BR112016021739B1

BR112016021739B1 - Método para preparar um poloxâmero para uso em um meio de cultura de célula

Info

Publication number: BR112016021739B1
Application number: BR112016021739-0A
Authority: BR
Inventors: Ganesh Prasadh Vissvesvaran; Robert David Kiss; Steven J. Meier; Inchan Kwon; Kara Calhoun; Kate WINCHESTER; Amelia ADAMS; Marion GLENN; Stefan Koenig; Alan DEESE
Original assignee: Genentech, Inc
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2021-11-03
Also published as: CA2943357A1; IL279583B; MY178060A; IL247902A0; EP3122799B1; CN111808276A; US11034793B2; KR102352250B1; MX2021001981A; SI3122799T1; MX2016012288A; IL279583A; KR20160138161A; CN106414552B; RU2016141568A3; JP2017516459A; NZ725151A; JP7472222B2; JP2020103290A; ZA201606711B

Abstract

métodos para preparar um poloxâmero para uso em meio de cultura de célula. a presente invenção proporciona métodos para preparar um poloxâmero para uso em um meio de cultura de célula. também são fornecidos pela presente invenção meios de cultura de célula contendo o poloxâmero preparado pelos métodos deste documento, assim como métodos para usar os meios para cultura de células e produção de polipeptídeo de células.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/970.281, depositado em 25 de março, 2014, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Esta invenção se refere a métodos de preparação de po- loxâmero (por exemplo, para utilização em um meio de cultura celular), meios de cultura celular contendo o poloxâmero preparado como aqui descrito, e métodos de utilização dos meios de cultura celular aqui descritos para as células de cultura e produzir polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Tecnologia de fabricação de cultura celular é amplamente utilizada para a produção de agentes terapêuticos à base de proteínas, como anticorpos, para utilização em formulações farmacêuticas. A produção comercial de produtos à base de proteínas, como um produto de anticorpo, requer a otimização de parâmetros de cultura celular, para que a célula produza uma elevada quantidade de produto de proteína para satisfazer as exigências de fabricação. Quando os produtos à base de proteínas são feitos em escala industrial, os fatores, como a eficiência da produção de proteína e o custo das matérias-primas (por exemplo, os componentes do meio de cultura celular) são extremamente importantes.

[004] Poloxâmero é um componente no meio de cultura celular que é amplamente utilizado na produção de proteínas industriais. Este é adicionado a um meio de cultura celular para aumentar a viabilidade das células cultivadas. Uma das suas muitas funções é atuar como um tensoativo, reduzindo a força de ligação entre as células e as bolhas de gás no meio de cultura celular e proteger as células de danos quando as bolhas explodem. Este também pode reforçar as membranas das células, melhorar a drenagem de células a partir da camada de espuma da cultura, e alterar a frequência e a velocidade da bolha.

[005] Infelizmente, variabilidade de lote para lote significativa no desempenho de poloxâmero foi observada. Quando usado em um meio de cultura celular, os lotes de fraco desempenho de poloxâmero podem causar viabilidade celular reduzida e taxa de crescimento celular. A viabilidade celular reduzida leva à produção de proteína reduzida. Quando a cultura é realizada a uma escala industrial, esta produção reduzida pode resultar em graves perdas financeiras.

[006] Portanto, existe uma necessidade para uma solução simples e barata para reduzir a variabilidade de poloxâmero e para melhorar o desempenho de poloxâmero, particularmente para lotes de baixo desempenho.

[007] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados aqui estão incorporados em sua totalidade por referência para todos os fins.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A invenção aqui fornecida divulga, entre outros, métodos de preparação de um poloxâmero (por exemplo, para utilização em um meio de cultura celular). Também são fornecidos poloxâmeros preparados pelos métodos aqui descritos. Além disso, são aqui divulgadas composições de meio de cultura celular contendo um poloxâmero preparado pelos métodos aqui descritos. Além disso, são aqui divulgados métodos de produção de um polipeptídeo em uma cultura celular por cultura de uma célula que produz o polipeptídeo em um meio de cultura celular contendo um poloxâmero preparado pelos métodos aqui descritos.

[009] Por conseguinte, em um aspecto, proporcionam-se aqui métodos para a preparação de um poloxâmero, para utilização em um meio de cultura celular, compreendendo as etapas de: (a) aquecer um poloxâmero sólido a pelo menos cerca de 60°C para formar um po- loxâmero líquido; e (b) resfriar o poloxâmero líquido a uma temperatura abaixo de cerca de 50°C para formar um poloxâmero sólido tratado termicamente, em que o resfriamento não é conduzido em um dispositivo de peletização ou moagem, e em que o poloxâmero compreende um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero tratado termicamente é aumentada em comparação com a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a). Em algumas moda-lidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 185 °C. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 157°C e cerca de 185°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 157°C e cerca de 185°C durante pelo menos 1 minuto. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 157°C e cerca de 185°C durante entre 1 minuto e cerca de 250 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 134°C e cerca de 157°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 134°C e cerca de 157°C, durante pelo menos 1 minuto. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 134°C e cerca de 157°C durante entre 1 minuto e cerca de 250 minu-tos. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C, por pelo menos cerca de 62 minutos. Em algumas modalidades, o po- loxâmero é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C por entre cerca de 62 minutos e cerca de 250 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C, por pelo menos cerca de 98 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C, por entre cerca 98 minutos e cerca de 250 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C por pelo menos cerca de 122 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C por entre cerca de 122 minutos e cerca de 250 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C por pelo menos cerca de 143 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C por entre cerca de 143 minutos e cerca de 250 minutos. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero tratado termicamente é aumentada em pelo menos 10%, em comparação com a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a). Em algumas modalidades, a viabilidade celular é aumentada em pelo menos cerca de 20%. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é aumentada em pelo menos cerca de 30%. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a) é menos do que cerca de 80% após cerca de 3 horas de cultura celular. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido na etapa (b) é resfriado até a temperatura ambiente, cerca de 2°C a cerca de 8°C, ou abaixo de 0°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido sob um vácuo. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido é resfriado por, pelo menos, cerca de 20 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero tratado termicamente produzido na etapa (b) é adicionado a um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, as etapas (a) e (b) são repetidas pelo menos uma vez antes da adição do poloxâme- ro tratado termicamente ao meio de cultura celular. Em algumas modalidades, o poloxâmero foi tratado por um processo de peletização por pulverização antes da etapa (a). Em algumas modalidades, o poloxâ- mero tem uma fórmula de HO (C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, em que n é de cerca de 60 a cerca de 150 e m é de cerca de 25 a cerca de 60. Em algumas modalidades, o poloxâmero tem uma temperatura de fusão de cerca de 55°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero tem um peso molecular médio de cerca de 6.000 a cerca de 18.000 Dál- tons. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende um copo- límero que tem uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH com n tendo um valor de cerca de 80, com m tendo um valor de cerca de 27, e o poloxâmero tem um peso molecular médio de cerca de 7680 a cerca de 9510 g/mol. Em algumas modalidades, o poloxâmero é poloxâ- mero 188. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em outras encarnações, a célula é uma célula do ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, a célula é uma célula de inseto. Em algumas modalidades, a célula produz um polipeptídeo.

[0010] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um poloxâmero preparado por qualquer um dos métodos descritos acima e aqui.

[0011] Em outro aspecto, é aqui proporcionado um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero preparado por qualquer um dos métodos descritos acima e aqui. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 3 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 3 g/L a cerca de 10 g/L.

[0012] Em ainda outro aspecto, proporcionam-se aqui métodos de produção de um polipeptídeo em uma cultura celular, compreendendo a etapa de cultura de uma célula que produz o polipeptídeo em um meio de cultura celular em condições adequadas para a produção do polipeptídeo, em que o meio de cultura celular compreende o poloxâ- mero produzido por qualquer um dos métodos descritos acima e aqui. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em outras modalidades, a célula é uma célula do ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, a célula é uma célula de inseto. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termi- camente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 3 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 3 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0013] Por conseguinte, em um aspecto, aqui são proporcionados métodos de preparação de um poloxâmero (por exemplo, para utilização em um meio de cultura celular), que compreende as etapas de (a) aquecer um poloxâmero purificado a cerca de 80°C ou superior (por exemplo, cerca de 80°C a cerca de 100°C) para formar um poloxâmero líquido, e (b) resfriar o poloxâmero líquido a uma temperatura a cerca de 50°C ou inferior, para formar um poloxâmero tratado termicamente sólido, em que o resfriamento não é conduzido em um dispositivo de peletização ou moagem. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno que tem uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, em que n é de cerca de 60 a cerca de 150 e m é de cerca de 25 a cerca de 60. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero tratado termicamente é aumentada em comparação com a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a). Em algumas modalidades, o poloxâ- mero é um poloxâmero purificado. Em algumas modalidades, um po- loxâmero purificado é uma composição de poloxâmero que não contêm um outro composto terapêutico ou farmacêutico. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) não contém um outro composto terapêutico ou farmacêutico. Em algumas modalidades, o poloxâmero na etapa (a) é aquecido a cerca de 85°C a cerca de 91°C. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero é aquecido desde cerca de 10 a cerca de 15 minutos. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero líquido na etapa (b) é resfriado até a temperatura ambiente, cerca de 2°C a cerca de 8°C, ou abaixo de 0°C. Em algumas modalidades aqui, o po- loxâmero líquido é resfriado durante, pelo menos, cerca de 20 minutos. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero tratado termicamente produzido na etapa (b) é adicionado a um meio de cultura celular. Em algumas modalidades aqui, as etapas (a) e (b) são repetidas pelo menos uma vez antes da adição do poloxâmero tratado termicamente no meio de cultura celular. Em algumas modalidades aqui, a viabilidade celular é aumentada em pelo menos cerca de 10%. Em algumas modalidades aqui, a viabilidade celular é aumentada em pelo menos cerca de 30%. Em algumas modalidades aqui, a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a) é menos do que cerca de 80%. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero foi tratado por um processo de peletização antes da etapa (a). Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero tem uma temperatura de fusão na faixa de cerca de 45°C a cerca de 60°C. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero tem um peso molecular médio de cerca de 6.000 a cerca de 18.000 Dáltons. Em algumas modali- dades aqui, o poloxâmero é poloxâmero 188. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende um copolímero que tem uma fórmula de HO (C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH com n tendo um valor de cerca de 80, com m tendo um valor de cerca de 27, e o poloxâmero tem um peso molecular médio de cerca de 7680 a cerca de 9510 g/mol. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero é poloxâmero 237. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende um copolímero tendo uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH com n tendo um valor de cerca de 64 com m tendo um valor de cerca de 37. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero é poloxâmero 338. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende um copolímero que tem uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH com n tendo um valor de cerca de 141 e com m tendo um valor de cerca de 44. Em algumas modalidades aqui, o poloxâmero é poloxâmero 407. Em algumas mo-dalidades, o poloxâmero compreende um copolímero tendo uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH com n tendo um valor de cerca de 101 e com m tendo um valor de cerca de 56. Em algumas modalidades aqui, a célula pode ser uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades aqui, a célula pode ser uma célula de inseto. Em algumas modalidades aqui, a célula produz um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em um outro aspecto, é aqui proporcionado um poloxâmero produzido por qualquer um dos métodos descritos acima e aqui.

[0014] Em outro aspecto, são aqui proporcionados meios de cultura celular que compreende o poloxâmero produzido por qualquer um dos métodos descritos acima e aqui. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 3 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 3 g/L a cerca de 10 g/L.

[0015] Em outro aspecto, proporcionam-se aqui métodos de produção de um polipeptídeo em uma cultura celular, compreendendo a etapa de cultura de uma célula que produz o polipeptídeo em um meio de cultura celular em condições adequadas para a produção do poli- peptídeo, em que o meio de cultura celular compreende o poloxâmero produzido por qualquer um dos métodos descritos acima e aqui. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em outras modalidades, a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, a célula é uma célula de inseto. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termi- camente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 3 g/L. Em algumas modalidades, o meio celular compreende o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 3 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo produzido pela célula é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0016] Deve ser entendido que uma, algumas, ou todas as propriedades das várias modalidades aqui descritas podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes para um especialista na técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A FIGURA 1 mostra que o tratamento térmico de poloxâ- mero melhora o seu efeito sobre a viabilidade celular em cultura. O gráfico em diamantes indica a média (linha central) e intervalos de confiança de 95% superiores/inferiores (pontos de diamantes), bem como os valores de viabilidade celular (pontos) para cada condição experimental. Cada experimento compara poloxâmero não tratado (HT) e tratado termicamente a partir de um lote bom ou ruim ("suspeito") de poloxâmero, como indicado no eixo x. As setas indicam a melhoria da viabilidade celular após tratamento térmico de lotes ruins. Note-se que o tratamento térmico também melhora a viabilidade celular do lote bom, de uma média de aproximadamente 85% para um valor de aproximadamente 95%.

[0018] A FIGURA 2 apresenta a viabilidade celular (%) em um teste de modelo de frasco em agitação de elevado cisalhamento (HSSF) para amostras de poloxâmero não tratado (_HT) e tratados termica- mente A, B, E C (ver também a Tabela 2).

[0019] A FIGURA 3 mostra o desenho de superfície de resposta das condições testadas em fornos. Cada condição é rotulada no formato "tempo, temperatura." Condições marcadas com '♦' foram testadas em HSSF. Condições marcadas com '◊' foram preparadas em fornos, mas não testadas em HSSF. Temperatura (em °C) representa a temperatura definida do forno, enquanto que o tempo (em minutos) representa o momento em que a amostra de poloxâmero estava no forno.

[0020] A FIGURA 4 mostra a melhoria da viabilidade celular (%) (Vf (Tratada) - Vf (Não tratada)) para amostras poloxâmero C tratadas termi- camente em fornos nas condições indicadas, em relação aos controles positivos ("Lote bom") e negativos ("Lote ruim não tratado") (D e C, respectivamente. As barras de erro representam um desvio padrão.

[0021] A FIGURA 5 mostra um gráfico de contorno de um desenho completo de experimentos (DOE) explorando efeitos de diferentes condições de tratamento térmico sobre o desempenho do poloxâmero na cultura celular. A melhoria da viabilidade (Vf (Tratada) - Vf (Não tratada)) no teste HSSF é mostrada como uma função de tempo e temperatura. Pontos indicam as condições da amostra testada.

[0022] A FIGURA 6 mostra a melhoria da viabilidade celular (%) (Vf (Tratada) - Vf (Não tratada)) em um teste HSSF para amostras de poloxâ- mero de três lotes ruins (H, F, e G) e um lotem bom (E) tratado com calor sob as condições indicadas.

[0023] A FIGURA 7 mostra uma comparação de melhoria da viabilidade celular (%) (Vf (Tratada) - Vf (Não tratada)) para lotes ruins de poloxâ- mero (H e G) tratados a temperaturas baixas (60-80°C) durante um longo período (120 min). * Modelo HSSF executado em duplicatas.

[0024] A FIGURA 8 mostra a melhoria da viabilidade celular (%) (Vf (Tratada) - Vf (Não tratada)) em um teste HSSF para amostras de poloxâ- mero (H e G) tratadas termicamente sob condições de vácuo, em comparação com as não tratadas.

[0025] A FIGURA 9 mostra os perfis de aquecimento e resfriamento para o material de poloxâmero em fornos. Três temperaturas foram testadas: 140°C, 155°C e 170°C. Uma vez que a leitura de temperatura começou a estabilizar, o material foi retirado do forno e resfriado até temperatura ambiente. Perfis estabilizaram a 40°C, perto do ponto de fusão do poloxâmero.

[0026] A FIGURA 10 mostra resultados de Teste t de Student para cada lote de poloxâmero tratado termicamente em comparação com o controlo positivo (D) e o material não tratado. Os diamantes médios ilustram (pontos superior e inferior) intervalos de confiança de 95% e a média (linha central) para cada conjunto de dados.

[0027] A FIGURA 11 mostra um gráfico de contorno para os dados a partir da superfície de resposta e experimentos completos DOE que ilustram a grande variedade de trabalho para condições de tratamento térmico do poloxâmero. Mudança na viabilidade celular (%) para cada espaço experimental está ilustrada. A melhoria da viabilidade (Vf (Tratada) - Vf (Não tratada)) em testes HSSF é mostrada como uma função de tempo e temperatura. Os dados de superfície de resposta refletem tempos e temperaturas corrigidos para o tempo necessário para atingir a temperatura alvo. Pontos indicam as condições da amostra testada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0028] Os inventores deste pedido de patente demonstraram que o tratamento térmico de poloxâmero melhora a capacidade do poloxâ- mero para suportar a viabilidade em cultura celular. Os dados apresentados no pedido mostram que o uso de um meio de cultura celular com o poloxâmero tratado termicamente melhora a viabilidade celular, em comparação ao uso de um meio de cultura celular sem o tratamento térmico. Os inventores demonstraram que diferentes lotes de poloxâ- mero, quando adicionados ao meio de cultura celular, têm efeitos drasticamente diferentes na viabilidade celular, e que o tratamento térmico aqui descrito melhora o efeito sobre a viabilidade celular para ambas as lotes bons e ruins de poloxâmero.

[0029] Em um aspecto, proporcionam-se aqui métodos para a preparação de um poloxâmero por aquecimento de um poloxâmero e resfriamento do poloxâmero, em que a refrigeração não é conduzido em um dispositivo de peletização ou moagem. Em algumas modalidades, os métodos incluem a preparação de um poloxâmero por aquecimento de um poloxâmero e cerca de 80°C ou superior (por exemplo, a cerca de 100°C) para formar um poloxâmero líquido e resfriando a poloxâmero líquido a uma temperatura abaixo de cerca de 50°C para formar um poloxâmero tratado termicamente sólido, em que o resfriamento não é conduzido em um dispositivo de peletização ou moagem, e em que o poloxâmero contém um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno. Em algumas modalidades, o poloxâmero contém um co- polímero de óxido de etileno e óxido de propileno tendo uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, em que n é de cerca de 60 a cerca de 150 e m é de cerca de 25 a cerca de 60. Em algumas modalida- des, o poloxâmero é um poloxâmero um sólido antes do processo de aquecimento e resfriamento. Em algumas modalidades, o poloxâmero é um poloxâmero líquido em temperatura ambiente antes do processo de aquecimento e resfriamento. Em algumas modalidades, o poloxâ- mero é um poloxâmero sólido dissolvido em uma solução líquida ou aquosa antes do processo de aquecimento e resfriamento. Por exemplo, os métodos aqui proporcionados podem ser usados para preparar um poloxâmero, para utilização em um meio de cultura celular ou cultura celular.

[0030] Em outro aspecto, proporcionam-se aqui composições para a cultura celular, incluindo um poloxâmero tratado termicamente. Em outro aspecto, proporcionam-se aqui composições para cultura celular contendo um poloxâmero tratado termicamente em um meio de cultura celular.

[0031] Em outro aspecto, proporcionam-se aqui métodos para a produção de um polipeptídeo em uma cultura celular por cultura de uma célula que produz o polipeptídeo em um meio de cultura celular contendo um poloxâmero tratado termicamente sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo. I. Definições

[0032] Antes de descrever a invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a composições particulares ou sistemas biológicos que podem, é claro, variar. Deve também ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a ser limitativa.

[0033] Conforme usadas neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "uma molécula" inclui, o- pcionalmente, uma combinação de duas ou mais de tais moléculas, e semelhantes.

[0034] O termo "cerca de", como aqui utilizado refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido dos especialistas este campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui aqui (e descreve) modalidades que são dirigidas àquele ou parâmetro por si só.

[0035] Entende-se que aspectos e modalidades da invenção descritas aqui incluem "compreendendo," "consistindo," e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades.

[0036] O termo "poloxâmero" refere-se a um copolímero de bloco feito de uma cadeia de polioxipropileno (o termo "óxido de propileno" pode ser aqui utilizado alternadamente) flanqueado por duas cadeias de polioxietileno (o termo "óxido de etileno" pode ser aqui utilizado alternadamente). Poloxâmeros podem ser vendidos sob os nomes comerciais, incluindo PLURONIC® (BASF), KOLLIPHOR® (BASF), LUTROL® (BASF), e SYNPERONIC® (Croda International). A menos que uma espécie particular de poloxâmero seja especificada, as referências a "poloxâmero" podem se referir genericamente a várias espécies de poloxâmero.

[0037] Em algumas modalidades, o poloxâmero é um poloxâmero purificado. O termo "poloxâmero purificado" refere-se a uma composição de poloxâmero que é substancialmente isenta de outros compostos. Um poloxâmero purificado pode incluir, por exemplo, um poloxâ- mero comercialmente disponível tendo um grau de técnica ou superior. Exemplos de tipos de técnica ou superior podem incluir grau técnico, grau purificado, grau N.F. (US National Formulary), grau U.S.P. (Farmacopeia dos Estados Unidos), grau reagente, e grau A.C.S. (American Chemical Society). Um poloxâmero purificado refere-se a um que não está misturado com outro composto. Por exemplo, um poloxâmero purificado pode referir-se a um poloxâmero que não se mistura com um composto terapêutico ou farmacêutico, por exemplo, como parte de uma formulação de fármaco. Em algumas modalidades, um po- loxâmero purificado é um que é substancialmente livre de, ou não misturado com reagentes que não reagiram, catalisadores ou outros produtos gerados através de um processo de síntese de poloxâmero ou de reação.

[0038] O termo "poloxâmero tratado termicamente" refere-se a um poloxâmero tratado termicamente pelo menos uma vez pelos métodos aqui fornecidos.

[0039] Os termos "meio" e "meio de cultura celular" referem-se a uma fonte de nutriente utilizada para o cultivo ou a manutenção de células. Como é entendido por um especialista na técnica, a fonte de nutrientes pode conter componentes exigidos pela célula para o crescimento e/ou sobrevivência ou pode conter componentes que auxiliam no crescimento e/ou sobrevivência celular. Vitaminas, aminoácidos essenciais ou não essenciais, elementos traços, e tensoativos (por exemplo, poloxâmeros) são exemplos de componentes do meio. Quaisquer meios aqui proporcionados também podem ser suplementados com qualquer um ou mais de insulina, hidrolisados de plantas e hidrolisados de animais.

[0040] "A cultura" de uma célula refere-se ao contato de uma célula com um meio de cultura celular em condições adequadas para a viabilidade e/ou crescimento e/ou a proliferação da célula.

[0041] "Cultura em lote" refere-se a uma cultura em que todos os componentes para a cultura celular (incluindo as células e todos os nutrientes e componentes de cultura) são fornecidos ao recipiente de cultura no início do processo de cultura.

[0042] A frase "cultura celular em batelada alimentada", como aqui utilizado refere-se a uma cultura em lotes em que as células e meio de cultura são fornecidos ao recipiente de cultura inicialmente e nutrientes de cultura adicionais são alimentados, continuamente ou em incrementos discretos, para a cultura durante o processo de cultura, com ou sem colheita periódica de célula e/ou produto antes do término da cultura.

[0043] "Cultura de perfusão" é uma cultura através da qual as células são contidas na cultura por, por exemplo, filtração, encapsulamento, ancoragem a microtransportadores etc. e o meio de cultura é continuamente ou intermitentemente introduzido e removido do recipiente de cultura.

[0044] "Recipiente de cultura" refere-se a um recipiente utilizado para a cultura de uma célula. O recipiente de cultura pode ser de qualquer tamanho, contanto que seja útil para a cultura celular.

[0045] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados alternadamente aqui para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os polímeros podem ser lineares ou ramificados, podem compreender aminoácidos modificados, e podem ser interrompidos por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, pela formação da ligação de dissulfeto, glicosila- ção, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de marcação. Estão também incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Exemplos de polipeptídeos incluídos dentro da definição aqui incluem proteínas de mamíferos, como, por exemplo, renina; um hormônio do crescimento, incluindo hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; fator de liberação do hormônio do crescimento; hormônio paratireoide; hormônio estimu- lante da tireoide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pró-insulina; hormônio folículo-estimulante; calci- tonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coagulação como fator VIIIC, fator IX, fator tecidual, e fator de von Willebrands; fatores anticoagulantes como proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; um ativador de plasminogênio, como uroquinase ou ativador de plasminogênio tipo tecidual ou urina humano (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoietico; fator de necrose tumoral alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulada na ativação de célula T normalmente expressa e secretada); proteína inflamatória de macrófa- go humano (MIP-1-alfa); uma albumina sérica como albumina sérica humana; substância inibidora de Muellerian; cadeia A de relaxina; ca-deia B de relaxina; pré-relaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado a linfócito T citotóxico (CTLA), como CTLA-4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófico como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina -3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo como NGF-b; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF) como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ou TGF-β5; fator de crescimento tipo insulina I e II (IGF-I e IGF-II); des(1- 3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação ao fator de crescimento tipo insulina (IGFBPs); proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon como interferon alfa, beta, e gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs), por exemplo, M- CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (IL), por exemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutase; receptores de células T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração de decaimento; antígeno viral como, por exemplo, uma porção do envelope da AIDS; proteínas de transporte; receptores homing; adressinas; proteínas reguladoras; in- tegrinas como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado a um tumor, como CA125 (antígeno do câncer do ovário) ou receptor HER2, HER3 ou HER4; imunoadesinas; e fragmentos e/ou variantes de qualquer uma das proteínas acima listadas bem como os anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, ligação a uma proteína, incluindo, por exemplo, qualquer uma das proteínas acima listadas.

[0046] O termo "título", como aqui utilizado refere-se à quantidade total de anticorpo expressa de forma recombinante produzida por uma cultura celular dividida por uma dada quantidade de volume de meio. O título é tipicamente expresso em unidades de miligramas de anticorpo por mililitro de meio. Título pode ser expresso ou avaliado em termos de uma medição relativa, como uma percentagem de aumento no título em comparação como a obtenção do produto de proteína sob diferentes condições de cultura.

[0047] O termo "anticorpo" aqui utilizado é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlo- nais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecífi- cos), e fragmentos de anticorpos, contanto que apresentem a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou maturado por afinidade.

[0048] Os termos "anticorpo de comprimento completo", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são aqui utilizados de modo alternativo para se referir a um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, não fragmentos de anticorpo como definido abaixo. Os termos referem-se particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm uma região Fc.

[0049] "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente compreendendo a região de ligação do antígeno (o termo "fragmento de ligação ao antígeno" pode ser utilizado indiferentemente) do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; dia- bodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. II. Métodos de preparação de um Poloxâmero

[0050] São aqui proporcionados métodos de preparação de um poloxâmero, por exemplo, para utilização em um meio de cultura celular.

Aquecimento

[0051] Em alguns aspectos, os métodos de preparação de um po- loxâmero, para utilização em um meio de cultura celular aqui fornecidos incluem o aquecimento de um poloxâmero (por exemplo, um po- loxâmero purificado) para formar um poloxâmero líquido. Por exemplo, um poloxâmero purificado na fase sólida pode ser aquecido para fundir, formando assim um poloxâmero líquido. A temperatura na qual o poloxâmero é aquecido pode ser ajustada com base na temperatura de fusão das espécies poloxâmero particulares utilizadas. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado tem uma temperatura de fusão na faixa de cerca de 45°C a cerca de 60°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado tem uma temperatura de fusão na faixa de cerca de 50°C a cerca de 55°C.

[0052] Em algumas modalidades, os métodos de preparação de um poloxâmero, para utilização em um meio de cultura celular aqui fornecidos incluem o aquecimento de um poloxâmero sólido a pelo menos cerca de 60°C para formar um poloxâmero líquido e resfriando a poloxâmero líquido a uma temperatura abaixo de cerca de 50°C para formar um poloxâmero termicamente tratado sólido, em que a refrigeração não é conduzida em um dispositivo de peletização ou moagem, e o poloxâmero compreende um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno. Em algumas modalidades, o poloxâmero é um po- loxâmero purificado. Em algumas modalidades, um poloxâmero purificado é uma composição de poloxâmero que não contêm outro composto terapêutico ou farmacêutico.

[0053] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecida até pelo menos cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, ou 185. Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido durante pelo menos 1 minuto. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido por pelo menos cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 2 minutos, pelo menos cerca de 3 minutos, pelo menos cerca de 4 minutos, pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 6 minutos, pelo menos cerca de 7 minutos, pelo menos cerca de 8 minutos, pelo menos cerca de 9 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 15 minutos , pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 25 pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 35 minutos, pelo menos cerca de 40 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 50 minutos, pelo menos cerca de 55 minutos, pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 65 minutos, pelo menos cerca de 70 minutos, pelo menos cerca de 75 minutos, pelo menos cerca de 80 minutos, pelo menos cerca de 85 de 90 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 110 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos cerca de 130 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 150 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 170 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 190 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 210 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos ou pelo menos cerca de 240 minutos.

[0054] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 185°C. Deve ser notado que nenhuma das faixas de temperaturas aqui descrita destina-se a ser inclusiva, salvo indicação em contrário. Por exemplo, uma faixa de temperaturas entre cerca de 60°C e cerca de 185°C inclui cerca de 60°C e cerca de 185°C como estando dentro da faixa referida. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, ou 65. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, ou 180. Isto é, o po- loxâmeros pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que têm um limite superior de 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, ou 65 e um limite inferior selecionado independentemente de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, ou 180, em que o limite inferior é menos do que o limite superior. Em algumas modalidades, o poloxâme- ro (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 185°C durante pelo menos 1 minuto. Em algumas mo-dalidades, o poloxâmero é aquecido por pelo menos cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 2 minutos, pelo menos cerca de 3 minutos, pelo menos cerca de 4 minutos, pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 6 minutos, pelo menos cerca de 7 minutos, pelo menos cerca de 8 minutos, pelo menos cerca de 9 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 25 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 35 minutos, pelo menos cerca de 40 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 50 minutos, pelo menos cerca de 55 minutos, pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 65 minutos, pelo menos cerca de 70 minutos, pelo menos cerca de 75 minutos, pelo menos cerca de 80 minutos, pelo menos cerca de 85 minutos, pelo menos cerca de 90 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 110 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos cerca de 130 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 150 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 170 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 190 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 210 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido por entre cerca de 60°C e cerca de 185°C durante entre cerca de 1 minuto e cerca de 250 minutos. Deve ser notado que qualquer um dos intervalos de tempo aqui descritos destinam-se a ser inclusivo, salvo indicação em contrário. Por exemplo, uma faixa de tempos entre cerca de 1 minuto e cerca de 250 minutos inclui cerca de 1 minuto e cerca de 250 minutos como sendo dentro do referido intervalo. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido para menos de cerca de qualquer um dos seguintes tempos (em minutos): 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido para mais de cerca de qualquer um dos seguintes tempos (em minutos): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, ou 240. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecida durante um tempo na faixa de tempos tendo um limite superior de 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 e um limite inferior selecionado independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, ou 2400, em que a inferior limite é menor do que o limite superior.

[0055] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 157°C e cerca de 185°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 185, 180, 175, 170, 165, ou 160. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 157, 160, 165, 170, 175, ou 180. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que tem um limite superior de 185, 180, 175, 170, 165, ou 160 e um limite inferior independentemente selecionado 157, 160, 165, 170, 175, ou 180, em que o limite inferior é menor do que o limite superior. Em algumas modalidades, o poloxâ- mero é aquecido a entre cerca de 157°C e cerca de 185°C durante pe-lo menos cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 2 minutos, pelo menos cerca de 3 minutos, pelo menos cerca de 4 minutos, pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 6 minutos, pelo menos cerca de 7 minutos, pelo menos cerca de 8 minutos, pelo menos cerca de 9 minutos, pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 25 minutos, pelo menos cerca de 35 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 55 minutos, pelo menos cerca de 65 minutos, pelo menos cerca de 75 minutos, pelo menos cerca de 85 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos, ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 157°C e cerca de 185°C para menos do que ou igual a 250 minutos.

[0056] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 134°C e cerca de 157°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura menor do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 157, 155, 150, 145, 140, ou 135. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 134, 135, 140, 145, 150, ou 155. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que tem um limite superior de 157, 155, 150, 145, 140, ou 135 e um limite inferior independentemen- te selecionado 134, 135, 140, 145, 150, ou 155, em que o limite inferior for menor do que o limite superior. Em algumas modalidades, o po- loxâmero é aquecido a entre cerca de 134°C e cerca de 157°C durante pelo menos cerca de 1 minuto, pelo menos cerca de 2 minutos, pelo menos cerca de 3 minutos, pelo menos cerca de 4 minutos, pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 6 minutos, pelo menos cerca de 7 minutos, pelo menos cerca de 8 minutos, pelo menos cerca de 9 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 25 minutos, pelo menos cerca de 35 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 55 minutos, pelo menos cerca de 65 minutos, pelo menos cerca de 75 minutos, pelo menos cerca de 85 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos, ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 134°C e cerca de 157°C para menos do que ou igual a 250 minutos.

[0057] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 134, 130, ou 125. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 120, 125 ou 130. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que tem um limite superior de 134, 130, ou 125 e um limite inferior selecionado independentemente de 120, 125, ou 130, em que o limite inferior é menor do que a superior limite. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C por pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 40 minutos, pelo menos cerca de 50 minutos, ou pelo menos cerca de 60 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C por pelo menos cerca de 62 minutos, pelo menos cerca de 65 minutos, pelo menos cerca de 70 minutos, pelo menos cerca de 75 minutos, pelo menos cerca de 80 minutos, pelo menos cerca de 85 minutos, pelo menos cerca de 90 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 110 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos cerca de 130 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 150 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 170 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 190 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 210 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos, ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 120°C e cerca de 134°C para menos do que ou igual a 250 minutos.

[0058] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 120, 115, 110, ou 105. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 100, 105, 110, ou 115. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que tem um limite superior de 120, 115, 110, ou 105 e um limite inferior independentemente selecionado 100, 105, 110, ou 115, em que o limite inferior é menos do que o limite superior. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C por pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 40 minutos, pelo menos cerca de 50 minutos ou pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 70 minutos, pelo menos cerca de 80 minutos, ou pelo menos cerca de 90 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C por pelo menos cerca de 98 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 110 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos cerca de 130 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 150 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 170 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 190 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 210 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos, ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 100°C e cerca de 120°C para menos do que ou igual a 250 minutos.

[0059] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 100, 95, 90, ou 85. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qual- quer uma das seguintes temperaturas (em °C): 80, 85, 90, ou 95. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que tem um limite superior de 100, 95, 90, ou 85 e um limite inferior selecionado independentemente de 80, 85, 90, ou 95, em que o limite inferior é menos do que o limite superior. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C por pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 40 minutos, pelo menos cerca de 50 minutos, ou pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 70 minutos, pelo menos cerca de 80 minutos, ou pelo menos cerca de 90 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 110 minutos, ou pelo menos cerca de 120 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C por pelo menos cerca de 122 minutos, pelo menos cerca de 130 minutos, pelo menos cerca de 140 minutos, pelo menos cerca de 150 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 170 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 190 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 210 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minu tos, ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 80°C e cerca de 100°C por menos do que ou igual a 250 minutos.

[0060] Em algumas modalidades, o poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 80, 75, 70, ou 65. Em algumas modalidades, o po- loxâmero é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 60, 65, 70 ou 75. Isto é, o poloxâmero pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de tempe- raturas que tem um limite superior de 80, 75, 70, ou 65 e um limite inferior selecionado independentemente de 60, 65, 70, ou 75, em que o limite inferior é menos do que o limite superior. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C por pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 40 minutos, pelo menos cerca de 50 minutos, ou pelo menos cerca de 60 minutos, pelo menos cerca de 70 minutos, pelo menos cerca de 80 minutos, ou pelo menos cerca de 90 minutos, pelo menos cerca de 100 minutos, pelo menos cerca de 110 minutos, pelo menos cerca de 120 minutos, pelo menos de 130 minutos, ou pelo menos 140 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C por pelo menos cerca de 143 minutos, pelo menos cerca de 150 minutos, pelo menos cerca de 160 minutos, pelo menos cerca de 170 minutos, pelo menos cerca de 180 minutos, pelo menos cerca de 190 minutos, pelo menos cerca de 200 minutos, pelo menos cerca de 210 minutos, pelo menos cerca de 220 minutos, pelo menos cerca de 230 minutos, ou pelo menos cerca de 240 minutos. Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido a entre cerca de 60°C e cerca de 80°C por menos do que ou igual a 250 minutos.

[0061] Em algumas modalidades, o poloxâmero é aquecido sob um vácuo. Por exemplo, o poloxâmero pode ser aquecido em um forno de vácuo sob um vácuo aplicado. Como descrito abaixo, foi inesperadamente verificado que aquecer o poloxâmero nas temperaturas aqui descritas sob um vácuo aplicado resulta em desempenho melhorado do poloxâmero (ver, por exemplo, Exemplo 7). Dito de outra forma, a aplicação de vácuo ao poloxâmero durante o aquecimento não nega os efeitos benéficos de aquecimento sobre o subsequente desempenho do poloxâmero, por exemplo, em cultura celular.

[0062] Em outras modalidades, o aquecimento de um poloxâmero a uma temperatura alvo por um período de tempo pode referir-se ao tempo durante o qual o poloxâmero está na temperatura particular. Isto quer dizer, tempo = 0 pode indicar o momento em que o poloxâmero atingiu a temperatura alvo. Por exemplo, o aquecimento de um po- loxâmero a 140°C durante 5 minutos, pode indicar que o poloxâmero foi aquecido durante 5 minutos, depois de atingir uma temperatura de 140°C. Por exemplo, o aquecimento de um poloxâmero (por exemplo, um poloxâmero purificado) a entre cerca de 60°C e cerca de 185°C durante pelo menos 1 minuto indica que o poloxâmero alcançou a temperatura alvo (por exemplo, entre cerca de 60°C e cerca de 185°C) durante pelo menos 1 minuto.

[0063] Em algumas modalidades, a temperatura do poloxâmero purificado durante o processo de aquecimento não excede cerca de 120°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado pode ser dissolvido em uma solução líquida aquosa ou antes do processo de aquecimento. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado dissolvido em uma solução líquida ou aquosa pode ser aquecido a uma temperatura mais elevada do que seria utilizada para um poloxâmero sólido. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é um po- loxâmero sólido antes do processo de aquecimento. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é um poloxâmero líquido em temperatura ambiente antes do processo de aquecimento.

[0064] Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido a uma temperatura de cerca de 80°C até cerca de 100°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido a uma temperatura de cerca de 85°C a cerca de 91°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, ou 81. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido a uma temperatura superior a cerca de qualquer uma das seguintes temperaturas (em °C): 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99. Isto é, o poloxâmero purificado pode ser aquecido a uma temperatura na faixa de temperaturas que tem um limite superior de 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, ou 81 e um limite inferior selecionado independentemente de 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99, em que o limite inferior é menor do que o limite superior. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de 120°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido a uma temperatura de menos do que cerca de qualquer uma de 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C, 116°C, 117°C, 118°C e 119°C.

[0065] O poloxâmero purificado pode ser aquecido por qualquer período de tempo desejado. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido por cerca de 10 a cerca de 15 minutos. O tempo de aquecimento pode referir-se ao tempo total durante o qual o calor é aplicado ao poloxâmero, de modo que o tempo de aquecimento não está limitado ao tempo durante o qual o poloxâmero atingiu a temperatura desejada. Em algumas modalidades, o poloxâmero purificado é aquecido durante um período total de tempo entre cerca de 10 e cerca de 15 minutos, e o aquecimento é interrompido quando o poloxâmero atinge uma temperatura máxima desejada, por exemplo, cerca de 80°C a cerca de 100°C.

[0066] Qualquer aparelho de aquecimento adequado conhecido na técnica pode ser utilizado para aquecer o poloxâmero purificado. Como um exemplo não limitativo, o poloxâmero sólido pode ser aquecido em um recipiente de vidro (por exemplo, um béquer PYREX®, frasco ou outro recipiente aberto) que é aquecido em uma placa de aqueci- mento de laboratório padrão (por exemplo, em uma placa de aquecimento e agitação vendido pela Corning®, Costar® ou Thermo Scientific™). Alternativamente, o poloxâmero pode ser aquecido em um forno de vácuo.

[0067] Qualquer instrumento de medição de temperatura adequado conhecido na técnica pode ser utilizado para medir a temperatura do poloxâmero durante/depois do tratamento térmico, contanto que a ferramenta de medição de temperatura seja utilizada de tal maneira que uma medição precisa da temperatura poloxâmero possa ser feita (por exemplo, de acordo com as instruções de uso do fabricante). Exemplos não limitativos de ferramentas de medição de temperatura adequadas incluem, sem limitação termômetros (por exemplo, termômetros de líquido em vidro), termopares (por exemplo, como descrito abaixo), detectores de temperatura de resistência (RTDs), e/ou termistores. Em algumas modalidades, a ferramenta de medição de temperatura pode ser intrínseca ao equipamento utilizado para o aquecimento. Resfriamento

[0068] Em alguns aspectos, os métodos de preparação de um po- loxâmeros para utilização em um meio de cultura celular descritos aqui incluem o resfriamento de um poloxâmero aquecido, purificado para formar um poloxâmero sólido tratado termicamente. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido é resfriado até uma temperatura abaixo de cerca de 50°C. A temperatura na qual o poloxâmero líquido é resfriado pode ser qualquer temperatura abaixo da sua temperatura de congelamento, que pode variar dependendo do poloxâmero particular utilizado. Por exemplo, poloxâmero 188 tem uma temperatura de congelamento de cerca de 52°C, de modo que este poloxâmero pode ser resfriado a qualquer temperatura abaixo de cerca de 52°C para formar um poloxâmero sólido tratado termicamente.

[0069] O poloxâmero líquido aquecido pode ser resfriado a qual- quer temperatura suficiente para que o poloxâmero possa congelar. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido aquecido é resfriado em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido aquecido é resfriado a cerca de 2°C a cerca de 8°C. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido aquecido é resfriado a abaixo de cerca de 0°C, por exemplo, a cerca de -20°C ou a cerca de -70°C.

[0070] O poloxâmero líquido aquecido pode ser resfriado por qualquer duração desejada de tempo suficiente para o poloxâmero líquido aquecido congelar a essa temperatura de resfriamento. Em algumas modalidades, o poloxâmero líquido é resfriado por cerca de 20 minutos. O tempo de resfriamento pode depender da temperatura na qual o poloxâmero foi aquecido e/ou a temperatura de resfriamento. As temperaturas e tempos de resfriamento podem ser determinados empiricamente por observação de quanto tempo um poloxâmero líquido (aquecido a uma determinada temperatura durante um determinado período de tempo) leva para congelar a uma temperatura de resfriamento especial.

[0071] Qualquer aparelho de resfriamento adequado conhecido na técnica, exceto para um dispositivo de peletização ou moagem, pode ser utilizado para resfriar o poloxâmero líquido aquecido. Por exemplo, o poloxâmero líquido aquecido pode ser colocado em um refrigerador, congelador, ou em uma sala refrigerada mantida a uma temperatura de resfriamento suficiente, como descrito acima. Como alternativa, há aparelhos de resfriamento em particular pode ser usado, mas em vez disso o poloxâmero líquido aquecido pode ser resfriado no dispositivo de aquecimento, após o aparelho ter sido desligado ou programado para parar o aquecimento. Neste caso, o poloxâmero líquido aquecido é deixado resfriar em temperatura ambiente. Por exemplo, se o po- loxâmero é aquecido em uma placa de aquecimento, o poloxâmero líquido aquecido pode ser resfriado simplesmente deixando-o sobre a placa de aquecimento após a função de aquecimento da placa de aquecimento ter sido desligada. Alternativamente, o poloxâmero pode ser resfriado em um forno de vácuo. Em algumas modalidades, o resfriamento do poloxâmero líquido aquecido não inclui o uso de nitrogênio líquido. Em algumas modalidades, o resfriamento do poloxâmero líquido aquecido não inclui pulverizar ou atomizar o poloxâmero líquido aquecido através de um gás mantido a uma temperatura específica. Em algumas modalidades, o resfriamento do poloxâmero líquido aquecido não inclui moldar o poloxâmero em partículas ou micropartículas de um tamanho e/ou forma específicos ou uniforme. Peletização/moagem

[0072] Em algumas modalidades, o resfriamento não é conduzido em um dispositivo de peletização ou moagem. Poloxâmero foi preparado na técnica, por peletização ou moagem para conseguir um tamanho das partículas e/ou a forma de poloxâmero uniforme específico (para um exemplo que descreve a peletização e moagem de poloxâ- mero, consulte patente europeia EP1661558 B1 ou Patente US 7.887.844). A peletização de poloxâmero envolve a passagem de po- loxâmero líquido através de um atomizador para criar partículas de po- loxâmero líquido e resfriamento destas partículas em um meio de resfriamento, por exemplo, um gás mantido a uma temperatura específica ou nitrogênio líquido. A temperatura do meio de resfriamento é pensada para determinar a taxa de congelamento do poloxâmero, o que in-fluencia o tamanho final e forma das partículas de poloxâmero. Um exemplo de um dispositivo de peletização pode incluir, sem limitação, uma torre de peletização. Em uma torre de peletização, um poloxâme- ro atomizado é lançado a partir do topo da torre, e este congela em partículas, enquanto caem através de um meio de resfriamento gasoso ou líquido (por exemplo, ar ambiente, ar mantido a uma temperatura específica, ou nitrogênio líquido).

[0073] A moagem de poloxâmero (ou micro-moagem) envolve a trituração de um poloxâmero sólido, ou forçando um poloxâmero sólido por alta pressão através de um bocal, até que as partículas de po- loxâmero de um determinado tamanho sejam produzidas. Porque moagem pode gerar calor e poloxâmeros têm uma temperatura de fusão relativamente baixa, o poloxâmero é frequentemente resfriado durante o processo de moagem para manter uma fase sólida, por exemplo, por resfriamento com ar refrigerado ou em nitrogênio líquido. O poloxâme- ro pode também ser resfriado antes da moagem e moído durante um período de tempo suficiente para o poloxâmero derreter. Exemplos de dispositivos de moagem podem incluir, sem limitação, moinhos de jato de ar, moinho de bolas e moinhos congeladores (por exemplo, SPEX SamplePrep® Freezer/Mill®).

[0074] Peletização e moagem são úteis para os processos que requerem padrões rigorosos para tamanho e forma de partícula de po- loxâmero, por exemplo, como parte de formulações de fármacos. Po- loxâmero é conhecido na técnica como um componente em formulações de fármacos que auxilia a solubilidade e afeta a libertação do fármaco. Nessas formulações, as partículas de poloxâmero devem manter as características padrões de modo a conferir as propriedades farmacocinéticas desejadas da formulação de fármaco e aderir aos rigorosos padrões de segurança do fármaco e de reprodutibilidade. Note-se que os métodos aqui descritos não necessitam de tais padrões rigorosos ou precisos para poloxâmero, de modo que estes mé-todos de peletização ou moagem não são utilizados.

[0075] Em algumas modalidades, o poloxâmero foi tratado por um processo de peletização antes de ser aquecido, como aqui descrito. Muitos poloxâmeros disponíveis comercialmente para utilização em cultura celular (por exemplo, Pluronic® F68 Prill NF Poloxâmero 188 como é vendido pela BASF®) foram submetidos a um processo de pe- letização ou micro-peletização durante a fabricação. As etapas de aquecimento e resfriamento incluídas nos métodos aqui descritos não envolvem peletização. Em vez disso, eles podem ser aplicados ao po- loxâmero que já tenha sido peletizado ou micro-peletizado. É uma descoberta da presente invenção que o desempenho de poloxâmeros disponíveis comercialmente (por exemplo, poloxâmero peletizado ou micro-peletizado) em cultura celular pode ser melhorado através de aquecimento e resfriamento, como aqui descrito.

[0076] Em alguns aspectos, os métodos de preparação de um po- loxâmero, para utilização em um meio de cultura celular aqui descritos incluem a adição de um poloxâmero tratado termicamente em um meio de cultura celular. Depois de aquecimento e resfriamento, o poloxâme- ro tratado termicamente sólido pode ser dissolvido em um meio de cultura celular através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se o poloxâmero é aquecido e resfriado em um recipiente de vidro aberto, o poloxâmero sólido tratado termicamente resultante pode simplesmente ser raspado ou flocado em uma quantidade apropriada (por peso) para adicionar ao meio de cultura celular. O poloxâ- mero tratado termicamente pode ser adicionado a um meio de cultura celular imediatamente, ou pode ser armazenado e adicionado a um meio de cultura celular em um momento posterior (por exemplo, mais do que cerca de um dia, mais do que cerca de um mês, ou mais do que cerca de um ano após o tratamento térmico).

[0077] Em algumas modalidades, as etapas de aquecimento e resfriamento como descrito acima, são cada uma delas executada antes de se adicionar o poloxâmero tratado termicamente ao meio de cultura celular. Em algumas modalidades, as etapas de aquecimento e resfriamento como descrito acima são repetidas pelo menos uma vez antes da adição do poloxâmero tratado termicamente ao meio de cultura celular. III. Poloxâmeros e Propriedades de Poloxâmero

[0078] Aqui são proporcionados os métodos para a preparação de um poloxâmero. Em algumas modalidades, o poloxâmero, produzido pelos métodos é para uso em um meio de cultura celular.

[0079] O termo "poloxâmero" pode englobar muitos compostos distintos, porque os diferentes comprimentos para as cadeias polioxi- propileno e polioxietileno podem ser utilizados em combinação. A combinação particular de cadeias de polioxipropileno e polioxietileno presentes em um poloxâmero pode dar origem a determinadas propriedades biofísicas e/ou químicas. Em algumas modalidades, o po- loxâmero tem a fórmula química de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH. Em algumas modalidades, n (isto é, o comprimento da cadeia de poli- oxietileno) tem um valor de cerca de 60 a cerca de 150. Em algumas modalidades, m (isto é, o comprimento da cadeia de polioxipropileno) tem um valor de cerca de 25 a cerca de 60.

[0080] Poloxâmeros são frequentemente descritos por um sistema de numeração que designa o seu peso molecular aproximado e percentual de teor de polioxietileno. Estes valores podem se referir a um valor médio de uma composição de poloxâmero, em vez de um valor absoluto de cada molécula de poloxâmero na composição. Sob este sistema, os primeiros dois dígitos são multiplicados por 100 para se obter o peso molecular aproximado do bloco de polioxipropileno, e o terceiro dígito é multiplicado por 10 para se obter a percentagem em peso do bloco de polioxietileno. Por exemplo, poloxâmero 188 (CAS No. 9003-11-6) pode se referir a um poloxâmero com n tendo um valor de cerca de 80 com m tendo um valor de cerca de 27 como descrito na fórmula acima. Poloxâmero 237 pode se referir a um poloxâmero com n tendo um valor de cerca de 64 com m tendo um valor de cerca de 37. Poloxâmero 338 pode se referir a um poloxâmero com n tendo um valor de cerca de 141 e com m tendo um valor de cerca de 44. Po- loxâmero 407 pode se referir a um poloxâmero com n tendo um valor de cerca de 101 e com m tendo um valor de cerca de 56. Em algumas modalidades, o poloxâmero possui um peso molecular médio de cerca de 6.000 a cerca de 18.000 dáltons. Em algumas modalidades, po- loxâmero 188 pode se referir a um poloxâmero com n tendo um valor de cerca de 80, com m tendo um valor de cerca de 27 como na fórmula descrita acima, e com o poloxâmero tendo um peso molecular médio de cerca de 7680 a cerca de 9510 g/mol. Em algumas modalidades, poloxâmero 188 pode se referir a um poloxâmero com n tendo um valor de cerca de 80, com m tendo um valor de cerca de 27 como na fórmula descrita acima, e com o poloxâmero tendo um peso molecular médio de cerca de 7000 a cerca de 10000 g/mol.

[0081] Poloxâmeros vendidos sob nomes comerciais, por exemplo, PLURONIC®, podem ser nomeados sob um sistema diferente. Uma carta pode ser usada para indicar o estado físico (por exemplo, F para o sólido, P para pastoso, ou L para líquido). Um número dois ou três dígitos pode ser utilizada para indicar as propriedades químicas. Os primeiros um ou dois dígitos são multiplicados por 300 para se obter o peso molecular aproximado do bloco de polioxipropileno, e o terceiro dígito é multiplicado por 10 para se obter a percentagem em peso do bloco de polioxietileno. Por exemplo, PLURONIC® F68 pode se referir a um poloxâmero sólido com n tendo um valor de cerca de 80 com m tendo um valor de cerca de 27 como descrito na fórmula acima. PLURONIC® F87 pode se referir a um poloxâmero sólido com n tendo um valor de cerca de 64 com m tendo um valor de cerca de 37. PLURONIC® F108 pode se referir a um poloxâmero sólido com n tendo um valor de cerca de 141 e com m tendo um valor de cerca de 44. PLURONIC® F127 pode se referir a um poloxâmero sólido com n tendo um valor de cerca de 101 e com m tendo um valor de cerca de 56.

[0082] Uma vez que poloxâmeros têm ambas as frações hidrofóbi- ca (polioxipropileno) e hidrofílicas (polioxietileno) de vários comprimentos, diferentes poloxâmeros podem possuir diferentes saldos hidrofí- lico-lipofílico (HLBs). O HLB de um composto é determinado através do cálculo da proporção relativa do composto que é hidrofílico ou lipo- fílico, e o valor de HLB é utilizado para prever as propriedades de ten- soativo de um composto. Por exemplo, um composto com um HLB inferior a 10, está previsto para ser insolúvel em água, e um composto com um HLB superior a 10 é previsto para ser solúvel em água. Em modalidades preferidas, o poloxâmero para utilização em cultura celular tem um HLB de 24 ou superior. O HLB de um poloxâmero pode ser calculado de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, incluindo os descritos em Griffin, W.C. (1954) J. Soc. Cosmet. Chemists 5 (4): 249-56 e Davies, J.T. (1957) Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interfaces: Proc. of 2nd Intl. Congress Surface Activity, Butterworths (Londres): 426-38.

[0083] Em algumas modalidades, as propriedades físicas e/ou químicas de um poloxâmero podem ser medidas. Por exemplo, as propriedades físicas e/ou químicas de um poloxâmero podem ser medidas antes e depois do tratamento térmico, como aqui descrito para identificar as propriedades associadas com um poloxâmero tratado termicamente. Como outro exemplo, as propriedades físicas e/ou químicas de um lote bom de poloxâmero e um lote ruim de poloxâmero, como aqui descrito podem ser medidos para identificar as propriedades associadas com um lote bom de poloxâmero.

[0084] Exemplos de ensaios para medir as propriedades físicas e/ou químicas podem incluir, sem limitação, MALDI-MS, Cromatografia de Permeação em Gel, XRD em pó, dispersão de luz quase elástica, e RMN de estado sólido. MALDI-MS (espectrometria de massa por de- sorção/ionização a laser associada a matriz) é conhecido na técnica como uma técnica para a análise, quantificação, ou identificação de um composto, por exemplo, pela sua massa molecular e carga. Como um exemplo não limitativo, MALDI-MS pode ser utilizada para identificar um composto (por exemplo, uma impureza), preferencialmente, associada com ou presente em um lote de poloxâmero antes do tratamento térmico ou um lote ruim de poloxâmero, em comparação com um poloxâmero tratado termicamente ou um lote bom de poloxâmero. Cromatografia de Permeação em Gel é conhecida na técnica como uma técnica para a separação de compostos pelo tamanho. Como um exemplo não limitativo, cromatografia de permeação em gel pode ser utilizada para isolar um composto (por exemplo, uma impureza), preferencialmente, associado com ou presente em um lote de poloxâmero antes do tratamento térmico ou um lote ruim de poloxâmero, em comparação com um poloxâmero tratado termicamente ou um lote bom de poloxâmero. XRD em pó (difração de raios X em pó) é conhecida na técnica como uma técnica para caracterizar a estrutura de um composto, e pode incluir as etapas de produção de uma amostra em pó de um composto (contendo uma pluralidade de cristais orientados aleatoriamente) e usando difração de raios X para analisar características estruturais dos cristais. Como um exemplo não limitativo, XRD em pó pode ser utilizado para caracterizar uma propriedade estrutural de um poloxâmero tratado termicamente ou um lote bom de poloxâmero, por exemplo, em comparação com um poloxâmero antes do tratamento térmico ou um lote ruim de poloxâmero. A dispersão da luz quase elástica (também conhecida por dispersão de luz dinâmica e espectrosco- pia de correlação de fótons) é conhecida na técnica como uma técnica para a determinação de um perfil de distribuição de tamanhos de par-tículas em uma solução ou suspensão. Como um exemplo não limitativo, a dispersão de luz quase elástica pode ser usada para identificar um composto (por exemplo, uma impureza) pelo seu tamanho de partícula que é preferencialmente associado com ou presente em um lote de poloxâmero antes do tratamento térmico ou um lote ruim de po- loxâmero, em comparação com um poloxâmero tratado termicamente ou um lote bom de poloxâmero.

[0085] RMN de estado sólido (ressonância magnética nuclear, ou SSNMR) é conhecida na técnica como uma técnica para a determinação de uma variedade de características estruturais de um composto. Por exemplo, RMN de estado sólido pode ser utilizado para caracterizar uma conformação molecular, arranjo, deslocamento químico, ou a natureza polimórfica de um composto. Como um exemplo não limitativo, RMN de estado sólido pode ser utilizado para caracterizar uma propriedade estrutural de um poloxâmero tratado termicamente ou um lote bom de poloxâmero, em comparação a um poloxâmero antes do tratamento térmico ou lote ruim de poloxâmero. Em algumas modalidades, uma propriedade estrutural determinada por RMN de estado sólido pode incluir a proporção de poloxâmero cristalino para amorfo em uma amostra de poloxâmero. Como um outro exemplo não limitativo, RMN de estado sólido pode ser usada para fornecer espectros que podem resolver ou perfilar um ou mais polimorfos de poloxâmero. Em algumas modalidades, RMN de estado sólido pode ser utilizada para resolver um ou mais polimorfos de poloxâmero em um lote bom de po- loxâmero ou um poloxâmero tratado termicamente, quando comparado com os polimorfos de poloxâmero presentes em um lote ruim de po- loxâmero ou um poloxâmero antes do tratamento térmico. Em algumas modalidades, um espectro de poloxâmero gerado por RMN de estado sólido pode ser correlacionado com o desempenho de um poloxâmero em um meio de cultura celular, por exemplo, medindo a viabilidade celular de uma cultura celular cultivada em um meio de cultura celular contendo um lote bom de poloxâmero ou um poloxâmero tratado ter- micamente, em comparação com a viabilidade celular de uma cultura celular cultivada em um meio de cultura celular que contém um lote ruim de poloxâmero ou um poloxâmero antes do tratamento térmico. IV. Uso de poloxâmeros em cultura celular e produção de poli- peptídeos

[0086] Poloxâmeros tratados termicamente aqui proporcionadas podem encontrar uso em métodos (por exemplo, de cultura celular e a produção de polipeptídeos, utilizando um meio de cultura contendo um poloxâmero tratado termicamente da presente descrição) e em composições (por exemplo, um meio de cultura celular contendo um po- loxâmero tratado termicamente da presente descrição). Uso de poloxâmero em cultura celular

[0087] Os poloxâmeros podem ser utilizados como aditivos para meios de cultura celular conhecidos na técnica. Sem pretender ficar limitado pela teoria, acredita-se que poloxâmeros têm muitas funções no meio de cultura celular que podem proteger as células contra danos e melhorar a viabilidade celular. Por exemplo, poloxâmero pode atuar como um protetor de cisalhamento para células. Poloxâmero pode reduzir a fixação de célula-bolha e/ou reduzir o choque quando as bolhas estouram, evitando assim danos às células. Poloxâmero podem também alterar a velocidade e frequência da bolha, melhorar a drenagem de células a partir da camada de espuma, e/ou reforçar a membranas celulares. Ver, por exemplo, Meier, S.J., et al. (1999) Bio- technol. Bioeng. 62 (4): 468-78; Chisti, Y. (2000) Trends Biotechnol. 18 (10): 420-32; e Tharmalingam, T., et al. (2008) Mol. Biotechnol. 39 (2): 167-77.

[0088] Poloxâmeros tratado termicamente, como aqui descrito pode ser adicionado a um meio de cultura celular em qualquer concentração normalmente utilizada para poloxâmero. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular inclui o poloxâmero tratado termica- mente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular inclui o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L a cerca de 3 g/L. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular inclui o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 3 g/L a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular inclui o poloxâmero tratado termicamente a cerca de 0,1 g/L, a cerca de 0,2 g/L, a cerca de 0,3 g/L, a cerca de 0,4 g/L, a cerca de 0,5g/L, pelo cerca de 0,6 g/L, a cerca de 0,7 g/L, a cerca de 0,8 g/L, a cerca de 0,9 g/L, a cerca de 1 g/L, a cerca de 2 g/L, a cerca de 3 g/L, a cerca de 4 g/L, a cerca de 5 g/L, em cerca de 6 g/L, a cerca de 7 g/L, a cerca de 8 g/L, a cerca de 9 g/L, ou a cerca de 10 g/L. Em algumas modalidades, um poloxâmero tratado termicamente preparado como aqui descrito pode ser usado em uma concentração inferior em um meio de cultura celular para alcançar um nível desejado de viabilidade celular do que um poloxâmero antes do tratamento térmico. Em algumas modalidades, um poloxâmero tratado termicamente preparado como aqui descrito pode ser utilizado a uma concentração mais consistente ou padronizada em um meio de cultura celular para alcançar um nível desejado de viabilidade celular do que um poloxâmero antes do tratamento térmico.

[0089] Tensoativos, como poloxâmeros têm um limite em solução, denominada a concentração micelar crítica (CMC), além do qual as moléculas tensoativos adicionadas adicionados começam a ser incorporadas em micelas, em vez de se dissolver na solução. Em concentrações mais elevadas do que a CMC, a tensão superficial da solução não diminui na mesma taxa proporcional à concentração de tensoati- vo. Em modalidades preferidas, o poloxâmero tratado termicamente é adicionado a um meio de cultura celular a uma concentração inferior à sua CMC. Por exemplo, a CMC de poloxâmero 188 foi determinada como sendo 100 mg/mL (Kabanov, A.V., et al. (1995) Macromolecules 28 (7): 2303-14). A CMC de um poloxâmero pode ser determinada pela medição da tensão superficial de uma solução enquanto o poloxâ- mero é adicionado. A concentração para a qual o aumento da concentração de poloxâmero não resulta em aumento da tensão superficial é a CMC para aquele poloxâmero. A tensão superficial pode ser medida, por exemplo e sem limitação, através de um tensiômetro (por exemplo, tensiômetro Sigma 700/701 de Attension). Meios de cultura celular

[0090] Certos aspectos da presente invenção referem-se a cultura de uma célula em um meio de cultura celular. Qualquer meio de cultura celular conhecido na técnica, adequado para o tipo desejado de célula e/ou produto de polipeptídeo, pode ser utilizado. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular é um meio quimicamente definido. Em outras modalidades, o meio de cultura celular é um meio quimicamente definido. Em algumas modalidades, um poloxâmero tratado termicamente, como aqui descrito é adicionado a um meio de cultura celular basal. Em algumas modalidades, um poloxâmero tratado termi- camente, como aqui descrito é adicionado a um meio de cultura celular de alimentação ou em batelada alimentada.

[0091] Meios comercialmente disponíveis podem ser utilizados, incluindo como, mas não limitado a, F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), meio de Dulbecco modificado por Eagle ([DMEM], Sigma), caldo de Luria (LB), e o caldo Terrific (TB), e qualquer um destes meios pode ser suplementado com qualquer um dos componentes do meio, como aqui descrito (por exemplo, um poloxâmero tratado termicamente). Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham e Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes e Sato, Anal. Biochem. 102: 255. (1980), Vijayasankaran et al, Biomacromolecules., 6: 605:. 611 (2005), Patkar et al, J Biotechnology, 93: 217-229 (2002), Patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; ou 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; Patente US Re. 30.985; ou Patente US 5.122.469, as descrições completas de todos os quais são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades, podem ser su-plementadas com qualquer um dos componentes do meio, como aqui descrito (por exemplo, um poloxâmero tratado termicamente).

[0092] Quaisquer meios aqui proporcionados também podem ser suplementados conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), íons (por exemplo, sódio, cloreto, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleosídeos (como adenosina e timidina), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), tensoativos, como poloxâmero, e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Em alguns aspectos, um meio de cultura celular aqui fornecido contém proteínas derivadas de uma planta ou um animal. Em algumas modalidades, uma cultura celular aqui proporcionada é livre de proteínas derivadas de uma planta ou um animal. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que serão conhecidas dos especialistas na técnica. Viabilidade celular

[0093] Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular, incluindo o poloxâmero tratado termicamente é aumentada em comparação com a viabilidade celular em um meio de cultura celular, incluindo poloxâmero não tratado (ou poloxâmero antes do tratamento térmico). É uma descoberta da presente invenção que a preparação de um poloxâmero, como aqui descrito resulta no aumento da viabilidade celular quando o poloxâmero tratado termicamente é usado em um meio de cultura celular, em comparação com quando poloxâmero não tratado é usado no mesmo meio de cultura celular. Os métodos para testes de viabilidade celular são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é medida como des-crito em detalhe nos Exemplos aqui proporcionados. Em algumas mo- dalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular pode ser medida após cerca de 1 hora, após cerca de 2 horas, ou após cerca de 3 horas (por exemplo, como descrito abaixo).

[0094] Como aqui utilizado, a viabilidade celular é quantificada como a percentagem de células vivas em uma solução (isto é, o número de células vivas dividido pelo número total de células). Qualquer método adequado conhecido na técnica pode ser usado para medir a viabilidade celular. Como células são vivas ou mortas, a viabilidade celular pode ser determinada por quantificação, seja de células mortas ou células vivas. Um método adequado é a exclusão de azul de tripano. Neste método, uma amostra de células é obtida a partir de uma cultura celular. Uma solução de azul de tripano é adicionada à amostra. Apenas as células não viáveis absorvem azul de tripano, e estes são posteriormente coradas de azul. Portanto, o número de células azuis é contado, subtraído do número total de células, para se obter o número de células vivas, e este número é dividido pelo número total de células, para se obter a viabilidade celular. As células podem ser contadas manualmente, como com um hemacitômetro, ou automaticamente, como com, por exemplo, um analisador de viabilidade Vi-Cell® (Beckman Coulter). Outros ensaios para determinar a viabilidade celular podem incluir, sem limitação, coloração com iodeto de propídio, TUNEL, resazurina, violeta de metil, lactato desidrogenase, hidrólise de diacetato de fluoresceína, MTT, caspase, e ensaios de ATP.

[0095] O efeito de um poloxâmero tratado termicamente pode ser determinado, por exemplo, através da medição da viabilidade celular em uma cultura celular cultivada em um meio de cultura celular contendo o poloxâmero tratado termicamente e comparando este com a viabilidade celular em uma cultura celular cultivada em um meio de cultura celular contendo a mesma concentração de poloxâmero não tratado. Em algumas modalidades, uma cultura celular pode ser culti- vada em um frasco de agitação defletor. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado termicamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 10%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado termicamente, em comparação com um po- loxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 15%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâ- mero tratado termicamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 20%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado ter- micamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 25%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado termicamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 30%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado termicamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 35%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado termicamente, em comparação com um po- loxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos cerca de 40%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâ- mero tratado termicamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 45%. Em algumas modalidades, a utilização de um poloxâmero tratado ter- micamente, em comparação com um poloxâmero não tratado, aumenta a viabilidade celular em, pelo menos, cerca de 50%.

[0096] Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular que compreende um poloxâmero tratado termica- mente da presente invenção é aumentada em, pelo menos 10%, em comparação com a viabilidade celular em um meio de cultura celular compreendendo o poloxâmero antes do tratamento térmico. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é aumentada em pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7 %, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 21%, pelo me-nos cerca de 22%, pelo menos cerca de 23%, pelo menos cerca de 24%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 26%, pelo menos cerca de 27%, pelo menos cerca de 28%, pelo menos cerca de 29%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 31%, pelo menos cerca de 32 %, pelo menos cerca de 33%, pelo menos cerca de 34%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 36%, pelo menos cerca de 37%, pelo menos cerca de 38%, pelo menos cerca de 39%, ou pelo menos cerca de 40% .

[0097] Poloxâmero tratado termicamente pode ser especialmente útil para melhorar o desempenho de um poloxâmero (por exemplo, um lote particular de um poloxâmero desejado) que não produz a viabilidade celular satisfatória, quando adicionado a um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular com poloxâmero não tratado é menos do que cerca de 80%. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular com poloxâmero não tratado é menos do que cerca de 70%. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular com poloxâmero não tratado é menos do que cerca de 60%. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular com poloxâmero não tratado é menos do que cerca de 50%. Em algumas modalidades, a viabilidade celular em um meio de cultura celular com poloxâmero não tratado é menos do que cerca de 40%. Crescimento celular e Produção de Polipeptídeo

[0098] Em algumas modalidades, uma célula da presente divulgação (por exemplo, uma célula em cultura em um meio de cultura celular aqui descrito) pode conter um polinucleotídeo de interesse (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou um polinucleotídeo de interesse per se). Em algumas modalidades, uma célula da presente divulgação pode ser transfectada, transformada, ou de outra forma geneticamente modificada para incluir um polinucleotídeo de interesse. Os métodos adequados para transfectar ou transformar uma variedade de células são bem conhecidos na técnica. Exemplos de referências são fornecidos a seguir no que diz respeito à produção de polipeptídeo; um especialista na técnica irá apreciar que os métodos aí descritos não estão limitados à produção de polipeptídeo.

[0099] Geralmente, as células são combinadas (contatadas) com qualquer um dos meios de cultura celular aqui descrito com uma ou mais condições que promovam qualquer de crescimento celular, a manutenção e/ou produção de polinucleotídeo e/ou polipeptídeo. Os métodos de cultura de uma célula e a produção de um polipeptídeo empregam um recipiente de cultura (biorreator) para conter o meio celular e cultura celular. O recipiente de cultura pode ser composto por qualquer material que é adequado para a cultura celular, incluindo vidro, plástico ou metal. Tipicamente, o recipiente de cultura será de pelo menos 1 litro e pode ser de 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 25.000 litros ou mais. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas usadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para o especialista na técnica. As condições de cultura que podem ser ajustadas durante o processo de cultivo incluem, mas não estão limitadas ao pH e temperatura.

[00100] Uma cultura celular pode ser mantida sob condições propícias para a sobrevivência, o crescimento, a viabilidade (manutenção), e capacidades de produção de polipeptídeo da cultura celular. As condições exatas irão variar, dependendo do tipo celular, do organismo do qual a célula foi derivada, bem como a natureza e o caráter do polipep- tídeo expresso. Durante a fase de produção de polipeptídeo, a cultura celular pode, opcionalmente, ser mantida sob um segundo conjunto de condições de cultura (em comparação com a fase de crescimento inicial) favorável à sobrevivência e viabilidade da cultura celular e apropriada para a expressão do polipeptídeo desejado.

[00101] Em certos casos, pode ser vantajoso ou necessário suplementar a cultura celular com nutrientes ou outros componentes do meio que tenham sido esgotados ou metabolizados pelas células. Por exemplo, pode ser vantajoso suplementar a cultura celular com nutrientes ou outros componentes do meio observados que tenham sido esgotados durante o monitoramento da cultura celular. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura celular antes da fase de produção. Como exemplos não limitativos, pode ser vantajoso ou necessário para suplementar a cultura celular com hormônios e/ou outros fatores de crescimento, íons parti-culares (como sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, elementos vestigiais (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, ou glicose ou outra fonte de energia.

[00102] Os meios de cultura celular aqui descritos podem ser utilizados em um método de cultura celular para produzir polipeptídeos, incluindo anticorpos. O meio pode ser utilizado em um método para a cultura celular, por cultura em lote, cultura de batelada alimentada ou cultura de perfusão, e pode ser utilizado em um método de produzir qualquer polipeptídeo incluindo quaisquer aspectos ou modalidades do polipeptídeo, como aqui descrito. Os polipeptídeos produzidos pelos métodos detalhados aqui (por exemplo, cultura celular e a produção de polipeptídeos, utilizando um meio de cultura contendo um poloxâmero tratado termicamente da presente divulgação) podem ser homólogos à célula hospedeira, ou de preferência, podem ser exógenos, o que significa que são heterólogos, ou seja, estranhos, para a célula hospedeira sendo utilizada, como uma proteína humana produzida por uma célula de CHO, ou um polipeptídeo de levedura produzido por uma célula de mamífero. Em uma variante, o polipeptídeo é um polipeptídeo de mamífero (como um anticorpo) diretamente secretado para o meio da célula hospedeira. Em outra variação, o polipeptídeo é liberado para o meio por lise de uma célula que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[00103] Qualquer polipeptídeo que pode ser expresso em uma célula hospedeira pode ser produzido de acordo com a presente divulgação e pode estar presente nas composições fornecidas. O polipeptídeo pode ser expresso a partir de um gene que é endógeno relativamente à célula hospedeira, ou a partir de um gene que é introduzido na célula hospedeira por meio de engenharia genética. O polipeptídeo pode ser um que ocorre na natureza, ou pode, alternativamente, ter uma sequência que foi manipulada ou selecionada pela mão do homem. Um polipeptídeo modificado pode ser montado a partir de outros segmentos de polipeptídeos que ocorrem individualmente na natureza, ou pode incluir um ou mais segmentos que não são de ocorrência natural.

[00104] Os polipeptídeos que podem desejavelmente ser expressos de acordo com a presente invenção, frequentemente, são selecionados com base em uma atividade biológica ou química interessante. Por exemplo, a presente invenção pode ser empregue para expressar qualquer enzima farmaceuticamente ou comercialmente relevante, receptor, anticorpo, hormônio, fator regulador, antígeno, agente de ligação, etc.

[00105] Os métodos para a produção de polipeptídeos, como anticorpos, em cultura celular são bem conhecidos na técnica. São aqui fornecidos exemplos não limitativos de métodos para a produção de um anticorpo (por exemplo, anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpos e anticorpos multiespecíficos) em cultura celular. Os métodos aqui descritos podem ser adaptados por um especialista na técnica para a produção de outras proteínas, como os inibidores à base de proteínas. Ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sam- brook et al., 4a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Au- subel, et al. eds., 2003); Short Protocolos in Molecular Biology (Ausu- bel et al., Eds., J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow e Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6a Ed., J. Wiley and Sons, 2010) para técnicas e procedimentos geralmente bem entendidos e comumente empregadas para a produção de proteínas (por exemplo, proteínas terapêuticas), que são todas aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00106] As condições adequadas para a produção de polipeptídeos são conhecidas na técnica para uma variedade de tipos de célula hospedeira e polipeptídeos. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas usadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para o especialista na técnica.

[00107] Uma cultura celular pode ser agitada ou misturada durante a cultura celular, a fim de aumentar a oxigenação e a dispersão de nutrientes para as células. O uso de poloxâmero pode ser particularmente vantajoso em culturas de células que são agitadas por causa das forças de cisalhamento que, potencialmente, danificam as células. De acordo com a presente invenção, um especialista na técnica compreenderá que pode ser benéfico controlar ou regular certas condições internas do biorreator durante a fase inicial do crescimento incluindo, mas não limitado a pH, temperatura, oxigenação, etc. Por exemplo, o pH pode ser controlado fornecendo uma quantidade apropriada de ácido ou de base e a oxigenação pode ser controlada com dispositivos de aspersão que são bem conhecidos na técnica. Células

[00108] As células adequadas para cultura em um meio de cultura e a produção de um polipeptídeo podem incluir células procariotas, de leveduras ou eucariota superior (por exemplo, de mamífero). Em algumas modalidades, é utilizada uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, é usada uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).

[00109] As células de mamífero podem ser cultivadas, e a propagação de células de mamíferos em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos podem incluir, sem limitação, linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebês (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de camundongos (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. Sci, 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem linhagens de células de mieloma, como NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de anticorpos, ver, por exemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K C. Lo, ed., (Humana Press, Totowa, N.J.).). 2003), pp. 255-268.

[00110] Em algumas modalidades, as células CHO podem ser cultivadas. As células CHO são bem conhecidas e rotineiramente utilizadas na técnica para a produção de polipeptídeos em culturas de células, por exemplo, anticorpos. As células CHO podem incluir, mas não estão limitadas a, células CHO DHFR- (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)), por exemplo, ATCC CRL-9096.

[00111] Células procariotas adequadas para este fim incluem eubactérias, como organismos Gram negativos ou Gram positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteu, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescanse Shigella, assim como Bacilli como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgado em DD 266,710 publicado em 12 abril 1989), Pseudomonas como P. aeruginosae Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31446), embora outras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes.

[00112] Em adição aos procariotas, micróbios eucarióticos como fungos filamentosos ou leveduras, são adequados para clonagem ou hospedeiros de expressão para vetores que codificam anticorpos. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais comumente utilizado entre os micro-organismos hospedeiros eucario- tas inferiores. No entanto, um número de outros gêneros, espécies e cepas estão comumente disponíveis e são úteis aqui, como Schizo- saccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotoleranse K. marxianus; Yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanni- omyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neu- rospora, Penicillium, Tolypocladiume e hospedeiros Aspergillus como A. nidulans e A. niger. Para uma revisão discutindo a utilização de leveduras e fungos filamentosos para a produção de proteínas terapêuticas, ver, por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004).

[00113] Certos fungos e cepas de levedura podem ser selecionados em que as vias de glicosilação foram "humanizadas", resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Ver, por exemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24: 210215 (2006) (descrevendo a humanização da via de glicosilação em Pi- chia pastoris); e Gerngross et al., supra.

[00114] As células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelu- lares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas e variantes de baculovírus e células de inseto a partir de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes ae- gypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogas- ter (Mosca da fruta), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser utilizados como os vírus aqui de acordo com a invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Exemplos de células de inseto podem incluir, sem limitação, células de Drosophila (por exemplo, células S2), células de Trichoplusia ni (por exemplo, células High Five™), e células de Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf21 ou Sf9).

[00115] Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, lentilha de água (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula), e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras. ver, por exemplo, Patentes US 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, e 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para a produção de anticorpos em plantas transgênicas). Produção de Anticorpos.

[00116] Em algumas modalidades, a célula cultivada em um meio de cultura celular contendo um poloxâmero tratado termicamente é usada para produzir um anticorpo.

[00117] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo monoclonal. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como a exigência da produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais sendo utilizados de acordo com a invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal an- tobodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567), tecnologias de apresentação de fagos (ver, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou de tipo humano em animais que possuem parte ou a totalidade dos loci de imunoglobulinas humanas ou genes que codificam para sequências de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes US 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Em algumas modalidades, o anticorpo produzido pelos métodos aqui descritos é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo derivado de biblioteca, ou um anticorpo multiespecífico.

[00118] Os anticorpos podem ser produzidos utilizando métodos recombinantes, por exemplo, na produção de um anticorpo, utilizando células CHO. Para a produção recombinante de um anticorpo anti- antígeno, ácido nucleico que codifica o anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ser ligarem especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Estão disponíveis muitos vetores. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição.

[00119] Um anticorpo da invenção pode ser produzido de forma re- combinante não só diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferencialmente uma sequência sinal ou outro polipeptídeo possuindo um local de clivagem específico no N terminal da proteína madura ou polipeptídeo. A sequência de sinal heteróloga preferencialmente selecionada é uma que é reconhecida e processada (por exemplo, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras proca- rióticas que não reconhecem e processam a sequência de sinal do anticorpo nativo, a sequência de sinal é substituída por uma sequência sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, lpp, ou enterotoxina estável ao calor líderes II. Para secreção em levedura a sequência de sinal nativa pode ser substituída por, por exemplo, líder invertase de levedura, um líder fator (incluindo líderes de fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou a líder de fosfatase ácida, a líder de glucoamilase de C. albicans, ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células de mamíferos, as sequências de sinal de mamíferos bem como líderes de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.

[00120] O anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado para o meio. Se o anti- corpo é produzido intracelularmente, como primeira etapa, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al. Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são secretados para o espaço peri- plasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenilme- tilsulfonil (PMSF) durante cerca de 30 min. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é secretado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease como PMSF pode ser incluído em qualquer das etapas anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.

[00121] Os anticorpos podem ser purificados utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de interação hidro- fóbica, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo entre uma das etapas de purificação normalmente preferida A adequabilidade da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas Y1 , Y2, ou Y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para Y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes me-canicamente estáveis como vidro de poro controlado ou po- li(estirenodivinil)benzeno permitem vazões mais rápidos e tempos de processamento mais curtos do que pode ser conseguido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de Fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSETM cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amônio estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[00122] Em algumas modalidades, o anticorpo aqui descrito é um fragmento de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. O fragmento "Fab" contém os domínios variáveis de cadeia pesada e leve e contém também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos no terminal carboxi do domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Fab'- SH é a de-signação aqui para Fab' na qual os resíduos de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo de tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm regiões de dobradiça entre estes. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são conhecidos também. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação ao an- tígeno completo. "Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo scFv adicionalmente compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL os quais permitem o scFv formar a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, veja, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (SpringerVerlag, New York), pp. 269-315. Muitos dos métodos para a purificação de um anticorpo descritos acima podem ser convenientemente adaptados para a purificação de um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno.

[00123] Em geral, as diversas metodologias para a preparação de anticorpos para utilização na pesquisa, teste e clínicas estão bem estabelecidos na técnica, de acordo com as metodologias acima descritas e/ou que sejam consideradas adequadas por um especialista na técnica para um anticorpo particular de interesse. EXEMPLOS

[00124] A invenção será mais completamente compreendida pela referência aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações na à luz dos mesmos serão sugeridas para especialistas na técnica e devem ser incluídas dentro do sentido e o alcance deste pedido e escopo das reivindicações acrescentadas. Exemplo 1: O tratamento térmico melhora o desempenho de po- loxâmero para cultura celular

[00125] Poloxâmero é comumente utilizado na cultura celular como um tensoativo que protege as células de danos relacionados com aspersão e/ou bolhas. Infelizmente, a variabilidade de lote para lote mina a sua eficácia e resulta em reduções no rendimento do produto re- combinante. Por exemplo, um lote ruim de poloxâmero reduz a viabilidade celular e pode provocar uma diminuição no título de produto de até 45%. Após uma extensiva série de investigações, descobriu-se que os lotes ruins de poloxâmero eram a fonte de reduções significativas no rendimento do produto e perdas financeiras subsequentes na produção de proteína industrial. Assim, os métodos para melhorar o desempenho de poloxâmero seriam altamente benéficos.

[00126] Surpreendentemente, verificou-se que um único tratamento térmico é capaz de aumentar o desempenho de poloxâmero na cultura celular. Importante, este tratamento pelo calor não só melhora o desempenho de lotes ruins de poloxâmero, mas também é capaz de aumentar ainda mais o desempenho de lotes bons também. São descritos aqui métodos para o tratamento de poloxâmero para melhorar o seu desempenho como um suplemento de cultura celular. Métodos Tratamento do poloxâmero

[00127] 15 g de poloxâmero 188 (PLURONIC® F 68 NF Prill Po- loxâmero 188, BASF) foram aquecidos em uma placa de agitação padrão durante 10-12 minutos. O aquecimento foi parado quando o po- loxâmero atingiu uma temperatura de 86-91°C. Poloxâmero foi então resfriado em temperatura ambiente, 2-8°C, ou -72°C durante aproximadamente 20 minutos. O poloxâmero sólido foi, em seguida, flocado e adicionado ao meio de cultura celular para teste. Modelo de testes de cultura celular

[00128] Poloxâmero 188, com tratamento térmico, como descrito acima, foi adicionada ao meio celular CHO padrão isento de soro a uma concentração final de 1 g/L. As células CHO foram cultivadas a 37°C em 25-75 ml de meio de cultura celular em frascos de agitação defletidos de 250 ml a uma concentração de 1,5x106 células/ml em 5% de CO2. Durante a cultura celular, frascos foram rodados em um agita- dor orbital, entre 250 e 350 rpm. A utilização de frascos de agitação defletidos criada uma grande quantidade de bolhas aprisionadas nas culturas. A viabilidade celular foi medida pela exclusão do azul de tripano utilizando um analisador de viabilidade Vi-Cell® (Beckman Coulter). 300 μL da cultura celular foram amostrados, e a percentagem de viabilidade celular foi calculada dividindo o número de células viáveis (isto é, aquelas que não absorveram azul de tripano) pelo número total de células na amostra. Resultados

[00129] Um modelo de triagem simples foi desenvolvido para simular o efeito de poloxâmero na viabilidade celular em cultura em uma escala de laboratório, em vez de industrial. Resumidamente, as células CHO foram cultivadas em frascos de 250 ml, como descrito acima. De modo a maximizar a diferença na viabilidade celular produzida por lotes bons e ruins de poloxâmero, o volume de meio de cultura celular e a velocidade de agitação foram testados. As células foram cultivadas em 25, 50, ou 75 mL de meio e agitadas sobre uma plataforma de agitador orbital a 250, 300, ou 350 rpm. Verificou-se que o volume do meio não teve nenhum efeito sobre Δviabilidade (isto é, a diferença na viabilidade celular, em percentagem, entre um lote bom conhecido e um lote ruim conhecido de poloxâmero), mas velocidades mais elevadas de agitação mostraram um aumento na Δviabilidade.

[00130] Como mostrado na FIGURA 1, verificou-se que o poloxâ- mero tratado termicamente (ver Métodos) melhora significativamente o desempenho de poloxâmero na cultura celular. Uma variedade de lotes de poloxâmero foi testada quanto ao seu efeito sobre a viabilidade celular utilizando o modelo de triagem acima. Alguns lotes eram conhecidos para um bom desempenho, e outros eram suspeitos de ser de baixo desempenho. Para cada lote, (HT) lotes não tratados e tratados termicamente foram adicionados ao meio de cultura celular para teste. Em comparação com poloxâmero não tratado, poloxâmero tratado termicamente demonstrou melhorar a viabilidade de células em todos os lotes testados (FIGURA 1). Em alguns casos, poloxâmero tratado termicamente foi capaz de dobrar a viabilidade, a partir de 45% a cerca de 90%. Importante, poloxâmero tratado termicamente foi capaz de melhorar a viabilidade para os lotes que já demonstraram alto desempenho (ver, por exemplo, "Bom 4" em FIGURA 1).

[00131] Estes resultados demonstram que o tratamento térmico de poloxâmero é capaz de melhorar o seu efeito sobre a viabilidade celular em cultura. O tratamento térmico é capaz de melhorar de forma drástica o desempenho de lotes ruins de poloxâmero e melhorar ainda mais o desempenho de lotes bons, sugerindo que a implementação do tratamento térmico ao poloxâmero pode reduzir significativamente o problema da variabilidade do lote de poloxâmero. Exemplo 2: Tratamento térmico de poloxâmero medido com um termômetro RTD

[00132] Os experimentos descritos no Exemplo 1 foram conduzidos sobre uma placa quente. Estes experimentos envolveram o aquecimento de poloxâmero a aproximadamente 80-100°C (medido por RTD) ao longo de 10 minutos. Estes experimentos foram repetidos com a adição de uma amostra aquecida a 100°C acima (isto é, 124°C). Métodos Fabricantes e Lotes de Poloxâmero 188

[00133] Foi utilizado material de Poloxâmero 188. Identificadores e desempenho de cultura celular associado (determinado pelo desempenho no teste de frasco agitado em alto cisalhamento, HSSF) estão listados na Tabela 1. Tabela 1. Identificadores (usados para se referir ao lote ao longo dos exemplos subsequentes) e desempenho de cultura celular associado a partir de dados HSSF.

Métodos de Tratamento Térmico

[00134] Para avaliar o processo de tratamento térmico do poloxâ- mero, foram avaliados vários métodos de tratamento térmico: aquecimento em uma placa quente, em um forno, ou em uma autoclave. Placa Quente.

[00135] Cinco a quinze gramas de poloxâmero foram colocados em um béquer de vidro (100-400mL) e aquecidos em uma placa quente com agitação contínua. Temperatura do poloxâmero foi medida utilizando um termopar (termopar Kaye 731) ou um detector de temperatura de resistência (RTD) (Fluke 5627A-12 Precision RTD Probe). Po- loxâmero foi aquecido até atingir a temperatura alvo (aproximadamente cinco a dez minutos) e em seguida foi imediatamente removido do calor. O poloxâmero fundido foi deixado a resfriar em temperatura ambiente. Forno

[00136] Cinco gramas de poloxâmero foram pesados em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Um termopar foi fixado no frasco de modo a que a ponta fosse imersa no poloxâmero seco. O poloxâmero e o termopar foram então colocados em um forno (Forno de secagem à Vácuo Yamato ADP 21) já na temperatura alvo. A menos que especificado de outro modo, os fornos foram operados sem a função de vácuo (em pressão atmosférica). O poloxâmero foi deixado atingir a temperatura alvo (+/- 3°C, conforme medida pelo termopar), e o tempo em que o poloxâmero atingiu esta temperatura alvo foi marcado como tempo = 0. Após o tempo de incubação desejado, um ligeiro vácuo foi aplicado por 10-30 segundos para desviar quaisquer voláteis liberados no forno. Após ventilação, o frasco de vidro foi removido do forno e deixado resfriar até a temperatura ambiente (não tampado). Meio e Cultura celular CHO

[00137] Meio celular CHO padrão isento de soro foi utilizado para todos os experimentos, com uma notável exceção: Pluronic F68 foi omitido do meio. Para apoiar este estudo, duas linhagens de células CHO descongeladas foram mantidas em um biorreator trem semente (STB). Método de frasco em agitação de cultura celular em alto cisalhamento Adição de amostras de poloxâmero para meios de cultura celular

[00138] Os meios foram preparados por alíquotas de 250 ml de meio CHO padrão isento de soro (sem poloxâmero) por amostra em recipientes de PETG e adicionando 0,25 gramas de amostra de po- loxâmero para cada alíquota. O meio foi agitado durante pelo menos 5 minutos a 150 rpm de modo a dissolver completamente o poloxâmero nos meios. O meio foi em seguida filtrado a vácuo em uma cabine de segurança biológica (BSC) usando unidades de filtro PES de 0,22 μm. O meio foi armazenado a 37°C para utilização no prazo de 24 horas. Troca de meio e ensaio de cultura celular

[00139] As amostras de cultura celular foram transferidas para tubos Falcon de 50 ml de tal modo que cada alíquota continha aproximadamente 7,5 x 10E7 células. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 830 x g de modo a formar um pellet. O sobrenadante foi removido e as células foram novamente suspensas em meio contendo amostras de poloxâmero para testar, e, em seguida, transferido em frascos de agitação defletidos de 250 ml ventilados. A densidade inicial de células totais (TCD) e viabilidade foram medidas usando um NOVA Flex após agitação de frascos a 150 rpm durante alguns minu- tos para distribuir uniformemente as células. Os frascos de agitação foram então colocados em uma incubadora a 5% de CO2, 80% de umidade e 37°C e agitados a 300 rpm durante 3 horas. As medições de TCD e de viabilidade foram realizadas após 1 hora, 2 horas e 3 horas de incubação e em comparação com TCD e viabilidade originais. Resultados

[00140] As amostras de um lote bom de poloxâmero (A) e dois lotes ruins (B e C) foram tratadas termicamente a cerca de 100°C. Uma amostra adicional de C foi tratada termicamente a 124°C. Após o tratamento térmico, as amostras foram testadas no teste de HSSF.

[00141] Todas as amostras de poloxâmero tratadas a 100°C (como medido por RTD) não mostraram qualquer melhoria sobre o material não tratado do mesmo lote (FIGURA 2). No entanto, C tratado termi- camente a 124°C demonstrou um aumento de 19% na viabilidade final, em comparação com C não tratado. Além disso, a alteração global na viabilidade (isto é, % final de viabilidade, Vf, menos % de viabilidade inicial, V0) para o C tratado termicamente foi -27,4%, um aumento de 21% em comparação com C não tratado (Tabela 2).

[00142] Tabela 2. Amostras de poloxâmero tratado termicamente, condições, melhoria na viabilidade sobre lote tratado, e viabilidade final no teste HSSF.

Modelo de frasco agitado em alto cisalhamento corre com N = 1

[00143] Estes resultados confirmaram que o tratamento térmico melhorou o desempenho de poloxâmero em cultura celular e gerou uma indicação preliminar da temperatura eficaz e duração do tratamento. No entanto, estes resultados sugerem que temperaturas superiores a 100°C, podem ser mais eficazes em poloxâmero tratado termicamente para a cultura celular. Pensa-se que as diferenças na medição da temperatura (por exemplo, o tipo de termômetro usado para medir a temperatura de poloxâmero) pode resultar em diferentes faixas eficazes para poloxâmero tratado termicamente (ver Exemplo 8 para outros dados e discussão). Exemplo 3: Transferência de Tratamento Térmico para Fornos

[00144] Um forno de secagem de bancada foi utilizado como um mecanismo de aquecimento alternativo, o que proporcionou um controle de temperatura e reprodutibilidade. Além disso, a função de vácuo permitiu que a fumaça liberada pela fusão de poloxâmero fosse desviada para fora do forno antes da abertura deste e removendo o poloxâmero tratado termicamente. Experimentos em forno foram realizados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2.

[00145] Os experimentos iniciais no forno usaram um desenho de superfície de resposta, a fim de testar uma grande variedade de condições, com o número mínimo de amostras necessárias (FIGURA 3). A temperatura variou de 92 a 148°C, com tempos de incubação de 10120 minutos. Amostras de um lote ruim (C) foram tratadas termicamen- te em condições especificadas em um forno. As amostras resultantes foram então testadas no modelo HSSF para determinar a melhoria no desempenho de cultura celular.

[00146] O poloxâmero de desempenho fraco aquecido em um forno a 140°C durante 60 minutos e 150°C durante 35 minutos mostrou aumentos substanciais na viabilidade final, equivalente às do controle positivo no teste de HSSF (FIGURA 4 e Tabela 3). Tabela 3. Viabilidade de poloxâmero aquecido em um forno.

Modelo HSSF executado em duplicatas

[00147] No entanto, nestes experimentos, poloxâmero tratado ter- micamente em condições abaixo de 140°C e/ou por menos de 60 minutos, não mostraram melhoria no desempenho. Estes dados indicaram que a temperatura mínima do tratamento térmico para melhorar o desempenho de poloxâmero foi aproximadamente 140°C nas durações de tempo testadas. Testes mais extensivos de temperatura e duração do aquecimento são descritos abaixo, por exemplo, no Exemplo 5. Exemplo 4: Tratamento Térmico em Forno DOE

[00148] O mapa de superfície de resposta primário para as condições de tratamento térmico em forno indicou a temperatura mínima para o tratamento de calor eficaz nas condições testadas foi de aproximadamente 140°C. A concepção completa dos experimentos (DOE) foi realizada em fornos de acordo com os métodos do Exemplo 2 para determinar a faixa de trabalho, indo para temperaturas muito elevadas e longos períodos de incubação. A temperatura máxima testada foi de 185°C e o tempo máximo de incubação testado para cada temperatura foi de 120 minutos. Um lote ruim de poloxâmero (G) foi tratado e testado em blocos de seis amostras que foram segmentados usando um desenho Latin Square. No total, três blocos de amostras e um adicional de seis amostras de condições de interesse foram tratados (Tabela 4). Estas amostras foram então testadas no teste de HSSF para determinar o desempenho de cultura celular.

[00149] Tabela 4. Condições de tratamento térmico avaliadas em DOE completo em fornos. As temperaturas variaram de 110 a 185°C; a duração variou de 1 a 120 min. Caixas marcadas com uma letra (correspondendo aos blocos na Tabela 5) indicam condições de tratamento que foram testadas, como listado na Tabela 5.

[00150] Dados DOE não processados são apresentados na Tabela 5. Os resultados completos do DOE, quando mapeados em um gráfico de contorno, ilustraram a grande variedade de trabalho de condições de tratamento térmico que melhoram o desempenho do poloxâmero (FIGURA 5). Tabela 5: Dados brutos do experimento DOE completo.

[00151] As amostras tratadas termicamente a ou acima de 155°C durante todo o tempo de incubação resultou em melhorias drásticas no desempenho de cultura celular. No teste HSSF, estas amostras tiveram alterações na viabilidade inferior a 10% após 3 horas. A 140°C, o tratamento térmico não foi eficaz até que o tempo de incubação fosse igual ou superior a 30 minutos. Além disso, as temperaturas mais baixas testadas, 125°C e 110°C, não foram eficazes até que as amostras fossem incubadas durante 2 horas. Exemplo 5: Robustez e reprodutibilidade de tratamento térmico

[00152] A fim de demonstrar a reprodutibilidade e a robustez do espaço de concepção do tratamento térmico ilustrado na FIGURA 5, condições essenciais de tratamento do DOE completo foram replicadas utilizando lotes adicionais de poloxâmero de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2. Duas dessas condições foram duplicados a fim de direcionar a reprodutibilidade. As condições selecionadas caíram dentro ou na borda da faixa de trabalho. No total, três lotes ruins foram tratados (incluindo G, que foi previamente utilizado para a DOE) (Tabela 6). Para garantir que o tratamento térmico não fosse prejudicial se fosse realizado em um lote bom, um lote bom também foi tratado (E).

[00153] Tabela 6: Número de repetições para condições essenciais de tratamento térmico testadas em quatro lotes de poloxâmero.

[00154] Os resultados do teste HSSF para as condições de tratamento repetidos foram altamente comparáveis com os resultados de DOE original (Tabelas 7 e 8); no entanto, houve uma variabilidade observada em condições ideais de tratamento térmico ao longo dos lotes ruins (FIGURA 6).

[00155] Tabela 7. Viabilidade celular final para condições de tratamento térmico testadas no teste HSSF em quatro lotes de poloxâmero: E (lote bom), F (lote ruim), H (lote ruim) e G (lote ruim) muito utilizados em experimentos DOE completos.

[00156] Tabela 8. Alteração da viabilidade celular (Vf (Tratado) - Vf (Não tratada)) em teste HSSF para condições de tratamento térmico testadas em quatro diferentes lotes de poloxâmero: E (lote bom), F (lote ruim), H (Lote ruim) e G (lote ruim) utilizados em experimentos DOE completos.

[00157] Modelo de frasco em agitação de alto cisalhamento executado com N = 1

[00158] Lotes G e F, quando tratados a 155°C durante 1 minuto ou a 140°C durante 1 minuto, demonstraram um aumento significativo no desempenho de cultura celular. No entanto, lote H não mostrou melhora com o tratamento a 140°C durante 1 minuto, e apenas uma melhoria marginal (<10%) com o tratamento a 155°C durante 1 min. Todas as outras condições de tratamento para este lote mostraram melhoria significativas na cultura celular. Estes resultados demonstram que os lotes têm pequenas diferenças de tempo na temperatura mínima e tempo de incubação do tratamento térmico. Exemplo 6: Avaliação de temperaturas mais baixas e de Longa Duração

[00159] As condições de tratamento térmico descritas nos Exemplos 2-5 foram bem acima do ponto de fusão de poloxâmero. Para determinar se temperaturas apenas ligeiramente acima do ponto de fusão de poloxâmero (~ 50°C) podiam ter um efeito sobre a viabilidade de cultura celular, amostras de dois lotes ruins de poloxâmero (H e G) foram tratadas em fornos a 60°C e 80°C durante 120 minutos e, em seguida, testadas no método HSSF de acordo com o Exemplo 2.

[00160] Os resultados para as amostras tratadas termicamente não demonstraram nenhuma melhoria significativa no desempenho em comparação com poloxâmero não tratado, independentemente da temperatura (FIGURA 7). Sem se pretender ficar limitado pela teoria, é a hipótese de que os tempos de incubação mais longos podem ser necessários para estas temperaturas mais baixas, para se obter um po- loxâmeros melhorado. Exemplo 7: Tratamento Térmico no vácuo

[00161] Para determinar o impacto de oxigênio no tratamento térmico de poloxâmero, amostras de dois lotes ruins de poloxâmero (H e G) foram tratadas termicamente a 140°C, enquanto sob um ligeiro vácuo no forno de acordo com os métodos no Exemplo 2. Ao invés de remoção de amostras a partir do vácuo, após um certo tempo de incubação, o poloxâmero foi resfriado no forno sob vácuo até a temperatura ambiente para garantir que não houve exposição externa de oxigênio enquanto o poloxâmero estava na temperatura alvo. Tabela 9. Condições de tratamento térmico de poloxâmero e os resultados HSSF para amostras testadas em um vácuo.

[00162] *Modelo de frasco em agitação de alto cisalhamento executado com N = 2

[00163] Poloxâmero tratado em um vácuo demonstrou uma melhoria significativa (> 20% de aumento na viabilidade final) sobre poloxâ- mero não tratado em cultura celular (FIGURA 8, Tabela 9). Estes resultados demonstram que a exposição ao oxigênio externo durante o tratamento térmico de poloxâmero pode não ser necessária para produzir a melhoria no poloxâmero. Exemplo 8: Medição de Temperatura Usando um RTD contra um Termopar com Fio

[00164] Dados anteriores suportados em um intervalo de temperatura de 80-100°C para o processo de tratamento térmico. No entanto, o DOE total (por exemplo, como mostrado na FIGURA 5) suportou em uma faixa de funcionamento em ou superior a 140°C.

[00165] Um experimento foi conduzido examinando os dois termômetros diferentes usados para medir a temperatura de poloxâmero durante o tratamento térmico. Os experimentos descritos no Exemplo 1 utilizaram um RTF, enquanto que um fio termopar foi utilizado em to- dos os experimentos de forno. O RTD usado requer uma profundidade de imersão de 4" para medição de temperatura precisas. Por outro lado, o termopar com fio é concebido para medir com precisão a temperatura na sua ponta, o que lhe permite medir com precisão a temperatura enquanto imerso em apenas poucos milímetros de poloxâmero.

[00166] Uma comparação lado a lado foi realizada enquanto sob tratamento térmico de poloxâmero em uma placa quente de acordo com os métodos no Exemplo 2. O termopar com fio gerou uma leitura de temperatura de 152,6°C, enquanto que o termômetro RDT gerou uma leitura de 81,65°C. Assim, o RTD mostrou uma submedição significativa da temperatura (> 70°C), quando comparada com a do termopar. Estes resultados demonstram que diferentes leituras de temperatura de poloxâmero sublinham diferenças em faixas de temperatura eficazes suficientes para a produção melhorada de poloxâmero. Exemplo 9: Rampa de Aquecimento e Caracterização da Taxa de Resfriamento no Forno

[00167] Amostras de poloxâmero, uma vez colocadas em um forno, não atingem imediatamente a temperatura alvo. Os perfis de aquecimento e resfriamento para três temperaturas utilizadas no DOE foram avaliados no forno de acordo com os métodos no Exemplo 2.

[00168] Amostras levaram uma média de 18 minutos para atingir a temperatura alvo (+/- 3°C) no forno com um desvio padrão de 5,8 minutos (FIGURA 9). Apesar da variabilidade nos tempos de aquecimento, as velocidades de resfriamento foram relativamente semelhantes. O tempo médio para uma amostra atingir a temperatura de fusão de poloxâmero (~ 40°C) foi de 7 minutos, com um desvio padrão de 0,8 minutos. Assumindo que os perfis de resfriamento são, em grande medida lineares, as taxas de resfriamento para as amostras aquecidas a 170C, 155C, e 140C foram, aproximadamente, -19°C/min, - 19,5°C/min, e -18°C/min, respectivamente. Exemplo 10: Significância estatística da viabilidade e tratamento térmico de poloxâmero

[00169] Um teste t de Student foi utilizado para determinar a diferença entre o desempenho dos lotes de controle de poloxâmero nos testes HSSF e o significado das melhorias observadas no desempenho de cultura celular. Todos os resultados do controle de HSSF a partir do forno DOE foram incluídos no conjunto de dados. Para as amostras tratadas termicamente, apenas as amostras no interior da faixa de trabalho foram usadas para calcular a variação média da viabilidade celular após o tratamento térmico. A faixa de trabalho foi definida como sendo condições em que a mudança na viabilidade no teste HSSF era inferior a 15%.

[00170] Poloxâmeros tratados e não tratados foram comparados pelo teste t de Student (α = 0,05) para determinar diferenças estatisticamente significativas nos meios. Além disso, os resultados dos materiais tratados foram comparados com resultados de controle positivo (D).

[00171] Tabela 10: A viabilidade delta média (Vf (Tratado) - Vf (Não tratado)) no teste HSSF para o material de poloxâmero tratado e não tratado de lotes testados.

[00172] Com um nível alfa de 0,05, comparações médias entre lotes ruins não tratados de poloxâmero e lote de controle positivo (D) demonstraram diferenças significativas (Tabela 10). Após o tratamento térmico, todos os lotes tiveram um desempenho significativamente melhor do que o lote de controle positivo, com a exceção de H, que foi comparável. Lote E, um lote bom, teve um valor de p> 0,05, indicando que seu desempenho não foi significativamente diferente do que o lote de controle positivo. No entanto, o poloxâmero tratado termicamente a partir do lote E teve um desempenho significativamente melhor no ensaio de HSSF do que o controle positivo (valor de p = 0,0005), demonstrando que o processo de tratamento térmico melhorou um lote já aceitável.

[00173] Estes resultados estão ilustrados nas FIGURA 10, que exibe resultados tratados e não tratados de cada lote, em comparação com os dados globais de conjunto de dados do controle positivo. Por exemplo, FIGURA 10 ilustra que para o lote ruim G, o G não tratado, o lote bom D de controle positivo, e o G tratado termicamente foram todos estatisticamente distinguíveis, com o lote G tratado termicamente mostrando viabilidade significativamente melhorada, em comparação com lote bom de controle positivo (D) ou o lote G ruim não tratado.

[00174] Com base nesta análise, casos em que o processo de tratamento térmico foi considerado bem-sucedido demonstraram uma melhoria de 18% sobre o material não tratado. Além disso, o material tratado desempenhou pelo menos tão bem, em geral, como o lote de controle positivo utilizado nestes experimentos.

[00175] Lotes ruins de poloxâmero com tratamento térmico antes da sua utilização em meios de cultura celular foi um método eficaz de melhorar o seu desempenho de proteção celular. O tratamento térmico foi eficaz em uma ampla faixa de temperaturas e períodos; no entanto, quanto menor for a temperatura, maior o tempo de tratamento necessário. Este processo foi robusto, demonstrando resultados semelhantes em vários lotes de poloxâmero e reprodutível. Embora os resultados aqui apresentados fossem de experimentos conduzidos em um forno, o processo pode ser transferido para o equipamento de escala maior. O processo de tratamento térmico aqui descrito pode ser transferido para qualquer método de tratamento que vai garantir um aquecimento consistente de poloxâmero por uma duração necessária na temperatura necessária. Exemplo 11: Análise estatística dos dados de teste DOE

[00176] Os exemplos descritos acima demonstram o efeito do tratamento térmico do poloxâmero sobre o desempenho subsequente em cultura celular (por exemplo, viabilidade celular). Em seguida, as análises foram realizadas para produzir uma função de transfermento, que é um modelo matemático para a saída (viabilidade @ 3 horas em um modelo de frasco em agitação) em função das duas variáveis dependentes (temperatura e tempo).

[00177] Dados de teste DOE (descritos na Tabela 12) agrupados em um forno com temperatura e tempo como variáveis foram analisadas em Minitab pelo método de regressão de Superfície de Resposta. Um conhecido lote ruim de Poloxâmero (G) foi tratado termicamente para o desenho do teste DOE e testado em um modelo de frasco em agitação em alto cisalhamento usado como um substituto para a funcionalidade protetora de cisalhamento. A viabilidade mais elevada no final do teste de 3 horas indica um melhor desempenho de poloxâme- ro. Do mesmo modo, foi realizada uma avaliação entre o mesmo lote de poloxâmero que foi tratado para melhorar o desempenho em comparação com uma amostra não tratada (controle negativo). Para levar em conta a variabilidade intra lotes observada nos lotes de fraco desempenho, a viabilidade média final de seis controles G foi usada como linha de base para calcular o percentual de melhorias de viabilidade observado para cada caso de teste. Viabilidade (%) em 3 horas e diferença em lotes tratados versus não tratados (%) foram as variáveis de resposta. Os resultados mostram que a qualidade deste lote de baixo desempenho pode ser melhorada como medido por um aumento na viabilidade. O objetivo da viabilidade desejada de mudança positiva na viabilidade (lote tratado-lote não tratado) pode ser alcançado em vários tratamentos de temperatura e tempo.

[00178] A análise foi realizada com a alteração na viabilidade (lote tratado-lote não tratado) @ 3 horas. Uma vez que a viabilidade média final de um lote dos lotes de baixo desempenho estudado sob condições de estresse, G demonstrou ser 79,7 +/- 5,0%, um aumento de 10% ou 20% na viabilidade foi tido como alvo para o gráfico de contorno e para o estabelecimento de duração mínima de tratamento térmico a uma temperatura designada. Deve também notar-se que em caso de outro executor fraco, C, viabilidades mais baixas (44,8 +/- 7,8%) do que as observadas para o G podem ser esperadas para o controle não tratado. Portanto, > 35% de melhoria nas viabilidades para C podem ser esperadas em condições onde um aumento de 20% foi alcançado para o lote G. Estes resultados indicam que existe efeito linear da temperatura e tempo, interação de temperatura e tempo. Os termos nos modelos são estatisticamente significativos ao nível de confiança de 95%, com valor P <0,05. A identificação da faixa de funcionamento ideal e os fatores no modelo são descobertas inesperadas e inovadoras.

[00179] Tabela 12. Conjunto de dados para o lote G tratamento térmico.

[00180] Modelo HSSF executado em duplicai tas

[00181] Para análise o software, Minitab versão 17.1 (Minitab.com, State College PA) foi utilizado. A análise foi análise de regressão (RSRegress). Regressão da superfície de resposta foi utilizada para analisar a melhoria da viabilidade (sobre lote não tratado) versus tempo (min) e da temperatura (°C).

[00182] A análise de variância, Resumo do modelo, e coeficientes codificados são fornecidos nas Tabelas 13-15 abaixo. Tabela 13. Análise de variância

Tabela 14. Resumo do modelo.

Tabela 15. Coeficientes codificados.

[00183] Com base nestes resultados, uma equação de regressão (em unidades não codificadas) foi determinada como: Melhoria em viabilidade (sobre não tratad),% = -113,5 0,486 * (Tempo, min) +1,238* (Temperatura, C) +0,00047 * (Tempo, min)2 -0,00286 * (Temperatura, C)2 - 0,00333 * (Tempo, min) * (Temperatura, C)

[00184] A função de transferência apresentada acima prediz a melhoria da viabilidade para o lote G sobre controle não tratado como uma função da temperatura e duração do tratamento térmico. Ele também contém termos de segunda ordem envolvendo temperatura e tempo e sua interação. Usando o modelo acima, a viabilidade esperada para um caso de teste (não derivada empiricamente) pode ser obtida. A previsão de saída de exemplo é mostrada abaixo de condições de teste 157°C e 1 minuto: Melhoria na Viabilidade = -113,5 + (0,486 * 1) + (1,238 * 157) 0,00047 * 1 A 2) - (0,00286 * 157 A 2) - (0,00333 * 1 * 157) = 10,3%

[00185] Os dados experimentais foram utilizados para gerar o gráfico de contorno mostrado nas FIGURA 11 (dados empíricos mostrados em círculos pretos). Com base no modelo gerado pela regressão, 5 pontos podem ser inferidos matematicamente.

[00186] Em primeiro lugar, a resposta ao tratamento pode ser classificada em três zonas de temperatura (157°C -185°C). (134°C -157°C) e (60°C-134°C).

[00187] Em segundo lugar, na zona de temperatura elevada de 157°C -185°C, as viabilidades dos lotes tratados termicamente podem ser melhoradas de 1 a 20% dentro de um tratamento térmico mínimo de um minuto.

[00188] Em terceiro lugar, na zona média de temperatura de 134°C -157°C, as viabilidades dos lotes tratados termicamente podem ser melhoradas entre 1 e 10% dentro de um período mínimo de tratamento térmico de 1 minuto. As viabilidades podem ser aumentadas até 20%, com uma duração mínima de tratamento térmico de 120 minutos.

[00189] Em quarto lugar, na zona de baixa temperatura de 60°C - 134°C, as viabilidades de lotes tratados termicamente podem ser melhoradas até 10% dentro de um período de tratamento térmico de 140 minutos. As viabilidades podem ser aumentadas até 20%, com uma duração mínima de tratamento térmico de 164 minutos. Deve-se notar que as durações descritas para as zonas de temperatura médias e baixas são as orientações simplificadas. Por exemplo, como mostrado na FIGURA 11, as temperaturas de 60°C, 80°C, 120°C no interior da zona de baixa temperatura requer 164 minutos, 147 minutos e 115 minutos, respectivamente, para atingir, pelo menos, uma melhoria de 10% na viabilidade. Valores exemplificativos encontram-se descritos na Tabela 16 abaixo. Tabela 16. Temperaturas exemplares, horários e melhorias de viabilidade correspondentes.

[00190] Em quinto lugar, o modelo estabelecid o acima foi obtido a partir de dados gerados com o lote G. Uma vez que o controle não tratado tinha uma maior viabilidade da linha de base de 79%, melhorias de viabilidade podem ser realizadas a um máximo de 20%. No entanto, para os lotes, como C, em que o lote não tratado tinha uma viabilidade muito baixa de 45%, os níveis mais elevados de melhoria podem ser realizados. Por exemplo, na zona de temperatura média de 134°C - 157°C, a viabilidade pode ser melhorada por 42% dentro de um período de tratamento térmico de 15 minutos para o lote C. As diferenças observadas no desempenho entre os lotes C e G estão resumidas na Tabela 17 abaixo. Tabela 17. Resumo do desempenho de C e G

[00191] Portan to, o valor do tratamento térmico é mais pronunciado em lotes como C. Um conjunto de dados completo para este lote não poderia ser realizado devido à falta de matéria-prima para executar um conjunto completo de experimentos. G representa um lote de desempenho marginalmente baixo e o modelo previsto acima pode ser considerado conservador. Os dados gerados usando lotes C e G demonstram que poloxâmero tratado termicamente pode melhorar o desempenho de outros lotes de poloxâmero não testados aqui. As melhorias no desempenho podem ser afetadas pelo tempo e pela temperatura, como descrito acima. Os resultados descritos acima demonstram que o aumento da temperatura diminui a duração do tratamento térmico necessário para melhorar o desempenho do poloxâmero, e que as temperaturas mais baixas podem ser usadas para melhorar o desempenho de poloxâmero em durações mais longas. Sem pretender ficar limitado pela teoria, pensa-se que a percentagem exata de melhoria de viabilidade observada mediante o tratamento térmico vai depender da viabilidade da linha de base observada para um lote de poloxâmero particular antes do tratamento térmico.

Claims

1. Método para preparar um poloxâmero para uso em um meio de cultura de célula, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) aquecer um poloxâmero sólido até pelo menos 60°C para formar um poloxâmero líquido; em que (a1) o poloxâmero na etapa (a) é aquecido até entre 157°C e 185°C durante pelo menos 1 minuto; ou (a2) em que o poloxâmero é aquecido até entre 134°C e 157°C durante pelo menos 1 minuto; ou (a3) o poloxâmero é aquecido até entre 120°C e 134°C durante pelo menos 62 minutos; ou (a4) o poloxâmero é aquecido até entre 100°C e 120°C durante pelo menos 98 minutos; ou (a5) o poloxâmero é aquecido até entre 80°C e 100°C durante pelo menos 122 minutos; ou (a6) o poloxâmero é aquecido até entre 60°C e 80°C durante pelo menos 143 minutos; e (b) resfriar o poloxâmero líquido até uma temperatura abaixo de 50°C para formar um poloxâmero tratado termicamente sólido, em que o resfriamento não é conduzido em um dispositivo de pelotização e moagem, e em que o poloxâmero compreende um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno, sendo que a viabilidade da célula em um meio de cultura de célula compreendendo o poloxâmero tratado termicamente é aumentada em pelo menos 10% em comparação com a viabilidade da célula em um meio de cultura de célula compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a1) o poloxâmero é aquecido até entre 157°C e 185°C por entre 1 minuto e 250 minutos; (a2) o poloxâmero é aquecido entre 134°C e 157°C por entre 1 minuto e 250 minutos; (a3) o poloxâmero é aquecido entre 120°C e 134°C por entre 62 minutos e 250 minutos; ou (a4) o poloxâmero é aquecido entre 100°C e 120°C por entre 98 minutos e 250 minutos; ou (a5) o poloxâmero é aquecido entre 80°C e 100°C por entre 122 minutos e 250 minutos; ou (a6) o poloxâmero é aquecido entre 60°C e 80°C por 250 minutos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a viabilidade da célula é aumentada em pelo menos 20%.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a viabilidade da célula é aumentada em pelo menos 30%.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a viabilidade das células em um meio de cultura de célula compreendendo o poloxâmero antes da etapa (a) está abaixo de 80% após 3 horas de cultura da célula.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero líquido na etapa (b) é resfriado à temperatura ambiente, a 2°C a 8°C, ou abaixo de 0°C.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero é aquecido sob um vácuo.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero líquido é resfriado por pelo menos 20 minutos.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero tratado termicamente produzido na etapa (b) é adicionado a um meio de cultura de célula.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são repetidas pelo menos uma vez antes de adicionar poloxâmero tratado termicamente no meio de cultura de célula.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero foi tratado por um processo de peletização antes da etapa (a).

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero: (a) apresenta uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH, em que n é de 60 a 150, e m é de 25 a 60; e/ou (b) apresenta uma temperatura de fusão de 55°C; e/ou (c) apresenta um peso molecular médio de 6.000 a 18.000 Daltons.; e/ou (d) compreende um copolímero tendo uma fórmula de HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH com n tendo um valor de 80, com m tendo um valor de 27, e o poloxâmero tendo um peso molecular médio de 7680 a 9510 g/mol; e;ou (e) é o poloxâmero 188.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula é: (a) uma célula de mamífero; e/ou (b) uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO); e/ou (c) uma célula de inseto.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a célula produz um polipeptídeo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.