий полоксамер охлаждали при температуре от около 2°С до около 8°C. В некоторых вариантах реализации изобретения нагретый жидкий полоксамер охлаждали при температуре ниже около 0°С, например, при температуре около -20°С или при температуре около -70°C.
[0069] Нагретый жидкий полоксамер может быть охлажден в течение любого необходимого периода времени, достаточного для отвердевания нагретого жидкого полоксамера при данной температуре охлаждения. В некоторых вариантах реализации изобретения жидкий полоксамер охлаждали в течение примерно 20 минут. Время охлаждения может зависеть от температуры до которой полоксамер нагревали и/или температуры охлаждения. Температура охлаждения и время могут быть определены эмпирически путем наблюдения за тем сколько времени требуется жидкому полоксамеру (нагреваемый до заданной температуры в течение заданного промежутка времени) для отвердевания при определенной температуре охлаждения.
[0070] Любое подходящее охлаждающее устройство известное в данной области техники, за исключением устройства для для приллирования или измельчения, может быть использовано для охлаждения нагретого жидкого полоксамера. Например, нагретый жидкий полоксамер может быть помещен в рефрижератор, морозильную установку или холодильную камеру, обеспечивающую достаточную температуру охлаждения, как описано выше. В качестве альтернативы, конкретное охлаждающее устройство может не использоваться, но взамен нагретый жидкий полоксамер может быть охлажден в нагревательном приборе после того, как прибор будет выключен или запрограммирован на остановку нагревания. В этом случае нагретый жидкий полоксамер остывает при температуре окружающей среды. Например, если полоксамер нагревали на плите, то нагретый жидкий полоксамер может быть охлажден простым остыванием на плите, после того как функция нагрева плиты будет отключена. В качестве альтернативы, полоксамер может быть охлажден в вакуумном сушильном шкафу. В некоторых вариантах реализации изобретения охлаждение нагретого жидкого полоксамера не включает использование жидкого азота. В некоторых вариантах реализации изобретения охлаждение нагретого жидкого полоксамера не включает распыление или пульверизацию нагретого жидкого полоксамера через газ, поддерживаемый при определенной температуре. В некоторых вариантах реализации изобретения охлаждение нагретого жидкого полоксамера не включает формирование полоксамера в частицы или микрочастицы определенного или одинакового размера и/или формы
Приллирование/измельчение
[0071] В некоторых вариантах реализации изобретения охлаждение не проводится в устройстве для приллирования или измельчения. Полоксамер был приготовлен в данной области техники путем приллирования или измельчения для достижения конкретного, одинакового размера частиц и/или формы полоксамера (для примера, описываемый полоксамер приллировали и измельчали, см. европейский патент EP1661558 B1 или патент США №7887844). Приллирование полоксамера включает пропускание жидкого полоксамера через форсунку для создания жидких частиц полоксамера и охлаждение этих частиц в охлаждающей среде, например, газе, поддерживаемом при определенной температуре, или жидком азоте. Температура охлаждающей среды, как полагают, определяет скорость затвердевания полоксамера, которая влияет на конечный размер и форму частиц полоксамера. Пример устройства для приллирования может включать, без ограничений, башню приллирования. В башне приллирования распыляемый полоксамер выпускается из верхней части башни, и застывает в виде частиц при падении через газ или жидкость охлаждающей среды (например, атмосферный воздуха, воздух, поддерживаемый при определенной температуре, или жидкий азот).
[0072] Измельчение (или микроизмельчение) полоксамера включает измельчение твердого полоксамера, или нагнетание твердого полоксамера под высоким давлением через сопло, пока частицы полоксамера определенного размера не образуются. Так как в процессе измельчения может выделяться тепло, а полоксамеры имеют относительно низкую температуру плавления, то полоксамер часто охлаждают во время процесса измельчения для сохранения твердого состояния, например, путем охлаждения охлажденным воздухом или жидким азотом. Полоксамер также может быть охлажден перед измельчением и измельчаться в течение периода времени недостаточного для плавления полоксамера. Примеры измельчителей могут включать, без ограничений, воздухоструйную мельницу, шаровую вибромельницу, криогенную дробильную установку (например, SPEX SamplePrep® Freezer/Mill®).
[0073] Приллирование и измельчение полезно для процессов, которые требуют строгих стандартов для размера частиц и формы полоксамера, например, как часть технологии приготовления лекарственных средств. Полоксамер известен в данной области техники в качестве компонента в лекарственных формах, который облегчает растворимость и влияет на высвобождение лекарственного средства. В этих составах частицы полоксамера должны сохранять стандартные характеристики для того, чтобы придать желаемые фармакокинетические свойства лекарственной форме и соблюсти строгие стандарты безопасности лекарственных средств и воспроизводимости. Следует отметить, что способы, описанные в данном документе, не требуют таких строгих или точных стандартов для полоксамера, так что данные способы приллирования и измельчения не применяются.
[0074] В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер обрабатывали с помощью процесса приллирования, прежде чем его нагревали, как описано в данном документе. Многие коммерчески доступные полоксамеры для применения в клеточной культуре (например, Полоксамер 188 Pluronic® F68 NF Prill, продаваемый BASF®) подверглись приллированию или микроприллированию в процессе производства. Этапы нагрева и охлаждения, включенные в способы, описанные в данном документе, не связаны с приллированием. Скорее всего, они могут быть применены к полоксамеру, который уже был приллирован или микроприллирован. Данное открытие настоящего изобретения заключается в том, что свойства коммерчески доступных полоксамеров (например, приллированного или микроприллированного полоксамера) в клеточной культуре могут быть улучшены путем нагревания и охлаждения, как описано в настоящем документе.
[0075] В некоторых аспектах изобретения способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде, описанной в данном документе, включают добавление термообработанного полоксамера в клеточную культуральную среду. После нагревания и охлаждения, твердый термообработанный полоксамер может быть растворен в среде для культивирования клеток любым известным в данной области техники способом. Например, если полоксамер нагревали и охлаждали в открытом стеклянном сосуде, полученный твердый термообработанный полоксамер может быть просто соскаблен или отслоен в соответствующем количестве (по массе) для добавления в клеточную культуральную среду. Термообработанный полоксамер может быть добавлен к клеточной культуральной среде непосредственно после приготовления, или он может быть сохранен и добавлен в клеточную культуральную среду в более позднее время (например, примерно более, чем через день, примерно более, чем через месяц, или примерно более, чем через год после термической обработки).
[0076] В некоторых вариантах реализации изобретения стадии нагревания и охлаждения, описанные выше, каждую из которых проводили один раз перед добавлением термообработанного полоксамера в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах реализации изобретения стадии нагревания и охлаждения, описанные выше, повторяли по меньшей мере один раз перед добавлением термообработанного полоксамера в клеточную культуральную среду.
III. Полоксамеры и свойства полоксамера
[0077] В данном документе предложены способы приготовления полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер, полученный данными способами, применяется в клеточной культуральной среде.
[0078] Термин «полоксамер» может включать множество различных соединений, потому что цепи полиоксипропилена и полиоксиэтилена различной длины могут быть использованы в комбинации. Конкретная комбинация цепей полиоксипропилена и полиоксиэтилена, присутствующие в полоксамере, могут привести к определенным химическим и/или биофизическим свойствам. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер имеет химическую формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH. В некоторых вариантах реализации изобретения n (т.е., длина цепи полиоксиэтилена) равняется от около 60 до около 150. В некоторых вариантах реализации изобретения m (т. е., длина цепи полиоксипропилена) имеет значение от около 25 до около 60.
[0079] Полоксамеры часто описываются системой нумерации, которая определяет их приблизительный молекулярный вес и процентное содержание полиоксиэтилена. Эти значения могут относится к среднему значению в композиции полоксамера, а не к абсолютному значению каждой молекулы полоксамера в композиции. В соответствии с этой системой первые две цифры умножают на 100 для определения приблизительной молекулярной массы блока полиоксипропилена, а третью цифру умножают на 10 для определения процента от массы блока полиоксиэтилена. Например, полоксамер 188 (CAS № 9003-11-6) может относится к полоксамеру с n, имеющим значение около 80, и с m, имеющим значение около 27, как и в формуле, изображенной выше. Полоксамер 237 может относится к полоксамеру с n, имеющим значение около 64, и с m, имеющим значение около 37. Полоксамер 338 может относится к полоксамеру с n, имеющим значение около 141, и с m, имеющим значение около 44. Полоксамер 407 может относится к полоксамеру с n, имеющим значение около 101, и с m, имеющим значение около 56. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер имеет среднюю молекулярную массу от около 6000 до около 18000 дальтон. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер 188 может относится к полоксамеру с n, имеющим значение около 80, с m, имеющим значение около 27, как и в формуле, изображенной выше, и с полоксамером, имеющим среднюю молекулярную массу от около 7680 до около 9510 г/моль. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер 188 может относиться к полоксамеру с n, имеющим значение около 80, c m, имеющим значение около 27, как и в формуле, изображенной выше, и с полоксамером, имеющим среднюю молекулярную массу от около 7000 до около 10000 г/моль.
[0080] Полоксамеры, продаваемые под торговыми названиями, например, PLURONIC® могут быть названы в соответствии с другой системой. Букву могут использовать для указания физического состояния (например, F для твердого вещества, P для пасты или L для жидкости). 2- или 3-значный номер может быть использован для обозначения химических свойств. Первые одну или две цифры умножают на 300 для определения приблизительной молекулярной массы блока полиоксипропилена, а третью цифру умножают на 10 для определения процента от массы блока полиоксиэтилена. Например, PLURONIC® F68 может относиться к твердому полоксамеру с n, имеющим значение около 80, и с m, имеющим значение около 27, как и в формуле, изображенной выше. PLURONIC® F87 может относится к твердому полоксамеру с n, имеющим значение около 64, и с m, имеющим значение около 37.PLURONIC® F108 может относится к твердому полоксамеру с n, имеющим значение около 141, и с n, имеющим значение около 44. PLURONIC® F127 может относится к твердому полоксамеру с n, имеющим значение около 101, и с m, имеющим значение около 56.
[0081] Поскольку полоксамеры имеют как гидрофобные (полиоксипропилен), так и гидрофильные (полиоксиэтилен) фрагменты различной длины, то различные полоксамеры могут обладать различными гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ). ГЛБ соединения определяли путем вычисления относительной доли соединения, которое является гидрофильной или липофильной, и значение ГЛБ использовали для прогнозирования поверхностно-активными свойствами соединения. Например, соединение с ГЛБ менее 10, по прогнозам, нерастворим в воде и соединение с ГЛБ больше, чем 10, по прогнозам, растворимо в воде. В предпочтительных вариантах реализации изобретения полоксамер для применения в клеточной культуре имеет ГЛБ, равное 24 или выше. ГЛБ полоксамера может быть рассчитано в соответствии со способами хорошо известными в данной области, в том числе и теми, которые описаны в Griffin, W.C. (1954) J. Soc. Cosmet. Chemists 5(4):249-56 и Davies, J.T. (1957) Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interfaces: Proc. of 2 nd Intl. Congress Surface Activity, Butterworths (London): 426-38.
[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения физические и/или химические свойства полоксамера могут быть измерены. Например, физические и/или химические свойства полоксамера могут быть измерены до и после термообработки, описанной в данном документе, для определения свойств, связанных с термообаботкой полоксамера. В качестве другого примера, физические и/или химические свойства качественной партии полоксамера и полоксамера некачественной партии, как описано в данном документе, могут быть измерены для определения свойств, связанных с полоксамером качественной партии.
[0083] Примеры анализов для измерения физических и/или химических свойств могут включать, без ограничений, MALDI-MS, гель-проникающую хроматографию, порошковую РД, квазиупругое светорассеяние, а также ЯМР твердого тела. MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы) известна в данной области техники как метод анализа, количественной оценки или идентификации соединения, например, путем определения его молекулярной массы и заряда. В качестве не ограничивающего примера, MALDI-MS может быть использована для идентификации соединения (например, примеси), которое преимущественно связано с или присутствует в партии полоксамера до термической обработки или в партии некачественного полоксамера по сравнению с термообработанным полоксамером или с качественной партией полоксамера. Гель-проникающая хроматография известна в данной области техники как метод разделения соединений по размеру молекул. В качестве не ограничивающего примера, гель-проникающая хроматография может быть использована для выделения соединения (например, примеси), которое преимущественно связано с или присутствует в партии полоксамера до термической обработки или в полоксамере некачественной партии по сравнению с термообработанным полоксамером или качественной партией полоксамера. Порошковая РД (порошковая рентгеновская дифракция) известна в данной области техники в качестве методики для определения характеристик структуры соединения, и может включать в себя этапы формирования образца в виде порошка соединения (содержащего множество хаотически ориентированных кристаллитов), и с помощью рентгеновской дифракции анализировать структурные особенности кристаллитов. В качестве не ограничивающего примера, порошковая РД может быть использована для оценки структурных свойств термообработанного полоксамера или качественной партии полоксамера, например, по сравнению с полоксамером до термической обработки или полоксамером некачественной партией. Квазиупругое светорассеяние (также известное как динамическое рассеяние света и фотонная корреляционная спектроскопия) известно в данной области техники как метод определения профиля распределения по размерам частиц в растворе или суспензии. В качестве не ограничивающего примера, квазиупругое рассеяние света может быть использовано для идентификации соединения (например, примеси) по размеру частиц, которое преимущественно связано с или присутствует в партии полоксамера перед термообработкой или в полоксамере некачественной партии по сравнению с термообработанным полоксамерам или качественной партией полоксамера.
[0084] ЯМР твердого тела (ядерный магнитный резонанс, или ЯМР твердого тела) известен в данной области техники как метод определения различных структурных особенностей соединения. Например, ЯМР твердого тела может быть использован для оценки конформации молекул, размещения, химического сдвига или полиморфной природы соединения. В качестве не ограничивающего примера, ЯМР твердого тела может быть использован для оценки структурного свойства термообработанного полоксамера или полоксамера качественной партии по сравнению с полоксамером до термической обработки или полоксамером некачественной партии. В некоторых вариантах реализации изобретения структурное свойство, определяемое ЯМР твердого тела, может включать отношение кристаллитов к аморфному полоксамеру в образце полоксамера. В качестве другого не ограничивающего примера, ЯМР твердого тела может быть использовано для приготовления спектров, по которым можно разделить или профилировать один или более полиморфов полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения ЯМР твердого тела может быть использован для разделения одного или более полиморфов полоксамера в качественной партии полоксамера или термообработанном полоксамере от полиморфов полоксамера, присутствующих в некачественной партии полоксамера или полоксамера до термической обработки. В некоторых вариантах реализации изобретения полоксамер спектр генерируется ЯМР твердого тела может быть соотнесена со свойством полоксамера в клеточной культуральной среде, например, путем измерения жизнеспособности клеток в культуре клеток, выращенных в клеточной культуральной среде, содержащей полкосамер качественной партии или термообработанный полоксамер по сравнению с жизнеспособностью клеток в культуре клеток, выращенной в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер некачественной партии или полоксамер до термической обработки.
IV. Применение полоксамеров в культуре клеток и получение полипептидов
[0085] Термообработанным полоксамерам, представленным в данном документе, могут найти применение в способах (например, в культивировании клеток и получении полипептидов с использованием культуральной среды, содержащей термообработанный полоксамер по настоящему изобретению), а также в композициях (например, клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер по настоящему изобретению).
Применение полоксамера в культуре клеток
[0086] Полоксамеры могут использоваться в качестве добавок к клеточной культуральной среде, известной в данной области техники. Не желая быть привязанными к теории, полагают, что полоксамеры выполняют множество функций в клеточной культуральной среде: могут защищать клетки от повреждений и повышать жизнеспособности клеток. Например, полоксамер может выступать в качестве протектанта клеток от разрушения. Полоксамер может уменьшать силу прилипания между клетками и пузырьками и/или уменьшить шок, в то время как лопаются пузырьки, тем самым предотвращая повреждение клеток. Полоксамер также может изменить частоту и скорость образования пузырьков, улучшить дренаж клеток из вспененного слоя и/или повысить прочность клеточных мембран. См, например, Meier, S.J., et al. (1999) Biotechnol. Bioeng. 62(4):468-78; Chisti, Y. (2000) Trends Biotechnol. 18 (10):420-32; и Tharmalingam, T., et al. (2008) Mol. Biotechnol. 39(2): 167-77.
[0087] Термообработанный полоксамер, описанный в данном документе, могут быть добавлен к среде для культивирования клеток в любой концентрации, обычно используемой для полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда включает термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда включает термообработанный полоксамер в концентрации от около 0,1 г/л до около 3 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда включает термообработанный полоксамер в концентрации от около 3 г/л до около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда включает термообработанный полоксамер в концентрации около 0,1 г/л, около 0,2 г/л, около 0,3 г/л, около 0,4 г/л, около 0,5 г/л, около 0,6 г/л, около 0,7 г/л, около 0,8 г/л, около 0,9 г/л, около 1 г/л, около 2 г/л, около 3 г/л, около 4 г/л, около 5 г/л, около 6 г/л, около 7 г/л, около 8 г/л, около 9 г/л, или около 10 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения термообработанный полоксамер, полученный как описано в данном документе, может быть использован в более низкой концентрации в клеточной культуральной среде для достижения желаемого уровня жизнеспособности клеток, чем полоксамер до термической обработки. В некоторых вариантах реализации изобретения термообработанный полоксамер, полученный как описано в данном документе, может быть использован в более подходящей или стандартизированной концентрации в клеточной культуральной среде для достижения желаемого уровня жизнеспособности клеток, чем полоксамер до термической обработки.
[0088] Поверхностно-активные вещества, такие как полоксамеры, имеют предел в растворении, называемый критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), за которой добавленные дополнительные поверхностно-активные молекулы начинают включаться в мицеллы, а не растворятся в растворе. При концентрациях выше ККМ, поверхностное натяжение раствора не уменьшается со скоростью пропорциональной концентрации поверхностно-активного вещества. В предпочтительных вариантах реализации изобретения термообработанный полоксамер добавляют к клеточной культуральной среде в концентрации более низкой, чем его ККМ. Так, например, ККМ полоксамера 188 было определена на уровне в 100 мг/мл (Kabanov, A.V., et al. (1995) Macromolecules 28(7):2303-14). ККМ полоксамера может быть определена путем измерения поверхностного натяжения раствора во время добавления полоксамера. Концентрация, при которой увеличение концентрации полоксамера больше не приводит к увеличению поверхностного натяжения, представляет собой ККМ для данного полоксамера. Поверхностное натяжение может быть измерено, например, без ограничений, с использованием тензиометра (например, Sigma 700/701 Tensiometer от Attension).
Клеточная культуральная среда
[0089] Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к культивированию клетки в клеточной культуральной среде. Любая клеточная культуральная среда известная в данной области техники, подходящая для необходимого типа клеток и/или полипептидного продукта, может быть использована. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда представляет собой химически определенную питательную среду. В других вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда представляет собой питательную среду неопределенного химического состава. В некоторых вариантах реализации изобретения термообработанной полоксамер, описанный в данном документе, добавляется к базовой клеточной культуральной среде. В некоторых вариантах реализации изобретения термообработанный полоксамер, описанный в данном документе, добавляется к клеточной культуральной среде для подпитки или периодической подпитки.
[0090] Коммерчески доступные питательные среды могут использоваться, включая такие, как, без ограничений, среда F-10 Ham (Sigma), минимальная питательная среда Игла ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), среда Игла модифицированная по способу Дульбекко ([DMEM], Sigma), среда Лурия (LB), и среда ТB (TB), и любая из этих питательных сред может быть дополнена любым из компонентов сред, как подробно описано в данном документе (например, термообработанным полоксамером). Кроме того, любая из питательных сред, описанных в Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), Vijayasankaran et al., Biomacromolecules., 6:605:611 (2005), Patkar et al., J Biotechnology, 93:217-229 (2002),, в патенте США. № 4767704. 4657866; 4927762; или 4560655; WO 90/03430; WO 87/00195; в патенте США. № Re. 30985; или в патенте США. № 5122469, все описания которых включены в данный документ в качестве ссылки во всей их полноте, и может быть дополнено любым из компонентов питательных сред, как подробно в данном документе (например, термообработанным полоксамером).
[0091] Любые питательные среды, предложенные в данном документе, могут быть также дополнены при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как ГЭПЭС), нуклеозидами (например, аденозин и тимидин), микроэлементами (определенные как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), поверхностно-активными веществами, такими как полоксамер и глюкоза или эквивалентным источником энергии. В некоторых аспектах изобретения клеточная культуральная среда, предложенная в данном документе, содержит белки, полученные из растения или животного. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная культуральная среда, предложенная в данном документе, не содержит белков, полученных из растения или животного. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в соответствующих концентрациях, которые должны быть известны специалистам в данной области техники.
Жизнеспособность клеток
[0092] В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер, повышается по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей необработанный полоксамер (или полоксамер до термической обработки). Данное открытие настоящего изобретения заключается в том, что подготовка полоксамера, описанная в данном документе, приводит к увеличению жизнеспособности клеток при применении термообработанного полоксамера в клеточной культуральной среде по сравнению с применением необработанного полоксамера в той же клеточной культуральной среде. Способы тестирования жизнеспособности клеток хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток измеряли, как подробно описано в примерах, приведенных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде может быть измерена примерно через 1 час, примерно через 2 часа или примерно через 3 часа (например, как описано ниже).
[0093] Используемую в данном документе «жизнеспособность клеток» количественно определяют как процент живых клеток в растворе (т.е., количество живых клеток, деленное на общее количество клеток). Любой подходящий способ, известный в данной области техники, может быть использован для измерения жизнеспособности клеток. Поскольку клетки или живые, или мертвые, то жизнеспособность клеток может быть определена путем количественного определения или мертвых клеток, или живых клеток. Один подходящий способ представляет собой вытеснение трипанового синего. В этом способе образец клеток получали из культуры клеток. Раствор трипанового синего добавляли к образцу. Только нежизнеспособные клетки впитывали трипановый синий, и как следствие окрашивались в синий цвет. Таким образом, количество синих клеток подсчитывали, вычитали общее количество клеток, чтобы получить количество живых клеток, и это число делили на общее количество клеток, чтобы определить жизнеспособность клеток. Клетки можно пересчитать вручную, по аналогии с гематоцитометром или автоматически, как, например, с анализатором жизнеспособности клеток Vi-Cell® (Beckman Coulter). Другие анализы для определения жизнеспособности клеток могут включать, без ограничений, анализы с окрашиванием пропидиумом йодида, терминальным дезоксиуридиновым мечением концов, резазурином, метиловым фиолетовым, лактатдегидрогеназой, гидролизом деацетата флуоресцеина, анализ на основе 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT), каспазы и АТФ.
[0094] Эффект термообработанного полоксамера может быть определен, например, путем измерения жизнеспособности клеток в культуре клеток, выращенных в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер, и сравнив ее с жизнеспособностью клеток в культуре клеток, выращенных в культуральной среде клеток, содержащую такую же концентрацию необработанного полоксамера. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточные культуры могут быть выращены во встряхиваемой колбе с дефлекторами. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 10%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 15%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 25%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 40%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 45%. В некоторых вариантах реализации изобретения применение термообработанного полоксамера по сравнению с необработанным полоксамером повышает жизнеспособность клеток по меньшей мере на около 50%.
[0095] В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер по настоящему изобретению, повышается по меньшей мере на 10% по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер до термической обработки. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток повышается по меньшей мере на около 1%, по меньшей мере на около 2%, по меньшей мере на около 3%, по меньшей мере на около 4%, по меньшей мере на около 5%, по меньшей мере на около 6%, по меньшей мере на около 7%, по меньшей мере на около 8%, по меньшей мере на около 9%, по меньшей мере на около 10%, по меньшей мере на около 11%, по меньшей мере на около 12%, по меньшей мере на около 13%, по меньшей мере на около 14%, по меньшей мере на около 15%, по меньшей мере на около 16%, по меньшей мере на около 17%, по меньшей мере на около 18%, по меньшей мере на около 19%, по меньшей мере на около 20%, по меньшей мере на около 21%, по меньшей мере на около 22%, по меньшей мере на около 23%, по меньшей мере на около 24%, по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 26%, по меньшей мере на около 27%, по меньшей мере на около 28%, по меньшей мере на около 29%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 31%, по меньшей мере на около 32%, по меньшей мере на около 33%, по меньшей мере на около 34%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 36%, по меньшей мере на около 37%, по меньшей мере на около 38%, по меньшей мере на около 39% или по меньшей мере на около 40%.
[0096] Термообработанный полоксамер может быть особенно полезным для улучшения свойств полоксамера (например, конкретная партия необходимого полоксамера), который не дает приемлемой жизнеспособности клеток при добавлении в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде с необработанным полоксамером ниже примерно на 80%. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде с необработанным полоксамером ниже примерно на 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде с необработанным полоксамером ниже примерно на 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде с необработанным полоксамером ниже примерно на 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде с необработанным полоксамером ниже примерно на 40%.
Клеточный рост и получение полипептидов
[0097] В некоторых вариантах реализации клетка по настоящему изобретению (например, клетки культивируют в клеточной культуральной среде, описанной в данном документе) может содержать необходимый полинуклеотид (например, полинуклеотид, кодирующий необходимый полипептид, или по существу необходимый полинуклеотид). В некоторых вариантах реализации клетка по настоящему изобретению может быть трансфецирована, трансформирована или иным образом генетически модифицирована для включения необходимого полинуклеотида. Способы, подходящие для трансфекции или трансформации различных клеток, широко известны в данной области техники. Примеры ссылок относительно получения полипептида приведены ниже; специалисту в данной области техники будет понятно, что способы, раскрытые в данном документе, не ограничиваются получением полипептида.
[0099] Как правило, клетки объединяют (приводят в контакт) с любой клеточной культуральной средой, описанной в данном документе, в соответствии с одним или более условий, которые способствуют любому из процессов: клеточного роста, поддержки, и/или продуцирования полинуклеотида и/или полипептида. В способах культивирования клетки и приготовления полипептида используют культуральный сосуд (биореактор), содержащий клетку и клеточную культуральную среду. Культуральный сосуд может состоять из любого материала, который пригоден для культивирования клеток, в том числе из стекла, пластика или металла. Как правило, культуральный сосуд объемом по меньшей мере в 1 литр и может быть объемом в 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 25000 литров или более. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., являются такими, которые ранее использовали для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и будут очевидны каждому специалисту. Условия культивирования, которые могут быть изменены в процессе культивирования включают, без ограничений, рН и температуру.
[0100] Культура клеток может поддерживаться в условиях, благоприятных для выживания, роста, жизнеспособности (поддержание), а также возможностей продуцирования полипептида в клеточной культуре. Точные условия будут варьироваться в зависимости от типа клеток, организма из которого была получена клетка, а также от природы и характера экспрессируемого полипептида. На стадии получения полипептида, культура клеток, необязательно, может дополнительно поддерживаться в соответствии со вторым набором условий культивирования (по сравнению с начальной стадией роста), способствующих выживанию и жизнеспособности культуры клеток и подходящих для экспрессии целевого полипептида.
[0101] В некоторых случаях культуру клеток может быть полезным или необходимым дополнить питательными веществами или другими компонентами питательной среды, которые были истощены или метаболизированы клетками. Например, культуру клеток можно предпочтительно дополнить рассмотренными питательными веществами или другими компонентами питательной среды, которые были истощены во время мониторинга клеточной культуры. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть полезным или необходимым дополнить культуру клеток до стадии продуцирования. В качестве не ограничивающих примеров, может быть полезным или необходимым дополнить культуры клеток гормонами и/или другими факторами роста, определенными ионами (такими, как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами, витаминами, нуклеозидами или нуклеотидами, микроэлементами (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низких конечных концентрациях), аминокислотами, липидами, глюкозой или другим источником энергии.
[0102] Клеточная культуральная среда, подробно описанная в данном документе, может быть использована в способе культивирования клеток для приготовления полипептидов, в том числе антител. Питательная среда может быть использована в способе культивирования клеток, не важно в периодической культуре, периодической культуре с подпиткой или проточной культуре, и может быть использована в способе приготовления любого полипептида, включающий любые аспекты или варианты реализации полипептида, как описано в данном документе. Полипептиды, полученные способами, подробно описанными в данном документе, например, культивированием клеток и получением полипептидов с использованием культуральной среды, содержащей термообработанный полоксамер по настоящему изобретению), могут быть гомологичными клетке-хозяину, или предпочтительно могут быть экзогенным, а это означает, что они являются гетерологичными, т.е. привнесенными, в используемую клетку-хозяин, такие как человеческий белок, вырабатываемый клеткой CHO, или полипептид дрожжей, продуцируемый клеткой млекопитающего. В одном варианте полипептиды представляет собой полипептид млекопитающего (такой как антитело) непосредственно секретируемый в питательную среду клеткой-хозяином. В другом варианте реализации изобретения полипептид выделяется в питательную среду путем лизиса клетки, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид.
[0103] Любой полипептид, который экспрессируется в клетке-хозяине, может быть получен в соответствии с настоящим изобретением, и может присутствовать в предложенных композициях. Полипептид может быть экспрессирован из гена, который является эндогенным для клетки-хозяина, или из гена, который вводят в клетку-хозяина с помощью генной инженерии. Полипептид может встречаться в природе, или альтернативно может иметь последовательность, которая была сконструирована или выбрана человеком. Сконструированный полипептид может быть собран из других сегментов полипептида, которые по отдельности встречаются в природе, или могут включать один или более сегментов, которые в природе не встречаются.
[0104] Полипептиды, которые при желании могут быть экспрессированы в соответствии с настоящим изобретением, часто выбирают на основе целевой биологической или химической активности. Например, настоящее изобретение может быть использовано для экспрессии любого фармацевтически или коммерчески релевантного фермента, рецептора, антитела, гормона, регулирующего фактора, антигена, связывающего агента, и т.д.
[0105] Способы приготовления полипептидов, таких как антитела, в клеточной культуре, хорошо известны в данной области техники. Неограничивающие примеры способов приготовления антитела (например, полноразмерные антитела, фрагменты антител и мультиспецифические антитела) в культуре клеток предложены в данном документе. Способы по настоящему изобретению могут быть адаптированы специалистом в данной области техники для приготовления других белков, таких как ингибиторы на основе белка. См., в целом, хорошо известные и широко используемые методы и процедуры получения белков (например, терапевтических белков), которые включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010).
[0106] Условия, подходящие для получения полипептидов, известны в данной области техники для различных типов клеток-хозяев и полипептидов. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., являются такими, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны каждому специалисту.
[0107] Культуру клеток можно перемешивать или встряхивать в течение культивирования клеток с целью повышения оксигенации и дисперсии питательных веществ к клеткам. Применение полоксамера может быть особенно полезным в перемешиваемых культурах клеток, в которых по причине сдвигающих усилий потенциально могут повредиться клетки. В соответствии с настоящим изобретением, обычный специалист в данной области техники поймет, что это может быть полезным для контроля или регулирования определенных внутренних условий биореактора на начальной стадии роста, в том числе, без ограничений, рН, температуры, оксигенации и т.д. Например, рН можно контролировать путем подачи соответствующего количества кислоты или основания, а оксигенацию можно контролировать с помощью устройств для барботирования, которые хорошо известны в данной области техники.
Клетки
[0108] Клетки, подходящие для культивирования в культуральной среде и продуцирования полипептида, могут включать клетки прокариот, дрожжей или высших эукариотов (например, млекопитающего). В некоторых вариантах реализации изобретения используется клетка млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения используется клетка яичника китайского хомячка (СНО).
[0109] Клетки млекопитающих могут культивироваться, и размножение клеток млекопитающих в культуре (культуре тканей) стало рутинной процедурой. Примерами линий клеток-хозяев млекопитающих могут включать, без ограничений, линию почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию человеческой эмбриональной почки (293 или 293 клетки, субклонируемые для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); мышиные клетки Сертоли (ТМ4, Mather, Biol Reprod, 23: 243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383: 44-68 (1982)); клетки MRC-5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2). Другие подходящие линии клеток-хозяев млекопитающих включают линии клеток миеломы, такие как NS0 и Sp2/0. Для ознакомления с некоторыми линиями клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для продуцирования антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.
[0110] В некоторых вариантах реализации изобретения могут культивироваться клетки СНО. Клетки СНО хорошо известны и обычно используются в данной области техники для приготовления полипептидов в культуре клеток, например, антител. Клетки СНО, могут включать, без ограничений, CHO ДГФР-дефицитные клетки (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), например ATCC CRL-9096
[0111] Прокариотические клетки, подходящие для этой цели включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia,, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella,, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, описанная в DD 266,710, опубликованном 12 апреля 1989), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa и Streptomyces. Один предпочтительный клонирующий хозяин E. coli представляет собой E. coli 294 (АТСС 31446), хотя возможны и другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X1776 (АТСС 31537), и штамм E. coli W3110 (ATCC 27325), которые подходят. Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.
[0112] Кроме прокариот, эукариотические микроорганизмы, такие как гифомицеты или дрожжи, являются подходящими хозяевами, клонирующими или экспрессирующими вектора, кодирующие антитело. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, является наиболее часто используемыми среди низших эукариотов микроорганизмов-хозяев. Тем не менее, ряд других родов, видов и штаммов являются общедоступными и применяются в настоящем изобретении, такие как хозяева Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, и K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такая как Schwanniomyces occidentalis; и гифомицеты, такие как, например, хозяева Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger. Для ознакомления с обсуждением вопросов об использовании дрожжей и мицелиальных грибов в получении терапевтических белков, см., например, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004).
[0113] Могу быть выбраны некоторые штаммы грибов и дрожжей в которых пути гликозилирования были «гуманизированы», в результате продуцирования антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См., например, Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) (описание гуманизации пути гликозилирования у Pichia pastoris); и в Gerngross et al., выше.
[0114] Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированного антитела, также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток, не относящихся к клеткам позвоночных, включают клетки растений и насекомых. Были выявлены многочисленные штаммы и варианты штаммы и варианты бакуловирусов и клетки насекомых из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Различные вирусные штаммы для трансфекции являются общедоступными, например, вариант L-1 вируса ядерного полиэдроза Autographa californica и штамм Bm-5 вируса ядерного полиэдроза Bombyx mori, и такие вирусы могут быть использованы в качестве вируса в соответствии с настоящим изобретением, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Примеры клеток насекомых могут включать, без ограничений, клетки дрозофилы (например, клетки S2), клетки Trichoplusia ni (например, клетки High Five™) и клетки Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf21 или Sf9).
[0115] Культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов, ряски (Leninaceae), люцерны (M. truncatula), и табака также могут быть использованы в качестве хозяев. См., например, патент США №№. 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIESTM для продуцирования антител трансгенными растениями).
Получение антител
[0116] В некоторых вариантах реализации изобретения клетку, культивируемую в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанной полоксамер, использовали для получения антител.
[0117] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. Модификатор «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного в основном из гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использовать в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными методами, в том числе, например, методом гибридом (например,Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США. 4816567), технологией фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004), а также технологии приготовления человеческих или человекоподобных антител у животных, у которых есть некоторые или все из последовательностей локусов иммуноглобулина человека или генов, кодирующих иммуноглобулин человека (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); патенты США. № 5545807. 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, полученное с помощью способов, описанных в данном документе, представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело, человеческое антитело, антитело из фаговых библиотек или мультиспецифическое антитело.
[0118] Антитела могут быть получены с использованием рекомбинантных методов, например, в производстве антитела с использованием клеток СНО. Для рекомбинантного приготовления антитела анти-антигена, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующую антитело, можно легко выделить и секвенировать общепринятыми способами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Многие векторы доступны. Компоненты вектора обычно включают, без ограничений, один или более из следующих компонентов: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или более маркерных генов, энхансер, промотор и последовательность терминации транскрипции.
[0119] Антитело по изобретению может быть получено рекомбинантно не только непосредственно, но также в виде гибридного полипептида с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно представляет собой сигнальную последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. Гетерологичная сигнальная последовательность, выбираемая предпочтительно, представляет собой ту, которая распознается и процессируется (например, расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность антитела, сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной, например, из группы, включающей щелочную фосфатазу, пенициллиназу, ЛП или термостабильный энтеротоксин II. Для дрожжевой секреции нативная сигнальная последовательность может быть замещена, например, лидерной последовательностью дрожжевой инвертазы, лидерной последовательностью фактора (в том числе лидерные последовательности α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces), или лидерной последовательностью кислой фосфатазы, лидерной или сигнальной последовательностью глюкоамилазы C. albicans, описанных в WO 90/13646. Для экспрессии в клетке млекопитающего доступны сигнальные последовательности млекопитающего, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, сигнальный гликопротеин gD простого герпеса.
[0120] Антитело может продуцироваться внутриклеточно, в периплазматическое пространство или непосредственно секретироваться в питательную среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, в качестве первого шага, частицы дебриса, или клеток-хозяев или лизированных фрагментов, удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) описывают процедуру выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство E. coli. Коротко, клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), ЭДТА и фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) в течение около 30 мин. Остатки клеток могут быть удалены центрифугированием. Если антитело секретируется в питательную среду, то супернатанты от таких систем экспрессии, как правило, сначала концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, ультрафильтрационного модуля Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеазы, такой как ФМСФ, может быть включен в любую из предыдущих стадий для ингибирования протеолиза и антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных контаминантов.
[0121] Антитела могут быть очищены с использованием, например, хроматографии с ггидроксиапатитом, гидрофобной хроматографии, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, при этом аффинная хроматография обычно представляет собой одну из предпочтительных стадий очистки. Пригодность белка A в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, который присутствует в антителе. Белок A можно использовать для очистки антител, которые основаны на человеческих γ1, γ2 или γ4 тяжелых цепей (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Протеин G рекомендуется для всех мышиных изотипов и для человеческого γ3 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Матрица, к которой присоединен аффинный лиганд, наиболее часто является агарозной, но и другие матрицы применимы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или полистирол-дивинилбензол, обеспечивают более высокие скорости потока и более короткое время обработки, чем может быть достигнуто с использованием агарозы. Если антитело содержит CH3 -домен, смола Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) применима для очистки. Другие способы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-сефарозе, хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, ДСН-ПААГ-электрофорез, и осаждение сульфатом аммония, также применимы в зависимости от антитела и могут быть выбраны.
[0122] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, описанное в данном документе, представляет собой антигенсвязывающий фрагмент. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают Fab-, Fab '-, F (аb') 2- и Fv фрагменты; димеры; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Fab-фрагмент содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, а также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце тяжелой цепи СН1 домена, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в данном документе обозначает Fab ', в котором цистеиновый остаток (и) константных доменов несет свободную тиольную группу. F (аb ') 2-фрагменты антитела первоначально были получены как пары Fab'-фрагментов, которые имеют между ними шарнирные цистеины. Известны также другие химические связи фрагментов антитела. «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенсвязывающий сайт. «Одноцепочечные Fv» или фрагменты антител «ScFv» содержат домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид ScFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который дает возможность scFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv, см., например, Pluckthün, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315. Многие из способов очистки антитела, описанного выше, могут быть соответствующим образом адаптированы для очистки антигенсвязывающего фрагмента антитела.
[0123] В целом, различные методики в подготовке антител для использования в исследованиях, тестировании и клинике хорошо разработаны в данной области техники, в соответствии с описанными выше методиками, и/или по усмотрению соответствующего специалиста в данной области техники для конкретного представляющего интерес антитела.
ПРИМЕРЫ
[0124] Настоящее изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Примеры, однако, не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Понятно, что примеры и варианты реализации изобретения, описанные в данном документе, представлены только в качестве иллюстрации и что различные модификации или изменения в его свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу действия этой заявки и объема прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1: Термическая обработка улучшает свойства полоксамера в культуре клеток
[0125] Полоксамер обычно используется в клеточной культуре, в качестве поверхностно-активного вещества, который защищает клетки от барботирования и/или пузырьков, связанных с повреждением. К сожалению, от партии к партии изменчивость подрывает его эффективность и приводит к снижению выхода рекомбинантного продукта. Например, партия некачественного полоксамера снижает жизнеспособность клеток и может привести к снижению титра продукта до 45%. После обширной серии исследований, было установлено, что некачественный полоксамер были источником значительного сокращения выхода продукта и последующих финансовых потерь в промышленном производстве белка. Таким образом, способы улучшения свойств полоксамера были бы весьма полезными.
[0126] Неожиданно, было обнаружено, что одна термообработка способна улучшить свойства полоксамера в культуре клеток. Важно отметить, что эта термообработка не только улучшает свойства некачественных партий полоксамера, но также может дополнительно повысить эффективность качественных партий. Способы, описанные в данном документе, представляют собой способы обработки полоксамера для улучшения его свойств в качестве добавки к культуре клеток.
Способы
Обработка полоксамером
[0127] 15 г полоксамера 188 (полоксамер 188 PLURONIC® F 68 NF Prill, BASF), нагревали на стандартной плите с магнитной мешалкой в течение 10-12 минут. Нагревание прекращали, когда полоксамер достигал температуры 86-91°C. Полоксамер затем охлаждали при комнатной температуре, 2-8°С, или -72°C в течение около 20 минут. Твердый полоксамер затем отслаивался и добавлялся в клеточную культуральную среду для тестирования.
Модель для испытаний культуры клеток
[0128] Полоксамер 188, подвергаемый термообработке как описано выше, был добавлен к стандартной, не содержащей сыворотки, питательной среде для клеток CHO в конечной концентрации 1 г/л. Клетки СНО выращивали при температуре 37°С в 25-75 мл клеточной культуральной среды в 250 мл встряхиваемой колбе с дефлекторами при концентрации 1,5×106 клеток/мл в 5% СО2. Во время культивирования клеток, колбы вращали на круговой качалке со скоростью от 250 до 350 оборотов в минуту. Использование встряхиваемой колбы с дефлекторами создавало большое количество захваченных пузырьков в культурах. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью трипанового синего, используя анализатор жизнеспособности Vi-Cell® (Beckman Coulter). Отбирали 300 мкл клеточной культуры, и рассчитывали процент жизнеспособности клеток путем деления количества жизнеспособных клеток (т.е. тех, которые не абсорбируют трипановый синий) на общее количество клеток в образце.
Результаты
[0129] Простая модель скрининга была разработана для имитации влияния полоксамера на жизнеспособность культуры клеток в лаборатории, а не в промышленных масштабах. Коротко, клетки СНО выращивали в 250 мл колбах, как описано выше. Для того, чтобы максимально увеличить разницу в жизнеспособности клеток, полученную качественными и некачественными партиями полоксамера, были протестированы объемы клеточной культуральной среды и скорость встряхивания. Клетки выращивали в 25, 50, или 75 мл питательной среды и встряхивали на круговой качалке при скорости в 250, 300 или 350 оборотов в минуту. Было установлено, что объем среды не оказывает никакого влияния на Δжизнеспособности (то есть, разница в жизнеспособности клеток, в процентах, между известной качественной партией и известной некачественной партией полоксамера), но более высокие скорости встряхивания показали увеличение Δжизнеспособности.
[0130] Как показано на фиг. 1, было установлено, что термическая обработка полоксамера (см. методы) значительно улучшает свойства полоксамера в культуре клеток. Различные партии полоксамера были протестированы на их влияние на жизнеспособность клеток с использованием модели скрининга, упоминаемой выше. Некоторые партии были известны своей эффективностью, а другие предположительно были неэффективными. Для каждой партии, необработанные и термообработанные (ТО) порции добавляли в клеточную культуральную среду для тестирования. Было установлено, что по сравнению с необработанным полоксамером, термообрабанный полоксамер повышает жизнеспособность клеток во всех тестируемых партиях (фиг. 1). В некоторых случаях, термообработанный полоксамер обеспечил удвоение жизнеспособности, от 45% до почти 90%. Важно отметить, что термообработанный полоксамер обеспечил повышение жизнеспособности для партий, которые уже продемонстрировали высокое качество (см., например, «Качественная партия 4» на фиг. 1).
[0131] Эти результаты показывают, что термическая обработка полоксамера может усилить его влияние на жизнеспособность в культуре клеток. Термическая обработка может значительно улучшить свойства некачественных партий и еще больше улучшить свойства качественных партий, предполагая практическое применение термообработки полоксамера, которая может существенно уменьшить проблему изменчивости в партии полоксамера.
Пример 2: Процесс термической обработки полоксамера измеряли с помощью термометра сопротивления
[0132] Эксперименты, описанные в примере 1, выполняли на нагревательной плите. Данные эксперименты включали нагревание полоксамера до около 80-100°C (измеряли терморезистором) в течение 10 минут. Данные эксперименты повторяли с добавлением образца, нагреваемого до температуры выше 100°С (то есть, до 124°C).
Способы
Производители и партии полоксамера 188
[0133] Вещество «полоксамер 188» использовали. Идентификаторы и связанные с ними показатели клеточной культуры (определяется эффективностью в тесте модели с большим сдвиговым усилием к встряхиваемой колбе, HSSF) приведены в таблице 1.Таблица
Таблица 1 Идентификаторы (используемые для обозначения партии во всех последующих примерах) и связанные с ними показатели культуры клеток из данных HSSF |
|
Идентификатор | Эффективность в культуре клеток |
G | Низкая |
D | Высокая |
H | Низкая |
B | Низкая |
C | Низкая |
F | Низкая |
E | Крайне низкая |
A | Высокая |
Способы термической обработки
[0134] Для оценки процесса термической обработки полоксамера оценивали несколько способов термообработки: нагрев на нагревательной плите, в сушильном шкафу или в автоклаве.
Нагревательная плита
[0135] От пяти до пятнадцати граммов полоксамера помещали в химический стакан (100-400 мл) и нагревали на нагревательной плитке при непрерывном перемешивании. Температуру полоксамера измеряли с помощью термопары (Kaye 731 Thermocouple) или термометра сопротивления (терморезистор) (высокоточный термочувствительный элемент RTD Fluke 5627A-12). Полоксамер нагревали до тех пор, пока он не достигал заданной температуры (примерно от пяти до десяти минут), а затем сразу же убирали от источников тепла. Расплавленному полоксамеру давали остыть при комнатной температуре.
Сушильный шкаф
[0136] Пять граммов полоксамера взвешивали в сцинтилляционном флаконе из стекла емкостью 20 мл. Термопару закрепляли во флаконе таким образом, чтобы кончик был погружен в сухой полоксамер. Полоксамер и термопару затем помещали в сушильный шкаф (вакуумный сушильный шкаф Yamato ADP 21) уже при заданной температуре. Если не указано иное, сушильные шкафы использовали без функции вакуума (при атмосферном давлении). Полоксамер оставляли нагреваться до заданной температуры (+/- 3°C, как измерено термопарой), и момент времени, в котором полоксамер достигал этой целевой температуры отмечали как момент времени=0. По истечении заданного времени инкубации применяли слабый вакуум в течение 10-30 секунд, чтобы откачать любые летучие вещества, выделяющиеся в сушильный шкаф. После откачивания воздуха, стеклянный флакон извлекали из сушильного шкафа и давали остыть при комнатной температуре (открытый).
Питательная среда и культура клеток CHO
[0137] Стандартную, не содержащую сыворотку, питательную среду для клеток CHO использовали для всех экспериментов, с одним исключением: Pluronic F68 был исключен из питательной среды. Для обеспечения данного исследования, две линии клеток СНО, которые оттаивали, сохраняли в системе посевного биореактора (STB).
Способ большого сдвигового усилия к культуре клеток во встряхиваемой колбе
Добавление образцов полоксамера к клеточной культуральной среде
[0138] Питательные среды готовили разделением на аликвоты 250 мл стандартной, не содержащей сыворотки, питательной среды для клеток СНО (без полоксамера) на образец в контейнеры ПСТ и добавлением 0,25 г образца полоксамера в каждую аликвоту. Среду перемешивали в течение по меньшей мере 5 минут при 150 оборотах в минуту для того, чтобы полностью растворить полоксамер в питательных средах. Питательные среды затем подвергали вакуумной фильтрации в боксе микробиологической безопасности (БМБ) с использованием 0,22 мкм фильтрационного модуля из полиэфирсульфона. Питательные среды хранили при температуре 37°C для использования в течение 24 часов.
Замена питательных сред и анализ культуры клеток
[0139] Образцы клеточных культур переносили в 50 мл пробирки фирмы Falcon таким образом, что каждая аликвота содержала около 7,5×10E7 клеток. Клетки центрифугировали в течение 10 минут при 830×g с образованием гранул. Надосадочную жидкость удаляли и клетки ресуспендировали в питательной среде, содержащей образцы полоксамера для тестирования, а затем переносили в 250 мл вентилируемые встряхиваемые колбы с дефлекторами. Начальную общую плотность клеток (ОПК) и жизнеспособность измеряли с помощью NOVA Flex после встряхивания колб при 150 оборотах в минуту в течение нескольких минут для равномерного распределения клеток. Встряхиваемые колбы затем помещали в инкубатор при 5% CO2, влажности 80%, и температуре 37°С и встряхивали при 300 оборотах в минуту в течение 3-х часов. Измерения ОПК и жизнеспособности проводили через 1 час, 2 часа и 3 часа инкубации и по сравнению с исходными ОПК и жизнеспособностью.
Результаты
[0140] Образцы качественной партии полоксамера (А) и двух некачественных партий (В и С) подвергали термообработке до температуры около 100°С. Дополнительный образец C подвергали термообработке до температуры в 124°С. После термообработки образцы были испытаны в тесте HSSF.
[0141] Все образцы полоксамера, нагреваемые до температуры в 100°C (измерено терморезистором), не показали улучшения по сравнению с необработанным веществом из той же партии (фиг. 2). Тем не менее, С, термически обработанный до температуры в 124°С, показал повышение конечной жизнеспособности на 19% по сравнению с необработанным C. Кроме того, общее изменение жизнеспособности (т.е., %конечная жизнеспособность, Vf, минус % начальной жизнеспособности, V0) для термообработанного C составила -27,4%, увеличившись на 21% по сравнению с необработанным C (таблица 2).Таблица
Таблица 2 Образцы термообработанного полоксамера, условия, повышение жизнеспособности по сравнению с необработанной партией, и окончательная жизнеспособность в тесте HSSF |
|||
Описание выборки | Идентификатор образца | Повышение жизнеспособности по сравнению с необработанной партией @ 3 часа | Жизне-способность @ 3 часа (%) |
Качественная партия, необработанная | A | 0,0 | 85,6 |
Качественная партия, термически обработанная | A_HT | 1,8 | 87,4 |
Некачественная партия (B), необработанная | B | 0,0 | 69,0 |
Некачественная партия (B), термически обработанная до 100 C | B_HT | -5,4 | 63,6 |
Некачественная партия (C), необработанная | C | 0,0 | 49,0 |
Некачественная партия (C), термически обработанная до 100 C | C_HT | -2,8 | 46,2 |
Некачественная партия (C), термически обработанная до 124 C | C_HT_124C | 21,8 | 68,0 |
Модель с большим сдвиговым усилием к встряхиваемой колбе выполняли с N=1
[0142] Данные результаты подтвердили, что термическая обработка улучшала свойства полоксамера в культуре клеток и дали предварительную оценку эффективной температуре и продолжительности обработки. Тем не менее, эти результаты свидетельствуют о том, что температура выше 100°С может быть более эффективна для термической обработки полоксамера в культивировании клеток. Считается, что различия в измерении температуры (например, тип термометра, используемый для измерения температуры полоксамера), может привести к различным эффективным диапазонам в термической обработке полоксамера (см., пример 8 для дополнительных данных и обсуждения).
Пример 3: Перенос термообработки в сушильные шкафы
[0143] Настольный сушильный шкаф использовали в качестве альтернативного механизма нагрева, который предусматривает контроль температуры и воспроизводимость результатов. Кроме того, функция вакуума позволила выкачивать испарения, выделяющиейся из полоксамера, из сушильного шкафа до его открытия и извлекать термообработанный полоксамер. Эксперименты с сушильным шкафом проводили в соответствии с способами, описанными в примере 2.
[0144] Для первых экспериментов в сушильном шкафу использовали план эксперимента на поверхности отклика, чтобы проверить широкий спектр условий с минимальным количеством требуемых образцов (фиг. 3). Температура колебалась в пределах 92-148°С, при времени инкубации в пределах 10-120 минут. Образцы некачественной партии (C) подвергали термообработке в определенных условиях в сушильном шкафу. Затем полученные образцы были испытаны в модели HSSF, чтобы определить улучшения характеристик культуры клеток.
[0145] Неэффективный полоксамер, нагреваемый в сушильном шкафу при температуре 140°С в течение 60 минут и 150°C в течение 35 минут, показал значительное повышение конечной жизнеспособности, что эквивалентно положительному контролю в тесте HSSF (фиг. 4 и таблица 3).
Таблица 3 Жизнеспособность для полоксамера, нагреваемого в сушильном шкафу |
||||
Идентификатор образца | Усредненная жизнеспособ-ность @ 3 часа |
Стандартное отклонение (СО)* | Усредненное повышение жизнеспо-собности по сравнению с необрабо-танной партией @ 3 часа | Стандартное отклонение (СО)* повышения жизнеспособ-ности |
Необработанная некачественная партия (C) | 30,4 | 11,1 | 0,0 | 0,0 |
Положительный контроль (D) | 88,4 | 2,5 | 58,1 | 13,6 |
C_100C, 10 минут | 40,5 | 3,9 | 10,1 | 15,0 |
C_100C, 60 минут | 42,6 | 8,1 | 12,2 | 3,0 |
C_120C, 35 минут | 42,1 | 1,0 | 11,8 | 10,1 |
C_140C, 10 минут | 46,7 | 0,1 | 16,4 | 11,2 |
C_140C, 60 минут | 89,7 | 0,4 | 59,4 | 10,7 |
C_150C, 35 минут | 91,6 | 0,5 | 61,2 | 11,6 |
* модель HSSF выполняли в двух повторностях |
[0146] Однако в данных экспериментах, полоксамер, термически обработанный в условиях ниже 140°С и/или в течение менее 60 минут, не показал улучшения свойств. Эти данные указывают на то, что минимальная температура термической обработки с целью улучшения свойств полоксамера составляла около 140°С в течение тестируемого времени. Более обширные испытания температуры и продолжительности нагрева, описаны ниже, например, в примере 5.
Пример 4: Планирование эксперимента термической обработки в сушильном шкафу
[0147] Первичная модель эксперимента на поверхности отклика для условий термообработки в сушильных шкафах показала, что минимальная температура для эффективной термической обработки в условиях испытания составляла около 140°С. Полное планирование экспериментов (ПЭ) проводили в сушильных шкафах в соответствии со способами, описанными в примере 2, с целью определения рабочего диапазона, переходя на очень высокие температуры и длительное время инкубации. Максимальная температура испытания составляла 185°С, а максимальное время инкубации испытания для каждой температуры составляло 120 мин. Некачественную партию полоксамера (G) обрабатывали и тестировали в шести выборочных блоках, которые были сегментированы с использованием плана на латинском квадрате. В общей сложности три выборных блока и еще шесть образцов обрабатывали в интересующих нас условиях (таблица 4). Затем эти образцы испытывали в тесте HSSF для определения характеристик клеточной культуры.
Таблица 4 Условия термической обработки оценивали в полном ПЭ в сушильных шкафах. Температура колебалась в пределах 110-185°C; продолжительность колебалась в пределах 1-120 мин. Коробки, помеченные буквой (соответствует блокам в таблице 5), указывают на условия обработки, которые были испытаны, как указано в таблице 5 |
|||||||
Время (мин) | |||||||
1 | 5 | 10 | 30 | 60 | 120 | ||
Температура (°C) | 110 | A | D | X | F | ||
125 | D | F | A | ||||
140 | F | A | X | X | D | X | |
155 | X | D | F | A | |||
170 | F | A | D | ||||
185 | D | F | A | X |
[0148] Исходные данные ПЭ представлены в таблице 5. Полные результаты ПЭ при отображении на контурный график, проиллюстрировали большой рабочий диапазон условий термообработки, которые улучшают свойства полоксамера (фиг. 5).
Таблица 5 Исходные данные полного ПЭ эксперимента |
|||||
Номер партии | Время, мин | Темпе-ратура, C | Блок | Жизнеспособ-ность @ 3 часа |
Повышение жизнеспособности (по сравнению с необработанным контролем, среднее) % |
G | 1 | 110 | A | 74,9 | -4,8 |
G | 5 | 140 | A | 77,1 | -2,6 |
G | 10 | 170 | A | 88,9 | 9,2 |
G | 30 | 185 | A | 89,5 | 9,8 |
G | 60 | 155 | A | 88,7 | 9,0 |
G | 120 | 125 | A | 82,3 | 2,6 |
G | 10 | 140 | B | 91,3 | 11,6 |
G | 1 | 155 | C | 93,6 | 13,9 |
G | 30 | 140 | C | 95,5 | 15,8 |
G | 120 | 185 | C | 95,9 | 16,2 |
G | 1 | 185 | D | 93,9 | 14,2 |
G | 5 | 155 | D | 92,6 | 12,9 |
G | 10 | 125 | D | 73,4 | -6,3 |
G | 30 | 110 | D | 51,9 | -27,8 |
G | 60 | 140 | D | 93,7 | 14,0 |
G | 120 | 170 | D | 82,6 | 2,9 |
G | 60 | 110 | E | 82,1 | 2,4 |
G | 120 | 140 | E | 95,9 | 16,2 |
G | 1 | 140 | F | 68,5 | -11,2 |
G | 5 | 170 | F | 94,5 | 14,8 |
G | 10 | 185 | F | 95,6 | 15,9 |
G | 30 | 155 | F | 95,2 | 15,5 |
G | 60 | 125 | F | 68,2 | -11,5 |
G | 120 | 110 | F | 94,8 | 15,1 |
[0149] Образцы, подвергаемые термической обработке при температуре 155°С или выше в течение всего времени инкубации, резко улучшили характеристики клеточной культуры. В тесте HSSF эти образцы изменяли показатели жизнеспособности менее чем на 10% после 3-х часов. При температуре 140°С термическая обработка не была эффективной до тех пор, пока время инкубации не составило 30 минут или выше. Кроме того, тестируемые минимальные температуры в 125°C и 110°C не были эффективными до тех пор, пока образцы не инкубировали в течение 2-х часов.
Пример 5: Надежность и воспроизводимость термической обработки
[0150] Для того, чтобы продемонстрировать воспроизводимость и надежность проектного поля термообработки, показанного на фиг. 5, ключевые условия обработки по полному ПЭ были воспроизведены с использованием дополнительных партий полоксамера в соответствии со способами, описанными в примере 2. Два из этих условий дублировали для решения воспроизводимости. Выбранные условия попадали внутрь или на границу рабочего диапазона. В общей сложности три некачественные партии были обработаны (в том числе G, который ранее был использован для ПЭ) (таблица 6). Чтобы убедиться, что термическая обработка не вредит, если используют качественную партию, одну качественную партию также обрабатывали (Е).
Таблица 6 Количество повторов для ключевых условий термообработки, протестированных на четырех партиях полоксамер |
|||||
Темпе-ратура | Время | Некачест-венная партия №1 (G) | Некачест-венная партия №2 (H) |
Некачест-венная партия №3 (F) |
Качест-венная партия (E) |
170 C | 1 мин | 1 | 1 | 1 | 1 |
30 мин | 1 | 1 | 1 | 1 | |
155 C | 1 мин | 2 | 2 | 2 | |
30 мин | 2 | 1 | 1 | 1 | |
140 C | 1 мин | 2 | 1 | 1 | 1 |
30 мин | 2 | 2 | 2 |
[0151] Результаты теста HSSF для повторяемых условий обработки были сопоставимы с результатами первоначального ПЭ (таблицы 7 и 8); однако, можно было наблюдать изменчивость в оптимальных условиях термообработки всех некачественных партий (фиг. 6).
Таблица 7 Конечная жизнеспособность клеток для условий термообработки, испытанных в тесте HSSF на четырех партиях полоксамера: E (качественная партия), F (некачественная партия), H (некачественная партия) и G (некачественная партия, используемая в полных ПЭ экспериментах) |
||||
Образец | E | F | G | H |
Необработанный | 92,2 | 72,7 | 78,8 | 77,5 |
140 C, 30 мин №1 | 93,8 | 89,8 | 91,5 | 77,3 |
140 C, 30 мин №2 | 96,1 | 89,8 | 89,5 | 90,6 |
140 C, 1 мин | 95,3 | 90,8 | 90,0 | 90,7 |
155 C, 1 мин №1 | 95,2 | 90,2 | 90,8 | 84,1 |
155 C, 1 мин №2 | 94,8 | 89,9 | 90,7 | 81,5 |
155 C, 30 мин | 96,0 | 91,0 | 89,5 | 92,4 |
170 C, 1 мин | 95,5 | 87,4 | 90,6 | 93,4 |
170 C, 30 мин | 94,0 | 89,2 | 89,4 | 92,0 |
Таблица 8 Изменение жизнеспособности клеток (Vf (обработанный) -Vf (необработанный)) в тесте HSSF для условий термообработки, испытанных на четырех различных партиях полоксамера: E (качественная партия), F (некачественная партия), H (некачественная партия) и G (некачественная партия, используемая в полных ПЭ экспериментах) |
||||
Повышение жизнеспособности по сравнению с необработанной партией @ 3 часа (%) | ||||
Партии | ||||
Образец | E | F | G | H |
140 C, 1 мин | 3,1 | 18,1 | 11,2 | -0,2 |
140 C, 30 мин №1 | 1,6 | 17,1 | 12,7 | 13,1 |
140 C, 30 мин №2 | 3,9 | 17,1 | 10,7 | 13,2 |
155 C, 1 мин №1 | 3,1 | 17,5 | 12,0 | 6,6 |
155 C, 1 мин №2 | 2,6 | 17,2 | 11,9 | 4,1 |
155 C, 30 мин | 3,8 | 18,3 | 10,7 | 15,0 |
170 C, 1 мин | 3,3 | 14,7 | 11,8 | 15,9 |
170 C, 30 мин | 1,8 | 16,5 | 10,6 | 14,5 |
Модель с большим сдвиговым усилием к встряхиваемой колбе выполняли с N=1
[0152] Партии G и F, обрабатываемые при температуре 155°С в течение 1 мин или 140°С в течение 1 минуты, продемонстрировали значительное улучшение характеристик культуры клеток. Тем не менее, партия Н не продемонстрировала улучшения при обработке температурой в 140°С в течение 1 минуты, и только крайне низкое (<10%) улучшение при обработке температурой в 155°С в течение 1 мин. Все остальные условия обработки для этой партии продемонстрировали существенное улучшение в культуре клеток. Эти результаты показывают, что партии имеют небольшие различия в минимальной температуре и инкубационном периоде термообработки.
Пример 6: Оценка низких температур и большой продолжительности
[0153] Условия термообработки, описанные в примерах 2-5, были значительно выше температуры плавления полоксамера. Для того, чтобы определить, может ли температура лишь немного выше точки плавления полоксамера (~ 50°C) оказать влияние на жизнеспособность клеток культуры, образцы двух некачественных партий полоксамера (H и G) обрабатывали в сушильном шкафу при температуре 60°C и 80°С в течение 120 минут и затем тестировали в способе HSSF согласно примеру 2.
[0154] Результаты для термообработанных образцов не продемонстрировали существенного улучшения характеристик по сравнению с необработанным полоксамером, независимо от температуры (фиг. 7). Не желая быть привязанными к теории, была выдвинута гипотеза о том, что может потребоваться более длительное время инкубации для данных более низких температур, чтобы получить улучшенный полоксамер.
Пример 7: Термическая обработка в вакууме
[0155] Для того, чтобы определить влияние кислорода на термообработку полоксамера, образцы двух некачественных партий полоксамера (H и G) подвергали термообработке при температуре 140°C, в условиях низкого вакуума в сушильном шкафу в соответствии со способами, описанными в примере 2. Вместо извлечения образцов из вакуума после определенного времени инкубации, полоксамер охлаждали в сушильном шкафу под вакуумом до комнатной температуры, чтобы гарантировать отсутствие внешнего воздействия кислорода, в то время как полоксамер был нагрет до заданной температуры.
Таблица 9 Условия термообработки полоксамера и результаты HSSF для протестированных образцов в вакууме |
||||
Идентификатор образца | Усредненная жизнеспо-собность @ 3 часа | Стандартное отклонение (СО)* | Усредненное повышение жизнеспо-собности по сравнению с необрабо-танной партией @3 часа |
Стандартное отклонение (СО)* повышения жизнеспо-собности |
H (необработанный) | 58,8 | -37,5 | 0,0 | 0,0 |
H_6°C 120 мин | 68,3 | 0,0 | 9,5 | 18,8 |
H_8°C 120 мин | 63,4 | 9,4 | 4,6 | 9,4 |
G (необработанный) | 80,0 | -16,5 | 0,0 | 0,0 |
G_6°C 120 мин | 77,2 | 2,5 | -2,8 | 4,6 |
G_8°C 120 мин | 74,8 | 0,1 | -5,2 | 7,3 |
*Модель с большим сдвиговым усилием к встряхиваемой колбе выполняли с N=2 |
[0156] Полоксамер, обрабатываемый в вакууме, продемонстрировал значительное улучшение (> 20% -ное повышение конечной жизнеспособности) по сравнению с необработанным полоксамером в культуре клеток (фиг. 8, таблица 9). Данные результаты показывают, что внешнее воздействие кислорода во время термообработки полоксамера может не потребоваться для приготовления улучшенного полоксамера.
Пример 8: Измерение температуры с помощью терморезистора в сравнении с проводной термопарой
[0157] Предыдущие данные поддерживали диапазон температур 80-100°С в течение процесса термообработки. Тем не менее, полный ПЭ (например, как показано на фиг. 5) поддерживал рабочий диапазон на уровне 140°C или выше.
[0158] В эксперименте проводили изучение двух различных термометров для измерения температуры полоксамера в процессе термической обработки. В экспериментах, описанных в примере 1, использовали терморезистор, в то время как проводную термопару использовали во всех экспериментах в сушильном шкафу. Использование терморезистора требует погружения на глубину 4 «для точного измерения температуры. С другой стороны, проводная термопара предназначена для измерения температуры точно на ее кончике, что позволяет точно измерить температуру при погружении всего на несколько миллиметров в полоксамер.
[0159] Параллельное сравнение проводили во время термической обработки полоксамера на нагревательной плите в соответствии со способами по примеру 2. Проводная термопара дала показания температуры в 152,6°С, в то время как терморезистор дал показание в 81,65°C. Таким образом, терморезистор показал существенное занижение значений температуры (> 70°С) по сравнению с термопарой. Данные результаты показывают, что различные температурные показатели полоксамера лежат в различных эффективных температурных диапазонах, достаточных для приготовления улучшенного полоксамера.
Пример 9: Описание характеристик линейного изменения скорости нагревания и скорости охлаждения в сушильном шкафу
[0160] Образцы полоксамера, помещаемые в сушильный шкаф, не сразу достигали заданной температуры. Профили нагревания и охлаждения для трех температур, используемых в ПЭ, оценивали в сушильном шкафу в соответствии со способами, описанными в примере 2.
[0161] Для достижения заданной температуры (+/-3°C) образцам в сушильном шкафу требовалось в среднем 18 минут со стандартным отклонением 5,8 минут (фиг. 9). Несмотря на изменчивость времени нагревания, скорости охлаждения были примерно одинаковы. Среднее время необходимое образцу для достижения температуры плавления полоксамера (~ 40°C) составляло 7 минут, со стандартным отклонением 0,8 минут. Если предположить, что профили охлаждения в основном линейные, то скорости охлаждения для образцов, нагреваемые до 170°С, 155°С, 140°С, составляли около -19°С/мин, -19,5°С/мин и -18°С/мин, соответственно.
Пример 10: Статистическая значимость жизнеспособности и термической обработки полоксамера
[0162] Критерий Стьюдента был использован для определения разницы между свойствами контрольных групп полоксамера в тестах HSSF и значимости наблюдаемых улучшений в характеристиках клеточной культуры. Все результаты HSSF для контрольной группы из ПЭ в сушильном шкафу были включены в массив данных. Из термообработанных образцов, только образцы в пределах рабочего диапазона были использованы для расчета изменения средней жизнеспособности клеток после термообработки. Рабочий диапазон был определен в условиях, когда изменение жизнеспособности в тесте HSSF составляло менее, чем 15%.
[0163] Обработанные и необработанные полоксамеры сравнивали с использованием критерия Стьюдента (α=0,05) для определения статистически значимых различий в средних значениях. Кроме того, данные обработанного вещества сравнивали с данными положительного контроля (D).
Таблица 10 Средняя Δ жизнеспособности (Vf(обработанный) - Vf (необработанный)) в тесте HSSF для обработанного и необработанного полоксамера тестируемых партий. |
|||
Номер партии | Средняя жизнеспособность @ 3 часа (%), необработанный | Средняя жизнеспособность @ 3 часа (%), обработанный | P значение |
Необработанный x Обработанный | |||
G | 78,7 | 91,4 | < 0,0001* |
E | 92,2 | 95,1 | 0,2490 |
F | 79,3 | 89,8 | < 0,0006* |
H | 67,9 | 91,8 | <0,0001* |
D | 87,8 | - | - |
[0164] При уровне значимости равном 0,05, сравнения средних между необработанными некачественными партиями полоксамера и положительной контрольной партией (D) продемонстрировали существенные различия (таблица 10). После термообработки все партии показали намного лучшие характеристики, чем положительная контрольная партия, за исключением Н, для которой характеристики были сопоставимы. Партия E, качественная партия, имела значение р> 0,05, что указывает на ее эффективность, которая существенно не отличалась от положительной контрольной партии. Тем не менее, термообработанный полоксамер из партии Е значительно более эффективен в тесте HSSF, чем положительный контроль (Р-значение=0,0005), демонстрируя то, что процесс термообработки улучшает уже соответствующую требованиям партию.
[0165] Данные результаты показаны на фиг. 10, которая отображает обработанные и необработанные данные каждой партии по сравнению с установленными данными положительного контроля. Например, на фиг. 10 показано, что для некачественной партии G, необработанной G, положительной контрольной качественной партии D и термообработанной G отмечены статистические различия с термообработанной партией G, показывающей существенно повышенную жизнеспособность, по сравнению или с положительным контролем качественной партией (D), или с необработанной некачественной партией G.
[0166] Основываясь на этом анализе, процесс термообработки признавали успешным в тех случаях, когда обнаруживали улучшение на 18% по сравнению с необработанным веществом. Более того, обрабатываемое вещество имело по меньшей мере такие же хорошие характеристики, как, в общем, положительная контрольная партия, используемая в данных экспериментах.
[0167] Термическая обработка некачественных партий полоксамера до применения в клеточной культуральной среде представляет собой эффективный способ повышения его свойств защиты клеток. Термическая обработка была эффективна в широком диапазоне температур и периодов инкубации; однако, чем ниже температура, тем дольше время, необходимое для обработки. Этот процесс был устойчивым, демонстрируя схожие результаты по нескольким партиям полоксамера, и воспроизводимым. В то время как результаты, представленные в данном документе, были получены в экспериментах, проведенных в сушильном шкафу, поэтому данный процесс можно перенести на более масштабное оборудование. Процесс термической обработки, описанный в данном документе, можно перенести на любой способ обработки, который обеспечит последовательное нагревание полоксамера в течение требуемого времени при нужной температуре.
Пример 11: Статистический анализ экспериментальных данных ПЭ
[0168] Примеры, описанные выше, демонстрируют влияние термообработанного полоксамера на последующие характеристики культуры клеток (например, жизнеспособность клеток). Затем были проведены расчеты для получения передаточной функции, которая представляет собой математическую модель для выходных данных (жизнеспособность на 3 час в модели встряхиваемой колбы) в зависимости от двух зависимых переменных (температура и время).
[0169] Экспериментальные данные ПЭ (описанные в таблице 12), собранные из экспериментов сушильном шкафу с температурой и временем, как переменными, были проанализированы в Minitab регрессионным методом поверхности отклика. Известную некачественную партию полоксамера (G), которую подвергали термической обработке в плане эксперимента ПЭ и тестировали в модели с большим сдвиговым усилием к встряхиваемой колбе, использовали как заменитель, обеспечивающий защиту от разрушения. Более высокая жизнеспособность в конце 3-часового теста показывала более высокую эффективность полоксамера. Подобным же образом была выполнена оценка партии полоксамера, который был обработан с целью улучшения свойств по сравнению с необработанным образцом (отрицательный контроль). Для того, чтобы учесть изменчивость внутри партии, наблюдаемую в некачественных партиях, среднюю конечную жизнеспособность по шести контрольным группам G использовали в качестве исходного уровня для расчета процентов повышения жизнеспособности, наблюдаемых для каждого теста. Различия жизнеспособности (%) на 3 час в обработанных по сравнению с необработанными партиями (%) были переменными отклика. Результаты показывают, что качество данной неэффективной партии может быть улучшено, если учитывать повышение жизнеспособности. Положительное изменение жизнеспособности до требуемого уровня жизнеспособности (обработанная партия-необработанная партия) может быть достигнуто при различных температурных и временных обработках.
[0170] Анализ был выполнен с изменением в жизнеспособности (обработанная партия- необработанная партия) после 3 часов. Так как средняя конечная жизнеспособность одной из малоэффективных партий G, изученной в условиях стресса, составила 79,7+/-5,0%, то повышение на 10% или 20% жизнеспособности была предназначено для контурного графика и для установления минимальной продолжительности термообработки при заданной температуре. Следует также отметить, что для другой некачественной C наблюдались более низкие уровни жизнеспособности (44,8+/-7,8%), по сравнению с таковыми для G, которые ожидать по отношению к необработанному контролю. Таким образом, >35% повышение жизнеспособности для C можно ожидать в условиях, когда 20% увеличение было достигнуто для партии G. Данные результаты указывают на то, что существует линейный эффект температуры и времени, взаимодействия температуры и времени. Условия в моделях являются статистически значимыми при 95% уровне достоверности с р-значением <0,05. Определение оптимального рабочего диапазона и параметров в модели представляют собой неожиданные и новые результаты.
Таблица 12 Массив данных для термообработанной партии G |
||||
Номер партии | Время, мин | Температура, C |
Жизнеспо-собность @ 3 часа | Повышение жизнеспособности (по сравнению с необработанным контролем, среднее) % |
G | 1 | 110 | 74,9 | -4,77 |
G | 5 | 140 | 77,05 | -2,62 |
G | 10 | 170 | 88,9 | 9,23 |
G | 30 | 185 | 89,5 | 9,83 |
G | 60 | 155 | 88,65 | 8,98 |
G | 120 | 125 | 82,25 | 2,58 |
G | 10 | 140 | 91,3 | 11,63 |
G | 1 | 155 | 93,6 | 13,93 |
G | 30 | 140 | 95,5 | 15,83 |
G | 120 | 185 | 95,85 | 16,18 |
G | 1 | 185 | 93,9 | 14,23 |
G | 5 | 155 | 92,6 | 12,93 |
G | 10 | 125 | 73,4 | -6,27 |
G | 30 | 110 | 51,9 | -27,77 |
G | 60 | 140 | 93,7 | 14,03 |
G | 120 | 170 | 82,6 | 2,93 |
G | 60 | 110 | 82,1 | 2,43 |
G | 120 | 140 | 95,9 | 16,23 |
G | 1 | 140 | 68,5 | -11,17 |
G | 5 | 170 | 94,5 | 14,83 |
G | 10 | 185 | 95,6 | 15,93 |
G | 30 | 155 | 95,2 | 15,53 |
G | 60 | 125 | 68,15 | -11,52 |
G | 120 | 110 | 94,75 | 15,08 |
G | 1 | 140 | 91,5 | 11,83 |
G | 30 | 140 | 89,5 | 9,83 |
G | 30 | 140 | 90 | 10,33 |
G | 1 | 155 | 90,8 | 11,13 |
G | 1 | 155 | 90,7 | 11,03 |
G | 30 | 155 | 89,5 | 9,83 |
G | 1 | 170 | 90,6 | 10,93 |
G | 30 | 170 | 89,4 | 9,73 |
G | 120 | 60 | 77,2 | -2,47 |
G | 120 | 80 | 74,7 | -4,97 |
Модель HSSF выполняли в двух повторностях
[0171] Для анализа использовали программное обеспечение Minitab версии 17.1 (Minitab.com, Государственный колледж, Пенсильвания). Анализ проводили на основе регрессионного анализа (RSRegress). Регрессию поверхности отклика использовали для анализа повышения жизнеспособности (по сравнению с необработанной партией) в зависимости от времени (мин) и температуры (°C).
[0172] Дисперсионный анализ, итоговая модель и закодированные коэффициенты, представлены ниже в таблицах 13-15.
Таблица 13 Дисперсионный анализ |
|||||
Источник | Число степеней свободы | Скоррект. сумма квадратов | Скоррект. средние квадраты | F-значе-ние | P-значе-ние |
Модель | 5 | 1666,90 | 333,38 | 5,29 | 0,002 |
Линейный | 2 | 1369,54 | 684,77 | 10,87 | 0,000 |
Время, мин | 1 | 484,39 | 484,39 | 7,69 | 0,010 |
Темп., °C | 1 | 1356,83 | 1356,83 | 21,54 | 0,000 |
Квадрат | 2 | 203,14 | 101,57 | 1,61 | 0,217 |
(Время, мин)2 | 1 | 12,47 | 12,47 | 0,20 | 0,660 |
(Температура, C)2 | 1 | 201,47 | 201,47 | 3,20 | 0,085 |
взаимодействие двух факторов | 1 | 432,89 | 432,89 | 6,87 | 0,014 |
(Время, мин)* (Температура, C) |
1 | 432,89 | 432,89 | 6,87 | 0,014 |
Ошибка | 28 | 1764,05 | 63,00 | ||
Потеря согласия | 22 | 1455,72 | 66,17 | 1,29 | 0,403 |
Чистая ошибка | 6 | 308,33 | 51,39 | ||
Общая | 33 | 3430,94 |
Таблица 14 Итоговая модель |
|||
S | R-квадрат | R-квадрат (скорректированный) | r-квадрат (пред.) |
7,93736 | 48,58% | 39,40% | 8,41% |
Таблица 15. Закодированные коэффициенты
Условие | Эффект | Коэф. | СО коэф. | T-значе-ние | P- значе-ние |
Величина отражающая мульти-коллине- арность |
Константа | 1,59 | 3,01 | 0,53 | 0,602 | ||
Время, мин | 16,01 | 8,01 | 2,89 | 2,77 | 0,010 | 2,49 |
Темп., °C | 41,89 | 20,94 | 4,51 | 4,64 | 0,000 | 2,31 |
(Время, мин)2 | 3,32 | 1,66 | 3,73 | 0,44 | 0,660 | 1,08 |
(Температура, C)2 | -22,36 | -11,18 | 6,25 | -1,79 | 0,085 | 2,37 |
(Время, мин)* (Температура, C) |
-24,78 | -12,39 | 4,73 | -2,62 | 0,014 | 2,22 |
[0173] Основываясь на этих результатах, уравнение регрессии (в некодированных единицах) определено как: Повышение жизнеспособности (по сравнению с необработанной партией), %=-113,5+0,486*(время, мин)+1,238*(температура, C)+0,00047*(время, мин)2-0,00286*(температура, C)2-0,00333*(время, мин)*(температура, C)
[0174] Передаточная функция, показанная выше, предсказывает повышение жизнеспособности для партии G по сравнению с необработанным контролем в зависимости от температуры термообработки и продолжительности. Она также содержит члены второго порядка с участием температуры и времени и их взаимодействием. Используя описанную выше модель, ожидаемая жизнеспособность для тестового примера (не полученного эмпирически) может быть получена. Предсказывание выходных данных образца показано ниже для тестовых условий в 157°C и 1 минуту:
Повышение жизнеспособности=-113,5+(0,486*1)+(1,238*157)+0,00047*1^2)-(0,00286*157^2)-(0,00333 *1*157)=10,3%
[0175] Экспериментальные данные использовали для создания контурного графика, показанного на фиг. 11 (эмпирические данные, приведенные в черных кругах). Опираясь на созданную модель регрессии, математически может быть выведено 5 точек.
[0176] Во-первых, отклик на обработку можно разделить на три температурные зоны (157°С-185°С), (134°С-157°С) и (60°С-134°С).
[0177] Во-вторых, в зоне высоких температур в 157°C-185°C, жизнеспособность от 1 до 20% может быть повышена минимальной 1-минутной термической обработкой термообработанных партий.
[0178] В-третьих, в средней температурной зоне в 134°C-157°С, жизнеспособность от 1 до 10% может быть повышена минимальной 1-минутной термической обработкой термообработанных партий. Жизнеспособность может быть повышена до 20% при минимальной продолжительности термообработки в течение 120 минут.
[0179] В-четвертых, в зоне низких температур в 60°С-134°С, жизнеспособность термически обработанных партий может быть повышена до 10% в течение 140-минутной термообработки. Жизнеспособность может быть повышена до 20% при минимальной продолжительности термообработки в 164 минуты. Следует отметить, что промежутки времени, описанные для зон средних и низких температур, являются упрощенными общими указаниями. Например, как показано на фиг. 11, температуры в 60°C, 80°C, 120°C в пределах зоны с низкой температурой требуют 164 минуты, 147 минут и 115 минут, соответственно, чтобы достичь по меньшей мере повышения жизнеспособности на 10%. Примерные значения приведены ниже в таблице 16.
Таблица 16 Примерные температуры, промежутки времени и соответствующие повышения жизнеспособности |
|||
Температурный диапазон, °С | Минимальное время, необходимое для повышения до светло-серой зоны (1-10%), мин | Минимальное время, необходимое для повышения до темно-серой зоны (10-20%), мин | Минимальное время, необходимое для повышения до темно-серой зоны (>20%), мин |
60 | 143 | 164 | 186 |
80 | 122 | 147 | 175 |
100 | 98 | 132 | 166 |
120 | 62 | 115 | 162 |
134 | 1 | 102 | 163 |
157 | 1 | 1 | н.д. |
185 | 1 | 1 | н.д. |
[0180] В-пятых, модель, приведенная выше, была получена из данных, полученных с партией G. Так как необработанный контроль имел более высокую базовую жизнеспособность в 79%, то повышение жизнеспособности может быть реализовано максимум до 20%. Тем не менее, для партий, таких как C, где необработанная партия имела намного более низкую жизнеспособность в 45%, может быть достигнуто более высокое повышение уровней. Например, в зоне средних температур 134°C -157°C, для партии C, жизнеспособность может быть повышена на 42% в течение 15-минутной термообработки. Наблюдаемые различия в характеристиках между партиями С и G приведены ниже в таблице 17.
Таблица 17 Итоговая эффективность C и G |
|||
C | G | ||
Параметр | Жизнеспособность для образца (%) @3 часа | Параметр | Жизнеспособность для образца (%) @3 часа |
Среднее | 44,8 | Среднее | 79,7 |
Стандартное отклонение | 7,4 | Стандартное отклонение | 5,0 |
N | 6 | N | 6 |
[0181] Таким образом, желаемый результат термической обработки является более выраженным в партиях, таких как С. Полный массив данных, установленных для данной партии, не может быть получен из-за отсутствия сырья для запуска полного набора экспериментов. G представляет собой крайне неэффективную партию и модель, определенную выше, можно считать консервативной. Данные, полученные с помощью партий C и G, показывают, что термообработка полоксамера может улучшить свойства других партий полоксамера, не исследуемых в данном документе. Улучшение свойств может зависеть от времени и температуры, как описано выше. Описанные выше результаты показывают, что повышение температуры сокращает продолжительность термообработки, необходимую для улучшения свойств полоксамера, и что более низкие температуры могут быть использованы для улучшения свойства полоксамера за более длительные периоды. Не желая быть привязанными к теории, считается, что точный процент повышения жизнеспособности, наблюдаемый после термической обработки, будет зависеть от исходных условий жизнеспособности, наблюдаемых для конкретной партии полоксамера перед термообработкой.
Claims (34)
1. Способ получения полоксамера для применения в клеточной культуральной среде, включающий следующие стадии:
(a) нагревание твердого полоксамера по меньшей мере до 60°C с образованием жидкого полоксамера, где полоксамер нагревали:
(1) от 157°C до 185°C в течение по меньшей мере 1 минуты,
(2) от 134°C до 157°C в течение по меньшей мере 1 минуты,
(3) от 120°C до 134°C в течение по меньшей мере 62 минут,
(4) от 100°C до 120°C в течение по меньшей мере 98 минут,
(5) от 80°C до 100°C в течение по меньшей мере 122 минут,
(6) от 60°C до 80°C в течение по меньшей мере около 143 минут; и
(б) охлаждение жидкого полоксамера до температуры ниже 50°C с образованием твердого термообработанного полоксамера, причем охлаждение не проводят в устройстве для приллирования или измельчения, где полоксамер содержит сополимер оксида этилена и оксида пропилена и где полоксамер имеет формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, в которой n равно 60-150 и m равно 25-60.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер, повышалась по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер до стадии (а).
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в диапазоне от 157°C до 185°C в течение от 1 минуты до 250 минут.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в диапазоне от 134°C до 157°C в течение от 1 минуты до 250 минут.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в диапазоне от 120°C до 134°C в течение от 62 минут до 250 минут.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в диапазоне от 100°C до 120°C в течение от 98 минут до 250 минут.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в диапазоне 80°C до 100°C в течение от 122 минут до 250 минут.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в диапазоне от 60°C до 80°C в течение от 143 минут до 250 минут.
9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что жизнеспособность клеток в клеточной культуральной среде, содержащей термообработанный полоксамер, повышалась по меньшей мере на 10% по сравнению с жизнеспособностью клеток в клеточной культуральной среде, содержащей полоксамер до стадии (а).
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что жизнеспособность клеток повышалась по меньшей мере на 20%.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что жизнеспособность клеток повышалась по меньшей мере на 30%.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что жидкий полоксамер в стадии (б) охлаждали при температуре окружающей среды в диапазоне от 2°С до 8°C или ниже 0°С.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что полоксамер нагревали в условиях вакуума.
14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что жидкий полоксамер охлаждали в течение по меньшей мере 20 минут.
15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что термообработанный полоксамер, полученный на стадии (б), добавляли в клеточную культуральную среду.
16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что стадии (а) и (б) повторяли по меньшей мере один раз перед добавлением термообработанного полоксамера в клеточную культуральную среду.
17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что полоксамер приллировали перед стадией (а).
18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что полоксамер имеет формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, где n равняется 80, а m равняется 27.
19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что полоксамер имеет температуру плавления 55°C.
20. Способ по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что полоксамер имеет среднюю молекулярную массу от 6000 до 18000 дальтон.
21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что полоксамер содержит сополимер, имеющий формулу HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, с n, имеющим значение 80, с m, имеющим значение 27, и полоксамер имеет среднюю молекулярную массу от 7680 до 9510 г/моль.
22. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что полоксамер представляет собой полоксамер 188.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку млекопитающего.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).
25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку насекомого.
26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что клетка продуцирует полипептид.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461970281P | 2014-03-25 | 2014-03-25 | |
US61/970,281 | 2014-03-25 | ||
PCT/US2015/022592 WO2015148736A1 (en) | 2014-03-25 | 2015-03-25 | Methods of preparing a poloxamer for use in cell culture medium |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016141568A RU2016141568A (ru) | 2018-04-28 |
RU2016141568A3 RU2016141568A3 (ru) | 2018-09-26 |
RU2710551C2 true RU2710551C2 (ru) | 2019-12-27 |
Family
ID=52824596
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016141568A RU2710551C2 (ru) | 2014-03-25 | 2015-03-25 | Способы приготовления полоксамера для применения в клеточной культуральной среде |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11034793B2 (ru) |
EP (2) | EP3122799B8 (ru) |
JP (3) | JP6655548B2 (ru) |
KR (1) | KR102352250B1 (ru) |
CN (2) | CN106414552B (ru) |
AU (1) | AU2015236008B2 (ru) |
BR (1) | BR112016021739B1 (ru) |
CA (1) | CA2943357C (ru) |
ES (1) | ES2778680T3 (ru) |
HR (1) | HRP20200372T1 (ru) |
IL (2) | IL247902B (ru) |
MX (2) | MX2016012288A (ru) |
MY (1) | MY178060A (ru) |
PL (1) | PL3122799T3 (ru) |
RU (1) | RU2710551C2 (ru) |
SG (1) | SG11201607929PA (ru) |
SI (1) | SI3122799T1 (ru) |
WO (1) | WO2015148736A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201606711B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2741710C1 (ru) * | 2018-07-12 | 2021-01-28 | Елена Валентиновна Аршинцева | Термический способ стерилизации жидких лекарственных средств, содержащих в своем составе полоксамер |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MY178060A (en) | 2014-03-25 | 2020-09-30 | Genentech Inc | Methods of preparing a poloxamer for use in cell culture medium |
DK3430072T3 (da) * | 2016-03-17 | 2020-08-31 | Merck Patent Gmbh | Fremgangsmåde til oprensning af poloxamerer |
CN111465655A (zh) * | 2017-12-21 | 2020-07-28 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 泊洛沙姆组合物及其制造和使用方法 |
WO2020022511A1 (ja) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 味の素株式会社 | 動物細胞の浮遊培養用の添加物、浮遊培養用培地および浮遊培養方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5912228A (en) * | 1995-01-13 | 1999-06-15 | Xoma Corporation | Therapeutic compositions comprising bactericidal/permeability-increasing (BPI) protein products |
RU2222547C2 (ru) * | 1997-04-18 | 2004-01-27 | Байер Корпорейшн | Получение рекомбинантного фактора viii в среде, не содержащей белка |
WO2004071452A2 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Ceremed, Inc. | Random and non-random alkylene oxide polymer alloy compositions |
EP1661558B1 (en) * | 2004-11-30 | 2010-07-21 | Basf Se | Compositions based on micro-prilled poloxamer particles and methods for their manufacturing |
Family Cites Families (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE266710C (ru) | ||||
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
WO1990003430A1 (en) | 1988-09-23 | 1990-04-05 | Cetus Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
FR2646437B1 (fr) | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
DE69133566T2 (de) | 1990-01-12 | 2007-12-06 | Amgen Fremont Inc. | Bildung von xenogenen Antikörpern |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
EP0814159B1 (en) | 1990-08-29 | 2005-07-27 | GenPharm International, Inc. | Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
DE69229640T2 (de) | 1991-10-04 | 1999-12-16 | Gs Development Ab, Malmoe | Teilchen, methode zur herstellung der teilchen und deren verwendung |
DE69527195T2 (de) * | 1994-01-14 | 2003-03-06 | Xoma Technology Ltd., Berkeley | Anti gram positive bakterielle verfahren und mittel |
ATE390933T1 (de) | 1995-04-27 | 2008-04-15 | Amgen Fremont Inc | Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8 |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
AU5702298A (en) | 1996-12-03 | 1998-06-29 | Abgenix, Inc. | Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and VK regions nd antibodies produced therefrom |
GB9625175D0 (en) * | 1996-12-04 | 1997-01-22 | Medi Cult As | Serum-free cell culture media |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
DE60022369T2 (de) | 1999-10-04 | 2006-05-18 | Medicago Inc., Sainte Foy | Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
AU2003900887A0 (en) * | 2003-02-27 | 2003-03-13 | Novasel Australia Pty Ltd | Poloxamer emulsion preparations |
US8802116B2 (en) * | 2003-02-27 | 2014-08-12 | Novasel Australia Pty. Ltd. | Poloxamer emulsion preparations |
JP5180474B2 (ja) * | 2003-08-04 | 2013-04-10 | カムルス エービー | 両親媒性粒子の特性を改良する方法 |
WO2005053652A1 (en) | 2003-12-04 | 2005-06-16 | Pfizer Products Inc. | Multiparticulate crystalline drug compositions containing a poloxamer and a glyceride |
WO2006044738A2 (en) | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Maroon Biotech Corporation | Methods and compositions for treatment of free radical injury |
CN1939534B (zh) * | 2005-09-27 | 2010-12-01 | 长春金赛药业股份有限公司 | 含有人生长激素或人粒细胞巨噬细胞刺激因子的用于治疗损伤和溃疡的外用制剂 |
AU2007284615B2 (en) | 2006-08-16 | 2011-10-27 | Novartis Ag | Method for making solid dispersions of highly crystalline therapeutic compounds |
KR100932613B1 (ko) * | 2007-04-27 | 2009-12-17 | 한남대학교 산학협력단 | 고분자 용융공정을 이용한 약물전달용 생체적합성 고분자나노 미립구의 제조방법 및 그 나노 미립구 |
WO2009055312A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Dfb Pharmaceuticals, Inc. | Process for producing a poloxamer gel |
SG10201503304RA (en) | 2007-12-27 | 2015-06-29 | Baxter Int | Cell culture processes |
BR112012015596B1 (pt) * | 2009-12-23 | 2021-06-01 | Sanofi Pasteur | Processo de cultura de células aderentes |
EP2830598B1 (en) * | 2012-03-30 | 2016-11-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Microsphere compositions, preparation method and applications thereof |
MY178060A (en) * | 2014-03-25 | 2020-09-30 | Genentech Inc | Methods of preparing a poloxamer for use in cell culture medium |
-
2015
- 2015-03-25 MY MYPI2016001715A patent/MY178060A/en unknown
- 2015-03-25 CA CA2943357A patent/CA2943357C/en active Active
- 2015-03-25 PL PL15715932T patent/PL3122799T3/pl unknown
- 2015-03-25 KR KR1020167029244A patent/KR102352250B1/ko active IP Right Grant
- 2015-03-25 AU AU2015236008A patent/AU2015236008B2/en active Active
- 2015-03-25 CN CN201580026701.5A patent/CN106414552B/zh active Active
- 2015-03-25 BR BR112016021739-0A patent/BR112016021739B1/pt active IP Right Grant
- 2015-03-25 RU RU2016141568A patent/RU2710551C2/ru active
- 2015-03-25 MX MX2016012288A patent/MX2016012288A/es unknown
- 2015-03-25 EP EP15715932.8A patent/EP3122799B8/en active Active
- 2015-03-25 CN CN202010723304.6A patent/CN111808276A/zh active Pending
- 2015-03-25 EP EP20151556.6A patent/EP3778702B1/en active Active
- 2015-03-25 WO PCT/US2015/022592 patent/WO2015148736A1/en active Application Filing
- 2015-03-25 SI SI201531128T patent/SI3122799T1/sl unknown
- 2015-03-25 JP JP2016558605A patent/JP6655548B2/ja active Active
- 2015-03-25 SG SG11201607929PA patent/SG11201607929PA/en unknown
- 2015-03-25 ES ES15715932T patent/ES2778680T3/es active Active
-
2016
- 2016-09-19 IL IL247902A patent/IL247902B/en active IP Right Grant
- 2016-09-22 US US15/273,155 patent/US11034793B2/en active Active
- 2016-09-22 MX MX2021001981A patent/MX2021001981A/es unknown
- 2016-09-28 ZA ZA2016/06711A patent/ZA201606711B/en unknown
-
2020
- 2020-02-04 JP JP2020017136A patent/JP2020103290A/ja not_active Withdrawn
- 2020-03-04 HR HRP20200372TT patent/HRP20200372T1/hr unknown
- 2020-12-20 IL IL279583A patent/IL279583B/en unknown
-
2021
- 2021-05-13 US US17/319,886 patent/US11912823B2/en active Active
-
2022
- 2022-09-30 JP JP2022157928A patent/JP7472222B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5912228A (en) * | 1995-01-13 | 1999-06-15 | Xoma Corporation | Therapeutic compositions comprising bactericidal/permeability-increasing (BPI) protein products |
RU2222547C2 (ru) * | 1997-04-18 | 2004-01-27 | Байер Корпорейшн | Получение рекомбинантного фактора viii в среде, не содержащей белка |
WO2004071452A2 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Ceremed, Inc. | Random and non-random alkylene oxide polymer alloy compositions |
EP1661558B1 (en) * | 2004-11-30 | 2010-07-21 | Basf Se | Compositions based on micro-prilled poloxamer particles and methods for their manufacturing |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Chul Soon Young et al "Enhanced anti-tumor activity and alleviated hepatotoxicity of clotrimazole-loaded suppository using poloxamer-propylene glycol gel" International Journal of Pharmaceutics, vol.321, N1-2, pp.56-61, 2006. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2741710C1 (ru) * | 2018-07-12 | 2021-01-28 | Елена Валентиновна Аршинцева | Термический способ стерилизации жидких лекарственных средств, содержащих в своем составе полоксамер |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11912823B2 (en) | Methods of preparing a poloxamer for use in cell culture medium | |
JP7377316B2 (ja) | 哺乳類細胞培養物を回収するための方法 | |
JP7066775B2 (ja) | 糖タンパク質のグリカン含量のレベルを操作するためのプロセス | |
EP2459702B1 (en) | Cell culture medium for adamts protein expression | |
US7067279B1 (en) | Cell culture performance with betaine | |
CN101903512A (zh) | 使用稳定的储存中间体制造生物产物的方法 | |
AU2023200660A1 (en) | Direct selection of cells expressing high levels of heteromeric proteins using glutamine synthetase intragenic complementation vectors | |
KR20170007457A (ko) | 환원제의 첨가에 의한 단백질 용액에서의 디술피드 결합의 형성의 제어 | |
US9102709B1 (en) | Regeneration of chromatography material | |
NZ725151B2 (en) | Methods of preparing a poloxamer for use in cell culture medium | |
JP6411891B2 (ja) | 培養液にアミノ酸を添加することによるポリペプチドの還元防止方法 |