CN106414552A - 制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法。本文还提供含有通过本文方法制备的泊洛沙姆的细胞培养基、以及使用该培养基用于细胞培养并从细胞生产多肽的方法。

Description

制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年3月25日提交的美国临时申请系列No.61/970,281的优先权权益，将其全部按引用并入本文中。
发明领域
本发明涉及制备泊洛沙姆(例如，用于细胞培养基中)的方法、含有按照本文所述制备的泊洛沙姆的细胞培养基、和使用本文中所述的细胞培养基来培养细胞和生产多肽的方法。
发明背景
细胞培养制造技术广泛用于生产基于蛋白质的治疗剂(如，抗体)，用于药物制剂中。基于蛋白质的产品(如，抗体产品)的商业生产需要细胞培养参数的优化，以使细胞产生大量蛋白质产物以满足制造需求。以工业规模制造基于蛋白质的产品时，如蛋白质生产效率和原料(例如，细胞培养基中的组分)成本这样的因素就非常重要。
泊洛沙姆是广泛用于工业蛋白质生产的细胞培养基中的组分。将其加入细胞培养基中，以增强所培养细胞的生存力。其许多功能中的一种是作为表面活性剂起作用，降低细胞培养基中的细胞和气泡之间的附着力并且在气泡破裂时保护细胞免受损伤。其还可以强化细胞膜，提高细胞从培养物的泡沫层的排出以及改变起泡频率和速度。
不幸地，已经观察到了泊洛沙姆性能在批与批之间的变异性显著。用于细胞培养基中时，性能差的泊洛沙姆批次可以引起降低的细胞生存力和细胞生长速率。降低的细胞生存力导致降低的蛋白质生产。以工业规模进行培养时，这种降低的生产可以导致严重的经济损失。
因此，需要一种简单、廉价的技术方案来降低泊洛沙姆的变异性和提高泊洛沙姆的性能，特别是针对性能差的批次。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请将其全部按引用并入本文中，用于全部目的。
发明概述
本文中提供的本发明尤其公开了用于制备泊洛沙姆(例如，用于细胞培养物中)的方法。还提供了通过本文中所述的方法制备的泊洛沙姆。本文中进一步公开了含有通过本文中所述的方法制备的泊洛沙姆的细胞培养基组合物。本文中进一步公开了，在含有通过本文中所述的方法制备的泊洛沙姆的细胞培养基中培养产生多肽的细胞以在细胞培养物中生产多肽的方法。
因此，在一个方面中，本文中提供了制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法，包括步骤：(a)将固体泊洛沙姆加热到至少约60℃，形成液体泊洛沙姆；和(b)将液体泊洛沙姆冷却至低于约50℃的温度，形成固体热处理过的泊洛沙姆，其中冷却不在造粒(prilling)或研磨设备中进行，并且其中泊洛沙姆包含环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。在一些实施方案中，与包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力相比，在包含热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中细胞生存力提高。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约60℃至约185℃。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约157℃至约185℃。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃并且至少1分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃并且约1分钟至约250分钟。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约134℃至约157℃。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃并且至少1分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃并且1分钟至约250分钟。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约120℃至约134℃。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且至少约62分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且约62分钟至约250分钟。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约100℃至约120℃。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且至少约98分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且约98分钟至约250分钟。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约80℃至约100℃。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且至少约122分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且约122分钟至约250分钟。在一些实施方案中，步骤(a)中将泊洛沙姆加热到约60℃至约80℃。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且至少约143分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且约143分钟至约250分钟。在一些实施方案中，与包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力相比，在包含热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中细胞生存力提高至少10％。在一些实施方案中，细胞生存力提高至少约20％。在一些实施方案中，细胞生存力提高至少约30％。在一些实施方案中，在包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中细胞生存力在约3小时的细胞培养后低于约80％。在一些实施方案中，在步骤(b)中，在环境温度，约2℃至约8℃，或低于0℃，冷却液体泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆在真空下加热。在一些实施方案中，液体泊洛沙姆冷却至少约20分钟。在一些实施方案中，将步骤(b)中产生的热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基中。在一些实施方案中，在将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基之前，将步骤(a)和(b)重复至少一次。在一些实施方案中，在步骤(a)之前已经通过造粒工艺(prilling process)处理过泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH，其中n从约60至约150和m从约25至约60。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约55℃的熔化温度。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约6,000至约18,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有约80的值，m具有约27的值，并且该泊洛沙姆具有约7680至约9510g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞产生多肽。
在另一个方面中，本文中提供了通过以上和本文中所述的任一种方法制备的泊洛沙姆。
在进一步的方面中，本文中提供了包含通过以上和本文中所述的任一种方法制备的泊洛沙姆的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约3g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。
在再进一步的方面中，本文中提供了在细胞培养物中生产多肽的方法，包括步骤：在适于多肽生产的条件下，在细胞培养基中，培养产生多肽的细胞，其中细胞培养基包含通过以上和本文中所述的任一种方法制备的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约3g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，多肽是抗体或其抗原结合片段。
因此，在一个方面中，本文中提供了制备泊洛沙姆(例如，用于细胞培养基中)的方法，包括步骤：(a)将纯化的泊洛沙姆加热到约80℃或以上(例如，约80℃至约100℃)，形成液体泊洛沙姆，和(b)将液体泊洛沙姆冷却至约50℃或以下的温度，形成固体热处理过的泊洛沙姆，其中冷却不在造粒或研磨设备中进行。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，其中n从约60至约150和m从约25至约60。在一些实施方案中，与包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力相比，在包含热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中细胞生存力提高。在一些实施方案中，泊洛沙姆是纯化的泊洛沙姆。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆是不含另外的治疗化合物或药物化合物的泊洛沙姆组合物。在一些实施方案中，步骤(a)中泊洛沙姆不含另外的治疗化合物或药物化合物。在一些实施方案中，步骤(a)中泊洛沙姆加热到约85℃至约91℃。在本文中的一些实施方案中，加热泊洛沙姆约10至约15分钟。在本文中的一些实施方案中，液体泊洛沙姆在步骤(b)中在环境温度、约2℃至约8℃，或低于0℃冷却。在本文中的一些实施方案中，将液体泊洛沙姆冷却至少约20分钟。在本文中的一些实施方案中，将步骤(b)中产生的热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基中。在本文中的一些实施方案中，在将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基之前，将步骤(a)和(b)重复至少一次。在本文中的一些实施方案中，细胞生存力提高至少约10％。在本文中的一些实施方案中，细胞生存力提高至少约30％。在本文中的一些实施方案中，在包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中细胞生存力低于约80％。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆在步骤(a)之前已经通过造粒工艺加热。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆具有约45℃至约60℃范围的熔化温度。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆具有约6,000至约18,000道尔顿的平均分子量。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有约80的值，m具有约27的值，并且泊洛沙姆具有约7680至约9510g/mol的平均分子量。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆237。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有约64的值和m具有约37的值。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆338。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有约141的值和m具有约44的值。在本文中的一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆407。在一些实施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有约101的值和m具有约56的值。在本文中的一些实施方案中，细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本文中的一些实施方案中，细胞可以是昆虫细胞。在本文中的一些实施方案中，细胞产生多肽。在一些实施方案中，多肽是抗体或其抗原结合片段。在另一个方面中，本文中提供了通过以上和本文中所述的任一种方法产生的泊洛沙姆。
在另一个方面中，本文中提供了包含通过以上和文本中所述的任一种方法产生的泊洛沙姆的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约3g/L的热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。
在另一个方面中，本文中提供了在细胞培养物中生产多肽的方法，包括步骤：在适于多肽生产的条件下，在细胞培养基中培养产生多肽的细胞，其中细胞培养基包含通过以上和本文中所述的任一种方法产生的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约10g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1g/L至约3g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3g/L至约10g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞产生的多肽是抗体或其抗原结合片段。
可以理解，本文中所述的各种实施方案的一个、一些或全部特性可以组合形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面将是本领域技术人员显而易见的。
附图简述
图1显示，泊洛沙姆的热处理改善了其对培养物中的细胞生存力的作用。菱形图表示平均值(中心线)和上/下95％置信区间(菱形的顶点)，以及每个实验条件的细胞生存力值(点)。如x-轴所示的，每个实验比较了来自好或差(“可疑”)的泊洛沙姆批次的未处理和热处理(HT)的泊洛沙姆。箭头指示在热处理差批次后细胞生存力的提高。注意，热处理也提高了好批次的细胞生存力，从平均大约85％提高至大约95％的值。
图2显示，对于未处理和热处理(_HT)泊洛沙姆样品A、B和C，高剪切摇瓶模型(HSSF)测试的细胞生存力(％)(还参见表2)。
图3显示在烘箱中测试的条件的响应曲面设计(Response surface design)。每种条件以“时间，温度”的格式标记。在HSSF中测试了带“◆”标的条件。在烘箱中准备了带“◇”标的条件，但没在HSSF中测试。温度(以℃计)表示烘箱的设定温度，而时间(以min计)表示泊洛沙姆样品在烘箱中的时间。
图4显示，在所示条件下在烘箱中热处理的C泊洛沙姆样品与阳性(“好批次”)和阴性(“未处理的差批次”)对照(分别为D和C)相比，细胞生存力的提高(％)(Vf(处理的)-Vf(未处理的))。误差棒描绘了一个标准偏差。
图5显示来自全实验设计(DOE)的等值线图，探索不同热处理条件对泊洛沙姆在细胞培养物中的性能的影响。HSSF测试中生存力的提高(Vf(处理的)-Vf(未处理的))显示为时间和温度的函数。点表示测试的样品条件。
图6显示了，对于在所示条件下热处理的三个差批次(H、F和G)和一个好批次(E)的泊洛沙姆样品，在HSSF测试中细胞生存力的提高(％)(Vf(处理的)-Vf(未处理的))。
图7显示，对于在低温(60-80℃)下长时间(120min)处理的差泊洛沙姆批次(H和G)，细胞生存力提高(％)(Vf(处理的)-Vf(未处理的))的比较。*HSSF模型一式二份运行。
图8显示，与未处理相比，真空条件下热处理的泊洛沙姆样品(H和G)的HSSF测试中细胞生存力的提高(％)(Vf(处理的)-Vf(未处理的))。
图9显示在烘箱中泊洛沙姆材料的加热和冷却曲线。测试了三个温度：140℃、155℃和170℃。一旦温度读数开始稳定，从烘箱中取出材料并在室温下冷却。曲线在40℃(接近泊洛沙姆的熔点)趋向平缓。
图10显示，与阳性对照(D)和未处理材料相比，每个批次的热处理的泊洛沙姆的student’s t-检验结果。平均值菱形表示每个数据集的95％置信区间(上下顶点)和平均值(中心线)。
图11显示，来自响应曲面和全DOE实验的数据的等值线图，说明泊洛沙姆热处理条件的大工作范围。说明了每个实验间隔的细胞生存力的改变(％)。作为时间和温度的函数，显示了HSSF测试中生存力的提高(Vf(处理的)-Vf(未处理的))。响应曲面数据反映，针对达到目标温度所需的时间进行校正后的孵育时间和温度。点表示测试的样品条件。
发明详述
本申请的发明人证明，泊洛沙姆的热处理可以提高泊洛沙姆在细胞培养物中支持生存力的能力。本申请中的数据表明，与使用没有热处理泊洛沙姆的细胞培养基相比，使用含有热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基，可以提高细胞生存力。本发明人证明，不同批次的泊洛沙姆当加入细胞培养基时对细胞生存力具有显著不同的影响，本文中所述的热处理可以改善好批次和差批次的泊洛沙姆对细胞生存力的作用。
在一个方面中，本文提供，通过加热泊洛沙姆和冷却泊洛沙姆来制备泊洛沙姆的方法，其中冷却不在造粒或研磨设备中进行。在一些实施方案中，所述方法包括通过如下方式来制备泊洛沙姆：将泊洛沙姆加热到约80℃或更高(例如，至约100℃)以形成液体泊洛沙姆，将液体泊洛沙姆冷却至低于约50℃的温度以形成固体热处理过的泊洛沙姆，其中冷却不在造粒或研磨设备中进行，并且其中泊洛沙姆含有环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。在一些实施方案中，泊洛沙姆含有具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，其中n为约60至约150且m为约25至约60。在一些实施方案中，在加热和冷却处理之前，泊洛沙姆是固体泊洛沙姆。在一些实施方案中，在加热和冷却处理之前，泊洛沙姆在室温下是液体泊洛沙姆。在一些实施方案中，在加热和冷却处理之前，泊洛沙姆是溶解于液体或含水溶液中的固体泊洛沙姆。例如，本文中提供的方法可以用于制备用于细胞培养或细胞培养基中的泊洛沙姆。
在另一个方面中，本文提供用于细胞培养的组合物，其包含热处理过的泊洛沙姆。在另一个方面中，本文提供用于细胞培养的组合物，其在细胞培养基中含有热处理过的泊洛沙姆。
在另一个方面中，本文提供用于在细胞培养中生产多肽的方法，通过在适于多肽产生的条件下在含有热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中培养产生多肽的细胞。
I.定义
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定组合物或生物系统，其当然可以改变。还应当理解，本文中所用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，并不旨在构成限制。
如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非内容另外明确规定。因此，例如，提及“一个分子”任选包括两个或多个这样的分子的组合，等等。
如本文中使用的术语“约”是指，本技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的通常误差范围。本文中提及“约”值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
可以理解，本文描述的本发明的各个方面和实施方案涵盖方面和实施方案的“包括(comprising)”、“由……组成(consisting)”和“基本上由……组成(consistingessentially of)”的情形。
术语“泊洛沙姆”是指，由侧接两条聚氧乙烯(在本文中可与术语“环氧乙烷”互换使用)链的聚氧丙烯(在本文中可与术语“环氧丙烷”互换使用)链形成的嵌段共聚物。泊洛沙姆可以以商品名销售，包括(BASF),(BASF),(BASF)和(Croda International)。除非具体指出特定的泊洛沙姆品种，否则提及“泊洛沙姆”可以泛指多种泊洛沙姆品种。
在一些实施方案中，泊洛沙姆是纯化的泊洛沙姆。术语“纯化的泊洛沙姆”是指，基本上不含其他化合物的泊洛沙姆组合物。纯化的泊洛沙姆可以包括，例如，商业上可购得的具有技术级别或更高级别的泊洛沙姆。技术级别或更高级别的实例包括技术级、纯化级、N.F.级(US National Formulary)、U.S.P.级(US Pharmacopeia)、试剂级和A.C.S.级(American Chemical Society)。纯化的泊洛沙姆是指没有与另一种化合物混合的泊洛沙姆。例如，纯化的泊洛沙姆可以是指没有与治疗化合物或药物化合物混合(例如，作为药剂制剂的一部分)的泊洛沙姆。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆是指，该泊洛沙姆基本上不含，或未混合，未反应的反应物、催化剂、或通过泊洛沙姆合成方法或反应产生的其他产物。
术语“热处理过的泊洛沙姆”是指，通过本文中提供的方法热处理过至少一次的泊洛沙姆。
术语“培养基”和“细胞培养基”是指，用于生长或维持细胞的营养源。如本领域技术人员理解的，营养源可以含有细胞生长和/或存活需要的成分或可以含有有助于细胞生长和/或存活的成分。维生素、必需或非必需氨基酸、微量元素和表面活性剂(例如，泊洛沙姆)是培养基成分的实例。本文中提供的任何培养基还可以补充胰岛素、植物水解产物和动物水解产物中的任何一种或多种。
“培养”细胞是指在适于细胞生存力/或生长和/或增殖的条件下使细胞接触细胞培养基。
“分批培养”是指，在培养过程开始时向培养容器提供用于细胞培养的所有成分(包括细胞以及所有培养营养物和成分)的培养。
如本文中使用的短语“补料分批细胞培养”是指这样的分批培养，其中最初向培养容器提供细胞和培养基，在培养过程中将另外的培养营养物连续地或以不连续的增量补入培养物中，培养终止前进行或不进行周期性的细胞和/或产物收集。
“灌流培养”是指，通过例如过滤、包囊、固定于微载体等方式将细胞限制在培养物中、并连续或间歇地将培养基引入和移出培养容器的培养。
“培养容器”是指用于培养细胞的容器。培养容器可以是任何大小的，只要其可以用于细胞的培养即可。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰，如与标记成分缀合。该定义内还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)、以及本领域已知的其他修饰的多肽。本文中，涵盖在该定义中的多肽的实例包括哺乳动物蛋白，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠利尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织类型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受激活调节正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白，如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-b；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素-样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；整联蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18和ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫粘附素；和上述任一种蛋白的片段和/或变体，以及结合蛋白(包括，例如，上述任一个蛋白)的抗体，包括抗体片段。
如本文中使用的术语“滴度”是指，通过细胞培养产生的重组表达的抗体的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以单位毫克抗体/毫升培养基来表示。滴度可以以相对测量来表示或评价，如比较不同培养条件下获得蛋白质产物，滴度的百分比增加。
本文中的术语“抗体”以最广的含义来使用，并且尤其涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现所需的生物活性即可。抗体可以是人、人源化和/或亲和力成熟的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指基本上完整形式的抗体，不是如以下定义的抗体片段。该术语特别是指具有含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区(术语“抗原结合片段”可互换使用)。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体(diabody)；直链抗体；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
II.制备泊洛沙姆的方法
本文提供制备泊洛沙姆的方法，例如，用于细胞培养基中。
加热
在一些方面，本文中提供的制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法包括加热泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)以形成液体泊洛沙姆。例如，可以将固相的纯化泊洛沙姆加热到融化，由此形成液体泊洛沙姆。可以基于使用的特定泊洛沙姆品种的熔化温度来调节将泊洛沙姆加热至的温度。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆具有约45℃至约60℃的熔化温度。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆具有约50℃至约55℃的熔化温度。
在一些实施方案中，本文中提供的制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法包括将固体泊洛沙姆加热到至少约60℃以形成液体泊洛沙姆，并且将液体泊洛沙姆冷却至低于约50℃的温度以形成固体热处理过的泊洛沙姆，其中冷却不在造粒或研磨设备中进行，并且泊洛沙姆包含环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。在一些实施方案中，泊洛沙姆是纯化的泊洛沙姆。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆是不含另外的治疗化合物或药物化合物的泊洛沙姆组合物。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到至少约任一个以下温度(以℃计)：60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180或185。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)至少1分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆至少约1分钟，至少约2分钟，至少约3分钟，至少约4分钟，至少约5分钟，至少约6分钟，至少约7分钟，至少约8分钟，至少约9分钟，至少约10分钟，至少约15分钟，至少约20分钟，至少约25分钟，至少约30分钟，至少约35分钟，至少约40分钟，至少约45分钟，至少约50分钟，至少约55分钟，至少约60分钟，至少约65分钟，至少约70分钟，至少约75分钟，至少约80分钟，至少约85分钟，至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约60℃至约185℃。值得注意的是，除非另外明确指出，本文中所述的任一个温度范围旨在是包含性的。例如，约60℃至约185℃的温度范围将约60℃和约185℃包含在所述范围内。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于以下任一个温度(以℃计)的温度：185，180，175，170，165，160，155，150，145，140，135，130，125，120，115，110，105，100，95，90，85，80，75，70或65。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于以下任一个温度(以℃计)的温度：60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175或180。即，泊洛沙姆可以加热到在如下温度范围中的温度，所述温度范围具有185，180，175，170，165，160，155，150，145，140，135，130，125，120，115，110，105，100，95，90，85，80，75，70或65的上限和60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175或180的独立选择的下限，其中下限小于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)到约60℃至约185℃并且至少1分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆至少约1分钟，至少约2分钟，至少约3分钟，至少约4分钟，至少约5分钟，至少约6分钟，至少约7分钟，至少约8分钟，至少约9分钟，至少约10分钟，至少约15分钟，至少约20分钟，至少约25分钟，至少约30分钟，至少约35分钟，至少约40分钟，至少约45分钟，至少约50分钟，至少约55分钟，至少约60分钟，至少约65分钟，至少约70分钟，至少约75分钟，至少约80分钟，至少约85分钟，至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约60℃至约185℃并且约1分钟至约250分钟。值得注意的是，除非另外明确指出，本文中所述的任一个时间范围旨在是包含性的。例如，约1分钟至约250分钟的时间范围将约1分钟和约250分钟包含在所述范围内。在一些实施方案中，泊洛沙姆的加热时间少于约以下任一个时间(以分钟计)：250，240，230，220，210，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，95，90，85，80，75，70，65，60，55，50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3或2。在一些实施方案中，泊洛沙姆的加热时间多于约以下任一个时间(以分钟计)：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230或240。即，泊洛沙姆可以加热在如下时间范围中的时间长度，所述时间范围具有250，240，230，220，210，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，95，90，85，80，75，70，65，60，55，50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3或2的上限和1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230或240的独立选择的下限，其中下限小于上限。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约157℃至约185℃。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度(以℃计)的温度：185，180，175，170，165或160。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于约以下任一个温度(以℃计)的温度：157，160，165，170，175或180。即，泊洛沙姆可以加热到具有185，180，175，170，165或160的上限和独立选择的157，160，165，170，175或180的下限的温度范围中的温度，其中下限低于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃并且至少约1分钟，至少约2分钟，至少约3分钟，至少约4分钟，至少约5分钟，至少约6分钟，至少约7分钟，至少约8分钟，至少约9分钟，至少约10分钟，至少约15分钟，至少约20分钟，至少约25分钟，至少约30分钟，至少约35分钟，至少约40分钟，至少约45分钟，至少约50分钟，至少约55分钟，至少约60分钟，至少约65分钟，至少约70分钟，至少约75分钟，至少约80分钟，至少约85分钟，至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃并且少于或等于250分钟。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约134℃至约157℃。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度(以℃计)的温度：157，155，150，145，140或135。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于约以下任一个温度(以℃计)的温度：134，135，140，145，150或155。即，泊洛沙姆可以加热到具有157，155，150，145，140或135的上限和独立选择的134，135，140，145，150或155的下限的温度范围中的温度，其中下限低于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃并且至少约1分钟，至少约2分钟，至少约3分钟，至少约4分钟，至少约5分钟，至少约6分钟，至少约7分钟，至少约8分钟，至少约9分钟，至少约10分钟，至少约15分钟，至少约20分钟，至少约25分钟，至少约30分钟，至少约35分钟，至少约40分钟，至少约45分钟，至少约50分钟，至少约55分钟，至少约60分钟，至少约65分钟，至少约70分钟，至少约75分钟，至少约80分钟，至少约85分钟，至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃并且少于或等于250分钟。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约120℃至约134℃。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度(以℃计)的温度：134，130或125。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于约以下任一个温度(以℃计)的温度：120，125或130。即，泊洛沙姆可以加热到具有134，130或125的上限和独立选择的120，125或130的下限的温度范围中的温度，其中下限低于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且至少约20分钟，至少约30分钟，至少约40分钟，至少约50分钟，或至少约60分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且至少约62分钟，至少约65分钟，至少约70分钟，至少约75分钟，至少约80分钟，至少约85分钟，至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且少于或等于250分钟。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约100℃至约120℃。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度(以℃计)的温度：120，115，110或105。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于约以下任一个温度(以℃计)的温度：100，105，110或115。即，泊洛沙姆可以加热到具有120，115，110或105的上限和独立选择的100，105，110或115的下限的温度范围中的温度，其中下限低于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且至少约20分钟，至少约30分钟，至少约40分钟，至少约50分钟，或至少约60分钟，至少约70分钟，至少约80分钟，或至少约90分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且至少约98分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且少于或等于250分钟。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约80℃至约100℃。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度(以℃计)的温度：100，95，90或85。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于约以下任一个温度(以℃计)的温度：80，85，90或95。即，泊洛沙姆可以加热到具有100，95，90或85的上限和独立选择的80，85，90或95的下限的温度范围中的温度，其中下限低于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且至少约20分钟，至少约30分钟，至少约40分钟，至少约50分钟，或至少约60分钟，至少约70分钟，至少约80分钟，或至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，或至少约120分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且至少约122分钟，至少约130分钟，至少约140分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且少于或等于250分钟。
在一些实施方案中，将泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)加热到约60℃至约80℃。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度(以℃计)的温度：80，75，70或65。在一些实施方案中，将泊洛沙姆加热到高于约以下任一个温度(以℃计)的温度：60，65，70或75。即，泊洛沙姆可以加热到具有80，75，70或65的上限和独立选择的60，65，70或75的下限的温度范围中的温度，其中下限低于上限。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且至少约20分钟，至少约30分钟，至少约40分钟，至少约50分钟，或至少约60分钟，至少约70分钟，至少约80分钟，或至少约90分钟，至少约100分钟，至少约110分钟，至少约120分钟，至少130分钟，或至少140分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且至少约143分钟，至少约150分钟，至少约160分钟，至少约170分钟，至少约180分钟，至少约190分钟，至少约200分钟，至少约210分钟，至少约220分钟，至少约230分钟，或至少约240分钟。在一些实施方案中，加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且少于或等于250分钟。
在一些实施方案中，在真空下加热泊洛沙姆。例如，可以在所施加的真空下在真空炉中加热泊洛沙姆。如以下所述，出乎预料地发现，在所施加的真空下在本文中所述的温度下加热泊洛沙姆可以导致提高的泊洛沙姆性能(参见，例如，实施例7)。换句话说，在加热过程中给泊洛沙姆施加真空不会负面影响加热对随后的泊洛沙姆性能(例如在细胞培养物中)的有益作用。
在其他实施方案中，加热泊洛沙姆到目标温度并且一段时间是指，泊洛沙姆在该段时间中处于该特定温度。也就是说，时间＝0可以表示泊洛沙姆到达目标温度的时间。例如，加热泊洛沙姆到140℃并且5分钟可以指，在达到140℃温度后加热泊洛沙姆5分钟。例如，加热泊洛沙姆(例如，纯化的泊洛沙姆)到约60℃至约185℃并且至少1分钟，可以表示泊洛沙姆已经持续达到目标温度(例如，约60℃至约185℃)至少一分钟。
在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆在加热处理过程中的温度不超过约120℃。在一些实施方案中，在加热处理之前，纯化的泊洛沙姆可以溶解于液体或水溶液中。在一些实施方案中，溶解于液体或水溶液中的纯化泊洛沙姆可以加热到比用于固体泊洛沙姆的温度高的温度。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆在加热处理前是固体泊洛沙姆。在一些实施方案中，纯化的泊洛沙姆在加热处理前在室温下是液体泊洛沙姆。
在一些实施方案中，将纯化的泊洛沙姆加热到约80℃至约100℃的温度。在一些实施方案中，将纯化的泊洛沙姆加热到约85℃至约91℃的温度。在一些实施方案中，将纯化的泊洛沙姆加热到低于约以下任一个温度的温度(以℃计)：100，99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82或81。在一些实施方案中，将纯化的泊洛沙姆加热到高于以下任一个温度的温度(以℃计)：80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99。即，可以将纯化的泊洛沙姆加热到在如下温度范围中的温度，所述温度范围具有100，99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82或81的上限和80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的独立选择的下限，其中下限低于上限。在一些实施方案中，将纯化的泊洛沙姆加热到低于约120℃的温度。在一些实施方案中，将纯化的泊洛沙姆加热到低于约101℃，102℃，103℃，104℃，105℃，106℃，107℃，108℃，109℃，110℃，111℃，112℃，113℃，114℃，115℃，116℃，117℃，118℃和119℃之任一个的温度。
可以加热纯化的泊洛沙姆任何期望的时间长度。在一些实施方案中，加热纯化的泊洛沙姆约10至约15分钟。加热时间可以指，将热施加于泊洛沙姆的总时间，因此加热时间不限于泊洛沙姆已经持续达到所需温度的时间。在一些实施方案中，加热纯化的泊洛沙姆约10至约15分钟的总时间量，并且当泊洛沙姆达到所需的最大温度(例如，约80℃至约100℃)时，停止加热。
本领域已知的任何合适的加热装置可以用于加热纯化的泊洛沙姆。作为非限制性实例，可以在标准实验室加热板(例如，由或ThermoScientificTM销售的搅拌热板)上加热的玻璃容器(例如，烧杯、烧瓶或其他敞开的容器)中，加热固体泊洛沙姆。或者，可以在真空炉中加热泊洛沙姆。
本领域已知的任何合适的温度测量工具都可以用于测量加热处理过程中/加热处理后的泊洛沙姆温度，只要使用该温度测量工具可以进行泊洛沙姆温度的准确测量(例如，根据制造商的使用说明)即可。合适的温度测量工具的非限制性实例包括不限于温度计(例如，玻璃液体温度计)、热电偶(例如，如以下所述的)、电阻温度检测仪(RTD)和/或热敏电阻。在一些实施方案中，温度测量工具是用于加热的设备本身带有的。
冷却
在一些方面，本文中所述的制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法包括冷却加热过的纯化泊洛沙姆以形成固体热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，将液体泊洛沙姆冷却至低于约50℃的温度。将液体泊洛沙姆冷却至的温度可以是低于其冻结温度的任何温度，所述冻结温度可以根据使用的特定泊洛沙姆而不同。例如，泊洛沙姆188具有约52℃的冻结温度，因此可以将该泊洛沙姆冷却至低于约52℃的任何温度以形成固体热处理过的泊洛沙姆。
可以在足以使泊洛沙姆冻结的任何温度，冷却加热过的液体泊洛沙姆。在一些实施方案中，在环境温度冷却加热过的液体泊洛沙姆。在一些实施方案中，在约2℃至约8℃冷却加热过的液体泊洛沙姆。在一些实施方案中，在低于约0℃，例如，在约-20℃或在约-70℃，冷却加热过的液体泊洛沙姆。
可以将加热过的液体泊洛沙姆冷却足以使该热处理过的液体泊洛沙姆在该冷却温度下冻结的任何所需时间长度。在一些实施方案中，将液体泊洛沙姆冷却约20分钟。冷却时间可以取决于将泊洛沙姆加热至的温度和/或冷却温度。可以通过观察液体泊洛沙姆(加热到给定温度和给定时间量)在特定冷却温度下冻结所花费的时间，经验地确定冷却温度和时间。
本领域已知的任何合适的冷却装置，除了造粒或研磨设备外，可以用于冷却加热过的液体泊洛沙姆。例如，可以将加热过的液体泊洛沙姆放置在维持在如上所述的足够冷却温度的冰箱、冰柜或冷室中。或者，可以不使用特定的冷却装置，而是可以在将加热装置关闭或程序化停止加热后，在加热装置中冷却该加热过的液体泊洛沙姆。在这种情况中，允许加热过的液体泊洛沙姆在环境温度下冷却。例如，如果泊洛沙姆在热板上加热，可以在将热板的加热功能关闭后，简单地将泊洛沙姆留在热板上来冷却该加热过的液体泊洛沙姆。或者，可以在真空炉中冷却泊洛沙姆。在一些实施方案中，冷却加热过的液体泊洛沙姆不包括使用液氮。在一些实施方案中，冷却加热过的液体泊洛沙姆不包括，通过维持在特定温度的气体使加热过的液体泊洛沙姆喷雾或雾化。在一些实施方案中，冷却加热过的液体泊洛沙姆不包括，将泊洛沙姆成型为特定或均一大小和/或形状的颗粒或微粒。
造粒/研磨
在一些实施方案中，冷却不在造粒或研磨设备中进行。在本领域中一直通过造粒或研磨来制备泊洛沙姆，以实现特定的均一泊洛沙姆颗粒大小和/或形状(对于描述泊洛沙姆造粒和研磨的实例，参见欧洲专利EP1661558B1或美国专利No.7,887,844)。泊洛沙姆造粒涉及使液体泊洛沙姆通过雾化器以形成液体泊洛沙姆颗粒并且在冷却介质中冷却这些颗粒，所述冷却介质例如是维持在特定温度的气体或液氮。冷却介质的温度被认为决定了泊洛沙姆的冷冻速度，其影响泊洛沙姆颗粒的最终大小和形状。造粒设备的实例可以包括，不限于，造粒塔。在造粒塔中，雾化的泊洛沙姆从塔顶释放，并且在下降通过气体或液体冷却介质(例如，环境空气、维持在特定温度的空气、或液氮)时冻结成颗粒。
泊洛沙姆研磨(或微磨)涉及研磨固体泊洛沙姆，或通过高压迫使泊洛沙姆通过喷嘴，直至产生特定大小的泊洛沙姆颗粒。因为研磨可能产生热并且泊洛沙姆具有相对低的熔化温度，因此常常在研磨过程中冷却泊洛沙姆来维持固相，例如，通过使用冷空气或液氮来冷却。还可以在研磨前冷却泊洛沙姆并研磨不足以使泊洛沙姆熔化的时间长度。研磨设备的实例可以包括不限于空气喷射磨机、球磨机和冷冻研磨机(例如，SPEXFreezer/)。
对于要求泊洛沙姆颗粒大小和形状符合严格标准的方法(例如，作为药物制剂的一部分)，造粒和研磨是有用的。本领域中已知泊洛沙姆可以作为药物制剂中帮助溶解和影响药物释放的成分。在这些制剂中，泊洛沙姆颗粒必须保持标准特征，以赋予药物制剂所需的药代动力学特性以及遵守严格的药物安全性和可重复性标准。值得注意的是，本文中所述的方法对于泊洛沙姆没有这样的严格或精确标准的要求，因此不使用这些造粒或研磨方法。
在一些实施方案中，在按照本文中所述加热前，泊洛沙姆已经通过造粒工艺进行过处理。许多商业上可购得的用于细胞培养的泊洛沙姆(例如，销售的F68NF Prill泊洛沙姆188)在制造过程中已经经历过造粒或微造粒处理。本文中所述的方法中包括的加热和冷却步骤不涉及造粒。相反，它们可以应用于已经过造粒或微造粒的泊洛沙姆。本发明发现，通过如本文中所述的加热和冷却，可以提高商业上可购得的泊洛沙姆(例如，造粒或微造粒的泊洛沙姆)在细胞培养中的性能。
在一些方面，本文中所述的制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法包括将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基中。加热和冷却后，可以通过本领域已知的任何方法将固体热处理过的泊洛沙姆溶解于细胞培养基中。例如，如果在开口的玻璃容器中加热并冷却泊洛沙姆，可以简单地刮下或剥落合适量(以重量计)的所得固体热处理过的泊洛沙姆，以加入细胞培养基中。可以将热处理过的泊洛沙姆立即加入细胞培养基中，或可以将其储存并在之后的时间(例如，热处理后超过约一天，超过约一个月或超过约一年)加入细胞培养基中。
在一些实施方案中，将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基之前，如上所述的加热和冷却步骤各进行一次。在一些实施方案中，将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基之前，如上所述的加热和冷却步骤重复至少一次。
III.泊洛沙姆和泊洛沙姆特性
本文提供用于制备泊洛沙姆的方法。在一些实施方案中，将通过所述方法产生的泊洛沙姆用于细胞培养基中。
术语“泊洛沙姆”可以涵盖许多不同的化合物，这是因为可以组合使用不同长度的聚氧丙烯和聚氧乙烯链。存在于泊洛沙姆中的聚氧丙烯和聚氧乙烯链的特定组合可以产生特定的化学和/或生物物理特性。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的化学式。在一些实施方案中，n(即，聚氧乙烯链长)具有约60至约150的值。在一些实施方案中，m(即，聚氧丙烯链长)具有约25至约60的值。
泊洛沙姆常常通过指明其大约分子量和聚氧乙烯含量百分比的编号系统来描述。这些值可以指泊洛沙姆组合物中的平均值，而非组合物中每个泊洛沙姆分子的绝对值。依据这个系统，头两个数字乘以100可以给出聚氧丙烯嵌段的大约分子量，而第三个数字乘以10可以给出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，泊洛沙姆188(CAS No.9003-11-6)可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆237可以指n具有约64的值和m具有约37的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆338可以指n具有约141的值和m具有约44的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆407可以指n具有约101的值和m具有约56的值的泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约6,000至约18,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，泊洛沙姆188可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的泊洛沙姆，并且该泊洛沙姆具有约7680至约9510g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，泊洛沙姆188可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的泊洛沙姆，并且该泊洛沙姆具有约7000至约10000g/mol的平均分子量。
可以依据不同的系统来命名以商品名销售的泊洛沙姆，例如，字母可以用于表示物理状态(例如，F表示固体，P表示糊状，或L表示液体)。2个或3个数字可以用于表示化学特性。头一个或头两个数字乘以300来给出聚氧丙烯嵌段的大约分子量，而第三个数字乘以10来给出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，F68可以指上述分子式中n具有约80的值和m具有约27的值的固体泊洛沙姆。F87可以指n具有约64的值和m具有约37的值的固体泊洛沙姆。F108可以指n具有约141的值和m具有约44的值的固体泊洛沙姆。F127可以指n具有约101的值和m具有约56的值的固体泊洛沙姆。
由于泊洛沙姆可以具有各种长度的疏水性(聚氧丙烯)和亲水性(聚氧乙烯)部分，不同的泊洛沙姆可以具有不同的亲水-亲脂平衡值(HLB)。可以通过计算亲水性或亲脂性的化合物的相对比例来确定化合物的HLB，并且HLB值可以用于预测化合物的表面活性剂特性。例如，具有低于10的HLB的化合物预测是水不溶性的，而具有高于10的HLB的化合物预测是水溶性的。在优选实施方案中，用于细胞培养中的泊洛沙姆具有24或更高的HLB。可以根据本领域公知的方法来计算泊洛沙姆的HLB，所述方法包括Griffin，W.C.(1954)J.Soc.Cosmet.Chemists 5(4):249-56和Davies,J.T.(1957)Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interfaces:Proc.of 2nd Intl.Congress Surface Activity,Butterworths(London):426-38中所述的那些。
在一些实施方案中，可以测量泊洛沙姆的物理和/或化学特性。例如，可以在按照本文中所述的热处理之前和之后测量泊洛沙姆的物理和/或化学特性，以鉴定与热处理过的泊洛沙姆相关的特性。作为另一个实例，可以测量如本文中所述的好泊洛沙姆批次和差泊洛沙姆批次的物理和/或化学特性，以鉴定与好泊洛沙姆批次相关的特性。
测量物理和/或化学特性的试验的实例包括，不限于，MALDI-MS、凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography)、粉末-XRD、准-弹性光散射和固态NMR。MALDI-MS(基质辅助激光解吸/电离质谱)是本领域已知用于分析、定量或鉴定化合物的技术，例如，通过其分子质量和电荷。作为非限制性实例，MALDI-MS可以用于鉴定，与热处理过的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次相比，优先和热处理前的泊洛沙姆批次或差泊洛沙姆批次相关的化合物或优先存在于其中的化合物(例如，杂质)。凝胶渗透色谱是本领域中已知用于按大小分离化合物的技术。作为非限制性实例，凝胶渗透色谱可以用于分离，与热处理过的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次相比，在热处理前的泊洛沙姆批次中或差泊洛沙姆批次中优先相关的或存在的化合物(例如，杂质)。粉末-XRD(粉末X-射线衍射)是本领域已知用于表征化合物结构的技术，可以涉及产生化合物的粉末样品(含有多种随机取向的微晶)和使用X-射线衍射分析微晶结构特征的步骤。作为非限制性实例，粉末-XRD可以用于表征热处理过的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次(例如与热处理前的泊洛沙姆或差泊洛沙姆批次相比)的结构特性。准-弹性光散射(也称为动态光散射和光子相关光谱)是本领域已知用于测定溶液或悬浮液中颗粒的大小分布谱的技术。作为非限制性实例，准-弹性光散射可以用于通过其颗粒大小来鉴定，与热处理过的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次相比，在热处理前的泊洛沙姆批次中或差泊洛沙姆批次中优先相关的或存在的化合物(例如，杂质)。
固态NMR(核磁共振，或SSNMR)是本领域已知用于测定化合物的各种结构特征的技术。例如，固态NMR可以用于表征化合物的分子构象、排列、化学位移或多晶型性质。作为非限制性实例，固态NMR可以用于表征，与热处理前的泊洛沙姆或差的泊洛沙姆批次相比，热处理过的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次的结构特性。在一些实施方案中，通过固态NMR测定的结构特性可以包括泊洛沙姆样品中晶体与无定形泊洛沙姆的比例。作为另一个非限制性实例，固态NMR可以用于提供光谱，所述光谱可以分辨或剖析一种或多种泊洛沙姆多晶型物。在一些实施方案中，固态NMR可以用于，与差的泊洛沙姆批次或热处理前的泊洛沙姆中存在的泊洛沙姆多晶型物比较，分辨好泊洛沙姆批次或热处理过的泊洛沙姆中的一种或多种泊洛沙姆多晶型物。在一些实施方案中，可以例如通过测量在含有好泊洛沙姆批次或热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中生长的细胞培养物的细胞生存力，并与含有差的泊洛沙姆批次或热处理前的泊洛沙姆的细胞培养基中生长的细胞培养物的细胞生存力相比，将泊洛沙姆在细胞培养基中的性能与通过固态NMR产生的泊洛沙姆光谱相关联。
IV.泊洛沙姆在细胞培养和多肽生产中的用途
本文中提供的热处理过的泊洛沙姆可以在方法(例如，使用含有本发明公开的热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基来培养细胞和生产多肽的方法)和组合物(例如，含有本发明公开的热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基)中找到用途。
泊洛沙姆在细胞培养中的用途
泊洛沙姆可以用作本领域已知的细胞培养基中的添加剂。不希望受到理论的束缚，认为泊洛沙姆在细胞培养基中具有许多功能，其可以保护细胞免受损伤和增强细胞生存力。例如，泊洛沙姆可以作为细胞的剪切保护剂。泊洛沙姆可以降低细胞-气泡粘附和/或降低气泡破裂时的冲击，由此防止细胞损伤。泊洛沙姆还可以改变起泡速度和频率，提高细胞从泡沫层的排出和/或强化细胞膜。参见，例如，Meier,S.J.等，(1999)Biotechnol.Bioeng.62(4):468-78；Chisti,Y.(2000)Trends Biotechnol.18(10):420-32和Tharmalingam,T.等，(2008)Mol.Biotechnol.39(2):167-77。
如本文中所述的热处理过的泊洛沙姆可以以泊洛沙姆常用的任何浓度加入细胞培养基中。在一些实施方案中，细胞培养基包括约0.1g/L至约10g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包括约0.1g/L至约3g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包括约3g/L至约10g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞培养基包括约0.1g/L，约0.2g/L，约0.3g/L，约0.4g/L，约0.5g/L，约0.6g/L，约0.7g/L，约0.8g/L，约0.9g/L，约1g/L，约2g/L，约3g/L，约4g/L，约5g/L，约6g/L，约7g/L，约8g/L，约9g/L或约10g/L热处理过的泊洛沙姆。在一些实施方案中，与热处理前的泊洛沙姆相比，如本文中所述制备的热处理过的泊洛沙姆可以以较低的浓度用于细胞培养基中，来获得期望的细胞生存力水平。在一些实施方案中，与热处理前的泊洛沙姆相比，如本文中所述制备的热处理过的泊洛沙姆可以以更一致或标准化的浓度用于细胞培养基中，来获得期望的细胞生存力水平。
表面活性剂，如泊洛沙姆，在溶液中具有限值，称为临界胶束浓度(CMC)，超过该限后，加入的其他表面活性剂分子开始并入胶束，而不是溶解于溶液中。在高于CMC的浓度下，溶液的表面张力不再以与表面活性剂的浓度成比例的相同速率降低。在优选实施方案中，以低于其CMC的浓度，将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基中。例如，已经确定泊洛沙姆188的CMC为100mg/mL(Kabanov,A.V.等，(1995)Macromolecules28(7):2303-14)。可以通过测量泊洛沙姆加入时的溶液表面张力来测定泊洛沙姆的CMC。提高泊洛沙姆浓度不再导致提高的表面张力时的浓度为该泊洛沙姆的CMC。例如但非限制，可以使用张力计(例如，来自Attension的Sigma 700/701张力计)来测量表面张力。
在一些细胞培养基
本发明公开的特定方面涉及在细胞培养基中培养细胞。可以使用适用于所需类型的细胞和/或多肽产物的本领域已知的任何细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基是化学成分确知的培养基。在其他实施方案中，细胞培养基是化学成分不确知的培养基。在一些实施方案中，将本文中所述的热处理过的泊洛沙姆加入基础细胞培养基中。在一些实施方案中，将本文中所述的热处理过的泊洛沙姆加入补料或分批补料细胞培养基。
可以使用商业上可购得的培养基，包括如，但不限于，Ham’s F10(Sigma)、极限必需培养基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco’s改良Eagle’s培养基([DMEM]，Sigma)、Luria肉汤(LB)和Terrific肉汤(TB)，并且这些培养基中的任一种可以补充本文中详述的任何培养基组分(例如，热处理过的泊洛沙姆)。此外，Ham和Wallace，Meth.Enz.，58:44(1979)，Barnes和Sato，Anal.Biochem.，102:255(1980)，Vijayasankaran等，Biomacromolecules.，6:605:611(2005),Patkar等，J Biotechnology,93:217-229(2002)，美国专利Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美国专利No.Re.30,985或美国专利No.5,122,469中所述的任何培养基，可以补充本文中详述的任何培养基组分(例如，热处理过的泊洛沙姆)，将上述文献全部按引用并入本文中作为参考。
本文中提供的任何培养基也可以按照需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、表面活性剂(如泊洛沙姆)和葡萄糖或等价能量源。在一些方面中，本文中提供的细胞培养基含有源自植物或动物的蛋白质。在一些实施方案中，本文中提供的细胞培养基不含源自植物或动物的蛋白质。还可以以本领域技术人员已知的合适浓度包括任何其他需要的补充剂。
细胞生存力
在一些实施方案中，与包括未处理的泊洛沙姆(或热处理之前的泊洛沙姆)的细胞培养基中的细胞生存力相比，包括热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力提高。本发明发现，将热处理过的泊洛沙姆用于细胞培养基中时，与未处理泊洛沙姆用于相同的细胞培养基时相比，按照本文中所述制备泊洛沙姆可以导致提高的细胞生存力。用于测试细胞生存力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，按照本文提供的实施例中详细描述的，测量细胞生存力。在一些实施方案中，可以在约1小时后，约2小时后或约3小时后(例如，如以下所述的)，测量培养基中的细胞生存力。
如本文中使用的，细胞生存力可以定量为溶液中活细胞的百分比(即，活细胞的数量除以细胞总数)。本领域已知的任何合适的方法可以用于测量细胞生存力。因为细胞或是活的或是死的，因此可以通过定量死细胞或活细胞来测定细胞生存力。一种合适的方法是锥虫蓝排除法。在该方法中，从细胞培养物获得细胞样品。将锥虫蓝溶液加入样品中。只有非存活的细胞才摄取锥虫蓝，并且这些细胞随后被染成蓝色。因此，对蓝色细胞的数量进行计数，将其从细胞总数中减去，产生活细胞的数量，将这个数字除以细胞总数以产生细胞生存力。细胞可以人工计数，如使用血细胞计数器，或自动计数，如使用例如生存力分析仪(Beckman Coulter)。用于测定细胞生存力的其他试验可以包括，不限于，碘化丙啶染色、TUNEL、刃天青、甲基紫、乳酸脱氢酶、荧光素二乙酸酯水解、MTT、胱天蛋白酶(caspase)和ATP试验。
例如，可以通过测量在含有热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中生长的细胞培养物的细胞生存力，并将其与在含有相同浓度的未处理泊洛沙姆的细胞培养基中生长的细胞培养物的细胞生存力进行比较，来测定热处理过的泊洛沙姆的作用。在一些实施方案中，可以在带挡板的摇瓶中生长细胞培养物。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高了至少约10％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约15％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约20％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约25％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约30％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约35％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约40％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约45％。在一些实施方案中，与未处理的泊洛沙姆相比，热处理过的泊洛沙姆的使用将细胞生存力提高至少约50％。
在一些实施方案中，与包含热处理前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力相比，包含本发明公开的热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力提高至少10％。在一些实施方案中，细胞生存力提高至少约1％，至少约2％，至少约3％，至少约4％，至少约5％，至少约6％，至少约7％，至少约8％，至少约9％，至少约10％，至少约11％，至少约12％，至少约13％，至少约14％，至少约15％，至少约16％，至少约17％，至少约18％，至少约19％，至少约20％，至少约21％，至少约22％，至少约23％，至少约24％，至少约25％，至少约26％，至少约27％，至少约28％，至少约29％，至少约30％，至少约31％，至少约32％，至少约33％，至少约34％，至少约35％，至少约36％，至少约37％，至少约38％，至少约39％，或至少约40％。
热处理过的泊洛沙姆尤其可以用于提高加入细胞培养基时没有产生令人满意的细胞生存力的泊洛沙姆(例如，特定批次的期望泊洛沙姆)的性能。在一些实施方案中，含有未处理泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力低于约80％。在一些实施方案中，含有未处理泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力低于约70％。在一些实施方案中，含有未处理泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力低于约60％。在一些实施方案中，含有未处理泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力低于约50％。在一些实施方案中，含有未处理泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力低于约40％。
细胞生长和多肽生产
在一些实施方案中，本发明公开的细胞(例如，本文中所述的细胞培养基中培养的细胞)可以含有目标多核苷酸(例如，编码目标多肽的多核苷酸，或本身是目标的多核苷酸)。在一些实施方案中，本发明公开的细胞可以经转染、转化或另外遗传修饰以包括目标多核苷酸。适用于转染或转化各种细胞的方法是本领域公知的。以下提供了有关多肽生产的示例性参考文献；本领域技术人员将明了其中公开的方法不限于多肽生产。
通常，在促进细胞生长、维持和/或多核苷酸和/或多肽生产的一个或多个条件下，使细胞与本文中所述的任何细胞培养基混合(接触)。培养细胞和产生多肽的方法可以使用培养容器(生物反应器)来容纳细胞和细胞培养基。培养容器可以由适用于培养细胞的任何材料组成，包括玻璃、塑料或金属。通常，培养容器为至少1升，并且可以是10，100，250，500，1000，2500，5000，8000，10,000，25,000升或更大。培养条件，如温度、pH等，是选择用于表达的宿主细胞之前使用的那些条件，并将是本领域普通技术人员明了的。可以在培养过程中调节的培养条件包括但不限于pH和温度。
可以在有助于细胞培养物的存活、生长、生存力(维持)和多肽产生能力的条件下维持细胞培养物。确切的条件将取决于细胞类型、细胞的来源生物体、以及所表达的多肽的性质和特征。在多肽产生期中，任选可以将细胞培养物维持在有助于细胞培养物的存活和生存力并适于所需多肽表达的第二组培养条件(与初始生长期相比)下。
在特定情况中，给细胞培养物补充已经被细胞耗尽或代谢的营养物或其他培养基成分，可能是有益或必需的。例如，给细胞培养物补充在细胞培养监控过程中已经观察到耗尽的营养物或其他培养基成分，可能是有利的。备选地或另外地，在生产期之前，补充细胞培养物可能是有益或必需的。作为非限制性实例，给细胞培养物补充激素和/或其他生长因子、特定的离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质或葡萄糖或其他能量源，可能是有益或必需的。
本文中详述的细胞培养基可以用于培养细胞以产生多肽(包括抗体)的方法中。该培养基可以用于培养细胞的方法中，无论是分批培养、补料分批培养或是灌流培养，并且可以用于生产任何多肽的方法中，包括如本文中所述的多肽的任何方面或实施方案中。通过本文中详述的方法(例如，使用含有本发明公开的热处理过的泊洛沙姆的培养基来培养细胞和生产多肽的方法)产生的多肽可以是宿主细胞同源的，或优选，可以是外源性的，意思是它们相对于所用的宿主细胞是异源的，即，外来的，如通过CHO细胞产生的人蛋白，或通过哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在一个变化方案中，多肽是由宿主细胞直接分泌至培养基中的哺乳动物多肽(如抗体)。在另一个变化方案中，多肽通过细胞裂解而释放至培养基中，所述细胞包含编码多肽的多核苷酸。
在宿主细胞中可表达的任何多肽都可以根据本发明公开生产，并且可以存在于组合物中。可以从宿主细胞内源的基因，或从通过遗传工程引入宿主细胞的基因来表达多肽。多肽可以是自然界中存在的，或备选地，可以具有通过人工工程化或选择的序列。可以从各天然存在的多肽区段来装配工程化多肽，或工程化多肽可以包括一个或多个非天然存在的区段。
常常可以基于感兴趣的生物或化学活性来选择可能期望根据本发明表达的多肽。例如，本发明可以用于表达任何医药上或商业上相关的酶、受体、抗体、激素、调控因子、抗原、结合剂等。
用于在细胞培养中生产多肽(如抗体)的方法是本领域公知的。本文提供用于在细胞培养中生产抗体(例如，全长抗体、抗体片段和多特异性抗体)的非限制性示例方法。本文中的方法可以由本领域技术人员适应性改变而用于其他蛋白质(如基于蛋白质的抑制剂)的生产。用于蛋白质(例如，治疗性蛋白)生产的一般熟知的和通用的技术和程序，参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Sambrook等，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2012)；CurrentProtocols in Molecular Biology(当代分子生物学实验方案)(F.M.Ausubel等编辑，2003)；Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学简短实验方案)(Ausubel等编辑，J.Wiley和Sons，2002)；Current Protocols in Protein Science(当代蛋白质科学实验方案)(Horswill等，2006)；Antibodies,A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)(Harlow和Lane编辑，1988)；Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniqueand Specialized Applications(动物细胞的培养：基础技术和专门应用手册)(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley和Sons，2010)，所有文献全部按引用并入本文中。
针对各种宿主细胞类型和多肽，适用于多肽产生的条件是本领域已知的。培养条件，如温度、pH等，可以是选择用于表达的宿主细胞之前使用过的那些，并且将是本领域普通技术人员明了的。
在细胞培养过程中可以搅拌或振荡细胞培养物，以提高氧合和营养物至细胞的分散。由于剪切力潜在地伤害细胞，在搅拌的细胞培养物中使用泊洛沙姆特别有利。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，在初始生长期中控制或调节生物反应器的一些内部条件可能是有益的，包括但不限于，pH、温度、氧合等。例如，可以通过提供合适量的酸或碱来控制pH，以及可以用本领域公知的喷射设备(sparging device)来控制氧合。
细胞
用于在培养基中培养并产生多肽的合适细胞可以包括原核细胞、酵母细胞或高等真核(例如，哺乳动物)细胞。在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
可以培养哺乳动物细胞，并且哺乳动物细胞在培养(组织培养)中的增殖已经成为常规程序。哺乳动物宿主细胞系的实例可以包括，不限于，SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(HepG2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括骨髓瘤细胞系，如NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的特定哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo编辑，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，pp.255-268。
在一些实施方案中，可以培养CHO细胞。CHO细胞是公知的并且本领域常用于在细胞培养物中生产多肽，例如抗体。CHO细胞可以包括，但不限于，DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))，例如ATCC CRL-9096。
用于这个目的的合适原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如，大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在1989年4月12日出版的DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其他菌株，如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是举例说明性的，而非限制。
除了原核生物，真核微生物，如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或普通面包酵母，是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，各种其他属、种和株也是通常可得的并且可以用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)、里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。讨论酵母和丝状真菌在治疗性蛋白生产中的用途的综述，参见，例如，Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可以选择其中糖基化途径已经“人源化”的特定真菌和酵母株，导致具有部分或完全人糖基化模式的抗体的产生。参见，例如，Li等，Nat.Biotech.24:210-215(2006)(描述了巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中糖基化途径的人源化)；和Gerngross等，上引文。
用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了各种杆状病毒株和变体以及来自宿主的昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。各种用于转染的病毒株是公众可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且根据本发明，这些病毒可以用作本文中的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。昆虫细胞的实例包括，不限于，果蝇细胞(例如，S2细胞)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如，HighFiveTM细胞)和草地贪夜蛾细胞(例如，Sf21或Sf9细胞)。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿、浮萍(Leninaceae)、苜蓿(M.truncatula)和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，美国专利No.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
抗体生产
在一些实施方案中，将含有热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中培养的细胞用于产生抗体。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。修饰语“单克隆”表示抗体获自基本上同质的抗体群的特征，不应解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术来制得，包括，例如，杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein，Nature,256:495-97(1975)；Hongo等，Hybridoma，14(3):253-260(1995)，Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，见：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981))，重组DNA方法(参见，例如，美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等，Nature,352:624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016；Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。在一些实施方案中，通过本文中所述的方法产生的抗体是人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、文库衍生的抗体或多特异性抗体。
可以使用重组方法产生抗体，例如，在使用CHO细胞生产抗体中。对于抗抗原抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸并插入可复制载体中，用于进一步的克隆(DNA的扩增)或用于表达。可以容易地分离编码抗体的DNA并使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。许多载体是可利用的。载体组分通常包括，但不限于，以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本发明的抗体不仅可以直接通过重组产生，而且可以作为与异源多肽的融合多肽来产生，所述异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特定切割位点的其他多肽。优选选择的异源信号序列是由宿主细胞识别并加工(例如，被信号肽酶断裂)的序列。对于没有识别和处理天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列由选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列替代。对于酵母分泌，天然信号序列可以由例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母和克鲁维酵母α-因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列或WO90/13646中所述的信号替代。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如，单纯疱疹gD信号，是可利用的。
抗体可以在胞内、在细胞周质间隙中产生，或直接分泌至培养基中。如果抗体在胞内产生，作为第一步，除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)，例如，通过离心或超滤来去除。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的细胞周质间隙中的抗体的程序。简而言之，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氯(PMSF)的存在下在约30min内融化细胞糊状物。通过离心除去细胞碎片。在抗体分泌至培养基中的情况中，通常首先使用商业上可购得的蛋白质浓缩过滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩来自该表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂，如PMSF，可以包括在之前的任何步骤中，以抑制蛋白质水解，并且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和力色谱来纯化抗体，其中亲和力色谱是通常优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和力配体的的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和用于人γ3(Guss等，EMBO J.5:15671575(1986))。亲和力配体所附着的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也是可利用的。与使用琼脂糖可获得的流速和处理时间相比，机械稳定的基质，如受控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯，允许更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况中，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)对于纯化是有用的。取决于待收集的抗体，其他蛋白质纯化技术，如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反向HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂色谱(如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可利用的。
在一些实施方案中，本文中所述的抗体是其抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；直链抗体；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。Fab片段含有重链和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。通过在重链CH1结构域的羧基末端添加一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，Fab’片段不同于Fab片段。恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有游离硫醇基的Fab’在本文中命名为Fab’-SH。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段对产生，在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。“Fv”是最小抗体片段，其含有完整的抗原结合位点。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽衔接物，其使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。对于scFv的综述，参见，例如，Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315。用于纯化上述抗体的许多方法可以适宜地进行调整以适用于纯化抗原结合性抗体片段。
通常，制备用于研究、测试和临床的抗体的各种方法是本领域成熟建立的，与上述方法相一致和/或被本领域技术人员认为适用于特定目标抗体的。
实施例
通过参考以下实施例，可以更全面地理解本发明。然而，实施例不应当解释为对本发明范围的限制。可以理解，本文中所述的实施例和实施方案只是用于举例说明性的目的，对于本领域技术人员基于其将明了各种修饰或改变，这些修饰和变化包括在本申请和所附权利要求的精神和范围内。
实施例1：热处理提高用于细胞培养的泊洛沙姆性能
泊洛沙姆通常用于细胞培养中作为保护细胞免受喷射和/或气泡相关损伤的表面活性剂。不幸地，批与批之间的变异性破坏了其有效性并导致重组产物产量的降低。例如，差批次的泊洛沙姆降低细胞生存力并且可导致产物滴度降低高达45％。经过一系列广泛研究后发现，差的泊洛沙姆批次是工业蛋白质生产中产物产量显著降低以及随后经济损失的根源。因此，提高泊洛沙姆性能的方法将是高度有益的。
令人惊讶地，已经发现，单加热处理能够提高泊洛沙姆在细胞培养中的性能。重要地，这种加热处理不仅提高了坏泊洛沙姆批次的性能，而且也能够进一步增强好批次的性能。本文中描述了用于处理泊洛沙姆来提高其作为细胞培养补充剂的性能的方法。
方法
泊洛沙姆处理
将15g泊洛沙姆188(F 68 NF Prill泊洛沙姆188，BASF)在标准搅拌板上加热10-12分钟。当泊洛沙姆达到86-91℃温度时，停止加热。然后在室温、2-8℃或-72℃，将泊洛沙姆冷却大约20分钟。然后将固体泊洛沙姆剥下，并加入细胞培养基中用于测试。
细胞培养测试模型
将按照以上所述热处理过的泊洛沙姆188以1g/L的终浓度加入标准的、无血清的、CHO细胞培养基中。将CHO细胞以1.5×106细胞/mL的浓度在250mL带挡板的摇瓶中在25-75mL细胞培养基中在5％CO2中37℃生长。在细胞培养过程中，将摇瓶在轨道摇床上在250至350rpm之间旋转。使用带挡板的摇瓶在培养物中形成了大量带入的气泡。使用生存力分析仪(Beckman Coulter)，通过锥虫蓝排除，测量了细胞生存力。取样300μL细胞培养物，并且通过活细胞数(即，没有吸收锥虫蓝的细胞)除以样品中的细胞总数，计算了细胞生存力百分比。
结果
研发了简单筛选模型用于在实验室规模(而非工业规模)模拟泊洛沙姆对细胞培养物生存力的影响。简而言之，如上所述，将CHO细胞生长于250mL烧瓶中。为了最大化由好和差批次的泊洛沙姆产生的细胞生存力差异，测试了细胞培养基的体积和振荡速度。将细胞生长于25、50或75mL培养基中并且在轨道摇床平台上在250、300或350rpm振荡。发现，培养基的体积对Δ生存力(即，已知的好批次和已知的差批次泊洛沙姆之间的细胞生存力差异，以百分比表示)没有影响，但较高的振荡速度显示出Δ生存力的增加。
如图1中所示，发现，热处理泊洛沙姆(参见方法部分)显著提高了泊洛沙姆在细胞培养中的性能。使用以上的筛选模型，测试了各种泊洛沙姆批次对细胞生存力的作用。一些批次已知性能好，而其他被怀疑具有差的性能。对于每个批次，将未处理的泊洛沙姆组和热处理过的(HT)泊洛沙姆组加入细胞培养基中用于测试。与未处理的泊洛沙姆相比，发现热处理过的泊洛沙姆在测试的所有批次中均提高了细胞生存力(图1)。在一些情况中，热处理过的泊洛沙姆能够将生存力增倍，从45％提高至接近90％。重要地，热处理过的泊洛沙姆能够提高已经显示了高性能的批次的生存力(参见，例如，图1中的“好4”)。
这些结果证明，泊洛沙姆的热处理能够提高其对细胞培养物的生存力的作用。热处理能够显著提高差泊洛沙姆批次的性能，并且甚至进一步增强好批次的性能，表明泊洛沙姆热处理的实施可以显著降低泊洛沙姆批次变异性的问题。
实施例2：用RTD温度计测量泊洛沙姆热处理
在热板上进行了实施例1中所述的实验。这些实验涉及在10分钟的过程中将泊洛沙姆加热到大约80-100℃(通过RTD测量)。重复这些实验，并增加加热到高于100℃(即，124℃)的样品。
方法
泊洛沙姆188制造商和批次
使用了泊洛沙姆188材料。识别号和相关的细胞培养性能(通过在高剪切振荡烧瓶试验HSSF中的性能来确定)列于表1中。
表1.识别号(在所有随后实施例中用于指批号)和来自HSSF数据的相关细胞培养性能。
热处理方法
为了评价泊洛沙姆热处理方法，评价了几种热处理方法：在热板上加热、在烘箱中加热或在压热器中加热。
热板
将五至十五克泊洛沙姆放置在玻璃烧杯(100-400mL)中并在热板上持续搅拌加热。使用热电偶(Kaye 731热电偶)或电阻式温度检测器(RTD)(Fluke 5627A-12PrecisionRTD探头)测量泊洛沙姆的温度。加热泊洛沙姆直至其达到目标温度(大约五至十分钟)，然后立即停止加热。使熔化的泊洛沙姆在室温冷却。
烘箱
称重五克泊洛沙姆放入20mL闪烁玻璃小瓶中。将热电偶固定在小瓶中，使得尖端插入干的泊洛沙姆中。然后将泊洛沙姆和热电偶放入已经处于目标温度的烘箱(YamatoADP 21真空干燥烘箱)中。除非另外说明，运行烘箱，不使用真空功能(在大气压力下)。使泊洛沙姆达到目标温度(通过热电偶测量，+/-3℃)，并且将泊洛沙姆达到该目标温度的时间标记为时间＝0。期望孵育时间后，施加轻微的真空10-30秒，以吸走释放至烘箱中的任何挥发物。通气后，从烘箱中取出玻璃小瓶并使其在室温冷却(未加盖)。
CHO细胞培养和培养基
将标准的、无血清的CHO细胞培养基用于所有实验，除了一个值得注意的例外：从培养基中省略Pluronic F68。为了支持此研究，将两个CHO细胞系融化物维持于种子罐(seed train)生物反应器(STB)中。
高剪切细胞培养摇瓶方法
将泊洛沙姆样品加入细胞培养基中
按每样品250mL标准的、无血清的CHO细胞培养基(无泊洛沙姆)，将培养基等分至PETG容器中并将0.25克泊洛沙姆样品加入每个等份试样中，制备了培养基。将培养基在150rpm搅拌至少5分钟，以将泊洛沙姆彻底溶解在培养基中。然后将培养基在生物安全柜(BSC)中使用0.22μm PES过滤装置真空过滤。将培养基储存在37℃，在24小时内使用。
培养基更换和细胞培养试验
将细胞培养物样品转移至50mL Falcon试管中，使得每个等份试样含有大约7.5×10E7个细胞。将细胞在830×g下离心10分钟，形成沉淀。除去上清液，并将细胞重悬浮于含有待测泊洛沙姆样品的培养基中，然后转移至250mL通气的带挡板的摇瓶中。将摇瓶在150rpm下振荡几分钟以均匀分布细胞后，使用NOVA Flex测量初始的总细胞密度(TCD)和生存力。然后将摇瓶放入培养箱中，5％CO2，80％湿度和37℃，并在300rpm下振荡3小时。在培养1小时、2小时和3小时后进行TCD和生存力测量，并与初始TCD和生存力比较。
结果
将好批次的泊洛沙姆(A)和两个差批次(B和C)的样品加热到大约100℃。将另外的样品C加热到124℃。热处理后，在HSSF测试中测试了样品。
处理至100℃(通过RTD测量)的所有泊洛沙姆样品没有显示出超过相同批次的未处理材料的改善(图2)。然而，与未处理的C相比，热处理至124℃的C表现出19％的最终生存力增加。此外，对于热处理过的C，生存力的总体变化(即，最终生存力％(Vf)减去初始生存力％(V0))为-27.4％，与未处理C相比，提高21％(表2)。
表2.HSSF测试中热处理过的泊洛沙姆样品、条件、超过未处理批次的生存力改善、和最终生存力
高剪切摇瓶模型运行，使用N＝1
这些结果证实，热处理提高了泊洛沙姆在细胞培养中的性能并且给出了有效温度和处理持续时间的初步指示。然而，这些结果表明，高于100℃的温度在热处理用于细胞培养的泊洛沙姆时更有效。认为温度测量的差异(例如，用于测量泊洛沙姆温度的温度计类型)可能导致用于泊洛沙姆热处理的不同有效范围(对于更多数据和讨论，参见实施例8)。
实施例3：将热处理转移至烘箱
将台式干燥烘箱用作可替换的加热机制，其提供了温度控制和可重复性。另外，真空功能允许在打开烘箱和取出热处理的泊洛沙姆之前从烘箱中吸出由熔化泊洛沙姆释放的烟气。根据实施例2中所述的方法进行了烘箱实验。
烘箱中的初始实验使用了响应曲面设计，以便使用最小所需样品数来测试大范围的条件(图3)。温度范围为92-148℃，培养时间为10-120分钟。差批次(C)的样品在烘箱中在特定条件下热处理。然后在HSSF模型中测试所得到的样品，以确定在细胞培养性能上的提高。
在烘箱中在140℃加热60分钟和在150℃加热35分钟的差性能泊洛沙姆显示出了最终生存力的实质性提高，在HSSF测试中与阳性对照相当(图4和表3)。
表3.在烘箱中加热的泊洛沙姆的生存力
*HSSF模型一式两份运行
然而，在这些实验中，在低于140℃和/或短于60分钟的条件下热处理的泊洛沙姆没有显示出性能提高。这些数据表明，提高泊洛沙姆性能的热处理的最小温度在所测试的持续时间下为大约140℃。以下，例如，在实施例5中，描述了更广泛的温度和加热持续时间的测试。
实施例4：烘箱热处理DOE
用于烘箱中热处理条件的主响应曲面图表明了在测试条件下有效热处理的最小温度为大约140℃。根据实施例2的方法，在烘箱中进行了全实验设计(DOE)，通过升至非常高的温度和长培养时间，以确定工作范围。测试的最大温度为185℃，针对每个温度测试的最大培养时间为120分钟。处理了差批次的泊洛沙姆(G)并在六个样品区块中测试，所述区块使用拉丁方设计分区。总共，处理了三个样品区块和另外六个感兴趣条件的样品(表4)。然后在HSSF测试中测试了这些样品，来测定细胞培养性能。表4.在烘箱中在全DOE中评价的热处理条件。温度范围为110-185℃；持续时间为1-120分钟。带字母标记的框(对应于表5中的区块)指示测试的处理条件(如表5中所列)。
DOE原始数据显示于表5中。作图在等值线图(contour plot)上时，全DOE结果说明，提高泊洛沙姆性能的热处理条件的大工作范围(图5)。
表5：来自全DOE实验的原始数据
在155℃或高于155℃热处理的样品在所有孵育时间都导致了细胞培养性能的显著提高。在HSSF测试中，这些样品在3hr后具有小于10％的生存力变化。在140℃，在孵育时间达到30分钟或更长时间前，热处理是无效的。另外，在孵育样品2小时之前，测试的最低温度(125℃和110℃)是无效的。
实施例5：热处理的可靠性和再现性
为了证明图5中举例说明的热处理设计间隔的再现性和可靠性，根据实施例2中所述的方法，使用另外批次的泊洛沙姆，重复了全DOE的关键处理条件。这些条件中的两个以一式两份重复，以解决再现性。选定的条件落入工作范围内或落在工作范围的边缘。总共，处理了三个差批次(包括G，其之前用于DOE)(表6)。为了确保热处理对好批次进行时不会是有害的，还处理了一个好批次(E)。
表6.在四个泊洛沙姆批次上测试的关键热处理条件的重复次数
重复的处理条件的HSSF测试结果与来自初始DOE的结果高度相当(表7和8)；然而，在差批次上存在最佳热处理条件的可观察的变异性(图6)。
表7.在四批泊洛沙姆上HSSF测试中测试的热处理条件的最终细胞生存力：E(好批次)、F(差批次)、H(差批次)和G(全DOE实验中使用的差批次)。
表8.在四个不同泊洛沙姆批次上测试的热处理条件在HSSF测试中的细胞生存力变化(Vf(处理过的)-Vf(未处理的))：E(好批次)、F(差批次)、H(差批次)和G(全DOE实验中使用的差批次)。
高剪切摇瓶模型运行，使用N＝1
批次G和F，在155℃处理1min或在140℃处理1分钟时，显示了细胞培养性能的显著提高。然而，批次H在使用140℃处理1分钟时没有显示出改善，并且在使用155℃处理1min时仅有微小(<10％)改善。针对这个批次的所有其他处理条件显示出在细胞培养中的显著改善。这些结果说明，批次在热处理的最低温度和孵育时间上具有轻微差异。
实施例6：较低温度和长持续时间的评价
实施例2-5中所述的热处理条件明显高于泊洛沙姆的熔点。为了确定只是略高于泊洛沙姆熔点(～50℃)的温度是否对细胞培养物生存力有作用，在烘箱中在60℃和80℃下处理了两个差批次(H和G)的泊洛沙姆样品120分钟，然后根据实施例2在HSSF方法中测试。
热处理过的样品的结果显示，不管温度如何，与未处理泊洛沙姆相比，性能没有显著提高(图7)。不希望受到理论的束缚，猜测对于这些较低的温度可能需要更长的孵育时间来产生改善的泊洛沙姆。
实施例7：真空热处理
为了确定氧对泊洛沙姆热处理的影响，根据实施例2的方法，将两个差泊洛沙姆批次(H和G)的样品在烘箱中在略微真空下加热到140℃。在一定的孵育时间后不是从真空中取出样品，而是将泊洛沙姆在真空下在烘箱中冷却至室温，以确保不存在外部的氧暴露，同时泊洛沙姆处于目标温度。
表9.真空中测试的样品的泊洛沙姆热处理条件和HSSF结果
*高剪切摇瓶模型运行，使用N＝2
在真空中处理的泊洛沙姆显示了在细胞培养中超过未处理泊洛沙姆的显著改善(最终生存力提高>20％)(图8，表9)。这些结果证明，泊洛沙姆热处理过程中可不需要外部氧暴露来产生改善的泊洛沙姆。
实施例8：使用RTD vs.Wire热电偶的温度测量
之前的数据支持80-100℃的温度范围用于热处理过程。然而，全DOE(例如，如图5中所示)支持140℃或高于140℃的操作范围。
进行了实验来检测用于测量热处理过程中泊洛沙姆温度的两种不同温度计。实施例1中描述的实验使用了RTD，而wire热电偶用于所有烘箱实验中。使用的RTD需要4”的没入深度用于准确温度测量。相反，wire热电偶设计成在其尖端精确测量温度，使其可以在只插入几毫米泊洛沙姆时准确测量温度。
在根据实施例2中的方法在热板上热处理泊洛沙姆时进行了并排比较。wire热电偶给出了152.6℃的温度读数，而RTD温度计给出了81.65℃的读数。因此，与热电偶相比时，RTD显示出明显低测量的温度(>70℃)。这些结果说明，不同的泊洛沙姆温度读数是造成足够用于产生改善的泊洛沙姆的有效温度范围上差异的原因。
实施例9：烘箱中加热升温和冷却速率的表征
泊洛沙姆样品，一旦放在烘箱中，不会立即达到目标温度。根据实施例2中的方法，在烘箱中评价了DOE中使用的三个温度的加热和冷却曲线。
样品平均花费18分钟在烘箱中达到目标温度(+/-3℃)，具有5.8分钟的标准偏差(图9)。尽管加热时间的变异性，冷却速率相对相似。样品达到泊洛沙姆的熔化温度(～40℃)的平均时间为7分钟，0.8分钟的标准偏差。假定冷却曲线在很大程度上是线性的，加热到170℃，155℃和140℃的样品的冷却速率大约分别为-19℃/min，-19.5℃/min和-18℃/min。
实施例10：变异性的统计学显著性和泊洛沙姆热处理
使用了student’s t-检验来确定HSSF测试中泊洛沙姆对照批次性能之间的差异和观察到的细胞培养性能提高的显著性。将来自烘箱DOE的所有HSSF对照结果包括在数据集中。对于热处理过的样品，只有在工作范围内的样品用于计算热处理后的细胞生存力的平均变化。工作范围定义为在HSSF测试中生存力变化低于15％时的条件。
使用student’s t-检验比较了处理过的和未处理的泊洛沙姆(α＝0.05)来确定平均值的统计学显著性差异。另外，将处理过的材料的结果与阳性对照(D)结果进行比较。
表10：测试批次的处理过的和未处理过的泊洛沙姆材料在HSSF测试中的平均Δ生存力(Vf(处理过的)-Vf(未处理的))
使用0.05的α水平，未处理的差批次泊洛沙姆和阳性对照批次(D)之间的平均值比较显示了显著差异(表10)。热处理后，所有批次的性能显著好于阳性对照批次，除了H(其是相当的)。批次E(好批次)具有>0.05的p值，表明其性能与阳性对照批次相比没有显著不同。然而，来自批次E的热处理过的泊洛沙姆在HSSF测试中具有显著好于阳性对照的性能(p值＝0.0005)，证明热处理过程改善了已经可接受的批次。
这些结果举例说明于图10中，其展示了，与整体阳性对照数据集相比，每个批次的处理过和未处理的结果。例如，图10举例说明了，对于差批次G，未处理的G、阳性对照好批次D和热处理过的G均是统计学上可区分的，其中与阳性对照好批次(D)或未处理的G差批次相比，热处理过的G批次显示出显著提高的生存力。
基于这种分析，热处理过程被认为成功的例子显示出了超过未处理材料的18％提高。此外，处理过的材料至少整体上与这些实验中使用的阳性对照批次具有一样好的性能。
在用于细胞培养基之前热处理差批次的泊洛沙姆是提高其细胞保护性能的有效方法。热处理在宽的温度和持续时间的范围中是有效的；然而，温度越低，需要的处理时间越长。该方法是可靠的，在几个泊洛沙姆批次上显示相似的结果，并且是可再现的。尽管本文呈现的结果来自在烘箱中进行的实验，但该方法可以转移至更大规模的设备。本文中所述的热处理方法可以转化为可以确保泊洛沙姆在所需温度下连续加热所需持续时间的任何处理方法。
实施例11：DOE测试数据的统计学分析
以上所述的实施例证明了泊洛沙姆热处理对随后细胞培养中性能(例如，细胞生存力)的影响。接着，进行分析以产生转移函数(transfer function)，其是输出结果(摇瓶模型中3hr时的生存力)作为两个因变量(温度和时间)的函数的数学模型。
通过响应曲面回归方法，在Minitab中分析了随着作为变量的温度和时间的变化在烘箱中收集的DOE测试数据(描述于表12中)。每个DOE测试设计，将已知的差批次泊洛沙姆(G)进行热处理，并在高剪切摇瓶模型中进行了测试(用作剪切保护剂功能性的替代)。在3小时测试结束时，生存力越高，表明泊洛沙姆性能越好。相似地，在未处理样品(阴性对照)和已经处理来提高性能的相同批次泊洛沙姆之间进行了评价。为了说明在性能差的批次中观察到的批内变异性，将六个G对照的平均最终生存力用作基线来计算针对每个测试情况观察到的生存力提高的百分比。3小时时的生存力(％)和处理过的与未处理批次的差异(％)是响应变量。结果表明，如通过生存力的提高所测量的，该性能差的批次的品质可以被提高。在多种温度和时间处理下可以实现生存力阳性变化(处理过的批次-未处理批次)的期望生存力目标。
进行了在3hr时生存力变化(处理过的批次-未处理的批次)的分析。由于在胁迫条件下研究的性能差的批次之一(G)的平均最终生存力被发现为79.7+/-5.0％，将10％或20％的生存力增加作为目标用于等值线图和用于建立在指定温度下热处理的最小持续时间。还应当注意到，在另一个差性能者(C)的情况中，对于未处理的对照，可预期低于针对G观察到的更低生存力(44.8+/-7.8％)。因此，在针对批次G获得了20％提升的条件下，对于C可以预期>35％的生存力提高。这些结果表明，存在温度和时间的线性作用，温度和时间的相互作用。模型中这些项在95％置信水平下以P-值＜0.05是统计学显著的。在模型中鉴定最佳操作范围和因素是出乎预料的和新的发现。
表12.批次G热处理的数据集
HSSF模型一式两份运行
对于分析软件，使用了Minitab版本17.1(Minitab.com，State College PA)。分析为回归分析(RSRegress)。使用响应曲面回归来分析相对时间(min)和温度(℃)的生存力提高(超过未处理的批次)。
在以下表13-15中提供了方差分析、模型总结和编码的系数(codedcoefficients)。
表13.方差分析
表14.模型总结
S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred)
7.93736 48.58％ 39.40％ 8.41％
表15.编码的系数
基于这些结果，回归等式(以未编码的单位)确定为：生存力提高(超过未处理的批次),％＝-113.5+0.486*(时间,min)+1.238*(温度，C)+0.00047*(时间，min)2-0.00286*(温度，C)2-0.00333*(时间，min)*(温度，C)
以上显示的转移函数可以预测作为热处理温度和持续时间的函数的批次G超过未处理对照的生存力提高。其还含有涉及温度和时间及其相互作用的二阶项(second orderterms)。使用以上的模型，可以获得针对测试情况的预期生存力(不是按照经验产生的)。以下针对157℃和1分钟的测试条件，显示了样品输出预测。
生存力提高＝-113.5+(0.486*1)+(1.238*157)+0.00047*1^2)-(0.00286*157^2)-(0.00333*1*157)＝10.3％
使用实验数据来产生图11中所示的等值线图(经验数据显示在黑色圆中)。基于通过回归产生的该模型，可以计算推断5个点。
首先，处理响应可以分为三个温度区(157℃-185℃)、(134℃-157℃)和(60℃-134℃)。
其次，在157-185℃的高温区中，热处理过的批次的生存力可以在一分钟的最小热处理中提高1至20％。
第三，在134℃-157℃的中温区中，热处理过的批次的生存力可以在1分钟的最小热处理持续时间中提高1至10％。使用120分钟的最小热处理持续时间，生存力可以增加高达20％。
第四，在60℃-134℃的低温区中，热处理过的批次的生存力可以在140分钟的热处理持续时间中提高多达10％。在164分钟的最小热处理持续时间中可以增加高达20％。注意，针对中温区和低温区描述的持续时间是简化的指南。例如，如图11中所示，低温区内60℃，80℃，120℃的温度分别需要164分钟，147分钟和115分钟来实现至少10％的生存力提高。示例性数值描述于以下的表16中。
表16.示例性温度、时间和相应的生存力提高
第五，以上所列的模型源自用批次G产生的数据。由于未处理的对照具有79％的较高基线生存力，因此生存力提高可以实现至最大20％。然而，对于如C这样的批次，其中未处理的批次具有45％的低得多的生存力，则可以实现更高水平的提高。例如，在134℃-157℃的中温区，对于批次C，生存力可以在15分钟的热处理持续时间中提高42％。观察到的批次C和G之间的性能差异总结于以下的表17中。
表17.C和G性能的总结
因此，在如C这样的批次中，热处理值更明显。由于缺乏原材料来运行整套实验，因此不能执行这个批次的完整数据集。G是临界差性能的批次，以上预测的模型可能被认为保守。使用批次C和G产生的数据证明，热处理泊洛沙姆可以提高本文中未测试的其他泊洛沙姆批次的性能。如上所述，这种性能的提高受时间和温度的影响。以上所述的结果证明，提高温度可以缩短改善泊洛沙姆性能所需的热处理持续时间，而较低的温度可以用于在较长持续时间提高泊洛沙姆性能。不希望受缚于理论，认为热处理时观察到的生存力提高的精确百分比将取决于针对热处理前特定泊洛沙姆批次所观察到的基线生存力。

Claims (54)

1.一种制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法，包括步骤：
(a)将固体泊洛沙姆加热到至少约60℃，形成液体泊洛沙姆；和
(b)将液体泊洛沙姆冷却至低于约50℃的温度，形成固体热处理过的泊洛沙姆，其中冷却不在造粒或研磨设备中进行，并且其中泊洛沙姆包含环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。
2.权利要求1的方法，其中与包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力相比，包含热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力提高。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约60℃至约185℃。
4.权利要求3的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃。
5.权利要求4的方法，其中加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃并且至少1分钟。
6.权利要求5的方法，其中加热泊洛沙姆到约157℃至约185℃并且1分钟至约250分钟。
7.权利要求3的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃。
8.权利要求7的方法，其中加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃并且至少1分钟。
9.权利要求8的方法，其中加热泊洛沙姆到约134℃至约157℃并且1分钟至约250分钟。
10.权利要求3的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃。
11.权利要求10的方法，其中加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且至少约62分钟。
12.权利要求11的方法，其中加热泊洛沙姆到约120℃至约134℃并且约62分钟至约250分钟。
13.权利要求3的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃。
14.权利要求13的方法，其中加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且至少约98分钟。
15.权利要求14的方法，其中加热泊洛沙姆到约100℃至约120℃并且约98分钟至约250分钟。
16.权利要求3的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃。
17.权利要求16的方法，其中加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且至少约122分钟。
18.权利要求17的方法，其中加热泊洛沙姆到约80℃至约100℃并且约122分钟至约250分钟。
19.权利要求3的方法，其中步骤(a)中加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃。
20.权利要求16的方法，其中加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且至少约143分钟。
21.权利要求17的方法，其中加热泊洛沙姆到约60℃至约80℃并且约143分钟至约250分钟。
22.权利要求1或权利要求2的方法，其中与包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力相比，包含热处理过的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力提高至少10％。
23.权利要求22的方法，其中细胞生存力提高至少约20％。
24.权利要求22的方法，其中细胞生存力提高至少约30％。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中包含步骤(a)之前的泊洛沙姆的细胞培养基中的细胞生存力在约3小时的细胞培养后低于约80％。
26.权利要求1-25任一项的方法，其中步骤(b)中，在环境温度、约2℃至约8℃、或低于0℃，冷却液体泊洛沙姆。
27.权利要求1-26任一项的方法，其中在真空下加热泊洛沙姆。
28.权利要求1-27任一项的方法，其中冷却液体泊洛沙姆至少约20分钟。
29.权利要求1-28任一项的方法，其中将步骤(b)中产生的热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基中。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中在将热处理过的泊洛沙姆加入细胞培养基之前，将步骤(a)和(b)重复至少一次。
31.权利要求1-30任一项的方法，其中在步骤(a)之前，泊洛沙姆已经通过造粒工艺进行过处理。
32.权利要求1-31任一项的方法，其中泊洛沙姆具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH，其中n为约60至约150，且m为约25至约60。
33.权利要求1-32任一项的方法，其中泊洛沙姆具有约55℃的熔化温度。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中泊洛沙姆具有约6,000至约18,000道尔顿的平均分子量。
35.权利要求1-33任一项的方法，其中泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，其中n具有约80的值，m具有约27的值，并且该泊洛沙姆具有约7680至约9510g/mol的平均分子量。
36.权利要求1-33任一项的方法，其中泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
37.权利要求1-36任一项的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
38.权利要求37的方法，其中细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
39.权利要求1-38任一项的方法，其中细胞是昆虫细胞。
40.权利要求1-39任一项的方法，其中细胞产生多肽。
41.通过权利要求1-40任一项的方法制备的泊洛沙姆。
42.包含权利要求41的泊洛沙姆的细胞培养基。
43.权利要求42的细胞培养基，其中细胞培养基包含约0.1g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。
44.权利要求43的细胞培养基，其中细胞培养基包含约0.1g/L至约3g/L的热处理过的泊洛沙姆。
45.权利要求43的细胞培养基，其中细胞培养基包含约3g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。
46.一种在细胞培养中生产多肽的方法，包括步骤：在适于多肽产生的条件下在细胞培养基中培养产生多肽的细胞，其中细胞培养基包含权利要求41的泊洛沙姆。
47.权利要求46的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
48.权利要求46的方法，其中细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
49.权利要求46的方法，其中细胞是昆虫细胞。
50.权利要求46-49任一项的方法，其中细胞培养基包含约0.1g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。
51.权利要求50的方法，其中细胞培养基包含约0.1g/L至约3g/L的热处理过的泊洛沙姆。
52.权利要求50的方法，其中细胞培养基包含约3g/L至约10g/L的热处理过的泊洛沙姆。
53.权利要求46-52任一项的方法，其中多肽是抗体或其抗原结合片段。
54.一种制备用于细胞培养基中的泊洛沙姆的方法，包括步骤：
(a)将泊洛沙姆加热到约80℃至约100℃，形成液体泊洛沙姆；和
(b)将液体泊洛沙姆冷却至低于约50℃的温度，形成固体热处理过的泊洛沙姆，其中冷却不在造粒或研磨设备中进行；
其中泊洛沙姆包含环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。
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